4.1. Eigenschaften von Enzymen

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1 4. Enzyme 106

2 Eigenschaften von Enzymen Enzyme sind Proteine, die chemische Reaktionen beschleunigen (Biokatalysatoren) Herausragende Merkmale verglichen mit anderen Katalysatoren: drastische Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit (RG) bis fach gegenüber der unkatalysierten Reaktion (andere Katalysatoren: bis fach) hohe Reaktionsspezifität bzgl. Substrat und Reaktionstyp jedes Enzym katalysiert meist nur einen bestimmten Reaktionstyp zwischen bestimmten Molekülen die Katalyseaktivität ist regulierbar Katalysegeschwindigkeit kann reversibel schneller oder langsamer oder abgeschaltet werden Zentrale Frage des Kapitels: Wie funktionieren Enzyme?

3 Klassifizierung der Enzyme 108

4 Chemische Reaktionskinetik = Lehre von der Geschwindigkeit chemischer Reaktionen Definition der Geschwindigkeit v einer chemischen Reaktion (Edukte Produkte) v = - d [Edukt] dt = d [Produkt] + dt Die Eduktmoleküle reagieren umso schneller miteinandfer, je höher ihre Konzentrationen sind; Beispiel: für die Reaktion A + B C + D gilt v α [A] und v α [B] ist proportional zu v = k [A] [B] Reaktionsgeschwindigkeitskonstante (RG-Konstante)

5 110 Die RG-Konstante ist ein für jede Reaktion spezifischer Parameter, der von den Eigenschaften der reagierenden Moleküle (chemische und räumliche Struktur), dem Reaktionstyp (Umordnung von Bindungen) und der Temperatur (Bewegungsgeschwndigkeit der Moleküle) abhängt; Es gilt die Arrhenius Gleichung k = A e A: Frequenzfaktor ΔG : Aktivierungsenergie T: absolute Temperatur (in K) R: Gaskonstante (8,314 J K -1 mol -1 ) Frequenzfaktor A hängt von der 3D Struktur der Eduktmoleküle ab; er ist umso größer je wahrschenlicher es ist, dass ein Zusammenstoß der Eduktmoleküle zur Reaktion führt Aktivierungsenergie ΔG hängt von den Bindeungsenergien in den an der Reaktion beteiligten funktionellen Gruppen ab; sie ist umso größer, je mehr Energie benötigt wird, um die Bindungen in den funkt. Grupen der Eduktmoleküle aufzubrechen.

6 4.3. Prinzipien der Enzymkatalyse Enzyme erhöhen den Wert der RG-Konstante k (und damit v) durch: Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass Eduktmoleküle in einer Orientierung zusammentreffen, die zur Reaktion führt (korrekten Orientierung) Erhöhung des Freqzuenzfaktors A Absenkung der Energie die notwendig ist, um die für die Reaktion notwendigen Bindungen in den funktionellen Gruppen der Edukte aufzubrechen Verringerung der Aktivierungsenergie ΔG Wie wird die Erhöhung des Frequenzfaktors A erreicht? Die Oberflächen des aktiven Zentrums (active site) des Enzyms und der Reaktanden (Substrate) passen so zueinander, dass die Reaktanden nur in derjenigen Orientierung an das aktive Zentrum binden können, die für die chemische Reaktion am geeignetsten ist strukturelle Komplementarität zwischen Enzym und Reaktanden (key-lock, induced fit) Bindung und optimale Ausrichtung der Substratmoleküle im aktiven Zentrum durch strategische Positionierung funtioneller Gruppen im aktiven Zentrum 111

7 112 Strukturelle Komplementarität der Oberflächen von Enzym und Substratmolekülen Schlüssel-Schloss (key-lock) Model (Emil Fischer, 1890) Induced-fit Model (Daniel Koshland, 1958)

8 113 Effekt der Ausrichtung der Reaktanden Fiktives Beispiel: Damit eine chemische Reaktion (= Umordnung von kovalenten Bindungen) zwischen Reaktand 1 und Reaktand 2 stattfinden kann, müssen sich beide Moleküle genau so zueinander orientieren, dass gleichzeitig folgende Bedingungen erfüllt sind: Moleküleil A (Reaktand 1) nahe Molekülteil C (Reaktand 2) Moleküleil B (Reaktand 1) nahe Molekülteil D (Reaktand 2) Die funktionellen Gruppen der Reaktanden A und B (-OH, -CH 3, +) müssen weitestmöglich entfernt voneinander sein Optimale Orientierung Ungünstige Orientierungen (Auswahl) Reaktand 2 Reaktand 1 X X X Produkte Keine Produkte Keine Produkte Keine Produkte

9 Strategische Positionierung funktioneller Gruppen im aktiven Zentrum 114 Strategisch positionierte funktionelle Gruppen im aktiven Zentrum des Enzyms sind verantwortlich für: reversible Bindung der Substratmoleküle an das Enzym optimale Ausrichtung der Substramoleküle relativ zueinander

10 115 Chemische Reaktionen bedürfen immer der Zufuhr von Energie, um ablaufen zu können; Grund: es müssen zunächst bestehende Bindungen gebrochen werden bevor sich neue Bindungen ausbilden können Der energiereichste Zustand der Reaktanden im Verlauf der Reaktion heißt Übergangszustand (transition state); wird symbolisiert durch Dem zum Erreichen des Übergangszustandes notwendigen Energiebetrag bezeichnet man als Aktivierungsenergie (activation energy) ΔG Darstellung der Reaktion im Energie-Reaktionsdiagramm Übergangszustand (fiktives Beispiel)

11 116 Wie können Enzyme die Aktivierungsenergie einer Reaktion verringern? (a) Nicht-kovalenter Mechanismus: Strategisch positionierte funktionelle Gruppen (i.d.r. Dipole und/oder ionische Gruppen) im aktiven Zentrum wechselwirken mit Dipolen und Ladungen, die im Übergangszustand aber nicht im Ausgangszustand vorhanden sind Übergangszustand im aktiven Zentrum (fiktives Beispiel) A-B + C-D A-C + B-D

12 117 (b) Kovalenter Weg: das aktive Zentrum bewirkt eine Veränderung der Reaktionsweges durch Protonierung und Deprotonierung (Säure-Base Katalyse) der Substratmoleküle, oder durch das Ausbilden temporärer kovalenter Bindungen von funktionellen Gruppen des Enzyms mit den Reaktanden A-B + C-D A-C + B-D

13 Beispiel zur Säure-Base Katalyse: Enolase (Enzym des Glykolyse-Wegs) Gesamtreaktion: 2-Phosphoglycerat Phosphoenolpyruvat Reaktionsmechanismus: Binden und Ausrichten des Substrats im aktiven Zentrum des Enzyms Einleiten der Reaktion durch Deprotonierung des a-c-atoms Erleichterung der Eliminierungsreaktion durch Protonierung der OH-Gruppe 118

14 119 Beispiel zur Säure-Base Katalyse: Enolase (Enzym des Glykolyse-Wegs) Eliminierung der OH-Gruppe durch Abpspaltung als H 2 O Wiederherstellung des Ausgangszustandes des Enzyme durch Protonenaustausch zwischen Lys 345 und Glu 211

15 Aminosäurereste für die Säure-Base Katalyse 120

16 Beispiel zur Katalyse durch kovalente Bindung des Substrats an das Enzym: Serin Proteasen (Enzyme für Proteinabbau) Gesamtreaktion: Katalytische Triade im aktiven Zentrum des Enzyms: drastische Verringerung des pk a -Werts der OH-Gruppe von Serin 121

17 122 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 1 Bindung und Orientierung des ersten Substrat-Moleküls (Protein) im aktiven Zentrum

18 123 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 2 Kovalente Bindung des Substrats an das Enzym

19 124 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 3 Spaltung der Peptidbindung und Freisetzung des ersten Produktmoleküls (Peptid 1)

20 125 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 4 Bindung und Orientierung des zweiten Substratmoleküls (H 2 O) im aktiven Zentrum

21 126 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 5 Angriff von H 2 O auf die Bindung zwischen Enzym und Substrat

22 127 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 6 Spaltung der kovalenten Bindung zwischen Enzym und Substrat

23 128 Katalysemechanismus von Serin Proteasen: Schritt 7 Freisetzung des zweiten Produktmoleküls (Peptid 2)

24 Energetik im aktiven Zentrum des Enzyms (I) 129 Um welchen Betrag muss die Aktivierungsenergie einer Reaktion durch ein Enzym abgesenkt werden, damit sie 1 Million-fach beschleunigt abläuft? v enzymatisch v = k enzymatisch [Substrat 1] [Substrat 2] k [Substrat 1] [Substrat 2] für den Betrag der Absenkung der Aktivierungsenergie gilt: DDG cat = DG - daraus folgt: = DG enzymatisch A enzymatisch e A e v enzymatisch v = A enzymatisch A e erfahrungsgemäß ist A enzymatisch A < 10 Reaktionsbeschleunigung durch das Enzym ist überwiegend auf Absenken der Aktivierungsenergie zurückzuführen

25 Energetik im aktiven Zentrum des Enzyms (I) Mit der Annahme, dass A enzymatisch A vernachlässigbar klein (<10) ist, folgt: v enzymatisch / v DDG (kj mol -1 ) , , , , , , ,87 bei T = 310,15 K (37 C) Vergleich: H-Brückenbindung 20 kj mol -1 Ionenbindung 86 kj mol -1 Stabilisierung des Übergangszustandes durch 1-2 H-Brücken erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit ca. 1 Million-fach 130

26 4.4. Enzykinetik nach Michaelis und Menten Zeitabhängige Veränderung der Produktkonzentration bei chemischen Reaktionen (unkatalysierte und katalysierte Reaktionen) die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamt sich mit zunehmender Zeit, da die Edukt-/Substrat-Konzentration stetig abnimmt Definition: Die Anfangsgeschwindigkeit einer Reaktion v o ist die Produktabnahme mit der Zeit am Start der Reaktion (d.h. Tangente an die [P]-t Kurve im Punkt t = 0) ( d[p] Edukt-/Substrat-Konzentration am v 0 = dt t=0 Beginn der Reaktion: [S] 0 ( Zeit t 131

27 132 Die Anfangsgeschwindigkeit v 0 einer Reaktion ist abhänging von der Anfangskonzentration der Substrate [S] 0 für unkatalysierte Reaktionen für katalysierte Reaktionen v max Löslichkeitsgrenze des Substrats v max Substratsättigung Substratsättigung ist derjenige [S] 0 Wert, ab dem eine weitere Erhöhung von [S] 0 keine Erhöhung von v 0 der enzymkatalysierten Reaktion bewirkt v 0 = v max ; Substratsättigung eines Enzyms wird i.d.r. Bereits [S] 0 weit unterhalb der Löslichkeitsgrenze der Substrate erreicht

28 Wie lässt sich der Verlauf der v 0 - [S] 0 Kurve einer enzymkatalysierten Reaktion erklären? Michaels-Menten Modell für enzymkatalysierte Reaktionen (1913) k 1 E + S ES E + P k. 1 Enzym Substrat Enzym-Substrat k 1, k -1, k 2, k -2 k 2 k -2 Komplex sind RG-Konstanten für die Reaktionen, die zur Bildung Enzym Produkt bzw. den Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes führen Gleichung 1: Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen d[p] v = = k 2 [ES] - k dt -2 [E] [P] Geschwindigkeit des Zerfalls des ES-Komplexes zu Produkt und freiem Enzym Geschwindigkeit der Bildung des ES-Komplexes aus Produkt und freiem Enzym Gleichung 2: Geschwindigkeit der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes d[es] dt = k 1 [E] [S] - k -1 [ES] - k 2 [ES] + k -2 [E] [P] Geschwindigkeit der Bildung des ES-Komplexes aus Substrat und freiem Enzym Geschwindigkeit des Zerfalls des ES-Komplexes zu Substrat und freiem Enzym Siehe Gl. 1 Siehe Gl

29 Zeitabhängigkeit der Reaktandenkonzentationen in enzymkatalysierten Reaktionen 134 [E] ges Zustand des Fließgleichgewichts [E] ges

30 Näherungen: Die Bildung der Produkte verläuft viel langsamer als die Bildung des ES- Komplexes aus den Substraten und freiem Enzym k 1, k -1 >> k 2 Am Beginn der Reaktion (v 0, [S] 0 ) ist die Geschwindigkeit der Rückreaktion vernachlässigbar klein k -2 [E] [P] 0 Im Zustand des Fließgleichgewichts (stellt sich kurz nach Start der Reaktion ein) halten sich die Geschwindigkeiten von Bildung und Zerfall des ES Kompexes die Waage Definition: d[es] dt 0 k -1 +k 2 k 1 = K M Michaelis-Menten Konstante Durch Einbeziehung der Näherungen und der Definition für KM folgt aus den Gleichungen 1 und 2 nach Umformung die Michaelis-Menten (MM) Gleichung v 0 = v max [S] 0 K M + [S] 0 Die Michaelis-Menten (MM) Gleichung beschreibt den hyperbolischen Verlauf des v 0 -[S] 0 Diagramms, das die Reaktionen vieler (nicht aller!) Enzyme zeigen 135

31 v 0 -[S] 0 Diagramm enzymkatalysierter Reaktionen v 0 v max 0.5 v max K M [S] 0 136

32 137 Lineweaver-Burke Diagramm Ermöglicht die exakte Bestimmung von K M und v max aus der reziproken MM-Gleichung

33 138 Welche physikalische Bedeutung hat K M? sie ist diejenige Substratkonzentration, bei der das Enzym die Hälfte der maximal möglichen Katalysegeschwindigkeit besitzt sie ist ein Maß für die Affinität zwischen Enzym und Substrat k -1 +k 2 K M = da k 1, k -1 >> k 2 (siehe Näherungen auf S. 135), folgt k 1 K M k -1 k 1 was gleichbedeutend mit der Dissoziationskonstante des ES Komplexes ist E + S k 1 k -1 ES K diss = je größer die Dissoziationskonstante eines Komplexes ist, desto geringer ist die Affinität der Komponenten (hier: Enzym und Substrat) zueinander Welche physikalische Bedeutung hat v max? ist die maximal mögliche Reaktionsgeschwindigkeit in Gegenwart des Enzyms; dies ist dann gegeben, wenn das aktive Zentrum immer von Substratmolekülen besetzt ist (Substratsättigung) k -1 k 1

34 139 Wie kann man die katalytischen Fähigkeiten von Enzyme vergleichen? je mehr Enzymmoleküle vorhanden sind, desto mehr Substratmoleküle können bei Substratsättigung umgesetz werden die Umsatzzahl k cat (turnover number) eines Enzyms ist unabhängig von der Anzahl der vorhandenen Enzymmoleküle k cat = v max [E] ges gibt an wieviele Substratmoleküle pro Sekunde und pro Enzymmolekül umgesetzt werden (Einheit: s -1 ) unter physiologischen Bedingungen sind Enzyme fast niemals der Substratsättigung ausgesetzt, sondern es gilt meist [S] << K M dadurch vereinfacht sich die MM-Gleichung zu: v max v 0 = [S] 0 K M mit der Definition für k cat folgt (siehe oben): k cat v 0 = [E] ges [S] 0 K M bei niedriger Substratkonzentration ist die Katalysegeschwingigkeit eines Enzymmoleküls umso höher, je größer die Umsatzzahl ist und je kleiner die MM-Konstante ist (d.h. je höher die Affinität zwischen Enzym und Substrat ist) k cat K M wird als katalytische Effizienz (kinetic efficiency, specificity constant) bezeichnet (Einheit: l s -1 mol -1 )

35 Kinetische Parameter einiger Enzyme 140

36 Allosterische Kontrolle der Enzymaktivität Die Aktivität eines Enzyms kann durch binden eines Effektormoleküls (meist ein kleines organ. Molekül) an das Enzym oder durch post-translationale Modifikation eines Aminosäureresres des Enzyms (meist Phosphorylierung von Ser, Thr oder Tyr) verändert werden: Die Bindung/Modifikation erfolgt stets außerhalb des aktiven Zentrums. Aktivatoren erhöhen v max und/oder erniedrigen K M Inhibitoren erniedrigen v max und/oder erhöhen K M

37 Allosterische Inhibition 142

38 Allosterische Aktivierung 143