Akkreditiert nach DIN EN ISO/IEC 17025: Jahre Erfahrung mit DNA-Techniken 9 MitarbeiterInnen Spezialisiert auf DNA-Analytik Service und

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1 Nachweis von gentechnischen Veränderungen in Pflanzen Lothar Kruse

2 Impetus GmbH & Co. Bioscience KG Akkreditiert nach DIN EN ISO/IEC 17025: Jahre Erfahrung mit DNA-Techniken 9 MitarbeiterInnen Spezialisiert auf DNA-Analytik Service und Entwicklung Seit 2002 im BioNord-Biotechnologie-Zentrum in Bremerhaven

3 Anwendungsbeispiele Fleisch, roh Fleisch, gekocht Wurst Konservenfleisch Fisch, roh Fisch, geräuchert Fischkonserve Tofu Soja-Trunk Soja-Brot Soja-Gulasch Futtermittel Knochenmehl Blutmehl Tierkörpermehl Tiernahrung Nachweis von gentechnischen Veränderungen und Spezies Saatgut Sojabohnen/-mehl/-schrot Maiskörner/-mehl/-schrot Pollen Brühwürfel Schmalz Gelatine Vollmilch H-Milch Käse Naturfasern Pelze Schokolade Tomatenmark Cornflakes Raps-Honig Fruchtsaft Marzipan Persipan Soja-Sauce Soja-Lecithine Rohöle Soja-Margarine Maisstärke Ketchup

4 Von der biologischen Probe zum PCR-Produkt Produkt

5 Einfluß von Hitzebehandlung auf die DNA- Fragmentlänge Spur 1: DNA-Standard (λ-dna, Hind III-Schnitt) Spur 5: Rind-DNA, 30 min 100 C, 2 µg Spur 2: Rind-DNA, unbehandelt, 2 µg Spur 6: Rind-DNA, 5 min 121 C, 2 µg Spur 3: Rind-DNA, 5 min 100 C, 2 µg Spur 7: Rind-DNA, 13 min 121 C, 2 µg Spur 4: Rind-DNA, 15 min 100 C, 2 µg Spur 8: DNA-Standard d (puc18, Hpa II-Schnitt)

6 Schematische Darstellung einer tierischen Zelle pflanzlichen Zelle

7 Organisation der DNA im Zellkern

8 PCR-Zyklus 72 C Start: Template-DNA Elongation C Reaktion läuft im Thermocycler 1 Denaturierung 95 C Annealing 2

9 Effektivität ität der PCR Exponentielle Zunahme der Kopienzahl Anzahl PCR-Zyklen Anzahl doppelsträngiger DNA-Moleküle

10 Screening- / Konstrukt- / Eventspezifische Nachweise Screening CaMV 35S-Promotor nos-terminator Wirts-DNA CaMV 35S-Promotor CTP4 CP4 EPSPS-Gen nos-terminator Wirts-DNA RR Soja-35S/CTP4 RR Soja Konstruktspezifischer Nachweis Eventspezifischer Nachweis

11 PCR-Sicherheitsvorkehrungen Strikte Trennung der Bereiche DNA-Extraktion, Set-Up und Detektion Geeignetes Belüftungs-/Filtersystem Aliquotierte Lösungen, Einmalhandschuhe, Filterspitzen, Kittel etc. Intensive regelmäßige Reinigung Untersuchungen im Doppelansatz Positiv-Kontrollen Negativ-Kontrollen Inhibitions-Kontrollen Plus/Minus-Ergebnisse wiederholen

12 Relevante Verordnungen für gv Lebens- und Futtermittel Laut Verordnungen 1829/2003/EG & 1830/2003/EG Nur EU-zugelassene gv Pflanzen sind verkehrsfähig - Keine Kennzeichnung, wenn sie technisch unvermeidlich oder zufällig sind - Deklarationspflichtig, wenn jeweilige gv Bestandteile über 0,9% liegen Nicht EU-zugelassene gv Pflanzen sind nicht verkehrsfähig - Es gilt die Nulltoleranz z.b. LL601-Reis, FP967 Leinsaat - Keine Kennzeichnung tierischer Produkte (Fleisch, Eier, Milch etc.), auch wenn Futtermittel gentechnisch verändert waren - Keine Kennzeichnung von gv Honig - Keine Kennzeichnung von Produkten, die mit Hilfe von gv Mikroorganismen hergestellt wurden

13 Kennzeichnungsregeln für gv Lebens- und Futtermittel Laut Verordnungen 1829/2003/EG & 1830/2003/EG Bei Produkten, in denen analytisch keine gentechnischen Veränderungen nachgewiesen werden können (Öle, hochraffinierte Lecithine, spezielle Stärkeprodukte), kt muss der Nachweis in der Vorstufe bzw. im entsprechenden Ausgangsprodukt geführt und entsprechend dokumentiert werden (Rückverfolgbarkeit lt. 1830/2003/EG) Technisch unvermeidbar oder zufällig*: gv Bestandteile zugelassener GVO unter 0,9% müssen nicht deklariert werden, wenn sie zufällig oder technisch nicht zu vermeiden sind. Bei der Anwendung dieser Begriffe reicht die alleinige Einhaltung analytischer Werte nicht aus, zusätzliche Maßnahmen sind nötig. *Waiblinger et al 2007 DLR 103 Heft 3 p 97 *Waiblinger et. al. 2007, DLR 103 Heft 3 p.97 *Köster, Feed Magazine, 3/2007, p.30f

14 Zugelassene gv Pflanzen in der EU Soja: 3 (MON , MON89788, A2704-2) Mais: 7 (MON810, Bt11, MON863, GA21, 59122, NK603, DAS1507) Raps: 3 ( GT73, MS8xRF3, T45)) Baumwolle: 4 (MON531, MON15985, MON1445, LL25)) Reis: 0 Kartoffel: 0 Zuckerrübe: 1 (H7-1) Andere: 0

15 Ausblick bis : ca. 30 gv Pflanzen werden weltweit angebaut 2015: ca. 120 gv Pflanzen im weltweiten Anbau Soja: 17 (8) Mais: 24 (12) Raps: 8 (4) Baumwolle: 27 (12) Reis: 15 (1) Kartoffel: 8 (3) Andere: 23 (7), z.b. Papaya, Kürbis, Pfeffer, Tomate, Senf Zahlen liegen wahrscheinlich deutlich höher

16 Protein oder DNA abhängig von Genexpression (Protein-Profile Profile sind gewebespezifisch) Einfluß von Umweltfaktoren Detektion abhängig von Konformation der Proteine aufgrund von Denaturierung nur bei frischen oder gering prozessierten Materialien einsetzbar nah verwandte Spezies können nicht unterschieden werden keine Quantifizierung möglich kein Kontaminationsrisiko identisch in allen Körperzellen höherer Informationsgehalt (nahezu 90 % nicht-kodierende d Bereiche) konformationsunabhängig Detektion von Basenaustauschen DNA ist extrem stabil höhere Sensitivität durch Verwendung repetitiver Sequenzen (mt, cp, nr) Design/Verwendung universeller Primer (cyt b) zuverlässige Quantifizierung möglich Verfügbarkeit von Sequenzinformationen nimmt ständig zu hohes Kontaminationsrisiko (Amplikons)

17 TaqMan-Prinzip 1. Sequenzspezifische Anlagerung der Sonde und der PCR-Primer 2. Primer-Extension und Sonden-Hydrolyse 3. Freisetzung der Sonde 4. Reportersignal steigt proportional zur Zykluszahl