Regulation des camp Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren

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1 Regulation des camp Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Katharina Hubertus aus Stuttgart Würzburg 2012

2 Eingereicht am: 23.März 2012 Mitglieder der Promotionskommission: Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rössler, Dekan der Fakultät für Biologie Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Walter Gutachter: Prof. Dr. Thomas Dandekar Tag des Promotionskolloquiums: 02.Juli 2012 Doktorurkunde ausgehändigt am:...

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. ZUSAMMENFASSUNG Englisch Deutsch EINLEITUNG Das Blutplättchen Plättchen Aktivierung und Hemmung Physiologische Plättchen Aktivierung Physiologische Plättchen Hemmung Medizinische Bedeutung Prostanoide: Struktur und Synthese Die Prostaglandin E Synthase PTGES Prostanoid-Rezeptoren Der Thromboxanrezeptor TP Rezeptor Der Prostaglandin F Rezeptor FP Rezeptor Der Prostacyclin Rezeptor IP Rezeptor Der Prostaglandin E Rezeptor EP Rezeptor Der EP1 Rezeptor Der EP2 Rezeptor Der EP3 Rezeptor Der EP4 Rezeptor Der Prostaglandin D Rezeptor DP Rezeptor Funktion des G-Proteins Zielsetzung MATERIALIEN UND METHODEN MATERIALIEN Substanzen, Chemikalien und Lösungen Agonisten und Antagonisten Agonisten Antagonisten Antikörper Primärantikörper Sekundärantikörper Primer... 24

4 Inhaltsverzeichnis Verbrauchsmaterial Geräte METHODEN Methoden zur Blutpräparation Blutabnahme Isolation von gewaschenen Plättchen WPs mit EGTA Isolation von gewaschenen Plättchen ohne EGTA Zellzählung Methoden zur Bestimmung der Plättchenaktivierung Aggregationsmessung Bestimmung der Serotonin-Sekretion PGE 2 -Assay Methoden zur Bestimmung der Plättchenhemmung VASP-POD-Assay camp-assay EIA Proteinbiochemische Methoden Wet-Western Blot Membran/Cytosoltrennung Pull Down Assay Bicinchoninsäure BCA-Assay Probenherstellung für Elektronenmikroskopie Molekularbiologische Methoden mrna Isolation aus humanen Plättchen Reverse Transkription der mrna in cdna PCR Polymerase Chain Reaction Sequenzierung Klonierung ERGEBNISSE Mehrere Prostanoid-Rezeptoren regulieren die Funktion und den camp Spiegel in humanen Plättchen Einfluss des DP1 Rezeptors auf die Plättchenfunktion Funktioneller Nachweis des EP2 Rezeptors in humanen Plättchen Nachweis des EP3 Rezeptors in humanen Plättchen Untersuchung der EP3 Rezeptor Isoformen... 55

5 Inhaltsverzeichnis Einfluss des EP3 Rezeptors auf die Plättchenfunktion Funktion des EP4 Rezeptors in humanen Plättchen Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren Zusammenspiel mehrerer Prostanoid-Rezeptoren auf die Signaltransduktion in humanen Plättchen Die Wirkung von Prostaglandin A 1 auf die Plättchenfunktion und deren Effekt auf verschiedene Prostanoid-Rezeptoren Wirkung von Prostaglandin E 1 auf die Plättchenfunktion und Untersuchung der PGE 1 induzierten Rezeptoren Die Wirkung von Prostaglandin E 2 auf die Plättchenfunktion und Untersuchung der PGE 2 induzierten Rezeptoren Prostaglandin E 2 Generierung in humanen Plättchen und Untersuchung der beteiligten Synthasen und Isomerasen DISKUSSION Mehrere Prostanoid-Rezeptoren regulieren die Funktion und den camp Spiegel in humanen Plättchen Generelle Aspekte der pharmakologischen Untersuchung der Prostanoid- Rezeptoren Einfluss des DP1 Rezeptors auf die Plättchenfunktion Der EP2 Rezeptor und seine Funktion in humanen Plättchen Nachweis des EP3 Rezeptors in humanen Plättchen Untersuchung der EP3 Rezeptor Isoformen Einfluss des EP3 Rezeptors auf die Plättchenfunktion Funktion des EP4 Rezeptors in humanen Blutplättchen Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren Prostaglandin A Die Wirkung von Prostaglandin E 1 auf die Plättchenfunktion und Untersuchung der PGE 1 induzierten Rezeptoren Wirkung von Prostaglandin E 2 auf die Plättchenfunktion und Untersuchung der PGE 2 induzierten Rezeptoren Prostaglandin E 2 Generierung in humanen Plättchen und Untersuchung der beteiligten Synthasen und Isomerasen LITERATUR ABKÜRZUNGEN

6 Zusammenfassung 1. ZUSAMMENFASSUNG 1.1 Englisch Prostanoids are central to the regulation of platelet function in vivo. Besides the wellestablished prostanoids PGI 2 and TxA 2, other prostaglandins like PGA 1, PGE 1 and PGE 2 play an essential role in the regulation of platelet activation and inhibition. Prostaglandins act through specific G-protein coupled receptors. The prostanoid receptor family consists of the TP receptors TPα, TPβ, the IP receptor, the FP receptor, the DP receptors and the EP receptors. Prostanoid receptors are either coupled to adenylyl cyclase via stimulatory or inhibitory G-proteins and thus influence the camp levels or they are coupled to Gq-protein, activating the phospholipase C PLC and influencing calcium levels. An increase in camp levels activates protein kinase A PKA resulting in the phosphorylation of their substrates like the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP. Until now, the existence of different Gα s and Gα i coupled prostanoid receptors in human platelets has not been detected definitely. Aim of the first part of this work was, to identify the exact composition of these receptors in platelets. Therefore, the prostanoid receptors were detected on cdna and protein level. Furthermore, the functionality of the existing receptors was tested by using specific agonists and antagonist. In addition to the well-known IP and TP receptors, we could also establish the expression of three Gα s coupled prostanoid receptors EP2, EP4 and DP1 receptor and one Gα i coupled receptor EP3 receptor. In platelets, all four prostanoid receptors were functional. The EP2, EP4 and DP1 receptors led to activation of the inhibitory signaling pathway, while the EP3 receptor supported the activation of platelets. The first part of this work was essential to provide a basis for the secondary part. It is important to know the exact composition of prostanoid receptors, to examine the physiological role of prostaglandins in platelets. In the second part of this work, the interaction of the different prostanoid receptors was examined, the role of physiological prostaglandins like PGA 1, PGE 1 and PGE 2 was studied in platelets and the receptors involved in the reaction were determined. Therefore specific antagonists were used. We showed that PGA 1 causes an increase in VASP phosphorylation. This effect was mediated by the DP1 and the EP4 receptor but not by the IP receptor. PGE 1 led to an increase of camp level via EP4, EP3, DP1 and IP receptors. Low concentration of PGE 2 decreased the VASP phosphorylation 1

7 Zusammenfassung via the Gα i coupled EP3 receptor. In contrast, high concentrations of PGE 2 increased VASP phosphorylation by the Gα s coupled EP4 receptor. The DP1 and the IP receptor did not seem to be involved in the PGE 2 induced platelet response. By this prostaglandin concentration gradient an exact fine tuning of platelet activation and inhibition can be achieved. Moreover we demonstrated that PGE 2 is generated during platelet activation. The required prostaglandin E synthase PTGES 3 could be detected on cdna level as well as on protein level. Platelet activation and inhibition is controlled through vascular and platelet derived PGE 2, via the different mode of prostanoid receptors actions. In conclusion, the interaction of different prostanoid receptors is an interesting starting point to control platelet activation and inhibition. 1.2 Deutsch Prostanoide nehmen eine zentrale Rolle in der Regulation der Plättchenfunktion in vivo ein. Neben den bereits gut untersuchten Prostanoiden PGI 2 und TxA 2 sind weitere Prostaglandine wie PGA 1, PGE 1 und PGE 2 in der Regulation der Plättchenaktivierung und -hemmung beteiligt. Die Antwort der Prostaglandine wird über spezifische G-Protein gekoppelte Rezeptoren weitergeleitet. Die Gruppe der Prostanoid-Rezeptoren umfasst die TP Rezeptoren TPα, TPβ, den IP Rezeptor, den FP Rezeptor, die DP Rezeptoren sowie die EP Rezeptoren. Prostanoid- Rezeptoren sind entweder über inhibitorische oder stimulatorische G-Proteine an die Adenylyl Cyclase gekoppelt und beeinflussen so den camp Spiegel, oder sie sind an Gq-Proteine gekoppelt, was die Phospholipase C aktiviert und den Calcium Haushalt der Zelle beeinflusst. Ein erhöhter camp Spiegel aktiviert die Proteinkinase A PKA, welche ihrerseits Zielproteine wie das Vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein VASP phosphoryliert. Die Existenz der verschiedenen Gα s und Gα i gekoppelten Prostanoid-Rezeptoren in humanen Blutplättchen wurde bislang nicht eindeutig identifiziert. Ziel im ersten Abschnitt dieser Arbeit war es, die Existenz der Rezeptoren in Plättchen zu klären. Hierzu wurden die Prostanoid-Rezeptoren zunächst auf cdna Ebene und Protein Ebene nachgewiesen. Ferner wurden die vorhandenen Rezeptoren mit spezifischen Agonisten und Antagonisten auf ihre Funktionalität in Plättchen getestet. In dieser Arbeit konnte, neben den bereits gut untersuchten IP und TP Rezeptoren, die 2

8 Zusammenfassung Expression dreier Gα s gekoppelter Prostanoid-Rezeptoren EP2, EP4 und DP1 Rezeptor und eines Gα i gekoppelten Rezeptors EP3 nachgewiesen werden. Alle vier Prostanoid-Rezeptoren waren in Plättchen funktional. Die EP2, EP4 und DP1 Rezeptoren führten zu einer Aktivierung des hemmenden Plättchensignalweges, während der EP3 Rezeptor den aktivierenden Plättchensignalweg unterstützte. Dieser erste Abschnitt war essentiell um die Grundlage für den zweiten Abschnitt dieser Arbeit zu schaffen. Nur wenn die genaue Zusammensetzung der Prostanoid- Rezeptoren bekannt ist, kann die Rolle physiologischer Prostaglandine in Plättchen untersucht werden. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde das Zusammenspiel der Prostanoid- Rezeptoren dargestellt. Weiter wurden physiologische Prostaglandine wie PGA 1, PGE 1 und PGE 2 auf ihre Rolle in der Plättchenfunktion untersucht und ermittelt, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Antwort induziert wird. Hierzu kamen spezifische Antagonisten zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass PGA 1 zu einer vermehrten Phosphorylierung von VASP führt. Diese Antwort wurde über den DP1 und den EP4 Rezeptor vermittelt, jedoch nicht über den IP Rezeptor. PGE 1 führte zu einem Anstieg des camp Spiegels durch den EP4, den EP3, den DP1 und den IP Rezeptor. PGE 2 führte in niedrigen Konzentrationen zu einer Hemmung der VASP Phosphorylierung über den Gα i gekoppelten EP3 Rezeptor; in hohen PGE 2 Konzentrationen zu einem Anstieg der VASP Phosphorylierung durch den Gα s gekoppelten EP4 Rezeptor. Der DP1 und der IP Rezeptor scheinen an der PGE 2 vermittelten Plättchen Antwort nicht beteiligt zu sein. Dadurch entsteht ein differenziertes Feintuning in der Regulation zwischen Plättchenaktivierung und hemmung, das durch Konzentrationsgradienten der Prostaglandine beeinflusst werden kann. Ferner konnte gezeigt werden, dass PGE 2 bei einer Aktivierung von Plättchen generiert wird. Die verantwortliche Prostaglandin E Synthase PTGES 3 konnte sowohl auf cdna Ebene als auch auf Protein Ebene nachgewiesen werden. Durch die unterschiedliche Wirkungsweise der Prostanoid-Rezeptoren wird die Plättchenaktivierung und -hemmung durch vaskuläres und thrombozytär gebildetes PGE 2 kontrolliert. Damit stellt die Interaktion der unterschiedlichen Prostanoid-Rezeptoren einen interessanten Ansatzpunkt zur Kontrolle der Plättchenaktivierung und -hemmung dar. 3

9 Einleitung 2.EINLEITUNG 2.1 Das Blutplättchen Thrombozyten sind die kleinsten Zellen im Blut und erreichen einen Durchmesser von 1-3µm [1]. Sie sind keine klassischen Zellen, da sie keinen Kern und keine DNA enthalten, weshalb sie als anukleäre Zellen bezeichnet werden. Somit sind sie nicht zur Teilung und nur teilweise zur eigenen Proteinsynthese fähig. Thrombozyten entstehen durch Abschnürung von Megakaryozyten, die sich im Knochenmark befinden. Im Laufe eines Lebens solch einer Knochenmarksriesenzelle können sich mehrere tausend Thrombozyten abschnüren. Die physiologische Thrombozytenzahl im peripheren Blut eines Erwachsenen beträgt zwischen pro µl Blut. Die Überlebenszeit von Thrombozyten beläuft sich in etwa auf 7 Tage. Ihr Abbau findet im retikuloendothelialen System der Leber und Milz statt. Im nicht aktivierten Zustand weisen Plättchen eine typische diskoide Form auf, mit einer durchschnittlichen Oberfläche von 8µm 2 [2]. Bei der Aktivierung der Thrombozyten durch lösliche Agonisten oder bei Adhäsion findet eine Formveränderung shape change statt Abbildung1 [3]. Dabei werden Lamellipodien ausgebildet und die Oberfläche vergrößert sich auf bis zu 13µm 2 [2]. Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Blutplättchen. Links: ruhendes Plättchen in typischer diskoider Form. Rechts: aktivierte Blutplättchen nach Ausstülpung der Plasmamembran Lamellipodien. Quelle: Arbeitsgruppen-interne Aufnahmen in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Krohne. 4

10 Einleitung 2.2 Plättchen Aktivierung und Hemmung Physiologische Plättchen Aktivierung Im physiologischen Zustand zirkuliert das Blut in einem geschlossenen Gefäßsystem, ohne dass es zum Sistieren oder Austreten des Blutes kommt. Bei einer Verletzung der Gefäßwand mit nachfolgendem Austritt des Blutes ins umliegende Gewebe, bilden Thrombozyten in Verbindung mit löslichen Plasmakomponenten einen hämostatischen Pfropfen [4]. Der erste Kontakt zwischen Blutplättchen und der Gefäßwand findet über den von-willebrand-faktor statt, der gleichzeitig an Collagen und den Glykoprotein GP Komplex, GPIb-IX-V, auf der Plättchen Oberfläche bindet [5]. Die primäre Adhäsion führt zur Formveränderung und Aktivierung der Plättchen. Im Verlauf der Aktivierung kommt es zur Sekretion von Plättchenaktivatoren aus den im Inneren der Zelle befindlichen Granula, die wiederum andere Plättchen an die betroffene Stelle rekrutieren und aktivieren. Die Thrombozyten vernetzen sich untereinander über Fibrinogen-Brücken, die sich zwischen ihren GP-IIb/IIIa- Rezeptoren bilden. Die Plättchenaggregation wird durch Ausschüttung von sekundären Botenstoffen, wie ADP oder Thromboxan A 2 TxA 2 verstärkt. ADP und TxA 2 stellen Agonisten für G-Protein gekoppelte Rezeptoren auf der Oberfläche der Plättchen dar, was zusätzlich zu einer positiven Rückkopplung führt und somit die initiale Stimulation unterstützt [6, 7]. Um eine effiziente Blutstillung zu erreichen wird nahezu zeitgleich die Gerinnungskaskade aktiviert. Dabei werden Fibrinfibrillen gebildet, die sich an den Thrombus anlagern sekundäre Hämostase Physiologische Plättchen Hemmung Unter physiologischen Bedingungen wird die ungewollte Plättchenaktivierung durch Antagonisten reguliert, die von den Endothelzellen ständig freigesetzt werden [8]. Solche Plättcheninhibitoren sind Prostaglandine wie Prostacyclin PGI 2 und Prostaglandin D 2 PGD 2, Stickstoffmonoxid NO und endothelmembranständige Ektonukleotidasen. Diese Antagonisten stimulieren die Guanylyl Cyclase GC und die Adenylyl Cyclase AC, was wiederum zu einem Anstieg der cyclischen Nukleotide cgmp und camp führt [8]. NO wirkt direkt stimulierend auf die lösliche GC und erhöht den cgmp Spiegel in der Zelle. PGI 2 führt über den Gα s gekoppelten Prostanoid-Rezeptor zur 5

11 Einleitung Aktivierung der membranständigen AC und somit zum Anstieg des camp Spiegels. Eine indirekte Aktivierung der AC findet über Ektonukleotidasen statt. Diese hemmen durch den Abbau des sezernierten ADP den Gα i gekoppelten ADP-Rezeptor, der bei Abwesenheit von Ektonukleotidasen hemmend auf die AC wirkt. Somit wird dieser hemmende Effekt aufgehoben Abbildung 2. Der erhöhte Spiegel an Cyclonukleotiden aktiviert die cgmp- und camp-abhängigen Proteinkinasen PK, die für die Phosphorylierung vieler Proteine verantwortlich sind [9]. Durch diesen Vorgang werden zahlreiche Plättchenfunktionen gehemmt. Der durch Aktivatoren verursachte Anstieg an Calcium wird gehemmt [10], ebenso die Adhäsion [11], Fibrinogenbindung [12], Aggregation [8], Sekretion von Serotonin und die Formveränderung shape change der Plättchen [8]. Die cyclischen Nukleotide regulieren PDEs Phosphodiesterasen und werden ihrerseits wiederum durch PDEs abgebaut. In Plättchen sind drei unterschiedliche Arten von PDEs bekannt, die PDE2, PDE3 und PDE5 [8]. Abbildung 2: Regulationsmechanismen der Plättchenhemmung. Quelle: Abbildung modifiziert nach Schwarz et al.; 2001 [8]. 6

12 Einleitung 2.3 Medizinische Bedeutung Die Hämostase erfordert ein enges Zusammenspiel zwischen Gefäßwand, Blutplättchen und plasmatischen Gerinnungsfaktoren [2]. Im physiologischen Zustand stehen sowohl pro- als auch antithrombotische Mechanismen im Gleichgewicht und verhindern so eine unkontrollierte Thrombusbildung. Wird das Gleichgewicht zu Gunsten des prothrombotischen Zustands verschoben, kommt es zu einer Thromboseneigung thrombophile Diathese. Überwiegen die antithrombotischen und fibrinolytischen Mechanismen, kommt es zu einer Blutungsneigung hämorrhagische Diathese. Ein Blick auf die Statistik der häufigsten Todesursachen weltweit ergibt seit Jahren ein immer gleiches Bild: Die ersten Plätze werden mit großem Abstand von Erkrankungen des Gefäßsystems belegt, allen voran die chronische ischämische Herzerkrankung. Im Jahr 2005 hat diese Erkrankung in Deutschland fast Menschen das Leben gekostet [13]. Durch verschiedene Risikofaktoren wie Bluthochdruck Hypertonie, hohen Cholesterinspiegel Hypercholesterinämie, Tabakkonsum oder Diabetes mellitus [14] entstehen in den Gefäßen Druckschäden und Wirbelbildung, vor allem an Gefäßverzweigungen [15]. Dies führt zu einer Schädigung der innersten Zellschicht der Gefäße, dem Endothel, welches mit den Thrombozyten über die hemmenden Antagonisten in Wechselwirkung steht. Die Folge ist eine erleichterte Aktivierbarkeit der Thrombozyten, was zu einer Anlagerung bzw. Einlagerung von Plättchen führen kann Arteriosklerose und somit das Risiko eines Gefäßverschlusses Thrombose erhöht. Somit steigt auch die Gefahr einer potentiell letalen Erkrankung wie Herzinfarkt oder Schlaganfall [16]. Ziel der medikamentösen Behandlung bei vaskulären Erkrankungen ist es, das Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Hemmung der Thrombozyten herzustellen und zu erhalten, ohne auf der einen Seite einen Gefäßverschluss zu riskieren und auf der anderen Seite eine Blutungsneigung zu erzeugen [17]. Deshalb ist es wichtig, in der Grundlagenforschung die biochemischen Signalwege zu verstehen. Dies bildet den Grundstock, um diese Signalwege gezielt zu manipulieren und für die Entwicklung pharmakologischer Verbindungen zu nutzen. 7

13 Einleitung 2.4 Prostanoide: Struktur und Synthese Alle Prostanoide bestehen aus einer oxidierten Fettsäure aus 20 Kohlenstoff- Atomen, einem Ringsystem, einer trans-doppelbindung zwischen C13 und C14 und einer Hydroxylgruppe an C15. Prostanoide können in Prostaglandine PG und Thromboxane TX klassifiziert werden. Prostaglandine enthalten einen Cyclopentan Ring, während Thromboxane einen Cyclohexan Ring beinhalten [18]. Abbildung 3: Metabolisierung von Arachidonsäure zu unterschiedlichen Prostanoiden. Quelle: Abbildung aus Bos et al.; 2004 [18]. Prostanoide können aufgrund ihrer Instabilität nicht gespeichert werden, sondern werden de novo synthetisiert Abbildung 3. Zellen sind verschiedenen physiologischen und pathologischen Stimuli ausgesetzt, was zu einer Freisetzung von Arachidonsäure durch die Phospholipase A 2 PLA 2 oder Diacylglycerol Lipase aus den Phospholipiden der Membran führt [19]. Arachidonsäure wird in den Prostanoid Ausgangsstoff PGG 2 umgebaut und sofort durch eine Oxidation zu PGH 2 umgelagert. Beide Reaktionen werden durch das Enzym Cyclooxygenase COX katalysiert, welches in zwei Isoformen existiert [18, 20]. Die COX-1 ist für die basale 8

14 Einleitung und konstitutive Prostanoid Synthese verantwortlich, während die COX-2 wichtig für die inflammatorische und induzierte Synthese von Prostanoiden ist [21]. Durch verschiedene Zell-spezifische Isomerasen und Synthasen wird PGH 2 in fünf primäre Prostanoide metabolisiert: das Thromboxan A 2 TxA 2 sowie die vier Prostaglandine PGD 2, PGE 2, PGF 2 und PGI 2 [22]. Prostanoide sind chemisch oder metabolisch unstabil, weshalb sie nur lokal am Ort ihrer Synthese wirken. PGD 2 und PGE 2 dehydrieren in Anwesenheit von Serumalbuminen langsam zu PGA 1 und PGJ Die Prostaglandin E Synthase PTGES 3 Drei Prostaglandin E Synthasen wurden identifiziert, die die Biosynthese von PGE 2 regulieren [23, 24]. Zwei sind membrangebundene Enzyme, die PTGES und PTGES 2 genannt werden. PTGES ist an COX-2 gebunden [25] während PTGES 2 an COX- 1 und -2 gebunden sein kann [26]. Bei dem dritten Enzym handelt es sich um eine cytosolische Prostaglandin E Synthase PTGES 3, die an COX-1 gekoppelt ist [24]. PTGES 3 bildet in ruhenden Zellen einen stabilen Komplex mit HSP-90 [27]. Kobayashi et al. zeigten 2004, dass HSP-90 eine wichtige Rolle in der Regulation des PTGES 3 einnimmt, indem es die Interaktion zwischen PTGES 3 und der Casein Kinase-II CK-II erleichtert. Bei einer Aktivierung der Zelle bildet sich ein tertiärer Komplex aus PTGES 3, HSP-90 und CK-II Abbildung 4. Dies ermöglicht eine Phosphorylierung der PTGES 3 durch CK-II, so dass PTGES 3 optimal aktiviert wird. Folglich nimmt die Affinität zu PGH 2 zu, die Enzymaktivität der PTGES 3 steigt und die PGE 2 Produktion wird erhöht [28]. Abbildung 4: Übersicht über den tertiären Komplex aus PTGES 3, HSP-90 und CK-II in einer aktivierten Zelle. CK-II bindet an einen Komplex aus PTGES 3 und HSP-90 und kann somit PTGES 3 phosphorylieren. Dies führt zur Aktivierung von PTGES 3. Quelle: Abbildung modifiziert nach Forschung_HSP90.htm 9

15 Einleitung 2.5 Prostanoid-Rezeptoren Nach der Freisetzung der in Kapitel 2.4 genannten Prostanoide interagieren diese mit ihrem jeweiligen spezifischen Prostanoid-Rezeptor. Obwohl jedes Prostanoid mit der höchsten Affinität an seinen spezifischen Rezeptor bindet sind Kreuzreaktionen zwischen dem gegebenen Prostanoid und anderen Rezeptoren der Prostanoid- Rezeptor Familie bekannt [29]. Dabei unterscheidet man die Rezeptoren nach den fünf Liganden in fünf Gruppen: TP Rezeptor Thromboxan, DP Rezeptor PGD 2, EP Rezeptor PGE 2, FP Rezeptor PGF 2 und IP Rezeptor PGI 2. In der Gruppe der DP Rezeptoren existieren zwei Isoformen, der DP1 und der DP2 Rezeptor. In der Gruppe der EP Rezeptoren sind 4 Subtypen bekannt, die EP1, EP2, EP3 und EP4 Rezeptor genannt werden [18]. Alle Prostanoid-Rezeptoren sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren des Rhodopsin Types mit sieben Transmembranen Domänen Abbildung 5. Jeder Rezeptor ist auf unterschiedlichen Genen codiert [19]. Abbildung 5: Übersicht über die verschiedenen G-Protein gekoppelten Prostanoid-Rezeptoren mit dem jeweiligen stärksten Agonisten und dem induzierten Signalweg. 10

16 Einleitung Prostanoid-Rezeptoren können an ein stimulatorisches G-Protein Gα s, ein inhibitorisches G-Protein Gα i oder an ein Gα q -Protein gekoppelt sein. Der IP1, EP2, EP4 und DP1 Rezeptor sind an ein stimulatorisches G-Protein gekoppelt, was zu einer Aktivierung der Adenylyl Cyclase führt. Diese bildet aus ATP intrazelluläres camp, was wiederum aktivierend auf die camp-protein Kinase camp-pk wirkt. Diese phosphoryliert im aktivierten Zustand ihre Substrate, u.a. das Vasodilatorstimuliertes Phosphoprotein VASP. Eine Aktivierung dieses Signalweges führt im Ganzen zu einer Hemmung der Plättchenaktivität. Der EP3 und der DP2 Rezeptor sind an ein inhibitorisches G-Protein gekoppelt und hemmen die Adenylyl Cyclase. Dementsprechend wirken sie als Gegenspieler der Gα s -gekoppelten Rezeptoren und bewirken eine Aktivierung der Plättchen. Der FP, TP und EP1 Rezeptor sind an ein Gα q -Protein gekoppelt, was zu einer Aktivierung der Phospholipase C PLC führt. Diese spaltet ein Phospholipid in Inositoltriphosphat IP 3 und Diacylglycerol DAG. IP 3 bindet an IP 3 -Rezeptoren und aktiviert somit Calciumkanäle, so dass es zum Einstrom von Calcium aus dem Endoplasmatischen Retikulum in die Zelle kommt [30]. DAG und Calcium zusammen aktivieren die Protein Kinase C PKC, die ihrerseits weitere Substrate phosphoryliert Der Thromboxanrezeptor TP Rezeptor Die bedeutende Rolle von Thromboxan in der Hämostase ist weithin bekannt. Thromboxan ist ein wesentlicher Stimulator der Formveränderung shape change und der Aggregation in Plättchen, sowie ein Auslöser für die Kontraktion glatter Muskulatur mit nachfolgender Vasokonstriktion [31]. Thromboxan impliziert die Pathogenese von Atherosklerose und Herzinfarkt [18]. Der TP Rezeptor wird hauptsächlich in Blutplättchen exprimiert. Zwei alternative Splicevarianten des TP Rezeptors wurden beschrieben [32]: TPα und TPβ, deren Variation sich in der carboxy-terminalen Region des Rezeptors befindet. Die beiden Varianten weisen allerdings keine Unterschiede in der Ligandenbindung und der G-Protein Kopplung auf. Der TP Rezeptor führt über die Kopplung an ein Gα q -Protein zu einer Aktivierung der PLC und demnach zu einer Ausschüttung intrazellulären Calciums sowie der Aktivierung der PKC [33]. TP Rezeptor defiziente Mäuse weisen eine vermehrte Blutungstendenz sowie eine Resistenz gegen eine Thromboembolie auf [34]. 11

17 Einleitung Da der endogene Ligand Thromboxan A 2 zu unstabil für den Umgang im Labor ist, wurden eine große Anzahl synthetischer Agonisten und Antagonisten entwickelt. So wird als Agonist hauptsächlich das Thromboxan Analoga U46619 und als Antagonist SQ-29,548 verwendet [35] Der Prostaglandin F Rezeptor FP Rezeptor Der FP Rezeptor ist an ein Gα q -Protein gekoppelt. Eine Stimulation des Rezeptors mit PGF 2α führt zu einer Aktivierung der PLC und nachfolgend zur Ausschüttung von intrazellulärem Calcium und der Aktivierung der PKC [18]. PGF 2α bindet allerdings nicht nur an den FP Rezeptor, sondern weist auch signifikante Affinität zu den EP1 und EP3 Rezeptoren auf [29]. Deshalb ist es gut möglich, dass einige beschriebene Effekte von PGF 2α durch einen EP Rezeptor hervorgerufen werden [36]. Der FP Rezeptor wird hauptsächlich in Zellen der Niere und in Astrozyten exprimiert. Anhaltspunkte für die Existenz des FP Rezeptors in Plättchen gibt es bislang nicht Der Prostacyclin Rezeptor IP Rezeptor Prostacyclin inhibiert die Plättchenaggregation und induziert Vasodilatation. Somit wirkt es entgegen dem TxA 2, das als Vasokonstriktor und Initiator der Plättchenaggregation bekannt ist. PGI 2 interagiert mit dem IP Rezeptor, der an ein Gα s -Protein gekoppelt ist [37] und dementsprechend den camp Spiegel erhöht und die PKA aktiviert [38] und somit eine Hemmung der Plättchen Aktivität bewirkt. Auch eine Kopplung des IP Rezeptors an Gα q und Gα i ist beschrieben [39], was zu einer Ausschüttung des intrazellulären Calciums führt. Erhöhte camp Spiegel führen zu einer Hemmung des MAP Kinase Weges, sowohl der p42/p44 MAP Kinase [40] als auch der p38 MAP Kinase [41]. Der IP Rezeptor wird hauptsächlich in Neuronen des Spinal Ganglion und in vaskulärem Gewebe exprimiert [42]. Der IP Rezeptor ist in Plättchen der am besten untersuchte Prostanoid-Rezeptor. IP Rezeptor defiziente Mäuse weisen eine erhöhte Thromboseneigung auf [43] sowie eine Neigung zu Hyperplasie und Restenose [44]. Da Prostacyclin eine Halbwertszeit von wenigen Minuten aufweist, wird für die Arbeit im Labor das stabilere PGI 2 Analogon Iloprost verwendet. Als Inhibitor des IP Rezeptors hat sich CAY bewährt. 12

18 Einleitung Der Prostaglandin E Rezeptor EP Rezeptor Von allen COX Metaboliten wurde PGE 2 bislang am besten untersucht. PGE 2 induziert Vasodilatation [45], wirkt proinflammatorisch und reguliert die Produktion von Cytokinen, wie TNFα und IL-6 [46]. Die Effekte von PGE 2 sind vielfältig und scheinen manchmal funktionell gegensätzlich, was auf die Existenz verschiedener EP Rezeptor Subtypen hindeutet. Die Gruppe der EP Rezeptoren beinhaltet den EP1, EP2, EP3 und EP4 Rezeptor, die alle auf unterschiedlichen Genen lokalisiert sind und in Bezug auf die Aminosäure Homologie nicht nah miteinander verwandt sind. So ist beispielsweise der EP2 Rezeptor näher mit dem IP und dem DP1 Rezeptor verwandt als mit den anderen EP Rezeptoren Abbildung 6 [47]. Die Gruppe der EP Rezeptoren verbindet ihre gemeinsame hohe Affinität zu PGE 2. Abbildung 6: Genetische Verwandtschaft der Prostanoid-Rezeptoren. Quelle: Abbildung modifiziert nach Bos et al., 2004 [18]. 13

19 Einleitung Der EP1 Rezeptor Der EP1 Rezeptor wurde ursprünglich als Vermittler der Kontraktion der glatten Muskulatur beschrieben. EP1 Rezeptor mrna wird hauptsächlich in der Niere, der muscularis der Magenschleimhaut und der Nebenniere exprimiert [48]. Eine Aktivierung des EP1 Rezeptors führt zu einem PLC-abhängigen Anstieg des intrazellulären Calciums mit anschließender PKC Aktivierung [49, 50], was darauf hindeutet, dass der EP1 Rezeptor an ein Gα q -Protein gekoppelt ist. Andererseits wird die These vertreten, dass eine Aktivierung des EP1 Rezeptors zwar den intrazellulären Calciumspiegel erhöht, die Generierung von IP 3 allerdings ausbleibt, was wiederum gegen eine Kopplung an Gα q spricht [51]. Ji et al. zeigten 2010, dass der EP1 Rezeptor an ein Gα i -Protein gekoppelt ist [52]. Nach wie vor ist also unklar, ob und an welches G-Protein der EP1 Rezeptor gekoppelt ist und welche Signale die Aktivierung des Rezeptors auslösen. Auch herrscht Uneinigkeit darüber, ob der EP1 Rezeptor in Plättchen exprimiert wird oder ob er nicht in Plättchen existiert [53, 54] Der EP2 Rezeptor Der EP2 Rezeptor wirkt relaxierend auf glatte Muskulatur und wurde von Regan et al kloniert [55]. Er ist an ein Gα s -Protein gekoppelt und führt über die Aktivierung der Adenylyl Cyclase zu einem Anstieg des camp Spiegels [56]. Der EP2 Rezeptor kann selektiv mit dem Agonisten Butaprost aktiviert werden [57]. mrna des EP2 Rezeptors konnte hauptsächlich in der Lunge, im Uterus und in der Milz nachgewiesen werden. In den meisten Geweben wird der EP2 Rezeptor in geringeren Mengen exprimiert als der EP4 Rezeptor [58]. Über die Existenz des EP2 Rezeptors in Plättchen herrscht Uneinigkeit [53, 54]. EP2 Rezeptor defiziente Mäuse weisen eine verminderte Fruchtbarkeit [59], Hypertonie [59] und eine verminderte Blutdrucksenkung auf intravenöse PGE 2 -Gabe auf [60]. 14

20 Einleitung Der EP3 Rezeptor Ursprünglich wurde der EP3 Rezeptor als Vermittler der Kontraktion glatter Muskulatur identifiziert [35]. Er wird in großen Mengen in der Niere, dem Uterus, der Nebenniere und im Magen exprimiert. Der EP3 Rezeptor ist in der Familie der Prostanoid-Rezeptoren einmalig, da viele alternative Splicevarianten des EP3 Rezeptor Subtyps existieren. Die Unterschiede der verschiedenen Isoformen befinden sich in der carboxy-terminalen Region. Bislang konnten 10 mrna Splicevarianten identifiziert werden [61], die unterschiedliche Funktionen und Eigenschaften zeigen, wie alternative Signaltransduktionswege, Rezeptor Phosphorylierung und Desensibilisierung sowie im intrazellulären Austausch [29]. Eine Aktivierung des EP3 Rezeptors inhibiert über die Kopplung an ein Gα i -Protein die Adenylyl Cyclase [62] und führt so zu einer Aktivierung der Zelle. Einzelne Isoformen können auch an ein Gα s - oder Gα q -Protein gekoppelt sein [63]. EP3 Rezeptor defiziente Mäuse weisen eine erhöhte Blutdrucksenkung auf intravenöses PGE 2 auf [64]. Sulproston weist eine hohe Affinität gegenüber dem EP3 Rezeptor auf [65]. Als spezifischer Antagonist des EP3 Rezeptors hat sich L bewährt [66] Der EP4 Rezeptor Der EP4 Rezeptor ist wie der EP2 Rezeptor an ein stimulatorisches Gα-Protein gekoppelt und induziert somit einen Anstieg des camp Spiegels. Er wurde 1993 von Honda et al. kloniert und bis 1995 fälschlicherweise als EP2 Rezeptor bezeichnet [67]. Tatsächlich weisen beide Rezeptoren durch ihre Kopplung an ein Gα s -Protein vasodilatorische Effekte auf [35]. Der EP4 Rezeptor lässt sich aber durch seine Insensibilität gegenüber Butaprost und durch seine lange C-terminale Sequenz, die viele Phosphorylierungsstellen enthält, deutlich vom EP2 Rezeptor unterscheiden. Dies ermöglicht dem EP4 Rezeptor eine Agonisten-abhängige Phosphorylierung und Desensibilisierung. Gegen diesen regulatorische Effekt bleibt der EP2 Rezeptor insensitiv [68]. Gegenüber dem EP1 und EP3 Rezeptor grenzt sich der EP4 Rezeptor durch seine geringere Affinität für Sulproston ab. Der EP4 Rezeptor weist hingegen eine hohe Affinität gegenüber PGE 1 auf [65]. Der EP4 Rezeptor wird in großen Mengen im Thymus, Ileum, Lunge, Milz, Nebenniere und Niere exprimiert. EP4 Rezeptor defiziente Mäuse weisen wie EP2 Rezeptor defiziente Mäuse eine verminderte Blutdrucksenkung auf intravenöses PGE2 auf [64]. 15

21 Einleitung Der Prostaglandin D Rezeptor DP Rezeptor PGD 2 wird von einer Vielzahl an Geweben produziert und inhibiert wie auch PGI 2 die Plättchenaggregation und führt zur Relaxation von vaskulärer und nicht-vaskulärer glatter Muskulatur. PGD 2 aktiviert zwei G-Protein gekoppelte Prostanoid-Rezeptoren, den DP1 und den DP2 Rezeptor [57, 69], die nur eine kleine Sequenz Homologie aufweisen. Die Aktivierung des DP Rezeptors mit PGD 2 induziert eine Vielzahl physiologischer Prozesse, wie die Induktion des Schlafes [70], Überleben von Zellen [71] und allergische Antworten [72]. Aktivierung des an ein Gα s -Protein gekoppelten DP1 Rezeptors mit PGD 2 führt zu einem Anstieg des camp Spiegels und folglich zur Hemmung der Plättchenaggregation [73]. Der DP2 Rezeptor ist an ein Gα i -Protein gekoppelt und hemmt die Adenylyl Cyclase und somit die camp Produktion. Ferner führt die Aktivierung des DP2 Rezeptor zu einem Anstieg des zellulären Calciums [69]. Ob dies über eine Kopplung des DP2 an ein Gα q -Protein erfolgt ist bislang ungeklärt. In Geweben, die beide DP Rezeptortypen exprimieren, kann eine Stimulation mit PGD 2 zu verfälschten Ergebnissen führen, da der DP1 Rezeptor und der DP2 Rezeptor als Gegenspieler agieren. Deshalb existieren gute Agonisten und Antagonisten für den DP1 Rezeptor auf dem Markt, um eine spezifische Untersuchung des DP1 Rezeptors zu gewährleisten. Als Agonist hat sich BW 245C bewährt [74], während als Antagonist BW A868C beschrieben ist [75]. 16

22 Einleitung 2.6 Funktion des G-Proteins Um extrazelluläre Signale in die lebende Zelle zu transferieren, verbinden Membran - durchspannende Rezeptoren die extrazelluläre Umwelt mit dem Zellinnenraum. Eine große Gruppe stellen die G-Protein gekoppelten Rezeptoren GPCRs dar [76]. GPCRs reagieren auf spezifische extrazelluläre Liganden mit einer Konformationsänderung [77], was die cytoplasmatisch gelegene Bindungsstelle für G-Proteine freilegt. Die aktive cytoplasmatische Rezeptoroberfläche ermöglicht eine Bindung von heterotrimerem G-Protein Gαβγ und katalysiert den Austausch von GDP mit GTP in der Gα Untereinheit [78, 79]. Sowohl die Gα-GTP als auch die Gβγ Untereinheit können Zell-spezifische Antworten über verschiedene Effektor-Proteine auslösen und intrazelluläre Botenstoffe regulieren [76]. Die Hydrolyse von GTP zu GDP an der Gα Untereinheit und die damit verbundene Reassoziation von Gα-GDP mit Gβγ vervollständigt den G-Protein Zyklus Abbildung 7. Abbildung 7: Funktionsweise der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. 1 GPCR liegt in inaktiver Form vor, 2 extrazellulärer Ligand bindet an Rezeptor, 3 Konformationsänderung, 4 Austausch von GDP zu GTP an Gα Untereinheit, 5 Gα-GTP dissoziiert von Ligand-Rezeptor-G-Protein Komplex, 6 Hydrolyse von GTP zu GDP und 1 Reassoziation der Gα Untereinhalt zum Komplex. Quelle: 17

23 Einleitung 2.7 Zielsetzung Prostanoide und ihre Wirkung über G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind bereits in verschiedenen Geweben und Zellen gut untersucht worden. Das Wissen um die Existenz und Funktion der verschiedenen Prostanoid-Rezeptoren in Plättchen hingegen ist bislang nur lückenhaft. Über den TP Rezeptor und den IP Rezeptor liegen gute Studien zur Aktivierung durch Agonisten, die Kopplung an G-Proteine sowie die nachgeschalteten Signaltransduktionswege in humanen Plättchen vor. Die restlichen Prostanoid-Rezeptoren sind in Plättchen jedoch nur ungenügend untersucht worden. Es herrscht Uneinigkeit darüber, ob der EP1 Rezeptor sowie der EP2 Rezeptor in Plättchen überhaupt exprimiert werden [53, 54] und an welches G- Protein der EP1 Rezeptor dann gekoppelt ist. Der erste Teil dieser Arbeit widmet sich deshalb der Aufgabe, humane Plättchen auf die Anwesenheit der verschiedenen Prostanoid-Rezeptoren zu untersuchen und die Funktionsweise der nachgewiesenen Rezeptoren mit spezifischen Agonisten und Antagonisten zu überprüfen. Da Prostaglandine eine zentrale Rolle in der Regulation der Plättchenfunktion einnehmen, soll im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht werden, wie die verschiedenen Prostanoid-Rezeptoren durch natürliche Prostaglandine aktiviert werden und wie sich dies auf die Signaltransduktionswege in Plättchen auswirkt. Dadurch soll das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren ausgearbeitet werden. Die Existenz und das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren in humanen Plättchen sind sehr wichtig für das medizinische Verständnis. So stellt die Veränderung des intrazellulären camp Spiegels ein Schlüsselziel für die Medikamentenentwicklung dar. Durch ein besseres Verständnis der Interaktion der Prostanoid-Rezeptoren können in Zukunft mit synthetischen Agonisten und Antagonisten die Regulation der Plättchenfunktion je nach Krankheitsbild beeinflusst werden. 18

24 Materialien 3. MATERIALIEN UND METHODEN 3.1 MATERIALIEN Substanzen, Chemikalien und Lösungen ABTS-Tabletten ABTS Puffer Acrylamid Rotiphorese Agarose Albumin bovine serum BSA Ammoniumpersulfat APS Ampicillin Apyrase Aqua ad iniectabilia β-glycerolphosphat -Mercaptoethanol Borsäure Bromphenolblau Cacodylat Calciumchlorid camp-eia-kit Citronensäure Chloroform Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail tablets Coumarinsäure di-natriumhydrogenphosphat-dihydrat Na 2 HPO 4 DMSO Dimethylsulfoxid dntp-mix EDTA Roche Roche ROTH peqlab Sigma Sigma ROTH Sigma Delta Select Sigma Sigma ROTH Sigma Sigma Merck ENZO Life Science Merck J.T. BAKER Roche Sigma Merck Merck Invitrogen Gibco 19

25 Materialien EGTA Essigsäure Ethanol absolut, z. Spekt. Exonuklease/SAP-Mix Fibrinogen Fluoxetin Formamid GelRed Nucleic Acid Stain Genome Lab DTCS-Quick Start Kit Glucose Glutathione Sepharose 4B Glutaraldehyd Glycerin Glycin Größenstandard 100bp ladder Igepal CA-630 Isobutanol Isopropanol Kaliumchlorid Luminol Natrium Salz Magnesiumchlorid Methanol Milchpulver Natriumacetat Natriumchlorid Natriumcitrat-Dihydrat Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat NaH 2 PO 4 Sigma J.T. Baker Merck Affymetrix/USB Products Sigma Sigma Merck Biotium Beckman Coulter Riedel-deHaën GE Healthcare Merck ROTH Serva/Merck Invitrogen Sigma Merck Merck Merck Sigma Merck J.T. BAKER ROTH Sigma Merck Merck Merck 20

26 Materialien Natriumfluorid Natriumhydrogencarbonat Natriumhydroxidplättchen Natrium-Serotoninkreatininsulfat N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Temed N-2-Hydroxyethylpiperazine-N - 2-ethane-sulfonic-acid Hepes o-phtalaldehyd PageRuler Prestained Protein Ladder PBS Mg 2+ /Ca 2+ frei Pierce BCA Protein Assay Reagent A Pierce BCA Protein Assay Reagent B Platinum Taq-Polymerase Merck Merck Merck Sigma Sigma Sigma Sigma Fermentas Dulbecco Thermo Scientific Thermo Scientific Invitrogen Ral-GDS-RBD Fusionsprotein Dr. Albert Smolenski Universität Dublin RNase H RNase OUT Ponceau-S Prostaglandin E 2 -EIA-Kit Protein G Sepharose 4 Fast Flow Salz-Lösung Salzsäure HCl Silikonöl Sodium dodecyl sulfate SDS Superskript III Reverse Transkriptase Kit Taq-Polymerase TOPO-pCR 4 Kit Trichloressigsäure 100% TCA Invitrogen Invitrogen Sigma BIOTREND GE Healthcare Invitrogen Merck Merck Serva Invitrogen Invitrogen Invitrogen Merck 21

27 Materialien Tri-Natriumcitrat Trishydoxymethyl-aminomethan Triton X-100 Trizol Tween-20 Universal cdna all human Wasserstoffperoxid Zyxin Merck Merck Sigma Invitrogen Serva BioChain Merck in E.Coli überexprimiert Alle Substanzen p.a., soweit nicht anders angegeben Agonisten und Antagonisten Agonisten Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Agonisten Agonist Ziel Firma Adenosine 5 - ADP Rezeptoren Calbiochem Diphosphate, Mononatrium Salt ADP Collagen Nycomed R Butaprost EP2 Rezeptor Cayman Chemical BW 245C DP1 Rezeptor Sigma Ilomedin Iloprost IP Rezeptor Schering Prostaglandin A 1 Sigma-Aldrich Prostaglandin E 1 Cayman Chemical Prostaglandin E 2 Cayman Chemical Prostaglandin D 2 DP1 Rezeptor Cayman Chemical Sulproston EP3 Rezeptor Cayman Chemical TRAP-6 trifluoroacetat Bachem U46619 Cayman Chemical 22

28 Materialien Antagonisten Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Antagonisten Antagonist Ziel Firma ARC P2Y12 Rezeptor Astra Zeneca BW A868C DP1 Rezeptor Cayman Chemical CAY10441 IP1 Rezeptor Cayman Chemical CCT HSP-90 Calbiochem DRB Casein Kinase II Sigma KNK 437 HSP-70/-72/-105 Calbiochem L EP3 Rezeptor Tocris L EP4 Rezeptor Tocris Antikörper Primärantikörper Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper Antikörper Firma Blockmedium Verdünnung 2 Antikörper PTGES 3 Thermo Fisher #LD % MP 1:1000 5% MP 1:7500 Maus DP1 Rezeptor Cayman # % MP 1:500 5% MP 1:20000 Hase EP2 Rezeptor Cayman # % MP 1:200 5% MP 1:10000 Hase EP3 Rezeptor Cayman # % MP 1:200 5% BSA 1:10000 Hase EP4 Rezeptor Cayman # % MP 1:500 5% MP 1:10000 Hase HSP-90 StressGen SPA-845 5% MP 1:1000 5% MP 1:7500 Ratte P-VASP 5C6 Nano Tools - 1:540 1:2000 Ser 157 PBS Maus P-VASP 16C2 Nano Tools - 1:1820 1:2000 Ser 239 PBS Maus Rap-1 BD # % MP 1:1000 5% MP 1:10000 Maus VASP IE273 Nano Tools - 1:1670 PBS 1:2000 Maus 23

29 Materialien Sekundärantikörper Tabelle 4: Übersicht über die verwendeten Sekundärantikörper Antikörper Markierung Firma Goat-anti-Rabbit-Ig HRP BioRad Goat-anti-Mouse-Ig HRP BioRad Goat-anti-Mouse-IgG Peroxidase Chemicon Chicken-anti-Rat-Ig HRP Santa Cruz Primer Tabelle 5: Übersicht über die Primersequenzen Protein Gen SwissProt Sequenz Rap 1B RAP1B P61224 Fw: 5 -CATCACAGCACAGTCCACATTT-3 N1-2α1 Rv: 5 -GAATTGGGCAACAGTTCTTCAG-3 Fw: 5 -CAACACCATGTTCTGCACGAAGC-3 GAP-DH GAPDH P04406 Rv: 5 -GTATCACTCTCTTTGTGTAATCC-3 Fw: 5 -ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3 HFE Exon2 HFE2 Q6ZVN8 Rv: 5 -TACTCCTTGGAGGCCATGTG-3 Fw: 5 -TCCTGCTCCCCTCCTACTACA-3 M13 Rv: 5 -GCTCTGACAACCTCAGGAAGG-3 Fw: 5 -GTAAAACGACGGCCAG-3 DP1 PTGDR Q13258 Rv: 5 -CAGGAAACAGCTATGAC-3 Fw: 5 -AAA GCC CAC CCA GGA CTT AG-3 DP2 GPR44 Q9Y5Y4 Rv: 5 -CCC CAG CTG TTC TTT TAC CA-3 Fw: 5 -AAT CCT GTG CTC CCT CTG TG-3 EP1 PTGER1 P34995 Rv: 5 -CGG CCA AGA AGT AGG TGA AG-3 Fw: 5 -ACC TTC TTT GGC GGC TCT-3 EP2 PTGER2 P43116 Rv: 5 -CCT GGC GCA GTA GGA TGT A-3 Fw: 5 -TGC TGC TTC TCA TTG TCT CG-3 EP3 PTGER3 P43115 Rv: 5 -AGC TTG GAG GTC CCA TTT TT-3 Fw: 5 -TGA GCA CTG CAA GAC ACA CA-3 EP4 PTGER4 P35408 Rv: 5 -CAA ATT CAG GGA AGC AGG AA-3 Fw: 5 -GCC GAA GAT TTG GCA GTT TC-3 FP PTGFR P43088 Rv: 5 -GTG ACA GCC AGC CCA CAT AC-3 Fw: 5 -TGC AAT GCA ATC ACA GGA AT-3 Rv: 5 -GAC ATG CAC TCC ACA GCA TT-3 24

30 Materialien EP3 Isoformen FW_2: 5 -ACGGCATCTCAGTCCAGTG-3 EP3_4,6,7 Rv: 5 -CAGTGATGTGATCCTGGCA-3 EP3_5 Rv: 5 -TCAGCTACGAATGGCAGACT-3 EP3_11,8 Rv: 5 -TTCAGCACACGATAGGTTTG-3 EP3_9 Rv: 5 -CGTTCTTTCATTATCTTTCCA-3 EP3_41,6,7 Rv: 5 -ATGTGATCCTGGCAGAAAGG-3 COX-1 PTGS1 P23219 Fw: 5 -TCAGCTGGGAGTCTTTCTCC-3 Rv: 5 -CATTTCTCCATCCAGCACCT-3 COX-2 PTGS2 P35354 Fw: 5 -GTTCCCACCCATGTCAAAAC-3 Rv: 5 -GAGAAGGCTTCCCAGCTTTT-3 PTGDS PTGDS P41222 Fw: 5 -CTCGCTCTCCCACACCAC-3 Rv: 5 -CGGGTCTCACACTGGTTTTT-3 HPGDS HPGDS O60760 Fw: 5 -ATGAGGGGGAGAGCAGAAAT-3 Rv: 5 -TTTTCACATCTTGCTTTTTCTCTG-3 PTGES PTGES O14684 Fw: 5 -GATCACACCCACAGTTGAGC-3 Rv: 5 -CCAGGAAAAGGAAGGGGTAG-3 PTGES2 PTGES2 Q9H7Z7 Fw: 5 -CCCTCAAGACCTACCTGGTG-3 Rv: 5 -CTCGCGGACAATGTAGTCAA-3 TEBP PTGES3 Q15185 Fw: 5 -TGCTTCTGCAAAGTGGTACG-3 Rv: 5 -GGCCAGATTCTCCTTTTCGT Verbrauchsmaterial Aggregationsröhrchen Test Tubes makro BioData Corporation makro 300μl Aggregationsröhrchen Cuvettes Micro with Mixer DiaSysGreiner micro 200μl Bechergläser Schott Desinfektionspray Terralin Liquid Schülke&Mayr Dialysekanüle 1,8mm Bionic Medizintechnik Einmalhandschuhe Flexam Puderfrei Latex Cardinal Health Eppendorf Caps 1,5ml und 2ml Eppendorf Erlenmayerkolben Flaschen Schott Schott Greiner Röhrchen 50ml Cellstar PP-Test tubes Greiner bio-one Greiner Röhrchen 15ml Cellstar PP-Test tubes Greiner bio-one 25

31 Materialien Hautdesinfektion Cutasept F BODE Chemie Insulinspritze Omnican 40 B. Braun Low Bind Tubes Protein LoBind Tube 1,5ml Eppendorf Mikrotiter-Platten für PS-microplate Greiner bio-one Serotonin Assay Mikrotiter-Platten für Nunc Immobilizer TM NUNC VASP Assay Monovetten S-Monovette 10ml grün Sarstedt Multipipette Spitzen TipStackPack Sarstedt Nitrocellulose Nitrocellulose Transfer Membran Schleicher&Schuell Protran Porengröße 0,45μm Parafilm Parafilm M American National Can TM PCR-Tubes PCR disposables Brand Petrischalen Cellstar, tissue culture dishes Greiner bio-one Pipettenspitzen 0,1-20 μl ep T.I.P.S. standard Eppendorf μl ep T.I.P.S. standard Eppendorf 1000 Pipette Tips Greiner bio-one Plastikpipetten Cellstar 5ml/10ml/25ml Greiner Polypropylenröhrchen PP-Röhrchen natur 14ml Greiner Röntgenfilme Super RX Fuji Rundbodenröhrchen 14ml PP Tube steril Greiner bio-one Serotonin-Platten FluoroNunc MaxiSorp NUNC Tupfer Pur-Zellin HARTMANN Whatman-Papier Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell 26

32 Materialien Geräte Aggregometer APACT LAbor Aggregometer Platelet Aggregation BioData Corporation Profiler PAP-4 Blotkammer für WetBlot Trans-blot CELL BioRad Brutschrank Certomat H B. Braun Eismaschine Elektrophoresekammer Scotsman Noras Entwickler X-OMAT M35 Kodak Feinwaage Sartorius Heinse+Ziller Fluorimeter/Photometer Victor 2 TM 1420 Multilabel Perkin Elmer Counter Wallac Heizblock Stuart Scientific Heinse+Ziller Kammer für Agarosegele Horizon Whatman Magnetrührer Ikamag Janke&Kunkel Mehrkanalpipette Research Pro Eppendorf Millipore-Anlage Milli-Q UF Millipore PCR-Maschine MyCycler Biometra Plattenwaschgerät Microplate Washer Tecan Proteinmessung microplate Reader Molecular Devices Schüttelinkubator Certomat Hartenstein Shaker Heidolph Heinse+Ziller Delfia Plateshake Wallac Spannungsgeber PowerPac HC BioRad H.Hölzel SpeedVac Concentrator plus Eppendorf Stickstoffbehälter Nalgene Überkopfschüttler Rotary Mixer A.Hartenstein Ultraschalllanze 102C G.Heinemann 27

33 Materialien UV-Transilluminator TFX-35M Life Technologies Waage N KERN Wasserbad Thermo Electron Corporation Haake Vortexer Vortex Genie 2 TM Bender&Hobein AG Zellzähler KX-21N Sysmex Zentrifugen Centrifuge 5415C Eppendorf Centrifuge 5417R 3K1 Allegra TM 2IR Centrifuge Eppendorf Sigma Beckman Coulter L-80 Beckman Labofuge 400R Thermo Scientific 28

34 Methoden 3.2 METHODEN Methoden zur Blutpräparation Blutabnahme Das Blut wird mit einer 1,8mm Dialysekanüle von gesunden humanen Spendern aus einer Vene aus der Armbeuge entnommen. Es wird darauf geachtet, dass der Spender mindestens 2 Wochen vor Entnahme des Blutes keine Medikamente eingenommen hat, welche die Plättchenfunktion beeinträchtigen könnten. Dabei wird erst kurz vor Anlegen der Nadel das Blut im Arm mit einem Stauschlauch gestaut, um eine Präaktivierung der Thrombozyten zu vermeiden. Das Blut wird in 50ml Greiner- Röhrchen entnommen Isolation von gewaschenen Plättchen WPs mit EGTA Für die Isolation von gewaschenen Plättchen Washed Platelets; WPs werden pro Röhrchen 10ml CCD+EGTA-Puffer vorgelegt 1:5, der vorher auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Damit werden die Thrombozyten stabilisiert und die Blutgerinnung unterbunden. Das entnommene Blut wird direkt nach der Abnahme 20min bei 300xg und 20 C zentrifugiert. Dabei trennt sich das Blut auf. Im Überstand befindet sich das plättchenreiche Plasma Platelet Rich Plasma; PRP, in der unteren Schicht befinden sich die schwereren Blutzellen wie Erythrozyten, Leukozyten etc. Etwa 20-25ml des PRP werden mit einer Einmal-Plastikpipette langsam abgenommen und in ein neues Greiner-Röhrchen überführt. Das PRP wird 1:1 mit Hepes/CCD aufgefüllt und für 10min bei 100xg zentrifugiert. Das Pellet mit den Leukozyten wird verworfen und der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt. Dieses wird 10min bei Raumtemperatur stehen gelassen, damit eventuell präaktivierte Plättchen wieder in den Ruhezustand zurück finden können. Anschließend wird das PRP 10min bei 380xg und 18 C zentrifugiert. Der Überstand, das plättchenarme Plasma Platelet Poor Plasma; PPP wird nach der Zentrifugation verworfen und das Pellet mit den Plättchen in CGS-Puffer resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 380xg für 10min wird das Plättchenpellet in Hepes-Puffer resuspendiert. Das Volumen richtet sich nach der gewünschten Zellzahl. 29

35 Methoden CCD + EGTA-Puffer ph 6,5 Hepes-Puffer ph 7,4 100mM Na-Citrat 7mM Citronensäure 145mM NaCl 5mM KCl 140mM Glucose 1mM MgCl 2 15mM EGTA 10mM Hepes 10mM Glucose CGS-Puffer ph 6,5 120mM NaCl 12,9mM tri-na-citrat Hepes/CCD-Puffer 4 Teile Hepes-Puffer 1Teil CCD-Puffer 30mM Glucose Isolation von gewaschenen Plättchen ohne EGTA 9,75ml Hepes/CCD-Puffer werden auf Raumtemperatur erwärmt und kurz vor der Blutabnahme mit 250µl Apyrase 1U/ml versetzt. 40ml Blut 5:1 werden zugegeben. Bei einer Zentrifugation bei 300xg für 20min bei Raumtemperatur werden die schwereren Blutzellen vom PRP getrennt. 1U/ml Apyrase werden in einem neuen Röhrchen vorgelegt und das PRP zugegeben. Nach 2min Ruhephase wird das Röhrchen 1:1 mit Hepes/CCD-Puffer aufgefüllt und weitere 2min stehen gelassen. Es folgt ein Leukozytenschritt, bei dem bei 100xg für 10min zentrifugiert wird. Dabei werden die Leukozyten pelletiert und verworfen. Der Überstand mit dem PRP wird in ein neues Röhrchen überführt und 2min stehen gelassen. Es folgt ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 400xg für 10min bei Raumtemperatur. Dabei werden die Thrombozyten pelletiert und anschließend in 10ml Hepes/CCD-Puffer und 1U/ml Apyrase zum Waschen resuspendiert und 2min ruhen gelassen. Zum Pelletieren der gewaschenen Plättchen wird bei 380xg für 7min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand mit dem PPP wird verworfen und das Plättchenpellet in Tyrodes- Puffer aufgenommen. Das Volumen des Puffers richtet sich nach der gewünschten Zellzahl. 30