1. SEMINARVORTRAG MAMMALIAN GAMETE FUSION DEPENDS ON THE INHIBITION OF OVASTACIN BY FETUIN-B

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1 1. SEMINARVORTRAG MAMMALIAN GAMETE FUSION DEPENDS ON THE INHIBITION OF OVASTACIN BY FETUIN-B (Walter Stöcker, Konstantin Karmilin, André Hildebrand, Hagen Westphal, Irene Yiallouros, Ralf Weiskirchen, Eileen Dietzel, Julia Floehr and Willi Jahnen-Dechen) Von: Israfil Yalcin Saarbrücken, 29.November 2017

2 1. Zumasammenfassung Bevor Spermien eine Säugetier-Eizelle befruchten können, müssen sie eine Reihe von hochselektiven Barrieren überwinden, eines dieser Barrieren ist die Zona pellucida (ZP). Die Zona pellucida oder auch Glashaut genannt, ist eine Schutzhülle aus Glykoprotein- Matrix um die Eizelle, die beim Menschen aus den ZP-Proteinen ZP1, ZP2, ZP3 und ZP4 besteht (bei der Maus nur ZP1, ZP2, ZP3). Sobald die Spermien die Eizelle erreichen und auf die ZP treffen kommt es zu einer Akrosomalreaktion. Durch diese Reaktion werden Enzyme auf beiden Seiten freigesetzt. Eines von diesen Proteinen ist die Hyaluronidase, sie löst die Interzelluläre Matrix zwischen den Kumuluszellen auf, während andere Enzyme die um die Eizelle gelegene ZP auflösen. Dadurch kommt es zur einer Spermien- Ei-Membranfusion (Bianchi et al., 2014). Nach der Spermien-Ei-Membranfusion induziert das Spermium eine schnelle Signalkaskade mit der Phospholipase C und G- Protein-vermittelten Calcium-Signalisierung. Durch die Kaskade wird die Exozytose der Corticalgranula aus und schüttet ihren Inhalt in den perivitelline Raum zwischen der Eiplasma-Membran (Oolemma) und der ZP. Diese Reaktion führt zur Ablösung der Eihülle bzw. Vitellinmembran und es kommt zu einer Fusion. Dadurch kommt es zur Blockierung gegen Spermien, welches direkt nach der Spermien-Ei-Membranfusion geschieht. Sie wird durch die Wirkungen von exozytierten Proteinkomponenten aus der Corticalgranula hervorgerufen. Eine dieser Komponenten ist die Metalloprotease Ovastacin. Sie wurde vor zehn Jahren sowohl in unbefruchteter Maus als auch in menschlichen Oozyten entdeckt. Dieses Enzym wird der Astacin-Familie der Metalloproteasen zugeordnet. Das Ovastacin ist in der Kortikalgranula der Oocyte gespeichert. Sie wird bei der Befruchtung nach der Spermien-Ei-Membranfusion aus der Kortikalgranula ausgeschüttet und reguliert somit die Fruchtbarkeit der Eizelle. Ovastacin spaltet das ZP Protein ZP2 und bewirkt auf diese Weise die Verhärtung der ZP. Dadurch findet ein Schutz gegen Polyspermie statt. Bei einer zu frühen Verhärtung der ZP führt es zur Unfruchtbarkeit einer Eizelle. Deshalb spielt ein Plasma-Protein, das von der Leber produziert wird, eine wichtige Rolle: Fetuin-B. Ohne das Fetuin-B Protein verhärtet die äußere Hülle der Eizelle und Spermien können nicht mehr eindringen (Stöcker et al., 2012). Abbildung 1: Schematische Darstellung der Cystatine vom Typ3 (Abbildung aus Lee et all., 2009). Wie alle anderen Fetuine gehört auch das Fetuin-B zu den Typ 3 Cystatinen. Cystatine werden auf der Basis ihrer Aminosäurensequenz in drei Typen unterteilt und zwar in Typ 1 (intrazelluläre cytosolische Proteine), Typ 2 (hauptsächlich extrazelluläre Proteine) und Typ 3 Cystatine (Plasmaproteine). Bei den Typ 3 Cystatinen bzw. Plasmaproteinen handelt es sich um das Fetuin-A (AHSG= Alpha-2-Heremans-Schmid- Glycoprotein) und Fetuin-B. Beide Fetuine weisen nur eine geringe Sequenzähnlichkeit auf, aber besitzen einen sehr ähnlichen Domänenaufbau aus zwei Cystatin-Domänen und einer dritten Domäne mit unbekannter Funktion (Abb. 1) (Nawratil et al., 1996; Olivier et al., 2000). Seite 1

3 Abbildung 2: Vergleich von Röntgenaufnahmen einer Wildtyp Maus (+/+) und einer Fetuin-A Knockout-Maus (-/-). Radiologische Analyse einer 9-monatigen männlichen Wildtyp Maus (oben). Verkalkung im Bereich der Weichteile des Thorax, Nieren und Hoden einer Fetuin-A knockout Maus (unten) (Abbildung aus Schäfer et al., 2003) Die zentrale Funktion des in der Leber produzierten Fetuin-A/AHSG ist die systemische Inhibition der Calcium-Phosphat-Präzipitation, wodurch unerwünschte Verkalkung bzw. Mineralisierung im Körper verhindert wird. Die Hemmung durch Fetuin-A geschieht durch eine vorübergehende Bildung von Kügelchen, die Fetuin-A, Calcium und Phosphat enthalten (Abb. 2)(Lee et al., 2009). Abbildung 3: Schematische Darstellung des Mechanismus für die Wechselwirkung von Ovastacin und Fetuin-B in der Eizelle. (Oben links) In der Eizelle einer Wildtyp-Maus sickern geringe Mengen an Ovastacin (blau) aus dem unbefruchteten Ei, die von Fetuin-B (rot) gehemmt werden. (Oben rechts) Das Eindringen eines Spermiums in die Eizelle löst den massiven Ausstoß an Ovastacin aus. Die ausgestoßene Menge an Ovastacin ist so hoch, dass es vom Fetuin-B nicht mehr gehemmt werden kann und es zur Verhärtung der Zona pellucida kommmt. Es wird das Eindringen weiterer Spermien blockiert. (Unten links) In Fetuin-B knockout Maus werden die geringen Mengen an Ovastacin, die aus dem unbefruchteten Ei aussickern nicht gehemmt. Die Zona pellucida verhärtet sich ohne das Eindringen eines Spermiums. (Unten rechts) Es können keine Spermien eindringen und die Eizelle bleibt unbefruchtet. (Abbildung aus Stöcker et al. 2014) Seite 2

4 Auch Fetuin-B ist ein Plasmaprotein und wird ebenfalls in der Leber produziert. Im Gegensatz zu Fetuin-A ist sie nicht an der Calciumphosphat-Homöostase beteiligt. Während einer Studie hat man festgestellt, dass Fetuin-B defiziente Mäuse einen auffälligen Phänotyp haben. Die weiblichen Tiere waren unfruchtbar. Als Ursache wurde die Hemmung der Matalloprotease Ovastacin festgestellt, die wie bereits erwähnt in den Corticalgranula der Oocyte gespeichert vorliegt. Der Grund für die Unfruchtbarkeit Fetuin-B-defizienter Weibchen lag darin, dass in Abwesenheit von Fetuin-B die ZP vorzeitig, durch kleine Mengen an Ovastacin, die aus der Eizelle sickern, verhärtet und somit das Eindringen von Spermien verhindert wird (Abb. 3) (Stöcker et al., 2012, Dietzel et al., 2013). Bislang waren Cystatine hauptsächlich als Hemmstoffe Papain-ähnlicher Cysteinproteasen bekannt. Der Mechanismus der Hemmung von Metalloproteasen durch Mitglieder der Cystatin Superfamilie war völlig unbekannt. Deshalb müsste man Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Cystatine auf der Basis der Proteinsequenz und der dreidimensionalen Struktur analysieren und Sequenzmotive identifizierten, die für diese Funktion verantwortlich sein könnten. Seite 3

5 2. Literatur Burkart, A. D., Xiong, B., Baibakov, B., Jimenez-Movilla, M., & Dean, J. (2012). Ovastacin, a cortical granule protease, cleaves ZP2 in the zona pellucida to polyspermy. J.Cell Biol., pp Dietzel, E., Wessling, J., Floehr, J., Schaäfer, C., Ensslen, S., Denecke, B., Willi, J.-D. (2013). Fetuin-B, a Liver-Derived Plasma Protein Is Essential for Fertilization. Developmental Cell, pp Lee, C., Bongcam-Rudloff, E., Sollner, C., Jahnen-Dechent, W., & Claesson-Welsh, L. (2009). Type 3 cystatins; fetuins, kininogen and histidine-rich glycoprotein. Frontiers in Bioscience, pp Nawratil, P., Lenzen, S., Kellermann, J., Haupt, H., Schinkei, T., Müller-Esterl, W., & Jahnen- Dechent, W. (1996). Limited Proteolysis of Human a2-hs Glycoprotein/Fetuin, Evidence that a chymotryptic activity can release the connecting peptide. The Journal of Biological Chemistry, pp Olivier, E., Soury, E., Ruminy, P., Husson, A., Parmentier, F., Daveau, M., & Salier, J.-P. (2000). Fetuin-B, a second member of the fetuin family in mammals. Biochem. J., pp Schäfer, C., Heiss, A., Schwarz, A., Westenfeld, R., Ketteler, M., Floege, J., Jahnen-Dechent, W. (2003). The serum protein α2 Heremans-Schmid glycoprotein/fetuin-a is a systemically acting inhibitor of ectopic calcification. J. Clin. Invest., S Stöcker, W., Karmilin, K., Hildebrand, A., Westphal, H., Yiallouros, I., Weiskirchen, R.,... Jahnen-Dechent, W. (2014). Mammalian gamete fusion depends on the inhibition of ovastacin by fetuin-b. Biol. Chem., S Seite 4