Stammzellen (Stammzelltherapie)

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1 1 1. Stammzellen Stammzellen (Stammzelltherapie) Unter dem Titel Molekulare Medizin werden solche molekularbiologische Forschungsgebiete bearbeitet, deren Ergebnisse in der Medizin schon verwendet werden. Folie 1 Regeneration Seesterne können ihren Fuβ, bestimmte Eidechsen ihren verlorenen Schwanz regenerieren. Menschen können zwar die verlorenen Finger nicht regenerieren, aber bestimmte Gewebe (z.b. Haut, Blut) erneuern sich ständig während des Lebens. Die Medizin sucht schon seit dem Altertum die Technik, mit der defekte Geweben ersetzt werden könnten. Die Stammzelltechnologie verspricht eine Lösung für dieses Problem. Folie 2 Was ist eine Stammzelle? Die Stammzelle ist eine Zelle, die sich selbst reproduzieren oder sich in spezialisierte Zellen differenzieren kann. Im Gegensatz zu diesen können die differenzierten Zellen dann aber entweder nur andere differenzierte Zellen produzieren (z.b. Hautzellen), oder sich gar nicht teilen (z.b. Nervenzellen). Folie 3 Zelltypen nach ihrer Verbundenheit Die Zellen können anhand ihrer Fähigkeit (Potenz)wie sie sich in andere Zelltypen entwickeln, eingeteilt werden. (1) Totipotente Zellen haben die gröβte Potenz und dementsprechend die kleinste Verbundenheit. Aus diesen Zellen können sich alle andere Zelltypen entwickeln. Totipotente Zellen sind z.b. die Zygote und das 2-, 4- und 8-Zellen Menschenembryo. (2) Die pluripotenten Zellen haben weniger Potenz. Solche Zellen bilden die sogenannte innere Zellmasse (ICM: inner cell mass) des Bläschenkeims (Blastozyste). Diese Zellen können in alle andere Zellarten entwickelt werden, auβer Trophoblastzellen, die für das Ernähren des Embryos verantwortliche Geweben erzeugen (sie spielen eine Rolle bei der Bildung der Teile der Plazenta, die embryonaler Herkunft sind). Die Zellen der inneren Zellmasse sind die häufigsten Quellen von den sogenannten embryonalen Stammzellen (embryonic stem cells: ESC, oder ES-Zellen). Da die ES-Zellen nicht totipotent sind, kann ein Individuum aus denen nur so hergestellt werden, wenn wir sie in die innere Zellmasse der Blastozyste implantieren. Bemerkung: wir können nicht alle Zellen der inneren Zellmasse mit implantierten ES-Zellen ersetzen. (3) Die Potenz von multipotenten Zellen ist weiter eingeschränkt. Die adulten Stammzellen können nur zu bestimmten Zellarten entwickeln, z.b. hämatopoetische Stammzellen zu Blutzellen. Multipotente Zellen (aber keine Stammzellen mehr) sind auch noch die Progenitor (Vorläufer)-Zellen, wie z.b. die Myeloid- und Lymphoidprogenitorzellen, die weniger Potenz haben, als die adulten Stammzellen. (4) Die unipotenten Zellen können nur mit sich identische Zellen erzeugen, eine Hautzelle z.b. kann nur Hautzellen erzeugen. Die Anzahl ihrer Teilungen ist durch ein genetisches Programm bestimmt, und dieses Programm folgen sie auch in in vitro Zellkulturen, wo sie sich nur ebenso lange wie im Körper teilen können, dann beendet sich ihre Vermehrung (Ausnahme sind die unsterblichen Zelllinien). Eine statische Zellpopulation wird aus solche Zellen gebildet, deren mitotische Aktivität sehr niedrig ist (die Mehrheit der Zellen ist in der G 0- Phase), sie beginnen sich meiβtens nur in Folge von Verletzungen zu teilen. Solche Zellen sind z.b. die faserbildenden Zellen vom Bindegewebe (Fibroblast- und Osteoblastzellen), und die unterschiedlichen Epithelzellen. Eine sich erneuernde Zellpopulation wird aus solche Zellen gebildet, die eine hohe mitotische Aktivität haben (z.b. die Blutzellen, Zellen des Lumenepithels im Darm, und Zellen in der unteren Schicht von mehrschichtigen Epithelien) (5) Die sich-nicht-teilenden Zellen haben mit der Vermehrung aufgehört (Nervenzellen, Muskelzellen, Herzmuskelzellen, weiβe Blutzellen). Dies bedeutet aber nicht, daβ sie im adulten Körper nicht gebildet werden, diese Zellen entstehen aber nicht aus sich selbst, (einander), sondern aus Progenitor (Vorläufer)-Zellen. Folie 4, 5 Stammzellen in unserem Körper Drei Keimblätter entstehen während der embryonalen Enwicklung: die Zellen des äuβeren Ektoderms erzeugen die Haut und das Nervensystem; aus dem Mesoderm entwickelt sich das Knochensystem, die Muskeln und das blutbildende System; die Zellen des inneren Endoderms erzeugen das gastrointestinale System (Magen, Darm) und die Lungen. Die Stammzellen in diesen drei Keimblättern sind multipotent, d.h. dass sie zu allen möglichen Zellen innerhalb der dermalen Grenzen entwickelt werden können. Multipotente Zellen (adulte Stammzellen, Progenitorzellen) finden wir im Gehirn, im Auge (Hornhaut, Netzhaut), im Blut, im Knochenmark, in der Leber, im Muskel, in der Haut, u.s.w. Alle Zellarten haben ihre Stammzellen. Solche Zellen hat man auch in der Zahnpulpa, in der Bauchspeicheldrüse (Pancreas) und im gastrointestinalen System gefunden. Von bestimmten adulten Stammzellen (z.b. mesenchymale Stammzellen) nimmt man an, dass sie die dermalen Grenzen überschreiten können, also pluripotent sind. Während der embryonalen Entwicklung trennen sich die Urkeimzellen (embryonale Keimzellen) schon sehr früh von den Körperzellen. Aus diesen Urkeimzellen Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 1

2 2 1. Stammzellen werden die Keimzellen gebildet, die miteinander zur totipotenten Zygote verschmelzen können - die Urkeimzellen und die Keimzellen selbst sind aber nicht totipotent. Folie 6-8 Adulte Stammzellen können nur zu bestimmte Zellarten differenziert werden, z.b. eine neurale Stammzelle kann alle Arten von Neuronen (Nervenzellen) und Gliazellen erzeugen, aber keine Muskelzellen. Den neuesten Forschungen nach, spielen die stromalen Zellen (auch mesenchymalen Zellen genannt; kommen vor in: Knochenmark, Fettgewebe, u.s.w.) neben ihrer Bindegewebefunktion auch in der Geweberegeneration eine Rolle, sie können sich also in völlig unterschiedliche Zellarten (z.b. Nervenzellen) entwickeln, dieses Thema ist aber noch umstritten (siehe später). Neben dem Knochenmark ist heute das Nabelschnurblut die populärste Quelle von adulten Stammzellen. Man hat in vielen Ländern spezielle Zellbänke für die Aufbewahrung von Nabelschnurblut in flüssigem Stickstoff gegründet. Die Stammzellen vom Nabelschnurblut können im Fall einer Krankheit des geborenen Kindes selbst, oder seiner Geschwister (genetische Verwandschaft!) wichtig sein. Das Nabelschnurblut enthält adulte Stammzellen in einem höheren Anteil als das Blut der Erwachsenen, und die Telomere sind auch nicht so verkürzt wie in einer späteren Lebensperiode. Das eingefrorene Nabelschnurblut kann mit guten Chancen auch Jahrzehnte nach der Geburt für Transplantation benutzt werden. Stammzellen von dem Nabelschnurblut werden bei Menschen zu allererst für die Behandlung von Patienten mit Knochenmarkmangel benutzt, weil die Nabelschnurblut-Stammzellen leicht zu Knochenmarkzellen differenzieren können. Ihre Verwendung hat Vorteile gegenüber Transplantationen des Knochenmarks von einem anderen Menschen: es ist mehr effizient und verursacht keine Abstossungsreaktion. Die adulten Stammzellen können nicht nur im Körper, sondern unter entsprechenden Umständen (nach der Zugabe von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren) auch in vitro (in einer Petri-Schale) zu spezialisierten Zellen differenziert werden. Die adulten Stammzellen differenzieren erstmal zu Progenitorzellen, dann zu spezialisierten Zellen. Folie 9 Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) Die ersten embryonalen Stammzellen haben im Jahre 1981 Martin Evans und Gail Martin (unabhängig von einander) aus der inneren Zellmasse von Mausblastozysten isoliert. Die Welt der Wissenschaft verbindet die Stammzelltechnologie mit dem Namen von Martin Evans. Mit zwei Kollegen hat er im Jahre 2007 den Nobel-Preis für Medizin bekommen. Dies wurde für die Herstellung von knock-out Mäusen gegeben, wobei die Rolle von M. Evans die Ausarbeitung der Mausstammzelltechnologie war. Die ersten menschlichen embryonalen Stammzellen hat James Thompson im Jahre 1998 isoliert, und damit hat die gröβte, durch Wissenschaft erzeugte gesellschaftliche Debatte der menschlichen Geschichte begonnen, deren Hauptfrage es ist, ob wir einen Menschchen so klein wie der Punkt am Satzende zerstören können. Folie 10 Quellen der menschlichen ES-Zellen Menschliche embryonale Stammzellen können aus zwei Hauptquellen gewonnen werden: aus in vitro Befruchtung (IVF, in vitro Fertilisation), oder durch die Implantation von Zellkernen aus adulten Körperzellen in entkernte Eizellen. (1) Bei dem in vitro Weg der künstlichen Befruchtung (der andere Weg ist die Injektion von Spermien in die Gebährmutter oder in die Eileitung) bleiben in den zuständigen Kliniken befruchtete Eizellen übrig, viele von diesen können nämlich nicht in den Körper der Mutter implantiert werden. Die übrigbleibenden Zellen werden meiβtens weggeworfen. Es gibt starke Proteste gegen die Verwendung für Forschunszwecke von befruchteten Eizellen, die während der künstlichen Befruchtung entstehen. In bestimmten (einigen) entwickelten Ländern ist dieses Protokoll verboten. Die befruchtete Eizellen läβt man in vitro (im Kolb) differenzieren, bis es das Blastozystenstadium erreicht (5 Tage). Die innere Zellmasse der Blastozyste (woraus sich unter natürlichen Umständen das Embryo enwickelt) wird isoliert und die Zellen dann in vitro kultiviert. Aus den isolierten Zellen macht man pluripotente embryonale Stammzellkulturen, die für Forschungszwecke verwendet werden können. Die so gewonnenen embryonalen Stammzellen haben ein individuellen Genotyp, welcher nicht mit dem Genotyp von irgendeinem lebenden Menschen identisch ist. (2) Dagegen ist der Genotyp von durch Zellkerntransfer gewonnenen Stammzellen völlig mit dem genetischen Material des Donors identisch (das ist eine Art von Klonen). Die Bedeutung von den so gewonnenen Stammzellen liegt darin, dass im Fall ihrer Implantation in dem Donor keine Gewebeinkompatibilität auftreten kann, das Immunsystem akzeptiert diese Zellen. Andererseits, kann bei der personenspezifischen Medizin wichtig sein, dass man Experimente mit kultivierten Zellen durchführen kann, um z.b. die Reaktionen auf bestimmte Medikamente zu testen. Die Schwierigkeiten bei dieser Strategie liegen erstens bei der Technologie, zweitens dort, dass man freiwillige Spender von Eizellen finden muβ, drittens, dass die juristische Umgebung dies genehmigen muβ was in vielen Ländern nicht der Fall ist. Über die Herstellung von klonierten embryonalen Stammzellen wurde von dem süd-koreaner Forscher Hwang Woo Suk (derselbe Forscher, der Snoopy, den klonierten Hund hergestellt hat) im Jahre 2004 berichtet. Es hat sich aber herausgestellt, dass er seine weiblichen Angestellten gezwungen hat, Eier zu spenden, und weiterhin die Protokollbücher gefälscht hat, so war diese Ansage unwahr (Snoopy aber war es). Später hat ein englischer Forscher das Experiment erfolgreich durchgeführt. Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 2

3 3 1. Stammzellen Folie 11, 12 Herstellung von embryonalen Stammzellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste Die aus der inneren Zellmasse des Bläschenkeims (Blastozyste) gewonnenen ES-Zellen kultivieren wir in vitro auf Nährzellen (Fibroblast). Abhängig davon, welche Differenzierungsfaktoren wir zum Nährmedium dazugeben, können wir unterschiedliche spezialisierte Zellen bekommen. Die Differenzierung der Stammzellen kann auβerhalb des Körpers (in vitro Differenzierung), oder innerhalb des Körpers (in vivo Differenzierung) erfolgen, abhängig davon, ob wir die Stammzellen in der Petri-Schale mit der Zugabe von unteschiedlichen Faktoren kultivieren, oder wir sie in den entsprechenden Teil des Körpers injizieren. Während der in vivo Differenzierung der ES-Zellen bilden sie oft Teratomen (spezielle Tumorzellen), diese Gefahr ist im Fall von adulten Stammzellen gering. Folie 13 EXTRA ANFORDERUNG Herstellung von ES-Zellen aus embryonalen Keimzellen ES-Zellen können wir auch aus Urkeimzellen (embryonalen Keimzellen) herstellen. Die Isolierung von solchen Zellen aus Erwachsenen ist schwierig, sie können aber relativ einfach aus Embryonen isoliert werden. Folie 14 Herstellung von ES-Zellen aus Körperzellen durch Zellkerntransfer Eine weitere Möglichkeit für die Herstellung von ES-Zellen ist die oben genannte Prozedur, wobei der Zellkern einer Körperzelle aus einem Erwachsenen in eine entkernte Eizelle durch Kerntransfer oder Fusion implantiert wird. Dieses Protokoll ist ein typischer Fall von Klonen, weil dadurch wir ES-Zellen herstellen, die einen Genotyp haben, welcher mit dem Genotyp der Donorzelle identisch ist. Die so hergestellten Zellen stimulieren wir, damit sie sich zur Blastozyste enwickeln, dann können wir durch die Isolierung der inneren Zellmasse ES-Zellen gewinnen und kultivieren. Die Forscher hoffen, dass diese Technik die Untersuchung der Krankheit des gegebenen Patienten ermöglicht, weil dabei die eigenen Zellen unter in vitro Umständen studiert werden. In der Zukunft können die Forscher mit dieser Technik personenspezifische Stammzellen herstellen. Die Implantation von solchen Stammzellen in den Körper des Donors wird keine Abstossungsreaktion verursachen, weil diese Stammzellen genetisch identisch (körpereigen) sind. Folie 15 EXTRA ANFORDERUNG Herstellung von ES-Zellen aus embryonalen Keimzellen durch Zellkerntransfer (Klonen) Die Zellkerne aus den embryonalen Keimzellen (Urkeimzellen) müssen nicht in so einem Maβe reprogrammiert werden, wie die Zellkerne aus Körperzellen, weil sie nicht so verbunden sind. Die Isolierung von solchen Zellen ist aber viel schwieriger als die Isolierung von z.b. Hautzellen. EXTRA ANFORDERUNG: Die REGENERATIVE MEDIZIN ist das Gebiet der Medizin, welches sich mit der Neubildung von beschädigten Geweben beschäftigt. Früher (und auch heute) erreichte man Erfolge im Fall von unterschiedlichen Organtransplantationen (z.b. Knochenmark, Knochen, Hornhaut, Herz, Leber, Lunge, Langerhans-Inseln im Pancreas, Haut). Probleme können dann auftreten, wenn der Donor eine andere Person ist. Heute sind die auf Stammzellen basierenden Strategien vielversprechend. Folie 16, 17 ES-Zellen in der Medizin Die in der Medizin verwendeten ES-Zellen können aus den obengenannten zwei Quellen stammen: aus der Blastozyste erzeugt (1) durch in vitro Befruchtung oder (2) nach Zellkerntransfer. Die ES-Zellen werden in beiden Fällen in vitro kultiviert, in die entsprechenden Zellarten differenziert und dann in den Körper des Patienten implantiert. Die embryonalen Keimzellen, und die durch Gentransfer reprogrammierten ips-zellen wurden bislang noch nicht für die Therapie von Menschen benutzt. Folie 18 Adulte Zellen in der Medizin hämatopoetische (blutbildende) Stammzellen In der Medizin wurden die hämatopoetischen Stammzellen schon seit langer Zeit bei der Behandlung von Leukemiepatienten verwendet. Im ersten Schritt werden Stammzellen aus dem Knochenmark einer Donorperson isoliert, dann werden diese Zellen in vitro kultiviert (Ziel ist die Vervielfältigung der Zellen). Danach werden diese Stammzellen ins Knochenmark der Patienten implantiert (Transplantation). Diese Art der Therapie nennen wir Zellersatztherapie. Folie 19 EXTRA ANFORDERUNG Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen Im Knochenmark befinden sich zwei wichtige Arten von Stammzellen: die hämatopoetischen und die stromalen (mesenchymalen) Stammzellen. Die hämatopoetischen Stammzellen sind multipotente Stammzellen, deren Potenz stufenweise niedriger wird. Im ersten Schritt entsteht aus der langzeitigen multipotenten Stammzelle eine kurzzeitige multipotente Stammzelle, demnach trennen sich die Entwicklugswege der Lymphozyten und der anderen Blutzellen von einander: aus den Lymphoidprogenitorzellen entstehen nur Lymphozyten, dendritische Zellen und NK (natural killer) Zellen, aus den Myeloidprogenitorzellen entstehen Granulozyten, Monozyten, Megakaryozyten und Erythroblasten. Folie 20 EXTRA ANFORDERUNG Verwendung der hämatopoetischen Stammzellen in der Medizin Hämatopoetische Stammzellen können aus den folgenden Quellen gewonnen werden: (1) Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 3

4 4 1. Stammzellen Knochenmark, (2) Nabelschnurblut, (3) Plazentablut, (4) adultes Blut. Adulte Stammzellen aus dem Knochenmark hat man schon seit den 1950-er Jahren für die Behandlung von unterschiedlichen Krankheiten benutzt: Leukemie, Sichelzellanämie, Immunversagen, Knochenmarkschäden, einige metabolische Funktionsstörungen. Die Knochenmarktransplantation ist bei Weitem die erfolgreichste, auf Stammzellen basierende Therapie. Die Behandlung ist sehr unangenehm sowohl für den Donor, als auch für den Rezipienten, und sie ist nur erfolgreich wenn der Donor und Empfänger einander genetisch ähnlich sind. Die Technik der Isolierung von Stammzellen aus Nabelschnurblut und Plazentablut wurde in den letzten Jahren ausgearbeitet. Diese Technik ist nicht unangenehm, und produziert genetisch identische, oder ähnliche Stammzellen für den Donor oder ihre genetischen Verwandten - auch Jahre später. Das peripheriale Blut von Erwachsenen ist am einfachsten zugänglich, es enthält Stammzellen aber nur in geringen Mengen. Folie 21 EXTRA ANFORDERUNG Stammzellen in der Medizin Stromale Stammzellen Im Fall der Regeneration von Knochen (und Knorpel) werden die stromalen Stammzellen ex vivo kultiviert, dann werden die Zellen zu Keramienpartikeln mit dreidimesionaler Struktur gekoppelt, und am Ende in das verletzte Knochengewebe implantiert, wo die Zellen den Raum dreidimensional ausfüllen. Folie 22 EXTRA ANFORDERUNG Herzmuskeltherapie Neben den hämatopoeitischen Stammzellen ist die medizinische Verwendung der Herzvorläuferzellen am weitesten entwickelt, bis heute gibt es schon mehrere Berichte über erfolgreiche klinische Anwendungen. Die Herzvorläuferzellen werden von -aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnenen- ES-Zellen durch die Zugabe von den entsprechenden Faktoren hergestellt. Demnächst stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (1) diese Zellen direkt in das beschädigte Herzteil zu inokulieren, wo sie zu glatten Muskelzellen (in der Wand von Blutgefäßen), Herzmuskeln, und Endothelzellen (in Blutgefäßen) differenziert werden; oder (2) die Differenzierung der Zellen in vitro ablaufen zu lassen, und danach die spezialisierten Zellen ins Herz zu implantieren. Im Fall der in vitro Differenzierung besteht die Möglichkeit, die eventuellen genetischen Fehler durch Einführung von Genen zu korrigieren (das nennt man Gentherapie). Folie 23 EXTRA ANFORDERUNG Stammzellen der Haut Die Ergänzung der Haut ist im Fall von unterschiedlichen Verletzungen oder im Fall von plastischer Chirurgie nötig. (1) Die traditionelle Behandlung bedeutet Hauttransplantation von unbeschädigten Körperarealen. Dies ist erfolgreich, da die Stammzellen direkt unter der Epidermis liegen, und die implantierte Gewebe ergänzen können. Wenn aber nicht genügend unbeschädigte Haut vorhanden ist, kann der Patient sterben. (2) Seit 20 Jahren wird eine alternative Technologie verwendet, wo die Hautstammzellen kultiviert und dann in die Haut implantiert werden. (3) Vor kurzer Zeit man hat neue Hautstammzellen in tieferen Schichten der Haut und in Haarwurzeln entdeckt, die Verwendungsmöglichkeiten von diesen Zellen werden getestet. Folie 24 EXTRA ANFORDERUNG Neurale Stammzellen (neural stem cells, NCS) Neurogenese im adulten Gehirn Man hat vor kurzer Zeit im Gehirn der Ratte zwei Gehirngebiete (hippocampus dentate gyrus und die subventrikulare Zone der anterio-lateralen Kammer SVZ) entdeckt, wo auch im adulten Alter neue Nervenzellen gebildet werden. Die SVZ-Stammzellen wandern in die Richtung des Bulbus olfactorius, wo sie zu Nervenzellen differenziert werden. Vermutlich befinden sich Stammzellen auch in den entsprechenden Gebieten des menschlichen Gehirns. So ist der Standpunkt,, dass man nach 35 Jahren die Nervenzellen nur verliert und diese nicht ersetzt werden nicht ganz wahr, da aus den Stammzellen neue Neurone entstehen können. Diese Stammzellen werden aber mehr im Fall von Verletzungen aktiviert, und in diesen Fällen spielen auch noch eher die Gliazellen die Hauptrolle, die die abgestorbenen Nervenzellen ersetzen: sie vermehren sich, verwandeln sich aber nicht zu Neuronen. Folie 25 EXTRA ANFORDERUNG Parkinson(sche) Krankheit Das Gehirngebiet substantia nigra spielt eine grundlegende Rolle bei der Koordination der Bewegung. Eine Art der hier zu findenden Neuronen ist notwendig, um unnötige Bewegungen zu eliminieren. Im Fall der Parkinsonschen Krankheit degenerieren diese Neurone, deshalb zittern die Hände der Betroffenen. Man hat schon mehrere Methoden versucht, um diese Krankheit zu heilen (z.b. Gentherapie), die meist versprechende Methode ist aber die Implantation von Stammzellen. Einen Durchbruch konnte man aber bei der Heilung dieser Krankheit bis heute nicht erreichen. Folie 26 EXTRA ANFORDERUNG Rückenmarksverletzung Ein weiteres, sehr wichtiges Problem ist die Ersetzung von abgestorbenen Neuronen im Fall von Rückenmarksverletzungen. Hier gibt es auch Versuche das Problem mit Stammzellen oder gentherapeutischen Techniken zu lösen. Folie 27 EXTRA ANFORDERUNG Y Chromosom im weiblichen Gehirn? Ungarische Forscher in den USA (NIMH, National Institute of Mental Health, Bethesda, USA) haben Y Chromosome in Nervenzellen von einigen gestorbenen Frauen beobachtet. An diesen Frauen wurde früher eine Knochenmarktransplantation durchgeführt, wo die Donore Männer waren. Es scheint also, dass bestimmte Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 4

5 5 1. Stammzellen Zellen des Knochenmarks (stromale = mesenchymale Zellen) nicht nur multipotente, sondern auch pluripotente Fähigkeiten haben, denn im Knochenmark gibt es ja keine adulten neuralen Stammzellen. Das Experiment hat man dann erfolgreich an Ratten durchgeführt, und anhand der Ergebnisse vermutet man, dass aus den mesenchymalen Zellen des Knochenmarks fast alle Zelltypen entstehen können. Diese Theorie ist aber noch umstritten. Es wäre ein riesiger Fortschritt für die Medizin, wenn sich herausstellen würde, dass die Plastizität (Potenz) des Knochenmarks viel gröβer ist, als man früher annahm. Nachzuweisen, dass Zelltypen aller Herkunft (ekto-, endo- und mesodermal) aus Knochenmarkzellen entwickelt werden können, reicht alleine aber nicht, die Frage ist, wie häufig das vorkommt. Wenn diese Frequenz zu niedrig ist, wird dieses Ereignis auf der Ebene von theoretischen Merkwürdigkeiten bleiben, ausser wenn wir diese Zellen leicht isolieren und dann in vitro differenzieren lassen können. Folie 28, 29 EXTRA ANFORDERUNG Plastizität der adulten Stammzellen Anhand von Beobachtungen und Experimenten vermutet man, dass die stromalen (mesenchymalen) Stammzellen des Knochenmarks fähig sind sich zu Muskeln, Neuronen, und Glia- und Epithelzellen zu entwickeln. Mesenchymale Stammzellen findet man noch im Knochen, Knorpel, Fettgewebe und in anderen bindegeweblichen Elementen. In den letzten Zeiten hat man grosse Hoffnungen was die medizinische Anwendung von diesen Zellen betrifft, man hat nämlich gefunden, dass diese Zellen sich als pluripotente Stammzellen benehmen, so können sie für die Geweberegeneration verwendet werden. Manche jedoch zweifeln an der pluripotenten Natur der mesenchymalen Stammzellen, und sagen, dass in der Wirklichkeit diese Zellen nicht zu anderen Zelltypen umgewandelt werden, sondern sie nur mit anderen Zelltypen fusionieren. Die Zukunft wird diese Frage entscheiden. Folie EXTRA ANFORDERUNG Embryonale Stammzellen Werk des Teufels Die am besten zugänglichen Quellen der Stammzellen sind die abortierten Embryos, und die Zygoten, die nach der in vitro Befruchtung übrig bleiben. Diese Zellen können aber die Forscher der entwickelten Ländern wegen dem gesellschaftlichen Druck und der darauf resonierenden Politik nicht verwenden. Die Gegner des Abortus und die Kämpfer für die Rechte des Embryos sind der Meinung, dass (man eine Zygote schützen muss) eine Zygote (schon) zu schützen ist, weil sie alle Fähigkeiten besitzt, um sich zu einem erwachsenen Menschen zu entwickeln, weiterhin, dass die Zygote und das Embryo selbst schon als Mensch betrachtet werden können. Stammzellforscher haben während der Amtszeit von George W. Bush keine staatliche Unterstützung bekommen, und sie konnten nur solche ES-Zellen benutzen, die noch vor der Amtszeit von Bush hergestellt worden sind. Die Qualität von diesen Zellen verschlechtert sich aber mit der Zeit. Die amerikanischen Forscher sind erst nach England übersiedelt, nachdem aber die Regelung auch in England strenger wurde, sind sie nach südost-asien gegangen, wo sie riesige Stammzellforschungszentren gegründet haben. Selbstverständlich (Natürlich) ist es nicht egal, ob die Stammzellen für therapeutischen Zwecke, oder für die Erzeugung eines Individuums benutzt werden. Die Verwendung von Stammzellen für Forschungs- und Therapiezwecke hat in der Medizin eine riesige Bedeutung. Innerhalb der ersten 24 Stunden seiner Amtszeit hat Barack Obama das Verbot der Erzeugung von menschlichen ES-Zellen ausser Kraft gesetzt. Folie 33 Wozu sind Stammzellen gut? (1) Im Rahmen der Grundforschung spielen die Stammzellen bei der Herstellung von knock-out Tieren und beim Verstehen der Mechanismen der Zelldifferenzierung eine unentbehrliche Rolle. (2) Im Rahmen der medizinischen Forschung und Heilung spielen sie eine wichtige Rolle (a) beim Testen von Wirkstoffen; (b) beim Testen der Zellen vom Patienten auf verschiedene Therapien; (c) bei der Heilung von Leukemie, Parkinsonscher und Alzheimer-Krankheit, Nervenverletzungen, Gehirnblutung, Herz- und Zuckerkrankheiten, u.s.w. Folie Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (ips) durch das Reprogrammieren von Körperzellen Ein japanischer Forscher, Shinya Yamakan konnte differenzierte Hautfibroblastzellen der Maus mit der Einführung von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen in ESähnliche Zellen umwandeln. Diese Zellen wurden induzierte pluripotente Stammzellen (induced Pluripotent Stem Cells) genannt. Gene von solchen Tanskriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4, c-myc) wurden mit Hilfe von einem genetisch modifizierten (avirulent gemachten) Retrovirus in die Hautfibroblastzellen eingebracht, die das epigenetische Programm der Zellen auf eine, mit den pluripotenten Stammzellen gleiche Ebene wiederhergestellt haben. Diese Zellen hatten die Fähigkeit sich in alle Zellarten zu differenzieren, weiterhin ist es auch möglich, solche fertile Mäuse herzustellen, bei denen alle Zellen aus ipsc-s entstanden sind. James Thomson (Hersteller der menschlichen ES-Zellen) konnte als erster menschliche ipsc-zellen durch die Einführung von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen in menschliche Fibroblastzellen erzeugen. EXTRA ANFORDERUNG: Aus den 4 Transkriptionsfaktoren war nur Oct4 nicht ersetzbar. Die anderen 3 Transkriptionsfaktor-kodierenden Gene können nicht nur mit anderen Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen ersetzt werden, sondern z.b. anstatt von Klf4 und c-myc Genen ist auch ein kleines Molekül, die Histon-Deacetylase hemmende Valproinsäure zu dem Reprogrammieren der menschlichen Fibroblastzellen Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 5

6 6 1. Stammzellen fähig. Da das Retrovirus sich ins Genom der Zellen integriert, man hat eine intensive Forschung begonnen, um andere Gentransfermethoden zu entwickeln. Das Reprogrammieren der Zellen ist ein einmaliger Prozess, dementsprechend ist die kontinuierliche Anwesenheit der neuprogrammierenden Faktoren nicht nötig, es ist sogar besser, wenn sie nach der Induktion nicht mehr exprimiert werden. Wenn wir die nötigen, Transkriptionsfaktor-kodierenden Gene mit der Transfektion von Plasmiden in die Zelle einbringen, können wir dadurch eine transiente (vorübergehende) Genexpression erreichen, welche das Reprogrammieren der Zelle einführt, wonach die fremden DNA-Moleküle aus den Zellen verschwinden. Die obengenannten Gene können mit Hilfe des sogenannten Cre-loxP Systems eingebaut werden, in diesem Fall können wir die eingebauten Gene mit der Zugabe des Cre-Enzyms ausschneiden. Der in Kanada arbeitende András Nagy hat die Transkriptionsfaktor-kodierenden Gene mit Hilfe von mobilen genetischen Elementen ins Genom der differenzierten Zellen eingeführt, woraus sie sich dann später herausgeschnitten haben. Die induzierte Expression der Transkriptionsfaktor-kodierenden Gene ist mit der Anwendung des Tetracyklin- Systems auch möglich. Die Proteine können auch direkt in die Zellen eingebracht werden, wo sie ihre Aufgabe erfüllen, und dann degradiert werden. Die einfachste Methode ist die Verwendung von kleinen Molekülen für das Reprogrammieren. Wenn das Reprogrammieren mit der ausschlieβlicher Verwendung von kleinen Molekülen lösbar wäre, würde das einen weiteren Durchbruch in der Stammzellforschung bedeuten. Neben der Umständlichkeit hat die auf DNA-basierende Methode ein anderes Problem: die niedrige Effizienz (<0,1%). Die niedrige Transformationseffizienz ist aber kein groβes Problem, weil wir die entstandenen ips-zellen dann sowieso vermehren. Das Problem ist mehr theoretisch: wir verstehen nicht, warum die Entstehungsfrequenz der ips-zellen auch bei einer hohen Transfektionsfrequenz so niedrig ist. Hierfür gibt es zwei Theorien: (1) nach der Theorie der eliten Zellen ist nur eine kleine Subpopulation der Zellen zum Reprogrammieren fähig; (2) Nach dem stochastischen Modell sind alle Zellen zum Reprogrammieren fähig, aber dieser Prozess läuft nur mit einer kleinen Frequenz und zufallsweise (mit der gleichen Chance in allen Zellen) ab. Das Reprogrammieren der Zellen betrifft die Methylierung der DNA und der Histone, und die Acetyliereung der Histone. Das inaktivierte X-Chromosom von Frauen wird wieder aktiv. Multipotente Zellen können einfacher in pluripotente Zellen umgewandelt werden, als die differenzierten Zellen (das Transkriptionsfaktor Sox2 ist dafür nicht mal nötig). Die Transkriptionsfaktoren, die zum Reprogrammieren nötig sind, wurden so bestimmt, indem man untersucht hat, welche Gene in den ES-Zellen exprimiert werden. Folie 38 EXTRA ANFORDERUNG Reprogrammieren von Zellen, Gentherapie Die Kombination von der Reprogrammierung der Zellen und der Gentherapie wird durch ein Mausmodell präsentiert. Der Mauspatient leidet unter Sichelzellanämie (monogenische Krankheit). Zuerst isolieren wir eine Epithelzelle von der Maus, dann führen wir mit Hilfe eines Retrovirusvektors solche Transkriptionsfaktorkodierende Gene in die Zelle ein, die die spezialisierte Zelle zu ips-zelle reprogrammieren. Wir isolieren die transformierten Zellen (welche die eingeführten Gene enthalten) mit Hilfe von ebenso eingeführten Antibiotikaresistenzgenen (wir geben Antibiotikum zum Nährmedium, wo nur die transformierten Zellen überleben). Der zweite Schritt ist, dass wir das mutante Gen mit dem normalen Gen ersetzen, indem wir das normale Gen mit einer einfachen chemischen Methode in die Zelle einschleusen. Danach, da die Sequenz des normalen Gens homolog mit der Sequenz des mutanten Gens ist, integriert sich das normale Gen durch homologe Rekombination in die DNA der Zelle. Zuletzt, lassen wir die transformierten ips- Zellen diffrenzieren und transplantieren sie ins Knochenmark der Maus. Das Ergebnis ist eine geheilte Maus. Folie 39 EXTRA ANFORDERUNG Reprogrammieren von Zellen und Gentherapie in der Medizin Die auf ips-zellen basierende Technologie kann auch in der Medizin verwendet werden. Wir wandeln adulte Körperzellen (z.b. Hautfibroblastzellen) in ips-zellen mit Hilfe der obengenannten, auf Retrovirus-basierenden Gentransfermethode um. Wir können diese Zellen vermehren, da sie die Fähigkeit auf Selbsterneuerung haben. Wenn der Patient keine genetische Erkrankung hat,und nur seine Geweben verletzt sind, lassen wir die ips-zellen differenzieren und (wir) implantieren sie in das entsprechende Organ. Wenn der Patient unter einer genetischen Krankheit leidet (welche eben der Grund dafür sein kann, dass er eine Zellersatztherapie benötigt), dann korrigieren wir ersl den Fehler in den ips-zellen mit molekulargenetischen Mitteln. Wenn das Problem durch eine dominante, negative Mutation verursacht wurde, müssen wir das fehlerhafte Gen durch homologe Rekombination ersetzen. Wenn aber die Mutation nicht dominant ist (das Problem die ungenügende Expression im heterozygotischen Zustand ist), dann können wir das Gen auch in andere Regionen des Genoms mit Hilfe der sogenannten illegitimen Rekombination einführen, dabei bleibt die fehlerhafte Kopie des Gens auch im Genom erhalten. Nach der Korrektur der Mutation lassen wir die transformierten Zellen differenzieren und dann implantieren wir sie in den Körper des Patienten. Wir bemerken, dass die Umwandlung von adulten Körperzellen in ips-zellen auch eine Art von Klonen ist, dadurch können wir diese Zellen so für die Heilung des Donors benutzen, dass dabei keine Gewebeinkompatibilität auftreten wird. Mit ips-zellen können wir auch pharmakologische Experimente durchführen um festzustellen, welche Drogen wir für die Behandlung des Patienten verwenden können: es kann bestimmt werden, worauf die Zellen sensitiv sind, welche Medikamente Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 6

7 7 1. Stammzellen ineffektiv sind, und auf welchen Medikamenten die Zellen positiv reagieren. Die Verwendung von ips- Zellen hat den groβen Vorteil gegenüber anderen Methoden, dass die Zellen von dem Körper des Patienten leicht isoliert werden können, und die Zelle, die wir nach der Korrektur des genetischen Fehlers in den Körper zurückführen, keine Immunreaktion auslösen wird. Vor der Verwendung von gentherapeutischen Methoden muβ natürlich die Technik der Therapie ausgearbeitet werden, und die Zellen der Patienten müssen auch untersucht werden, um die Diagnose aufstellen zu können. Die ipsc-technologie hat eine riesige Bedeutung bei der in vitro Untersuchung von Krankheitsmodellen. Zelllinien sind schon für unterschiedliche monogenische, und mit einem Gen modellierbare Krankheiten (z.b. ALS, Parkinsonsche Krankheit, u.s.w.) erhältlich. Die Frage ist, ob diese Technik für die Untersuchung von Krankheiten, die einen komplexen Hintergrund haben, verwendbar sein wird. Die ipsc-technik ist die groβe Hoffnung der personenspezifischen Medizin. Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 7

8 8 1. Stammzellen Folie40 Vergleich von Stammzellen Vergleich von Stammzellen Name adulte Stammzellen ES-Zellen (in vitro Fertilisation, IVF) ES-Zellen (Urkeimzellen) ES-Zellen (Zellkerntransfer Donor: differenzierte Zelle) ES-Zellen (Zellkerntransfer Donor: embryonale Keimzelle) ips-zellen Herkunft unterschiedliche Stellen des adulten Körpers, Nabelschnurblut In vitro Fertilisation ICM-Zellen der Blastozyste embryonale Keimzellen entkernte Eizelle + Zellkern einer Körperzelle entkernte Eizelle + Zellkern einer embryonalen Keimzelle Transformation von adulten Körperzellen mit Transkriptionsfaktore kodierenden Genen Eigenschaften begrenzte Differenzierungspotenzial. Erfolgreiche Behandlungen in einigen Fällen können alle Zellarten erzeugen können alle Zellarten erzeugen können alle Zellarten erzeugen können alle Zellarten erzeugen Isolierung der Zellen ist einfach Grenzen schwer zu isolieren politischer und gesellschaftliche r Widerstand Politischerund gesellschaftliche r Widerstand Politischer und gesellschaftliche r Widerstand Politischer und gesellschaftliche r Widerstand Effizienz heute noch niedrig Gefahren - können sich zu Tumorzellen entwickeln Können ich zu Tumorzellen entwickeln können sich zu Tumorzellen entwickeln können sich zu Tumorzellen entwickeln Gene des Retrovirus können exprimiert werden Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 8

9 9 1. Stammzellen Gentherapie Gentherapie ist der Transfer von genetischem Material in disfunktionelle Zellen, um eine Defizienz in der DNA oder im Genom eines Patienten zu korrigieren. Weiterhin kann die Gentherapie für geholte Krankheiten, z.b. Krebs oder Infektionen verwendet werden, um die Zellen mit spezifischen Eigenschaften zu versehen, welche die Bekämpfung der Krankheit ermöglichen. Folie B1 Keimbahntherapie vs. somatische Gentherapie Abhängig davon, ob wir die genetische Modifikation in allen Zellen oder nur in bestimmten Zellen eines Individuums durchführen, sprechen wir über Keimbahn- oder somatische Gentherapie. Folie B2 Keimbahntherapie Retrovirusvektor Schauen wir uns ein hypothetisches Beispiel für die Keimbahntherapie an! Nehmen wir an, dass beide Eltern ein mutantes Gen tragen, welches in der homozygotischen Form eine Krankheit verursacht (rezessives Merkmal). Mit der Wahrscheinlichkeit von 25% werden zwei Kopien des Gens in der befruchteten Eizelle vorhanden sein, was zu einem kranken Kind führt. Nehmen wir an, dass diese Krankheit in der ganz frühen Periode der Schwangerschaft diagnostisiert werden kann, und dabei es sich herausgestellt hat, dass das werdende Kind krank sein wird. Die Eltern möchten das Kind behalten, aber sie möchten nicht, dass es krank wird. Deshalb suchen sie einen Arzt auf, der sich mit Gentherapie beschäftigt. Der Arzt isoliert die Blastozyste und macht eine Zellkultur daraus. Er führt die funktionsfähige Version des kranken Gens mit Hilfe von einem Retrovirusvektor in die kultivierten Zellen ein, isoliert den Zellkern einer genetisch korrigierten Zelle, implantiert es in eine entkernte Eizelle, und führt dann die so entstandene, genetisch korrigierte Zygote in den Körper der Mutter zurück. Das Ergebnis wird ein gesundes Baby sein. Dieses Protokoll ist niergendwo auf der Welt erlaubt. Folie B3-6 Im Fall der somatischen Gentherapie führen wir das fremde Gen im erwachsenen Alter in bestimmte Zelltypen mit Hilfe von unterschiedlichen Methoden (Virusvektor, Liposom, Genkanone) ein. Das ist die in vivo (direkte) Gentherapie. Im Fall der ex vivo Gentherapie schleusen wir die fremden Gene erstmal in kultivierte Zellen (meisstens in embryonale oder adulte Stammzellen) ein, und dann implantieren wir diese Zellen in die entsprechende Stelle des Körpers. Die Stammzellen können also sowohl ohne, als auch mit genetischer Veränderung für therapeutische Zwecke benutzt werden. Folie B7 Ein Beispiel: ADA Einer der ersten Erfolge der Gentherapie war die Heilung einer schweren immunologischen Krankheit, der SCID (severe combined immunoldeficiency disease). SCID ist eine polygenische Krankheit in dem Sinne, dass sie als Ergebnis von Mutationen in unterschiedlichen Genen vorkommen kann (eine Mutation in irgendwelchem Gen aus diesen unterschiedlichen Genen reicht schon für das Entstehen der Krankheit). Eines von diesen Genen ist das ADA (Adenosin-Deaminase) Gen, dessen Funktionsunfähigkeit in nicht-funktionierende B- und T- Lymphozyten resultiert. Die traurige Mediensensation der 1970-er Jahre war David, das Bubble - Kind. David hatte schwere SCID-Krankheit und er verbrachte sein kurzes Leben in einem Luftzelt. Früher versuchte man SCID mit Transplantation von Knochenmark aus Verwandten zu behandeln, die Therapie war aber oft wegen der immunologischen Inkompatibilität erfolgslos. Die ersten Versuche mit Gentherapie waren erfolgreich: das funktionsfähige ADA-Gen wurde in Lymphozyten aus dem Knochenmark der Patienten eingeführt, und dann wurden diese Lymphozyten in die Patienten zurückgeführt. Knochenmark ist ein leichter Zielpunkt, ebenso, wie im Fall der Stammzelltherapie. Im Fall von anderen Organen hat diese Strategie nicht so erfolgreich funktioniert. Folie B8 Das erste Opfer der Gentherapie Diese vielversprechende Methodik wurde durch die Opfer der nicht sachgerecht vorbereiteten und dokumentierten gentherapeutischen Versuche zurückgeworfen. Das erste Opfer war der 18-jährige Jesse Gelsinger, der zu einer Art Symbol im Bereich der Gegner der Gentherapie wurde. Er litt an Ornithin-Trans-Carbamylase Defizienz. Dieses Enzym spielt eine Rolle bei der Degradation von Ammoniak, der Enzymmangel hat einen starken Vergiftungseffekt. Jesse Gelsinger ist an den Nebenwirkungen des adenoviralen Vektors gestorben. Der Arzt, der den Eingriff durchgeführt hat, hat leider sowohl die Komplikationen bei den präklinischen Experimenten, als auch weitere wichtige Umstände verschwiegen, als er um die Genehmigung zum Eingriff gebeten hat, und die FDA (Food and Drug Administration, USA) hat die Genehmigung gegeben. Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 9

10 10 1. Stammzellen Folie B9 Debatte Die Gentherapie steht, ebenso, wie die anderen, auf Gentechnologie basierenden Wissenschaftszweige im Kreuzfeuer von Attacken. Wegen den ersten Fehlschlägen gibt es ein starkes Misstrauen gegenüber der Gentherapie. Wegen den Attacken ist diese Technik in den letzten Zeiten in den Hintergrund geraten, vermutlich aber nur vorübergehend. Früher gab es heftige Debatten über die Keimbahntherapie, bei diesen Strategien kommt die Keimbahntherapie aber gar nicht in Frage. Grundanforderung Boldogkői Zsolt Seite 10