Anleitungen für die chemische Laboratoriumspraxis Band XXIII

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1 Anleitungen für die chemische Laboratoriumspraxis Band XXIII Herausgegeben von W. Fresenius, lf.k. Huber, E. Pungor, G.A. Rechnitz, W. Simon, G. Tölg und Th. S. West

2 Bandherausgeber Prof. Dr. Horst Wagner, Universität des Saarlandes Fachbereich 13 - Chemie, Fachrichtung Anorganische Analytik und Radiochemie, 6000 Saarbrücken Prof. Dr.-Ing. Ewald Blasius t Herausgeber Prof. Dr. Wilhelm Fresenius, Institut Fresenius, Chemische und Biologische Laboratorien GmbH, Im Maisel, D-6204 Taunusstein 4 Prof. Dr. lf.k. Huber, Institut für Analytische Chemie der Universität Wien, Währinger Straße 38, A-1090 Wien Prof. Dr. Ernö Pungor, Institute for General and Analytical Chemistry, Gellert-ter 4, H-1502 Budapest XI Prof. Garry A. Rechnitz, Department ofchemistry, University ofdelaware, Newark, DE 19711, USA Prof. Dr. Wilhelm Simon, Eidgenössische Technische Hochschule, Laboratorium für Organische Chemie, Universitätsstraße 16, CH-8092 Zürich Prof. Dr. G. Tölg, Institut für Spektrochemie, Postfach 778, 4600 Dortmund 1 Prof. Thomas S. West, Macaulay Institute for Soil Research, Craigiebuckler, Aberdeen AB92QJ, U.K.

3 Horst Wagner Ewald Blasius (Hrsg.) Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden Mit 141 Abbildungen und 42 Tabellen Springer-Verlag Berlin Heidelberg NewYork London Paris Toyko

4 ISBN-13: DOI: / e-isbn-13: CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden / Horst Wagner; Ewald Blasius (Hrsg.). - Berlin ; Heidelberg ; New York ; London ; Paris; Tokyo : Springer, 1989 (Anleitungen für die chemische Laboratoriumspraxis ; Bd. 23) ISBN (Berlin... ) ISBN (New York... ) NE: Wagner, Horst [Hrsg.]; GT Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdruckes, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der Fassung vom 24. Juni 1985 zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. by Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 1989 Softcover reprint ofthe hardcover 1st edition 1989 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Druck: Kutschbach, Berlin. Bindearbeiten: Lüderitz & Bauer, Berlin 2152/ Gedruckt auf säurefreiem Papier

5 Autorenverzeichnis Dr. A. Görg, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie, 8050 Freising-Weihenstephan Dr.-Ing. S. Günther, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie, 8050 Freising-Weihenstephan Dipl.-Chem. S. Hoffstetter, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik und Radiochemie, 6600 Saarbrücken Professor Dr. Dr. J. Klose, Freie Universität Berlin, Universitätsklinikum Charlottenburg, Institut für Toxikologie und Embryonalpharmakologie, Garystraße 5, 1000 Berlin 33 Dr. R. Kuhn, derzeitige Adresse: Analytical Research and Development, Pharma Division, Sandoz Ltd, Basel, Schweiz Prof. Dr. W Postei, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie, 8050 Freising-Weihenstephan Prof. Dr. G. M. Rothe, Johannes Gutenberg-Universität, Fachbereich 21 Biologie, Institut für Allgemeine Botanik, Postfach 3980, 6500 Mainz M. Schmid, Techn. Ass., Freie Universität Berlin. Universitätsklinikum Charlottenburg, Institut für. Toxikologie und Embryonalpharmakologie, Garystraße 5, 1000 Berlin 33 Prof. Dr. H. Wagner, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik und Radiochemie, 6600 Saarbrücken Dr.-Ing. R. Westermeier, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie, 8050 Freising-Weihenstephan Dr. K. Ziegler, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik und Radiochemie, 6600 Saarbrücken

6 Vorwort Dieser Band, entstanden durch die Zusammenarbeit verschiedener Autoren mit großer praktischer Erfahrung, ist ein wichtiger Beitrag zur Literatur über die Elektrophorese. Sein Hauptaugenmerk liegt auf den elektrophoretischen Methoden; es wird daher den Anfängern und Studenten als dringend benötigte Einführung dienen. Die große Themenbreite und die Güte der Darstellung machen das Werk auch zu einer wertvollen Referenz für etfahrene Praktiker. Die Nützlichkeit der Elektrophorese für die Analyse komplexer Proteinmischungen wurde zum ersten Mal vor 50 Jahren durch Tiselius in seinen mit dem Nobelpreis ausgezeichneten Arbeiten demonstriert. Sein elegant konstruierter Apparat wurde jedoch bald durch viel einfachere und breiter anwendbare Methoden, wie Papieroder Gelelektrophorese, ersetzt. Aus diesen Methoden entwickelten sich die Molekularsieb-, Disk-, SDS- und Immunelektrophorese und die isoelektrische Fokussierung. Alle diese Methoden arbeiteten mit einer hervorragenden Auflösung. Heutzutage ist die zweidimensionale Elektrophorese die ausgefeilteste Methode in der Proteinanalyse. Darüber hinaus hat sich die Gelelektrophorese vor kurzem als einzigartiges Werkzeug für die DNA-Sequenzierung erwiesen. Das Verständnis der theoretischen Aspekte der Elektrophorese verdanken wir zu einem großen Teil den bahnbrechenden Arbeiten von Kohlrausch vor fast 100 Jahren. Die Prozesse sind jedoch zu komplex, um einer mathematisch-analytischen Lösung zugänglich zu sein. Die diesen Prozessen zu Grunde liegenden Transportgleichungen und chemischen Gleichgewichte lassen sich am besten durch eine Computersimulation verständlich machen. Einige elektrohydrodynamische Effekte sind nach wie vor zu einem großen Teil unbekannt und bilden gegenwärtig den Gegenstand aktiver Forschung. Eine besondere Herausforderung in der modemen Biotechnologie ist die Anpassung der Elektrophorese an großtechnische Reinigungsverfahren. Die präparative Elektrophorese in Lösung geht noch auf die Zeit vor Tiselius zurück, das große Potential dieser Methoden ist jedoch bisher zum größten Teil unbemerkt geblieben. Nur wenige Zentren widmen sich der systematischen Forschung auf diesem Gebiet, München, Saarbrücken, Harwell und Tucson, um nur die wichtigsten zu nennen. In Lehre und Forschung muß noch viel Arbeit bewältigt werden. Es ist daher offensichtlich, daß die Elektrophorese trotz ihres bewundernswürdigen Alters eine lebendige Wissenschaft und ein fruchtbarer Boden für innovative Forschung geblieben ist. Ihre Anwendungsbreite reicht von Ionen mit geringem Mole-

7 VIII Vorwort kulargewicht bis zu lebenden Zellen, ihren Organellen und sogar intakten Chromosomen. In der Tat wurden einige der wichtigsten elektrophore tischen Anwendungen erst in den letzten beiden Jahrzehnten entwickelt, andere werden sich in allernächster Zukunft ergeben. Beispiele für das letztere sind die Elektrophorese im Mikrogravitationsfeld einer Raumstation und die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Tucson, USA Oktober 1988 Milan Bier

8 Inhaltsverzeichnis Theorie der elektrischen Wanderung (H. Wagner, R. Kuhn, S. Hoffstetter) 1 Einleitung Grundlagen..., Einflüsse auf die Wanderungsgeschwindigkeit Eigenschaften des geladenen Teilchens Eigenschaften des Mediums Einfluß der Ionenstärke Einfluß des ph-wertes Einfluß der Komplexbildnerkonzentration Einfluß der Temperatur Einfluß des elektrischen Feldes Einfluß des Trägermaterials Ionenwanderung im Träger Elektroosmose Sogströmung Prinzipien elektrophoretischer Trennmethoden Zonenelektrophorese Methode der wandernden Grenzflächen Isotachophorese Isoelektrische Fokussierung Literatur Praxis der eindimensionalen Gelelektrophorese (G. M. Rothe) 1 Allgemeines zur Arbeitstechnik Elektrophoreseapparaturen Geräte für die horizontale Elektrophorese Geräte für die vertikale Elektrophorese... 24

9 x Inhaltsverzeichnis 3 Die einzelnen Elektrophoreseverfahren Die Cellogel- und Zelluloseacetat-Elektrophorese Die Cellogel-Elektrophorese Anwendungsbeispiele Lipoprotein-Muster im Zuge von Hyperlipämien LDH-Muster Die Zelluloseacetat-Elektrophorese Vorbereitung der Membranen und Einsatz in der Elektrophoreseapparatur Anwendungsbeispiele Adenylat Kinase Die Agar- und Agarose-Elektrophorese Eigenschaften von Agar und Agarose Allgemeines zur Agarose-Elektrophorese Herstellung von Agarose Flachgelen zur Trennung von DNA-Molekülen nach Schaffner Aufbau einer Flachgelelektrophorese-Apparatur zur Trennung von DNA-Molekülen Probenauftrag AnHüben auf DNA Bestimmung der Molmasse von DNA-Bruchstücken Elution der DNA aus Agarosegelen Anwendungsbeispiel Die Stärkegel-Elektrophorese Herstellung von Stärkegelen Apparative Ausrüstung Anwendungsbeispiele Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese Allgemeines zur Technik Homogene Gele Bestimmung der Größe von DNA-Bruchstücken< 1 Kilobasen Abhängigkeit des Fraktionierbereiches von der Polyacrylamid Konzentration Herstellung homogener Flachgele Elektrophoresebedingungen Elution von DNA aus Polyacrylamidgelen Herstellung dünner Flachgele Die Bestimmung verschiedener Isozym-Typen Definition des Begriffs Isozym Herstellen der Gel- und Elektrodenlösungen Eichbeziehungen zur Ermittlung von ladungs- bzw. molmassenisomeren Isozymen Molmassenbestimmung in homogenen SDS-Gelen Allgemeines zur Technik Die Verwendung homogener Gele... 55

10 Inhaltsverzeichnis XI Gradientengel-Elektrophorese Allgemeines zur Technik Das Herstellen linearer Gradientengele Die Herstellung von Glaskassetten Das Gießen linearer Gelgradienten Die Bestimmung der molekularen Größe nativer Proteine Die Bestimmung der maximalen Wanderungsstrecke von Proteinen Das Trennverhalten ladungsisomerer Proteine Das Trennverhalten molmassenisomerer Proteine Die Ermittlung des Stokes-Radius nativer Proteine Die Bestimmung der Molmasse nativer Proteine Die Bestimmung der Molmasse SDSdenaturierter Proteine Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen Affinitäts-Elektrophorese Anwendungsbeispiele Literatur 89 Praxis der Papier-, Dünnschicht- bzw. Säulenelektrophorese und Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der anorganischen Chemie (K. Ziegl~r) 1 Allgemeine Gesichtspunkte zur Arbeitstechnik Trägermaterialien Papiere Trägermaterialien für die Dünnschichtelektrophorese Trägermaterialien für die Säulenelektrophorese Grundelektrolyt Auftragung der Probe Auswertung der Pherogramme Papier- bzw. Dünnschichtelektrophorese Qualitative Auswertung Quantitative Auswertung Direktbestimmungsmethoden Elutionsmethoden Säulenelektrophorese Apparaturen Papier- bzw. Dünnschichtelektrophorese Säulenelektrophorese

11 XII Inhaltsverzeichnis 3 Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der anorganischen Chemie Polyanionen Polysulfandisulfonate S und 75Se markierte Polyselenandisulfonate und Polysulfanselenandisulfonate Polysulfandiphosphonate und -phosphonsulfonate Halogenohydroborate Chemisch ähnliche Anionen CIOj, CIO.j, Br03' IOj und 1O.j Carbonsäure- bzw. Sulfonsäureanionen Anionen aus radioaktiven Abfallösungen Metallkomplexe Gemischtligandkomplexe von Pt-Elementen Chloro-aquo-rhodium (III)-Kompiexe Cliloro-bromo-iridate (IV) Gemischtligandkomplexe des Cr(III) Cyanato-ethylendiamin-chrom(III) Thiocyanato-8-hydroxychinolino-chrom(III)-Komplexe Rutheniumkomplexe in radioaktiven Abfallösungen Kationische Rutheniumnitrosylnitrato-Komplexe Umwandlung der Rutheniumnitrosylnitrato-Komplexe Gleichgewichtseinstellung einer frisch hergestellten salpetersauren Rutheniumnitrosylnitratokomplexlösung bei Zimmertemperatur Umwandlung einzelner isolierter Komplexe in Abhängigkeit von der Lagerzeit und der Temperatur Verhalten bei Gefriertrocknung Verhalten beim Eindampfen und Calcinieren Literatur Praxis der ultradünnschicht-isoelektrischen Fokussierung mit 'frägerampholyten und immobilisierten ph-gradienten (A. Görg, W. Postei, S. Günther, R. Westermeier) 1 Allgemeine Gesichtspunkte zur Arbeitstechnik Apparaturen Stromversorgung Trennkammern Kühlung Herstellung ultradünner Gele für die IEF mit Trägerampholyten Herstellung dünner Flachgele für die IEF in immobilisierten ph-gradienten

12 Inhaltsverzeichnis XIII 2 Isoelektrische Fokussierung IEF mit Trägerampholyten Eigenschaften der Trägerampholyte Wahl des pr-gradienten Gel-Zusammensetzung Probenvorbereitung und -applikation Trennbedingungen Titrationskurven IEF mit immobilisierten pr-gradienten Eigenschaften der Immobiline Wahl des pr-gradienten Gel-Zusammensetzung Probenvorbereitung und -applikation Trennbedingungen Bestimmung der pi-werte Einflußfaktoren auf den pi-wert pi-messung Visualisierungsmethoden Proteine Glykoprotein- und Lipoproteinanfärbung Peptidanfärbung Enzymanfärbung Print-Techniken Immunofixation und Immunoprint Autoradiographie Aufbewahrung und Dokumentation Trocknung der Gele Densitometrie Photographie Weitere horizontale Ultradünnschicht-Elektrophorese-Verfahren Polyacrylamidgel-Elektrophorese Disk-Elektrophorese Gradientengel-Elektrophorese SDS-Elektrophorese Zweidimensionale Elektrophorese Versuche zur isoelektrischen Fokussierung IEF mit Trägerampholyten IEF im immobilisierten pr-gradienten IEF im ultraengen immobilisierten pr-gradienten IEF mit Immobiline-Fertiggelen (DryPlates) IEF im immobilisierten pr-gradienten für die Rochauflösende 2D-Elektrophorese von Bohnensamenproteinen Literatur

13 XIV Inhaltsverzeichnis Praxis der zwei-dimensionalen Elektrophorese von Proteinen (1. Klose, M. Schmid) 1 Einleitung Arbeitstechnik Charakterisierung der zwei-dimensionalen Elektrophorese Apparaturen Gerät für die isoelektrische Fokussierung Geräte für die Elektrophorese Stromgeräte Geräte zur Geltrocknung Geräte zur Auswertung Gele und Lösungen Gele und Lösungen für die isoelektrische Fokussierung Gele und Lösungen für die Elektrophorese Lösungen für die Färbung Lösungen für die Fluorographie Versuchsdurchführung Versuch 1: 2DE in kleinen Gelen (SG-Technik) Probenherstellung Isoelektrische Fokussierung Elektrophorese Färbung Auswertung der Proteinmuster Versuch 2: 2DE in mittelgroßen Gelen (MG-Technik) Probenherstellung Isoelektrische Fokussierung Elektrophorese Fluorographie Auswertung der Proteinmuster Literatur Praxis der präparativen Free-Flow-Elektrophorese (H. Wagner, R. Kuhn, S. Hoffstetter) 1 Einleitung und geschichtliche Entwicklung Trennapparatur Einleitung Beschreibung der Apparatur Elphor VaP Das Detektionssystem Strömungsprofile

14 Inhaltsverzeichnis XV 3 Trennmethoden Zonenelektrophorese Prinzip Anwendung Beispiel Isotachophorese Prinzip Anwendung Beispiele Isoelektrische Fokussierung Isoelektrische Fokussierung im linearen pr-gradienten Prinzip Anwendung Beispiel Isoelektrisclie Fokussierung im stufenförmigen pr-gradienten Prinzip Anwendung Beispiele Feldsprungelektrophorese Prinzip Anwendung Beispiele Spezielle Trennapparaturen Einleitung Biostream-Apparatur RIEF-Apparatur Anhang Tabellen Anwendungen der Free-Flow-Elektrophorese Literatur Sachverzeichnis