Peptide. Peptidbindung. (Adapted from the handouts of Prof. AG Beck-Sickinger, Leipzig)

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1 Peptide Peptidbindung Alanin Glycin (Adapted from the handouts of Prof. AG Beck-Sickinger, Leipzig)

2 Peptidbindung Bindungslänge in Å = - Kristallverband Gasphase 1,241 1,219 1,318 1,352

3 Dieder Winkel Φ und Ψ

4 -Ala-Leu-Gly-Lys-is-

5 -Ala-Leu-Gly-Lys-is- Acetylierung der Lys-Seitenkette -Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-is- + Acetyl, 3 -

6 Acetyl, 3 - -Ala-Leu-Gly-Lys-is- Acetylierung von -Terminus Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-is-

7 -Ala-Leu-Gly-Lys-is- 2 Säureamid -Ala-Leu-Gly-Lys-is- 2

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9 Verzweigte Peptide S

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11 yclopeptide und verzweigte Peptide

12

13 -Ala-Lys(tert.butyl-oxy-carbonyl)-Asp(tert.butyl)-Tyr(tert.butyl)-Leu-

14 Schema der Peptidsynthese Kondensation zur Kettenverlängerung -Terminus Peptidbindung + R 5 _ + R4 R 3 R2 R 1 _ -Terminus α-aminosäure Peptid

15 R2 R1 Aktivierung und Schutzgruppen R 2 R1 Aktivierung + R 2 _ + R1 _ R 2 R1 R 2 R1

16 Peptidsynthese hemische Aktivierung (Schutzgruppen) Enzymatische Aktivierung (keine Schutzgruppen)

17 α-schutzgruppen basenlabil Fmoc Boc säurelabil

18 -Schutzgruppen Ester Methyl-Ester tert. Butyl-Ester Benzyl-Ester Allyl-Ester alkalisch sauer hydrogenolytisch Pd(0)

19 Trifunktionelle Aminosäuren Lys 2 S ys 2 Tyr Gln Glu

20 Seitenketten-Schutzgruppen in der Fmoc-Strategie (säurelabil, basenstabil) R R R R 3 S R = Peptid tert. butyloxycarbonyl Boc tert. butyl tbu trityl Trt pentamethylchromansulfonyl Pmc Lys, rn, Trp Tyr, Thr, Ser Glu, Asp is, ys, Asn, Gln Arg ohne Schutzgruppe: Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val

21 Fmoc-Ala- -Gly-Bzl Aktivierung, Kupplung 2 R 2 2 Fmoc-Ala-Gly-Bzl

22 Reagenzien zur Aktivierung BF 4 _ DI TBTU Bt

23 Mechanismus der Aktivierung + R + R 1-ydroxybenzotriazol _ DI -Acylisoharnstoff R + 2 R` R R` + Aktivester Peptidbindung

24 Uronium-Aktivierungsreagenzien BF 4 PF X mit R = TBTU (X=) BTU (X=) ATU (X=) R P P PF 6 PF PyBP (X=) BP (X=)

25 Fmoc-Ala- -Gly-Bzl Aktivierung, Kupplung 2 R 2 2 Fmoc-Ala-Gly-Bzl

26 -Schutzgruppen Ester Methyl-Ester tert. Butyl-Ester Benzyl-Ester Allyl-Ester 1963: Festphasenpeptidsynthese Merrifield (obelpreis 1978): Polymer

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28 2 ( 2 2 ) n 2 2 X Poly(ethylenglykol)-Spacer Polystyrol- Matrix Funktionelle Gruppe

29 Festphasensynthese von Peptide, Proteine und Peptidmimetika Synthese Polymerträger Peptidketten gebunden am Polymerträger Linker E D P Linker L Kupplungsreagenzien G Linker Linker Linker Linker

30 Linker Festphasensynthese Ankergruppe: hlorid, Alkohol Linker Linker l l (Pg)(R) Base l l ()(R)(Pg) Synthese 2. Abspaltung mit 1 % TFA [(R)] n 2-hlortrityl hlorid Me (Pg)(R) Aktivierungsreagens, Base Me ()(R)(Pg) Synthese 2. Abspaltung mit 1-5 % TFA [(R)] n 4-ydroxymethyl-3- Methoxyphenoxybuttersäure Benzhydrylamin ()(R)(Pg) 4-Benzyloxybenzyl Alkohol (Pg)(R) Aktivierungsreagens, Base Synthese 2. Abspaltung mit > 80 % TFA [(R)] n

31 Linker Festphasensynthese Ankergruppe: Amin Linker Linker 2 2 (R)(Pg) (Pg)(R) Synthese Amino-xanthen-3- yloxy Aktivierungsreagens, Base 2. Abspaltung mit 1 % TFA [(R)] n 2 (R)(Pg) 2 Me (Pg)(R) Me Synthese Me Aktivierungsreagens, Base Me 2. Abspaltung mit > 5 % TFA [(R)] n 2 4-(2,4 -Dimethoxyphenylaminomethyl-phenoxy

32 Linker Festphasensynthese Ankergruppe: Aldehyd Linker Linker Me Me 4-Formyl-3- methoxyphenoxy R 2 /TMF DM/aB(Ac) 3 R /At/DI R R S 2 l/tea Me R R Me 25 % TFA 5 % TFA R S R R R S R R

33 Linker Festphasensynthese Ankergruppe: Sulfamyl Linker Linker ( 2 ) 3 S 2 R/DI/MeIm ( 2 ) 3 S R 4-Sulfamyl-butyryl I 2 /DIPEA ( 2 ) 3 S R R 2 R S R - R R R SR R R R

34 2 R Fmoc-Aminosäure - A Polymer Polymer mit Anker Aktivierung, Beladung des Polymers 2 R A Polymer

35 2 R A Polymer Piperidin Abspaltung der α-schutzgruppe R A Polymer

36 Mechanismus der Fmoc-Abspaltung 2 R + _ 2 + _ 2 R arbanion _ 2 + R _ 2 2 Dibenzofulven arbaminsäure- Anion + R = Peptid 2 R

37 2 R R A Polymer Fmoc-Aminosäure Aktivierung, Kupplung 2 R R A Polymer Fmoc-geschütztes, Dipeptid am Polymer

38 Synthese yclus Polymer Deblockieren Aminosäure Abspaltung Kupplung Aktivierung Peptid

39 Schema der Fmoc-Strategie Trifluoressigsäure t-bu Boc A Polymer 2 Peptid Piperidin Trifluoressigsäure

40 Schema der Boc-Strategie F, TFMSA Z Ada 3 3 Peptid A Polymer 3 Trifluoressigsäure F

41 Automatisierung der SPPS (Festphasen-Peptidsynthese) polymerer Träger: - filtrieren, statt kristallisieren - auswaschen der Reagenzien - hoher Ueberschuss an Reagenzien Probleme: Fehlsequenzen, ähnliche Peptide gute Analytik nötig (PL)

42 Syntheseprotokoll 1. Quellen den arzes: 2. Waschen mit DMF: 3. Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe: 30 % Piperidin in DMF 4. Waschen mit DMF 5. Kupplung der Aminosäure 10-facher Ueberschuss Aminosäure TBTU/Bt/Diisopropylethylamin 6. Waschen mit DMF 7. Waschen mit Ether 8. Trocknen mit Stickstoff 10 min 2 x 5 min 2 x 10 min 8 x 5 min 2 x 30 min 6 x 5 min 2 x 5 min 20 min

43 Multiple Peptidsynthese gleichzeitige, parallele Synthese von vielen Peptiden Bedingung: Festphasensynthese Vorteile: rasch viele, unterschiedliche Peptide kleiner Ansatz, günstig Fmoc-Abspaltung, Waschschritte gemeinsam, Kupplung selektiv achteile: keine Synthesekontrolle möglich Aufarbeitung und Analytik aufwendig

44 Synthesizer für Parallel-Peptidsynthese