Mikrovaskuläre und mikrolymphatische Dysfunktion nach lokalem Weichteiltrauma

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1 1 Aus dem Institut für Klinisch-Experimentelle Chirurgie der Universität des Saarlandes (Direktor: Professor Dr. med. M. D. Menger) Mikrovaskuläre und mikrolymphatische Dysfunktion nach lokalem Weichteiltrauma Eine intravitalmikroskopische Untersuchung am Rückenhautkammermodell der Maus als Dissertationsschrift zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Medizin an der Universität des Saarlandes vorgelegt von Michaela Amon 2007

2 2 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 5 2. Summary 7 3. Einleitung Lokale Auswirkungen der Weichteilschädigung Systemische Auswirkungen der Weichteilschädigung Beteiligung des mikrolymphatischen Systems Experimentelle Modelle zur Analyse des Weichteiltraumas Das Modell der chronischen Rückenhautkammer Ziel der Studie Material und Methoden Versuchstiere Rückenhautkammer Anästhesie und Implantation der Rückenhautkammer Anästhesie Implantation der Rückenhautkammer Ausschlusskriterien Weichteiltrauma Intravitale Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenzfarbstoffe Fluoreszein-Isothiozyanat Rhodamin 6G 22

3 Analyse der Mikrozirkulation Arterioläre und venuläre Durchmesser Arterioläre und venuläre Blutflussgeschwindigkeit Arteriolärer und venulärer volumetrischer Blutfluss Funktionelle Kapillardichte Arterioläre und venuläre Leukozytenadhärenz Makromolekulare Leakage Mikrolymphatisches Gefäßsystem Experimentelles Protokoll Auswertung der mikrovaskulären Parameter Statistik Ergebnisse Petechiale Einblutung Arterioläre Durchmesser Arterioläre Blutzellgeschwindigkeit Arteriolärer volumetrischer Blutfluss Venuläre Durchmesser Venuläre Blutzellgeschwindigkeit Venulärer volumetrischer Blutfluss Funktionelle Kapillardichte Arterioläre Leukozytenadhärenz Venuläre Leukozytenadhärenz Makromolekulare Leakage Schädigung von Lymphgefäßen Diskussion Diskussion des Modells Diskussion der Untersuchungsmethoden 47

4 Diskussion der Ergebnisse Mikrovaskuläre Dysfunktion Petechiale Einblutung Mikrolymphatisches Gefäßsystem Inflammatorische Reaktion Mikrovaskuläre Permeabilität Schlussfolgerung Verzeichnis der Abkürzungen Literaturverzeichnis Veröffentlichungen Lebenslauf 70

5 5 1. Zusammenfassung Das schwere Weichteiltrauma, das entweder als isolierte Verletzung oder aber in Kombination mit Frakturen oder Verletzungen der inneren Organe auftreten kann, stellt immer noch ein ernstzunehmendes Problem im chirurgischen Alltag dar. Lokale sowie auch systemische Komplikationen, die von verzögerter Wundheilung bis zum Multiorganversagen variieren können, führen zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Diese Komplikationen werden durch Beeinträchtigungen der Mikrozirkulation, durch Entzündungen aufgrund bakterieller Besiedlung der Wunde, aber auch durch abakterielle inflammatorische Reaktionen des traumatisierten Gewebes verursacht. Zusätzlich kann die Zerstörung von Lymphgefäßen eine verminderte Resorption und damit eine Verstärkung des durch das mechanische Trauma ausgelösten Gewebeödems bewirken. Bisher gibt es nur wenig Erkenntnisse zur Beeinträchtigung und insbesondere zum chronischen Remodelling der Mikrozirkulation und des mikrolymphatischen Gefäßsystems nach Weichteiltrauma. Dies liegt unter anderem daran, dass keine chronischen Modelle existieren, die eine repetitive Analyse der Mikrozirkulation sowie des lymphatischen Netzwerks in traumatisierten Gewebe erlauben. Desweiteren gibt es auch keinen Versuchsansatz, der die Untersuchung der Erholung betroffener Gefäße über einen längeren Zeitraum an identischen Tieren ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches Modell etabliert und der Einfluss des Schweregrades eines isolierten Weichteiltraumas auf das mikrovaskuläre und mikrolymphatische Gefäßsystem analysiert. Hierzu wurde in C57BL/6-Mäusen eine chronische Rückenhautkammer implantiert. Das Weichteilgewebe wurde einem leichten (180 J/m 2, n=6), moderaten (270 J/m 2, n=6) oder schweren mechanischen Trauma (450 J/m 2, n=6 und 540 J/m 2, n=6), ausgelöst durch ein weight drop device, ausgesetzt. Nicht-traumatisierte Tiere dienten als Kontrollen (sham; n=8). Mit Hilfe der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie mit den Fluoreszenzfarbstoffen FITC- Dextran und Rhodamin 6G wurde (i) die Zerstörung von Blut- und Lymphgefäßen, (ii) die Manifestation von petechialen Einblutungen, (iii) arterioläre und venuläre Konstriktion, (iv) das kapillare Perfusionsversagen, (v) arterioläre und venuläre Leukozyten-Adhärenz, und (vi) die interstitielle Ödembildung vor sowie 5min, 1h, 8h, 24h, 3d und 5d nach Trauma analysiert. Das leichte isolierte Weiteiltrauma führte im Vergleich zu Kontrolltieren zu keinerlei Veränderungen der mikrovaskulären Funktion und mikrolymphatischen Architektur. Eine

6 6 moderate Weichteilschädigung schädigte zwar die Lymphgefäße nicht, löste aber eine deutliche, allerdings vollständig reversible arterioläre Konstriktion und Einschränkung des Blutflusses, ein kapillares Perfusionsversagen und eine verstärkte arterioläre und venuläre Leukozyten-Endothelzell-Interaktion aus. Zusätzlich konnten vereinzelte Schädigungen von Blutgefäßen mit nachfolgender Hämatombildung beobachtet werden. Des weiteren fand sich eine Extravasation des Fluoreszenzmarker FITC-Dextran, was als Zeichen einer interstitiellen Ödembildung zu werten ist. Diese Veränderungen bildeten sich innerhalb von 24 Stunden nach Trauma vollständig zurück. Auch ein schweres Weichteiltrauma beeinflusste die lymphatischen Mikogefäße nicht. Es resultierte allerdings in einer massiven Hämatombildung, ausgeprägter arteriolärer Konstriktion und Hypoperfusion sowie einem nutritiven Perfusionsversagen, das mit einer deutlichen arteriolären und venulären Leukozytenrekrutierung und Ödembildung einher ging. Diese Veränderungen waren über den gesamten Versuchszeitraum von 5 Tagen nicht reversibel. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die Trauma-induzierten mikrozirkulatorischen Beeinträchtigungen weder von der mikrovaskulären Dysfunktion noch von der leukozytären Inflammation dominiert sind. Statt dessen entwickeln sich beide Pathologien nebeneinander, die Ischämie führt hierbei zur Aufrechterhaltung der Entzündungsreaktion und diese Inflammation verstärkt die initiale Ischämie. Dieser Teufelskreis könnte für die beeinträchtigte Heilung schwer geschädigten Weichteilgewebes verantwortlich sein, die im klinischen Alltag häufig zu beobachten ist.

7 7 2. Summary Severe soft tissue trauma, either as an isolated injury or combined with fractures or damage of organs, still represents a major problem in surgical practice. Local and systemic complications, ranging from delayed wound healing to multiple organ failure, result in an increase of morbidity and mortality of the affected patients. These complications are caused by restrictions of the deteriorated microcirculation, inflammation due to bacterial wound contaminations but also an inflammatory reaction of the traumatized tissue without involvement of microorganisms. Additionally, destruction of lymphatic vessels may result in an increase or a limited resolution of tissue edema. Up to now, however, there is little information on the consequences of mechanical damage on microvessels and microlymphatics after soft tissue trauma. This is mainly due to the fact that there are no experimental models which allow the repetitive analysis of the microcirculation and the lymphatic function in traumatized tissue. In particular, there is no approach to study remodelling of microvascular structures after soft tissue injury. With this work, such a model was established and the impact of the severity of local trauma on dysfunctions of microcirculation and microlymphatics was quantitatively evaluated. Therefore, a chronic dorsal skinfold chamber was implanted into C57BL/6 mice. The tissue under observation was subjected to mild (180 J/m 2, n=6), moderate (270 J/m 2, n=6) or severe trauma (450 J/m 2, n=6 and 540 J/m 2, n=6) by a weight drop device. Nontraumatized animals served as controls (sham; n=8). By means of intravital fluorescence microscopy using the fluorescent markers FITC-dextran and Rhodamine 6G, (i) blood and lymph microvessel rupture, (ii) hematoma formation, (iii) arteriolar and venular constriction, (iv) capillary perfusion failure, (v) arteriolar and venular leukocyte adhesion, and (vi) interstitial edema formation before and at 5min, 1h, 8h, 24h, 3d and 5d after trauma were evaluated. Mild trauma did not induce any alterations of microcirculatory function and microlymphatic architecture as compared to control animals. Moderate trauma did not affect microlymphatics, but provoked distinct, however reversible arteriolar constriction and reduction of blood flow, capillary perfusion failure, arteriolar and venular leukocyte-endothelial cell interactions and minor blood vessel ruptures with petechial bleedings. Additionally, extravasation of the high molecular weight fluorescent dye into the interstial space, indicating the formation of interstitial tissue edema, could be observed. These alterations completely recovered within the first 24hs after trauma. Severe trauma did also not affect the lymphatic

8 8 microvasculature, but resulted in massive hematoma formation, severe arteriolar constriction and hypoperfusion as well as nutritive perfusion failure, which was associated with marked arteriolar and venular leukocyte recruitment and edema formation. This did not recover to normal over the 5-day observation period. Thus, severe trauma of >450 J/m 2 provoked irreversible microcirculatory dysfunction in soft tissue, however, without affecting the integrity of lymphatic microvessels. Of interest, trauma-induced microcirculatory alterations are neither dominated solely by microcirculatory dysfunction nor by leukocytic inflammation. Instead, both pathologies develop in parallel. Ischemia results in a maintenance of the inflammatory response, and this inflammation aggravates the initial ischemic conditions of the traumatized tissue. This vicious circle may be responsible for the compromised healing of severely traumatized soft tissue, frequently observed in clinical practice.

9 9 3. Einleitung Lokale Auswirkungen der Weichteilschädigung Die Schädigung von Weichteilgewebe ist Bestandteil des Verletzungsmusters von mehrfach- bzw. schwer verletzen Patienten. So kommt es z. B. nach Frakturen regelmäßig zur Traumatisierung der umgebenden Muskulatur und bei höhergradigen Verletzungen auch zum Integritätsverlust der Haut. Obwohl die Auswirkungen dieser begleitenden Weichteilschädigung nur teilweise erforscht sind, besteht kein Zweifel daran, dass sie sich negativ auf den Verlauf der Erkrankung auswirken können (Abb. 1) (Pape, Giannoudis et al. 2005). Dies geschieht zum einen durch einen eventuell auftretenden Blutverlust nach Verletzung größerer Blutgefäße, was bis zur Entwicklung eines letalen hämorrhagischen Schocks führen kann, zum anderen werden durch die Weichteilschädigung eine Vielzahl an pro-inflammatorischen Mediatoren freigesetzt, die potenziell toxische Wirkungen entfalten können (Harris und Gelfand 1995). Diese Mediatoren, darunter TNF-α, Interleukin (IL)-1, IL-6 und IL-8, führen ihrerseits zu einer gesteigerten Aktivität verschiedener Enzyme, wie der Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase sowie der Cyclooxygenase, wobei insbesondere die induzierbaren Isoformen inos (Lee und Lee 2003) und COX-2 (Gierer, Mittlmeier et al. 2005) betroffen sind. Die hierbei vermehrt entstehenden Stoffwechselprodukte (Stickstoffmonoxid, Thromboxane, Prostaglandine, Platelet activating factor, Adhäsionsmoleküle) bewirken schlussendlich ein mikrovaskuläres Perfusionsversagen, eine nutritive Dysfunktion und primär eine lokale, später unter Umständen auch systemische Entzündungsreaktion (Menth-Chiari, Curl et al. 1998; Zhang, Bail et al. 2003). Die daraus resultierende Hypoxie des traumatisierten Gewebes führt zur lokalen Azidose. Daraus manifestiert sich eine endotheliale Dysfunktion mit gesteigerter Permeabilität der Gefäßwände. Durch den Austritt von Blutplasma aus dem Gefäßsystem kommt es zur Steigerung des interstitiellen Druckes, der wiederum die Hypoxie durch den gesteigerten Widerstand und die damit verminderte Perfusion verstärkt. Zusätzlich bewirkt die Hypoxie eine Steigerung der leukozytären Inflammation mit der Konsequenz der mechanischen Behinderung der Perfusion und einer weiteren Beeinträchtigung der endothelialen Funktion. Diese Entzündung wiederum ist damit für die Zunahme oder zumindest für die Aufrechterhaltung der bestehenden Hypoxie verantwortlich. Dieser Teufelskreis ist nur schwer zu durchbrechen und führt zu schwerwiegenden lokalen Komplikationen wie Verzögerungen oder Verhinderung der regulären Wundheilung, zur Bildung von Gewebsnekrosen und zur erhöhten Infektionsanfälligkeit des traumatisierten

10 10 Gewebes aufgrund der eingeschränkten Perfusion. Oft zwingen diese Komplikationen zu wiederholten chirurgischen Eingriffen. Ödem Hypoxie Blutfluss Weichteiltrauma Azidose Permeabilität Interstitieller Druck Abb. 1: Schematische Darstellung der lokalen Auswirkungen des mechanischen Traumas auf Weichteilgewebe Systemische Auswirkungen der Weichteilschädigung Bei schweren Verletzungen, aber auch bei vorerkrankten Patienten kann es zusätzlich zu den oben beschriebenen lokalen Reaktionen zur Freisetzung inflammatorischer Zytokine in den systemischen Kreislauf kommen. Die ubiquitäre Aktivierung von Monozyten, Thrombozyten sowie des Gerinnungssystems sind die Folge (Bone 1996). Kommt es nicht zu einer Kompensation dieser Reaktion (Abb. 2), wird aus der bis dahin kontrollierten Entzündungsreaktion ein systemic inflammatory response syndrome (SIRS), eine auf chirurgischen Intensivstationen gefürchtete Komplikation, die ein extrem aufwändiges und nicht selten invasives Monitoring der betroffenen Patienten mit den entsprechenden Konsequenzen (wie z.b. Katheterinfekte bei zentralen Zugängen, Endokarditis) erfordert. Prinzipiell verursachen die systemisch freigesetzten Mediatoren die selben pathologischen Veränderungen die auch lokal zu beobachten sind: es bilden sich Mikrothromben in

11 11 den Blutgefäßen, die zur Ischämie der Organe führen (Gando, Kameue et al. 1996). Die gesteigerte endotheliale Permeabilität resultiert in einer ausgeprägten Ödembildung, die die Perfusion zusätzlich beeinträchtigt (Pape, Remmers et al. 1994). Kommt es zur Reperfusion initial ischämischer Gewebeareale, so wird durch Sauerstoffradikale ein so genannter Reperfusionsschaden ausgelöst und durch die Schädigung der Zellen die Funktion der betroffenen Gewebe eingeschränkt (Cipolle, Pasquale et al. 1993). Dauert dieser Zustand an, entwickelt sich ein Multiorgan-Versagen, welches in 50-80% der Fälle zum Tod des Patienten führt. Um die systemische Inflammation zu verhindern bzw. zu minimieren, werden zusätzlich anti-inflammatorische Zytokine freigesetzt, unter anderem IL-4, IL-10, IL-13 und transforming growth factor (TGF) β. Im Rahmen dieses compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS) kann es allerdings zur endogenen Immunsuppression kommen und dadurch zum gehäuften Auftreten von Infektionen mit pathogenen Keimen bis hin zur Sepsis (Levin und Condit 1996). Existieren SIRS und CARS nebeneinander, so spricht man vom so genannten mixed antagonist response syndrome (MARS) (Davies und Hagen 1997). Die Gesamtheit der hier geschilderten systemischen Reaktionen und der daraus resultierenden Krankheitszeichen wird auch CHAOS genannt (cardiovascular shock, apoptosis, organ dysfunction, immune suppression) (Bone 1996; Davies und Hagen 1997) und bezeichnet die Folgen, die durch eine primär lokale Schädigung von Gewebe ausgelöst werden können. Kompensationsmechanismen Hypoxämie-Koagulopathie Gewebenekrose Freisetzung von Mediatoren Ödembildung Entzündung Ausschöpfung der Kompensationsmechanismen Erholung ARDS/ MODS Abb. 2: Schematische Darstellung der systemischen Auswirkungen des Weichteiltraumas.

12 Beteiligung des mikrolymphatischen Systems Bisher gibt es nur wenig Information über die in-vivo Reaktion mikrolymphatischer Gefäße auf eine Weichteilschädigung. Frühere Studien konnten zeigen, dass größere Lymphgefäße, also kontraktile Sammelgefäße, wahrscheinlich aufgrund ihrer schwach ausgebildeten Gefäßwand nur eine geringe Beständigkeit gegenüber mechanischer Beanspruchung aufweisen (Schmid-Schönbein 1990; Olszewski 2003). Demgegenüber belegt eine aktuelle Studie am Hinterbein der Maus das Fehlen von Verletzungen der die Arteria und Vena saphena superficialis begleitenden Lymphgefäße nach direktem Trauma (Szczesny, Veihelmann et al. 2001). Die Reaktion der lymphatischen Mikrozirkulation, die die initiale Drainage parenchymatösen Gewebes garantieren soll, ist bisher auf direkte mechanische Schädigung nicht untersucht. Da Mikrolymphgefäße nicht von einer Muskelschicht umgeben sind, sondern nur aus einer Endothelzell-Schicht auf einer Basalmembran aus Kollagen Typ IV bestehen, könnte sich ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischem Stress von der der Sammelgefäße unterscheiden. Die Fragilität der Lymphgefäße könnte somit zu ihrer Zerstörung und damit zur Störung des interstitiellen Flüssigkeitstransportes auch nach leichtem oder moderatem Trauma führen. Diese Tatsache könnte die fehlende Resorption eines interstitiellen Ödems trotz adäquater Heilung der Blutgefäße erklären Experimentelle Modelle zur Analyse des Weichteiltraumas Bisher existieren nur wenige experimentelle Modelle, die die direkte Visualisierung mikrozirkulatorischer Veränderungen nach mechanischem Trauma erlauben. So wurden, wie zuvor beschrieben, Untersuchungen am Hinterlauf von Nagern durchgeführt und die Mikrozirkulation mit Hilfe der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie beurteilt (Szczesny, Veihelmann et al. 2001; Gierer, Mittlmeier et al. 2005). Eine weitere Arbeitsgruppe etablierte ein Modell eines isolierten mechanischen Traumas am Cremastermuskel der Ratte (Lee, Natsui et al. 2005). Ein entscheidender Nachteil dieser Modelle ist jedoch die Limitierung auf einen bestimmten Untersuchungszeitpunkt. Repetitive Analysen sind hier nicht möglich, daher kann auch keine Aussage zur Reaktion individueller Gefäße über die Zeit, und schon gar nicht zum Remodelling getroffen werden. Eine weitere Einschränkung stellt die Notwendigkeit der zeitnahen chirurgischen Präparation vor der Analyse der Mikrozirkulation dar (Yamauchi, Vollmar et al. 1999). Durch

13 13 das chirurgische Trauma werden reaktive Einschränkungen der Perfusion verursacht, die von den Veränderungen aufgrund einer anders gearteten Traumatisierung des Gewebes nicht unterschieden werden können und so die Interpretation der erhobenen Daten erschweren. Die überwiegende Mehrheit der Studien, die sich mit Schädigungen der Mikrozirkulation in Weichteilgewebe beschäftigten, verwendeten hierzu das standardisierte Modell des Ischämie-Reperfusionsschadens (Menger, Pelikan et al. 1992; Nanobashvili, Neumayer et al. 2003), der jedoch mit der direkten mechanischen Schädigung sowohl der Blutgefäße wie auch des umgebenden Gewebes nicht vergleichbar ist Das Modell der chronischen Rückenhautkammer Das Modell der chronischen Rückenhautkammerpräparation an Nagern stellt ein etabliertes Modell für die Analyse der Mikrozirkulation im Rahmen verschiedenster physiologischer und pathophysiologischer Gegebenheiten dar. Dieses Modell wurde zuerst am Syrischen Goldhamster beschrieben (Endrich, Asaishi et al. 1980) und später so modifiziert, dass es auch an Mäusen anwendbar war (Lehr, Leunig et al. 1993). Es erlaubt die repetitive Untersuchung identischer Blutgefäße über einen Zeitraum von bis zu 14 Tagen. Dadurch lassen sich -im Gegensatz zur Verwendung von Akut-Modellen- neben den Veränderungen die durch das mechanische Trauma ausgelöst werden, auch die Restitution des Gewebes beurteilen. Dies war mit den bisher verwendeten Modellen, die meist auf einen Untersuchungszeitraum von nur wenigen Stunden beschränkt waren, nicht möglich (Schaser, Vollmar et al. 1999; Szczesny, Veihelmann et al. 2001; Schaser, Zhang et al. 2003). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, durch sub- bzw. intrakutane Injektion von Farbstoffen auch das mikrolymphatische System zu beurteilen (Schacht, Berens von Rautenfeld et al. 2004; Amon, Laschke et al. 2006)

14 14 4. Ziel der Studie Aktuelle Studien belegen, dass der mikrovaskulären Dysfunktion, bestehend aus nutritivem Perfusionsversagen und einer Leukozyten-Endothelzell-Interaktion-vermittelten Entzündungsreaktion, eine wesentliche Rolle bei der Entstehung der Weichteilschädigung zukommt (Menth-Chiari, Curl et al. 1998; Schaser, Vollmar et al. 1999; Szczesny, Veihelmann et al. 2001). Zunächst war es Ziel ein experimentelles Modell zu etablieren, welches die quantitative und repetitve Analyse der Mikrozirkulation in traumatisiertem Gewebe erlaubt. In diesem Modell sollten dann die differentielle Auswirkung verschiedener Traumastärken auf die Schädigung der Mikrozirkulation und des lymphatischen Systems sowie die Rückbildung bzw. das Remodelling der durch die mechanische Schädigung ausgelösten Veränderungen untersucht werden. Von besonderem Interesse waren hierbei, inwieweit das Perfusionsversagen oder die leukozytäre Inflammation die Manifestation der Erkrankung initiiert und dominiert, verschiedene Intensitäten der Energie-Einwirkung die Charakteristik der mikrovaskulären Schädigung beeinflussen diese Trauma-induzierte mikrovaskuläre Dysfunktion wiederum abhängig vom Schweregrad des Traumas- irreversibel ist oder einem Reparationsprozess unterliegt.

15 15 5. Material und Methoden Versuchstiere Für die Versuche wurden C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet (Abb. 3). Die Versuchstiere wurden im Institut für Klinisch-Experimentelle Chirurgie, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar (Tierschutzbeauftragte Frau Dr. med. vet. M. Frings) gezüchtet. Das Körpergewicht der Tiere betrug zu Versuchsbeginn 25-30g, was einem Alter von 8-12 Wochen entsprach. Durch die Verwendung relativ junger Tiere wurden Einschränkungen der Mikrozirkulation, die im Rahmen des Alterungsprozesses stattfinden (Vollmar, Morgenthaler et al. 2000), vermieden. Die Tiere wurden unter klimatisierten Bedingungen (Lufttemperatur: C, relative Luftfeuchtigkeit: ca. 70%; Tag/Nachtrhythmus: 12h/12h) in Einzelkäfigen gehalten. Während ihrer Haltung bekamen die Versuchstiere Standardlaborfutter (ALMA 0801, Botzenhardt KG, Kempten; I.E./kg Vitamin A, 500 I.E./kg Vitamin D3, 150 mg/kg Vitamin E, 50 mg/kg Vitamin C) und Wasser ad libitum. Abb. 3: C57BL/6-Maus im Alter von 10 Wochen.

16 Das Modell der Rückenhautkammer Das Modell der Rückenhautkammer stellt ein etabliertes Verfahren zur Analyse der Mikrozirkulation dar. Endrich et al. (Endrich, Asaishi et al. 1980) etablierten sie zunächst am Syrischen Goldhamster, bevor sie auf die Maus übertragen wurde (Lehr, Leunig et al. 1993). Das Modell ermöglicht Untersuchungen der physiologischen und pathologischen Mikrozirkulation wie z.b. im Rahmen der Wundheilung oder der Tumorangiogense von Haut und Muskulatur auch in genmanipulierten Mäusen. Durch das geringe Gewicht der formstabilen, gewebeverträglichen Titankonstruktion stellt die Rückenhautkammer für die Versuchstiere keine wesentliche Belastung dar, was sich in einem unveränderten Freß-, Putz- und Schlafverhalten äußert (Abb. 4). Bei sorgfältiger Kammerpräparation klingen die durch das chirurgische Trauma hervorgerufene initiale Entzündungsreaktion und mikrovaskuläre Perfusionsstörung innerhalb von 72 Stunden vollständig ab. Vorteile der Rückenhautkammer sind zum einen die Möglichkeit, identische Blutgefäße über einen Zeitraum von bis zu 14 Tagen wiederholt auch am wachen Tier zu untersuchen ohne dabei das Gewebe durch weitere chirurgische Eingriffe zu traumatisieren. Des weiteren ermöglicht das durch ein abnehmbares Deckglas verschlossene Beobachtungsfenster das Einbringen von Zellsuspensionen, Gewebefragmenten oder auch Fremdmaterialien sowie die lokale Applikation therapeutischer Substanzen. Aufgrund der geringen Dicke des Gewebes ist die intravitalmikroskopische Analyse sowohl mit Hilfe der Durchlichtmikroskopie als auch der Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie möglich. Abb. 4: Maus 24 Stunden nach Implantation der chronischen Rückenhautkammer.

17 Anästhesie und Implantation der Rückenhautkammer Anästhesie Zur Präparation der Rückenhautkammer, zur Traumatisierung des Gewebes sowie zur repetitiven Analyse der Mikrozirkulation wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (90 mg/kg KG; Ketavet, Upjohn GmbH, Heppenheim) und Xylazinhydrochlorid (25 mg/kg KG; Rompun, Bayer AG, Leverkusen) anästhesiert. Diese Medikamente gewährleisten eine schnell wirkende, ca. 20 Minuten anhaltende Anästhesie mit gleichzeitiger Analgesie und Muskelrelaxierung, ohne dass relevante Kreislauf- oder Atemdepressionen auftreten. Auch repetitive Anästhesien werden von den Tieren über einen längeren Zeitraum gut toleriert Präparation der Rückenhautkammer Die Rückenhautkammern (Abb. 5A) wurden in tiefer Narkose implantiert. Nach Rasur, Epilation (PilcaMed, Schwarzkopf, Deutschland) und Desinfektion (Softasept, Fa. Braun, Melsungen) der Rückenhaut (Abb. 5B) wurde in Bauchlage der Tiere unter Gegenlichtkontrolle mit Hilfe einer Kaltlichtquelle die Rückenhautfalte des Versuchstieres angehoben und mit Haltenähten aufgespannt. Es wurden zwei Inzisionen für die Schrauben des hinteren Kammerrahmens angefertigt und diese mit Einzelknopfnähten fixiert. Anschließend wurde, ebenfalls unter Gegenlichtkontrolle, der Bereich des späteren Beobachtungsfensters kranial des Insertionsgebiets des Retractormuskels und kaudal der entlang der Schulterbasis verlaufenden Versorgungsgefäße markiert (Abb. 5C). Nach Umlagerung der Tiere wurde mit Hilfe mikrochirurgischer Instrumente (Fa. Aeskulap) sowie eines Operationsmikroskopes (Leica Microsystems, Bensheim) die Hautschicht innerhalb des Beobachtungsfensters bis auf den Panniculus carnosus der Gegenseite exzidiert. Die Wunde wurde mit 2 ml isotoner Kochsalzlösung (Fa. Braun, Melsungen) gespült und anschließend der zweite Kammerrahmen aufgebracht und fixiert. Eine Kompression der kutanen Blutgefäße konnte durch Schraubenmuttern verhindert werden, die als Abstandshalter (400µm) dienten. Zur Vermeidung von Verschmutzungen und Austrocknung des Gewebes wurde ein Deckglas auf die vordere Kammerhälfte aufgebracht und mit einem Kupfersprengring fixiert (Abb. 5D). Der gesamte Eingriff dautere etwa 20 Minuten, die Tiere benötigten daher keine zusätzliche Narkose und erholten sich nach der Kammerpräparation schnell. Aufgrund des geringen Gewichtes von ca. 3,5 g stellt die Rückenhautkammer für die Versuchstiere nur eine geringe Belastung dar, die keine postoperative Analgesie erfordert. Die Tiere zeigten nach der

18 18 Operation ein normales Verhalten. Insbesondere kam es nicht zu Veränderungen des Schlaf- Wach-Rhythmus oder des Putz- und Fressverhaltens. A B C D Abb. 5: Präparation der Rückenhautkammer. (A) Kammer bestehend aus 2 Titanrahmen fixiert mit Schrauben und Muttern; Deckglas im Beobachtungsfenster mit Kupfersprengring fixiert. (B) Maus nach Rasur und Enthaarung des Präparationsgebiets. (C) Präparation nach Fixierung der ersten Kammerhälfte und Markierung des Beobachtungsfensters. (D) Maus mit komplett montierter Rückenhautkammer Ausschlusskriterien Vor Beginn der ersten intravitalmikroskopischen Analyse wurden sowohl der Allgemeinzustand der Versuchstiere wie auch die Qualität der Kammerpräparation beurteilt. Ausschlusskriterien waren ein schlechter Allgemeinzustand der Tiere (Gewichtsverlust, Exsiccose, Lethargie), Einblutungen, Entzündungszeichen oder Ödembildung des Gewebes bzw. eine Dilatation mit Kinking von Kammergefäßen.

19 Weichteiltrauma Drei Tage nach Präparation der Rückenhautkammern wurden die Tiere erneut anästhesiert und auf einer Plexiglasbühne fixiert. Das Deckglas wurde entfernt und durch ein Metallplättchen der selben Größe ersetzt. Anschließend wurden die Tiere umgelagert und die Metallabdeckung auf einem entsprechend geformten Widerlager, bestehend aus einem Edelstahlzylinder, genau horizontal fixiert. Eine Plexiglasröhre mit einem Innendurchmesser von 12,8 mm wurde auf den rückwärtigen Titanrahmen der Kammer aufgesetzt (Abb. 6B). Diese Röhre diente als Leitschiene für Edelstahlzylinder mit verschiedenen Gewichten, die aus einer Höhe von 14,5 cm auf das Rückenhautgewebe fallen gelassen wurden. Verwendet wurden Zylinder mit einem Gewicht von 10g, 15g, 25g und 30g, was einer beim Aufprall freigesetzten Energie von 180 J/m 2, 270 J/m 2, 450 J/m 2 und 540 J/m 2 entspricht. Dieses Vorgehen garantiert eine gleichmäßige Verteilung der freigesetzten Energie und damit eine homogene und standardisierte Traumatisierung des Weichteilgewebes (Abb. 7). A B Abb. 6: (A) Makroskopische Aufnahme einer Rückenhautkammer zwei Tage nach Präparation. (B) Rückenhautkammer mit aufgesetzter Plexiglasröhre als Leitschiene für die Edelstahlzylinder, mit denen das Weichteiltrauma induziert wird.

20 20 A B C D * * Abb. 7: (A) Makroskopische Aufnahme einer Rückenhautkammer vor (A) sowie nach moderatem (B) und schweren Trauma (C+D). Nach moderatem Trauma (15g, B) erkennt man nur wenige, kleine Hämatome im Beobachtungsfenster der Kammer. Nach schwerem Trauma (25g, C+D) sind diese Hämatome häufiger, konfluieren und nehmen so eine größere Fläche ein. Bei höherer Vergößerung (40x, D) erkennt man, dass die Hämatome sowohl durch Schädigungen von größeren Gefäßen (Sterne) sowie aus petechialen Einblutungen im Bereich der Kapillaren besteht (Pfeile) Intravitale Fluoreszenzmikroskopie Die intravitalmikroskopische Analyse der Mikrozirkulation wird durch die Kontrastierung einzelner Blutbestandteile mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht. Dazu wurden die Versuchstiere auf einer Plexiglasplatte fixiert und der entsprechende Farbstoff intravenös bzw. intrakutan injiziert. Die Darstellung der Blut- und Lymphgefäße erfolgte mit Hilfe eines modifizierten Othoplan-Mikroskops (Abb. 8; Fa. Leitz GmbH, Wetzlar) mit einer 100 Watt HBO-Quecksilberdampf-Lampe als Lichtquelle (HBO 100W OFR, Osram, Augsburg; Gehäuse 100Z, Fa. Leitz GmbH, Wetzlar), die an ein Ploemo-Pak-System (Ploemopak 2, Fa. Leitz GmbH, Wetzlar) zur Auflichtbeleuchtung angeschlossen war. In den Strahlengang des Mikroskops wurden verschiedene Filter eingebracht, die die Quantifizierung mikrozirku-

21 21 latorischer Parameter nach Injektion von Fluoreszein-Isothiozyanat-Dextran und Rhodamin 6G erlaubte. Die mikroskopischen Bilder wurden von einer hochempfindlichen CCD (charge coupled device)-videokamera (FK 6990; Lichtempfindlichkeit 10-2 Lux; Prospective Measurements, San Diego, California, USA) aufgenommen und über einen Bildschirm (PVM 1371-QM, Sony Corp., Tokio, Japan) an einen S-VHS-Videorecorder mit einer Aufzeichnungsrate von 50 Bildern pro Sekunde (Panasonic AG-7350, Matsushita Electric Corp., Japan) weitergeleitet. Ein zwischen Videokamera und Bildschirm geschalteter Video- Zeitgenerator (VTG 33, FOR-A Company Ltd., Tokyo, Japan) diente zur gleichzeitigen Einblendung und Aufnahme der Zeit in Minuten und Sekunden sowie Zehntel und Hundertstel Sekunden. Die quantitative Analyse erfolgte anschließend anhand der Aufnahmen an einer speziellen Computereinheit auf deren Aufbau später genauer eingegangen wird (s ). CCD-Kamera Timer Monitor S-VHS- Rekorder Abb. 8: Schematischer Aufbau des Arbeitsplatzes Intravitale Fluoreszenzmikroskopie mit der auf einer Platte fixierten Maus mit Rückenhautkammer, Objektivrevolver, CCD-Kamera, Timer und Aufnahmeeinheit bestehend aus einem Monitor und S-VHS-Rekorder.

22 Fluoreszenzfarbstoffe Fluoreszein-Isothiozyanat Zur Kontrastierung der Blut- und Lymphgefäße (Abb. 9A-C) im Rahmen der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie wurde Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) verwendet, das an hochmolekulares Dextran gekoppelt war, um eine Extravasation unter physiologischen Bedingungen zu verhindern. Zum Einsatz kam eine 5%-ige Lösung (in NaCl) des Fluoreszenzfarbstoffes (Molekulargewicht , Exzitationsmaximum 490nm; Fluka 46946). Der Farbstoff, der über Leber und Nieren metabolisiert und ausgeschieden wird, wurde entweder intravenös über den retrobulbären Venenplexus zur Analyse der Mikrozirkulation (0,05 ml/tier) oder interstitiell (0,2 ml/tier verteilt über 4 Injektionsstellen am Rand des Beobachtungsfensters) zur Analyse des mikrolymphatischen Gefäßsystems verabreicht Rhodamin 6G Zur in-vivo-kontrastierung der Leukozyten (Abb. 9D) wurde Rhodamin 6G verwendet. Dieser Fluoreszenzfarbstoff bindet an Cytochrom C in Leukozyten und Thrombozyten. Das Exzitationsmaximum liegt bei 530 nm, die Emmissionswellenlänge bei 590 nm. Auch dieser Farbstoff wurde in isotoner Kochsalzlösung gelöst (1%-ige Lösung), anschließend filtriert, um Farbkristalle aus der Lösung zu entfernen, und bis zum Gebrauch bei einer Temperatur von 20 C lichtgeschützt gelagert. Zur Analyse der leukozytären Entzündungsreaktion des Gewebes wurde den Versuchstieren 0,1 ml dieser Lösung intravenös injiziert.

23 23 A B C D Abb. 9: Intravitalmikroskopische Aufnahmen einer chronischen Rückenhautkammer. (A) Arteriole (Pfeil) und Venole (Doppelpfeil) nach Kontrastierung mit FITC-Dextran (120x). (B) Kapillaren nach Kontrastierung mit FITC-Dextran (120x). Charakteristisch ist hier die nahezu parallele Anordnung der Kapillaren im Paniculus carnosus. (C) Lymphgefäß (Pfeil) nach intrakutaner Applikation von FITC-Dextran (60x). Die Blutgefäße sind in dieser Abbildung nicht kontrastiert und erscheinen daher dunkel (Doppelpfeil). (D) Venole nach Injektion von Rhodamin 6G zur Färbung von Leukozyten (120x). Erkennbar sind hier an der Gefäßwand adhärente Leukozyten (Pfeile) Analyse der Mikrozirkulation Arterioläre und venuläre Durchmesser Um die Veränderungen der Durchmesser im Verlauf der Versuche zu analysieren, wurden in jedem Beobachtungsfenster zwei arterio-venöse Bündel aufgenommen. Die Durchmesser der Gefäße konnten durch die Markierung der Gefäßränder aufgrund der Fluoreszenzunterschiede nach Injektion von FITC-Dextran bestimmt werden. Analysiert wurden daher lediglich die Durchmesser perfundierter Gefäße. Die Ergebnisse sind zur besseren Vergleichbarkeit als Prozent des Ausgangswertes angegeben.

24 Arterioläre und venuläre Blutzellgeschwindigkeit Die Blutzellgeschwindigkeit wurde nach intravenöser Markierung des Blutplasmas mit FITC-Dextran mit Hilfe der Line-Shift-Methode (CapImage, Fa. Zeintl, Heidelberg) quantifiziert. Hierbei werden über einen definierten Zeitraum von 10 Sekunden entlang einer Linie die im Zentrum des zu analysierenden Gefäßes liegt die Helligkeitswerte aufgezeichnet. Es ergeben sich -abhängig von der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes- Linien verschiedener Helligkeit. Aus der Steigung dieser Linien errechnet sich die Flussgeschwindigkeit der Erythrozyten bzw. des Blutplasmas Arteriolärer und venulärer volumetrischer Blutfluss Aus Durchmesser und Blutzellgeschwindigkeit wurde der Blutfluss für die perfundierten Gefäße errechnet nach der Formel BF = v * π* r 2 wobei v der erythrozytären Blutzellgeschwindigkeit und r dem Radius des Gefäßes entspricht (Gross und Aroesty 1972). Für diese Berechnungen wurde eine zylindrische Gefäßgeometrie zugrunde gelegt Funktionelle Kapillardichte Zur Analyse der funktionellen Kapillardichte wurden randomisiert 5 Gesichtsfelder pro Kammer ausgewählt und mit dem 20x Objektiv über ca. 20 Sekunden im entsprechenden Filter aufgenommen. Zur Quantifizierung wurden alle Kapillaren markiert, die zum Zeitpunkt der Mikroskopie perfundiert waren, d.h. in denen während der 20-sekündigen Aufnahme Erythrozytenfluss zu beobachten war (Abb. 10). Die Gesamtlänge der markierten Kapillaren pro Fläche des Gesichtsfeldes ergibt die funktionelle Kapillardichte in cm/cm 2. Um den Vergleich zwischen den Gruppen zu erleichtern wird dieser Parameter in % des Ausgangswertes, erhoben vor Induktion des Weichteiltraumas, angegeben.

25 25 Abb. 10: Analyse der funktionellen Kapillardichte. Hierbei werden anhand intravitalmikroskopischer Aufnahmen, die mit einer hohen Vergrößerung (120x) angefertigt wurden, alle perfundierten Kapillaren, d.h. Kapillaren in denen eine Bewegung der negativ kontrastierten Erythrozyten zu beobachten ist, manuell markiert (blaue Linien). CapImage berechnet anhand der Länge der markierten Kapillaren sowie der Fläche des aufgenommenen Bildschirmausschnitts die funktionelle Kapillardichte in cm/cm Arterioläre und venuläre Leukozytenadhärenz Die auszuwertenden Gefäße wurden mit dem 20x Objektiv für 30 Sekunden mikroskopiert und auf Videoband aufgenommen. Innerhalb eines 100µm langen, annährend geraden Abschnittes wurde die Anzahl Rhodamin-gefärbter Leukozyten analysiert, die über den gesamten Zeitraum keinerlei Bewegung erkennen ließen. Aus dieser Anzahl und dem Gefäßdurchmesser wurde die Anzahl permanent adhärenter Leukozyten pro mm 2 Endotheloberfläche nach der Formel L=n*10 6 /(d*π*l) berechnet. Dabei ist n die Anzahl adhärenter Leukozyten, d der Durchmesser des Gefäßes und l die Länge des analysierten Gefäßabschnittes (100µm) Makromolekulare Permeabilität Zur Bestimmung der makromolekularen Leakage als Zeichen für die Gefäßpermeabilität und damit der Endothelschädigung wurde die Extravasation des hochmolekularen Fluoreszenzmarkers FITC-Dextran in das die Gefäße umgebende Gewebe bestimmt.

26 26 Hierzu wurde innerhalb einer postkapillaren Venole sowie in einem angrenzenden Gewebeareal die Fluoreszenzintensität bestimmt. Aus dem Quotienten QF=I a /I i ergibt sich die Permeabilität der Gefäßwand. Hierbei steht I a für die extraluminale, I i für die intravasale Fluoreszenzintensität. Auch dieser Parameter wird als Prozent des Ausgangswertes angegeben Analyse der Lymphgefäße Durch die intrakutane Injektion von insgesamt 200µl FITC-Dextran verteilt auf 4 definierten Stellen der intakten Haut an der Rückseite der Kammerpräparation war die Darstellung der initialen Lymphgefäße der Rückenhaut möglich. Anhand der so angefertigten Aufnahmen wurde die Integrität der mikrolymphatischen Gefäße nach direkter mechanischer Schädigung analysiert Experimentelles Protokoll Drei Tage nach Präparation der Rückenhautkammer erfolgte an anästhesierten Tieren die erste intravitalmikroskopische Analyse zur Kontrolle physiologischer Bedingungen. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, da aus früheren Studien bekannt war, dass die durch das chirurgische Trauma ausgelösten Veränderungen wie Mikrozirkulationsstörungen und Entzündung des Gewebes nach 72 Stunden abgeklungen sind. Nach dieser basalen Analyse wurde das Weichteiltrauma entsprechend der Versuchsgruppe, durch die mechanische Schädigung mit einem Edelstahlzylinder induziert, der aus einer Höhe von 14,5cm auf das Gewebe im Beobachtungsfenster fallen gelassen wurde. Die intravitalmikroskopischen Untersuchungen wurden wie zuvor beschrieben nach 5 Minuten sowie nach 1 Stunde, 8 Stunden, 24 Stunden und 3 und 5 Tagen wiederholt. Die Tiere wurden randomisiert einer der folgenden Versuchsgruppen, benannt nach dem Gewicht des entsprechenden Edelstahlzylinders, zugeordnet: 1. 0g (0 J/m 2, sham, n=8) 2. 10g (180 J/m 2, n=6) 3. 15g (270 J/m 2, n=6) 4. 25g (450 J/m 2, n=6)

27 g (540 J/m 2, n=6) 5.9. Auswertung der intravitalmikroskopischen Aufnahmen Die quantitative Analyse der Mikrozirkulation erfolgte nach Versuchsende anhand der erstellten Videoaufnahmen an einer Computer-gestützten Einheit die einen S-VHS- Videorekorder (AG-7350, Panasonic, Ratingen) sowie einen nachgeschalteten Monitor (36 cm Bildschirmdiagonale; PVM 2130 QM, Sony, München) beinhaltete. Die Quantifizierung der Parameter wurde mit einer speziell entwickelten Software durchgeführt (CapImage Version 5.03, Zeintel Software Engineering, Heidelberg) Statistische Auswertung Die primäre Datenerfassung erfolgte während der Auswertung der Videobänder auf Erhebungsbögen. Die so gewonnenen Daten wurden in einem zweiten Schritt in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Excel, Microsoft Corporation, Unterschleißheim) zur elektronischen Datenverarbeitung eingegeben. Für die statistische Auswertung und graphische Darstellung wurden die Programme SigmaStat und SigmaPlot (Jandel Corporation, San Rafael, California, USA) verwendet. Bei normal verteilten Daten kam zum Vergleich zwischen den Gruppen die One Way Analysis of Variance (ANOVA) zur Anwendung. Als post-hoc-test wurde der Student- Newman-Keuls-Test verwendet. Als Signifikanzniveau wurde ein p-wert von <0,05 festgelegt.

28 28 6. Ergebnisse 6.1. Petechiale Einblutung Die mechanische Traumatisierung bewirkte, abhängig von der freigesetzten Energie beim Auftreffen des Stahlzylinders, eine Schädigung der Blutgefäße und dadurch Einblutungen in das umgebende Gewebe. Hierbei konnte nicht immer zuverlässig festgestellt werden, ob es sich um eine Verletzung der arteriolären oder venulären Gefäße handelte, da das entstandene Hämatom die intravitalmikroskopische Analyse zu Beginn verhinderte. Erst nach der teilweisen Resorption des extravasierten Blutes konnten die Gefäße wieder dargestellt werden (Abb. 11). A B * * * Abb. 11: Intravitalmikroskopische Aufnahmen (120x) einer Kammer nach schwerem Trauma (30g). Erkennbar sind (A) eine Kontinuitätsunterbrechung der Venole mit Extravasation von Blut (Doppelpfeil) sowie eine Konstriktion (Pfeil) und Flussunterbrechung (Stern) der begleitenden Arteriole direkt nach Trauma. (B) Am 3. Tag nach Trauma sind die Einblutungen (Sterne) teilweise resorbiert und die Gefäße sind wieder intravitalmikroskopisch darstellbar. Die quantitative Analyse der petechialen Einblutungen ergab nach leichtem Trauma (10g) keine wesentliche Hämatombildung über den gesamten Versuchszeitraum von 5 Tagen (Abb. 12 A). Mit zunehmender Traumastärke nahm auch die Fläche des sich bildenden Hämatoms zu, sie betrug nach schwerstem Trauma (30g; Abb. 12 D) ca. 18mm 2 und damit ungefähr 20% der Fläche des gesamten Beobachtungsfensters. Die maximale Ausprägung der Einblutung konnte 8 Stunden nach Trauma beobachtet werden, anschließend kam es in allen Versuchsgruppen zu einer teilweisen Resorption des extravasierten Blutes.

29 29 Hämatom (mm 2 ) A Sham 10g B * * Sham 15g 0 Hämatom (mm 2 ) C Sham 25g D Sham 30g 0 Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d. Abb. 12: Quantitative Analyse der Hämatombildung im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; A-D; Kreis; n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (A; Quadrat; n=6), 15g (B; Dreieck; n=6), 25g (C; Raute; n=6) und 30g (D; Dreieck; n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05; p<0.01 vs Sham Arterioläre Durchmesser Auch die quantitative Analyse der arteriolären Durchmesser zeigte nach leichter Weichteiltraumatisierung (10g) lediglich eine minimale Veränderung im Vergleich zu den nicht-traumatisierten Kontrolltieren (Abb. 14 A). Nach einer Weichteilschädigung mit 15g (Abb. 14 B) bzw. 25g (Abb. 14 C) konnte eine initiale, deutlich ausgeprägte Vasokonstriktion beobachtet werden (72% bzw. 59% vom Ausganswert; s. auch Abb. 13 A und B), die jedoch innerhalb von 8 Stunden nahezu vollständig reversibel war und am Versuchsende nach 5 Tagen die Ausganswerte erreichte (88% bzw. 106%). Demgegenüber führte das schwere Weichteiltrauma (30g; Abb. 14 D) zu einer deutlich stärkeren, irreversiblen Konstriktion der versorgenden Gefäße (53±8% vom Ausgangswert). In dieser Versuchsgruppe kam es ledig-

30 30 lich zu einer partiellen Erholung der Gefäße, 5 Tage nach Trauma betrugen die Durchmesser lediglich ca. 75% der Ausgangswerte. A B Abb. 13: Intravitalmikroskopische Aufnahme (120x) einer Arteriole vor (A) sowie nach schwerem Trauma (25g; B). Man erkennt eine ausgeprägte Vasokonstriktion und eine Reduktion des Blutflusses. Durchmesser (%) A Sham 10g B * Sham 15g * Durchmesser (%) C Sham 25g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d D Sham 30g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Abb. 14: Quantitative Analyse der arteriolären Durchmesser in Prozent des Ausgangswertes (Base) im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; A-D; Kreis;

31 31 n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (A; Quadrat; n=6), 15g (B; Dreieck; n=6), 25g (C; Raute; n=6) und 30g (D; Dreieck; n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05; p<0.01 vs Sham Arterioläre Blutzellgeschwindigkeit Die Analyse der arteriolären Blutzellgeschwindigkeit (Abb. 15) erfolgte an identischen Gefäßabschnitten wie die Analyse der Durchmesser. Wie zu erwarten war, führte die mechanische Schädigung des Gewebes zu einer deutlichen Reduktion der Blutzellgeschwindigkeit, die von der Stärke des Traumas abhängig war (10g (A): 81±8%; 15g (B): 59±16%; 25g (C): 15±9%; 30g (D): 21±9% vom Ausgangswert). Während jedoch diese Einschränkungen in den ersten drei Gruppen über den Versuchszeitraum von 5 Tagen vollständig reversibel waren (10g: 84±8%; 15g: 106±15%; 25g: 111±15%; Tag 5 nach Trauma), zeigte auch die Quantifizierung der Blutzellgeschwindigkeit parallel zu den Veränderungen der Gefäßdurchmesser eine irreversible Beeinträchtigung nach schwerstem Trauma (30g: 77±12% vom Ausgangswert; Tag 5). Auffallend war, dass nicht nur die initiale Schädigung von der Traumastärke abhängig war, sondern auch die Zeitspanne, die bis zur vollständigen Wiederherstellung der Blutzellgeschwindigkeit benötigt wurde (15g: 24 Stunden; 25g: 3 Tage).

32 A B RBV (%) Sham 10g Sham 15g C D RBV (%) * 20 0 Sham 25g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Sham 30g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Abb. 15: Quantitative Analyse der arteriolären Blutzellgeschwindigkeit in Prozent des Ausgangswertes (Base) im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; A- D; Kreis; n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (A; Quadrat; n=6), 15g (B; Dreieck; n=6), 25g (C; Raute; n=6) und 30g (D; Dreieck; n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05; p<0.01 vs Sham Arteriolärer volumetrischer Blutfluss Aus arteriolärem Durchmesser und Blutzellgeschwindigkeit wurde der arterioläre volumetrische Blutfluss errechnet (Abb. 16). Sowohl Kontrolltiere wie auch Tiere, die einem leichten Weichteiltrauma (Abb. 16A) ausgesetzt waren, zeigten keine signifikanten Einschränkungen der Perfusion. Nach moderatem Trauma (Abb. 16B) kam es demgegenüber zu einer vorübergehenden 50%-igen Reduktion des Blutflusses; 24 Stunden nach dem Insult wurden die Ausgangswerte allerdings wieder erreicht. Eine schwere Weichteilschädigung mit Gewichten von 25g (Abb. 16C) bzw. 30g (Abb. 16D) resultierte in einer ausgeprägten arteriolären Hypoperfusion, die initial nur noch 10% bzw. 15% der ursprünglichen Werte betrug. Parallel zum Verlauf der Durchmesser und der Blutzellgeschwindigkeit waren die hier beobachteten Veränderungen in Tieren mit schwerstem Weichteiltrauma (30g) irreversibel, am

33 33 Ende der Versuche 5 Tage nach Trauma erreichte die Perfusion lediglich 44 ± 9% der Ausgangswerte A B 140 VBF (%) * Sham 10g * * Sham 15g C D 140 VBF (%) Sham 25g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Sham 30g Base 5min 1h 8h 24h 3d 5d Abb. 16: Quantitative Analyse des arteriolären volumetrischen Blutflusses in Prozent des Ausgangswertes (Base) im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; A-D; Kreis; n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (A; Quadrat; n=6), 15g (B; Dreieck; n=6), 25g (C; Raute; n=6) und 30g (D; Dreieck; n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05; p<0.01 vs Sham.

34 Venuläre Durchmesser Im Gegensatz zu arteriolären Gefäßen, die nach Trauma eine ausgeprägte Konstriktion erkennen ließen, konnte eine solche Reaktion bei der Analyse der venulären Gefäße (Tabelle 1) nicht festgestellt werden. Selbst nach schwerster Weichteilschädigung, die zu einem beinahe vollständigen Stillstand der arteriolären Perfusion führte, betrugen die Durchmesser der postkapillaren Venolen noch 91 ± 5% der ursprünglichen Werte. Sham 10g 15g 25g 30g Base 100 ± ± ± ± ± 0 5min 99 ± ± ± 3 91 ± 4* 99 ± 5 1h 98 ± 1 97 ± 2 96 ± 3 96 ± 4 91 ± 5 8h 100 ± ± ± 6 97 ± 6 93 ± 5 24h 98 ± ± ± ± ± 3 3d 86 ± 9 92 ± ± ± 9 92 ± 4 5d 111 ± ± ± ± ± 8 Tabelle 1: Quantitative Analyse der venulären Durchmesser in Prozent des Ausgangswertes (Base) im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (n=6), 15g (n=6), 25g (n=6) und 30g (n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05 vs Sham.

35 Venuläre Blutzellgeschwindigkeit Demgegenüber ergab die Analyse der venulären Blutzellgeschwindigkeit (Tabelle 2) eine Reduktion, die abhängig vom Schweregrad des Weichteiltraumas war. Während ein geringes Trauma (10g bzw. 15g) nur eine gering ausgeprägte Verminderung der Blutzellgeschwindigkeit bewirkte, zeigte sich nach schwerem Trauma von 25g bzw. 30g eine signifikante Reduktion auf 34 ± 9% und 44 ± 15% der Ausgangswerte. Im Gegensatz zu den Veränderungen der arteriolären Perfusion waren jedoch die der venulären Perfusion auch nach schwerstem Trauma vollständig reversibel. Am Versuchsende nach 5 Tagen betrug die Blutzellgeschwindigkeit wieder 91 ± 13% bzw. 106 ± 9% der Ausgangswerte. sham 10g 15g 25g 30g Base 100 ± ± ± ± ± 0 5min 96 ± 4 98 ± ± ± 9 44 ± 15 1h 103 ± ± ± ± ± 11* 8h 94 ± 6 75 ± 9 78 ± ± ± 7 24h 108 ± 4 83 ± 9* 122 ± ± ± 10* 3d 115 ± ± ± ± 8* 91 ± 10 5d 106 ± ± ± ± ± 9 Tabelle 2: Quantitative Analyse der venulären Blutzellgeschwindigkeit in Prozent des Ausgangswertes (Base) im Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer in nicht-traumatisierten Tieren (Sham; n=8) und Tieren, die einem mechanischen Trauma von 10g (n=6), 15g (n=6), 25g (n=6) und 30g (n=6) ausgesetzt wurden. Mittelwert ± SEM; *p<0.05; p<0.01 vs Sham.