PM, Positivkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren. RM, Referenzkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren

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1 Hantavirus Dobrava / Hantaan IgG/IgM Art.Nr.: PR59165 Inhalt der Testpackung: 96 Bestimmungen Lagerung: 2-8 C IVD Instruction sheet / Gebrauchsanweisung / Carnet d instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per l'uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: 1. Hantaviren Verbreitung und Erkrankung Hantaviren sind einzelsträngige RNA-Viren aus der Familie der Bunyaviren mit weltweiter Verbreitung und einem Serotyp-spezifischen Wirtsreservoir. Sie sind die Erreger des hämorrhagischen Fiebers mit renalem Syndrom (HFRS) in Europa und Asien und des hantaviralen kardiopulmonalen Syndroms (HCPS) in Amerika. In Abhängigkeit vom Erregertyp kann die Krankheit einen schweren oder leichten Verlauf nehmen, die Letalität schwankt beim HFRS zwischen 0,1 % und 10% und beim HCPS zwischen 25 und 35% (13). Virusträger sind Nager, die Übertragung auf den Menschen erfolgt meist durch Einatmen virushaltiger Aerosole aus den Ausscheidungen der Wirtstiere. Das HFRS wird durch Hantaan-Virus, das damit eng verwandte Dobrava-Virus, den Seoul und den Puumala Virustyp ausgelöst, wobei in Asien der Hantaan Typ und in Europa der Dobrava Serotyp gefunden werden; für beide sind Apodemus-Spezies (Waldmaus) Reservoirtiere. Der in Deutschland überwiegend (etwa 90%) auftretende Virustyp ist Puumala, sein Reservoirwirt ist die Rötelmaus (Myodes glareolus). Gering in Mitteleuropa und vermehrt bis überwiegend in Ost- und Südeuropa und der Balkanregion treten Infektionen durch das Dobrava-Virus auf, das durch die Brandmaus, Gelbhalsmaus und Schwarzmeerwaldmaus verbreitet wird. Regelmäßige Aktualisierungen über Gefährdung und Verbreitung sowie aktuelle Daten finden sich unter und Surv-Stat@rki sowie in den Epidemiologischen Bulletins des Robert-Koch-Instituts. 2. Anwendung des Tests Der Hantavirus Dobrava/Hantaan (DOB/HTN) IgG/IgM ist geeignet zum Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen Dobrava- und Hantaan-Virus bei Verdacht auf hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndrom (HFRS). 3. Testprinzip Die Mikrotiterplatte ist mit rekombinantem Nukleokapsidprotein des Hantaan-Virus beschichtet. Zur Bestimmung von IgM-Antikörpern müssen die Patientenseren vor Testbeginn mit Rheumafaktor IgG-Absorber inkubiert werden, um unspezifische Reaktionen durch IgG-Antikörper oder Rheumafaktoren zu vermeiden. Während der Probeninkubation bilden die nachzuweisenden Antikörper Immunkomplexe mit den rekombinanten Beschichtungsantigenen. Nach dem Waschen werden die spezifischen IgG- und IgM-Antikörper mit Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern nachgewiesen. Durch Zugabe einer Substratlösung entsteht proportional zu der spezifisch gebundenen Antikörpermenge ein Farbstoff, der photometrisch gemessen wird. 4. Benötigte, nicht mitgelieferte Materialien und Geräte Destilliertes Wasser Messzylinder Reaktionsgefäße für Serumverdünnungen Präzisionspipetten (5 µl, 20 µl, 50 µl, 200 µl, 1000 µl) Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (100 µl, 200 µl) -Reader mit 450 nm Filter Einmalhandschuhe Stoppuhr 5. Inhalt des Testkits 5.1. Inhalt des Testkits (PR59165) MTP, Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinantem Hantaan-Antigen, mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt. Bei Bedarf können einzelne Näpfe von den Streifen abgebrochen werden. Gebrauchsfertig! PG, Positivkontrolle IgG, Humanserum mit Stabilisatoren Enthält DOB/HTN-spezifische IgG-Antikörper (grüner RG, Referenzkontrolle IgG, Humanserum mit Stabilisatoren Enthält DOB/HTN-spezifische IgG-Antikörper (roter PM, Positivkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren Enthält DOB/HTN-spezifische IgM-Antikörper (gelber RM, Referenzkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren Enthält DOB/HTN-spezifische IgM-Antikörper (blauer NEG, Negativkontrolle, Humanserum mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel, 1 Microtube, 1,9 ml. Enthält keine spezifischen IgG- und IgM-Antikörper (farbloser SB 20x, Probenpuffer (20x), PBS ph 7,4, enthält Konservierungsmittel, rot gefärbt, 1 Flasche, 15 ml. Vor Gebrauch WASH 20x, Waschpuffer (20x), PBS ph 7,5, enthält Konservierungsmittel, 1 Flasche, 50 ml. Vor Gebrauch PR59165 Hanta (DOB_HTN) IgG+IgM de_v12 1

2 CG 20x, Anti-IgG-Peroxidase-Konjugat (20x), 1 Microtube, 750 µl (20x) (schwarzer Deckel). Vor Gebrauch CM 20x, Anti-IgM-Peroxidase-Konjugat (20x), 1 Microtube, 750 µl (20x) (weißer Deckel). Vor Gebrauch S, Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB), 1 Flasche, 12 ml. Gebrauchsfertig! STOP, Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, 1 Flasche, 12 ml. Gebrauchsfertig! ABS, Rheumafaktor IgG-Absorber, Anti-human-IgG mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel, 1 Microtube, 1,5 ml. Gebrauchsfertig! Abklebefolien für -Teststreifen; 2 Stück. 6. Testvorbereitung 6.1. Untersuchungsmaterial und Probenlagerung Mit dem DOB/HTN IgG/IgM werden u.a. Humanseren untersucht. Diese können bis zu 6 Wochen bei 2-8 C gelagert werden. Bei -20 C können sie mehrere Monate aufbewahrt werden. Die Proben dürfen nicht mehrfach aufgetaut und eingefroren werden Vorbereitung der Komponenten Testkit auf Raumtemperatur (20-26 C) bringen. Pufferkonzentrate können konzentrationsbedingt Salzkristalle enthalten, die sich bei 37 C rasch lösen. Vor Gebrauch muss der Puffer wieder auf Raumtemperatur (20-26 C) abgekühlt sein. Benötige Reagenzmengen unmittelbar vor Gebrauch Gebrauchsfertiger Probenpuffer, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 1 ml SB 20x in 19 ml destilliertem Wasser verdünnen. Gebrauchsfertiger Waschpuffer, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 1 ml Wash 20x in 19 ml destilliertem Wasser verdünnen. Gebrauchsfertige Konjugate, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 50 µl CG 20x oder CM 20x in 950 µl gebrauchsfertigem Waschpuffer verdünnen. Verdünnen der Patientenproben, IgG: 5 µl Serum mit 1000 µl gebrauchsfertigem Probenpuffer mischen. IgM: Verdünnung wie bei IgG. Dann zu 250 µl verdünntem Serum 15 µl ABS pipettieren, 30 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren lassen. 7. Stabilität Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum bei 2-8 C haltbar. Stabilität nach Anbruch: Alle Komponenten sind nach Anbruch 3 Monate bei 2-8 C haltbar (unverdünnte Komponenten, MTP im Aluminiumbeutel mit Trockenmittel). Stabilität nach Verdünnung: Gebrauchsfertige Waschpuffer und Probenpuffer sind 1 Woche bei 2-8 C haltbar. Gebrauchsfertige Konjugatlösung muss innerhalb von 60 Min. verwendet werden. 8. Testablauf Probeninkubation: 100 µl Negativ-, Positiv-, Referenzkontrollen sowie verdünntes (evtl. mit ABS vorbehandeltes) Patientenserum in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei 37 C 45 Min. inkubieren. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und 200 µl gebrauchsfertigen Waschpuffer pro Testvertiefung einfüllen, 3x wiederholen und dann auf saugfähiger Unterlage ausklopfen. Konjugatinkubation: 100 µl gebrauchsfertiges Konjugat (IgG oder IgM) pro Testvertiefung pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei 37 C 45 Min. inkubieren. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und wie oben beschrieben waschen (4 x 200 µl pro Testvertiefung). Substratreaktion: Pro Vertiefung 100 µl gebrauchsfertiges Substrat pipettieren. 10 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren. Stoppen: Durch Zugabe von je 100 µl STOP die Farbreaktion abstoppen. Intensität der Farbreaktion innerhalb von 20 Min. bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge 650 nm). 9. Hinweise Gebrauch nur durch Fachpersonal! Wichtig für Präzision und Richtigkeit: Hämolytische, lipämische, ikterische oder mikrobiell kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen führen. Inkubationstemperatur 37 C, bzw C einhalten. Inkubationszeit 10% einhalten. Sie beginnt nach dem Einpipettieren der letzten Probe. Einhaltung der Pipettierreihenfolge: Einpipettieren der Proben: maximal 60 Sec. pro -Teststreifen. Einpipettieren von Konjugat-, Substrat- sowie Stopplösung: maximal 10 Sec. pro -Teststreifen. Sicherheitshinweise Stopplösung (Schwefelsäure) und Bestandteile des Substrats können zu Reizungen der Haut führen. Sollten diese Lösungen in die Augen gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und Arzt aufsuchen. Kontrollseren sind HBsAg-negativ, HIV- und HCV- Antikörper-negativ. Trotzdem sollten diese Komponenten wie die Proben als potenziell infektiös behandelt werden. Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel. Nicht schlucken, Haut- und Schleimhautkontakt vermeiden! Sicherheitsdatenblatt wird auf Anfrage versendet. Entsorgungshinweise Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet. Maßnahmen bei Beschädigung Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der Hersteller zu benachrichtigen. Falls einzelne Komponenten erheblich beschädigt sind, dürfen diese nicht zur Testdurchführung verwendet werden. Sie sollten so lange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie ordnungsgemäß entsorgt werden PR59165 Hanta (DOB_HTN) IgG+IgM de_v12 2

3 10. Qualitätskontrolle Als Qualitätskontrollparameter für eine gültige Durchführung des Tests müssen folgende Kriterien erfüllt sein: PG RG NEG RG PM RM NEG RM OD Positivkontrolle IgG oder OD Positivkontrolle IgM OD Positivkontrolle IgG OD Referenzkontrolle IgG OD Negativkontrolle IgG OD Referenzkontrolle IgG OD Positivkontrolle IgM OD Referenzkontrolle IgM OD Negativkontrolle IgM OD Referenzkontrolle IgM > 0,8 > 1,8 < 0,5 > 2 < 0,5 Der Testlauf ist ungültig und muss wiederholt werden, wenn obige Bedingungen nicht erfüllt sind. 11. Auswertung/Interpretation der Ergebnisse Zur Ermittlung der Ergebnisse wird der Quotient aus der optischen Dichte (OD) der Patientenprobe und der Referenzkontrolle bestimmt: OD Patientenprobe OD Referenzkontrolle und wie folgt ausgewertet: a) Für IgG-Antikörper Q < 1 1 Q 1,5 Q > 1,5 b) Für IgM-Antikörper Q < 1 1 Q 2 Q > 2 Q Negativ: keine IgG-Antikörper spezifisch gegen DOB/ HTN nachgewiesen Keine eindeutige Interpretation möglich. Es sollte eine Verlaufskontrolle nach 10 Tagen durchgeführt werden. Bei bestehendem Verdacht auf Hantavirus-Infektion wird empfohlen, die Probe auf DOB/HTN IgM- Antikörper und/oder auf Antikörper des Puumala-Serotyps zu testen. Positiv: spezifische IgG-Antikörper gegen DOB/HTN nachgewiesen. Negativ: keine IgM-Antikörper spezifisch gegen DOB/HTN nachgewiesen. Keine eindeutige Interpretation möglich. Es sollte eine Verlaufskontrolle nach 10 Tagen durchgeführt werden. Bei bestehendem Verdacht auf Hantavirus-Infektion wird empfohlen, die Probe im Puumala-IgM zu testen. Positiv: spezifische IgM-Antikörper gegen DOB/HTN nachgewiesen. 12. Evaluierung des Tests a) IgG Die Evaluierung des ursprünglichen Hantavirus (Hantaan) IgG parallel mit dem Hantavirus (Puumala) IgG sowie Hantavirus Hantaan Antibody IF Test, Hantavirus Puumala Antibody IF Test, Hantavirus Seoul Antibody IF Test, ergab nachfolgende diagnostische Effizienz a : Seoul IFT n 38 PUU-IFT n 29 HTN-IFT n 56 IFT 95% 88% 99% Hantaan b IgG 75% 98% 84% Puumala IgG Sensitivität und Spezifität wurden mit 194 Seren von gesunden Blutspendern und 123 in der Immunfluoreszenz IgG-positiven Seren überprüft, davon 56 Hantaan-Virus-IgG-positiv. Die Sensitivität betrug 98%, die Spezifität für Hantaan-Virus 99%. b) IgM Die Evaluierung des ursprünglichen Hantavirus (Hantaan) IgM parallel mit dem Hantavirus (Puumala) IgM sowie Hantavirus Hantaan Antibody IF Test, Hantavirus Puumala Antibody IF Test, Hantavirus Seoul Antibody IF Test, ergab nachfolgende diagnostische Effizienz: Seoul IFT n 47 PUU-IFT n 25 HTN-IFT n 50 IFT 95% 74% 100% Hantaan c IgM 68% 99% 62% Puumala IgM Sensitivität und Spezifität wurden mit 194 Seren von gesunden Blutspendern und 122 in der Immunfluoreszenz IgM-positiven Seren überprüft, davon 50 Hantaan-Virus-IgM-positiv. Die Sensitivität und Spezifität lagen bei 100%. 13. Erweiterung der Zweckbestimmung Zur Erweiterung der Zweckbestimmung des Progen Hantaan IgG/IgM wurden Mikrotiterplatten mit dem Dobrava-Virus-Antigen (N-Terminus des Dobrava- Virus Nukleokapsidantigens) beschichtet und mit der Mikrotiterplatte aus dem Hantaan-Virus verglichen. Getestet wurden dabei Proben aus diversen Verbreitungsgebieten der einzelnen Hantavirus Serotypen: Belgien (überwiegend PUU-Serotyp), Südeuropa/ Balkan (überwiegend DOB-Serotyp), Schweden (überwiegend PUU-Serotyp), China (überwiegend HTN- Serotyp), Mecklenburg-Vorpommern (überwiegend DOB-Serotyp), Unterfranken (überwiegend PUU- Serotyp), Baden-Württemberg (PUU-Serotyp) und im Ringversuch (u.a. Instand, diverse Serotypen) ausgegebene Proben. a Diagnostische Effizienz Spezifität/2 + Sensitivität/2 b Neu: Dobrava/Hantaan IgG (siehe Kap. 13) c Neu: Dobrava/Hantaan IgM (siehe Kap. 13) PR59165 Hanta (DOB_HTN) IgG+IgM de_v12 3

4 a) IgG n 92 IgG PROGEN Dobrava MTPL PROGEN Hantaan MTPL neg. grenzw. pos. neg grenzw pos Die beiden Plattenvarianten zeigten im IgG-Test eine Sensitivität und Spezifität von 100%, d.h. eine diagnostische Effizienz von 100%. Ein Serum wurde auf der HTN-Platte positiv und auf der DOB-Platte grenzwertig gefunden, alle anderen Seren (91) stimmten überein! b) IgM n 123 IgM PROGEN Dobrava MTPL PROGEN Hantaan MTPL neg. grenzw. pos. neg grenzw pos Im IgM-Test ergab sich eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 97,7%, d.h. eine diagnostische Effizienz von 98,9%. Ein Serum wurde auf der HTN- Platte positiv und auf der DOB-Platte grenzwertig gefunden, zwei Seren wurden auf der HTN-Platte grenzwertig. und auf der DOB-Platte negativ gefunden, für alle anderen 120 Seren ergaben sich gleiche Resultate! Ergebnis und Interpretation: Da sowohl im IgG- als auch im IgM-Test alle Dobravaund Hantaan-spezifischen Seren auf der Hantaan- Platte detektiert werden, wurde die Zweckbestimmung des Hantaan IgG/IgM-Elisas um den Dobrava-Serotyp erweitert. Der Test erhält die Bezeichnung Hantavirus Dobrava/Hantaan (DOB/HTN) IgG/IgM-. Bedingt durch die hohe Kreuzreaktivität (6, 7, 8, 10, 11, 12) der Dobrava- und Hantaan-Viren, kann eine Zuordnung des die Infektion verursachenden Serotyps unter Berücksichtigung der Reiseanamnese der Patienten vorgenommen werden: Wenn keine Reisetätigkeit außerhalb Europas vorliegt, kann von einer Dobrava- Virus Infektion ausgegangen werden (Hinweise dazu sind den Ringversuchsunterlagen von Instand zu entnehmen). 14. Weiterführende Literatur 1. Gött P, Zöller L, Yang S, Stohwasser R, Bautz EKF, Darai G. Antigenicity of Hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli. Virus Res 19: 1-16 (1991) 2. Zöller L, Yang S, Gött P, Bautz EKF, Darai G. Use of recombinant nucleocapsid proteins of the Puumala and Nephropathia epidemica serotypes of Hantaviruses as immunodiagnostic antigens. J Med Virol 39: (1993) 3. Zöller L, Yang S, Gött P, Bautz EKF, Darai G. A novel µ-capture based on recombinant proteins allows sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome. J Clin Microbiol 31: (1993) 4. Gött P, Zöller L, Darai G, Bautz EKF. A major antigenic domain of hantaviruses is located on the aminoproximal site of the viral nucleocapsid protein. Virus Genes, 14 (1):31-40 (1997) 5. Clement J, Heyman P, McKenna P, Colson P, and Avsic-Zupanc T. The Hantaviruses in Europe: from the Bedside to the Bench. Emerg Infect Diseases Vol. 3 No. 2 (1997) 6. Elgh F, Lundkvist A, Alexeyev OA, Stenlund H, Avsic-Zupanc T, Hjelle B, Lee HW, Smith KJ, Vainionpää R, Wiger D, Wadell G and P Juto. Serological Diagnosis of Hantavirus Infections by an Enzyme-linked Immunosorbent Assay Based on Detection of Immunoglobulin G and M Responses to Recombinant Nucleocapsid Proteins of Five Viral Serotypes. J Clin Microbiol 35(5): (1997) 7. Brus-Sjölander K, Lundkvist A. Dobrava virus infection: serologic diagnosis and cross-reactions to other hantaviruses. J Virol Methods 80: (1999) 8. Araki K, Yoshimatsu KM, Ogino M, Ebihara H, Lundkvist A, Kariwa H, Takashima I and J Arikawa. Truncated Hantavirus Nucleocapsid Proteins for Serotyping Hantaan, Seoul and Dobrava Hantavirus Infections. J Clin Microbiol (2001) 9. Togni G u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) 10. Aitichou M, Saleh S, McElroy A, Schmaljohn C, Ibrahim MS. Identification of Dobrava, Hantaan, Seoul and Puumala viruses by one-step real-time RT-PCR. J Virol Methods 124:21-26 (2005) 11. Mertens M. Entwicklung serologischer Testverfahren zum Nachweis Hantavirus spezifischer Antikörper und deren Anwendung bei epidemiologischen Untersuchungen. Dissertation Universität Greifswald (2010) 12. Papa A. Genetic Detection of Dobrava/Belgrade Virus, Bulgaria. Letters, Emerg Infect Diseases, Vol. 17, No. 2 (2011) 13. Krüger, DH, Schönrich, G und Klempa, B Human Vaccines 7:6, ; June 2011 PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße Heidelberg Deutschland Telefon +49 (0) 6221 / Telefax +49 (0) 6221 / info@progen.de Gültig ab: PR59165 Hanta (DOB_HTN) IgG+IgM de_v12 4

5 Schema Hantavirus DOB/HTN IgG und IgM Serumverdünnung, µl + 5 µl Nur bei IgM : 250 µl verdünntes Serum + 15 µl ABS 30 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren NEG, PG, RG, PM, RM unverdünnt; 100 µl Patientenserum verdünnt 45 Min. bei 37 C inkubieren 4 x mit 200 µl Waschpuffer waschen CON 100 µl 45 Min. bei 37 C inkubieren 4 x mit 200 µl Waschpuffer waschen S 100 µl 10 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren STOP 100 µl Optische Dichte bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge 650 nm) PR59165 Hanta (DOB_HTN) IgG+IgM de_v12 5