Vertiefendes Seminar zur Vorlesung Biochemie I. Bearbeitung Übungsblatt 6

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1 Vertiefendes Seminar zur Vorlesung Biochemie I Bearbeitung Übungsblatt 6 Gerhild van Echten-Deckert Fon Homepage:

2 Energiediagramm einer Reaktion Enzym

3 Abhängigkeit der Geschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion von der Substratkonzentration.

4 Wie verändern sich die Konzentrationen der Teilnehmer im Verlaufe einer einfachen -Reaktion?

5 ichaelis-enten-odellodell k E+S +1 k +2 a) Anfangsgeschwindigkeiten : k E+P -2 = 0 ES frei k -1 k -2 frei b) Fließgleichgewicht : [ES] = C V *[ ] 0 k ES 2 Vf k 1 *[ E]*[ S] V k *[ ES] K [ ES] d 1 2 k 1 1 :[ L 1 smol ] 1 k 1 :[ ] s Fließgleichgewicht : [ES] ist konstant V f =V d k 1*[ E]*[ S] [ ES]( k 2 k 1) [ E]*[ S] k 1 k 2 K ; ichalis-enten-konstante [ ES] k 1 [ ES] [ S] ; [ E ] [ Et ] [ ES ] [ Et] K [ S] [ S] [ ES] [ Et ]* K [ S ] Bei Substratsättigung [ES]=[E [ S] t ] V0 k 2[ Et ]* K [ S] [ S] Vmax k 2[ Et ] V0 Vmax * K [ S] ichalis-enten-gleichung

6 ichaelis-enten-odellodell K max 0 Alternative ichaelis-enten-gleichung : Oder : In vitro, [S] Überschuss, [E] begrenzend V [ S] V V 0 V 0 V max K 1 [ S ] v Vmax 1 max 2 V V V 0 max K [ S ] [ S] K Grenzfälle : [S] [ S] a) Für [S] K V0 Vmax v steigt fast linear mit [S] K b) Für [S] = K V0 1 V max 2 Definition von K : v halbmaximale Substratkonzentration c) Für [S] K v maximal, Grenzwert V0 V max

7 V V 0 max Für Für * Bestimmung von K und V max : Lineweaver-Burk K [ S] [ S] V 0 [ S ] K [ S ] V V K * V V V [ S ] 0 max max 0 max

8 Die Geschwindigkeit einer ichaelis-enten Reaktion als Funktion der Substratkonzentration Lineweaver Burk kauftragung

9 E+S ES E+P frei ichaelis-enten-odellodell k +1 k K k -1 k -2 frei k 1 K Für k -1 k +2 (ES zerfällt schneller in E + S als in E + P) k 1 K -Werte einiger Enzyme Enzym Substrat K k k 1 k 1 sec 1 sec*l mol Dissoziationskonstante von ES Chymotrypsin Acetyl-L-tryptophanamid 5x10-3 Lysozym Hexa-N-Acetylglucosamin 6x10-6 -Galactosidase Lactone 4x10-3 Threonin-Deaminase Threonin 5x10-3 Carboanhydrase CO 2 8x10-3 Penicillinase Benzylpenicillin 5x10-5 Pyruvat carboxylase Pyruvat 4x10-4 HCO - 3 1x10-3 ATP 6x10-5 Arginin t-rna Synthetase Arginin 3x10-6 trna 4x10-7 ATP 3x10-4 Je kleiner K desto stabiler ES, desto höher Affinität von E für S

10 S oleküle k 2 Wechselzahl *[ ] E oleküle*sec V *[ ] max k 2 E t k k 2 cat Carboanhydrase : diffusionskontrolliert H 2 O + CO 2 HCO 3- + H + Acetylcholinesterase auch : O O N + H 2 O O O + HO N Enzym [s -1 ] Carboanhydrase Acetylcholinesterase Penicillinase 2000 Lactat-Dehydrogenase 1000 Chymotrypsin 100 DNA-Polymerase I 15 Tryptophan-Synthetase 2 Lysozym 0,5 aximale Wechselzahlen einiger Enzyme

11 k cat K ichaelis-enten-odell odell Katalytische Leistungsfähigkeit eines Enzyms [ ES] [ E ]*[ S] Für [S] << K (in vivo) gilt : E t E frei und aus wird (I) V k 2 *[ ES ] (II) k V 2 *[ S]*[ E t ] K 1 k K k k 1 I in II ; k K 2 K k 1 K K 1 2 t [ S] k k * k K k * k (diffusionskontrolliert), da : k 2 Und stets kleiner als 1 k k 1 2 [ Et ]*[ S] [ ES] K k k k i l k ih ( k k ) d i t E diff i k t lli t k +2 =k cat kann maximal k +1 erreichen (wenn k -1 << k +2 ) dann ist E diffusionskontrolliert: k +1 max = s -1

12 Kinetische essungen zum Enzym-Optimum Plot : v als Funktion von ph Veränderung der Nettoladung z.b. COO - zu COOH Wendepunkt bei ph ca. 6 deuten oft auf ein Histidin Wendepunkt bei ph ca. 3,5 deuten auf Aspartat oder Glutamatrest Temperatureffekte bis 40 C Verdoppelung von V bei Erhöhung von je 10 C Später Inaktivierung durch Denaturierung Substratkonzentration häufig Produkthemmung durch unspezifische Bindung, ggf. Blockade des aktiven Zentrums ps = - log [S]

13 1. Irreversible Inhibitoren Suizid-Inhibitoren Enzymkinetik (Inhibitoren) 2. Reversible Inhibitoren (a) kompetitive Inhibitoren : Substratanaloga (EtOH bei eoh od.glykol- Vergiftung), Übergangszustandsanaloga (b) nichtkompetitive Inhibitoren Angriffspunkte: Aktives Zentrum, Inhibitoren werden durch das Substrat verdrängt In Bereichen Beeihe außerhalb ßehlbdes aktiven Zentrums Keine Verdrängung durch das Substrat Erniedrigung der Wechselzahl

14 Unterschied zw einem kompetitiven und einem nichtkompetitiven Inhibitor

15 Reversible Inhibitoren Kompetitive Inhibition Kompetitiv i (ki (aktives Zentrum, häufigster häfi Typ) : reversible Bindung, aber kein Umsatz Erschwerung des Substratzutritts keine Veränderung des Katalyseeigenschaften V max wird nicht verändert Ek Erkennung durch hki kinetische essung : K steigt tit V max unverändert 1 1 K (1 + [I]/K I ) 1 = + V V max V max [S]

16 Kompetitive Inhibition A double reciprocal plot of enzyme kinetics in the presence (blue, red) and absence (green) of a competitive inhibitor. V max is unaltered whereas K is increased

17 Nichtkompetitive Hemmung Nichtkompetitive Hemmung Unkompetitive Hemmung Erkennung durch kinetische essung : K unverändert V max fällt häufig bei zwei oder mehr Substraten keine Blockade oder Verdrängung des Substrats Enzym wird auch unabhängig vom Substrat inaktiviert Effekt : scheinbare Verringerung der Enzymkonzentration meist kein Effekt auf K unkompetitive Inhibitoren binden nur an den ES-Komplex

18 Unkompetitive Hemmung in der Lineweaver-Burk Auftragung

19 Gemischt-kompetitive Hemmung in der Lineweaver-Burk Auftragung

20 Kinetik allosterischer Enzyme in Anwesenheit positiver bzw. negativer allosterischer Effektoren K-Typ: v-typ: v max -konstant K -konstant K -ändert sich ± v max -ändert sich ±

21 Substratbindung an ein allosterisches Protein: SYETRIE-ODELL Jaques onod Jeffries Wyman Jean-Pierre Changeux Alles oder Nichts Konzertiertes odell

22 Substratbindung an ein allosterisches Protein: SEQUENZ-ODELL Daniel Koshland Induced fit

23 Wirkung allosterischer Effektoren auf die kooperative Substratbindung eines dimeren Enzyms niedrigaffin hochaffin

24 1) ichaelis-enten kinetics and calculation of K & Vmax K = 4.6 µ V max = 12.8 nmol/min

25 2. Zugabe von 4 µ eines kompetitiven Inhibitors K I = 1.5µ