Enzyme. Fermente = chemische Substanzen En - zym = in Hefe/Sauerteig ; Trypsin Buchner (1897) zellfreier Hefeextrakt produziert Alkohol

Transkript

1 Enzyme Pasteur (1850) force vitale Liebig (1850) Fermente = chemische Substanzen Kühne (1878) En - zym = in efe/sauerteig ; Trypsin Buchner (1897) zellfreier efeextrakt produziert Alkohol Fischer (1894) Schlüssel-Schloss-Prinzip Sumner (1926) Enzyme sind Proteine (Urease) Northrop & Kunitz (1930) Kristallisation von Trypsin, Chymotrypsin, Elastase Substratspezifität Wirkungsspezifität Stereospezifität geometrische Spezifität im Vergleich zu chemischen Katalysatoren: - höhere Geschwindigkeit - mildere Bedingungen - höhere Spezifität - regulierbar

2 Enzymklassifikation Dehydrogenasen Kinasen Amylase Carboanhydrase Prolin cis/trans Isomerase Aminoacylsynthetase EC Nummer: Beispiel Carboxypeptidase, eine Peptidyl-L-aminosäurehydrolase, EC ; EC = Enzyme Commission, 3 = Enzymklasse (ydrolasen), 4 = Unterklasse (Peptidasen), 17 = Unterunterklasse(Metallocarboxypeptidasen), 1 = Nummer des Enzyms in dieser Unterunterklasse

3 Enzym-Substratkomplex Schlüssel - Schloß Prinzip sind stereospezifisch

4 p-abhängigkeit von Enzymen

5 p-activity profile of astacin 6,4 log kcat/km 5,9 5,4 4,9 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 p

6 Carboanhydrase Metallionenkatalyse

7 Säure-Basekatalyse Mechanismus der Keto-Enol Tautomerisierung

8 Decarboxylierung von Acetoacetat über ein kovalentes Zwischenprodukt

9 katalytische Wirkung durch Nachbargruppeneffekte

10 Katalyse durch Stabilisierung des Übergangszustandes

11 Theorie des Übergangszustandes spontane Reaktion Enzyme binden nicht den Grundzustand besonders gut, sondern den Übergangszustand (ÜZ).

12 N N N + N `R R N N N + N `R R N N + N + R N `R N N N + N P `R R Peptid im Grundzustand Peptid im Übergangszustand ydrolysiertes Peptid Übergangszustand -Analogon

13 Katalytische Antikörper William Jencks (1969) Prinzip: Antikörper binden mit hoher Affinität an Peptide, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren, Lipide, usw. Sie binden den Grundzustand. Enzyme binden nicht den Grundzustand einer Struktur sondern den Übergangszustand. Dadurch erhöhen sie die Existenzdauer dieses Übergangszustandes und ermöglichen dadurch, dass eine Reaktion leichter ablaufen kann (Katalysatorfunktion).

14 Antikörper gegen den ÜZ -Immunisiert man ein Wirbeltier mit einem Analogon des ÜZ einer chemischen Reaktion, so erhält man Antikörper, die den ÜZ dieser Reaktion stabilisieren. - Dadurch können diese Antikörper als Katalysatoren wirken, weil sie die Wahrscheinlichkeit der Existenz des ÜZ erhöhen.

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17 Enzymkinetik

18 Enzymkinetik k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 d[p] v = = k 2 [ES] (1) dt d[es] = k 1 [E][S] - k -1 [ES]-k 2 [ES] (2) dt 1. Annahme: Gleichgewicht (enri, Michaelis, Menten) k -1 >>k 2 [E] t = [E] + [ES] (4) aus (2,3,4) k 1 ([E] t - [ES])[S] = (k -1 + k 2 )[ES] [ES](k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 1 [E] t [S] [E] t [S] k -1 +k 2 [ES] = (5) wobei K m = (6) K m +[S] k 1 k -1 [E][S] Ks = = k 1 [ES] 2. Annahme: Fließgleichgewicht (steady state) (Briggs, aldane) [ES] = const. d[es] = 0 (3) dt V max (5) in (1) d[p] k 2 [E] t [S] v = = k 2 [ES] = dt K m +[S] = k 2 [E] t V max [S] v = K m +[S]

19 Michaelis-Menten-Kinetik Michaelis-Menten Diagramm Lineweaver-Burk Diagramm V max [S] K m 1 1 v = 1/v = x + K m +[S] V max [S] V max

20 kinetische Parameter von Enzymen Umsatzzahl: Spezifitätskonstante (Geschwindigkeitskonstante 2. rd.) V max k cat k 2 =k cat = ; für[s]<<k m folgt: v = [S] [E] t [E] t K m k cat /K m =k 2 /K m =k 1 xk 2 /k -1 +k 2 ; max., wenn k 2 >> k -1 ; also wenn Produktbildung favorisiert ist vordekomp. des [ES]. Aber k 1 ist maximal so groß wie die Frequenz der Molekülzusammenstöße.

21 Enzymhemmung k 1 k 2 E + S ES E + P + k -1 + I I K ic K iu EI + S EIS keine Reaktion

22 Inhibitorkinetik V max [S] K m 1 1 v = ; 1/v = x + K m +[S] V max [S] V max V max [S] K m (1+[I]/Ki) 1 1 v = ; 1/v = x + K m (1+[I]/Ki) + [S] V max [S] V max

23 kompetitive emmung k 1 k 2 E + S ES E + P + k -1 I K ic EI

24 Gemischte emmung k 1 k 2 E + S ES E + P + k -1 + I I K ic K iu EI EIS Spezialfall: Kic = Kiu Nicht-kompetitive emmung Achtung: für den Spezialfall α = α, also K ic =K iu, liegt der Schnittpunkt der Geraden auf der x-achse, d.h. K m bleibt unbeeinflusst.

25 Unkompetitive emmung k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 + I K iu EIS

26 Reversible Enzymhemmung

27 Zink-ydrolase-Inhibitor Komplex Z-Pro-Lys-Phe-Ψ(P 2 )Ala-Pro-met K i =14µM Grams, F., Dive, V., Yiotakis, A., Yiallouros, I., Vassiliou, S., Zwilling, R., Bode, W. & Stöcker, W. Nature Struct. Biol. 3, (1996).

28 Konformationsänderung (Induced Fit) bei der Katalyse Grams, F., Dive, V., Yiotakis, A., Yiallouros, I., Vassiliou, S., Zwilling, R., Bode, W. & Stöcker, W. Nature Struct. Biol. 3, (1996).

29 Enzymkinetik

30 Slow Binding Inhibition P = v + ( v v )(1 e ) / s 0 s k app t k app

31 k off [] I 1 [] S / K ) k app = koff + kon /( + m

32 K = i k k off on 1 t 1 2 = k off + k I on [] o

33 k off [ EI ]/[ EI ] = e koff t 0

34 Inhibition of uman Meprin α by PLG-N v v i o [( ) ( ) ] 2 = 1 Io + Eo + Ki Io + Eo + Ki 4 Eo Io / 2 Eo 1 0,8 Meprin α Astacin Collagenase K i =0.45µM K i =16µM K i =40µM 0,6 V i /v 0 0,4 0, e-6 4e-6 6e-6 8e-6 1e-5 PLG-N [M]

35 Enzym-emmung durch Übergangszustand-Analoga P 4 P 3 P 2 P 1 P 1 P 2 P 3 P 4 k on k off K i t 1/2 [M -1 s -1 ][10-4 s -1 ][µm] (@[I]=K i ) CBZ-Pro-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro min CBZ-Pro-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Gly-Pro 580 CBZ-Pro-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro-Leu h CBZ-Pro-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Gly-Pro-Leu 11 CBZ-Pro-Lys-LysΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro-Leu-Val h FMC-Pro-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro-Leu-Val h FMC-Lys-PheΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro-Leu-Val min FMC-PheΨ(P 2 C 2 )Ala-Pro-Leu-Val min

36 Katalyse durch Zink-ydrolasen Glu93 Cys64 Glu93 Cys64 Glu93 Cys64 Glu93 Cys64 R N R Tyr149 R N R Tyr149 R N R Tyr149 Zn Zn Zn Zn is92 is96 is92 is96 is92 is96 is92 is96 is102 is102 is102 is102 + R + 3 N Tyr149 R

37 Radiationless Energy Transfer RET (FRET)

38 ES-Komplex

39 Tryptophan oder Dansyl Fluoreszenz

40 Quenched Fluorescent Substrate

41 Stopped Flow Kinetik

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