Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung)

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1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) Hämatoxylin Hämalaun (17) Hämatoxylin ist ein farbloser Pflanzenfarbstoff, welcher durch Alkoholextraktion aus Blauholz gewonnen wird. Durch Oxidation wird Hämatoxylin in den Farbstoff Hämatein überführt. Diese Oxidierung = Dehydrierung = Reifung kann -natürlich- durch längeres stehen an der Raumluft oder -künstlich- durch Zugabe von Oxidierungsmitteln schneller erfolgen. Angewandte Oxidationsmittel sind z.b.: NaJO3, KJO3 und KClO4. Hämatein ist ein saurer Farbstoff und hat in saurer Lösung eine gelb-rötliche Farbe. Ohne zusätzliche "Beizung" des Hämateins ist eine Kernfärbung nicht durchführbar. Über Zugabe von Alaunen entstehen nun die unterschiedlichen Lacke - Hämatoxylin-Alaune = Hämalaune - wobei es Eisen-, Blei- und Chromhämatoxyline gibt. Das ganze ist etwas verwirrend und soll in folgender Grafik vereinfacht dargestellt werden: Hämalaun selbst sollte progressiv gefärbt werden. Das heißt das der Färbegrad während der Färbung kontrolliert, und die Färbung bei gewünschtem Färbeergebnis abgebrochen wird. Eine "Überfärbung" ist nur schwer rückgängig zu machen - z.b. durch ein Salzsäure-Alkohol-Gemisch. Während der Färbung lagern sich die positiv geladenen Komplexverbindungen des Alaun an die negativ geladenen Phosphatgruppen von Nucleinsäuren. Die eigentliche tiefblaue Färbung der Kerne wird durch Bläuen - das Einstellen des ph Wertes >3 - mittels Leitungswasser oder einer 0,1%igen NaHCO3-Lsg. erreicht, was auf die Indikatoreigenschaften der Schwermetallanteile des Alauns zurückzuführen ist. Eosin Die Hauptbedeutung des Eosins liegt in der am häufigst angewandten Übersichtsfärbung, der gemeinsamen Färbung mit Hämalaun - der HE-Färbung. Eosin wird regressiv gefärbt, es wird also erst überfärbt und anschließend differenziert. Es ist negativ geladen und bindet sich an die postiven Gruppen von z.b. Eiweißen mittels elektrostatischer Adsorbtion. Ein zu starkes überfärben ist strikt zu vermeiden, es erzeugt keinesfalls eine bessere Unterscheidung bei der Mikroskopie, sondern erzeugt nur schmierige und undeutliche Präparate. Eosin Y - Eosin G Der Name Eosin Y bzw. G oder besser gesagt das Kürzel Y bzw. G stammt von der gelblichen Farbe des wasserlöslichen Eosins. Gelb = G = Yellow = Y Eosin gehört der Fluoreszein-Gruppe an, ist gut wasserlöslich und schwach sauer. Benutzt wird es in 1%iger, mit Eisessig angesäuerter, wässriger Lösung. (1Tr. Eisessig auf 100ml 1%igem Eosin in a.d.) Eosin muss nach dem Färben ausreichend in Wasser differenziert werden, es wird also regressiv gefärbt. Außerdem kann Eosin ansonsten bei wasserlöslichen Eindeckmitteln, z.b. Glyzeringelatine, sich darin lösen und einen Farbschleier erzeugen. Eosin S Neben dem wasserlöslichen Eosin gibt es noch das wasserunlösliche Eosin. Dieses Ethyleosin -Eosin S- wird in 70%igem EtOH gelöst und weist eine bessere Lichtbeständigkeit auf. Das Kürzel S weist hier auf die Alkohollöslichkeit hin, S = spritlöslich. Jod-Eosin Bei diesem Eosin sind die 4 Brommoleküle durch Jod ersetzt. Ein anderer Name für Jod- Eosin ist auch Erythrosin.

2 Erythrosin findet in der Histologie kaum Anwendung. Ein Färbebeispiel ist die CHESA Färbung, einer kombinierten Färbung von Keratin und Schleim. Zusammenfassung Die HE-Färbung : ist eine Succedanfärbung / Sukzedanfärbung - es wird nacheinander gefärbt basiert auf dem Prinzip der Durchtränkung und der elektrostatischen Absorbtion. Hämalaun wird progressiv gefärbt, beim erreichen des gewünschten Färbegrades wird die Färbung abgebrochen. Hämalaun ist positiv geladen und bindet sich an die sauren Bestandteile der DNS -> Kernfärbung Eosin wird regressiv gefärbt, es wird also erst überfärbt und anschließend differenziert. Eosin ist negativ geladen und bindet sich an die positiven Gewebsbestandteile (Eiweiße) - > Plasmafärbung Arbeitsvorschriften: Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung) nach: Paraffinierte Schnitte in Küvetten mit folgenden Lösungen nacheinander einstellen: Objekte in saurem Hämatoxylin nach Ehrlich Saures Hämatoxylin nach Ehrlich 2-15 min Ist die Färbung nach dem Bläuen zu dunkel ausgefallen, in 0.1%iger wäßriger Salzsäure differenzieren (unter dem Mikroskop kontrollieren). Wenn die Differenzierung das gewünschte Ausmaß erreicht hat, den Objektträger möglichst schnell in ammoniakalisches Wasser bringen. Der Objektträger bleibt hierin solange, bis sich die Objekte blau verfärbt haben, anschließend in fließendem Leitungswasser auswaschen, Bläuen in fließendem Leitungswasser oder in %iger Natriumhydrogencarbonatlösung Abspülen in Aqua dest. Eosinlösung verdünnt mit Aqua dest. 1+10, Sollte der Farbstoff nicht auf das Gewebe aufziehen, zu 100ml dieser Lösung 1 Tropfen Eisessig geben. Spülen in Aqua dest. 2x 10 min oder in saurem Hämalaun nach Mayer färben Hämalaun Gebrauchslösung 5-10 Min., bis die Kerne gut gefärbt sind (unter dem Mikroskop kontrollieren). Überschüssige Farblösung vom Objektträger ablaufen lassen und mit Aqua dest. spülen bis das ablaufende Wasser farblos ist. (Objekte bzw. Schnitte sind weinrot) Ev. mit Salzsäure differenzieren siehe Ehrlichs Hämatoxylin (oft bessere Ergebnisse!) 10 min 5-10 min. 1-2min spülen Kerne blauschwarz bis violett, Plasma rosa bis rot, Knorpel dunkelblau,

3 Nissl-Färbung Eine Nissl-Färbung ist jede Färbemethode zur Darstellung von Nervenzellkernen und sog. Tigroid-Schollen oder Nissl-Schollen (Endoplasmatisches Retikulum der Nervenzellen). Besonders gut geeignet ist der basische Teerfarbstoff Kresyl(echt) violett oder Thionin Arbeitsvorschriften: Nisslfärbung Schnellmethode nach: Paraffinierte Schnitte in Küvetten mit folgenden Lösungen nacheinander einstellen: 2x 10 min gepufferte Farblösung 10 Min. Abspülen der Schnitte in Acetatpuffer Zellkerne und Nissl-Substanz violett, Nervenzellen ganz schwach blau, Rest farblos.

4 Papanicolaou-Färbung Die Färbung dient insbesondere zur Darstellung unterschiedlich alter Zellen von Zellabstrichen. Dies spielt insbesondere eine große Rolle in der gynäkologischen Zytodiagnostik. Der Pap-Test wurde 1928 von dem griechischen Arzt George Papanicolaou entwickelt. Er beruht auf der Beurteilung von gefärbten Zellabstrichen vom Muttermund der Frau und dient der Früherkennung eines Gebärmutterhalskrebses. Die Befunde werden insbesondere hinsichtlich der Zervix-Krebsdiagnostik in Gruppen nach der Münchner Nomenklatur II klassifiziert. (18) Arbeitsvorschriften: Papanicolaou-Färbung Nach: Mittels Wattestäbchen wird ein Abstrich der Mundschleimhaut entnommen und auf einem Objektträger ausgestrichen, indem der Watteträger auf dem zuvor mit Alkohol geputzten Objektträger abgerollt wird (Nicht wischen!). Nach der Anfertigung des Ausstriches muss sofort fixiert werden, bevor eine Lufttrockung einsetzt. Als Fixiermittel können käufliche Sprays, wie Merckofix-Fixiertspray, oder ein Ether-Ethanol-Gemisch (1+1) verwendet werden. Jedoch ist auch eine Fixierung in Ethanol w=95% möglich. (9) Der Abstrich wird in Küvetten mit folgenden Lösungen nacheinander einstellen: Ausstriche sofort nach Entnahme in Fixierlösung 5-10min z.b. Ethanol w=95% Ethanol (Spiritus) w=80% 1-2min A. dest. 1-2min Eisenhämatoxylin nach Harris 4min Differenzieren in Salzsäure-Alkohol ca.3sec Spülen und Bläuen in fließendem Leitungswasser 10 min Ethanol (Spiritus) w=80% 1-2min Orange G 3min Ethanol (Spiritus) w=80% 1-2min Ethanol (Spiritus) w=96% Polychromlsg. EA 50 5min Ethanol (Spiritus) w=96% Junge Zellen haben blaue Kerne und dunkelblaues Plasma. Ältere Zellen: blaue bis rote Zellkerne und hellblaues Plasma (azidophile Zellen: Plasma rosa bis orangerot, basophile Zellen: Plasma grün bis grünblau) Bakterien: blau, Leukozyten blassrosa bis hellviolett, Erythrozyten: rotorange bis rotbraun

5 Masson-Goldner-Färbung Diese Färbung dient der differenzierten Anfärbung der Bindegewebskomponenten. Arbeitsvorschriften: Masson-Goldner-Färbung nach: Paraffinierte Schnitte in Küvetten mit folgenden Lösungen nacheinander einstellen: Weigert s Eisenhämatoxylin Spülen und Bläuen in fließendem Leitungswasser Masson-Goldner I = Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin Abspülen in Essigsäure, w=1% Masson-Goldner II = Differenzieren in Molybdatophosphorsäure-Orange oder Wolframatophosphorsäure-Orange bis zur völligen Entfärbung des Bindegewebes Abspülen in Essigsäure, w=1% Unter dem Mikroskop begutachten, Vorsicht: Das Präparat nicht trocken werden lassen! Masson-Goldner III = Gegenfärbung mit Lichtgrün (bzw. Anilinblau) Auswaschen in Essigsäure,w=1% Von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop begutachten, Vorsicht: Das Präparat nicht trocken werden lassen! Ethanol (Spiritus) w=96% 2x 10 min 1-2 min. Nicht Überfärben! 10-15min 5-7 min 3 min 5 min max.5 min 2x 2-5min Kerne braunschwarz/blauschwarz, Cytoplasma schwachorange bis rot, Erythrocyten leuchtend rot, Bindegewebe, Kollagen und Schleim grün, Muskulatur hellrot Bemerkung: Die Färbung gelingt besonders gut nach Fixierung mit Bouin. Das Lichtgrün kann auch durch Anilinblau wasserlösl. ersetzt werden.

6 Materialien und Chemikalien: Hinweis: viele Färbelösungen sind lange vor Gebrauch anzusetzen und müssen reifen. Käuflich sind diese Lösungen auch bei der Firma Merck oder Chroma erhältlich. Acetatpuffer für Nissl-Färbung: In vorgelegten 100ml Aqua dest. werden 1.088g Natriumacetat (wasserfrei) oder 1.805g Natriumacetat-Trihydrat gelöst und auf 200ml aufgefüllt. (ph-wert 3,8-4,0) oder 1 Teil 2,72% Natriumacetat + 4 Teile 1,201% Essigsäure ammoniakalisches Wasser : Zu 100ml Aqua dest. wird 1 Tropfen konz. Ammoniaklösung gegeben. Eisenhämatoxylin nach Weigert: Lösung A: 1g Hämatoxylin in 100ml 96%igem Ethanol lösen. Eventuell etwas erwärmen. Die Lösung sollte eine Woche reifen. Lösung B (Methode 1): 1.16g Eisen(III)-chlorid in 99ml Aqua dest. lösen dann 1ml 25%ige Salzsäure zusetzen. Lösung B (Methode 2): 4ml 29%ige Eisen(III)-chloridlösung (=Ferrum sesquichloratum) und 1ml 25%ige Salzsäure zu 95ml Aqua dest. geben. Beide Stammlösungen sind unbegrenzt haltbar. Unmittelbar vor der Färbung mischt man Lösung A und B zu gleichen Teilen. Diese Lösung ist nur ca. 8 Tage haltbar! Regressive Färbung! Eisenhämatoxylin nach Harris = Papanicolaoulösung I: 1g Hämatoxylin in 10ml abs. Ethanol unter leichtem Erwärmen lösen, 20g Ammonium- oder Kalialaun in 200ml Aqua dest. unter Erwärmen lösen. Die Hämatoxylinlösung langsam und unter ständigem Rühren in die heiße Alaunlösung einfließen lassen, anschließend kurz aufkochen. Das Erhitzen beenden und 0,5g Quecksilber(II)-oxid zugeben ( VORSICHT schäumt auf ). Im kalten Wasserbad rasch abkühlen und mit 1ml Eisessig versetzen, filtrieren. Regressive Färbung! Eiweißglycerin: geschlagenes Eiweiß, filtriert und Glycerin im Verhältnis 1:1, zur besseren Stabilität ein Körnchen Thymol zusetzen) Eosinlösung: 1g Eosin in 100ml Aqua dest. lösen. Haltbar Hämalaun (saures) nach Mayer (Stammlösung): 1g Hämatoxylin in 1000ml Aqua dest. lösen, dann genau 0.2g Natriumjodat und 50g reinen Kalialaun zugeben. Hämalaun Gebrauchslösung: Zu 100ml der Stammlösung werden 5g Chloralhydrat und 0.1g Zitronensäure zugefügt. Vor Gebrauch filtrieren. Hämatoxylin (saures) nach Ehrlich (Methode 1): 1g Hämatoxylin in 50ml 96%igem Isopropanol lösen (evtl. etwas erwärmen). 1.5g Kalialaun in 50ml Aqua dest. unter Aufkochen lösen und in die noch warme Alaunlösung 50ml reinstes Glycerin geben. Zu dieser Mischung wird die Hämatoxylinlösung unter ständigem Rühren zugegeben und mit 5ml Eisessig versetzt. Diesen Ansatz 14 Tage unter öfterem Umschütteln in, mit einem Papierhütchen bedeckten, Gefäß reifen lassen. Hämatoxylin (saures) nach Ehrlich (Methode 2): 1g Hämatoxylin in 50ml 96%igem Isopropanol lösen und 50ml Aqua dest., 50ml reinstes Glycerin, 1.5g Kalialaun und 5ml Eisessig zufügen. Dann mit genau 0.2g Kaliumjodat versetzen, gut vermischen. Dieser Ansatz ist sofort gebrauchsfertig.

7 Kesylviolett-acetat: siehe Nissl Lichtgrün SF: siehe Masson-Goldner III Masson-Goldner I = Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin: 88ml 0.2%ige Essigsäure mit 7ml Masson-Lösung und 2ml Azophloxinlösung versetzen. Masson-Lösung: 0.2g Ponceau de Xylidine, 0.1g Säurefuchsin in 300ml Aqua dest. kurz kochen, dann 0.6ml Eisessig zugeben und filtrieren. Azophloxin-Lösg.: 0.5g Azophloxin werden in 100ml Aqua dest., das mit 0.2ml Eisessig versetzt wurde, gelöst. Masson-Goldner II = Molybdatophosphorsäure-Orange: 3-5g Molybdatophosphorsäure und 2g Orange G in 100ml Aqua dest. lösen. Oder Wolframatophosphorsäure-Orange: 3-5g Wolframatophosphorsäure und 2g Orange G in 100ml Aqua dest. lösen. Masson-Goldner III = Lichtgrün SF: g Lichtgrün SF in 100ml Aqua dest., das mit 0.2ml Eisessig versetzt wurde, lösen, Statt Lichtgrün kann auch Anilinblau wasserl. verwendet werden. Molybdatophosphorsäure-Orange: siehe Masson-Goldner II Nissl-Farblösung: In 100ml Acetatpuffer Pufferlösung werden 0.5g Kesylviolett-acetat oder Thionin gelöst. Orange G = Papanicolaoulösung II: Orange G 5g/L in 100ml Ethanol, w=96% + Phosphorwolframsäure 0,015g, Papanicolaoulösung I: siehe Eisenhämatoxylin nach Harris Papanicolaou II: siehe Orange G Papanicolaou III: siehe Polychromlsg. EA 31 oder EA 50 (zum Färben v. Vaginal-, Zervikaloder Uterusabstrichen oder Polychromlsg. EA 65 (zum Färben von Sputum-, Bronchial-, Magen- oder Darmproben) käuflich zu erwerben bei Chroma oder Merck Polychromlösung EA 36: Lichtgrün SF, gelblich 1g/L in Ethanol, w=95%, 145ml +Bismarckbraun 5g/L in Ethanol, w=95%, 10ml +Eosin, gelbl., wasserl.und alkoholl., 5g/L in Ethanol, w=95%, 45ml +Phosphorwolframsäure 0,2g Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin: siehe Masson-Goldner I Salzsäure-Alkohol: w=0,5% in 95% Ethanol Thionin: siehe Nissl