Abschlussbericht Rise Weltweit

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1 Abschlussbericht Rise Weltweit von Alexandra Rottenkolber DAAD Rise worldwide Praktikum vom am International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw Fachlicher Teil Ich habe im Herbst 2014 angefangen, an der Universität Heidelberg Molekulare Biotechnologie zu studieren. Das erste Jahr des Studiums bestand, wie in vielen anderen Studiengängen auch, hauptsächlich aus theoretischer Grundlagenvermittlung. Es war kein biologisches Praktikum vorgesehen. Ich wollte aber sehr gerne ein biologisches Praktikum machen, das mit zeigen sollte, ob mir dieses Fach wirklich Spaß macht und ich in diesem Gebiet später arbeiten möchte. Ich konnte mir am Anfang des Studiums nicht vorstellen, wie das Berufsleben als Biotechnologe aussehen würde. Im DAAD Rise Weltweit Programm habe ich darum die Chance gesehen, genau dies herauszufinden und auch meine Motivation und Freude für mein Studienfach zu vermehren. Polen als Land habe ich mir ausgesucht, da ich dort nach dem Abitur einen Internationalen Jugendfreiwilligendienst geleistet habe und gerne zurückkehren wollte, um auch meine Sprachkenntnisse in Polnisch zu verbessern. Ich bekam eine Praktikumsstelle für 6 Wochen im Laboratory of Bioinformatics and Protein Engineering am International Institute of Molecular and Cell Biology. In dem Labor wird theoretisch (dry lab) und experimentell (wet lab) an den Beziehungen zwischen der Sequenz, der Struktur und der Funktion von Proteinen, Nucleinsäuren und Makromolekülen geforscht. Das dry lab beschäftigt sich mit der Entwicklung von Computersoftware zur Analyse dieser Makromoleküle, beziehungsweise von RNA und RNA- Protein- Komplexe. Im wet lab wird an den Sequenz- Struktur- Funktion- Interaktionen mit Hilfe von Methoden aus den Bereichen der Biochemie, Biophysik, Molekularbiologie und Zellbiologie geforscht. Gene cloning, die Synthese von Nukleinsäuren, Protein und RNA Überexpression, Purifikation des Produkts, Entwicklung von in vitro und in vivo functional assays kommen zum Einsatz um funktionelle Vorhersagen zu treffen. Crosslinking, mass spectroscopy, chemical modification, und circular dichroism werden genutzt, um die Struktur von RNA und Proteinen zu erforschen und mit Hilfe von Protein engineering werden Enzyme mit neuen nützlichen Eigenschaften oder veränderter Substratspezifizität entwickelt, so zum Beispiel Nucleasen, welche bestimmte Sequenzen in DNA oder RNA erkennen und spezifisch schneiden. Die Wissenschaftler im dry lab und wet lab arbeiten zusammen: es gibt wöchentliche Meetings, in denen die Arbeitsergebnisse der letzten Wochen vorgestellt und diskutiert werden. An diesen Seminaren nahm ich auch stets teil, sodass ich auch viele Einblicke in Bereiche außerhalb meines Arbeitsfeldes erhielt.

2 Als ich mein Praktikum begann, hatte ich gerade das zweite Semester meines Studiums beendet und noch keinerlei praktische Erfahrung und kein Wissen über die Arbeit in einem biologischen Labor. So brachte mir mein Supervisor in den ersten zwei Wochen die grundlegenden Labortechniken bei: Pipettieren, Herstellung verschiedener Gele und weitere experimentelle Methoden. Nach diesen zwei Wochen des Einarbeitens erhielt ich mein eigenes kleines Projekt. Es war ein Teil von dem Projekt meines Supervisors, sodass wir weiterhin stets zusammenarbeiteten: Die Untersuchung der Sekundärstruktur von RNA während eine RNase namens MiniIII gebunden ist. MiniIII ist eine Endoribonuclease aus dem Bakterium Bacillus Subtilis und gehört zur RNaseIII Superfamily. Interessant dabei ist, dass MiniIII keine dsrna binding domain besitzt, die alle anderen Mitglieder dieser Familie haben. MiniIII ist ein Monomer, formt aber, wenn sie dsrna bindet um diese zu schneiden, ein Homodimer. MiniIII schneidet dsrna sequenzspezifisch, indem sie Phosphodiesterbindungen hydrolysiert. Für das Schneiden der dsrna sind Mg 2+ Ionen notwendig, während MiniIII dsrna auch ohne Mg 2+ Ionen binden kann. Dies ist ein sehr wichtiger Punkt, da wir uns dies in unseren Experimenten zunutze machten. In unserem Experiment nutzten wir eine besondere Variante von MiniIII, single chain MiniIII genannt, welche aus zwei Monomeren bestand, die durch einen nicht flexiblen Linker verbunden waren. Mit unserem Experiment wollten wir zwei verschiedene Fragestellungen beantworten: Zum einen, wollten wir herausfinden, ob MiniIII, während sie an die dsrna gebunden ist, die Helixstruktur der RNA öffnet, oder ob die Struktur geschlossen bleibt. Unsere Idee für ein Experiment ist in folgernder Abbildung veranschaulicht: Abb. 1: Konzept des ersten Experimentes Wir präparierten eine Probe mit MiniIII aber ohne Mg 2+, sodass MiniIII zwar binden aber die dsrna nicht schneiden kann. Außerdem fügten wir noch eine RNase, welche ssrna scheiden kann (RNase T/A), zu unserer Probe dazu. Nun gab es zwei Möglichkeiten: 1. Wenn nun MiniIII die Doppelhelix öffnen sollte, so hätte RNase T/A die Möglichkeit, den einzelsträngigen Teil zu schneiden und wir würden im Gel mehrere Balken niedrigerer Level erhalten. 2. Wenn MiniIII jedoch keinen Einfluss auf die Struktur der Doppelhelix hat, so bliebe die RNase T/A ohne Wirkung und wir würden im Gel keine RNA Fragmente erhalten. Control und Reaction würden sich nicht unterscheiden.

3 Die Fragmente wollten wir durch ein isotope label sichtbar machen. Leider blieb der erste Versuch ohne Ergebnis und um das ganze Experiment zu beenden, blieb nicht mehr genug Zeit. Die zweite Frage, die wir versuchten zu beantworten, war, ob es eine Konformationsänderung in der dsrna gibt, wenn MiniIII bindet. Dies wollten wir mit Hilfe des Circular Dichroisms herausfinden. Doch bevor wir dieses Experiment durchführen konnten, mussten wir unsere dsrna synthetisieren. Dazu vervielfältigten wir unser dsdna Fragment via PCR und isolierten es nachdem die Reaktion abgeschlossen war. Schließlich bereiteten wir eine Overnight Reaction vor mit T7 RNA polymerase, welche ssrna produzierte, und phi6 replicase, welche sich dann an das ssrna Fragment anheftete und einen komplementären Stang erstellte. So konnten wir letztendlich dsrna purifizieren, indem wir sie mit LiCl ausfällten. Nun konnten wir mit dem Cicular Dichroism Experiment beginnen. Als Circular Dichroism (CD) wird die Differenz in der Absorption von linkshändig polarisiertem Licht und rechtshändig polarisiertem Licht bezeichnet. CD entsteht, wenn ein Molekül eine oder mehr optisch aktive Untereinheiten enthält; also chirale Untereinheiten, licht- absorbierende Gruppen, oder wenn das Molekül an sich chiral ist. Wenn nun also links- oder rechtshändig- polarisiertes Licht ein optisch aktives Medium passiert, so kann, wenn das Licht das Medium wieder verlässt, ein Unterschied in der Geschwindigkeit, der Wellenlänge und der Menge der Absorption detektiert werden. Dieser Unterschied in der Absorption wird als Circular Dichroism bezeichnet. Die Spektren von verschiedenen Proteinstrukturen und Nuleinsäuren unterscheiden sich immens, sodass aus dem Spektrum Rückschlüsse auf den Aufbau der z.b. Proteins gezogen werden können. Außerdem ist das erhaltene Spektrum abhängig von der molekularen Konformation des Moleküls, und somit indirekt auch von der Temperatur und den Pufferbedingungen. Wir führten in unserem Versuch drei Experimente durch: wir untersuchten das Spektrum vom MiniIII, dsrna und dsrna+miniiii (Abb. 2, Abb. 3, Abb. 4). Abb. 2: Spektrum von MiniIII Abb. 3: Spektrum von dsrna Abb. 4: Spektrum von dsrna und MiniIII Wir nahmen ein Spektrum im UV- Lichtbereich und von 25 C 95 C auf. Das Spektrum von MiniIII entsprach genau unseren Erwartungen, da wir ein typisches Proteinspektrum, eine Art W, also eine Kurve an der Kante mit 2 Tälern, erhielten. Dieses W ist charakteristisch für α- Helices und lässt darauf schließen, dass MiniIII diese enthält. Auch kann man sehen, dass wir über 45 C kein Signal mehr vom Protein erhielten die Ebene ist gleichmäßig hellblau was darauf schließen lässt, dass unser Protein ab dieser Temperatur denaturiert war.

4 Auch für die dsrna erhielten wir ein Spektrum, typisch für Nukleinsäuren. Das große Tal und der hohe Peak repräsentieren das rechthändig und linkshändig polarisierte Licht. Außerdem lässt sich erkennen, dass das Signal abfällt, je mehr die RNA erwärmt wurde. Dies hängt mit dem Schmelzen der RNA zusammen und der Auflösung der Sekundärstruktur. Für die Probe in der MiniIII und die dsrna waren, erhielten wir ein relativ schlechtes Signal. Um trotzdem noch einige Informationen aus unserem Spektrum zu erhalten, schnitten wir aus dem Spektrum von der dsrna und dem der dsrna+miniiii eine Scheibe aus der Ebene bei 264 nm (Peak) aus und verglichen die Graphen (Abb. 5.) Die Graphen glichen annähernd der zu erwartenden Schmelzkurve für dsrna. Außerdem ist ein Unterschied zwischen den beiden Kurven zu sehen, woraus sich schließen lässt, dass MiniIII irgendeinen Einfluss auf die Struktur der RNA hat. Genauere Schlüsse konnten wir aus diesem Experiment allerdings nicht ziehen, da MiniIII ab 45 C denaturiert und inaktiv war und so keinen großen Einfluss zeigte. So sollte dieses Experiment noch einmal mit einer kürzeren dsrna Abb. 5. Schmelzkurve von dsrna (rot) und dsrna+miniiii (blau) wiederholt werden, welche dann eine niedrigere Schmelztemperatur hat, sodass das Schmelzen während des Temperaturfensters stattfindet, in dem das Protein immer noch aktiv ist. Allgemeiner Teil Ich habe die 6 Wochen, welche ich jetzt in Polen verbracht habe, in sehr guter Erinnerung. Ich bin jeden Tag sehr gerne ins Labor gegangen, ich habe extrem viel gelernt ich konnte meinem Wissenszuwachs praktisch zuschauen und hatte auch viel Freude daran, außerhalb vom Labor Warschau zu entdecken. Um nach Polen zu reisen, ist es nicht nötig ein Visum zu beantragen und für einen Aufenthalt von 6 Wochen sind auch keine weiteren formellen Maßnahmen nötig. Größere Reisevorbereitungen sind auch nicht zu treffen, außer vielleicht, sich mit Hilfe eines Länderführers ein bisschen mit Land und Leute bekannt zu machen. Wer nicht gerne Reiseführer liest, dem sind die Bücher von Steffen Möller zu empfehlen, welcher dem Leser, durch Anekdoten und Geschichten und Situationen aus dem alltäglichen Leben, sehr gut ein großes Stück Allgemeinbildung und ein Gefühl für Polen zu vermitteln mag. Das DPJW (Deutsch- polnische Jugendwerk) bietet zahlreiche Bücher zum Spracherwerb und zur Information über Polen an, die einfach und ohne größeren Aufwand auf der Internetseite bestellt werden können (oftmals nur für kleines Geld). Für den Geldtransfer kann ich Konten bei der Deutschen Bank oder der Online- Bank DKB empfehlen. Die Deutsche Bank hat viele Filialen in Polen, in denen man problemlos und ohne Gebühren mit der Giro Card Geld abheben kann. Mit einer Kreditkarte der DKB

5 geht dies genauso, allerdings anders als bei der Deutschen Bank, an jedem beliebigen Geldautomaten. Für Reisen in Polen, kann ich folgende Internetseiten empfehlen: Entweder man bucht sein Ticket direkt bei der polnischen Bahn (PKP) ( oder man benutzt diese Vergleichsseite podroznik.pl, um die richtige Verbindung zu finden. Außerdem ist das Busverkehrsnetz in Polen extrem gut ausgebaut: eigentlich jede Stadt hat ihre eigenen Fernbusse (PKS). Diese findet man, in dem man nach PKS + Name der Stadt bei Google sucht (z.b.: für Jelenia Góra). Für günstige Reisen zwischen größeren Städten ist das Fernbusunternehmen Polskibus ( zu empfehlen. Hier gibt es oft extrem günstige Reiseangebote. Auf der Website Jakdojade ( finden sich die Verbindungen des öffentlichen Stadtverkehrs in größeren Städten (wie Warschau, Poznań, Krakau, Białystok oder Zielona Góra). Wichtig zu wissen ist auch, dass es nicht zwingend notwendig ist, die Bahntickets oder Bustickets im vorherein zu kaufen, da man diese auch stets erst im Bus oder in der Bahn erwerben kann. Allerdings empfiehlt es sich, Polskibustickets bereits vor Reisebeginn zu erwerben, da diese Busse extrem beliebt und schnell ausgebucht sind. Wenn man an der Sprache und den Leute interessiert ist, kann ich es sehr empfehlen, sich eine WG zu suchen. In Polen ist es auch nicht ungewöhnlich, dass oft Leute, die bereits mit ihrer Ausbildung fertig sind und arbeiten, in einer WG zusammen leben. Meist ist es auch nicht schwierig, eine Unterkunft zu finden, wenn man nur für einen kurzen Zeitraum, wie etwa für 2 Monate ein Zimmer sucht. Oftmals gibt es auch die Möglichkeit ein Zimmer im Studentenwohnheim zu bewohnen, allerdings ist dies nicht immer empfehlenswert. Im Sommer bieten viele Sprachschulen Intensivkurse (mit Stunden Sprachunterricht in der Woche) an. Zeitlich wird es jedoch kaum möglich sein, einen solchen zu besuchen, wenn ein Praktikum zu absolvieren ist. So ist wahrscheinlich die beste Option, sich einen privaten Sprachkurs, und/oder einen polnischen Tandem- Gesprächspartner zu suchen, der mit euch polnisch und ihr mit ihm deutsch sprecht. Wenn man noch während des Semesters nach Polen kommt, lohnt sich auf jeden Fall ein Blick auf die Seiten der Universität, denn diese bieten oft Sprachkurse für ausländische Studenten an. Ansonsten lohnt es sich immer sehr, etwas zu unternehmen, um mit Leuten in Kontakt zu kommen und so viel wie möglich mitzunehmen. Polen ist ein unglaublich spannendes Land, sowohl historisch als auch kulturell gesehen und es lohnt sich sehr und macht riesen Spaß, sich mit dem Land und den Menschen zu beschäftigen. Es gibt immer sehr viel zu entdecken und zu sehen. Ich habe die Polen als ein sehr gastfreundliches Völkchen kennengelernt: wenn man ihnen mit Offenheit begegnet, wird man rasch von ihnen ins Herz geschlossen. Ich kann es nur jedem wärmstens empfehlen, dieses Land zu bereisen.