Die Staudinger-Ligation

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1 Die Staudinger-Ligation -ein Geschenk für die chemische Biologie Von C. Erger, M. Marek, T. ein, K. einsberg 1

2 Inhalt Staudinger eaktion Staudinger Ligation Anwendungen Peptidligation Synthese von Biokonjugaten Metabolisches Zell-Engineering 2

3 ermann Staudinger ( ) xalylchlorid, zonisierung, Autoxidation, aliphatische Diazoverbindungen, Explosionen, Pyrethrin, synthetische Pfeffer- und Kaffeearomen, Arbeiten über Makromoleküle, organische Kolloide Staudinger Index 1953 obelpreis in Chemie für die Entdeckungen in der makrolekularen Chemie 3

4 Die Problematik Verknüpfung zweier molekularer Einheiten Komplexe biologische Systeme Vielzahl von funktionellen Gruppen Funktionalität der biologischen Systeme hängt von äußeren Parametern ab (p-wert, Temperatur, ) 4

5 Ziel der Synthese ur zwei funktionelle Gruppen sollen miteinander reagieren, die wechselseitig selektiv sind Möglichst in wäßrigem Milieu Tolerieren von anderen funktionellen Gruppen bzw. Vermeidung von Schutzgruppen 5

6 Vorteile der Azidogruppe Fast kein natürliches Vorkommen in Molekülen (Bioorthogonalität) ohe ukleophilie, aber trotzdem eine hohe Selektivität Kleines Volumen 6

7 Die Staudinger eaktion 7

8 Staudinger eaktion P P + 2 Azide Triarylphosphane Iminophosphorane M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

9 Mechanismus P P P Azid - 2 Aza-Ylid P 1 P 1 == Triarylphosphan M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

10 Wittig-eaktion 2 Ph P Ph Ph + X 1 Ph 3 + P 1 Base Ph 3 + P C C + Ph 3 P 1 Ph 3 P PPh Betain xophosphetan 10

11 eaktionsvarianten (1) P 1 P P 2-3 P M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116, v 11

12 eaktionsvarianten (2) P 1 P P C P C M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

13 Die Staudinger-Ligation 13

14 Übersicht Chemoselektive Ligationsmethoden ative chemische Ligation ichtspurlose Staudinger-Ligation 14

15 Chemoselektive Ligationsreaktion Kupplung von zwei ausschließlich miteinander reagierenden funktionellen Gruppen in wässriger Umgebung 15

16 ative chemische Ligation S 2 S S B. ilsson, L. Kiessling,. aines, rg. Lett. 2000, 2,

17 Arbeit von Bertozzi Ziel: Verständnis der Kommunikation von Zellen untereinander und mit der sie umgebenden Matrix Methode: Anbringen einer Sonde an einer Zelloberfläche durch chemoselektive Ligationsreaktionen 17

18 ydrazonligation C Probleme: Limitierung der Länge und des sterischen Anspruchs der eingeführten Substituenten eaktivitätsmaximum bei zu niedrigem p (6.5) C 2 C C. ang, C. Bertozzi, Acc. Chem. es. 2001, 34,

19 Staudinger-eaktion Zur Erinnerung: ydrolyse in wässriger Lösung P P P 2 M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

20 Lösung des Problems Einführung einer elektrophilen Falle in den Liganden 3 C 1% Pd(Ac) 2 3 C 1) a 2 3 C PPh 2 Ph 2 P Et 3, Me I Cl / 2 2) KI, % 57% intramolekulare Cyclisierung 20

21 ichtspurlose Staudinger-Ligation 3 C Probe PPh Probe P Ph Ph Sonde Sonde 2 Sonde M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

22 Spurlose Staudinger-Ligation Ph Ph X P ' P X Ph Ph ' X Ph P Ph S Ph Ph 2 P 2 P PPh Ph 2 2 P S M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

23 Anwendungen 1. Peptidligation 23

24 Peptidbildung Bt (1eq) DCC (1eq) 3 C Ph 2 P(C 2 )S (1eq) DMF, T C 3 S PPh 2 3 Ph TF/ 2 (3:1) T, 12 h % C 3 Ph 24

25 Totalsynthese von Proteinen erstellung kürzerer Peptidfragmente durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) Kombination der Fragmente zu fertigen Proteinen mit chemoselektiven Ligationsmethoden mildeste Möglichkeit, die keine bestimmte Funktionalität der AS-este erfordert: Staudinger-Ligation 25

26 Totalsynthese des Proteins Ase A SPPS Ase A ( ) Abspaltung vom arz Ase A ( ) S PPh 2 Ase A ( ) SPPS 3 Ase A ( ) ma-translation Ase A (1-109) S + Cys Ase A ( ) native chemische Ligation Ase A (1-124) M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

27 erstellung mittelgroßer Lactame Synthese mittlerer inge: entropisch ungünstig 3 C 2 DABC 2 Mechanistische Problemlösung: Darstellung großer inge mit anschließender intramolekularer ingverkleinerung 27

28 Anwendungen Synthese von Biokonjugaten 28

29 Biokonjugate eportergruppen (z.b. Farbstoffe oder andere Erkennungsmotive) werden mit biologischen Proben bzw. Biopolymeren verknüpft 29

30 Markierung von Proteinen C 3 P P 2 C KDDDDKYD C KDDDDKYD 3 3 Protein-Expression Azido-mDF P C 3 nicht fluoreszierend P M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116, fluoreszierend 30

31 Anwendungen Metabolisches Zell-Engineering 31

32 Metabolisches Zellengineering Untersuchung an der lebenden Zelle oder einzelner Kompartimente Inkubation / Substratvorlage Metabolisierung achweis der Produkte 32

33 Glykosyltransferasen Polypeptid- Glykosyltransferasen 24 Enzymisoformen Substratabhängigkeit 33

34 Durchführung Substrat abfangen Proteinglykosylierung Anbindung des Flag-Peptids achweis mit P 34

35 1. Substrate abfangen C 2 BITI C 2 M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116, BITI eutr-avidin-beschichtete Mikrotiterplatte 35

36 2. Proteinglykosylierung -Glykolysierung an Serin oder Threonin Erster Baustein: UDP--Acetylgalactosamin (UDP-GalAc) 36

37 Austausch gegen UDP--Azido- Acetylgalactosamin (UDP-GalAz) 3 37

38 C 2 BITI ppgalacts BITI C M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

39 3. Anbindung des Flag-Peptids Staudinger-Ligation 3 C 2 BITI P Me M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116, C DYKDDDK 39

40 C DYKDDDK Ph P Ph C 2 BITI M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

41 Flag-Erkennung P α FLAG FLAG Ph P Ph C 2 BITI 41

42 2 450 nm 4. achweis P α FLAG FLAG Quantifizierung durch Strahlung bei 450 nm Ph P Ph C BITI M. Köhn,. Breinbauer, Angew. Chem. 2004, 116,

43 Anwendungsmöglichkeiten Erkennung von Substratspezifität Auch in der lebender Zelle Analyse von Mechanismen und Strukturen Indirekte Charakterisierung von Krankheiten oder Defekten 43

44 Überblick Staudinger eaktion (wittiganalog, mild) Staudinger-Ligation (chemoselektiv, keine bestimmte Funktionalität) Anwendungen: - Peptidligation (Proteinsynthese) - Biokonjugate (Markierung von Biomolekülen) - Metabolisches Zell-Engineering (Verständnis von biologischen Abläufen in Zellen) 44