Tamoxifen-Inducible Glia-Specific Cre Mice for Somatic Mutagenesis in Oligodendrocytes and Schwann Cells. and

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1 Diss. ETH N Tamoxifen-Inducible Glia-Specific Cre Mice for Somatic Mutagenesis in Oligodendrocytes and Schwann Cells and ß1-lntegrin regulates Neural Progenitor Maintenance through Modulation of Growth Factor Signaling A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology Zurich For a degree of Doctor of Natural Seiences Presented by Dino Leone Bioehemist University of Zurich Born May 9 th 1970, in Bülach, Switzerland Citizen of Switzerland Accepted on recommendation of Prof. Dr. Ueli Suter, examiner Prof. Dr. Martin Schwab, coexaminer 2003

2 Summary Summary During the four years of my Ph.D. thesis, I had the opportunity to gain experience in two separate fields of neurobiology. Accordingly, this thesis is divided into two parts. While the first part (chapter 2 on page 25) focuses on glial cell biology, the second section (chapter 3 on page 61) concentrates on the research of neural stern cells. Summary of Part I Nearly a century after Ram6n y Cajal's studies describing the cellular structures of the peripheral nervous system (Ram6n y Cajal, 1928), both molecular and cellular mechanisms leading to myelination are still poorly understood. The investigation of hereditary diseases of the peripheral nervous system has improved our clinical knowledge, but the change in the perception of the molecular basis was initiated with the identification of point mutations in the peripheral myelin protein (Pmp22) gene in the natural mouse mutants Trembler (Tr) and Trembler-J (Tr-J) (Suter et al., 1992a; 1992b). The subsequent generation and analysis of animal models harboring mutations in genes involved in peripheral neuropathies in man has further improved our understanding of these diseases (for review see Berger et al., 2002). However, on the molecular level, it remains unclear how specific proteins thought to be important for myelination actually exert their function. Particularly the interactions between neurons and the ensheathing Schwann cells are not weil understood. Recently, genetic approaches have become available to introduce changes in gene expression in a both temporally- and spatially-controlled manner (reviewed in Lewandoski, 2001). These genetic tools provide the possibility to target somatic mutations in a tissue-specific way, for example specifically in glial cells. In order to address the issue of neuron-glia interaction and to investigate gene functions directly in glial cells, I employed the Cre/lox technique and generated two strains of transgenie mice expressing an improved variant of the Cre recombinase specifically in glial cells. This tamoxifen-inducible Cre/lox system allows recombination of target genes at will by the administration of the estrogen analogue tamoxifen in vivo. My results show that the PLP-CreERT2 mediates efficient recombination of the Rosa26 Cre reporter allele in oligodendrocytes, adult oligodendrocyte precursors and Schwann cells of the peripheral nervous system. The POCx-CreERT2 drives recombination exclusively in Schwann cells. I am convinced that the inducible Cre mice described here (chapter 2 on page 25) will be of major value to investigate gene functions in glial cells.

3 2 Summary Summary of Part 11 Neural stern cells are multi potent progenitor cells in the nervous system that can give rise to both neurons and glial cells. After the initial reports about successful isolation and subsequent propagation of neural stern cells in vitro (Cattaneo and McKay, 1990; Reynolds et al., 1992; Kilpatrick and Bartlett, 1993), the field of neural stern cell research has received considerable interest during the last decade. Particularly the discovery that a relatively quiescent population of neural stern cells persists in specialized regions of the brain until adulthood (Lois and Alvarez-Buylla, 1993) has lead to the hope that these cells maybe could be primed to expand and to differentiate into functional neurons in pathological situations, for example in Parkinson's disease. Consequently, a substantial effort has been made to characterize adult neural stern cells on a molecular and cellular level. Integrins have previously been shown to be involved in the maintenance of stern cell compartments such as the male germline (Shinohara et al., 1999) and the mammalian skin (Brakebusch et al., 2000). Accordingly, the goal of the second part of my thesis (chapter 3 on page 61) was to investigate the role of ßl integrin in both neural stern cells and in neural stern cell-derived progenitor cells. Using neurosphere cultures derived from mutant mice that carry a conditional ßl integrin null allele, I found that loss of ßl integrin does not impair the maintenance of neural stern cells. However, ßl integrin is essential for neural stern cell-derived progenitor cells for both survival and proliferation. Furthermore, ß1 integrin-deficient neurosphere-derived cells show a significantly impaired short term adhesion on integrin-specific substrates and a significantly reduced migration capacity. These new findings suggest that integrin-mediated adherence plays an important role in the behavior of neural stern cell-derived progenitors. References Berger, P.,Young, P., and Suter, U. (2002). Molecular cell biology of Charcot-Marie-Tooth disease, Neurogenetics 4, Brakebusch, C., Grose, R, Quondamatteo, F., Ramirez, A., Jorcano, J. L., Pirro, A., Svensson, M., Herken, R, Sasaki, T., Timpi, R, et al. (2000). Skin and hair follicle integrity is crucially dependent on beta 1 integrin expression on keratinocytes, Embo J 19, Cattaneo, E., and McKay, R (1990). Proliferation and differentiation of neuronal stern cells regulated by nerve growthfactor, Nature 347, Kilpatrick, T. J., and Bartlett, P. F. (1993). Cloning and growth of multipotential neural precursors: requirementsfor proliferation and differentiation, Neuron 10, Lewandoski, M. (2001). Conditional control of gene expression in the mouse, Nat Rev Genet 2,

4 Summary 3 Lois, c., and Alvarez-Buylla, A. (1993). Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia, Proc Natl Acad Sei USA 90, Ram6n Y Cajal, S. (1928). Degeneration and Regeneration of the Nervous System (New York, Hafner Publishing). Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., and Weiss, S. (1992). A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes, J Neurosei 12, Shinohara, T., Avarbock, M. R, and Brinster, R L. (1999). betal- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stern cells, Proc Natl Acad Sei USA 96, Suter, U., Moskow, 1.1., Welcher, A. A., Snipes, G. J., Kosaras, B., Sidman, R L., Buchberg, A. M., and Shooter, E. M. (1992a). A leueine-to-proline mutation in the putative first transmembrane domain of the 22-kDa peripheral myelin protein in the trembler-j mouse, Proc Natl Acad Sei USA 89, Suter, U., Welcher, A. A., Ozcelik, T., Snipes, G. J., Kosaras, B., Francke, U., Billings-Gagliardi, S., Sidman, R L., and Shooter, E. M. (1992b). Trembler mouse carries a point mutation in a myelin gene, Nature 356,

5 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Während der vier Jahre meiner Doktorarbeit hatte ich die Gelegenheit, in zwei verschiedenen Gebieten der Neurobiologie Erfahrungen zu sammeln. Dementsprechend ist meine Doktorarbeit in zwei Teile aufgeteilt. Während der erste Teil (Kapitel 2 auf Seite 25) sich mit der Zellbiologie von Gliazellen befasst, konzentriert sich der zweite (Kapitel 3 auf Seite 61) auf die Untersuchung von neuralen Stammzellen. Zusammenfassung von Teil I Beinahe ein Jahrhundert nach Ramön y Cajals Studien über die zellulären Strukturen des peripheren Nervensystems (Ramön y Cajal, 1928) sind die molekularen und zellulären Mechanismen, die zur Myelinisierung führen, immer noch ungenügend verstanden. Die Erforschung von Erbkrankheiten des peripheren Nervensystems hat zwar unser klinisches Verständnis verbessert, aber die Auffassung über die molekularen Grundlagen hat sich aber erst geändert, als Punktmutationen im Peripheren Myelin Protein (Pmp22) Gen in den natürlichen Mausmutanten Trembler (Tr) und Trembler-J (Tr-J) identifiziert wurden (Suter et al., 1992a; 1992b). Die anschliessende Erzeugung und Analyse von Tieren, welche Mutationen in Genen tragen, die in peripheren Neuropathien im Menschen involviert sind, hat unser Verständnis über diese Krankheiten verbessert (als Übersicht siehe Berger et al., 2002). Auf der molekularen Ebene jedoch bleibt unklar, wie spezifische, für die Myelinisierung wichtige Proteine ihre Funktionen ausüben. Die Interaktionen zwischen Neuronen und Schwarmzellen sind im Detail nicht genügend verstanden. Während der letzten Jahre sind genetische Methoden verfügbar geworden, welche es erlauben, sowohl zeitlich- als auch örtlich-regulierte Änderungen in der Genexpression vorzunehmen (als Übersicht siehe Lewandoski, 2001). Diese Verfahren ermöglichen es, somatische, gewebespezifische Mutationen einzubringen, zum Beispiel spezifisch in Gliazellen. Um die Interaktionen zwischen Neuronen und Gliazellen besser in Angriff zu nehmen und um Genfunktionen direkt in Gliazellen zu untersuchen, habe ich die Cre/lox Technik verwendet und 2 Stämme transgener Mäuse hergestellt, die eine weiterentwickelte Variante der Cre Rekombinase spezifisch in Gliazellen exprimieren. Dieses Tamoxifen-induzierbare Cre/lox System erlaubt eine beliebige Rekombination von Zielgenen durch die Administration des Östrogenanalogons Tamoxifen in vivo. Meine Resultate zeigen, dass das PLP CreERT2 effizient das Rosa26 Cre Reporterallel in Oligodendrozyten, adulten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und in Schwarmzellen rekombiniert. Das POCx-CreERT2 vermittelt Rekombination exklusiv in Schwannzellen.

6 6 Zusammenfassung Ich bin überzeugt, dass die induzierbaren Cre Mäuse, die in dieser Arbeit beschrieben sind (Kapitel 2 auf Seite 25), einen hohen Wert für die Erforschung von Genfunktionen in Gliazellen haben werden. Zusammenfassung von Teil 11 Neurale Stammzellen sind multipotente Vorläuferzellen des Nervensystems und sie können sowohl zu Neuronen als auch zu Gliazellen differenzieren. Nach den anfänglichen Publikationen, die über die erfolgreiche Isolierung und anschliessende Vermehrung von neuralen Stammzellen in vitro berichteten (Cattaneo und McKay, 1990; Reynolds et al., 1992; Kilpatrick und Bartlett, 1993), hat das Gebiet der Stammzellforschung während der letzten zehn Jahre ein beachtliches Interesse erlangt. Speziell die Entdeckung, dass eine relativ ruhende Population von neuralen Stammzellen in spezialisierten Regionen des Gehirns bis zum erwachsenen Alter erhalten bleibt (Lois und Alvarez-Buylla, 1993), hat Hoffnungen geweckt, dass diese Zellen vielleicht aktiviert werden könnten, um in pathologischen Fällen-zum Beispiel in der Parkinson'schen Krankheit-in funktionelle Neuronen zu differenzieren. Dementsprechend wurden grasse Anstrengungen unternommen, um die adulten neuralen Stammzellen auf molekularer und zellulärer Ebene zu charakterisieren. Es ist gezeigt worden, dass Integrine in die Aufrechterhaltung von Stammzell-kompartimenten, wie zum Beispiel die männliche Keimbahn (Shinohara et al., 1999) und die Haut (Brakebusch et al., 2000) involviert sind. In diesem Zusammenhang war das Ziel des zweiten Teils meiner Doktorarbeit (Kapitel 3 auf Seite 61), die Rolle von ß1-Integrin in neuralen Stammzellen und in stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen zu untersuchen. Mittels Neurosphere-Kulturen aus mutanten Mäusen, die ein konditionelles ß1-Integrin knock-out Allel tragen, konnte ich zeigen, dass ß1-Integrin nicht für die Erhaltung von neuralen Stammzellen, aber für das Überleben und die Proliferation der stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen notwendig ist. ß1-Integrin-defiziente Vorläuferzellen zeigen eine signifikant beinträchtigte Adhäsion und eine stark reduzierte Migrationskapazität auf Integrin-spezifischen Substraten. Diese neuen Erkenntnisse legen nahe, dass Integrin-vermittelte Adhäsion eine wichtige Rolle im Verhalten von neuralenvorläuferzellen spielt. Referenzen Berger, P., Young, P., and Suter, U. (2002). Molecularcell biology of Charcot-Marie-Tooth disease, Neurogenetics 4, Brakebusch, c., Grase, R, Quondamatteo, E, Rarnirez, A., Jorcano, J. L., Pirro, A., Svensson, M., Herken, R, Sasaki,T., Timpi, R, et al. (2000). Skin and hair follicle integrity is cruciallydependent on beta 1 integrin expressionon keratinocytes, Embo J 19,

7 Zusammenfassung 7 Cattaneo, E., and MeKay, R (1990). Proliferation and differentiation of neuronal stern eells regulated by nerve growth faetor, Nature 347, Kilpatrick.T. J., and Bartlett, P. F. (1993). Cloning and growth of multipotential neural preeursors: requirements for proliferation and differentiation, Neuron 10, Lewandoski, M. (2001). Conditional control of gene expression in the mouse, Nat Rev Genet 2, Lois, c., and Alvarez-Buylla, A. (1993). Proliferating subventricular zone eells in the adult mammalian forebrain ean differentiate into neurons and glia, Proe Natl Aead Sei USA 90, Ramön Y Cajal, S. (1928). Degeneration and Regeneration of the Nervous System (New York, Hafner Publishing). Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., and Weiss, S. (1992). A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor eell produees neurons and astrocytes, J Neurosei 12, Shinohara, T., Avarboek, M. R, and Brinster, R L. (1999). betal- and alpha6-integrin are surfaee markers on mouse spermatogonial stern cells, Proe Natl Aead Sei USA 96, Suter, U., Moskow, J. J., Welcher, A. A., Snipes, G. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Buehberg, A. M., and Shooter, E. M. (1992a). A leucine-to-proline mutation in the putative first transmembrane domain of the 22-kDa peripheral myelin protein in the trembler-j mouse, Proe Natl Aead Sei USA 89, Suter, U., Weleher,A. A., Ozeelik, T., Snipes, G. J., Kosaras, B., Franeke, U., Billings-Gagliardi, S., Sidman, R L., and Shooter, E. M. (1992b). Trembler mouse carries a point mutation in a myelin gene, Nature 356,