Was kann die PCR für. tun?

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Rüdiger Zimmermann
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1 Was kann die PCR für f die Futtermittel-Analytik tun? Nele Matthes,

2 Die GVO-Problematik gentechnisch veränderte Pflanzen: Anbau weltweit Soja Mais Reis Raps Tomaten Papaya Baumwolle Zuckerrübe Weizen Kürbis Melone Chicoree Tabak Sonnenblumen Nelken Luzerne Leinen / Flachs Linsen Pflaumen Kartoffeln Mio. ha

Die GVO-Problematik Fläche Fläche GVO Anteil GVO Soja 90 69 77 % Mais

3 Die GVO-Problematik Fläche Fläche GVO Anteil GVO Soja % Mais % Baumwolle % Raps 31 6,4 21 % Zuckerrübe 4,4 0,5 9 %

4 Gesetzliche Regelungen 1. Lebens- und Futtermittel - zugelassene GVO: Deklarationspflicht bei Anteil GVO am Gesamtgehalt > 0,9%, wenn zufällig oder technisch unvermeidbar - nicht zugelassene GVO, Null-Toleranz, bei Nachweis Produkte nicht verkehrsfähig - Zulassung für a) Import und Verarbeitung bei Futter- und/oder Lebensmitteln b) Freisetzung und Anbau (derzeit nur Amflora, Anbau im MÜR) - Fragestellung: GVO in Pet Food bei amerikanischen Produkten oft GVO 2. Saatgut - sämtliche GVO müssen deklariert sein, bei Nichtdeklaration Null-Toleranz - bisher keine Anbau-Zulassungen in der EU außer MON810 (teilweise) und Amflora

Herbizidtoleranz Schädlingstoxin zusätzliche Stoffwechselgene (z.b. Golden Rice) T-nos Dürretoleranzgene.

5 Pflanzen-GVO - Konstruktion DNA- Promotor zusätzliche Eigenschaft(en) Terminator -DNA p35s CAMV pfmv pnos Herbizidtoleranz Schädlingstoxin zusätzliche Stoffwechselgene (z.b. Golden Rice) T-nos Dürretoleranzgene... eventuell Selektionsmarker (Antibiotika-Resistenzgene...)

6 Herkunft der Elemente - Beispiele Bacillus thuringiensis (Bodenbakterium) - produziert das Bt-Toxin (Cry1AB, Cry1A...) - giftig für die Larven von Schmetterlingen, Käfern und Zweiflüglern - vor allem in Mais: Bt11, Bt176, MON810, NK und Baumwolle Agrobakterium tumefaciens CP4 (Bodenbakterium) - produziert Protein (5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)) zum Abbau von Glyphosate - z.b. RR-Soja (MON 89788, GTS ) Streptomyces viridochromogenes (Bodenbakterium) - produziert Phosphinothricin N-acetyltransferase (pat) Glufosinat-Resistenz - z.b. LL-Raps (Falcon GS40/90...)

7 gv-pflanzen bisher bekannte und charakterisierte Z. Mais Kartoffel Soja Raps

8 Untersuchungsstrategie Ausgangspunkt: unzählige mögliche GVO-Linien Problem: alle einzeln abarbeiten?! ALSO: Erst Screenen, dann Identifizieren und dann Quantifizieren

9 Screening Screening auf häufig vorkommende Bausteine in GVOs - besonders geeignet: Regulatorgene, v.a. Promotoren (p35s, pfmv...) und Terminatoren (T-nos...) - weitere Bausteine: Gene für die neuen Eigenschaften, z.b. CP4-EPSPS, Bar, pat... - im LLBB bisher Nachweis von 7 Pflanzenarten und 11 Screening-Elementen + CaMV Nachweis (Methoden: CRL/JRC, 64LFGB, LAG, VDLUFA ) - anhand der Bausteine lassen sich viele GVO-Linien ausschließen - Bausteine für alle Pflanzen gleich oder ähnlich

10 Identifizieren und Quantifizieren Screening Einschränkung nkung auf wenige mögliche GVO-Linien (Screening Tabelle (Waiblinger et al, 2009) 1.zugelassene GVO werden quantifiziert 0,9% Grenze (RR-Soja) 2.nicht zugelassene GVO werden identifiziert (BT63-Reis) Problem 1: Mischproben und Maisproben - mehrere Elemente vorhanden: alle Kombinationen möglich viele Linien testen - Mais: in einem Kolben mehrere Linien möglich stacked events Problem 2: RR-Soja - oft ist das Screening auf p35s und T-Nos nicht aussagekräftig Problem 3: Quantifizierung.

11 3. Problem: Quantifizierung 1. Standardreihe a) Probe mit bekannten Genomkopien Matrix b) Plasmide 2. Matrix 3. Qualität der extrahierten DNA Maiskörner Maiskleber, CornCobMix, Verarbeitungsgrad RV VDLUFA Arbeitskreis PCR-Analytik (2007, 2009, 2010) 4. Mischfuttermittel 5. Mais (stacked events)

12 Tierartendifferenzierung Fragestellungen: 1. PetFood v.a. Hunde- und Katzenfutter Verbrauchertäuschung 2. Futtermittel Tiermehle für die Nutztierfütterung Ausschluss von Kannibalismus Identifizierung von Tierarten durch PCR möglich in der Lebensmitteldiagnostik üblich - Milchprodukte (Feta, Mozarella, ) - Seltene Fleischarten (Wild, Strauß, Bison ) - Fischidentifizierung: durch Sequenzierung von Amplifikaten (Thunfisch) Verwendete Gene: Cytochrom b, Myostatin, ß-Actin

13 PetFood Futter mit reinem Fleisch / Fisch Bsp: Rinti, Pedigree pur Rind Frage: Werden teurere Zutaten durch billigere ersetzt? Bsp: Straußenfleischfutter, Pellets, Dosenfutter (Fisch?) o.ä. Besteht ein Knabberartikel wirklich aus den angebenen tierischen Materialien? ungeeignete Proben Matrix! z.b. Hundebier

14 Tiermehle PROBLEM: PROBLEM: Verarbeitung!! in Stücke gemahlen Kochen im Drucksterilisationsverfahren > 20 3 Bar / 133 C Trocknen und Pressen zu Futter- Pellets Hitze zerstört rt DNA (und auch Proteine ) Verringerung der Sensitivität der PCR momentan ~0,1% Anteil an Tiermehl CRL, nationale Referenzlaboratorien und Arbeitsgruppen arbeiten an der Entwicklung neuer PCR-Methoden

15 unerwünschte Stoffe Beispiele für unerwünschte nschte Stoffe in Futtermitteln Mutterkorn Claviceps purpurea) Stechapfel (Datura stramonium) Rizinus (Ricinus communis) Ambrosia artemisiifolia Jacobskreuzkraut (Senecio javobaea)

Pyrrolizidinalalkaloide - toxisch für die Leber - ältere Pflanzen: bitter -

16 Jacobskreuzkraut - Senecio jacobea - giftig - breitet sich stark aus - Gefährdung für Pferde und Widerkäuer - gefärhliche Stoffe: Pyrrolizidinalalkaloide - toxisch für die Leber - ältere Pflanzen: bitter - jüngere Pflanzen nicht bitter Vergiftung, v.a. bei Jungtieren

17 Jacobskreuzkraut

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