AZ Je/Vai 18. Juni 2003

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1 Universitätsfrauenklinik Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer - Universitätsklinik - In der Schornau Universitätsfrauenklinik Ministerium für Schule, Wissenschaft und Forschung NRW Völklinger Str Düsseldorf Tel.: (0234) / 3301 Fax: (0234) arne.jensen@ruhr-uni-bochum.de homepage: Frauenheilkunde mit den Schwerpunkten Operative Gynäkologie (Station 12) /3967 Gynäkologische Onkologie /3969 Pränatal-, Wochen- und Neugeborenenstation (Station 13) /3971 Kreissaal und Geburtsvorbereitung (Bereich 2.OG) /3321 Spezialambulanzen und Ultraschall (Ambulanz 1.OG) /3310 Pränatal- und Mammadiagnostik (DEGUM II) /3303 Schwangeren und Sterilitätsberatung /3310 Urodynamik und Endoskopie (MIC) (Amb. OP 1.OG) /3301 Ihre Zeichen, Ihre Nachricht vom Unsere Zeichen Datum AZ Je/Vai 18. Juni 2003 Kompetenznetzwerk Stammzellforschung NRW hier: Abschlußbericht zum geförderten Projekt: Behandlung perinataler-zns-schäden durch Nabelschnurstammzellen Sehr verehrte Frau Doktor Werner, hiermit übersende ich Ihnen unseren Abschlußbericht zum Projekt Behandlung perinataler- ZNS-Schäden durch Nabelschnurstammzellen. Die Untersuchungen waren aus unser Sicht sehr erfolgreich und ich möchte mich ganz herzlich für die großzügige Unterstützung bedanken. Mit besten Grüßen Ihr Prof. Dr. A. Jensen (Standortvertreter Ruhr-Universität Bochum) Anlage Abschlußbericht Abstrakts

2 Abschlußbericht zur Forschungsförderung des Ministeriums für Schule, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen Kompetenznetzwerk Stammzellen NRW Projekttitel: Antragsteller: Datum des Antrages: Datum der Bewilligung: Behandlung perinataler-zns-schäden durch Nabelschnurstammzellen Prof. Dr. med. Arne Jensen Universitätsfrauenklinik Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer In der Schornau D Bochum Förderzeitraum: AZ: AZ Forschungsprojekte 1. Transplantationsversuche mit Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut im Tiermodell a) Ischämie bei Schaffeten durch chronische Präparation in Utero, postoperative Transfusion von Stammzellen über den fetalen plazentaren Kreislauf b) Ischämie bei neonatalen Ratten (Levine-Modell), stereotaktische Applikation von Stammzellen bzw. in vitro differenzierten neuronalen Zellen 2. Kultur, Expansion und Differenzierung neuronaler Zellen aus humanem Nabelschnurblut in vitro, Einsatz in Transfusionsexperimenten und funktionale Untersuchung 3. Vergleich der neuronalen Differenzierungsfähigkeit von Stammzellen aus der Nabelschnur, knochenmarksderivierten und aus dem peripheren Blut gewonnene Stammzellen unter Anwendung verschiedener Kultur- und Differenzierungsprotokolle 4. Etablierung einer Reinkultur von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Ratte in vitro 5. Ischämie - Modell an hippokampalen Gewebescheiben des Meerschweinchens Die unter 4 und 5 genannten Experimente wurden während des Förderzeitraums noch nicht begonnen. 1

3 Zu 1a Transplantationsversuche mit Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut im Tiermodell Ischämie bei Schaffeten durch chronische Präparation in utero, postoperative Transfusion von Stammzellen über den fetalen plazentaren Kreislauf Ziele Langfristiges Ziel der geplanten Untersuchungen ist der klinische Einsatz von humanen Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Regeneration von Schädigungen des zentralen Nervensystems unter besonderer Berücksichtigung der Therapie perinataler Hirnschäden. Hierzu soll die Kapazität von transplantierten humanen Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Migration und Differenzierung nach hypoxisch-ischämischer Hirnschädigung am chronisch instrumentierten Schaffeten in utero geprüft werden. Durch bilaterale Okklusion der Karotisgefäße von 30 Min. Dauer wird ein Insult im Cortex cerebri mit bevorzugter Schädigung der Parasagittalregion induziert. Methode Präparation des Nabelschnurblutes Das Nabelschnurblut wird nach Abnabelung des Kindes durch Punktion der Vena umbilicalis in standardisierten Transfusionsbeuteln gewonnen und frisch aufbereitet. Vor jeder Blutentnahme aus der Nabelschnur wird eine Einverständniserklärung der Mutter eingeholt. Das Blut wird in 1- fach Blutbeuteln mit CPDA-1 (Citrate Phosphate Dextrose Adenine) als Antikoagulanz aufgefangen und bei Raumtemperatur bis zur schnellst möglichen Weiterverarbeitung gelagert. Die Entnahme des Blutes aus den Beiteln erfolgt unter sterilen Bedingungen. Die Probe wird 1:4 mit PBS verdünnt, 20 ml Ficoll (Dichtegradientenzentrifugationsmedium) werden in einem 50 ml PP-Röhrchen vorgelegt, 30 ml verdünntes Nabelschnurblut wird vorsichtig über das Ficoll geschichtet und 60 min bei 1500rpm zentrifugiert. Der Überstand wird bis auf ca. 5 ml über dem Interphasenring abgesaugt. Die Interphaseringe werden mit einer Pipette entnommen, in ein 50 ml PP-Röhrchen überführt und auf 50 ml mit PBS aufgefüllt. Nach 10 min Zentrifugation bei 1500 rpm wird das Pellet in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und die Zellzahl und Vitalität in einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Ein Teil der Experimente wurde mit zuvor kryokonserviertem Blut durchgeführt, das von der Firma Vita34 (Leipzig) zur Verfügung gestellt wurde. Die Isolierung der mononukleären Zellen aus diesen Bluten erfolgte ebenfalls durch Vita34. Die Kooperation wurde inzwischen zugunsten einer Frischpräparation der mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut eingestellt. Operatives Vorgehen Die trächtigen Schafe werden unter sterilen Bedingungen nach Spinalanästhesie operiert. Nach Eröffnung der vorderen Bauchwand in der Linea alba und Uterotomie, werden nacheinander die beiden unteren Extremitäten des Feten nach außen verlagert. Hier werden die Aa. und Vv. femorales dargestellt und Polyvinyl-Katheter bis in die Aa. iliacae com. bzw. V. cava inferior vorgeschoben. Ein weiterer Katheter wird in eine großkalibrige Kotyledonenvene implantiert und bis in die Nabelschnurvene vorgeschoben. Über diesen Zugang werden am ersten postoperativen Tag die Nabelschnur-Stammzellen transplantiert. Nach Verschluß der ersten Uterotomie wird der Uterus über dem Kopf des Feten inzidiert. Durch diese Öffnung wird der Kopf nach außen verlagert und die Karotiden beidseits nach Lokalanästhesie präpariert. Ein mit körperwarmer, physiologischer Kochsalzlösung gefüllter OP- Handschuh wird zur Vermeidung einer Spontanatmung über den Kopf des Feten gestülpt. Intraoperativ wird die Hirndurchblutung durch das sog. "Viergefäß-Okklusionsmodell" für 30 Min. unterbrochen. Hierbei wird eine globale zerebrale Ischämie durch bilaterale Okklusion der Aa. carotides communes ober- und unterhalb der Abgänge der Aa. linguales unter visueller 2

4 Kontrolle induziert. Nach Abschluß der Hypoxie-Ischämie wird die Hautinzision verschlossen und der Kopf in den Uterus zurückverlagert. Vor Verschluß der Uterotomie wird der bei der Präparation entstandene Verlust der Amnionflüssigkeit mit einer 0,9%igen (w/v) Kochsalzlösung ausgeglichen. Die Gefäßkatheter werden mit Heparin aufgefüllt (1000 IU/ml) und subkutan zur Flanke des Muttertieres geführt, dort über eine kleine Hautinzision nach außen geleitet und zur Vermeidung von Verschmutzungen in einer an der mütterlichen Flanke befestigten Kunststofftasche aufbewahrt. Die Gesamtpräparationszeit des Muttertieres und des Feten, inklusive der Durchführung des akuten Experimentes, dauerte ca. 75 Min. Sowohl am Tag der Operation als auch an den folgenden Tagen erhält das Muttertier eine Tagesdosis von 2 Millionen Einheiten Penicillin G (Grünenthal) und 80 mg Gentamycin-Sulfat (Merck) zu gleichen Teilen i. v. und direkt in die Amnionflüssigkeit. Die Zeit nach Abschluß der Präparation und des akuten Versuchsanteils verbringt das Schaf im Tierstall. Experimentelles Protokoll Zur Bestimmung der arteriellen Blutgase sowie des Säure-Basen Haushalts werden täglich Blutproben entnommen und die Gefäßkatheter mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt. Am ersten postoperativen Tag (+24 Std.) werden die humanen Nabelschnur-Stammzellen mit einer Zellzahl von ca. 1-3x10 8 mononukleäre Zellen über den Vena umbilicalis Katheter transplantiert (Flußgeschwindigkeit: 0,5 ml/min., totales Volumen: 10 ml). Nach der letzten Blutgasbestimmung, 3 bis 14 Tage nach Ischämieinduktion, wird dem Muttertier unter Sedierung erneut eine Spinalanästhesie gelegt. Unter nicht sterilen Bedingungen wird der Fet nach eine Laparo- und Uterotomie mit 300ml Paraformaldehyd (4%) in vivo perfundiert. Die Tiere werden anschließend durch T61 getötet. Experimentelles Protokoll Behandlung perinataler ZNS-Schäden durch Nabelschnurstammzellen OP Ischämie 30 Min. Versuchsende Perfusionsfixation 0 Std. +24 Std. Stammzell- Transplantation +1 d +2 d +3 d +5d bzw. +14 d Blutgase, SO2, Histologie, Immunhistochemie und DNA in situ Hybridisierung Im Anschluß an die Perfusionsfixation werden die fetalen Organe entnommen und zunächst in Paraformaldehyd (4%; +PBS) gelagert. Die Gehirne werden zur standardisierten Zerteilung in Agarose eingebettet. In einer speziellen Schneideapparatur werden die Gehirne in 16 Scheiben mit einer Schichtdicke von 4 mm geschnitten. Für die histologische und neuropathologische Evaluation werden Gefrierschnitte mit einer Dicke von 30 µm angefertigt und nach Haematoxilin & Eosin gefärbt. Schnitte eines jeden Blockes werden für die DNA in situ Hybridisierung zum 3

5 Nachweis des sog. "human alu repeat element" vorbereitet (Brüstle et al. 1998; Garnier et al. 2002). Zur Signaldetektion werden Alkalin-Phosphatase- und Fluorophor-konjugierte Antikörper verwendet. Ausgewählte hybridisierte Ausschnitte werden mit Antikörpern gegen spezifische neurale und hämatopoetische Marker-Antigene für die Immunfluoreszenz Analyse eingesetzt. Die DNA in situ Hybridisierung erfolgt in Kooperation mit Herrn Professor O. Brüstle (Institut für Rekonstruktive Neurobiologie, Universität Bonn). Ergebnisse Es wurden insgesamt 18 Mutterschafe operiert, wodurch 21 Feten in den Versuch eingeschlossen wurden. Anfänglich konnten, trotz Verwendung von termingedeckten Tieren, wegen eines zu hohen oder zu niedrigen Gestationsalters der Feten einige Versuche nicht durchgeführt werden bzw. es waren Aborte zu verzeichnen. Daraufhin wurde mit Antragsmitteln ein mobiles Ultraschallgerät angeschafft, mit dessen Hilfe sich das Gestationsalter vor OP- Beginn bestimmen läßt. Die histologische Auswertung zeigte schwere neuronale Degeneration im Kortex der Schaffeten, die einer Ischämie unterworfen waren. Degeneration eosinophilier Zellen und Neuropilfragmentierung waren besonders in den mittleren Schichten des Cingulate-Kortex und des temporalen Kortex. Mit der humanspezifischen DNA-In-situ-Hybridisierung wurden zahlreiche Zellen in diesen Regionen markiert. Die Doppelmarkierung der hybridisierten Zellen mit Antikörpern gegen zellspezifische Marker-Antigene läßt vermuten, daß ein geringer Anteil der Alu-Probe positiven Zellen das Astrozyten spezifische GFAP (glial fibrillary acidic protein) exprimiert. Fazit Die ersten Ergebnisse sind ermutigend in Bezug auf den Nachweis der erfolgreichen Transplantation und erster Hinweise einer neuronalen Differenzierung. Um diese ersten Ergebnisse zu bestätigen, bedarf es weiterer Untersuchungen der fetalen Gehirne aus den bereits abgeschlossenen Versuchen. Die Transplantationsexperimente werden fortgeführt, allerdings sind wir hierbei durch den Reproduktionszyklus der Schafe an einen begrenzten Zeitraum im Frühjahr gebunden. 4

6 Zu 1b Transplantationsversuche mit Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut im Tiermodell Ischämie bei neonatalen Ratten (Levine-Modell), stereotaktische Applikation von Stammzellen bzw. in vitro differenzierten neuronalen Zellen Ziele Vor dem klinischen Hintergrund der Problematik des perinatal erworbenen Hirnschadens soll in diesem Projekt geprüft werden, ob sich durch Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut auch in einem Modell der neonatalen Hirnschädigung bei Ratten eine neuronale Regeneration feststellen lässt. Im Tiermodell dienen histologische Schnitte zur Evaluation des Hirnschadens. Mittels Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung soll die Integration der transplantierten Zellen in das Gewebe überprüft und neuronale Differenzierung nachgewiesen werden. Methode Der hypoxisch-ischämische Hirnschaden wird an sieben Tage alten neonatalen Wistar-Ratten weiblichen Geschlechts unter Verwendung des "Levine-Modells" induziert. Die neonatalen Ratten werden mit einer Halothan-Inhalationsnarkose (3,5% zur Induktion, 1-1,5% zur Aufrechterhaltung) in einem 1:1 Sauerstoff-Lachgasgemisch betäubt. Nach Überprüfen der Narkosetiefe wird eine kleine Hautinzision von ca. 5 mm Länge im linken unteren Halsdrittel mit der Mikroschere angelegt und die Arteria carotis communis dargestellt. Diese wird mittels Seidennaht doppelt ligiert und zwischen den Knoten durchtrennt. Die Neonaten werden dann in einer Gasdurchflußkammer für 80 Minuten einem hypoxischen Gasgemisch (8% O 2, 92% N 2 ) ausgesetzt. Drei Tage nach Induktion des Hirnschadens sollen den Tieren der Therapiegruppe humane Nabelschnurstammzellen männlicher Neugeborener intraperitoneal injiziert werden (1x10 7 mononukleäre Zellen in 500 µl). Die Kontrollgruppe erhält äquivalente Volumina an NaCl. Die Entnahme der Gehirne erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation am 14. Lebenstag, nach 3 Wochen, 4 Wochen, 2 Monaten und 1/2 Jahr. Die Fixierung erfolgt am Neonaten durch Immersionsfixierug in 4%igem Paraformaldehyd, bei adulten Tieren durch Perfusionsfixierung. Zusätzlich zum Gehirn werden auch Leber, Milz, Lunge und Knochenmark zur Untersuchung entnommen. experimental protocol -1 h 0 Std. +80 min. +3 d. +7 d. (+ 14d., + 1m., + 2m., + 6 m. resp.) Start hypoxia (8% O2 / 92% N2) End ligation left common carotic artery intraperitoneal stem cell injection preparation of brain 5

7 Ergebnisse Es sind erste Transplantationsversuche an Tieren im Levine-Model durchgeführt worden. Die Untersuchungen laufen, es liegen noch keine publikationsreifen Ergebnisse vor. Fazit Die Experimente werden in der vorgestellten Weise fortgeführt und die Homing- und Differenzierungsprozesse weiter intensiviert untersucht. Des Weiteren wurde mit Verhaltensversuchen begonnen, in denen das Laufverhalten der transplantierten versus nicht transplantierter Tiere und Kontrolltiere untersucht wird. Die Auswertung dieser Untersuchungen ist noch nicht abgeschlossen. 6

8 Zu 2 Kultur, Expansion und Differenzierung neuronaler Zellen aus humanem Nabelschnurblut in vitro, Einsatz in Transfusionsexperimenten und funktionale Untersuchung Ziele Die In-vitro-Differenzierung humaner Nabelschnurstammzellen in funktionelle neuronale Zellen ist in wenigen Arbeiten in der Literatur beschrieben (Sanchez-Ramos et. al. 2001, Buzanska et al. 2002). Als Voraussetzung für die weiteren Teilprojekte Funktionelle Charakterisierung von aus Nabelschnurblutstammzellen differenzierten Neuronen mittels patch-clamp-ableitungen in sog."microisland"-kulturen, Funktionelle synaptische Integration humaner Nabelschnurstammzellen in neocortikalen Hirnschnittkulturen der Maus und Integration von neuronal differenzierten Nabelschnurblutstammzellen in Hirnschnittkulturen sollte zunächst die Proliferation und neuronale Differenzierung von Stammzellen aus Nabelschnurblut etabliert und optimiert werden. Ergebnisse In Kooperation mit dem Labor für experimentelle Hämatologie und Gentransfer der Uni Essen (PD Dr. Flaßhove/PD Dr. Moritz) hat die, mit Mitteln aus dieser Förderung finanzierte, Biologin zunächst in einer 2 monatigen Hospitation die notwendigen Techniken zur Zellseparation und Kultivierung sowie Grundlagen des viralen Gentransfers (GFP-Markierung) in Nabelschnurblutzellen erlernt. Gemeinsam mit PD Dr. Gottmann (Lehrstuhl für Zellphysiologie der Ruhr-Universität Bochum) wurden dann die Protokolle von Sanchez-Ramos und Buzanska angewendet. Während des Förderzeitraums wurden insgesamt 18 Blutkonserven aus kryokonservierten Beständen (Vita34, Leipzig) oder frischem Nabelschnurblut verwendet. Mit beiden Protokollen war es zunächst nicht möglich, die Zellen in nennenswertem Maße zur Proliferation anzuregen. Nach dem Buzanska Protokoll konnte letztlich eine Zellvermehrung erzielt werden, neuronale Differenzierung wurde nach diesem Protokoll nicht erreicht. Nach dem Sanchez-Ramos Protokoll ist es zwischenzeitlich gelungen, die Zellen in DMEM Medium mit 0,0001% -Mercaptoethanol, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bfgf und 10% FCS zu proliferieren und durch Austausch von EGF und bfgf gegen 0,5 µm All-Trans-Retinolsäure und 100 ng/ml NGF eine Differenzierung zu erzielen. Die solchermaßen behandelten Zellen zeigen immunhistochemisch eine deutliche Färbung mit Antikörpern gegen NSE (neuron specific enolase). Fazit Die weitere Optimierung der Kultivierungsprotokolle und der immunhistochemische Nachweis der neuronalen Differenzierung mit weiteren Antikörpern sind Bestandteil der fortlaufenden Arbeiten. Sobald diese eindeutige Ergebnisse erbringen, können die weiteren, o. g. Untersuchungen begonnen werden. 7

9 Zu 3 Vergleich der neuronalen Differenzierungsfähigkeit von Stammzellen aus der Nabelschnur, knochenmarksderivierten und aus dem peripheren Blut gewonnene Stammzellen unter Anwendung verschiedener Kultur- und Differenzierungsprotokolle. Ziele Die neuronale Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Stammzellpopulationen ist bisher noch nicht vergleichend untersucht worden. Die in-vitro-charakterisierung der verschiedenen Stammzellen im Hinblick auf die Differenzierbarkeit in neuronale und gliale Zellen ist ein unverzichtbarer Schritt im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung. Wachstums- und Differenzierungsparameter verschiedener Zellpopulationen sollen daher im Rahmen des geplanten Projektes zunächst unter Bedingungen der Zellkultur untersucht werden. Zielparameter sind morphologische Veränderungen der Zellen, immunhistochemische Charakteristika im Sinne von verstärkter Expression von neuronen- oder gliaspezifischen Markerproteinen, sowie der objektive Nachweis dieser Differenzierung mittels Western Blot und PCR. Ergebnisse Knochenmarksderivierte Stammzellen wurden nach verschiedenen Stammzellmarkern sortiert (AC 133+; CD 34+; AC 133+/CD 34-) oder als unsortierte mononukleäre Zellen in Kultur genommen. Sie wurden mittels Markentnahme unter sterilen Bedingungen aus posterioren Beckenkämmen gewonnen und die mononukleären Zellen mittels Ficoll- Gradientenzentrifugation isoliert. Die so kultivierten Zellen ließen sich bei einer durchschnittlichen Verdopplungszeit von ca. 1 Woche über 10 Passagen expandieren. Hierbei blieb die Proliferationsgeschwindigkeit auch in späteren Passagen weitgehend konstant. Ca Zellen/cm 2 wurden ausgesät, bis zur Konfluenz kultiviert und passagiert. Versuche zur neuronalen Differenzierung anhand des Schemas nach Woodbury (Woodbury et al Neurosci Res 61) mit geringer Modifikation durch Huss (Huss et al J Hematother Stem Cell Res 9) haben innerhalb von ca. 6 Stunden bei AC 133+-sortierten Zellen zu einer Kompaktierung des Perikaryons und zipfliger Ausziehung von Zellenden geführt. Hierbei standen die Zellen z.t. miteinander in Kontakt. Morphologisch ähneln diese Zellen insgesamt neuronalen Zellen. Zudem ließen sich elektrophysiologisch Calciumkanäle nachweisen. Ein Nachweis von Natrium- oder Kaliumströmen in diesen Zellen ist noch nicht gelungen. In Abhängigkeit von der Konzentration des eingesetzten -Mercaptoethanol ließ sich der Differenzierungszeitraum auf bis zu 4 Tage steigern (bei 1 mm) bzw. führte innerhalb von 24 Stunden zu einem Ablösen der Zellen von der Zellkulturoberfläche. Erste immunhistochemische Untersuchungen zeigen sowohl bei AC 133+ sortierten Zellen als auch der immortalisierten Knochenmarks-Zelllinie L 87/4, die von Herrn PD Dr. Huss, München, zur Verfügung gestellt wurde, die Expression der Markerproteine NeuN, NSE und GFAP. Die Expression von GFAP steigt sowohl bei der Zelllinie als auch bei der Primärkultur bei differenzierten Zellen immunhistochemisch nachgewiesen an. Auch NSE steigt während der Differenzierung an. Eine Änderung der Expression von NeuN ist nicht sicher nachweisbar. Längere Differenzierung über bis zu 4 Tage bei niedriger -Mercaptoethanol-Konzentration führte hierbei zu einer stärkeren Expression von NSE und insbesondere GFAP als die kurzfristige höher konzentrierte Behandlung über 6 Stunden mit bis zu über 10 mm. Fazit Die Experimente werden wie vorgestellt fortgesetzt, um die vorläufigen Ergebnisse zu verifizieren. 8

10 Verwendung der Fördermittel Haushaltsjahr 2002 Ordnungsnummer Prof. Dr. Jensen/Stammzellenforschung Einnahmen Ausgaben Saldo Personal , ,27 Sachmittel < , ,36 Verbrauchsmittel , ,87 Gesamtsaldo 1.718,76 Sachmittel < SonoSite 180 PIG Ultraschall ,20 Blutgasvollautomat ABL ,84 Stereotaktisches Gerät 5.463, ,64 Personal BAT IIa/ ,02 BAT Vc , ,73 9

11 RUHR-UNIVERSITY OF BOCHUM First International Meeting of the Stem Cell Network North Rhine Westphalia Düsseldorf, November 26-27, 2002 CEREBRAL ISCHEMIA AND UMBILICAL STEM CELL TRANSPLANTATION IN CHRONICALLY PREPARED FETAL SHEEP Yves Garnier 1, Hans-Martin Vaihinger 1, Johannes Middelanis 1, Oliver Brüstle 2, Arne Jensen 1 1 Department of Obstetrics & Gynecology, University of Bochum, Germany 2 Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, Germany Objective: Hypoxic-ischemic cerebral damage is an important contributor to perinatal mortality and morbidity including long-term neurological sequalae in term and preterm fetuses. Hypoxic-ischemic insults are usually causing parasagittal brain lesions and affect the parietal and occipital regions in particular. This form of damage has been reproduced in the chronically prepared fetal sheep model, which has been in use for years in Bochum. Experimental evidence has shown that neuroprotective strategies using pharmacologic agents may alleviate perinatal brain damage. However, so far no convincing strategies are available for regeneration of damaged nervous structures in the perinatal period. Therefore, one of the most urgent tasks for scientists and clinicians will be to explore the enormous potential of cell replacement therapies using stem cells in general and umbilical cord blood stem cells in particular to provide a future therapeutic approach for perinatal neuronal repair. Material and Methods: Fetal sheep will be chronically instrumented at 0.7 of gestation. The ewe will be anesthetized by subarachnoid injection of 0.75% bupivacaine at the lower spine, and will be operated under sterile conditions. The fetal hindlimbs will be exposed through a small incision of the uterus. Using local anesthesia polyvinyl catheters will be inserted into the inferior vena cava of the fetus. Furthermore, a catheter will be placed in a cotyledonary vein and its tip will be advanced to the umbilical vein. The uterine incision will be closed and a second uterine incision will be performed over the fetal snout in order to exteriorize the head and neck of the fetus. Catheters will be inserted into the fetal ascending aorta via the right brachial artery. Furthermore, both fetal common carotic arteries will be prepared. After measurements of blood gases and acid base balance global cerebral ischemia will be induced by bilateral occlusion of the carotid arteries for 30 min. All catheters will be filled with heparin, plugged, and passed subcutaneously to the ewe s flank, where they will be exteriorized and protected by a pouch sewn to the skin. Sampling of fetal blood and flushing of the catheters will be repeated daily. At +24 h, approx. 1-2 x 10 7 mononuclear cells prepared from human umbilical cord blood will be intravenously transfused to the fetus at a rate of 0.5 ml/min (10 ml total volume). The delay between the ischemic insult and the transplantation of cells will be extended up to two weeks in further experiments. At the end of the experiment (at +120 h or later in further experiments) the ewe will be anaesthetized for perfusion fixation. The brain will be dissected and immediately placed in ice-cold fixative without removal of the meninges. Furthermore, organ samples will be taken from spleen, liver, lung, bone marrow and cotyledons. Results: In a promising pilot experiment, cerebral ischemia was induced by occlusion of both carotid arteries in utero in chronically prepared fetal sheep. One day after the insult, mononuclear cells from human umbilical cord blood were applied to the fetus via the umbilical vein. Three days after transplantation, the fetal brain was examined for both damage and evidence of incorporated human cells. Preliminary evaluation indicates severe parasaggital neuronal degeneration in the host cortex. DNA in situ hybridization detecting a human alu-repeat element revealed numerous labeled cells, some of which also expressed the neural progenitor specific marker glial fibrillary acidic protein (GFAP). Conclusion and Outlook: Our preliminary results point to the migration of transplanted cells and, furthermore, indicate that differentiation commences in vivo. Thus, the planned series of studies is essential to solve important questions regarding therapeutical approaches using umbilical cord blood derived stem cells for the regeneration of damage of the nervous system. 10

12 RUHR-UNIVERSITY OF BOCHUM First International Meeting of the Stem Cell Network North Rhine Westphalia Düsseldorf, November 26-27, 2002 A MODEL OF NEONATAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATS ( LEVINE ) TO STUDY NEUROPROTECTION AND NEUROREGENERATION Johannes Middelanis 1, Hans-Martin Vaihinger; Yves Garnier 1, Kurt Gottmann 2, Hubert Dinse 3, Arne Jensen 1 1 Department of Obstetrics & Gynecology, University of Bochum, Germany 2 Institute of Cell Physiology, University of Bochum, Germany 3 Department of Neuroinformatics, University of Bochum, Germany Experimental evidence has shown that neuroprotective strategies using pharmacologic agents or moderate cerebral hypothermia may alleviate perinatal brain damage. Using the neonatal rat model we tested the neuroprotective effects of creatine against hypoxic-ischemic injury in the immature brain. We measured neuronal cell damage in 7-day-old rat pups that had undergone unilateral carotid artery occlusion followed by 80 min of hypoxia. Neuronal cell injury was significantly lower in the cortex of the neonatal rats that received creatine (3 g/kg) s.c. This was also true for the evaluated subfields in the hippocampus. From these results we conclude that creatine protects the immature brain from hypoxic-ischemic injury. Though neuroprotection by pharmacologic agents is possible, so far no convincing strategies are available for regeneration of damaged nervous structures in the perinatal period. Therefore we will now study the potential of cord blood derived stem cells to reconstitute brain damage caused by a hypoxic-ischemic insult in the perinatal period in the Levine-model. Seven day-old Wistar rat pups are exposed to ischemia by ligation of the left common carotid artery and subsequent hypoxia will be induced by exposure to a hypoxic gas mixture (8% oxygen, 92% nitrogen) for 80 min. Seven days after the insult, rat pups will receive a transplantation of mononuclear cells prepared from human umbilical by density gradient centrifugation or in vitro pre-differentiated cells from the same source. Cells will be applied by stereotactically controlled intraventricular injection (either contra- or ipsilateral to the ischemic insult) or, alternatively, by intraperitoneal injection. At various timepoints after transplantation (7 d, 14 d, 28 d, 3 month, 6 month, 12 month) the rats will be examined for the fate of the transplanted cells. Evaluation of 'homing' and differentiation will be perfomed by immunohistochemical analysis. The restoration of physiological functions will be investigated by movement tests. 11