Tierärztliche Hochschule Hannover Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für Pferde

Transkript

1 Tierärztliche Hochschule Hannover Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für Pferde Untersuchungen zur Superovulation bei der Stute: Einfluss von equinem FSH (efsh ) auf die genitale Durchblutung unter besonderer Berücksichtigung der lutealen Durchblutung INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Christine Baackmann aus Münster Hannover 2008

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. H. Sieme 1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Sieme 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. S. Meinecke-Tillmann Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2008 Die Studie wurde gefördert durch die Mehl-Mülhens-Stiftung.

3 Meinen Eltern Dr. med. vet. Ulrike Baackmann und Dr. med.vet. Werner Baackmann gewidmet

4 Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht: KÖLLMANN, M., J. PROBST, C. BAACKMANN, J. KLEWITZ, E. S. SQUIRES u. H. SIEME (2008): Embryonengewinnungsrate nach Superovulation mit equinem Hypophysenextrakt (efsh ) bei der Stute. Pferdeheilkunde 24 (3), KÖLLMANN, M., J. PROBST, C.BAACKMANN, E.L. SQUIRES u. H.SIEME (2008): Embryo recovery after AI with cooled semen 12 hours and 36 hours after hcg application in mares with spontaneous ovulation and superovulation with equine pituitary extract (efsh ). The Havemeyer Foundation Abstract Book, 100 (abstract)

5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Schrifttum Superovulationsbehandlung im Rahmen des Embryotransfers bei der Stute Embryotransfer (ET) bei der Stute Follikelentwicklung bei der Stute Superovulationsbehandlung bei der Stute Equiner Hypophysenextrakt (Equine Pituitary Extract, EPE) Equines follikelstimulierendes Hormon (efsh ) Gelbkörper (Corpus luteum) Aufbau und Funktion Zyklische Veränderungen und die Bedeutung der Durchblutung des Corpus luteum Frau Rind Stute Einfluss des Corpus luteum auf die ovarielle Reaktion im Rahmen der Superovulationsbehandlung beim Rind Einfluss des Corpus luteum auf die Anzahl und Qualität der Embryonen im Rahmen der Superovulationsbehandlung beim Rind Gefäßversorgung des inneren Genitals der Stute Gefäßversorgung des Uterus Gefäßversorgung des Ovars Dopplersonographie Physikalische Grundlagen Gerätetechnologie Auswertungsmethoden Color-Angio-Mode Ovarieller Blutfluss Ovarieller Blutfluss bei der Stute 30

6 Inhaltsverzeichnis Messung des ovariellen Blutflusses im Rahmen der assistierten Reproduktion Frau Rind Uteriner Blutfluss Uteriner Blutfluss bei der Stute Messung des uterinen Blutflusses im Rahmen der assistierten Reproduktion Frau Rind 36 3 Material und Methoden Tiere Versuchsanordnung Versuchsablauf in den Superovulationszyklen (Zyklen 2 und 4) Ultrasonographische Untersuchungen Verwendete Geräte und Sonden Untersuchungsschema B-Mode-Sonographie Darstellung der Corpora lutea Gefäßdurchmesser Luteale Durchblutung Darstellung der lutealen Durchblutung im Color-Angio-Mode Auswertung der lutealen Durchblutung im Color-Angio-Mode Untersuchungen an den Aa. uterinae und den Aa. ovaricae Farbdopplersonographische Darstellung der Aa. uterinae Farbdopplersonographische Darstellung der Aa. ovaricae Auswertung der Farbdopplerwellen Gewinnung und Beurteilung der Embryonen Blutplasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung 49

7 Inhaltsverzeichnis 3.6 Mikrobiologische und zytologische Untersuchung von Uterustupferproben Statistische Auswertungen 50 4 Ergebnisse Klinisch-gynäkologische Befunde Kontrollzyklen ohne Besamung (Zyklen 1 und 3) Superovulationszyklen (Zyklen 2 und 4) Kontrollzyklen mit Besamung und Embryonengewinnung (Zyklus 5) Ovarreaktion und Anzahl gewonnener Embryonen Durchblutung, Durchmesser und hormonelle Aktivität der Corpora lutea Durchblutung, Durchmesser und hormonelle Aktivität der Corpora lutea in den Superovulationszyklen zu Beginn der hormonellen Stimulation Durchblutung, Durchmesser und hormonelle Aktivität der Corpora lutea am Ovulationstag und den Tagen 1 bis 5 post ov. in den Superovulationszyklen und den Kontrollzyklen Ovarieller Blutfluss Ovarieller Blutfluss in den Superovulationszyklen zu Beginn der hormonellen Stimulation Ovarieller Blutfluss am Tag der Ovulation und den Tagen 1 bis 5 post ov. in den Superovulationszyklen und den Kontrollzyklen Uteriner Blutfluss Uteriner Blutfluss in den Superovulationszyklen zu Beginn der hormonellen Stimulation Uteriner Blutfluss am Tag der Ovulation und den Tagen 1 bis 5 post ov. in den Superovulationszyklen und den Kontrollzyklen Hormonkonzentrationen Hormonkonzentrationen in den Superovulationszyklen zu Beginn der hormonellen Stimulation 73

8 Inhaltsverzeichnis Hormonkonzentrationen am Tag der Ovulation und den Tagen 1 bis 5 post ov. in den Superovulationszyklen und den Kontrollzyklen Vorhersagbarkeit der Ovarreaktion Vorhersagbarkeit der Anzahl zu gewinnender Embryonen 77 5 Diskussion Ovarreaktion und Anzahl gewonnener Embryonen Durchblutung, Durchmesser und hormonelle Aktivität des Corpus luteum Ovarieller Blutfluss Uteriner Blutfluss Vorhersagbarkeit der Ovarreaktion Vorhersagbarkeit der Anzahl zu gewinnender Embryonen Ausblick 86 6 Zusammenfassung 87 7 Summary 89 8 Literaturverzeichnis 91 9 Anhang Tabellen Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis 110

9 Abkürzungsverzeichnis A. Arteria Aa. Arteriae Abb. Abbildung BFV Blutflussvolumen (blood flow volume) CH Corpus haemorrhagicum CL Corpus luteum cm Zentimeter CW continuous-wave D Tag De enddiastolische Frequenzverschiebung Dm minimale diastolische Frequenzverschiebung ecg equines Choriongonadotropin efsh equines Follikelstimulierendes Hormon E Embryo(nen) E 17ß Östradiol 17ß EIA Enzymimmunoassay ET Embryotransfer EPE Equine Pituitary Extract et al. et alii FS Frischsperma FSH Follikelstimulierendes Hormon GnRH Gonadotropin Releasing Hormon hcg humanes Choriongonadotropin hmg humanes Menopausengonadotropin Hz Hertz IE Internationale Einheiten IETS International Embryo Transfer Society i.m. intra muskulär inkl. Inklusive i.v. intra venös IVF In-vitro-Fertilisation Kap. Kapitel KB künstliche Besamung l Liter LH Luteinisierendes Hormon m Meter

10 M Median MAD mittlere absolute Abweichung (median absolut deviation) Max Maximum MDV minimale diastolische Blutflussgeschwindigkeit (minimun diastolic velocity) mg Milligramm MHz Megahertz min Minute Min Minimum ml Milliliter mm Millimeter μg Mikrogramm μm Mikrometer Ov Ovulation(en) p Irrtumswahrscheinlichkeit P4 Progesteron PBS Phosphate Buffered Saline PGF2α Prostaglandin F2α PI Pulsatility Index post ov. post ovulationem PSV maximale systolische Blutflussgeschwindigkeit (peak systolic velocity) PW pulsed wave r Korrelationskoeffizient R. Ramus RI Resistance Index ROI Region of Interest s Standardabweichung S maximale systolische Frequenzverschiebung sec Sekunde Tab. Tabelle TAMF mittlere maximale Frequenzverschiebung (time averaged maximum frequency shift) TAMV mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity) TG Tiefgefrier-Sperma Vmax maximale Blutflussgeschwindigkeit (maximum velocity) Vmin minimale Blutflussgeschwindigkeit (minimum velocity) x Mittelwert

11 Einleitung 1 Einleitung Bereits 1974 wurden erste Versuche zum equinen Embryotransfer unternommen (OGURI und TSUTSUMI 1974), vermehrt eingesetzt wurde diese Technologie jedoch erst in den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts. Im Jahr 2006 wurden laut der International Embryo Transfer Society (IETS) weltweit Embryotransfers (ET) durchgeführt (THIBIER 2007). Physiologischerweise gelangt bei Stuten meist nur ein Follikel zur Ovulation. Bei einfach ovulierenden Stuten liegt die Embryonengewinnungsrate nur bei ca. 50 % (SQUIRES und MCCUE 2007). Daher wurde in den vergangenen Jahren wiederholt versucht Superovulationen bei der Stute auszulösen, um damit die Embryonengewinnungsrate zu steigern und die anfallenden Kosten zu senken. Bisherige Studien zeigten jedoch, dass der Einsatz von equinem Choriongonadotropin (ecg), heterologem follikelstimulierenden Hormon (FSH), Anti- Inhibin-Vakzinen, Gonadotropin-Releasing-Hormon-(GnRH)-Analoga oder porcinem FSH wenig viel versprechend für den kommerziellen Einsatz bei der Stute zu sein scheint. Mit Extrakten aus equinen Hypophysen und dem von 2003 bis 2007 in den USA kommerziell erhältlichen efsh (equines follikelstimulierendes Hormon) werden mittlerweile zufriedenstellende Superovulationsresultate bei der Stute erzielt. Trotzdem ist die Superovulationsbehandlung noch mit Problemen verbunden. Diese bestehen darin, dass die ovarielle Reaktion auf die hormonelle Stimulation und die Anzahl gewonnener Embryonen stark variieren. In der Humanmedizin wird seit einiger Zeit die Farbdopplersonographie als standardisierte Methode zur Beurteilung der Perfusionsverhältnisse im weiblichen Genitale eingesetzt. BOLLWEIN et al. (2002b) etablierten diese nicht-invasive Methode beim Pferd. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, welchen Einfluss efsh auf die luteale und genitale Durchblutung bei der Stute hat. Weiterhin sollte überprüft werden, ob bei der Stute Zusammenhänge zwischen der genitalen Durchblutung und der ovariellen Reaktion nach hormoneller Stimulation sowie der Anzahl der zu gewinnenden Embryonen bestehen. 1

12 Schrifttum 2 Schrifttum 2.1 Superovulationsbehandlung im Rahmen des Embryotransfers bei der Stute Embryotransfer (ET) bei der Stute Schon 1974 wurden erstmals erfolgreich Pferdeembryonen transferiert (OGURI und TSUTSUMI 1974) durchgeführt. Besonders in den letzten zehn Jahren ist die Zahl der ET beim Pferd stetig gestiegen. Die International Embryo Transfer Society (IETS) gibt die Anzahl der ET dieser Spezies im Jahr 2006 weltweit mit an (THIBIER 2007). Dabei sind die USA und Brasilien mit etwa 80 % der durchgeführten ET führend, in Deutschland sind im Jahr ET registriert worden (Jahresbericht FN 2007). Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die weltweiten ET-Aktivitäten beim Pferd im Jahr 2006 (THIBIER 2007). Tab. 1: Anzahl der weltweiten equinen Embryotransfer-Aktivitäten im Jahr 2006 (THIBIER 2007) Land Uterusspülungen (n) transfertaugliche Embryonen (n) übertragene Embryonen * (n) Brasilien Kanada Europa? VR China Südafrika Neuseeland USA gesamt * inclusive tiefgefrorener Embryonen 2

13 Schrifttum Es gibt eine Reihe von Indikationen für die Anwendung des Embryotransfers beim Pferd: Aus kommerzieller Sicht wird der ET bei Stuten mit überdurchschnittlichen genetischen Anlagen, von denen pro Jahr mehr als ein Fohlen gezogen werden soll, angewendet. Auch von Sportpferden kann man mittels dieser Technologie ohne Unterbrechung des Trainings- oder Turniereinsatzes Nachzucht bereitstellen. Durch die Besamung und Spülung zweijähriger Stuten, denen es an körperlicher Reife fehlt, um ein Fohlen auszutragen, kann eine vorzeitige Zuchtnutzung erfolgen. Aus medizinischer Sicht ist der ET bei subfertilen oder älteren Stuten indiziert, die selbst nicht mehr in der Lage sind, ein Fohlen auszutragen. Des Weiteren kommt der ET in der Forschung vielfach zum Einsatz (MCKINNON und SQUIRES 1988a; EAST et al. 1998). Bei einem Embryotransfer-Programm müssen neben der bisherigen Fruchtbarkeitsleistung (Maidenstute, güste Stute, Stute mit Fohlen bei Fuß) der Spender- und Empfängerstuten verschiedene Kriterien beachtet werden. Hierzu gehören die Fruchtbarkeit und der Standort des Hengstes, Reglementierungen der Zuchtverbände, der geschätzte Wert des resultierenden Fohlens und die Anzahl der gewünschten Trächtigkeiten (SQUIRES et al. 1999) Follikelentwicklung bei der Stute Eine pulsatile Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) aus dem Hypothalamus stimuliert die Produktion und Sekretion des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) aus dem Hypophysenvorderlappen. Insbesondere FSH fördert das gemeinsame Wachstum multipler, gonadotropinreaktiver Follikel einer Follikelwelle, wobei sich bei der Stute der zukünftige ovulatorische Follikel meist aus der zweiten Follikelwelle innerhalb eines Zyklus entwickelt (BERGFELT und GINTHER 1993). Die ansteigende Konzentration luteinisierenden Hormons (LH) im Blut stimuliert in den Thekazellen die Androgensynthese, während FSH in den Granulosazellen die Aromatisierung der Androgene zu Östradiol 17ß fördert. Das gebildete Östradiol 17ß fördert die LH- 3

14 Schrifttum Sekretion und hemmt gemeinsam mit Inhibin, welches ebenfalls von den Granulosazellen synthetisiert wird, die FSH-Ausschüttung (GINTHER et al. 2001). Bei der Stute kommt es im Rahmen der zweiten Follikelwelle bei einer Follikelgröße von ca. 22,5 mm zu einer Selektion eines dominanten Follikels, welcher zu diesem Zeitpunkt einen gewissen Größen- und zumeist auch Entwicklungsvorteil (GASTAL et al. 1997) hat. Dieser dominante Follikel bewirkt zum einen die Verringerung der FSH-Ausschüttung und kann gleichzeitig die geringen Konzentrationen des verbliebenen FSH für die eigene Weiterentwicklung nutzen. Die nachfolgenden Follikel sind nicht mehr in der Lage ausreichende Mengen Östradiol 17ß zu produzieren; sie androgenisieren und atresieren (GINTHER et al 2003). Unter der Einwirkung von LH und FSH wird im dominanten Follikel neben Östradiol 17ß auch der Insulin-like-growth-factor 1 (IGF 1) und der Vaskularendothelial-growth-factor (VEGF) produziert, welche die Proliferation der Granulosazellen und die Vaskularisierung des dominanten Follikels fördern (GINTHER et al 2001). BEG und GINTHER (2006) stellten fest, dass beim Pferd der IGF 1, welcher v. a. die Proliferation der Granulosazellen induziert, einen positiven Einfluss auf den Beginn der Follikelselektion hat. Nach Ablation des größten Follikels konnten die Autoren eine vermehrte FSH-Ausschüttung und einen Anstieg des IGF 1-Gehalts im zweitgrößten Follikel beobachten und dieser entwickelte sich daraufhin zum ovulatorischen Follikel. Jeder Follikel einer Follikelwelle hat folglich die Entwicklungskompetenz zum ovulatorischen Follikel, wobei die dem größten Follikel nachfolgenden Follikel durch ihren Entwicklungsrückstand zum Zeitpunkt der Follikelselektion nicht in der Lage sind, ihr Wachstum bei abnehmenden Gonadotropin-Konzentrationen fortzusetzen. Im Rahmen der Superovulationsbehandlung soll durch Zugabe von exogenem FSH der FSH-Unterversorgung der subdominanten Follikel entgegengewirkt werden, wodurch die Entwicklung multipler Follikel ermöglicht werden soll (GINTHER et al 2001). 4

15 Schrifttum Superovulationsbehandlung bei der Stute Die Stute gehört zu den monoovulatorischen Spezies, d.h. dass physiologischerweise meist nur ein Follikel zur Ovulation gelangt. Die Häufigkeit von natürlichen Doppelovulationen bei der Stute variiert zwischen 2 % und 22 % und hängt neben der Rasse (Warmblut: %, Vollblut: 22 %, Pony: 2-3 %) auch vom Alter, Anzahl der bisherigen Trächtigkeiten und dem Zeitpunkt innerhalb der Zuchtsaison ab (STABENFELDT et al. 1972; GINTHER et al. 1982; SIEME und KLUG 1996). Die Anzahl gewonnener Embryonen im Rahmen einer Superovulationsbehandlung hängt neben der Anzahl der Ovulationen auch von weiteren Faktoren wie der Zuchttauglichkeit und dem Alter der Spenderstute, der Fruchtbarkeit des Hengstes, der Art des eingesetzten Spermas, dem Besamungsmanagement, sowie dem Zeitpunkt der Embryonengewinnung ab (SQUIRES et al. 1999). Nach singulärer Ovulation ist eine Embryonengewinnungsrate von etwa 50 % pro Zyklus zu erwarten. Geht man von einer Trächtigkeitsrate von 75 % bei der Rezipientenstute aus, so liegt die Wahrscheinlichkeit einer Trächtigkeit nach Embryotransfer bei etwa 35 % pro Zyklus (SQUIRES und MCCUE 2007). Dies führt aufgrund der hohen Decktaxen sowie Kosten von Spender und Rezipientenstuten zu einer z.zt. nicht wirtschaftlichen Situation des Embryotransfers beim Pferd. Durch die vor allem beim Rind im Rahmen von Embryotransferprogrammen etablierte Superovulation (Induktion einer über die artspezifische Anzahl hinausgehenden Ovulationszahl) könnten die Embryonengewinnungsrate pro Zyklus gesteigert, Kosten gesenkt und zusätzlich gewonnene Embryonen tiefgefroren werden. In den vergangenen Jahren wurde wiederholt versucht, Verfahren zur Superovulation bei der Stute zu etablieren. Erste Versuche zur Auslösung multipler Ovulationen bei der Stute wurden durch den Einsatz equinen Choriongonadotropins (ecg) unternommen. Doch auch in hohen Dosierungen führte der Einsatz von exogenem ecg nicht zu einer Superovulation bei der Stute (ALLEN 1982). Die scheinbare Resistenz des ovariellen Gewebes der Stute gegenüber ecg beruht wahrscheinlich darauf, dass es an deren FSH-Rezeptoren nicht gebunden wird und 5

16 Schrifttum im Vergleich zu anderen Säugetieren (Ratte, Kuh, Schwein) eine zehnfach geringere Affinität zu LH-Rezeptoren aufweist (STEWART und ALLEN 1979). Durch die Behandlung mit humanem Menopausengonadotropin (hmg) und humanem Choriongonadotropin (hcg) konnte zwar die Anzahl der Ovulationen (Ov) auf durchschnittlich 2,6 gesteigert werden, die Embryonengewinnungsrate lag jedoch sowohl bei behandelten Stuten als auch bei der Kontrollgruppe bei 50 % pro Zyklus (KOENE et al. 1991). GINTHER und BERGFELT (1990) konnten zeigen, dass die Applikation von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) und GnRH-Agonisten in der Übergangsphase im Frühjahr zu multiplen Ovulationen führt. Stuten im Anöstrus wurden zweimal täglich 200 µg GnRH injiziert. Schon nach sechs Tagen konnte ein Wachstum des größten Follikels festgestellt werden. Je größer dieser zu Beginn der Behandlung war, desto mehr Stuten ovulierten innerhalb von 21 Tagen. Bei einem Follikeldurchmesser von mm zu Behandlungsbeginn waren dies zwischen 62 und 100 %. Bei der Kontrollgruppe dagegen lag das kürzeste Intervall vom Beobachtungsbeginn im Anöstrus bis zur Ovulation bei 57 Tagen. Zudem konnten bei 31 % der behandelten Stuten Mehrfachovulationen festgestellt werden (davon 85 % Doppelovulationen, 15 % Dreifachovulationen) gegenüber einer Rate von 6 % bei der Kontrollgruppe. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen führte eine zweimal tägliche Applikation von GnRH bei zyklischen Stuten nicht zu einer Erhöhung der Ovulationszahl (SQUIRES et al. 1989). Die Behandlung von Stuten mit Folltropin (Fa. Bioniche Animal Health, Athens, GA, USA), einem kommerziell erhältlichen porcinen FSH-Präparat, ab Tag 6 post ov. konnte die Anzahl der Doppelovulationen verglichen mit der Kontrollgruppe deutlich erhöhen. Zeigten vor der Behandlung 20 % der Stuten Doppelovulationen, konnten nach der Behandlung bei bis zu 80 % der Stuten Doppelovulationen festgestellt werden (FORTUNE und KIMMICH 1983; SIROIS und KIMMICH 1992). Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die benötigte FSH-Menge sehr hoch und dadurch die Behandlung teuer ist. Ein weiterer Ansatz zur Auslösung multipler Ovulationen ist die aktive oder passive Immunisierung gegen Inhibin. Inhibin ist ein Glykoproteinhormon, das u. a. von den 6

17 Schrifttum Granulosazellen der heranwachsenden Follikel produziert wird und die FSH- Ausschüttung unterdrückt. Durch die Immunisierung soll das endogene Inhibin neutralisiert und so das Follikelwachstum stimuliert werden (FORAGE et al. 1987; MIZUMACHI et al. 1990; WRATHALL et al. 1990; TERHAAR et al. 1997). Durch die fünfmalige Immunisierung mit einem synthetischen porcinen Inhibin im dreiwöchigen Abstand konnte bei Stuten im Zyklus nach der fünften Immunisierung durchschnittlich 2,8 Ovulationen erreicht werden (Kontrollgruppe ø 1,1 Ovulationen pro Stute). Die Anzahl der gewonnenen Embryonen lag mit durchschnittlich 1,6 ebenfalls über der der Kontrollgruppe (ø 0,7) (MCCUE et al. 1992). Ähnliche Ovulationszahlen ergab die zweimalige Immunisierung mit einem rekombinanten bovinen Inhibin alpha- Untereinheit Fragment im Abstand von 35 Tagen (MCKINNON et al. 1992). In einer Studie an vier zyklischen Stuten konnte die Anzahl der Ovulationen durch eine Immunisierung mit einem humanen Inhibin alpha-untereinheit Fragment auf durchschnittlich 1,4 Ovulationen im Gegensatz zu 1,0 Ovulationen pro Stute in der Kontrollgruppe gesteigert werden (TERHAAR et al. 1997). Die aktive Immunisierung hat den Nachteil, dass sie erst nach mehreren Wochen Behandlungsdauer wirksam wird. Zudem ist die Wirkungsdauer schlecht steuerbar. Die passive Immunisierung mit Anti-Inhibin-Blutplasma ist wegen schwerwiegender Nebenwirkungen nicht praxisrelevant. In einer Versuchsgruppe mit 15 immunisierten Stuten trat bei einer Stute Urtikaria auf, die mit Cortison behandelt werden musste; eine andere Stute verstarb nach 44 Tagen. Bei der pathologischen Untersuchung wurde eine Lebernekrose und Anzeichen intravaskulärer Hämolyse nachgewiesen, die eventuell auf die Verabreichung des Plasmas zurückzuführen sind (MCCUE et al. 1993) Equiner Hypophysenextrakt (Equine Pituitary Extract, EPE) Der EPE ist ein aus Pferdehypophysen gewonnener Rohextrakt, welcher eine den natürlichen Schwankungen unterliegende LH- und FSH-Konzentration (LH:6-10 %, FSH:2-4 %) aufweist (SQUIRES et al. 2006). EPE wurde bereits 1974 erfolgreich zur Auslösung von Mehrfachovulationen eingesetzt (DOUGLAS et al. 1974). 7

18 Schrifttum Es folgten zahlreiche Versuche, in denen Dosierungen und Behandlungsschemata untersucht, Ovulationszahlen zwischen 1 und 7 beschrieben und zwischen 1 und 4 Embryonen pro Spülung gewonnen wurden (WOODS und GINTHER 1983, 1984, 1985; SQUIRES et al. 1987; DIPPERT et al. 1992; ALVARENGA et al. 2001). SQUIRES und MCCUE (2007) fassen in einem Übersichtsartikel die Ergebnisse mehrerer Studien der Colorado State University, in denen insgesamt 170 Stuten mit EPE behandelt wurden (ø 3,2 Ov und ø 1,96 Embryonen pro Stute) zusammen. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte geschlussfolgert werden, dass die Stute prinzipiell auf eine EPE-Behandlung anspricht und auch eine Steigerung der Anzahl gewonnener Embryonen zu erwarten ist. Faktoren, wie der Tag des Behandlungsbeginns, bzw. die Größe des dominanten Follikels bei Behandlungsbeginn, die Behandlungsdauer, die eingesetzte EPE-Dosis und die Frequenz der Injektionen beeinflussten den Effekt des EPE maßgeblich (SQUIRES und MCCUE 2007). DIPPERT et al. (1992) konnten feststellen, dass der Tag des Behandlungsbeginns einen Einfluss auf das Behandlungsergebnis hat. Die Anzahl der Ovulationen war bei Stuten, die ab Tag 5 post ovulationem (post ov.) mit EPE behandelt wurden höher (ø 2,9 Ov) als bei Stuten, bei denen die Behandlung 12 Tage post ov. begann (ø 1,1 Ov). Da es bei der Stute im Rahmen der sich anbildenden Follikelwelle ab einer Follikelgröße von ca mm durch verschiedene Mechanismen (s. Kap , S. 3 f) zu einer Selektion eines dominanten Follikels und Unterdrückung der anderen Follikel der Anbildungswelle kommt (Follikeldeviation) (GINTHER et al. 2001), war das Stimulationsergebnis in einer Studie von PIERSON und GINTHER (1990) besser, wenn die Follikel zu Behandlungsbeginn einen Durchmesser von mm, als einen Durchmesser von mm aufwiesen. Eine Superovulationsbehandlung sollte folglich vor der oben beschriebenen Follikeldeviation, d.h. bei einer Follikelgröße von < 25 mm stattfinden (SQUIRES und MCCUE 2007). Ebenfalls gute Stimulationsergebnisse erzielten ALVARENGA et al. (2001). Eine zweimal tägliche Injektion einer hohen Dosis EPE (2 x 25 mg EPE) konnte das 8

19 Schrifttum Follikelwachstum und die Anzahl der Ovulationen gegenüber der einmal täglichen Standardbehandlung (1 x 25 mg EPE) deutlich erhöhen (ø 7,1 vs. ø 2,4 Ov). Ein Grund für die bessere Ovarstimulation und die damit verbundenen erhöhten Ovulationszahlen könnte die konstantere Aufrechterhaltung der FSH-Konzentration bei zweimal täglicher EPE-Behandlung sein, da endogenes FSH bei der Stute eine recht kurze Halbwertszeit von 5,5-10,8 Stunden aufweist (BRIANT et al. 2004). In Gruppe 1 (1 x 25 mg EPE) konnten durchschnittlich 1,6, in Gruppe 2 (2 x 25 mg EPE) durchschnittlich 3,5 Embryonen gewonnen werden, wobei die Embryogewinnungsrate (Embryonen/Ovulation) in Gruppe 1 mit 68 % deutlich über der von Gruppe 2 (49 %) lag. Es wurde beobachtet, dass bei einer hohen Anzahl an Ovulationen prozentual weniger Embryonen gewonnen wurden. Diese Ergebnisse konnten SCOGGIN et al. (2002) bestätigen. Pferde, denen zweimal täglich 25 mg EPE injiziert wurden, hatten mehr Ovulationen (ø 4,7) als Pferde, denen zweimal täglich 12,5 mg EPE injiziert wurden (ø 3,4). Die Embryonengewinnungsrate war aber auch hier bei den Stuten, die mit der niedrigeren Dosis behandelt wurden höher Equines follikelstimulierendes Hormon (efsh ) Das von 2003 bis 2007 in den USA kommerziell erhältliche efsh (Fa. Bioniche Animal Health, Athens, GA, USA) ist ein aufgereinigtes und standardisiertes Präparat aus equinem Hypophysenextrakt, welches ein stabiles LH:FSH Verhältnis von 10:1 (25 mg enthalten 110 µg efsh und 10 µg elh) aufweist (WELCH et al. 2006). In dem ersten Experiment in dem dieses Produkt verwendet wurde, injizierte man Stuten ab dem 5. oder 6. Tag post ovulationem (post ov.) zweimal täglich 12,5 oder 25 mg efsh und bei Erreichen eines Follikeldurchmessers von > 35 mm humanes Choriongonadotropin (hcg) oder Deslorelin zur Ovulationsinduktion (NISWENDER et al. 2003). Die Stuten, die mit der höheren efsh -Dosis behandelt wurden, hatten zwar eine höhere Anzahl präovulatorischer Follikel (ø 6,7 vs. ø 3,6), jedoch ovulierten nur 50 % dieser angebildeten Follikel. Die Anzahl der Embryonen pro Ovulation, die Tage post ov. der Trächtigkeit ultrasonographisch ermittelt wurde, war bei Stuten, die mit 25 mg efsh behandelt wurden, niedriger als bei denen, die man 12,5 mg behandelte (18 % vs. 52 %). Des Weiteren wurden in 9

20 Schrifttum diesem Versuch die ovulationsinduzierenden Medikamente hcg und Deslorelin verglichen. In der mit hcg behandelten Gruppe lag die Anzahl der Ovulationen (ø 3,4 vs. ø 1,8) als auch die Anzahl der gewonnenen Embryonen (ø 1,8 vs. ø 0,8) über den Resultaten der mit Deslorelin behandelten Gruppe (NISWENDER et al. 2003). LOGAN (2006) bestätigte diese Ergebnisse. In einem zweiten Versuch wurden bei 16 Stuten sowohl die Anzahl der Ovulationen, als auch die der gewonnenen Embryonen zwischen einem Kontrollzyklus (Zyklus 1) und einem mit efsh (2 x täglich 12,5 mg) stimulierten Zyklus (Zyklus 2) verglichen (NISWENDER et al. 2003). Beide Parameter waren in dem mit efsh behandelten Zyklus gegenüber dem Kontrollzyklus signifikant erhöht (Ovulationen ø 3,6 vs. ø 1,0 gewonnene Embryonen ø 0,5 vs. ø 1,9). MCCUE et al. (2006) beschäftigten sich mit der Beurteilung der Wirksamkeit von efsh in aufeinanderfolgenden Zyklen. Dazu wurde eine Stutengruppe in drei aufeinanderfolgenden Zyklen und eine andere Gruppe alternierend (d.h. nach jedem efsh-zyklus folgte ein nicht beeinflusster Zyklus) mit efsh behandelt. Die Autoren beobachteten, dass nach efsh -Behandlung in aufeinanderfolgenden Zyklen die Gesamtanzahl der efsh -Applikation und somit auch die Gesamtdosis verwendeten efsh im Gegensatz zu alternierend behandelten Zyklen erhöht war. Die Anzahl der Ovulationen und die Zahl der gewonnenen Embryonen unterschieden sich jedoch zwischen den beiden Gruppen nicht (MCCUE et al. 2006). Neben einer favorisierten Dosis von zweimal täglich 12,5 mg efsh und Ovulationsinduktion mittels hcg wurde der Effekt des coasting im Rahmen der Superovulationsbehandlung untersucht. Coasting ist definiert als eine Zeitspanne nach der Follikelstimulation, in der keine weiteren Gonadotropine injiziert werden. Die besten Ergebnisse wurden bei einer 42-stündigen Behandlungspause ( coasting ) zwischen der letzten efsh -Behandlung und der hcg-applikation - in der die Follikel Zeit zum Ausreifen haben sollten - erzielt (WELCH et al. 2006). Auch SQUIRES und MCCUE (2007) erreichten bei einer zweimal täglichen efsh - Applikation (12,5 mg) bessere Ovulationsergebnisse als bei einmal täglicher Applikation von 25 mg (ø 4,2 vs. ø 2,8 Ov). Darüber hinaus war die Anzahl gewonnener Embryonen nach zweimal täglicher Injektion und anschließender 10

21 Schrifttum coasting period von 30 Stunden höher als ohne coasting period (ø 2,5 vs. ø 1,9 Embryonen). Trotz aller Dosierungsempfehlungen postulierten SQUIRES et al. (2006), dass die Variabilität in der Anzahl gewonnener Embryonen sehr stark vom Spendertier abhängig zu sein scheint. Auch in dem Übersichtsartikel von SQUIRES und MCCUE (2007) wird die individuelle, teils sehr unterschiedliche Reaktion der Spenderstuten im Rahmen einer efsh -Behandlung hervorgehoben. BRIANT et al. (2004) gehen davon aus, dass die hohe Variabilität auf die individuelle Sensitivität der Stuten gegenüber der injizierten efsh -Dosis zurückzuführen ist. In Tabelle 2 sind alle bisher veröffentlichten Studien, in denen efsh verwendet wurde, zusammengefasst. 11

22 Schrifttum Tab. 2: Übersicht über Studien zur Superovulation mit efsh bei Stuten und deren Ergebnisse 12

23 Schrifttum Fortsetzung Tab. 2 13

24 Schrifttum Basierend auf diesen Studien wird - wie in Abbildung 1 dargestellt - empfohlen, mit der efsh -Stimulation (2 x 12.5 mg) zu beginnen, wenn der größte Follikel einen Durchmesser von mm aufweist und die Behandlung fortzusetzen, bis der Großteil der sich anbildenden Follikel einen Durchmesser von mm erreicht hat. Am zweiten Tag der efsh -Behandlung sollte morgens Prostaglandin 2α (PGF 2α ) zur Luteolyse injiziert werden. Nach einer coasting period von Stunden wird mittels hcg die Ovulation induziert und am darauf folgenden Tag inseminiert. Die Embryonengewinnung sollte dann 7 bis 8 Tage nach der Ovulation erfolgen (SQUIRES und MCCUE 2007). Tag post ov.* efsh -Start h Coasting Ov efsh hcg oder GnRH KB Ov Embryonengewinnung 7-8 Tage post ov. Abb. 1: efsh -Behandlungsschema nach SQUIRES und MCCUE (2007) (* = Beginn der efsh -Behandlung 5 bis 7 Tage nach der Ovulation (Ov), wenn der größte Follikel einen Durchmesser von mm aufweist und Beendigung, wenn der Großteil der Follikel einen Durchmesser von mm erreicht hat; PGF 2α (Prostaglandin F 2α ) am 2. Tag der efsh - Behandlung, Coasting = Zeitabschnitt ohne hormonelle Behandlung, post ov. = post ovulationem, hcg = humanes Choriongonadotropin, GnRH = Gonadotropin Releasing Hormon, KB = künstliche Besamung einen Tag nach der hcg- oder GnRH-Applikation) Trotz viel versprechender Ergebnisse im Rahmen der Anwendung von efsh traten auch potentielle Probleme auf. Zwar ließen sich gute Stimulationsergebnisse reproduzieren, es waren jedoch sehr unterschiedliche Stimulationsantworten bei einzelnen Stuten zu beobachten. Bei zu hoher oder zu lang anhaltender Applikation kann es zu einer Überstimulation kommen, die dazu führt, dass die Follikel nicht ovulieren, sondern luteinisieren (SQUIRES und MCCUE 2007). In einer Studie von BRIANT et al. (2004) sollten Dosierungen bestimmt werden, die physiologische FSH- Konzentrationen bei der Stute reproduzieren. Sie stellten bei zu hohen efsh - 14

25 Schrifttum Dosierungen schon vor der Ovulation Plasmaprogesteronkonzentrationen von > 1 ng/ml fest, die durch einen LH-Anstieg verursacht waren. Es kam folglich zu frühzeitigen Ovulationen oder luteinisierenden Follikeln. Ein weiteres Problem ist die Abnahme der Embryonengewinnungsrate (Embryonen/Ovulation) bei mehr als 5 Ovulationen (SQUIRES et al. 2006; PERES et al. 2007), die möglicherweise auf die von CARMO et al. (2006) beobachteten Veränderungen am Eierstock zurückzuführen ist. Die Autoren untersuchten die Eierstöcke superovulierter Stuten, die Stunden nach der ersten Ovulation geschlachtet wurden. Bei den meisten dieser Stuten fanden sie in der Ovulationsgrube große Blutkoagula, die bei Stuten der Kontrollgruppe nicht vorkamen und die möglicherweise zu einer Blockade der Ovulationsgrube führen und den Übergang der Eizellen in den Eileiter verhindern. Aufgrund dieser Ergebnisse empfehlen ALVARENGA et al. (2008) niedrigere Dosen efsh einzusetzen, um eine geringere Ovarstimulation (3 oder weniger Ovulationen) zu erreichen. LOGAN et al. (2006) konnten zeigen, dass bei einer niedrigen Dosis von 6,25 mg efsh zweimal täglich zwar weniger Ovulationen erzielt und weniger Embryonen gewonnen wurden, die Embryonengewinnungsrate (Embryonen/Ovulation) war jedoch höher als bei herkömmlicher (12,5 mg 2 x täglich) Behandlung. 2.2 Gelbkörper (Corpus luteum) Aufbau und Funktion Der Gelbkörper ist eine temporäre endokrine Drüse, die vor allem Progesteron produziert (KÖNIG und PROBST 2005). Die Bildung des Gelbkörpers beginnt bereits kurz vor der Ovulation, indem die zwischen Granulosazellen und Theka follicularis interna gelegene Basalmembran aufbricht und Kapillaren aus der Theka interna und Arteriolen aus der Theca externa zwischen den Granulosazellen eindringen können. Aus den Granulosa- und Thekazellen formen sich die Luteinzellen des Corpus luteum (KÖNIG und PROBST 2005). Die Kapillardichte nimmt während der späteren Anbildungsphase des Gelbkörpers noch weiter zu (HEES et al. 1988). 15

26 Schrifttum Die luteale Angiogenese im Rahmen der Gelbkörperentwicklung sowie die darauf folgende Gefäßregression zum Zeitpunkt der Gewebeinvolution verlaufen parallel mit der Entwicklung und der Regression des nichtvaskulären Gewebes (FERREIRA- DIAS und MATEUS 2003). Diese Abläufe werden durch zahlreiche Faktoren reguliert. Im equinen CL wird die Produktion von angiogenen Faktoren und Prostaglandin E 2, welche für die vaskuläre und nichtvaskuläre Entwicklung während der Gelbkörperanbildung von Bedeutung sind, möglicherweise durch den Tumor Nekrose Faktor α (TNFα) und Stickoxid (NO) stimuliert. Die ansteigende Mikrovaskularisierung verläuft parallel zu der Synthese von P 4, einer Zunahme der Anzahl P 4 -Rezeptoren sowie großer Luteinzellen (FERREIRA-DIAS und SKARZYNSKI 2008). Aufgrund deutlicher Größenunterschiede und ultrastruktureller Merkmale unterscheidet man zwei Luteinzellpopulationen (Abb. 2), die als große und kleine Luteinzellen bezeichnet werden (NISWENDER et al. 1985; REYNOLDS et al. 1994). Obwohl beide Zelltypen die gleiche enzymatische Ausstattung besitzen, sind sie in unterschiedlichem Ausmaß zur Progesteronsynthese befähigt (NISWENDER et al. 1994). Untersuchungen beim Pferd (FERREIRA-DIAS und SKARZYNSKI 2008) geben Anlass zur Vermutung, dass die großen Luteinzellen für die autokrine / parakrine Regulation der P 4 -Synthese im equinen CL von Bedeutung sind. In einer histochemischen bzw. immunhistochemischen Untersuchung an post mortem entnommenem Gelbkörpergewebe von Stuten im frühen, mittleren und späten Interöstrus war die Anzahl großer Luteinzellen im Corpus hämorrhagicum (CH) geringer als in den anderen Gruppen (p < 0,05), wohingegen die Anzahl und Größe der kleinen Luteinzellen nicht variierte. Lediglich in den großen Luteinzellen konnten P 4 -Rezeptoren nachgewiesen werden. Im Vergleich zur mittleren und späten Gelbkörperphase war die Plasma-P 4 -Konzentration sowohl in der Follikel- als auch in der CH-Phase erniedrigt (p < 0,05, FERREIRA-DIAS und MATEUS 2003). Diese Ergebnisse weisen laut der Autoren darauf hin, dass das Gefäßwachstum und die Entwicklung von nicht vaskularisiertem Gewebe innerhalb des zyklischen Gelbkörpergewebes der Stute in einem direktem Zusammenhang zu stehen scheinen, wodurch eine P 4 -Synthese in der frühen Gelbkörperphase ermöglicht 16

27 Schrifttum werde. Es sei sehr wahrscheinlich, dass dieses Hormon überwiegend von den großen Luteinzellen synthetisiert werde, da die Anzahl dieser Zellen und die nachgewiesene Plasma-P 4 -Konzentration in einer direkten Beziehung zueinander stünden (FERREIRA-DIAS und MATEUS 2003). Abb. 2: Immunhistochemisches Bild eines equinen CL mit kleinen und großen Luteinzellen, entnommen aus FERREIRA-DIAS und MATEUS (2003) Die Lebensspanne und Funktion des Gelbkörpers wird durch komplexe Interaktionen zwischen stimulierenden (luteotropen) und hemmenden (luteolytischen) Mediatoren reguliert (BACHELOT und BINART 2005). Tritt keine Gravidität ein, wird das Corpus luteum cyclicum kurz nach Erreichen des Blütestadiums durch endometriale Sekretion von PGF 2α zurückgebildet. Nach Abschluss der Angiogenese im Gelbkörper scheint eine Langzeiteinwirkung von Progestagenen die proliferative, angiogene Aktivität zu hemmen. PGF 2α induziert vermutlich die luteale (und vaskuläre) Regression im equinen CL. Darüber hinaus bereitet möglicherweise eine NO- und P 4 -abhängige Inhibition der Produktion angiogener Faktoren den Gelbkörper auf die funktionelle und strukturelle Regression vor. Im Gegensatz zur frühen Lutealphase induzieren NO und Zytokine in der späten 17

28 Schrifttum Lutealphase eventuell einige Abläufe, die zur Regression des equinen CL führen (FERREIRA-DIAS und SKARZYNSKI 2008). Beim Zustandekommen einer Gravidität erfolgt die Rückbildung des Gelbkörpers (Corpus luteum gravitatis) erst im Verlauf der Trächtigkeit (NISWENDER et al. 2000). Eine Progesteronkonzentration von > 1 ng/ml weist stets auf das Vorhandensein eines endokrin aktiven Gelbkörpers hin. Maximale Werte liegen bei der Stute im Interöstrus zwischen 10 und 14 ng/ml (HOPPEN und NIEDERSTUCKE 2008) Zyklische Veränderungen und die Bedeutung der Durchblutung des Corpus luteum Frau TINKANEN (1994) untersuchte bei Frauen die Durchblutung des Corpus luteum (CL) während des Zyklus. Ab dem 2. Tag nach der Ovulation war ein lutealer Blutfluss messbar, der am 5. Tag nach der Ovulation die höchsten Werte erreichte und danach kontinuierlich bis zum Ende der Lutealphase wieder abnahm. Bei Frauen mit einer Gelbkörperinsuffizienz konnte nachgewiesen werden, dass der Blutflusswiderstand in den Gefäßen des CL signifikant höher war als bei Frauen mit physiologischer Lutealphase. Außerdem war der Blutflusswiderstand um so höher, je niedriger die Plasmaprogesteronwerte lagen (GLOCK und BRUMSTED 1995). ZALUD und KURJAK (1990) untersuchten die luteale Durchblutung bei Frauen mit physiologischen und pathologischen Schwangerschaften früher Stadien. Die Autoren zeigten, dass der Blutflusswiderstand im CL bei Frauen mit intrauteriner Schwangerschaft am höchsten und bei nicht schwangeren Frauen am niedrigsten war. Bei Patientinnen mit einer Bauchhöhlenschwangerschaft lagen die Blutflusswerte zwischen denen der beiden anderen Gruppen. Auch im Rahmen von In-vitro-Fertilisationsprogrammen wurde die Blutversorgung des CL bestimmt. Bei Frauen, die nach einem Embryotransfer schwanger geworden waren, war der Blutflusswiderstand am 3. Tag nach dem Transfer signifikant niedriger als bei nicht schwangeren Frauen. Bei einem Blutflusswiderstand (RI = Resistance Index) > 0,5 konnte keine Schwangerschaft erzielt werden (BABER 18

29 Schrifttum et al. 1988). Die Autoren schlossen daraus, dass mit der transvaginalen Farbdopplerultraschallsonographie früher als bisher eine Prognose über den Ausgang eines In-vitro-Fertilisationsprogrammes möglich ist Rind Baumgartner (1998) quantifizierte die Durchblutung des CL anhand der im Dopplermodus darstellbaren Farbpixel. Die Durchblutung des heranwachsenden CL stieg bis Tag 7 post ov. kontinuierlich an, verblieb während dessen Blütephase auf einem hohen Niveau und fiel in den letzten fünf Tagen vor der nächsten Ovulation wieder auf niedrige Werte ab. ACOSTA et al. (2002) untersuchten die luteale Perfusion unmittelbar vor und bis zu 48 Stunden nach Injektion einer luteolytischen Dosis PGF2α. Die Durchblutung des CL stieg initial zwischen einer halben und zwei Stunden nach der PGF2α -Gabe an, reduzierte sich nach vier Stunden auf das Niveau, das vor der Injektion herrschte, und fiel dann in den folgenden 48 Stunden noch weiter ab. Die Veränderungen des lutealen Blutflusses anhand der durchbluteten Fläche während der spontanen Luteolyse im normalen Zyklus untersuchten SHIRASUNA et al. (2004) sowie MIYAMOTO et al. (2005). Die Autoren stellten auch hier zunächst einen Anstieg der lutealen Durchblutung fest, der nach deren Ergebnissen an den Tagen 17 bis 18 mit der pulsatilen Ausschüttung von PGF2α aus dem Uterus zusammenfällt Stute Mit Hilfe der transrektal durchgeführten Farbdopplersonographie haben BOLLWEIN et al. (2002a) den lutealen Blutfluss bei Stuten während des Zyklus untersucht. Die Autoren zeigten, dass zyklische Veränderungen und individuelle Unterschiede in der Vaskularisation der Gelbkörper bestehen. Weiterhin konnten sie eine hohe Korrelation zwischen den zyklischen Veränderungen des lutealen Blutflusses und der Plasmaprogesteronkonzentration nachweisen. Beide Parameter stiegen in den ersten Tagen nach der Ovulation nahezu parallel an, wobei die 19

30 Schrifttum Gelbkörperdurchblutung (Anzahl der Farbpixel im Gelbkörper) 5 Tage und das Plasmaprogesteron 7 Tage post ov. ihr Maximum erreichten. Auch die Abnahme des Plasmaprogesterons und der Rückgang des lutealen Blutflusses liefen parallel zueinander ab. Ähnliche Ergebnisse erhielten GINTHER et al. (2007). Auch sie berichten von einer parallelen Zu- und Abnahme der Gelbkörperdurchblutung und des Plasmaprogesterons, wobei sie die maximale Gelbkörperdurchblutung 10 Tage und die höchsten Progesteronwerte 8 Tage nach der Ovulation messen konnten. HENDRIKS et al. (2006) untersuchten die Auswirkungen von PGF 2α und hcg, die 7 Tage post ov. verabreicht wurden, auf den lutealen Blutfluss. Die luteale Durchblutung ging in den ersten 30 Minuten nach der Applikation von PGF 2α kontinuierlich zurück, wobei sich bei den Plasmaprogesteronwerte nach 2 Stunden eine Abnahme messen ließ und nach Stunden Östruswerte erreichten wurden. Im Widerspruch zu den Ergebnissen einer Studie von ARRUDA und FLEURY (2005), die nach hcg-gabe von einer Stimulation der lutealen Progesteronsekretion berichten, konnten HENDRIKS et al. (2006) weder einen Effekt auf die Progesteronkonzentration noch auf die luteale Durchblutung feststellen Einfluss des Corpus luteum auf die ovarielle Reaktion im Rahmen der Superovulationsbehandlung beim Rind Anders als beim Pferd wurden beim Rind in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien durchgeführt, in denen der Einfluss des Gelbkörpers auf die ovarielle Reaktion im Gefolge einer Superovulationsbehandlung untersucht wurde. PUWANTARA et al. (1993) beschäftigten sich mit der Fragestellung, ob die Lokalisation (rechtes, linkes Ovar) und die Größe des CL den Erfolg einer Superovulationsbehandlung beim Rind beeinflussen können. Die Tiere wurden vier Tage zweimal täglich mit 35 mg FSH behandelt und erhielten 72 Stunden nach der initialen FSH Gabe Cloprostenol zur Luteolyse. Die Lokalisation des CL hatte keinen Einfluss auf die Entwicklung der Follikel. Zudem unterschied sich der Durchmesser des CL bei Stimulationsbeginn nicht zwischen Reagenten (> 2 Ovulationen) und Nichtreagenten (0-2 Ovulationen). 20

31 Schrifttum Auch SCHWAB (2000) konnte weder einen Einfluss der Lokalisation noch der Querschnittsfläche des CL bei Stimulationsbeginn auf die Ovarreaktion bei Rindern feststellen, die zwischen dem 7. und 14. Zyklustag beginnend vier Tage lang zweimal täglich mit FSH stimuliert wurden und am 4. Stimulationstag zweimal Cloprostenol erhielten. Diese Ergebnisse wurden durch Untersuchungen von HONNENS (2006) bestätigt, in denen die Tiere 10 Tage post ov. mit ecg stimuliert und denen 3 Tage später PGF 2α injiziert wurde. In dieser Studie hatte die Größe des CL keinen Einfluss auf die Ovarreaktion. So unterschied sich weder die maximale Querschnittsfläche des CL noch die Fläche des Lutealgewebes am Tag der ecg-applikation zwischen den jeweiligen Reaktionsgruppen. Das Vorhandensein eines funktionellen, Progesteron sezernierenden CL zu Stimulationsbeginn ist laut GREVE et al. (1983) ein wichtiger Faktor für die Erfolgsaussichten der Superovulation. Das aktive CL sichere die synchrone Entwicklung der Follikel und verhindere einen Anstieg der endogenen LH-Sekretion. Tiere, deren Plasmarogesteronkonzentration bei Beginn der Gonadotropintherapie (PMSG bzw. FSH) unter 1,59 nmol/l lag, zeigten nach Prostaglandin-Applikation weder Brunstsymptome noch einen LH-Anstieg und eine niedrigere Ovulationsrate (GREVE et al. 1983). Laut SAUMANDE (1980) und GREVE et al. (1983) besteht jedoch keine Beziehung zwischen der Höhe der Progesteronkonzentration zum Zeitpunkt des Stimulationsbeginns im Diöstrus und der Ovulationsrate. HONNENS (2006) konnte keine Zusammenhänge zwischen der Progesteronkonzentration im Plasma am Tag der ecg-applikation und der Stimulationsantwort feststellen. 21

32 Schrifttum Einfluss des Corpus luteum auf die Anzahl und Qualität der Embryonen im Rahmen der Superovulationsbehandlung beim Rind Widersprüchliche Ergebnisse existieren nicht nur in Bezug auf die ovarielle Reaktion (s. Kap , S. 20 f), sondern auch in Bezug auf die Quantität und Qualität gewonnener Embryonen. BARTMANN (1992) untersuchte den Einfluss des sonographisch darstellbaren Querschnittes des CL des vorausgehenden Zyklus auf den Erfolg der Embryonengewinnung. Am Tag vor Einleitung der Superovulation, d.h. 10 Tage nach festgestellter Brunst, unterschied sich die Fläche des CL der Tiere mit positivem Spülergebnis (> 1 Embryo) nicht signifikant von der Fläche der Tiere mit einem negativen Spülergebnis (0 Embryonen). Entsprechend war am Tag der Prostaglandininjektion kein Unterschied zwischen Donoren mit positivem und negativem Spülergebnis festzustellen. SCHWAB (2000) konnte ebenfalls keinen signifikanten Einfluss des Gelbkörperquerschnittes vor Stimulationsbeginn auf die Anzahl gewonnener Embryonen nachweisen. In ihrer Untersuchung an 170 Kühen wurden insgesamt 192 Corpora lutea sonographisch dargestellt. Die Größe des CL wurde ermittelt, indem die Länge und Breite bzw. die Fläche des größten CL-Querschnittes im Ultraschallbild berechnet wurde. Tiere mit größeren Gelbkörpern wiesen tendenziell eine höhere Gesamtzahl gewonnener Embryonen und mehr transfertaugliche Embryonen auf. Auch HONNENS (2006) konnte keine Zusammenhänge zwischen der Größe des Corpus luteum am Tag der ecg-applikation und dem Spülergebnis aufzeigen. BARTMANN (1992) beobachtete weiterhin, dass geringe Plasmaprogesteronkonzentationen zu Beginn eines Superovulationsprogrammes (Stimulation mittels PMSG bzw. FSH) zu schlechten Spülergebnissen führten. Er untersuchte Rinder während des Diöstrus vor und nach der Stimulationsbehandlung. Am ersten Untersuchungstag besaßen Spendertiere mit positivem Spülergebnis (> 1 Embryo) eine höhere Progesteronkonzentration im Blutplasma (16,9 nmol/l) als Spendertiere mit negativem Ergebnis (0 Embryonen, 10,2 nmol/l). Auch unmittelbar vor der Prostaglandingabe (72 und 84 Stunden nach Superovulationsbehandlung) 22

33 Schrifttum unterschied sich der Progesteronspiegel deutlich zwischen den beiden Gruppen (25,1 vs. 18,8 nmol/l). Ebenso stellten CHAGAS E SILVA et al. (2000) fest, dass bei Spenderkühen hohe Porgesteronwerte zu Beginn der Superovulationsbehandlung sowie steilere Progesteronanstiege post ovulationem mit einer höheren Zahl gewonnener Embryonen und transfertauglicher Embryonen einherging. Im Gegensatz dazu konnten andere Autoren keinen Zusammenhang zwischen der Progesteronkonzentration zum Zeitpunkt der Einleitung der Stimulationsbehandlung und der Quantität und Qualität der gewonnenen Embryonen feststellen (LINDSELL et al. 1986; WALTON und STUBBINGS 1986; ROBERTS et al. 1994). Nach der Stimulation, d.h sieben Tage post ov. konnte die Zahl der im Rahmen einer Embryonenspülung zu gewinnenden Embryonen laut HONNENS (2006) anhand der Zahl vorhandener Corpora lutea abgeschätzt werden. Die Zahl der bestimmten Gelbkörper korrelierte in der Studie mit der Anzahl gewonnener Embryonen. Zusätzlich korrelierte die Progesteronkonzentration sieben Tage post ovulationem in fast gleichem Maße mit der Zahl der Corpora lutea (r = 0,58) und der Zahl gewonnener Embryonen (r = 0,55). 2.3 Gefäßversorgung des inneren Genitals der Stute Gefäßversorgung des Uterus Für die Blutzufuhr des Uterus ist in erster Linie die A. uterina verantwortlich (Abb. 3). Sie entspringt aus der A. iliaca externa, die aus der Aorta abdominalis hervorgeht. Ca. 5 cm vor dem Erreichen des Uterushorns teilt sich die A. uterina in einen kleineren cranialen sowie einen größeren caudalen Ast auf. Der caudale Ast, der fast das gesamte Uterushorn versorgt, anastomosiert mit dem Ramus uterinus der A. vaginalis. Der craniale Ast, der nur der Uterushornspitze Blut zuführt, kommuniziert mit dem Ramus uterinus der A. ovarica. Der größte Teil des venösen Abflusses erfolgt über den Ramus uterinus der V. ovarica, wobei der Verlauf der Venen dem der Arterien entspricht (GINTHER et al. 1972). 23

34 Schrifttum Abb. 3: Arterien der Organe der Beckenhöhle der Stute. Halbschematisch (WILKENS und MÜNSTER 1984) (1 = Aorta, 2 = A.ovarica, 2 = R.uterinus, 3 = A.iliaca externa, 4 = A.uterina, 4 = R.cranialis, 4 = R.caudalis, 5 = A.iliaca interna, 6 = A.pudenda interna, 7 = A.vaginalis, 8 = R. uterinus) Gefäßversorgung des Ovars Auf Höhe des 4. Lendenwirbels zweigt die A. ovarica von der Aorta ab. Diese zieht im Mesovar bis zum Ovar hin, wo sie sich in zwei Äste aufteilt, die sich in engen Schleifen aneinander legen und so, nahe dem Ovar, ein Arterienkonvolut bilden. Der meist kräftigere caudale Ast zieht bogenförmig über die Ovaroberfläche und verzweigt sich dann an der Fossa ovarii in korkenzieherartige Endäste. Der craniale Ast verläuft ebenfalls über die Ovaroberfläche und kommt medial und lateral um die Fossa ovarii zu liegen (DELCAMPO und GINTHER 1972; GINTHER et al. 1972; KÖNIG et al. 1987). Von den beiden Ästen der A. ovarica werden im gesamten Verlauf Gefäße erster und zweiter Ordnung abgegeben, die in der Tiefe des Ovars die Funktionsgebilde versorgen. In der Theka externa des Follikels zweigen sich diese Äste in kleinere Gefäße auf, die dann in die Theka interna des Follikels ziehen und dort ein dichtes Kapillarnetz speisen. 24

35 Schrifttum Während der Ovulation fällt die Follikelhöhle in sich zusammen und es bilden sich zahlreiche Kavernen. Von den Arteriolen und Venolen, die durch diesen Faltungsprozess nun im Inneren des Corpus haemorrhagicum liegen, sprossen zentripetal gerichtete, parallel verlaufende Kapillaren aus, so dass ein dichtes Bett entsteht, diese Kapillaren anastomosieren jedoch nicht miteinander (HEES et al. 1988). Die V. ovarica vereinigt einen kurzen Ramus ovaricus, der das venöse Blut des Ovars abführt und einen prominenteren, vom Uterus herkommenden Ast. In diesen Gefäßast mündet nach GINTHER et al. (1972) ein weiterer Zweig der V. ovarica, der vom Ovar ausgehend die Windungen der A. ovarica passiert. Durch zahlreiche Anastomosierungen entsteht auch hier ein netzartiges Gefäßsystem. Als Besonderheit bei der Stute beschreiben KÖNIG et al. (1987) sphinkterartige Strukturen an den Venen des Eierstockes, die sie als hämodynamische Einrichtungen deuten, die in bestimmten Zyklusphasen eine Ischämie bzw. Blutfülle an den Funktionsgebilden bedingen könnten. 2.4 Dopplersonographie Die Dopplersonographie ist eine nicht invasive Methode zur Beurteilung von Blutströmungsverhältnissen in Gefäßen bzw. Geweben. Im folgenden Kapitel werden lediglich die wichtigsten Grundlagen der Dopplersonographie erläutert, soweit sie für das Verständnis der Arbeit erforderlich sind. Für eine ausführlichere Beschreibung der Grundlagen wird an dieser Stelle auf die vorausgegangenen Dissertationen von BAUMGARTNER (1998), BÜHLMEYER (1999) und MAYER (1999) verwiesen Physikalische Grundlagen Ultraschallwellen werden von einem in Schwingung versetzten piezoelektrischen Kristall ausgesandt und werden an den Grenzflächen der Körpergewebe z. T. reflektiert (WAITE et al. 1990; DICKEY 1997). Treffen diese Schallwellen auf sich bewegende Strukturen, wie beispielsweise in einem Gefäß strömenden Erythrozyten, so erfahren sie bei der Reflektion eine Frequenzverschiebung. Diese 25

36 Schrifttum Frequenzverschiebung wird nach ihrem Entdecker Christian Doppler als Dopplershift bezeichnet und bildet die Grundlage für die Blutflussmessung (WAITE et al. 1990; DUDWIESUS et al. 1993). Die Frequenzverschiebung kann nach folgender Formel berechnet werden: f d = 2 f 0 * TAMV * cosα c f d f 0 TAMV α c = Frequenzverschiebung = Dopplershift (Hz) = Sendefrequenz des Schallkopfes (Hz) = mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit (m/s) = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Blutflussrichtung = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Körpergewebe (ca.1540m/s) Diese akustisch wahrnehmbaren Frequenzverschiebungen kann zusätzlich in einem Koordinatensystem in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt werden. Der zur Sonde fließende Blutstrom wird dabei oberhalb, der von der Sonde wegströmende Blutfluss unterhalb der Nulllinie angezeigt. So entstehen für die arteriellen Gefäße jeweils charakteristische Dopplerwellen, welche sich aus den unterschiedlichen Blutflussgeschwindigkeiten während der Systole und Diastole ergeben (DUDWIESUS et al. 1993; DICKEY 1997) Gerätetechnologie Bei den heute verwendeten pulsed-wave (PW)-Dopplergeräten dient ein einziger piezoelektrischer Kristall im Schallkopf sowohl als Sender als auch als Empfänger der Schallwellen, d.h. es wird alternierend gesendet und empfangen. Dadurch wird ein tiefenselektives Arbeiten möglich, wobei die Messtiefe vom Untersucher eingestellt werden kann (DUDWIESUS et al. 1993). 26

37 Schrifttum Auswertungsmethoden Zur Auswertung von Dopplerwellen stehen drei verschiedene Methoden zur Auswahl: 1. Qualitative Auswertung: Bei der qualitativen Auswertung von Dopplerkurven werden die Pulswellen in deskriptiver Art beurteilt und klassifiziert. Dabei werden Eigenschaften wie die Flussrichtung, das Vorhandenseins eines diastolischen Blutflusses und dessen Kontinuität während einer Herzaktion herangezogen (GOSWAMY und STEPTOE 1988; TEKAY et al. 1996). 2. Semiquantitative Auswertung: Zur semiquantitativen Beurteilung wurden die sogenannten Dopplerindices eingeführt. Diese dienen der Quantifizierung der Widerstandsverhältnisse in der Peripherie des untersuchten Gefäßes. Je höher die Index-Werte sind, desto größer ist der Blutflusswiderstand in dem vom jeweiligen Gefäß versorgten Organ (DICKEY 1997). Gebräuchliche Indices in der Dopplersonographie sind der Resistance Index (RI) nach POURCELOT (1974) und und der Pulsatility Index (PI) nach DICKEY (1997): In die Berechnungen gehen die maximale systolische (S), die minimale diastolische (Dm), die enddiastolische (De) und die mittlere maximale (TAMF = time avaraged maximum frequency shift) Frequenzverschiebung ein (Abb. 4). Resistance Index (RI) = S De S Pulsatility Index (PI) = S Dm TAMF 27

38 Schrifttum Dm De Abb. 4: Schematische Darstellung einer Dopplerwelle mit der maximalen systolischen (S), der minimalen diastolischen (Dm), der enddiastolischen (De) und der maximalen mittleren Frequenzverschiebung (TAMF) während eines Herzzyklus 2. Quantitative Auswertung: Bei der quantitativen Auswertung wird das Blutflussvolumen bestimmt. Dazu muss sowohl der Winkel zwischen Gefäßverlauf und Dopplerstrahl als auch der Durchmesser des untersuchten Gefäßes bekannt sein. Das Blutflussvolumen (BFV (ml/s)) kann dann nach folgender Formel berechnet werden: BFV = TAMV * A = TAMV * r² * π BFV = Blutflussvolumen (ml/s) A = Fläche des Gefäßquerschnittes als kreisrund angenommen (cm²) TAMV = time averaged maximum velocity (m/s) (mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit) r = Gefäßradius (cm) 28

39 Schrifttum Die mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit (TAMV = time averaged maximum velocity) in Meter pro Sekunde (m/s), ergibt sich durch Umstellen der Dopplergleichung: TAMV = f d * c 2 * f 0 * cosα TAMV f d f 0 α c = time averaged maximum velocity (m/s) = Frequenzverschiebung (TAMF) = Sendefrequenz des Schallkopfes (Hz) = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Blutflussrichtung = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Körpergewebe (ca.1540m/s) Color-Angio-Mode Im so genannten Color-Angio-Modus wird nicht die Blutflussgeschwindigkeit, sondern die Blutflussintensität farblich kodiert. Das heißt, die Signale aller sich in Bewegung befindlichen zellulären Blutbestandteile werden registriert und als farbige Punkte über das B-Bild projiziert dargestellt. Hierbei wird der Blutflusses in der Regel unabhängig von dessen Richtung in den Farbabstufungen von rot (geringe Intensität) bis gelb (hohe Intensität) widergegeben (DUDWIESUS et al. 1993; DEANE 1995). Verschiedene Studien konnten zeigen, dass dieses Verfahren der herkömmlichen Farbdopplersonographie bei der Darstellung geringer Blutflüsse überlegen ist (BUDE et al. 1994; RUBIN et al. 1994; MIYAZAKI et al. 1998). In den letzten Jahren wurde der Color-Angio-Mode zur Darstellung des lutealen Blutflusses auch bei der Stute angewandt (BOLLWEIN et al. 2002a; HENDRIKS et al. 2006). Zur quantitativen Beurteilung der Farbbilder sind inzwischen computergestütze Methoden entwickelt worden. Dabei kann auf dem Farbdopplerbild vom Untersucher die auszuwertende Region (ROI = Region Of Interest) markiert werden, um Gefäße aus der Nachbarschaft des zu untersuchenden Organs auszugrenzen. 29

40 Schrifttum 2.5 Ovarieller Blutfluss NISWENDER et al. (1976) untersuchten das ovarielle Blutflussvolumen (BFV) mittels implantierter Dopplersonden beim Schaf. Es zeigte sich, dass die Blutversorgung mit dem Vorhandensein eines Funktionsgebildes variierte. Nach Meinung der Autoren sind Schwankungen in der Durchblutung der A. ovarica während der Lutealphase in erster Linie auf Veränderungen des Blutflusses im Corpus luteum zurückzuführen, da ihm etwa 90 % des Blutes, das zum Ovar fließt, zukäme Ovarieller Blutfluss bei der Stute BOLLWEIN et al. (2002b) bestätigten die von NISWENDER (1976) erhobenen Ergebnisse durch nicht-invasive farbdopplersonographische Untersuchungen bei der Stute, indem sie den ovariellen Blutfluss anhand des Pulsatility Index (PI) bestimmten. Die PI-Werte der ipsilateralen A. ovarica (= Seite des CL tragenden Ovars) waren signifikant tiefer, wobei die CL-Größe nicht mit den PI-Werten korrelierte. Der Blutflusswiderstand in der ipsilateralen A. ovarica nahm bis zum 6. Tag post ov. ab und danach bis zum Ende des Diöstrus wieder zu. Weiterhin bestand eine negative Korrelation zwischen den PI-Werten der ipsilateralen Seite und den Plasmaprogesteronwerten. BOLLWEIN et al. (2003b) infundierten in einer weiteren Studie Magermilchverdünner, Seminalplasma bzw. Nativsperma in den Uterus der Stute und beobachteten, dass der ovarielle Blutfluss nur in der ipsilateral zum präovulatorischen Follikel liegenden A. ovarica und nur nach Infusion von Nativsperma anstieg. Laut der Autoren ist diese Beobachtung möglicherweise auf Interaktionen zwischen den Spermien und dem Eileiter zurückzuführen. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl die Verabreichung von Östrogenen und Gestagenen (BOLLWEIN et al. 2004a) als auch die Applikation des Antikoagulans Acetylsalicylsäure und des Vasodilatators Captopril (BOLLWEIN et al. 2004b) zum Anstieg der ovariellen Perfusion führten. 30

41 Schrifttum Messung des ovariellen Blutflusses im Rahmen der assistierten Reproduktion Frau In der Humanmedizin beschäftigten sich unterschiedliche Studien mit Zusammenhängen zwischen dem ovariellen Blutfluss, der Oozytenqualität und dem Schwangerschaftserfolg. Zusammenhänge zwischen der Durchblutung des ovariellen Stromas zu Stimulationsbeginn und der Anbildung zahlreicher Follikel nach hormoneller Stimulation konnten WEINER et al. (1993) und ZAIDI et al feststellen. Es bestand sowohl eine Korellation (r = 0,50, p = 0,001) zwischen der intraovariellen maximalen systolischen Blutflussgeschwindigkeit und der Zahl angebildeter Follikel (ZAIDI et al. 1996), als auch zwischen dem in den Aa. ovaricae gemessenen PI und der Ovarreaktion (WEINER et al. 1993). Weitere Untersuchungen ergaben, dass die intraovarielle Durchblutung in der frühen Follikelphase, d.h. noch vor der hormonellen Stimulation, positiv mit der ovariellen Reaktion in Form der Follikelzahl korreliert (ALTUNDAG et al. 2002; SHRESTHA et al. 2006). BASSIL et al. (1997) behaupteten, dass der schon vor Stimulationsbeginn gemessene intraovarielle Blutflusswiderstand einen Hinweis auf die Zahl zu gewinnender Oozyten geben könne. Von Frauen, die zwei Tage vor der hmg- Verabreichung einen geringen RI (< 0,56) aufwiesen, konnten mehr Oozyten gewonnen werden als von Frauen mit einem hohen RI ( 0,56). Sie schlussfolgerten, dass der RI ein guter Indikator für eine eingeschränkte Ovaraktivität sei und dazu genutzt werden könnte, den Zeitpunkt der hmg-applikation besser zu terminieren. ALTUNDAG (2002) bestätigten diese Ergebnisse Rind HONNENS (2006) befasste sich beim Rind mit den Zusammenhängen zwischen dem genitalen Blutfluss einerseits und der ovariellen Reaktion bzw. der Anzahl gewonnener Embryonen andererseits. 31

42 Schrifttum In dieser Studie stand das ipsilateral zum CL gemessene ovarielle Blutflussvolumen (BFV) vor der hormonellen Stimulation in einer negativen Beziehung zu der ovariellen Stimulationsreaktion der Rinder. So bildeten Kühe, die vor der Stimulation ein hohes ovarielles BFV aufwiesen, drei Tage nach der ecg-applikation zunächst weniger Follikel und nach der Ovulation weniger Corpora lutea an. Die dargestellten Perfusionsverhältnisse galten jedoch nur auf der Körperseite, deren Ovarien ausschließlich ein Corpus luteum als Funktionsgebilde beherbergten. Das ovarielle BFV, welches ipsilateral zu den Ovarien gemessen wurde, die sowohl ein Corpus luteum als auch einen dominanten Follikel trugen, unterschied sich tendenziell zwischen Kühen mit geringer (0-1 0) und hoher (> 20) Gelbkörperzahl. Die Ergebnisse der genannten Studie liefern keine Erklärung, warum der Blutfluss in der A. ovarica vor der hormonellen Stimulation in einem negativen Zusammenhang mit der ovariellen Reaktion stand. Dennoch hält die Autorin es für unwahrscheinlich, dass es sich um einen Zufallsbefund handelt, da die Unterschiede zwischen den Gruppen deutlich gewesen seien. Sieben Tag post ov. variierten sowohl das ovarielle BFV als auch ovarielle PI in Abhängigkeit von der Zahl vorhandener Corpora lutea. Je mehr Corpora lutea die Ovarien beherbergten, desto höher war das ovarielle BFV und desto geringer war ovarielle PI. 2.6 Uteriner Blutfluss Uteriner Blutfluss bei der Stute Die uterine Durchblutung bei der Stute wurde erstmals von BOLLWEIN et al. (1998) untersucht und die Autoren stellten fest, dass der uterine Blutfluss zyklusabhängigen Schwankungen unterliegt. Sowohl in der genannten als auch in einer nachfolgenden Studie (BOLLWEIN et al. 2002b) bestanden zwischen den PI-Werten der rechten und linken A. uterina keine signifikanten Unterschiede und eine gute Korrelation, so dass für die Analyse ein Mittelwert der beiden Arterien verwendet wurde. Am Tag der Ovulation (D 0) und dem darauffolgenden Tag (D 1) sowie 11 Tage post ov. waren die höchsten, 5 Tage post ov. und 2 Tage vor der Ovulation die niedrigsten PI-Werte 32

43 Schrifttum zu verzeichnen. Es zeigte sich eine negative Korrelation zwischen den PI-Werten und den Östrogen-Konzentrationen im Östrus. Keine Korrelationen bestanden zwischen den PI-Werten und der Progesteronkonzentration (BOLLWEIN et al. 2002b). In weiteren Studien wurden Faktoren, die die uterine Durchblutung bei der Stute beeinflussen, untersucht: Zunächst beschäftigten sich BOLLWEIN et al. (2003a) mit dem transrektal per Dopplersonographie ermittelten uterinen Blutfluss der jeweils linken und rechten A. uterina während der frühen Trächtigkeit. Diese wurden wie schon in einer früheren Arbeit beschrieben (BOLLWEIN et al. 1998) aufgefunden. Elf Tage post ovulationem konnten die Trächtigkeiten sonographisch festgestellt werden, wobei sich zu diesem Zeitpunkt noch keine Unterschiede der uterinen Durchblutung zwischen tragenden und nicht tragenden Stuten zeigte. Ab dem 11. Tag post ov. waren die RI-Werte der tragenden Stuten niedriger und die TAMV-Werte höher als die der nicht tragenden Stuten. Außerdem war zu beobachten, dass die ipsilateral zum Konzeptus gelegene A. uterina einen niedrigeren Blutflusswiderstand als die contralaterale Seite aufwies (BOLLWEIN et al. 2003a). Im gleichen Jahr untersuchten BOLLWEIN et al. (2003b) weiterhin den Einfluss von Magermilchverdünner, Seminalplasma bzw. Nativsperma auf die Durchblutung des Uterus der Stute. Sechs Stuten wurden in drei aufeinanderfolgenden Zyklen jeweils 20 ml Magermilchverdünner, Seminalplasma oder Nativsperma 24 und 48 Stunden nach Auftreten eines 30 mm großen Follikels intrauterin infundiert. Im Rahmen der direkt vor, sowie 1, 3,6,12 und 24 Stunden nach den Infusionen durchgeführten ultrasonographischen Untersuchungen der Aa. ovaricae und Aa. uterinae nach zuvor beschriebenen Techniken (BOLLWEIN et al. 1998; BOLLWEIN et al. 2002b) konnte festgestellt werden, dass Magermilchverdünner keinen Einfluss auf die genitale Durchblutung hat. Im Gegensatz dazu stiegen die TAMV-Werte sowohl nach Infusion von Seminalplasma als auch von Nativsperma innerhalb einer Stunde nach Infusion in beiden uterinen Arterien deutlich an. Die Autoren vermuten, dass die vermehrte uterine Durchblutung auf die endometriale Entzündungsantwort und vasodilatatorische Komponenten des Seminalplasmas zurückzuführen sein könnte. 33

44 Schrifttum In einer weiteren Studie untersuchten Bollwein et al. (2004a) den Einfluss exogen zugeführten Östrogens und Progestins auf den uterinen Blutfluss bei zyklischen Stuten. Fünf Stuten erhielten für 14 Tage (beginnend am Tag der Ovulation = Tag 0) einmal täglich eine orale Gabe von Altrenogest (0,044 mg/kg). Im folgenden Zyklus wurde den Stuten 5 mg Östradiol an den Tagen 0 (Tag der Ovulation), 5 und 10 intramuskulär injiziert. Der mittels Dopplerultrasonographie ermittelte uterine Blutflusswiderstand (PI, ausgewertet von den Tagen 0 bis 15 sowie -6 bis -1) war sowohl im Diöstrus als auch im Östrus in beiden behandelten Zyklen höher als in einem nicht behandelten Kontrollzyklus. Eine Zunahme der uterinen Durchblutung konnte folglich nach der Verabreichung von Östrogenen und Gestagenen nicht festgestellt werden (BOLLWEIN et al. 2004a). Die Wirkung des Antikoagulans Acetylsalicylsäure und des Vasodilatators Captopril wurde in einem weiteren Versuch ermittelt. Fünf Stuten erhielten am Tag nach der Ovulation beginnend bis einschließlich zum 11. Tag post ovulationem jeweils zweimal täglich 2500 mg Acetylcystein bzw. in einem weitern Zyklus zweimal täglich 50 mg Captopril über das Futter. Der an Tag 11 post ovulationem ultrasonographisch ermittelte PI beider Aa. uterinae war nach Acetylcyteingabe im Mittel um 25 % niedriger und nach Captopril Applikation um 13 % geringer als die gemessenen PI- Werte in einem Kontrollzyklus, in dem die Stuten mit 2500 mg Laktose behandelten wurden. Das Antikoagulanz Acetylcyteingabe und der Vasodilatator Captopril verbesserten die uterine Perfusion, wobei die Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit nicht bestimmt wurden (BOLLWEIN et al. 2004b) Messung des uterinen Blutflusses im Rahmen der assistierten Reproduktion Frau Die ersten Autoren, die Fertilitätsstörungen bei der Frau in Zusammenhang mit einer herabgesetzten uterinen Durchblutung brachten, waren GOSWAMY et al. (1988). Sie untersuchten 153 Frauen, die in drei In-vitro-Fertilisations(IVF)-Zyklen nicht schwanger geworden waren, und stellten fest, dass 74 (48 %) von ihnen einen 34

45 Schrifttum ungenügenden diastolischen Blutfluss in der A. uterina während der Lutealphase des normalen Zyklus aufwiesen. Von diesen Frauen erhielten 38 eine Östradiolbehandlung über 3 Zyklen, woraufhin sich bei 31 Frauen (82 %) der uterine Vorwärtsfluss während der Diastole verbesserte. Von diesen 31 Patientinnen mit verbesserter uteriner Durchblutung unterzogen sich 14 einem erneuten IVF-ET- Durchgang und es konnte eine Schwangerschaftsrate von 43 % erreicht werden. WEINER et al. (1993) regten im Rahmen eines IVF-Programms das Follikelwachstum durch die wiederholte Verabreichung von humanem Menopausengonadotropin (hmg) an. Ab einer Follikelgröße von 16 mm wurde durch eine einmalige hcg-injektion die Ovulation induziert. Die behandelten Patientinnen wiesen gegenüber Frauen mit unbehandelten Zyklen zu Beginn der Follikelphase und während der frühen Lutealphase deutlich niedrigere Gefäßwiderstände in den intraovariellen Gefäßen und den Aa. uterinae auf. Auch CACCIATORE und TIITINEN (1996) beobachteten während der Stimulationsbehandlung im Rahmen eines IVF-Programms im Vergleich zum normalen Zyklus die Reduktion des Blutflusswiderstandes (PI) in der A. uterina und sehen die Veränderung des PI als wichtigen Faktor für den IVF-Erfolg an. Je stärker die prozentuale Abnahme des PI war, desto höher war die Zahl herangebildeter Follikel (r = 0,29) und gewonnener Oozyten (r = 0,28). Die Autoren stellten darüber hinaus fest, dass Frauen, deren PI infolge der Stimulation am Tag des Embryotransfers unter den Wert von 3,0 gefallen war, ein besseres Schwangerschaftsergebnis erzielten als Frauen, deren Werte erhöht blieben. Auch andere Autoren kamen zu einem vergleichbaren Ergebnis (STEER et al. 1992; FAVRE et al. 1993). Sie beobachteten, dass sich ab einem PI von 3,0 bzw. 3,5 bei keiner Frau eine Schwangerschaft entwickelte. Aufgrund ihrer Resultate empfahlen die Autoren bei einem uterinen Blutflusswiderstand von mindestens 3,0 die Kryokonservierung des Embryos und eine Verschiebung des Transfertermins auf einen späteren Zyklus mit besseren Blutflussverhältnissen. 35

46 Schrifttum Rind In der Studie von HONNENS (2006) wurde von der Autorin beschrieben, dass sich infolge der hormonellen Stimulation mittels ecg auch der uterine Blutfluss steigerte. Während das uterine Blutflussvolumen zwischen dem 10. und 13. Tag des Stimulationszyklus um 42 % zuzunehmen schien, sei der uterine Pulsatility Index (PI) um 30 % gesunken. Die Studie beschreibt, dass die absolute Zunahme des uterinen Blutflusses unabhängig von der Lokalisation des Corpus luteum beidseits gleich stark ausgeprägt war. Nach Meinung der Autorin stehe die Veränderung des uterinen Blutflusswiderstandes vermutlich mit dem Stimulationserfolg in Zusammenhang. Je stärker die prozentuale Abnahme des PI sei, desto höher sei die Zahl herangebildeter Follikel und gewonnener Oozyten. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen unterschied sich der uterine PI dieser Untersuchungen drei Tage nach hormoneller Stimulation in Abhängigkeit von der Zahl wachsender antraler Follikel. Kühe, die maximal zehn Follikel mit einem Durchmesser von mindestens fünf Millimetern angebildet hatten, wiesen einen signifikant höheren uterinen PI auf als Kühe, bei denen sich zwischen zehn und 20 solcher Follikel entwickelt hatten. Dieser Unterschied war auf der contralateral zum Corpus luteum gelegenen Seite nur tendenziell nachzuweisen. Die genannten Ergebnisse weisen nach Meinung der Autorin darauf hin, dass der arterielle uterine Blutfluss stärker als erwartet in das funktionelle Zusammenspiel von Ovar und Uterus involviert sei. Sie geben laut HONNENS (2006) Anlass zur Vermutung, dass ein geringeres Blutflussvolumen in der A. ovarica unmittelbar vor der Stimulationsbehandlung durch einen erhöhten indirekten Blutzufluss aus der A. uterina über den Ramus uterinus der A. ovarica gegeben sei. 36

47 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Tiere Die Untersuchungen erfolgten im Zeitraum von Mai bis November 2007 an 6 allgemeingesunden und zyklischen Stuten (3 Traber, 2 Warmblut, 1 Vollblut), die zwischen 5 und 13 Jahren alt waren (Durchschnittsalter: 9 Jahre). Es handelte sich um vier Maidenstuten und zwei Stuten, die bisher einmal gefohlt hatten. Die Tiere standen im Besitz der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover und wurden auch dort gehalten. Die Stuten wurden in Einzelboxen mit gegenseitigem Blickkontakt auf Stroh aufgestallt und wurden mit Heu und Kraftfutter gefüttert; während des Tages wurde ihnen Auslauf in der Gruppe gewährt. Im Interöstrus wurden die Stuten jeden zweiten Tag, während des Östrus täglich an einem Hengst auf das Vorhandensein äußerer Rossesymptome (Stehen, Blitzen, Schleimen) probiert. 3.2 Versuchsanordnung Die Stuten wurden in insgesamt 5 aufeinanderfolgenden Zyklen untersucht (Tab. 3). Die Zyklen 1 und 3 wurden als Kontrollzyklen ohne Superovulationsbehandlung und ohne Besamung definiert (Kontrolle ohne Embryonengewinnung). In den Zyklen 2 und 4 wurden die Stuten mit efsh (Fa. Bioniche Animal Health, Athens, GA, USA) stimuliert, nach Ovulationsinduktion mit hcg zweimal besamt, und es wurde eine Uterusspülung zur Embryonengewinnung durchgeführt (Superovulationszyklen). Im fünften Zyklus wurde eine Uterusspülung zur Embryonengewinnung nach Ovulationsinduktion mit hcg und zweimaliger Besamung ohne vorherige Stimulation vorgenommen (Kontrolle mit Embryonengewinnung). Für die künstliche Besamung der Stuten wurde Sperma eines achtjährigen, fertilen Warmbluthengstes des Niedersächsischen Landgestüts Celle verwendet. Das Sperma wurde unmittelbar nach der Gewinnung auf 50 x 10 6 Spermien/ml mit Magermilchverdünner (37 C) (INRA 82, IJAZ und DUCHARME 1995, s.anhang, Tab. 37

48 Material und Methoden 12, S. 105) verdünnt. Nach Zentrifugation (600 g für 10 min) wurden nach Dekantierung des Überstandes aus dem Samenpellet Besamungsportionen auf ein Volumen von 20 ml mit 750 x 10 6 progressiv motilen Spermien eingestellt. Bis zur Samenübertragung erfolgte die Lagerung des Spermas in sterilen Einmal- Plastikspritzen in Styroportransportboxen (Fa. Minitüb, Landshut) bei + 5 C. Tab. 3: Übersicht der fünf untersuchten Zyklen und der jeweils durchgeführten Superovulations- und Ovulationsinduktionsbehandlungen sowie der Besamung und Embryonengewinnung Zyklus efsh - Behandlung Ovulationsinduktion mit hcg Zweimalige Besamung Embryonengewinnung 6,5 Tage post ov hcg = humanes Choriongonadotropin, post ov. = post ovulationem, efsh = equines follikelstimulierendes Hormon Versuchsablauf in den Superovulationszyklen (Zyklen 2 und 4) In den Superovulationszyklen (Abb. 5) wurde zum einen die Anzahl der Follikel, zum anderen die Anzahl der Ovulationen pro Stute untersucht. Nach Bestimmung des Ovulationszeitpunktes im vorausgegangenen Zyklus erfolgte die Kontrolle der Follikelentwicklung im frühen Diöstrus täglich mittels transrektaler Ultrasonographie. Bei Erreichen einer Follikelgröße von mm im Durchmesser begann die efsh -Stimulation. Den Stuten wurde zweimal täglich (7.00 Uhr, Uhr) 12,5 mg efsh intramuskulär (i.m.) appliziert, bis die Follikel eine Größe von ca mm im Durchmesser aufwiesen. Am zweiten Tag der efsh -Behandlung erfolgte morgens eine intramuskuläre Injektion von 250 μg Cloprostenol (Estrumate, Essex Tierarznei, München). Nachdem die efsh -Behandlung bei einer erreichten Follikelgröße von mm beendet wurde, folgte eine Phase, in der die Stuten für 38

49 Material und Methoden 36 Stunden nicht behandelt wurden ( coasting period ). Anschließend erhielten die Stuten zur Ovulationsinduktion eine intra venöse (i.v.) Injektion 2500 IE humanen Choriongonadotropins (Ovogest, Intervet, Unterschleißheim). Die manuelltranszervikale Samenübertragung erfolgte 12 und 36 Stunden nach der hcg-gabe in den Gebärmutterkörper. Am Tag der ersten Besamung wurde das am gleichen Tag gewonnene und aufbereitete Frischsperma (s. Kap. 3.2, S. 37 f) vom Niedersächsischen Landgestüt in Celle abgeholt (Fahrtdauer ca. 45 min). Die Lagerung der zweiten Besamungsportion erfolgte bis zur zweiten Besamung im Kühlschrank bei + 5 C. Die Eingrenzung des Ovulationszeitpunktes geschah durch ein vierstündiges Untersuchungsintervall mittels transrektaler Ultraschalluntersuchung, wobei der Tag der Ovulationsfeststellung als Tag 0 definiert wurde. Nach Auslaufen des Follikels wurden die verbleibenden Funktionsgebilde als Gelbkörper (Corpora lutea) bezeichnet. Die Embryonengewinnung erfolgte dann 6,5 Tage nach der Ovulation und den Stuten wurden nach der Embryonengewinnung 250 μg Cloprostenol (Estrumate, Essex Tierarznei, München) i.m. injiziert, um eine Luteolyse auszulösen. Nach spätestens 10 Tagen hatten die Stuten erneut ovuliert und der sich anschließende Zyklus wurde als folgender Kontrollzyklus (Zyklus 3 bzw 5) definiert. D 0 D 0 D 6,5 OV Foll.-Ø bis Foll.-Ø 36 h coasting OV post ov mm mm efsh (2 x tgl.12,5 mg) 2500IE 1.KB 2.KB Embryonen- PGF 2α am 2.Behandlungstag hcg i.v. +12 h +36 h gewinnung Abb. 5: Darstellung des Behandlungsschemas der Superovulationszyklen (Zyklen 2 und 4) (D = Tag, Foll. = Follikel, Ov = Ovulation, tgl. = täglich, PGF 2α = Prostaglandin F 2α, hcg = humanes Choriongonadotropin, KB = künstliche Besamung, +12h / +36h = 12 / 36 Stunden nach hcg- Gabe, post ov. = post ovulationem) 39

50 Material und Methoden 3.3 Ultrasonographische Untersuchungen Die ultrasonographischen Untersuchungen wurden stets zwischen 8.00 und Uhr von derselben Untersucherin transrektal durchgeführt. Dazu verbrachte man die Tiere in einen Untersuchungsstand, der in einem ruhigen Raum mit gedämpftem Licht untergebracht war und fixierte sie mit einem Brustgurt. Die Tiere erhielten einige Minuten Beruhigungszeit, bevor mit der Untersuchung begonnen wurde. Die Geräteeinstellungen waren für alle Untersuchungen im jeweiligen Modus identisch Verwendete Geräte und Sonden Für die ultrasonografischen Untersuchungen wurde das Gerät Logig P5 (Fa. GE Healthcare, Solingen), das mit einer Endolinearsonde (4-10MHz) (I 739, Fa. GE Healthcare, Solingen) ausgestattet war, verwendet. Die zunächst im Gerät gespeicherten Daten wurden täglich auf DVDs (Verbatim, 4,7GB) und zur späteren Analyse auf einen Computer übertragen Untersuchungsschema In den Superovulationszyklen wurde mittels Farbdopplersonographie an den ersten beiden efsh -Behandlungstagen überprüft, ob sich bereits zu Behandlungsbeginn Hinweise auf die mögliche Induktion multipler Ovulationen erhalten lassen. In der vorliegenden Arbeit standen insbesondere die uterine, ovarielle und luteale Durchblutung im Vordergrund. Untersuchungen der follikulären, uterinen und ovariellen Durchblutung während der Dauer der efsh -Behandlung bis zur Ovulation waren Gegenstand eines weiteren zur Einreichung vorgesehenen Dissertationsvorhabens (Dissertation; Jeanette Probst, Tierärztliche Hochschule Hannover). Zur Prüfung auf Zusammenhänge zwischen der Durchblutung des inneren Genitales und dem Superovulationsergebnis bzw. der Anzahl gewonnener Embryonen wurden zusätzlich am Tag der Ovulation und den folgenden 5 Tagen farbdopplersonographische Untersuchungen beider Aa. uterinae, sowie beider 40

51 Material und Methoden Aa. ovaricae (s. Kap , S. 45 ff) durchgeführt. Außerdem wurde die luteale Durchblutung auf beiden Ovarien im Color-Angio-Mode festgehalten (Abb. 6). D0 D0 Ov efsh -Behandlungsbeginn Ov bei Foll.-Ø mm erster und zweiter D0 D1 D2 D3 D4 D5 post ov. efsh -Behandlungstag Abb. 6: Schematische Darstellung der ultrasonographischen Untersuchungstage (D = Tag, Ov = Ovulation, post ov. = post ovulationem, = kennzeichnet die Ultraschall-Untersuchungstage) In den Kontrollzyklen (1, 3 und 5) wurden die Stuten am Ovulationstag und den folgenden 5 Tagen ultrasonographisch untersucht, um die genitale Durchblutung in stimulierten und nicht-stimulierten Zyklen vergleichen zu können. Die Dauer dieser Ultraschall-Untersuchungen betrug im Durchschnitt jeweils 30 Minuten. Die den ersten beiden Behandlungstagen in den Superovulationszyklen entsprechende Zeitperiode wurde in den Kontrollzyklen nicht untersucht B-Mode-Sonographie Darstellung der Corpora lutea Zur Ermittlung der Anzahl (n) der CL wurden die Ovarien transrektal manuell fixiert und in verschiedenen Ebenen dargestellt (Abb. 7). 41

52 Material und Methoden Abb. 7: Ultrasonographisches B-Mode Bild (7,5 Mhz) eines Ovars mit 6 Gelbkörpern nach Auslösung einer Superovulation mittels efsh 24 Stunden post ovulationem Maßstab in cm Als Maß für die Größe der CL wurde deren maximale Querschnittsfläche (A CLgesamt (cm²)) herangezogen. Dazu wurde die maximale Fläche der einzelnen CL dargestellt und als B-Bild gespeichert. Die Gelbkörperfläche wurde mit Hilfe des Bildbearbeitungsprogrammes Pixelflux (Chameleon-Software, Leipzig) mittels Markierung der Region of Interest (ROI) bestimmt, die den Umriss des Funktionsgebildes einschloss Gefäßdurchmesser Unmittelbar vor jeder Blutflussmessung in den Aa. uterinae und Aa. ovaricae wurde an der jeweiligen Messlokalisation der Gefäßdurchmesser bestimmt. Der Cursor wurde dazu auf den hyperechogenen Linien positioniert, die bei senkrechtem Auftreffen der Ultraschallwellen am Übergang der Gefäßwand zum Gefäßlumen entstehen (Abb. 8). Es wurden zwei Messungen im Abstand von ca. 15 sec durchgefürt und aus diesen wurde ein Mittelwert gebildet. 42

53 Material und Methoden Abb. 8: Ultrasonographische B-Mode Bild (7,5 Mhz). Bestimmung des Durchmessers der rechten A. uterina zwei Tage post ovulationem. Die Kreuze begrenzen den maximalen Gefäßdurchmesser. Maßstab in cm Luteale Durchblutung Darstellung der lutealen Durchblutung im Color-Angio-Mode Die Messungen der Vaskularisation der CL wurden bei konstanten Geräteeinstellungen im Color-Angio-Mode durchgeführt. Das Ovar wurde dazu transrektal mit der Hand fixiert und zunächst in verschiedenen Ebenen untersucht. Sobald ein CL mit maximalem Farbausschlag und ohne Bewegungsartefakte ultrasonographisch sichtbar war, wurde das entsprechende Bild im Ultaschallgerät gespeichert. Damit es zu keiner Verfälschung der Ergebnisse durch die tangentiale Darstellung der verstärkt im Randbereich des CL vorherrschenden Durchblutung kam, wurden nur Schnittebenen ausgewählt, die sich im Bereich des maximalen Durchmessers des Funktionsgebildes befanden. 43

54 Material und Methoden Auswertung der lutealen Durchblutung im Color-Angio-Mode Die Bestimmung der lutealen Durchblutung erfolgte mit Hilfe der Software Pixelflux (Chameleon-Software, Leipzig). Für jede Untersuchung wurden zwei digitale Aufnahmen von Querschnitten des CL analysiert und daraus der Mittelwert der Perfusionsparameter errechnet. Zur Markierung des zu analysierenden Bereichs (Region of Interest = ROI) wurde das gesamte CL umfahren. Die das CL versorgenden Gefäße wurden dabei nicht miterfasst (Abb. 9). a) b) c) Abb. 9: a) Ultrasonographisches B-Mode Bild eines CL 5 Tage post ovulationem b) Farbdopplersonographisches Bild des CL aus Bild a) im Color-Angio- Mode c) Markierung des zu analysierenden Bereichs (ROI) unter Aussparung der das CL versorgenden Gefäße Maßstab in cm 44