Untersuchungen der Wirkung unterschiedlicher FSH-Dosierungen und FSH-Applikationsregime auf Superovulationsergebnisse bei Rindern der Rasse Fleckvieh

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1 Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Forschungsbereich Fortpflanzungsbiologie des Forschungsinstitutes für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf Untersuchungen der Wirkung unterschiedlicher FSH-Dosierungen und FSH-Applikationsregime auf Superovulationsergebnisse bei Rindern der Rasse Fleckvieh INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von GUIDO MARTENS aus Geestenseth Hannover 2004

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke Prof. Dr. W. Kanitz 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke 2. Gutachter: PD Dr. H. Zerbe Tag der mündlichen Prüfung: Gefördert aus den Mitteln der Dr. Dr. h.c. Karl-Eibl-Stiftung

3 Meinen Eltern und Isabelle

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Aufgabenstellung Literaturübersicht Der Sexualzyklus des Rindes Neuro-endokrine Regulation des Sexualzyklus Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) Hypophysäre Gonadotropine Progesteron Inhibin Activin / Follistatin Ovarielle Follikeldynamik Follikelpopulationen Follikelwachstum in Reifungswellen Superovulation Grundlagen der Superovulation Tierspezifische Faktoren Einflüsse der Superovulationsbehandlung Stimulationsregime mit den FSH-Präparaten Folltropin und Pluset Untersuchungen zur Optimierung der FSH-Dosis und der Injektionshäufigkeit Beeinflussung von Hormonkonzentrationen infolge von Superovulationsbehandlungen Beeinflussung des endogenen LH Beeinflussung des endogenen Östradiols Beeinflussung des endogenen Progesterons Konzentrationverläufe von endogenem und exogenem FSH Eigene Untersuchungen Material und Methode Tiermaterial Superovulationsbehandlung Künstliche Besamung Embryonengewinnung Extraktion der Embryonen und Eizellen Beurteilung und Klassifizierung von Embryonen und Eizellen Blutprobenentnahme Hormonanalytik Analyse von Progesteron Analyse von Östradiol 17ß Analyse von LH Analyse von FSH Ultrasonographische Untersuchung der Ovarien Statistische Auswertung Ergebnisse Versuch 1: klinische Erhebung... 53

6 Inhaltsverzeichnis Donorenreaktionsrate Ergebnisse der Embryonengewinnung in Abhängigkeit von der Applikationsfrequenz Ergebnisse der Embryonengewinnung in Abhängigkeit von der FSH- Dosis Ergebnisse der Embryonengewinnung in Abhängigkeit vom Zeitpunkt des Beginns der SO-Behandlung Ergebnisse der Embryonengewinnung in Abhängigkeit vom Alter des Donors Versuch 2: Modellstudie Klinische Ergebnisse Endokrinologische Ergebnisse Charakteristika der LH-Sekretion Konzentrationsverläufe von Östradiol-17β Konzentrationsverläufe von Progesteron Kinetik des exogenen FSH Diskussion Applikationsfrequenz Dosierung Einfluss des Zeitpunktes des Beginns der SO-Behandlung und des Alters der Donoren Endokrinologie Zusammenfassung Summary Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang Verzeichnis der verwendeten Medien Auflistung der Analysedaten für b-lh, p-fsh, Östradiol-17β und Progesteron

7 Literaturübersicht 7 1 Einleitung und Aufgabenstellung Das biotechnische Verfahren des ET wird in Deutschland seit ca. 30 Jahren eingesetzt. Durch die Einführung der unblutigen Embryonengewinnung ist es zum praxisreifen Routineverfahren geworden. Er dient auf breiter Basis der Beschleunigung und Festigung des Zuchtfortschrittes in den Rinderpopulationen unterschiedlicher Rassen. Der zusätzliche Zuchtfortschritt wird durch eine frühere Verfügbarkeit von Zuchtbullenkälbern sowie durch eine schärfere Selektion der Bullenmütter erreicht. Darüber hinaus ist der Embryotransfer zur Basistechnologie für weitere Teilgebiete der Reproduktionsmedizin geworden. Der Erfolg bei der Anwendung der Reproduktionstechnik hängt von der sicheren Beherrschung aller Teilschritte des Verfahrens ab. Ein bisher ungelöstes Problem bei der Anwendung des Verfahrens liegt in der hohen Variabilität der Ovarreaktion bei den Spendertieren. Neben tier- und umweltspezifischen Faktoren haben Aspekte der Superovulationsbehandlung selbst einen entscheidenden Einfluss auf das Ergebnis des Verfahrensschrittes. Unter Superovulation versteht man die Auslösung von Ovulationen, die hinsichtlich der Anzahl über der speziesspezifischen Ovulationszahl liegen. Superovulationen können durch die Applikation gonadotroper Hormone oder durch Immunisierungen gegen Inhibin ausgelöst werden. Bei Verwendung von Gonadotropinen werden die Ergebnisse der Superovulationsbehandlung vor allem vom Zeitpunkt des Behandlungsbeginns, von der Art des Gonadotropins, von der Gesamtdosis, der biologischen Aktivität des Gonadotropins im Fertigarzneimittel, der Applikationsdauer sowie der Applikationsfrequenz beeinflusst. International wird die Verwendung von Follikelstimulierendem Hormon (FSH), welches über die Dauer von 4 Tagen in 8 Injektionen verabreicht wird, favorisiert. Dieses Superovulationsregime bringt einige Nachteile mit sich. So bedeutet eine vielfache intramuskuläre Gabe im zwölfstündigen Abstand einerseits einen hohen Arbeitsaufwand für die durchführende Person, zum anderen Stress für das zu behandelnde Tier.

8 Literaturübersicht 8 In relativ wenigen Arbeiten wird über eine Reduzierung der Injektionsfrequenz berichtet. Die dabei erzielten Ergebnisse sind widersprüchlich. Mit der vorliegenden Arbeit wurden deshalb zwei Ziele verfolgt. Das erste bestand in der Untersuchung des möglichen Einflusses der Reduzierung der Injektionsfrequenz auf Superovulationsergebnisse. Das zweite Ziel lag in der Optimierung der Dosis für zwei ausgewählte Fertigarzneimittel. Die Zielstellungen sind für einen verringerten Arzneimitteleinsatz, für eine Reduzierung der Behandlungskosten, für eine Verringerung des mit Superovulationsbehandlungen verbundenen Arbeitsaufwandes sowie für eine verringerte Beeinflussung der Spendertiere bedeutsam.

9 Literaturübersicht 9 2 Literaturübersicht 2.1 Der Sexualzyklus des Rindes Neuro-endokrine Regulation des Sexualzyklus Der Sexualzyklus der weiblichen Säugetiere wird über ein hierarchisches System gesteuert. Die höchste Ebene bildet der Hypothalamus, darunter fungiert die Hypophyse und als untere endokrine Ebene wirken die Ovarien. Alle drei Ebenen interagieren über Rückkopplungsmechanismen miteinander, durch die sezernierte Botenstoffe ihre eigene Produktion und Sekretion direkt oder indirekt beeinflussen Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) Beim GnRH handelt es sich um ein Dekapeptid (MILLAR u. KING 1987). Das im Hypothalamus gebildete GnRH I, das bei Säugetieren in seiner Aminosäuresequenz variiert, ist der zentrale Regulator des Reproduktionssystems (MILLAR 2003). Es wird hauptsächlich im Nucleus arcuatus des Hypothalamus synthetisiert (SILVERMAN 1988; LESHIN et al. 1988) und dann über Zellausläufer in das Portalgefäßsystem des Hypothalamus abgegeben. In der Hypophyse liegt der Hauptwirkungsort des GnRH, wo es die Freisetzung und Synthese des Follikelstimulierenden Hormons und des Luteinisierenden Hormons (LH) bewirkt. GnRH weist eine geringe Halbwertzeit auf, die in einem Zeitraum von zwei bis zwölf Minuten liegt. DIERSCHKE et al. (1970) wiesen als erste auf die pulsatile Sekretion des GnRH hin. Durch die Amplitude und Frequenz der Sekretion ergeben sich zwei zusätzliche Regulationsmechanismen. Die Pulsation wird beim weiblichen Tier über einen Pulsgenerator gesteuert, der beim Affen und bei der Ratte im Nucleus infundibularis des Hypothalamus zu suchen ist. An den gonadotropen Zellen der Hypophyse bewirkt das GnRH zum einen die Freisetzung von membranständigen, Gonadotropin enthaltenen Sekretgranula (CONN et al. 1987). Ferner werden weitere Granula in die Peripherie verlagert und die Synthese der Gonadotropine stimuliert.

10 Literaturübersicht 10 Die Frequenz und Amplitude der Sekretion werden durch ein Netz von Feedback- Mechanismen modifiziert. GnRH ist in der Lage, die Rezeptordichte für den homologen Liganden an den Zielzellen zu erhöhen und diese über die Anreicherung von Sekretgranula für nachfolgende Pulse zu sensibilisieren (AIYER et al. 1974). Diese Sensibilisierung ist allerdings an eine ansteigende Östrogenkonzentration im Blut gebunden. Die Gonadotropine FSH und LH (short feedback) und GnRH selbst (ultra short feedback) wirken hemmend auf die GnRH-Sekretion. Eine weitere Form, das GnRH II tritt ubiquitär auf und weist bei allen Säugetieren eine einheitliche Struktur auf. GnRH II findet man in bestimmten Regionen des zentralen und peripheren Nervensystems sowie auch in nicht neuralen Geweben. GnRH II soll über die Hemmung von Kalium-Kanälen eine neuromodulatorische Funktion besitzen (MILLAR 2003). GnRH II-Rezeptoren sind hochspezifisch und besonders in den Arealen des Nervensystems, die mit dem Geschlechtsverhalten assoziiert sind sowie im Gewebe des Reproduktionstraktes anzutreffen. Beim Rind wird das GnRH II-Rezepor-Gen nicht expremiert (MILLAR 2003). Entwicklungsgeschichtlich ältere Spezies, wie Fische und Amphibien verfügen noch über eine dritte Form des GnRH (PAWSON et al. 2003) Hypophysäre Gonadotropine Im Hypophysenvorderlappen (HVL) werden FSH sowie LH synthetisiert. Beide Hormone sind Glycoproteine, die in den basophilen Zellen der Adenohypophyse unter GnRH-Einfluss synthetisiert werden (KEIDEL 1985). Das Molekulargewicht von FSH beträgt ca kda, das von LH kda. Der Proteinanteil der Gonadotropine besteht aus einer α- und einer β-untereinheit. Die α-kette ist innerhalb einer Spezies für sämtliche Gonadotropine weitestgehend identisch (GOODWIN et al. 1983; STEWART et al. 1987). Die β-kette ist hormonspezifisch und dient der Erkennung des Rezeptors (PIERCE u. PARSONS 1981).

11 Literaturübersicht 11 Abbildung 1: Endokrine Veränderungen beim Rind in den letzten Tagen des Zyklus. (HOFFMANN 1999) Der Kohlenhydratanteil der Gonadotropine macht 15 % - 18 % der Molekülmasse aus und besteht aus Oligosachariden, die kovalent an den Proteinanteil gebunden sind. Besonders hervorzuheben ist hier die Sialinsäure, die zum einen für die biologische Aktivität von Bedeutung ist und zum anderen einen Hemmer der Metabolisierung darstellt. Während die Aminosäuresequenz des Proteinanteils über die immunologische Aktivität des Hormons entscheidet, hängt seine biologische Aktivität im wesentlichen von den Kohlenhydratketten und Sulfatresten ab (RYAN et al. 1987; WILSON et al. 1990). Diese wird zyklusabhängig modifiziert und hauptsächlich durch Östrogene reguliert. Die Rolle des GnRH hierbei ist nicht ausreichend geklärt (COOKE et al. 1995). Die Pulsation oder Episodik ist beim FSH weniger deutlich ausgeprägt als beim LH, was in erster Linie an der längeren Halbwertzeit (HWZ) von 110 min (BOLAND 1991) liegt. Die HWZ von LH beträgt 30 min. Pulsamplitude und Frequenz unterliegen starken individuellen Schwankungen.

12 Literaturübersicht 12 Verallgemeinert gilt, dass die Pulse in der Follikelphase frequenter und in der Amplitude geringer ausfallen, als in der Gelbkörperphase (MEINECKE 2000). Beide Gonadotropine wirken an Rezeptoren gonadotropinreaktiver Follikel. Während LH vorwiegend an der Theca interna andockt, liegen die Rezeptoren des FSH auf den Granulosazellen. Beide Peptidhormone wirken über eine Gonadotropinempfindliche Adenylatcyclase auf die Konzentration des second messangers camp. Dieser bewirkt über Proteinkinasen die Synthese und Aktivierung von Enzymen, die der Steroidsynthese dienen (Abb. 2). Abbildung 2: Steroidbiosynthese (HOFFMANN 1999) Vereinfacht gesagt findet in den Theca interna-zellen, unter dem Einfluss von LH, die Synthese von Androgenen (Androstendion, Testosteron) aus den jeweiligen Steroidhormonvorstufen statt (AUSTIN et al. 2001). FSH bewirkt in den Granulosazellen durch die Aktivierung der Aromatase eine Umwandlung der Androgene in Östrogene, vor allem Östradiol-17β (E 2 ). Im präovulatorischen Zeitraum kommt es östrogenvermittelt zum LH-Peak. LH bindet an den Theca- und Granulosazellen, bewirkt die Luteinisierung der Zellen und induziert die Ovulation.

13 Literaturübersicht Östrogene Östrogene sind C 18 Steroide, die mit einem aromatischen Ring versehen sind. Sie werden im Graaf schen Follikel (KEIDEL 1985) sowie in der Plazenta des graviden Rindes (HOFFMANN et al. 1979) synthetisiert. Das follikuläre Östrogen nimmt in der Steuerung der Ovulation eine zentrale Position ein (GORE-LANGTON u. ARMSTRONG 1988). Indirekt wirkt Östrogen über Dopamin, Noradrenalin und β-endorphine auf die GnRH- Sekretion im Hypothalamus. Unter Östrogeneinfluss werden in der frühen Follikelphase die Zellen des HVL für die eintreffenden GnRH-Pulse sensibilisiert. Dabei steigt gleichzeitig die GnRH-Rezeptordichte im HVL an. In dieser Phase fördert das Östrogen die Synthese und Speicherung der Gonadotropine, wirkt aber hemmend auf deren Sekretion. Der Östrogengehalt steigt in der präovulatorischen Phase kontinuierlich, bis ein kritischer Schwellenwert erreicht wird. Östrogenvermittelt steigt die biologische Aktivität der Gonadotropine an. Unterdessen wird die FSH-Sekretion durch Östrogene gehemmt (GINTHER et al. 1999; 2000). Am Follikel bewirkt Östrogen in hohen Konzentrationen folgende Veränderungen. Es steigert die Mitoseaktivität und führt dadurch zu einer Vermehrung der Granulosazellen und der FSH-Rezeptoren, darüber hinaus ermöglicht Östrogen das Einsprossen von Blutgefäßen in die Theca interna (MEINECKE 2000). Präovulatorisch bewirkt das Östrogen die Ausbildung von LH-Rezeptoren auf den Granulosazellen, die damit befähigt sind auf die hohen, ovulationsauslösenden LH- Mengen zu reagieren. Die Ausschüttung der Gonadotropine wird durch die ansteigende Konzentration der Östrogene verstärkt, so dass es zur Sekretion großer Mengen LH kommt. Es kommt zum präovulatorischen LH-Peak, der im Mittel 26 h vor der Ovulation stattfindet (HOFFMANN 1999).

14 Literaturübersicht Progesteron Progesteron (P 4 ) gehört zu den Gestagenen und stellt chemisch ein C 21 - Steroidhormon dar. Es wird im wesentlichen im Corpus luteum (C.l.) gebildet (KEIDEL 1985). Dort sind die aus den Granulosa- und Thecazellen hervorgegangenen großen bzw. kleinen Luteinzellen für die Synthese und Sekretion des Progesteron verantwortlich. Als Ausgangssubstanz der LH-induzierten Progesteronbildung dient Cholesterol (DORFMAN 1974). In Bezug auf die Follikelbildung zeichnet sich P 4 durch eine stark hemmende Wirkung auf die pulsatile Ausschüttung von GnRH und der Gonadotropine aus. Diese lässt das Erreichen des LH-Peaks nicht zu, und in Folge dessen kommt es nicht zur Ovulation (IRELAND et al. 2000). NANDA et al. (1988) wiesen nach, dass sich bei Rindern mit einer Plasmaprogesteronkonzentration von mehr als 0,5 ng/ml, durch die Gabe von 1 ml Östradiolbenzoat kein LH-Gipfel induzieren lässt. Unter der Wirkung von P 4 ist die Zahl der in der Zeiteinheit gemessenen Freisetzungsimpulse der Gonadotropine erniedrigt (SCHALLENBERGER et al. 1985). (Abb.1). Der Mechanismus, der hier zu Grunde liegt, beruht auf einer kompetetiven Hemmung der Östrogene, die eine Sensibilisierung der HVL-Zellen gegenüber GnRH nicht zulässt, und wahrscheinlich ebenfalls die positive Wirkung des Östrogens auf die GnRH Sekretion unterdrückt (DÖCKE 1994). Erst die durch das Prostaglandin F 2α (PGF 2α ) induzierte Luteolyse löst diese Hemmung auf und lässt die Ovulation zu Inhibin Inhibine stellen glykolisierte Proteinhormone dar. Sie gehören zur Familie des transforming-growth-factors (TGF-β). Inhibine sind Dimere, bestehend aus einer konstanten α- und einer in verschiedenen Formen auftretenden β-untereinheit. Man unterscheidet Inhibin A, dass aus α-β A besteht vom Inhibin B, welches sich aus den Untereinheiten α-β B zusammensetzt. In der Follikelflüssigkeit von Rindern wurde bislang nur Inhibin A nachgewiesen (KNIGHT 1996). Inhibine werden episodisch sezerniert, dies ist aber nicht an die Freisetzung von FSH, LH oder Östradiol gekoppelt, so dass eine lokale Regulation angenommen wird (DÖCKE 1994).

15 Literaturübersicht 15 Syntheseort für Inhibin sind die Granulosazellen der Follikelwand und das Corpus luteum. Inhibine vermindern die Synthese und Sekretion von FSH, die LH- Ausschüttung wird nur unwesentlich vermindert. Inhibine wirken direkt an Rezeptoren der Hypophyse. Die endokrine Wirkung beruht auf einer Verminderung der Expression des Gens, welches der Bildung der FSH-β-Untereinheit dient (DÖCKE 1994). Da FSH den stärksten Stimulator für die Bildung von Inhibin darstellt, entsteht ein direkter negativer Rückkopplungsmechanismus vom Typ des long-loop negative feedback (KNIGHT 1996; MATHER et al. 1997; DE KRETSER et al. 2000). Die Tatsache, dass zum Zeitpunkt tiefster Inhibin-A-Werte im Serum maximale FSH- Konzentrationen gemessen werden können, lässt die Schlussfolgerung zu, dass follikuläres Inhibin den bedeutsamsten Faktor in der Regulation von FSH darstellt (BLEACH et al. 2001; MIHM et al. 2001). An den Theca-Zellen bewirkt es eine Sensibilsierung gegenüber LH, was zu einer verstärkten Bildung von Androgenen führt (KNIGHT u. GLISTER 2001). Neben der zentralen Wirkung übt Inhibin am Ovar auch para- uns autokrine Funktionen aus. Es dient neben Activin, Follistatin und verschiedenen Wachstumsfaktoren als Co-Regulator der Follikulogenese (WEBB et al. 1999a; ELVIN et al. 2000) Activin / Follistatin Activin ist ein Proteinhormon, das in den Granulosazellen sowie in vielen anderen Geweben, u.a. der Hypophyse gebildet wird (BESECKE et al. 1997). Es ist ein Dimer, dass aus zwei β-untereinheiten des Inhibins besteht. Es liegt in drei unterschiedlichen Formen vor. Activin bewirkt eine Steigerung der Sekretion und der Wirkung des FSH. Die zentrale Stimulation im HVL, wo es einen Anstieg der Anzahl gonadotroper Zellen hervorruft, ist der lokalen auto- und parakrinen Funktion am Ovar untergeordnet (WEBB et al. 1999a; ELVIN et al. 2000). Dort bewirkt es eine Proliferation der Granulosazellen, eine Erhöhung der FSH-Rezeptordichte und begünstigt die Synthese von Östrogenen. Des Weiteren hemmt es die Androgensynthese in den Thecazellen und verzögert so die Luteinisierung am Follikel (KNIGHT u. GLISTER 2001).

16 Literaturübersicht 16 In zahlreichen In-vitro-Untersuchungen wurde deutlich, dass Activin auch modulierend auf die GnRH-Sekretion im Hypothalamus wirken kann. Eine Bestätigung darüber besteht allerdings am lebenden Tier bislang noch nicht (PADMANABHAN et al. 2002). Follistatin ist ein monomeres Glycoprotein, dass von zahlreichen Zellen der Hypophyse gebildet wird, welches aber auch in der Follikelflüssigkeit zu finden ist. Es bindet und neutralisiert das Activin und hemmt so dessen Wirkung (NAKAMURA et al. 1990; ROBERTSON 1992). In seiner Hauptwirkung, der Verminderung der FSH- Sekretion, ist es deutlich weniger potent als das Inhibin Ovarielle Follikeldynamik Follikelpopulationen Beim Rind setzt die Oogenese bereits in der frühen Embryonalphase ein. Die primordialen Keimzellen unterliegen einer proliferativen mitotischen Zellteilung. Es können mehr als zwei Millionen Keimzellen entstehen, die allerdings größtenteils im Verlaufe der Oogenese degenerieren, so dass ein weibliches Kalb bei seiner Geburt durchschnittlich über Oozyten verfügt (ERICKSON 1966). Diese werden von Vorläufern der Granulosazellen umgeben, die den Mesenchymzellen des rete ovarii entstammen. Gemeinsam bilden sie einen Komplex, den man als Primordialfollikel bezeichnet. Erst mit Beginn der Geschlechtsreife beginnen Primordialfollikel ein initiales Wachstum, bei dem die Oozyte an Größe gewinnt und die Prägranulosazellen kubische Gestalt annehmen (FORTUNE et al. 2000). Der Übergang des Primordialfollikels in den jetzt entstandenen Primärfollikel teilt die Follikelpopulation in einen, die Primordialfollikel beinhaltenden, ruhenden und in einen wachsenden Pool, der sich aus Primär-, Sekundär- und Tertiärfollikeln zusammensetzt (SCHUFFENHAUSER et al. 1987; KANITZ et al. 2001). Der auslösende Mechanismus, der dem Eintritt der Primordialfollikel in den wachsenden Pool zugrunde liegt, ist noch nicht vollends geklärt (WEBB et al. 1999b). Der Eintritt in den wachsenden Pool ist unumkehrbar. Beginnt der Primordialfollikel seine Entwicklung, so führt diese bis zur Ovulation oder bis zur Atresie (HSUEH et al. 1996; MEINECKE 2000).

17 Literaturübersicht 17 Die ersten Teilungen der Granulosazellen und die Größenzunahme der Eizelle finden hormonunabhängig statt (MEINECKE 2000). Auch die erste antrale Wachstumsphase, also der Übergang vom Sekundär- zum Tertiärfollikel, kann bei basalen FSH-Konzentrationen und ohne LH-Pulse stattfinden (CROWE et al. 2001). Ob in der frühen antralen Follikelphase FSH überhaupt benötigt wird, ist noch unklar. So können Mäuse, die aufgrund einer Nullmutation nicht auf FSH reagieren können, den Wachstumsschritt von der präantralen zur frühen antralen Follikelphase nicht vollziehen (ABEL et al. 2000) Follikelwachstum in Reifungswellen Das Heranreifen der Follikel des wachsenden Pools bis zur Ovulation oder bis zur Atresie findet in Anbildungswellen statt. Es bilden sich innerhalb einer Follikelwelle Gruppen von drei bis sechs Follikeln mit einer Größe 5 mm heran (SAVIO et al. 1988; SIROIS u. FORTUNE 1988). Andere Autoren gehen von einer weitaus größeren Anzahl der, zu einer Kohorte gehörenden Follikel aus (TURZILLO u. FORTUNE 1990; ADAMS et al. 1992; SUNDERLAND et al. 1994; ADAMS 1999). Schwankunken in den Literaturangaben bezüglich der Anzahl der Follikel resultieren aus variierenden Methoden der Zählung und Klassifizierung der Follikel (KANITZ et al. 2002), insbesondere die Auflösung der sonographischen Bilder und der Einfluss des Untersuchers führen zu variierenden Ergebnissen. Innerhalb eines ovariellen Zyklus finden zwei (GINTHER et al. 1989; BELLMANN 2001), drei (GINTHER et al. 1989; BELLMANN 2001) oder vier (RHODES et al. 1995) solcher Anbildungswellen statt. Diese Art der Follikelanbildung kann man nicht nur bei Tieren mit normalem Brunstzyklus (ROCHE et al. 1999) beobachten, sondern bereits in der präpubertären Phase (EVANS et al. 1994; ADAMS et al. 1994; MELVIN et al. 1999), während der Gravidität (TAYLOR u. RAJAMAHENDRAN 1991) sowie post partum (MURPHY et al. 1990). Bei der Rekrutierung der Follikel einer Reifungswelle ist das FSH der entscheidende Auslöser (ADAMS et al. 1992; SUNDERLAND et al. 1994; FRICKE et al. 1997). CROWE et al. (1998) beschreiben, dass dem Erscheinen einer Follikelwelle, immer ein FSH-Anstieg vorausgeht. Die FSH-Konzentration steigt drei bis vier Tage und erreicht ihr Maximum ein bis zwei

18 Literaturübersicht 18 Tage, bevor die neue Anbildungswelle mittels Ultraschall erkennbar wird. Dabei zeigen Tiere, in deren Zyklus zwei Wachstumswellen beobachtet wurden, einen zweimaligen Anstieg von FSH, diejenigen mit drei Follikelreifungswellen zeigen drei mal einen Anstieg von FSH (ADAMS et al. 1992). Abbildung 3: Schematische Darstellung von Ereignissen in Follikelreifungswellen während eines Interöstrusintervalls. (Kanitz et al. 2003) Wird im Zeitraum der Rekrutierung die FSH-Wirkung durch die Gabe von steroidfreier boviner Follikelflüssigkeit unterdrückt, so bleibt das Erscheinen einer neuen Follikelwelle aus (BLEACH et al. 2001). Die Gabe von exogenem FSH bewirkt dagegen die Anbildung einer neuen Follikelwelle (BERGFELT et al. 1994). Die Rekrutierung der Kohorte geht in diesen Follikeln mit beginnender Expression der mitochondrialen RNA (mrna) für die Enzyme P450scc und P450arom in den Granulosazellen einher (BAO u. GARVERICK 1998; BEG et al. 2001; 2002). Diese Enzyme dienen der Abspaltung von Seitenketten bzw. der Aromatisierung bei der Steroidsynthese.

19 Literaturübersicht 19 Zwischen den Follikeln einer Kohorte findet eine Selektion statt, bei der sich die Anzahl der wachsenden Follikel auf die Spezies spezifische Ovulationsanzahl reduziert (FORTUNE 1994). Die Selektion findet unter dem Einfluss sinkender FSH- Konzentrationen (EVANS et al. 1997; AUSTIN et al. 2001), die unterhalb des benötigten Bedarfs kleinerer Follikel liegen statt (Abb. 3). Hierfür sind hauptsächlich die vom größten Follikel gebildeten Östrogene und Inhibin verantwortlich (GINTHER et al. 2001). Darüber hinaus wird die Rolle weiterer Wachstumsfaktoren wie Activin sowie des insulin-like-growth-faktors (IGF) bei der Auswahl des Dominanten Follikels (DF) diskutiert (CHAMBERLAIN u. SPICER 2001; MIHM u. AUSTIN 2002; SCHAMS et al. 2002). Das System der IGF besteht aus dem IGF-I, dem IGF-II (SPICER u. ECHTERNKAMP 1995), deren Rezeptoren und 6 verschiedenen, spezifischen IGF- Bindungsproteinen (IGFBP). IGF I wird lokal synthetisiert und reguliert. Es steigert die Wirkung, die die Gonadotropine auf das Wachstum und die Steroidsynthese der Follikel ausüben (MIHM u. AUSTIN 2002). Die Konzentration der IGFBP (insbesondere IGFBP II, IV und V) ist zum Zeitpunkt der Selektion in der Follikelflüssigkeit subordinanter Follikel größer, als im späteren DF (MIHM et al. 1997). Das Vorkommen der einzelnen Komponenten des IGF-Systems in den Follikeln einer Kohorte liefert Aufschlüsse über den Zustand des Follikels und kann dabei helfen, den Entwicklungszustand von Follikeln einzuschätzen (MIHM u. AUSTIN 2002). Um die Rolle des DF einnehmen zu können, ist die Expression von mrna für LH- Rezeptoren und für das Enzym 3β-HSD in den Granulosazellen von Bedeutung (BAO u. GARVERICK 1998; BEG et al. 2001; 2002). Inwieweit die Dominanz jetzt zur Ovulation oder zur Atresie des Follikels führt, hängt von der Funktion des Corpus luteum und damit vom negativem Einfluss des Progesterons auf die LH-Pulsatilität ab (IRELAND et al. 2000). Diese ist entscheidend für das weitere Wachstum von Follikeln mit einem Durchmesser von mehr als 9 mm (GONG et al. 1996; KANITZ et al. 2001). In der Phase der Dominanz findet ein Wechsel von der FSH- hin zur LH- Abhängigkeit statt. Wird eine Pulsrate von einem LH-Puls im Zeitraum von zwei Stunden unterschritten wird die Atresie des DF herbeiführt (MIHM u. BLEACH 2003).

20 Literaturübersicht Superovulation Grundlagen der Superovulation Unter Superovulation (SO) wird die Auslösung multipler Ovulationen verstanden, deren Anzahl das artspezifische Maß überschreiten. Dieses wird durch die Applikation exogener Hormone wie PMSG (Pregnant Mares` Serum Gonadotropin), FSH oder hmg (Human menopausal Gonadotropin) in der frühen Follikel- oder meist in der Lutealphase erreicht (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Ovulationszahl liegt in der aktiven (PRICE et al. 1987; SCANLON et al. 1993; MORRIS et al. 1993; MEDAN et al. 2003b) oder passiven (MEDAN et al. 2003a) Immunisierung gegen Inhibin. Die weltweit bevorzugte Methode beim Rind zur Auslösung einer Superovulation ist die Behandlung mit FSH. Das FSH wird in der Regel aus Schweinehypophysen gewonnen, da diese einen hohen Gehalt an FSH aufweisen und relativ leicht zu beschaffen sind. Die Applikation erfolgt meist in abnehmender Konzentration über drei bis vier Tage, beginnend zwischen Tag acht und Tag zwölf des Brunstzyklus (LINDSELL et al. 1986a; GOULDING et al. 1990). Dann sind besonders viele beeinflussbare Follikel vorhanden. An Tag drei oder vier der SO-Behandlung wird mittels PGF 2α, respektive eines seiner Analoga, die Luteolyse eingeleitet. Häufig werden zwei Injektionen im Abstand von 12 h verabreicht. Die Zeitspanne zwischen der Injektion von PGF 2α und dem LH-Peak ist bei superovulierten Tieren im Vergleich zu normal zyklischen Tieren stark verkürzt (SAUMANDE 1980b) und liegt relativ konstant bei Stunden (KANITZ et al. 2002). Die Follikel, die auf die SO-Behandlung reagieren, befinden sich beim Start der SO- Behandlung teilweise noch in der Wachstumsphase oder sie sind bereits in den Prozess beginnender Atresie eingetreten (MERTON et al. 2003). Die gonadotropinabhängigen, antralen Follikel weisen einen Durchmesser > 2 mm auf (KANITZ et al. 2002). KAWAMATA (1994) stellte eine positive Korrelation zwischen der Anzahl der kleinen Follikel (3-6 mm) bei Beginn der SO-Behandlung und der Anzahl der C.l nach der SO, der Anzahl gespülter Eizellen und Embryonen sowie der Anzahl der transfertauglichen Embryonen fest.

21 Literaturübersicht 21 Durch die exogene Zufuhr von Gonadotropinen wird zum einen die Atresie der Tertiärfollikel verhindert, wodurch mehrere Follikel zur Ovulation gelangen (MOOR et al. 1984; ARMSTRONG u. LEUNG 1990), zum anderen findet durch das exogene FSH eine verstärkte Rekrutierung statt (ARMSTRONG u. LEUNG 1990). Der negative feedback, der bei der Selektion des DF die Konzentration der Gonadotropine begrenzt, wird durch die Gabe exogener Gonadotropine außer Kraft gesetzt (DRIANCOURT 1991). Das größte Problem beim Embryotransfer liegt in der hohen Variabilität der Ovarreaktion (ADAMS 1994). Auf der Suche den Ursachen hierfür werden viele Faktoren in betracht gezogen Tierspezifische Faktoren Einflussfaktoren auf die Embryonenausbeute sind der Ernährungsstatus, das Alter, die Rasse, und die reproduktive Vergangenheit des Donors sowie die Auswirkungen wiederholter SO-Behandlungen (MAPLETOFT et al. 2002). Bei fleischbetonten Rassen ist in der Regel die zu erwartende Ovulationszahl deutlich höher als bei milchbetonten Rassen (NIEMANN u. MEINECKE 1993). CAMP (1989) stellte keinen Einfluss des Alters auf die Anzahl der gewonnenen Embryonen und Eizellen fest. Der Anteil der transfertauglichen Embryonen fiel jedoch bei Donoren ab dem achten Lebensjahr von 62 % auf 53 % und nach dem neunten Lebensjahr auf 32 % ab. Dies deckt sich mit Aussagen von LANGE u. REICHENBACH (1997), die die Embryonenausbeute von Färsen und Kühen in der ersten Laktation mit Donoren verglichen, die sich in der fünften oder sechsten Laktation befanden. LIBORIUSSEN et al. (1995) beschrieben, dass Kühe durchschnittlich 1,9 transfertaugliche Embryonen mehr als Färsen liefern. Ausschlaggebend für den Erfolg oder Misserfolgs einer SO-Behandlung ist die Größe des Pools, der Follikel, die bei Beginn der SO-Behandlung auf FSH reagieren können (MONNIAUX et al. 1983; CUSHMAN et al. 1999; KANITZ et al. 2002; MAPLETOFT et al. 2002). Bei der endokrinologischen Ausgangslage ist das Vorhandensein eines funktionsfähigen Gelbkörpers von besonderer Wichtigkeit

22 Literaturübersicht 22 (KANITZ et al. 1996). Das ist auch ein wichtiges Kriterium bei der Auswahl der Spendertiere. Allerdings wird ebenfalls beschrieben, dass man auf eine rektale Untersuchung der Donoren direkt vor der SO verzichten kann, wenn das Spendertier im Alter von 11 Monaten auf die korrekte Ausbildung der Genitalorgane untersucht wurde und eine effiziente Brunstbeobachtung gewährleistet ist (MERTON et al. 2003). Die Anwesenheit eines DF zu Beginn der SO-Behandlung wird hingegen in der Literatur meist als negativ für die zu erwartende Embryonenausbeute angesehen (GUILBAULT et al. 1991; HUHTINEN et al. 1992; BUNGARTZ u. NIEMANN 1994; WEHRMANN et al. 1996; D'OCCHIO et al. 1997; MURPHY et al. 1998). Viele Autoren empfehlen deshalb vor SO-Beginn den DF zu entfernen (KOHRAM et al. 1998; SHAW u. GOOD 2000; KIM et al. 2001). Im Gegensatz dazu fanden BERGFELT et al. (1997) und DIAZ et al. (2001), dass die Entfernung des DF keinen positiven Einfluss auf das Ergebnis der Superovulationsbehandlung hat. Daraus wird gefolgert, dass die exogene FSH- Gabe, den hemmenden Effekt, welcher ein persistierender Follikel auf die Hypophyse oder die Ovarien ausüben könnte, aufhebt (KANITZ et al. 2002). Die Milchleistung der Donoren steht in keiner eindeutigen Korrelation zum Ergebnis einer SO-Behandlung. CAMP (1989) untersuchte den Einfluss der Jahreslaktationsleistung in vier Gruppen ( kg, kg, kg und > 9000 kg). Er stellte weder eine Beziehung der Jahreslaktation noch der Milchleistung am Tag der Spülung zum SO-Ergebnis fest. Auffällig war nur, dass in der Donorengruppe mit einer Jahreslaktationsleistung von mehr als 9000 kg der Anteil der transfertauglichen Embryonen mit 67 % weit über dem der anderen Gruppen lag. LANGE u. REICHENBACH (1997) konnten ebenfalls keinen signifikanten Einfluss der Tagesmilchmengenleistung zur Anzahl der gewonnenen Embryonen nachweisen. Tendenziell stieg bis zu einer Tagesmilchmengenleistung von 20 l die Anzahl der transfertauglichen Embryonen mit steigender Milchmenge. Bei Donoren mit einer Leistung > 50 l wirkte sich eine höhere Milchleistung negativ auf das SO-Ergebnis aus.

23 Literaturübersicht Einflüsse der Superovulationsbehandlung Eine weitere Ursache der hohen Varianz liegt in der Schwierigkeit, die Stimulation der Donoren optimal zu steuern. Präzise Daten zur Interaktion von FSH- Konzentrationen zum Ablauf des Follikelwachstums fehlen, ebenso Erkenntnisse über den Einfluss den FSH im Zusammenspiel mit LH für die Follikelreifung und Ovulation kompetenter Oozyten spielt (KELLY et al. 1997). Die Art des verwendeten Gonadotropins, die Methode und Frequenz der Gonadotropin-Applikation sowie der Anteil von FSH- und LH-Wirkäquivalenten und deren biologische Aktivität haben einen Einfluss auf den Erfolg der Stimulation (KELLY et al. 1997). Die Wirksamkeit der verschiedenen Gonadotropine wurde in zahlreichen Studien miteinander verglichen. Während einige Autoren im Vergleich von FSH zum ecg bessere SO-Erfolge mit FSH feststellten (HAHN 1978; GREVE et al. 1983), fanden andere Autoren keinen signifikanten Unterschied in den SO-Resultaten (SEIDEL et al. 1978; MAPLETOFT et al. 1990). Unterschiedliche Präparate, die zur SO eingesetzt werden sowie verschiedene Chargen eines Präparates unterscheiden sich in ihrer biologischen Aktivität und, oder in der immunologischen Aktivität (DONALDSON et al. 1986; LINDSELL et al. 1986b; BRAILEANU et al. 1998). KANITZ et al. (2002) verglichen vier Chargen eines kommerziellen FSH-Präparates, bei denen die relative biologische Aktivität zwischen 78,9 % und 127,8 % schwankte. Die Ergebnisse der mit diesen Chargen durchgeführten Stimulationen zeigten einen signifikanten Einfluss der Bioaktivität auf das Ergebnis der SO-Behandlung. FSH-Präparate weisen unterschiedliche Gehalte an LH auf (LINDSELL et al. 1986b; DONALDSON 1990). In der Literatur wird im Allgemeinen beschrieben, dass FSH- Präparate mit einem geringen LH-Anteil höhere Fertilisationsraten und eine bessere Qualität der Embryonen liefern (DONALDSON et al. 1986; BECKERS 1987; GONZALES et al. 1990; YAMAMOTO et al. 1993; MAPLETOFT et al. 2002). Hingegen kann bei hochgereinigten FSH-Präparaten eine geringere Ovulationszahl erwartet werden (DONALDSON u. WARD 1986). Vermutet wird, dass hohe LH- Aktivitäten die Luteinisierung von Follikeln, eine Down-Regulation von Rezeptoren

24 Literaturübersicht 24 sowie eine vorzeitige Ovulation unreifer Follikel verursachen (HERRLER et al. 1991). Weitere Gründe für eine schlechtere Fertilisationsrate können asynchrone Ovulationen und gesteigerte Östrogenkonzentrationen bzw. Östrogen- Progesteronimbalanzen sein (MAURER u. ECHTERNKAMP 1982; ZEITOUN et al. 1991). CHUPIN et al. (1984) beobachteten bei steigenden LH-Gehalten der FSH- Präparate einen erhöhten Bedarf an FSH, um ausreichend gute Ovulationszahlen zu erzielen. Geringe LH-Aktivitäten sollen zu Abweichungen in der Oozyten-Reifung, der Befruchtung und der frühen Embryonalentwicklung führen (HERRLER et al. 1991). Eine andere Ansicht über den negativen Einfluss hoher LH-Gehalte wurde von WILLMOTT et al. (1990) vertreten. Sie stellten nur geringe Unterschiede in der SO- Reaktion von Kühen fest, welche mit Präparaten unterschiedlichen LH-Gehalts behandelt wurden. Allerdings gab es einen höheren Anteil Nichtreagenten in der Gruppe, die mit reinem FSH behandelt wurde. KANITZ et al. (2002) untersuchten den Einfluss des FSH/LH-Verhältnisses auf das Follikelwachstum und zeigten, dass LH nicht unabdingbar für die SO ist, aber dass es bis zu einem gewissen Grad toleriert werden kann. Diesen Toleranzbereich geben WILLMOTT et al. (1990) mit einem Prozentsatz von 15 % - 20 % an. In Einklang damit, erzielten LOONY et al. (1988) mit rbfsh ohne Zugabe von exogenem LH hohe SO-Ergebnisse. Auffallend hoch waren die Fertilisationsrate (95%) und der Anteil transfertauglicher Embryonen (85%). KELLY (1997) und PRICE et al. (1999) beschrieben, dass ein gewisser Anteil an LH im FSH-Präparat vorhanden sein muss. Die Rolle des LH in der finalen Follikelreifung ist wichtig, um die Östrogen-Aktivität aufrecht zu erhalten und so die Follikelatresie zu verhindern. Fraglich ist, ob die endogenen LH-Pulse ausreichend sind, um bei einem superovuliertem Tier für 10 bis 20 Follikel, die finale Follikelreifung und die Oozytenentwicklung zu regulieren (KELLY et al. 1997). TAKAGI et al. (2001) verglichen die Wirkung von rekombinantem humanen FSH (rhfsh), ohne jegliche LH-Kontamination, mit der von equinem Chorion Gonadotropin (ecg). Es waren mittels Ultraschall keine signifikanten Unterschiede

25 Literaturübersicht 25 im Follikelwachstum zu erkennen, aber es gab beträchtliche Unterschiede in der Steroidsynthese. So zeigten, die mit rhfsh behandelten Tiere in den ersten Behandlungstagen deutlich verringerte Östradiol-Konzentrationen und in der Zeit nach dem LH-Peak war in dieser Gruppe ebenfalls die P 4 -Bildung geringer. Darüber hinaus waren bei den Färsen, die mit rhfsh stimuliert wurden im Vergleich zur ecg- Gruppe weniger LH-Pulse zu messen und der LH-Peak erfolgte, bei den Tieren wo er gemessen werden konnte, später. Zum optimalen Zeitpunkt, an dem die SO-Behandlung begonnen werden soll, gibt es verschiedene Auffassungen: Einige Autoren vertreten die Hypothese, dass es zu einer höheren SO-Reaktion kommt, wenn die SO-Behandlung vor der Selektion des DF beginnt (MAPLETOFT et al. 2002). Gestützt wird dies durch Untersuchungen von ADAMS (1994), der bei einem SO-Beginn mit rekombinantem bovinen FSH (rbfsh), vor der Selektion des DF der ersten Follikelwelle (Tag 1; Tag 0 = Ovulation) eine höhere Ovulationszahl erzielte, als danach (Tag 5). Ähnliche Ergebnisse erzielten (NASSER et al. 1993), die Untersuchungen zum Zeitpunkt der SO-Behandlung in Relation zum endogenen FSH-Peak durchführten. Dabei wurde die erste FSH- Applikation entweder einen Tag vor, am Tag oder in den beiden darauf folgenden Tagen des zu erwartenden, endogenen FSH-Peaks durchgeführt. Bei einem Beginn der SO-Behandlung am Tag des FSH-Peaks sowie am Tag davor wurden signifikant mehr Follikel rekrutiert und es fanden mehr Ovulationen statt (NASSER et al. 1993). Der Erfolg der SO-Behandlung war unabhängig davon, ob sie mit Erscheinen der ersten oder der zweiten Follikelreifungswelle begonnen wurde. Die Anzahl der großen Follikel, die Ovulationszahl und die Anzahl der gewonnenen Embryonen veränderten sich nicht signifikant (ADAMS 1994). Eine Synchronisation der Follikelwellen kann durch die Entfernung des DF erfolgen, woraufhin zwei Tage später einer neue Reifungswelle auftritt (BARACALDO et al. 2000). Über die Auswirkungen von Dosis und Injektionshäufigkeit wird im Kap eingegangen.

26 Literaturübersicht Stimulationsregime mit den FSH-Präparaten Folltropin und Pluset Folltropin -V ist ein gereinigtes Hypophysenextrakt mit einem LH:FSH-Quotienten von 0,12 % (VETREPHARM INC., CANADA). Das Präparat weist pro 1 ml eine Aktivität von 20 mg NIH bfsh-b-1 auf. Vom Hersteller wird eine achtmalige intramuskuläre Injektion über vier Tage, mit einer gleich bleibenden Dosierung von 50 mg NIH-FSH-P1 pro Injektion empfohlen. Pluset ist eine Mischung von porcinen, hypophysären Gonadotropinen. Der Gehalt an FSH und LH wird in Bezug auf den International Standard for human urine FSH und LH angegeben. Die Menge von 1 ml Pluset enthält 50 I.E. FSH und 50 I.E. LH. Der Hersteller empfiehlt eine Dosierung bei juvenilen Fleischrindern von I.E, bei adulten Fleischrindern von I.E, bei Jungtieren von milchbetonten Rassen von I.E und bei Milchkühen von 900 I.E. Es wird eine achtmalige Applikation in absteigender Dosierung empfohlen (CALIER, BARCELONA). Der Vergleich von Dosierungen zwischen verschiedenen FSH-Präparaten durch die für die Wertbemessung verwendeten, unterschiedlichen Standards und Methoden erschwert oder unmöglich gemacht (KANITZ et al. 1996). KELLY et al. (1997) untersuchten zwei kommerzielle FSH-Präparate bezüglich ihrer relativen Potenz zum bfsh-b-1-standard des National Institut for Health (NIH). Nachgeprüft wurde die Bindungsfähigkeit an den Antikörper anti-ofsh (AFP-C , NIDDK- NIH, Bethesda). Als Tracer diente iodiertes ofsh-i-siafp-21 (AFP-7571A, NIDDK- NIH, Bethesda). Die mittleren Werte ergaben, dass 1000 I.E. Pluset äquivalent zu 25,3 mg bfsh-b-1 sind. Die Menge von 275 mg Folltropin entsprachen 4,6 mg bfsh-b-1. Damit ist Pluset mit dieser Methode der Einschätzung 5,5 mal potenter als Folltropin (KELLY et al. 1997). KELLY et al. (1997) verglichen die Präparate Pluset und Folltropin miteinander. Die Anwendung von Pluset führte im Vergleich zu Folltropin zu einer höheren Ovulationszahl, aber der Anteil unbefruchteter und degenerierter Embryonen war ebenfalls höher. Als Grund dafür können die im Kapitel angeführten, negativen Einflüsse hoher LH-Gehalte des Präparates angenommen werden. Die wird

27 Literaturübersicht 27 gesteigerte Ovulationszahl führen die Autoren auf die höhere Gesamtdosis an pfsh oder den höheren LH-Gehalt zurück Untersuchungen zur Optimierung der FSH-Dosis und der Injektionshäufigkeit In Bezug auf die Dosis ist davon auszugehen, dass es für jedes FSH-Präparat einen optimalen Dosisbereich gibt (KANITZ et al. 2002). Leider fehlen körpermassenbezogene Angaben zur optimalen Dosis weitestgehend. Mit steigender FSH-Dosis, steigt die Anzahl der Ovulationen signifikant bis ein Plateau erreicht wird. Supraoptimale Dosierungen bewirken einen Rückgang der Ovulationszahl (KANITZ et al. 1996). Als Ursachen hierfür werden zum einen stark erhöhte Progesteronkonzentrationen angegeben, die den E 2 -induzierten LH-Peak und damit die Ovulation vollständig unterdrücken. Zum anderen führen Dysregulationen in den Follikeln zu einem Rückgang der Ovulationen (KANITZ et al. 1996). Des Weiteren wird auch ein Rückgang der Rezeptordichte am Follikel, bei hoher Dosierung des homologen Liganden in Betracht gezogen (KANITZ et al. 2002). GONZALES et al. (1990) verglichen verschiedene Dosierungen des Präparates Folltropin in einem Bereich zwischen 100 und 900 mg NIH-FSH-P1. Sie stellten keinen negativen Einfluss der Dosis auf die Embryonenqualität fest. Die Ovulationszahl stieg bis zu einer Dosierung von 400 mg NIH-FSH-P1 (40 mg Armour-Standard). Darüber hinaus war keine Steigerung mehr zu erzielen. Die Fertilisationsrate und der Anteil der transfertauglichen Embryonen waren im gesamten Dosisbereich konstant. Im Gegensatz dazu führte eine Verdopplung der Dosis des LH-reichen Präparates FSH-P zu einer signifikant reduzierten Fertilisationsrate und der Anteil der transfertauglichen Embryonen nahm ebenfalls deutlich ab (ALKEMADE et al. 1993). MAPLETOFT et al. (2002) schlussfolgerten aus den Ergebnissen mehrerer Studien, dass der negative Effekt hoher Dosierung von hypophysären Gonadotropinen auf die Qualität von Oozyten und Embryonen durch ein Übermaß an LH zustande kommt.

28 Literaturübersicht 28 Untersuchungen zur Vereinfachung der FSH-Applikation belegen, dass die optimale FSH-Dosierung auch vom Applikationsschema abhängig ist (DONALDSON 1991; HOCKLEY et al. 1992; WALSH et al. 1993). Aufgrund der geringen HWZ (MONNIAUX et al. 1983) des FSH wird im Allgemeinen eine Applikation im Abstand von 12 h über drei bis fünf Tage empfohlen. Eine wiederholte intramuskuläre Gabe im zwölfstündigen Abstand bedeutet einerseits einen hohen Arbeitsaufwand für die durchführende Person, zum anderen Stress für das Tier (WALSH et al. 1993; MAPLETOFT et al. 2002). Deshalb wurden Untersuchungen vorgenommen, in denen die Applikationsfrequenz und / oder die Dosierung reduziert wurden. Eine einmalige subkutane (s.c.) Injektion von porcinem FSH (pfsh) wurde von mehreren Autoren beschrieben (BO et al. 1991; HOCKLEY et al. 1992; MISRA et al. 1992; BUNGARTZ u. NIEMANN 1993; SCHALLENBERGER et al. 1994; BO et al. 1994; KELLY et al. 1997). Bei dieser Vorgehensweise wurde angenommen, dass bei einer subkutanen Injektion die Resorption des FSH über einen längeren Zeitraum erfolgt (KELLY et al. 1997). Die Ergebnisse der Studien zur Reduzierung der Applikationsfrequenz sind in Tab.1 zusammengefasst. KELLY et al. (1997) wiesen bei der einmaligen s.c. Injektion im Vergleich zum empfohlenen Schema, eine Abnahme der einfriertauglichen und transfertauglichen Embryonen sowie einen Rückgang der Gesamtembryonenanzahl nach. BO et al. (1991; 1994) erzielten mit einer einmaligen, subkutanen Bolusinjektion von Folltropin in einer Menge, die 400 mg NIH-FSH-P1 entsprach, ein Ergebnis, das dem nach einer achtmaligen intramuskulären (i.m.) Injektion gleichkam. LOVIE et al. (1994) betonen, dass bei Tieren mit kleinen subkutanen Fettdepots eine Aufsplittung der Applikationsmenge auf zwei Injektionen (Tag 0: 75 %; Tag 2: 25 %) zu empfehlen ist. Bei der Gabe großer Mengen als Depot führt eine Steigerung der Absorptionsrate zu einer verschlechterten Donorenreaktion (MAPLETOFT et al. 2002). Dies kann gegeben sein, wenn das FSH-Präparat fälschlicher Weise i.m. statt s.c. verabreicht wird, oder die Applikation in die Halsregion magerer Kühe erfolgt. Die Fossa ischiorectalis ist eine Region, die für eine Depotgabe von FSH-Präparaten ebenfalls geeignet ist (MAPLETOFT et al. 2002; COLAZO et al. 2002). Eine zu

29 Literaturübersicht 29 schnelle Resorption von FSH nach Depotgabe führt nach Ansicht von MAPLETOFT et al. (2002) sogar bei der Verwendung von Folltropin zu einer Überversorgung mit LH. Eine einmalige, subkutane Applikation führte zu geringeren Plasmakonzentrationen von FSH als eine einmalige intramuskuläre Gabe. Subkutane Gaben im Abstand von zwölf Stunden führten zu schlechteren Ergebnissen als eine zweimalige i.m. Injektion pro Tag (ALKEMADE et al. 1993). Eine Verlängerung des Applikationsintervalls von 12 h auf 24 h, bei einer Behandlungsdauer von drei oder vier Tagen ergab in mehreren Untersuchungen zufrieden stellende Ergebnisse (BUNGARTZ u. NIEMANN 1993; PURWANTARA et al. 1994; KANITZ et al. 2002). WALSH et al. (1993) verglichen zwei Behandlungsregime mit dem Präparat Folltropin. Die erste Gruppe erhielt s.c. Applikationen im 24stündigen Abstand. Der zweiten Gruppe wurde das Präparat im 12 h Abstand appliziert. Beide Regime liefen über einen Zeitraum von vier Tagen. Sie stellten eine signifikante Abnahme der C.l., der Anzahl der mittleren und großen Follikel, der Gesamtembryonen sowie der Anzahl der gefriertauglichen Embryonen fest.

30 Tabelle 1:Superovulationsergebnisse nachverwendung von Folltropin oder Pluset in unterschiedlichen Applikationsregimen Autoren BO et al MISRA et al HOCKLEY et al WALSH et al Bungartz & Niemann 1993 BO et al SCHALLEN-BERGER 1994 PURWANTARA et al KELLY et al.1997 KANITZ et al Applikationsregime 1 x s.c. 1 x i.m. 8 x s.c. / 4d / gleichbl. Dosis 8 x i.m. / 4d / gleichbl. Dosis 1 x s.c. 8 x i.m./ 4d / abnehm. Dosis 1 x s.c. 1 x s.c. 1 x s.c. 1 x s.c. 4 x s.c. / 4d / abnehm. Dosis 8 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 1 x s.c.* 1 x s.c. 4 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis* 4 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 8 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis* 8 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 1 x s.c. 8 x i.m. / 4d / gleichbl. Dosis 1 x s.c. 7 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 3 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 8 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 1 x s.c. 8 x i.m./ 4d / abnehm. Dosis 1 x s.c. 10 x i.m./ 5d / abnehm. Dosis 4 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 4 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis 8 x i.m. / 4d / abnehm. Dosis Dosis / Präparat Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 49 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 49 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 200 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 600 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 800 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 24 mg Folltropin / 24 mg Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 300 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 300 mg NIH-FSH-P1 Folltropin * / 35 mg NIH Folltropin * / 35 mg NIH Folltropin / 270 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 270 mg NIH-FSH-P1 Pluset / 1000 I.E. Pluset / 1000 I.E. Folltropin / 360 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 260 mg NIH-FSH-P1 Folltropin / 400 mg NIH-FSH-P1 n Tiermaterial Brahmanen (Kühe) Holstein Friesian (Kühe) Fleischrinder Kreuzungs-tiere (Färsen) Holstein Friesian (Kühe) Fleischrinder (Kühe) Fleckvieh (Kühe) Kreuzungstiere (Färsen) Kreuzungstiere (Färsen) Fleckvieh Corpora lutea 30,6 ± 5,9 4,8 ± 1,8 9,3 ± 1,9 11,1 ± 3,2 6,5 ± 2,0 9,4 ± 1,3 3,6 ± 1, ± 4,1 25,0 ± 6,6 13,9 ± 2,3 7,7 ± 1,7 16,4 ± 1,7 11,2 ± 2,7 1,9 ± 0,8 15,5 ± 2,5 4,5 ± 1,4 11,7 ± 1,0 4,7 ± 1,1 26,8 ± 8,5 20,7 ± 4,7 11 ± 5 17 ± 4 10,5 ± 2,6 17,7 ± 2,1 22,6 ± 3,5 23,3 ± 2,3 Embryonen taugliche Follikel + Embryonen Eizellen 0,6 ± 0,3 0,3 ± 0,2 1,8 ± 0,6 1,2 ± 0,5 1,9 ± 0,5 15,2 ± 3,3 9,5 ± 2,3 3,3 ± 0,5 12,8 ± 3,4 5,7 ± 1,5 8,0 ± 2,1 10,2 ± 2,6 5,3 ± 1,8 11,1 ± 2,9 4,9 ± 1,1 3,3 7,2 9,6 ± 1,1 7,0 10,5 9,5 ± 2,7 3,3 ± 1,3 1,2 ± 0,6 0,3 ± 0,1 12,9 ± 2,8 7,8 ± 2,5 1,2 ± 0,4 0,3 ± 0,1 8,2 ± 1,1 5,0 ± 1,0 2,8 ± 1,0 2,1 ± 0,9 9,0 ± 2,6 2,5 ± 0,8 11,3 ± 4,9 4,8 ± 2,4 19,8 ± 5,1 8,8 15,5 ± 12,0 8,1 5,2 ± 3,6 3,2 ± 1,8 4,9 ± 1,2 1,7 ± 0,9 5,7 ± 1,1 3,9 1.5 ± 0,3 12,2 ± 1,7 11,8 3,3 ± 0,5 13,6 ± 2,2 6,4 4,8 ± 1,0 16,4 ± 1,4 8,0 4,1 ± 0,8 20,5 16,0 16,9 9,5 11, *in Abwesenheit eines DF Literaturübersicht 30