Praktikum. Enzymkinetik am Beispiel der Protease Trypsin

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Daniel Breiner
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1 Praktikum Methoden der molekularen Biowissenschaften Teil 1: Biochemie Enzymkinetik am Beispiel der Protease Trypsin Prof. Walter Nickel Biochemie-Zentrum der Universität Heidelberg

2 Thermodynamische Eigenschaften einer chemischen Reaktion 1. Spontanität einer Reaktion Änderung der freien Energie ΔG (ΔG = ΔH - TΔS) zwischen Edukten und Produkten während einer chemischen Reaktion: ΔG = 0 => Reaktion im Gleichgewicht ΔG < 0 => Reaktion verläuft spontan (exergonische Reaktion) ΔG > 0 => Reaktion kann nicht spontan verlaufen (endergonische Reaktion) ΔG errechnet sich aus der freien Energie der Produkte minus der freien Energie der Edukte ΔG ist unabhängig vom Reaktionsweg (Reaktionsmechanismus) (Bsp. Glucose-Umwandlung zu CO 2 + H 2 O in vitro und in vivo) ΔG enthält keine Information über die Geschwindigkeit, mit der eine Reaktion abläuft 2. Reaktionsgeschwindigkeit Abhängig von der Energiemenge, die benötigt wird, um die Reaktion der Edukte zu den Produkten zu initiieren (Aktivierungsenergie)

3 Mathematische Definition der Änderung der freien Energie ΔG ΔG hängt vom chemischen Gleichgewicht von Edukten und Produkten sowie von deren Konzentrationen zu Beginn der chemischen Reaktion ab Mit ΔG 0 = Änderung der freien Energie bei einer Ausgangskonzentration von 1M für Edukte und Produkte R T = Gaskonstante = Temperatur

4 Beziehung zwischen der Änderung der freien Energie ΔG und der Gleichgewichtskonstante K eq einer chemischen Reaktion ΔG = ΔG 0 + RT x ln [C] [D] [A] [B] Reaktion im Gleichgewicht: => ΔG = 0 => ΔG 0 = - RT x ln [C] [D] [A] [B] Definition der Gleichgewichtskonstante K eq : K eq = [C] [D] [A] [B] ΔG 0 = - RT x ln K eq K eq = 10 -ΔG 0 /1,36 Das Gleichgewicht (K eq ) einer chemischen Reaktion lässt sich unmittelbar aus ΔG 0 berechnen bzw. aus der experimentellen Bestimmung des Gleichgewichts einer chemischen Reaktion lässt sich ΔG 0 berechnen

5 Ich denke, dass es sich bei den Enzymen um Moleküle handelt, die zu den aktivierten Komplexen der Reaktionen, die sie katalysieren, komplementär sind, das heisst, zu einer molekularen Konfiguration, die eine Zwischenstufe zwischen den reagierenden Substanzen und den Produkten einer Reaktion bildet. Die Anziehung, die die Enzymmoleküle auf den aktivierten Komplex ausüben, führt so zu einer Verminderung seiner Energie und damit zu einer Verringerung der Aktivierungsenergie der Reaktion und somit auch zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit Linus Pauling, Nature 161 (1948), S. 707 The Nature of the Chemical Bond and the Structure of Molecules and Crystals Nobelpreis für Chemie in 1954 Friedensnobelpreis 1962

6 Enzyme erniedrigen die benötigte Aktivierungsenergie durch die Stabilisierung des Übergangszustandes einer chemischen Reaktion Durch die Bindung des Enzyms an den Übergangszustand wird dieser stabilisiert und demzufolge die für die Reaktion aufzubringende freie Energie gesenkt

7 Zusammenfassung => Enzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit durch das Herabsetzen der für die Initiation der chemischen Reaktion notwendigen freien Aktivierungsenergie => Enzyme beschleunigen die Einstellung des durch die Edukte und Produkte vorgebenen chemischen Gleichgewichts => Enzyme haben keinen Einfluss auf das Equilibrium einer Reaktion und können somit beide Reaktionsrichtungen gleichermassen beschleunigen

8 Durch Enzyme katalysierte chemische Reaktionen: => Enzyme sind substrat- und reaktions-spezifisch

9 Die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes stellt den ersten Schritt der enzymatischen Katalyse dar k 1 E + S ES Pre-steady state k 1 k E + S ES 2 E + P Steady state k -1 (Fließgleichgewicht) k 1 k 2 E + S ES E + P Equilibrium k -1 k -2 (Thermodynamisches Gleichgewicht)

10 Kinetik der Konzentrationsänderung von Substrat, Produkt, Enzym und Enzym-Substrat-Komplex [mm] [min]

11 Bestimmung der initialen Reaktionsgeschwindigkeit v 0 bei verschiedenen Substratkonzentrationen [µmol] [min] Konstant: [E], T, ph, [Salz]

12 Michaelis-Menten Modell: ein spezifischer ES-Komplex ist ein obligatorisches Intermediat der katalysierten Reaktion [µmol x min -1 ] Enzymkonzentration konstant Bei niedrigen Substratkonzentrationen ist die initiale Reaktionsgeschwindigkeit v 0 proportional zur Substratkonzentration Bei hohen Substratkonzentrationen ist die initiale Reaktionsgeschwindigkeit v 0 unabhängig von der Substratkonzentration [mm] k 1 k E + S ES 2 E + P k -1

13 Die Michaelis-Menten Gleichung [S] v 0 = v max [S] + K m mit K m als die Substratkonzentration, bei der eine halb-maximale Geschwindigkeit erreicht wird => bei [S] << K m => v 0 ist proportional zu [S] [µmol x min -1 ] => bei [S] >> K m => v 0 ist unabhängig von [S] => bei [S] = K m => v 0 ist halbmaximal => K m ist unabhängig von [E] v max [mm] => K m ist ein Maß für die Affinität des Substrates zum Enzym

14 Experimentelle Bestimmung von v max und K m : 1 v 0 = 1 v max + K m v max x 1 [S] [min x µmol -1 ] [mm -1 ] Doppeltreziproker Lineweaver-Burk-Plot: lineare Darstellung => Extrapolation

15 Kompetitive und nicht-kompetitive Hemmung von Enzymen

16 Veränderung kinetischer Konstanten in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors [min x µmol -1 ] [min x µmol -1 ] [mm -1 ] [mm -1 ] V max bleibt unverändert, K m wird grösser die Affinität zum Substrat nimmt ab

17 Veränderung kinetischer Konstanten in Gegenwart eines nicht-kompetitiven Inhibitors [min x µmol -1 ] [min x µmol -1 ] [mm -1 ] [mm -1 ] V max wird kleiner, K m bleibt unverändert die Affinität zum Substrat bleibt unverändert

18 Struktur des Chymotrypsins Katalytische Triade

19 Katalysemechanismus des Trypsins (gemischte Katalyse) Oxyanion Acylenzym

20 N-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als artifizielles Substrat für die Bestimmung der Trypsinaktivität Trypsin + H 2 O

21 Definitionen der Enzymaktivität Reaktionsgeschwindigkeit: Stoffumsatz pro Zeiteinheit 1 Unit (1 U) = 1 µmol Substratumsatz / min Volumenaktivität: Reaktionsgeschwindigkeit relativ zur eingesetzten Enzymmenge in Volumeneinheiten => U/ml Spezifische Aktivität: Reaktionsgeschwindigkeit relativ zur eingesetzten Enzymmenge in Proteinmasse => U/mg

22 Prinzip der Absorptionsphotometrie Definition: Indirekte Bestimmung der Absorption durch Messung der Transmission S = Lichtstreuung T = Transmission A = Absorption Voraussetzung: transparente Lösung mit vollständig gelösten Teilchen Es gilt: die Absorption ist proportional zur Konzentration der gelösten Teilchen => Lambert Beer Gesetz

23 Grundlagen zum Lambert-Beer Gesetz Transmission T = I I 0 Ausfallende Strahlungsintensität Einfallende Strahlungsintensität Bouguer-Experiment (1729): => die Transmission nimmt beim Passieren der Lösung exponentiell ab

24 Das Lambert-Beer Gesetz Beer: die Transmission ist umgekehrt proportional zur Konzentration der gelösten Substanz: T = 10 -a x c x d Beziehung zwischen Absorption und Transmission: A = - log T (=> 10% Transmission entspricht einer Absorption von 1; 1% Transmission entspricht einer Absorption von 2) = - log (10 -a x c x d ) = a x c x d a = Absorptionskoeffizient c = Konzentration des gelösten Stoffes d = Schichtdicke I 0 => E = log = ε [mm -1 x cm -1 ] x c [mm] x d [cm] I => die Absorption (= Extinktion) ist dimensionslos => Der molare Extinktionskoeffizient ε ist eine Substanz-spezifische Grösse, die darüber hinaus von Lösungsmittel, Temperatur und Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes abhängt

25 Schritt 1: Proteingehaltsbestimmung der Trypsin-Stammlösung: - Eichgerade mit Rinderserumalbumin (6 Werte) erstellen - 3 Verdünnungen der Trypsin-Stammlösung; Reaktionsansätze gemäß Script herstellen - Extinktion ΔE546 (Leerwert!!) bestimmen und aus Eichgerade die Proteinkonzentration der Stammlösung bestimmen => Ergebnis: X mg Gesamtprotein/ml Versuchsdurchführung Schritt 2: Bestimmung einer Trypsin-Konzentration, die für die Aufnahme der Enzymkinetiken geeignet ist: - bei einer BAPNA-Konzentration von 0,5 mm wird ΔE/min für verschiedene Trypsin-Verdünnungen bestimmt. Verdünnung auswählen, die ein ΔE/min von 0,05 bis 0,1 ergibt Schritt 3: Aufnahme der Enzymkinetiken - 5 verschiedenen BAPNA-Konzentrationen (0,2 bis 1 mm) und geeignete Trypsin-Verdünnung zur kinetischen Bestimmung von ΔE benutzen (alle 30 sec über insg. 5 min) - Graphische Auftragung von ΔE (Ordinate) gegen t (min, Abszisse) - Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit v 0 aus der Anfangssteigung der Kurve => für jede Substratkonzentration wird v 0 (= ΔE/min) bestimmt Schritt 4: Erstellung des Lineweaver-Burk-Plots zur Bestimmung von v max und K m - Berechnung von 1/v 0 [min] und 1/[BAPNA] [mm -1 ] - Graphische Auftragung von 1/v 0 (Ordinate) gegen 1/[BAPNA] (Abszisse) - Bestimmung von v max [1/min] und K m [mm] aus den Achsenschnittpunkten - Umrechnung von v max in [µmol/min]: ε kann aus Abb. 10 (Skript, Seite 54) berechnet werden Schritt 5: Berechnung der Volumenaktivität und der spezifischen Aktivität - Volumenaktivität: v max / Vol. der eingesetzten Trypsin-Stammlösung (ml) => µmol x min -1 x ml -1 (= U/ml) - Spezifische Aktivität: Volumenaktivität (U/ml) / Proteinkonzentration (mg/ml) => µmol x min -1 x mg -1 (= U/mg) Schritt 6: Hemmung der Trypsinaktivität durch AEBSF und Benzamidin => handelt es sich bei AEBSF und Benzamidin um kompetitive oder nicht-kompetitive Hemmstoffe?

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