Isolierung und Charakterisierung der Restriktionsendonuklease Bst PI aus B.stearothermophilus ATCC 12980

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1 Research Collection Doctoral Thesis Isolierung und Charakterisierung der Restriktionsendonuklease Bst PI aus B.stearothermophilus ATCC Author(s): Pugatsch, Thea Publication Date: 1979 Permanent Link: Rights / License: In Copyright NonCommercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Diss. ETH Nr Isolierung und Charakterisierung der Restriktionsendonuklease Bst PI aus B. stearothermophi1us ATCC ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften der EIDGENOESSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZUERICH vorgelegt von Thea Pugatsch di pl. natw. ETH geboren am von Zürich Angenommen auf Antrag von Prof. H. Zuber, Referent Dr. H. Weber, Korreferent 1979

3 99 Zusammenfassung Aus dem B. stearothermophi1usstamm ATCC wurde eine spezifische Restriktionsendonuklease Bst PI iso liert und charakterisiert. Das gereinigte Enzym zeigt eine optimale Spaltaktivität bei 100 mm NaCl, 10 mm Mg + + und ph 7.5. Die Endonukle ase Bst PI ist bis 65 C, der höchsten getesteten Tempe ratur aktiv. Unter den gewählten Testbedingungen spaltet das Enzym nur Doppelstrang DNA und keine Einzelstrang DNA. Die Erkennungsstelle der Endonuklease Bst PI auf einer DNA wurde durch chemischen Abbau nach der Methode von Maxam & Gilbert (56) bestimmt, wobei 5'terminal mar kierte Bst PIFragmente, sowie Fragmente welche die Bst Spaltstelle enthalten, verwendet wurden. Das Enzym er kennt die Basensequenz GGTNACC, wobei N jede der vier Basen A,T,G und C sein kann. Der Spaltort innerhalb der Sequenz liegt zwischen den beiden Purinen, so dass die Endonuklease Bst PI 5' überhängende Enden herstellt Diese Enden sind mit T.Ligase wieder zusammenfügbar. X S7 DNA enthält 11 Bst PlSpaltstel1en, Qß cdna deren SV 40 DNA, 0X 174 DNA und fd (RF) DNA werden von der En donuklease Bst PI nicht gespalten. B. Eine Methode wurde entwickelt, um Bakterienstämme an hand ihrer DNABandenmuster, nach Spaltung mit Restriktionsendonukleasen vergleichen zu können. Bakterien mit extremen Eigenschaften, wie z.b. die Ther

4 100 mophilen, können mit klassis chen mikrobiologischen Metho den schwer charakterisiert w erden. Mittels der Restrikkterien mit dem ursprlingli tionsanalyse können diese Ba chen Bakterienklon vergliche n werden, wobei die Identität mit diesem Bakterienklon übe rprüft werden kann, Die Restriktionsanalyse erla übt Vergleiche zwischen ver schiedenen Bakterienkulturen, jedoch ist eine taxono mische Einteilung der Bakter ienstämme mit dieser Methode nicht mögli eh.

5 101 Abstract A. A restriction endonuclease was purified from the B.stearothermophi1us strain ATCC by a procedure involving PEI fractionation, (NHL )2S0»precipitation and phosphocellulose chromatography. The enzyme Bst PI cleaves (3 29 DNA and P G DNA once, PCR I DNA twice, xs7 DNA 11 times and does not cleave fd (RF) DNA, 0X 174 DNA,SV 40 DNA and pbr 322 DNA. The sequence around the cleavage Site was established by a) cleaving DNA with the endonuclease 32 Bst PI, labeling the 5 termini with P Phosphate, isolating and sequencing the termini individually by the Maxam & Gilbert method and b) isolating several DNA fragments carrying a Bst PI cleavage Site and determining the nucleotide sequence in the region of the cleavage site. The recognition site common to all cleaved regions is GGTNACC...,,... where N can be any nucleotide. CCANTGG Cleaved ends can be rejoined by T.Ligase. B. Due to the so far absolute sequence specificity of res triction endonucleases, any uniform population of DNAmolecules will give rise to a unique set of fragments upon treatment with these enzymes. Therefore bacterial clones can be characterized and identified by isolating the total bacterial DNA and treating it with one or several restriction endonucleases. Bacteria for which only few taxonomic criteria exist, as in the case of several thermophilic bacilli, have been rapildly characterized by first determining their restric tion pattern and then comparing the pattern to already characterized bacterial strains.