2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on

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1 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 1 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on MAK-Wert Spitzenbegrenzung Hautresorption Sensibilisierende Wirkung (2012) Krebserzeugende Wirkung Fruchtschädigende Wirkung Keimzellmutagene Wirkung BAT-Wert vgl. Abschn. II bder MAK- und BAT- Werte-Liste Sh Synonyma 2-Methyl-3-isothiazolon 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on 2-Methyl-4-isothiazolin-3(2H)-on Methylisothiazolon Chemische Bezeichnung 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on CAS-Nr I - M Formel S N CH 3 O C 4 H 5 NOS Molmasse 115,2 g/mol (Burnett et al. 2010) Schmelzpunkt k. A. (Burnett et al. 2010) Siedepunkt 100 C (Burnett et al. 2010) Dichte bei 25 C 1,02 g/cm 3 (Burnett et al. 2010) Dampfdruck bei 25 C 0,026 hpa (Burnett et al. 2010) log K OW 0,486 (Burnett et al. 2010) Löslichkeit vollständig löslich in Wasser,weitestgehend löslich in Acetonitril, Methanol und Hexan, wenig löslich in Xylol (Burnett et al. 2010) MAK, 55. Lieferung, 2013

2 2 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 1ml/m 3 (ppm) ¼b 4,780 mg/m 3 1mg/m 3 ¼b 0,209 ml/m 3 (ppm) Stabilität Herstellung k. A. Reinheit Verunreinigungen Verwendung 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on reagiert oxidativ mit Thiolen wie Glutathion unter Bildung von Disulfiden. Die Reaktion ist abhängig vom ph-wert. Es werden Cystin und Mercaptoacrylamid freigesetzt (Burnett et al. 2010) 96,8% (technisch) 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (0,1%), 4,5-Dichlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (0,1%), N,N 0 -Dimethyl-3,3 0 - dithiodipropionamid (0,2%), N,N 0 -Dimethyl-3,3 0 -trithiodipropionamid (0,5%), N-Methyl-3-chlorpropionamid (0,1%), Ammoniumchlorid (0,3%), H 2 O(0,2%), Ethylacetat (0,1%), Essigsäure (0,1%), unbekannt (1,5%) (Burnett et al. 2010) Konservierungsmittel in Kosmetika und anderen Körperpflegeprodukten (bis zu 0,01%), in Reinigungsmitteln, Klebstoffen, Beschichtungen, Brennstoffen, Kühlschmierstoffen, Harz-Emulsionen und diagnostischen Reagenzien; Bakterizid für die Papier- und Zellstoffherstellung, in Kühlwassersystemen, Ölfeld-Betrieben, Luftreinigungssystemen und als Holzschutzmittel (Burnett et al. 2010) 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde früher vorwiegend als 1:3-Gemisch mit 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on eingesetzt (siehe Nachtrag 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 1999). Mittlerweile findet 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auch häufig alleine in den gleichen Einsatzbereichen Verwendung wie das Gemisch. Die vorliegende Begründung basiert in großen Teilen auf der Bewertung von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on durch das Cosmetic Ingredient Review Expert Panel (Burnett et al. 2010).

3 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 3 1Allgemeiner Wirkungscharakter 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wirkt beim Menschen und am Tier hautsensibilisierend. Unverdünntes 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wirkt ätzend an der Haut von Kaninchen, 0,1%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on ist nicht hautreizend. Am Kaninchenauge wirkt eine 0,01%ige 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Lösung nicht reizend. Die 4-Stunden-LC 50 beträgt 110 mg/m 3,wobei die exponierten Ratten ab 46 mg/m 3 leichte bis starke Rötungen der Lungenlappen und vereinzelte rote, stecknadelgroße Foci in der Lunge aufweisen. Die RD 50 bei der Maus ist nach zehnminütiger Exposition größer als 157 mg/m 3 (44% Atemdepression). Die dreimonatige Gabe von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on mit dem Trinkwasser (66 94 mg/kg KG und Tag) oder mit dem Futter (41 mg/kg KG und Tag) führt bei Ratten bzw. Hunden nicht zu adversen Effekten. Eine Zwei-Generationenstudie an Ratten zeigt weder Störungen der Fertilität durch 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on noch Effekte auf die Nachkommen. Entwicklungstoxizitätsstudien an Ratten und Kaninchen geben bei maternaler Toxizität keinen Hinweis auf ein fetotoxisches oder teratogenes Potenzial. An Bakterien und im HPRT-Test an CHO-Zellen wirkt 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on nicht mutagen. Ein In-vitro-Chromosomenaberrationstest ist ausschließlich bei zytotoxischen Konzentrationen positiv. Ein UDS-Test an Hepatozyten der Ratte und ein Maus-Mikronukleustest geben keinen Hinweis auf eine genotoxische Wirkung in vivo. Untersuchungen zur kanzerogenen Wirkung von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on liegen nicht vor.eine orale Studie an der Ratte und eine dermale Studie an der Maus mit einem Gemisch von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (3,6 3,8%) und 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on geben keinen Hinweis auf ein tumorigenes Potenzial. I - M 2Wirkungsmechanismus 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (siehe Begründung 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 2-Methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on 1991) besitzen zwei elektrophile Zentren, an der Doppelbindung in Position 5 und am Schwefelatom, an denen Reaktionen mit nukleophilen Gruppen erfolgen können (Aptula et al. 2005). Untersuchungen mit Modellpeptiden zeigten, dass 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on unter Öffnung des Isothiazolinon-Ringes mit Glutathion oder mit freien SH-Gruppen von Cystein-Resten reagieren können. Unter bestimmten Bedingungen (Hapten-Überschuss, basisches Milieu) reagiert zwar 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, nicht aber 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auch mit freien Amino- Gruppen von Lysin- oder Histidin-Resten (Alvarez-Sánchez et al. 2003, 2004 a, b; Gerberick et al. 2007; Mutschler et al. 2009). 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on reagiert offenbar nicht in einer Reaktion vom Typ der Michael-Addition. Nach der zunächst raschen Reaktion mit den Peptid-SH-Gruppen folgen eine Regenerierung freier MAK, 55. Lieferung, 2013

4 4 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on SH-Gruppen und weitere Reaktionen (Roberts und Natsch 2009). 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on dürfte daher eher, wie auch für 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on angenommen (Roberts et al. 2007), in einer nukleophilen Substitutionsreaktion 2. Ordnung am elektrophilen Schwefel reagieren. 3Toxikokinetik und Metabolismus 3.1 Aufnahme, Verteilung, Ausscheidung Aufnahme In einer Diffusionszelle mit Rattenhaut befanden sich 24 Stunden nach der Aufgabe von 25, 75 oder 150 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/ml, radioaktiv am C4- und C5-Atom des Isothiazolinon-Rings markiert, konzentrationsabhängig 29,2 bis 46,4% der Radioaktivität in der epidermalen Schicht, 3,8 bis 10,4% im Stratum corneum und 0,2 bis 0,9% in der Dermis der Rattenhaut. Die Resorptionsmengen betrugen nach einer 24-stündigen Inkubation mit einer Lösung von 25, 75 oder 150 μg/ml 0,0059; 0,0277 bzw. 0,0841 μg/cm 2.Der Anteil an resorbierter Radioaktivität betrug 21,4; 33,7 bzw.51,2% (Burnett et al. 2010). In einem weiteren Kammersystem wurde humane Epidermis mit 14 C-markiertem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Konzentrationen von 52, 104 und 313 μg/ml in wässriger Lösung (20 μl/cm 2 Haut) oder 100 μg/ml in Formulierungen mit Shampoo, Körperlotion und Gesichtscreme (20 mg/cm 2 Haut) behandelt. Nach 24-stündiger Applikation fanden sich in der wässrigen Lösung noch 11 13% der ursprünglichen Radioaktivität, 7 15% konnten von der Haut abgewaschen werden, 2 4% befanden sich im Stratum corneum und 11 36% in der restlichen Epidermis. Die gesamte resorbierte Dosis betrug 29,8; 38,0 bzw. 54,7% bei Inkubation gegen 52, 104 und 313 μg/ml. Die Resorptionsrate der mittleren Konzentration betrug 0,037 μg/cm 2 und Stunde. Bei den Formulierungen betrug die Restradioaktivität in der Donor-Kammer 4 9%, 30 69% konnten von der Haut gewaschen werden, im Stratum corneum waren 2 4% und in der Epidermis 17 20% der Dosis messbar. Die gesamte resorbierte Menge betrug 29,5; 8,98 bzw. 19,6% bei Shampoo, Körperlotion und Gesichtscreme. Die Resorptionsraten betrugen 0,007 0,026 μg/cm 2 und Stunde (Burnett et al. 2010). Für die höchste Konzentration der eingesetzten wässrigen Lösungen kann aus den vorliegenden Angaben eine Resorptionsrate von 0,143 μg/cm 2 und Stunde errechnet werden. Legt man diese zugrunde, so ergibt sich bei einstündigem Hautkontakt beider Hände und Unterarme (Fläche 2000 cm 2 )gegen eine gesättigte wässrige Lösung eine Aufnahme von 286 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Verteilung Nach einmaliger Schlundsondengabevon 100mg 14 C-markiertem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/kg KG an jeweils drei männliche und drei weibliche CD-1-Mäuse wurden Blut, Plasma, Knochenmark, Oberschenkelknochen und Leber der Tiere nach einer Stunde sowie 3, 6, 24 und 48 Stunden untersucht. Bei den frühen Untersuchungszeitpunkten war die Radioaktivität in allen Geweben hoch, am höchsten in der Leber, am niedrigstenimknochen.nach24stunden sank dieradioaktivitätinden Gewebensigni-

5 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 5 fikant, nach 48 Stunden wies das Blut das höchste Gewebe/Plasma-Verhältnis auf. Im Knochenmark betrug die Konzentration 1,2 39,4 μg/ml bei den männlichen und 1,1 30,4 μg/ml beiden weiblichen Tieren (Burnett et al.2010). Ausscheidung Nach einmaliger Schlundsondengabe von 5oder 50 mg 14 C-markiertem 2-Methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on/kg KG an jeweils vier männliche und vier weibliche Sprague- Dawley-Ratten wurden innerhalb von 24 Stunden 80 87% der Radioaktivität ausgeschieden. Davon fanden sich 53 70% im Urin und 21 37% in den Faeces. Nach 96 Stunden war im Restkörper,vorwiegend im Blut, 1,9 3,6% verblieben. Die Gesamtwiederfindung betrug 92 96%. Die initiale Eliminationshalbwertszeit aus dem Plasma betrug 3 6 Stunden und war nicht dosisabhängig. Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Tieren traten nicht auf (Burnett et al. 2010). Eine weitere Untersuchung wurde an vier Gallengangs-kanülierten Ratten mit einmaliger Schlundsondengabe von 50 mg 14 C-markiertem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on/kg KG und Tagdurchgeführt. Vonden Tieren wurde 24 Stunden lang Gallenflüssigkeit, Urin und Faeces gesammelt. Über 88% der verabreichten Dosis wurde innerhalb von 24 Stunden wiedergefunden, davon 29,1% in der Gallenflüssigkeit, 52,9% im Urin und 6,1% in den Faeces (Burnett et al. 2010). 3.2 Metabolismus In der im Abschnitt 3.1 beschriebenen Studie mit einmaliger Schlundsondengabe von 5 oder 50 mg 14 C-markiertem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/kg KG an jeweils vier männliche und vier weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden bei der HPLC-Untersuchung von Urin und Faeces 23 Metaboliten bestimmt. Die Muttersubstanz selbst konnte weder im Urin noch in den Faeces nachgewiesen werden. Hauptmetaboliten im Urin waren N-Methylmalonaminsäure, das 3-Mercaptursäure-Konjugat von 3-Thiomethyl-N-methylpropionamid und N-Methyl-3-hydroxyl-propionamid mit 21 23, bzw.4 5% der verabreichten Dosis (Burnett et al. 2010). In einer der Untersuchungen an vier Gallengangs-kanülierten Ratten (siehe Abschnitt 3.1), denen einmalig oral 50 mg 14 C-markiertes 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/ kg KG und Tag verabreicht wurde, wurden in Gallenflüssigkeit, Urin und Faeces mit LC/MS und LC/MS/MS 31 Metaboliten, aber keine Muttersubstanz nachgewiesen. Die Hauptmetaboliten waren N-Methylmalonaminsäure und das 3-Mercaptursäure-Konjugat von 3-Thiomethyl-N-methylpropionamid (Burnett et al. 2010). I - M 4Erfahrungen beim Menschen 4.1 Einmalige Exposition Hierzu liegen keine Angaben vor. MAK, 55. Lieferung, 2013

6 6 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 4.2 Wiederholte Exposition Hierzu liegen keine Angaben vor. 4.3 Wirkungauf Haut und Schleimhäute Die dermale Reizwirkung wurde an 40 Probanden untersucht, denen 24 Stunden lang 15 μl 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Konzentrationen von 0,01; 0,03 oder 0,06% auf den Rücken appliziert wurde (k. A. zur Applikationsmethode). Der Reizindex aus den Ablesungen nach einer Stunde und nach 24 Stunden betrug insgesamt 6,3; 1,3 und 6,3 bei 0,01; 0,03 bzw. 0,06%. Der Reizindex der Negativkontrolle (Wasser) war 5,0. Unter diesen Versuchsbedingungen war 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on nicht reizend (Burnett et al. 2010). Auch ähnliche Versuche mit 0,01%igem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Shampoo, Körperlotion oder Sonnencreme wirkten an jeweils 40 Probanden nicht hautreizend (Burnett et al. 2010). 4.4 Allergene Wirkung Hautsensibilisierende Wirkung Epikutantests Im Epikutantest wird 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Deutschland als 0,05%- ige (500 ppm) Zubereitung in Wasser getestet. Die 0,01%ige wässrige Zubereitung des 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Gemisches enthält 0,0025% (25 ppm) 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Der Reaktionsindex 1) für die 0,05%ige 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung von 0,43 und das Positivity Ratio 2) von 61,4% weisen die Testzubereitung als für den Epikutantest gut geeignet aus (Schnuch et al a). Elf gegen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on sensibilisierte Patienten wurden mit 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitungen (in Wasser/Ethanol 9:1) in abgestuften Konzentrationen von etwa 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,029%, 0,015%, 0,01%, 0,005%, 0,0015%, 0,0007%, 0,0005%, 0,00035% und 0,000035% (entsprechend etwa 60; 30; 15; 8,8; 4,4; 2,9; 1,5; 0,4; 0,2; 0,15; 0,105 und 0,0105 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/cm 2 )epikutan getestet. Auf 60, 30 und 15 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on/cm 2 reagierten je zehn der Untersuchten positiv und auf 1,5 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/cm 2 noch sechs der Untersuchten. Auf niedrigere Konzentrationen wurden keine Reaktionen beobachtet, jedoch reagierten sieben Untersuchte im Repeated Open Application Test (ROAT) auf 0,2 und 0,105 μg 2-Methyl-2,3-dihydro- 1) 2) Der Reaktionsindex ist definiert als der Quotient: (a -d-i)/(a þ d þ i); mit: a = Anzahl allergischer Reaktionen, d = Anzahl fraglicher Reaktionen, i = Anzahl irritativer Reaktionen (Brasch und Henseler 1992). Das Positivity Ratio ist definiert als der Prozentsatz einfach positiver Reaktionen an der Gesamtheit der positiven Reaktionen (Geier et al. 2003).

7 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 7 isothiazol-3-on/cm 2 und 2 auf 0,0105 μg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/cm 2 positiv (Lundov et al b). Fallberichte über beruflich bedingte Sensibilisierungen Nach wiederholtem Kontakt der Hände, der Stirn und der Unterarme mit Kleistern/Klebern, die mit 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on konserviert waren, traten bei einem Maler ekzematöse Hautveränderungen an den exponierten Hautarealen auf. Ein anderer, inder Herstellung von Stärke für die Papierindustrie tätiger Beschäftigter hatte akzidentellen Kontakt mit einem unverdünnten, 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on enthaltenden Konservierungsmittel. Hände und Gesicht wurden von dem Beschäftigten umgehend dekontaminiert, nicht aber die Füße bzw. Schuhe. Etwa eine Stunde später registrierte der Mann ein Brennen an den Füßen und erythematöse Hautveränderungen, worauf er auch die Füße dekontaminierte und Strümpfe und Schuhe wechselte. Nach einer Woche entwickelte sich schließlich eine vesikuläre Hautreaktion an den Händen, die innerhalb von zwei Wochen abheilte. Beide Patienten reagierten im Epikutantest auf 0,02% 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser. Bei der weiteren Testung mit abgestuften Konzentrationen reagierten beide Patienten auch auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und auf ein 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltiges Biozid bis zu einer Wirkstoffkonzentration von etwa 0,003% (30 ppm; einfach und zweifach positive Reaktionen) und auf 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on ab einer Konzentration von 0,0075% (zweifach und dreifach positive Reaktionen), nicht aber auf 0,00375% 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Isaksson et al. 2004). Bei vier von 14 Beschäftigten aus der Farbenherstellung traten nach Einführung eines 7-10% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 1-2,5% 2-Octyl-4-isothiazolin-3-on enthaltenden Biozids zur Produkt-Konservierung Hautveränderungen vor allem an den Händen sowie im Nacken und an den Unterarmen auf. Alle vier reagierten im Epikutantest mit einer zweifach positiven Reaktion auf 0,105% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (in Wasser verdünntes, kommerzielles 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-onhaltiges Biozid) und je einer mit einer einfach bzw. zweifach positiven Reaktion und zwei mit einer fraglichen Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/ 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Bei der Papierherstellung wurde auch ein weiteres 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on enthaltendes Produkt eingesetzt und ebenfalls manuell im offenen System verarbeitet, während das zuvor verwendete 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltige Biozid mittlerweile weitgehend mittels eines geschlossenen Dosiersystems gehandhabt wurde (Thyssen et al. 2006). I - M Weitere Fallberichte In einem Fall wurden die ekzematösen Hautveränderungen in den Axillae auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in einem Deodorant zurückgeführt. Die Patientin zeigte im Epikutantest auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, auf das Deodorant und nach 2 Tagen auf 0,02% 2-Methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on in Vaseline jeweils eine zweifach positive Reaktion. Nähere Angaben, ob das Deodorant tatsächlich nur 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on zur Konservierung enthielt, fehlen jedoch (Amaro et al. 2011). MAK, 55. Lieferung, 2013

8 8 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on Ein Kontaktgel für einen Schlankheitsgürtel, das 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in einer unbekannten Konzentration enthielt, löste bei einem Patienten eine erythematöse Reaktion im Kontaktbereich aus. Der Patient litt außerdem seit längerem an einem Perianalekzem und gab an, drei verschiedene feuchte Toilettenpapiere verwendet zu haben. Er reagierte im Epikutantest nach 72 Stunden mit einer fraglichen Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und mit einer zweifach positiven Reaktion auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Uter et al. 2012). Fünf von sechs Patienten mit allergischer Reaktion auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltiges, feuchtes Toilettenpapier und eine Patientin mit Dermatitis der Augenlider nach Anwendung eines 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltigen Makeup-Entferners wurden epikutan u. a. mit 0,1% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on getestet, bei allen mit positivem Ergebnis (einfach bis dreifach positive Reaktionen am vierten Tag). Vier der Patienten zeigten auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on/2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on keine oder eine deutlich geringer ausgeprägte Reaktion. In zwei Fällen wurde auch auf 0,001% (10 ppm) 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on eine einfach positive Reaktion registriert, die übrigen Patienten wurden lediglich mit der hohen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Konzentration getestet (García-Gavín et al. 2010). In drei weiteren Fällen mit ekzematösen Reaktionen auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltiges, feuchtes Toilettenpapier wurden zwar im Epikutantest positive Reaktionen auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on beobachtet, 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde jedoch nicht separat im Epikutantest überprüft (Gardner et al. 2010). Bei einer Restaurantangestellten stellte sich zwei Monate nach Aufnahme der Tätigkeit in einem Restaurant, in dem die Wände frisch gestrichen waren, tätigkeitsabhängig zunächst ein periorbitales Ödem und später eine vesikuläre Gesichtsdermatitis ein. Sie reagierte im Epikutantest sowohl auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on als auch auf 0,2% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on in Wasser mit einer zweifach positiven Reaktion. Die Exposition gegen ein mit 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on konserviertes Kosmetikum zur Gesichtsreinigung führte umgehend zu einer Exazerbation der Gesichtsdermatitis (Kaae et al. 2012). Klinisch-epidemiologische Daten In der Universitätsklinik Kopenhagen wurde 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on zwischen Mai 2006 und Februar 2010 als 0,2%ige wässrige Zubereitung routinemäßig bei 2536 Patienten im Epikutantest überprüft. Eine positive Reaktion zeigten dabei 37 Patienten (1,5%), 15 von ihnen mit gleichzeitiger Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Lundov et al. 2010). Zwischen 2006 und 2008 wurden in acht finnischen Kliniken Patienten auch epikutan mit 0,1% und 0,03% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser getestet (Verdünnungen eines kommerziellen, 9,8% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on enthaltenden Biozids). Auf die höhere Konzentration zeigten 147 (1,4%) und auf die niedrigere Konzentration 69 (0,6%) der Patienten eine positive Reaktion. Das 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-gemisch führte bei 194 Patienten zu einer positiven Reaktion, in 97 Fällen ohne Reaktion auf 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Gleichzeitige Reaktionen auf 0,1% 2-Methyl-2,3-

9 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 9 dihydroisothiazol-3-on und 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl- 2,3-dihydroisothiazol-3-on traten bei 97 Patienten auf, während 50 Patienten zwar auf 0,1% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, nicht aber auf das Gemisch reagierten. Ein ROAT mit einer 0,01% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on enthaltenden Lotion wurde bei 33 Patienten, die auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on positiv reagiert hatten, durchgeführt und ergab bei zehn Patienten (mit einfach bis dreifach positiver Reaktion auf 0,1% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on bei gleichzeitiger einfach oder zweifach positiver Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on) nach maximal zwei Wochen ein positives Resultat (Ackermann et al. 2011). 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde in den Kliniken des Informationsverbundes Dermatologischer Kliniken (IVDK) im Jahr 2005 als Anhang zur Standardreihe ( Monitor-Block ), in den Jahren 2006 und 2007 eher sporadisch sowie in den Jahren 2008 und 2009 als Bestandteil der Testreihen Konservierungsstoffe und Industrielle Biozide bei insgesamt Patienten getestet. Hierbei wurden 215 positive Reaktionen (1,5%) registriert. Von 199 Patienten mit positiver Reaktion auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on zeigten 134 (67,3%) auch eine positive Reaktion auf 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Schnuch et al a). Im Jahr 2009 betrug die Reaktionsquote bei 6789 getesteten Patienten 1,9% (Männer 2,6%, Frauen 1,6%) und stieg bis zum Jahr 2011 bei 7292 getesteten Patienten auf 4,4%, bei Männern auf 4,0% und bei Frauen noch deutlicher auf 4,6%. Parallel dazu stieg auch die Quote positiver Reaktionen auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on von 2,3% auf 3,9% an, bei Männern von 2,5% auf 3,8% und bei Frauen von 2,2% auf 3,9%. Da bei den Patienten mit positiver Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auch der Anteil gleichzeitiger positiver Reaktionen auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on von 43,3% auf 58,9 % anstieg, ist anzunehmen, dass der Anstieg der Reaktionsquote auf das chlorierte Gemisch auf Kreuzreaktionen infolge einer zunehmenden Sensibilisierungsquote gegen das in den letzten Jahren vermehrt eingesetzte 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on zurückzuführen ist. Diese Interpretation wird dadurch unterstützt, dass insbesondere in der Gruppe der jüngeren Patienten, bei denen eine Kosmetikunverträglichkeit vermutet worden war, ein besonders ausgeprägter Anstieg dieser Kreuzreaktionen von 27,3% auf 60,7% auftrat, die sich vermutlich damit erklärt, dass 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, nicht aber das Gemisch mit der chlorierten Verbindung in den letzten Jahren auch vermehrt in Kosmetika eingesetzt wurde (Geier et al. 2012). Bezogen auf die relative Einsatzhäufigkeit des 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-ons in Kosmetika unter Berücksichtigung von 3541 Leave-on-Produkten wurde für 2-Methyl- 2,3-dihydroisothiazol-3-on ein Sensibilisierungsrisiko abgeschätzt, das in etwa dem für die Formaldehyd-Abspalter Imidazolidinylharnstoff und Diazolidinylharnstoff entsprach (Schnuch et al b). In den Universitätskliniken Lissabon und Leuven wurde bis Ende 2010 bei insgesamt 23 Fällen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on als der für eine Sensibilisierung ursächliche Inhaltsstoff von kosmetischen Produkten angenommen. 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde von November 2005 bis April 2006 zunächst in 0,1%iger, dann in 0,15%iger und 0,2%iger Konzentration sowie danach wiederum in 0,1%iger Konzen- I - M MAK, 55. Lieferung, 2013

10 10 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on tration und ab Mai 2010 in 0,05%iger Konzentration getestet. Angaben zur Zahl der Getesteten und zu den Reaktionsausprägungen fehlen jedoch (Travassos et al. 2011). Von 2001 bis 2010 wurden in den Zentren der Danish Contact Dermatitis Group 219 Maler mit 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on als Bestandteil der Standardreihe epikutan getestet, bei 22 von ihnen mit positivem Ergebnis. Bei 41 der Untersuchten wurde auch mit 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on getestet (k. A. zur Testkonzentration), in elf Fällen mit positivem Ergebnis (Mose et al. 2012). Berichte über Epikutantestreaktionen auf Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on bei Patienten mit primärer Sensibilisierung gegen das Gemisch 5-Chlor-2-methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on/2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on Von 22Patienten mit bestehender Sensibilisierung gegen das 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Gemisch und initialer Epikutantestreaktion auf 0,03% oder 0,025% des Gemisches in Wasser reagierten zwei Patienten im Epikutantest auch positiv auf 0,0075%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Methanol/Wasser (k. w. A.), entsprechend dem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Gehalt in der 0,03%igen 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung. Sechs Patienten, die vermutlich durch den Epikutantest mit dem Gemisch sensibilisiert wurden, zeigten keine Reaktion auf die 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Testzubereitung. Weitere 18 Patienten mit bestehender 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Sensibilisierung (vier davon mit Sensibilisierung durch den Epikutantest) wurden epikutan mit 0,0225% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on getestet, davon in vier Fällen mit einem positiven Ergebnis (Bruze et al a). In einer anderen Untersuchung zeigten drei von zwölf Patienten mit bestehender 5- Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on- Sensibilisierung im Epikutantest eine fraglichereaktionauf 0,0115%iges2-Methyl- 2,3-dihydroisothiazol-3-on in Ethanol und einer von ihnen auch auf 0,00575%iges 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Bruze et al. 1989). Einer unveröffentlichten Untersuchung aus den Kliniken des IVDK zufolge zeigten 27 von 85 Patienten mit bestehender 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Sensibilisierung auch auf 0,05 oder 0,1%iges (Irritationsschwelle) 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser eine einfach oder zweifach positive Reaktion (Burnett et al. 2010). Zwei Beschäftigte aus der Metallindustrie mit einer Sensibilisierung durch einen 5- Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-haltigen Kühlschmierstoff reagierten im Epikutantest gleich ausgeprägt (zweifach bzw. dreifach positive Reaktion) auf 0,03%iges 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on und 0,03%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, die nach chromatographischer Auftrennung in Vaseline zubereitet wurden. Auch einer der Autoren der Publikation, der bei der chromatographischenauftrennung der Bestandteilesensibilisiertwurde, reagierte jeweilsmit einer zweifach positivenreaktion auf beide Testzubereitungen (Pilger et al. 1986). Bei einem Automechaniker trat nach etwa 24-jähriger Tätigkeit mit regelmäßigem Kontakt zu Dieselöl, dem seit drei Jahren ein 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol- 3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Gemisch zur Konservierung zugesetzt wur-

11 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 11 de, ein Handekzem auf, das nach Benutzung von 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-konserviertem feuchten Toilettenpapier exazerbierte. Im Epikutantest zeigte sich eine zweifach positive Reaktion auf 5-Chlor- 2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und auf 0,02%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser (Bruynzeel und Verburgh 1996). Von drei gegen 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on sensibilisierten Beschäftigten, zwei infolge einer akzidentellen Verätzung, aus einem Betrieb zur Herstellung von Bindemitteln für Farben und Kleber, die im Epikutantest eine dreifach positive Reaktion auf 0,02%iges 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 0,015%iges 5-Chlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on zeigten, reagierte nur einer mit einer einfach positiven Reaktion auf 0,1%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (keine Angabe zum Vehikel), nicht aber auf eine technische wässrige Zubereitung mit 0,095%igem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Isaksson et al. 2008). Bei einem Patienten mit bestehender Sensibilisierung gegen mehrere Konservierungsstoffe,darunter auch 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, traten im Zuge des Streichens mit Wandfarben, die neben 1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on und 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auch geringe Mengen 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on enthielten, ein Erythem im Gesicht und Atemwegssymptome auf, die unter systemischer Corticoid- und Antihistaminika-Gabe nicht länger als einen Tag persistierten. Nach dreiwöchiger Abwesenheit und Abbruch der Medikation kehrte der Mann in das Haus zurück, worauf sich drei Tage später sowohl die Haut- als auch die Atemwegssymptomatik erneut einstellten. Auch an den Hautregionen, an denen der Mann zwei Monate zuvor im Epikutantest (Lundov et al b; siehe Epikutantests ) gegen abgestufte Konzentrationen von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on exponiert worden war, traten Reaktionen auf. In einem zweiten Fall wurden ebenfalls Hautreaktionen auf den 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Gehalt von Wandfarben zurückgeführt, der betroffene Patient zeigte jedoch im Epikutantest lediglich eine fragliche Reaktion auf 0,2% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser (Lundov et al a). I - M Repeated Insult Patch Tests In einem Repeated Insult Patch Test (RIPT) wurde Gruppen zu je 80 Freiwilligen an 21 aufeinanderfolgenden Tagen für jeweils 23 Stunden 0,0050%, 0,01%, 0,025% (Gruppe 1-3), 0,05% (Gruppe 4) oder 0,1% (Gruppe 5) 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 98%) okklusiv appliziert. Nach einer 10- bis 14-tägigen Pause erfolgte die Auslösebehandlung in den Gruppen 1 bis 3 mit den zur Induktion eingesetzten Konzentrationen. Bei den Gruppen 4 und 5 wurde eine Auslösebehandlung mit 0,01%, 0,025% und 0,05% bzw. 0,025%, 0,05% und 0,1% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on durchgeführt. Während der Induktionsbehandlung wurden in allen Gruppen gering ausgeprägte, transiente und als irritativ gewertete Reaktionen beobachtet. Nur in Gruppe 5 zeigten zwei Probanden bei der Auslösebehandlung eine Reaktion (k. w. A.), die als Ausdruck einer Sensibilisierung gewertet wurde (Burnett et al. 2010). Eine Gruppe von 98 Probanden, die im Epikutantest keine Reaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on gezeigt hatten, erhielt in einem RIPT während drei Wochen an vier Tagen der Woche jeweils eine 23- MAK, 55. Lieferung, 2013

12 12 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on stündige okklusive Applikation von 150 μl einer 0,01%igen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung. Nach einer einwöchigen Pause erfolgte die Auslösebehandlung auf die gleiche Weise, jedoch mit etwa 24-stündiger Applikation. Außer bei einem Probanden, der im Nachhinein als bereits sensibilisiert betrachtet wurde, trat bei keinem der Probanden eine allergische Reaktion auf (Burnett et al. 2010). In einer Serie von fünf RIPT (drei Wochen, dreimal pro Woche je 24-stündige okklusive Applikation von 200 μl) wurden folgende 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on- Konzentrationen (Verdünnungen eines 50% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on enthaltenden industriellen Konservierungsmittel-Konzentrates) verwendet: 0,02% (Gruppe 1, 100 Probanden), 0,03% (Gruppe 2, 98 Probanden), 0,04% (Gruppe 3, 116 Probanden), 0,05% (Gruppe 4, 210 Probanden) und 0,06% (Gruppe 5, 214 Probanden). Während der Induktionsphase wurden keine irritativen oder allergischen Reaktionen beobachtet. Die Auslösebehandlung mit den zur Induktion verwendeten Konzentrationen erfolgte in den Gruppen 1und 2nach einer einwöchigen Pause und in den Gruppen 3 bis 5nach zehn- bis 14-tägiger Pause. Nur je ein Proband der Gruppen 3und 4zeigte dabei eine erythematöse Reaktion (Burnett et al. 2010) Photokontaktsensibilisierung Ineinem zweiwöchigen RIPT(Repeated Insult Patch Test)mit insgesamt sechsmaliger 24- stündigerapplikation einer0,02%igen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung (20 μl bei derersten und je 6 μl bei den folgenden Applikationen) wurde jeweils eine zusätzliche Bestrahlung mit der zweifachen minimalen Erythemdosis (MED) UVA/UVB vorgenommen. Nach einer Pause von9-14 Tagenerfolgteeine24-stündige okklusiveapplikation (5μl/cm 2 )mit einer anschließenden Applikation von 2μl/cm 2 und der Bestrahlung mit 10J/cm 2 UVA und 0,5 MED UVA/UVB. Bei den Ablesungen nach 24 und 48 Stundenzeigte sichbei keinem der32probanden einereaktion (Burnett et al.2010) Atemwegssensibilisierende Wirkung Bei einem Patienten mit bestehender Sensibilisierung gegen mehrere Konservierungsstoffe, darunter auch das Gemisch 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, traten im Zuge des Streichens mit Wandfarben, die neben 1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on und 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auch geringe Mengen 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on enthielten, neben einem Erythem im Gesicht auch Atemwegssymptome auf, die unter systemischer Corticoid- und Antihistaminika-Gabe nicht länger als einen Tag persistierten. Nach dreiwöchiger Abwesenheit und Abbruch der Medikation kehrte der Mann in das Haus zurück, worauf sich drei Tage später sowohl die Haut- als auch die Atemwegssymptomatik erneut einstellten. Trotz Inhalation eines Beta-Sympathomimetikums wies der Patient eine deutlich reduzierte Lungenfunktion auf (forciertes exspiratorisches Volumen der ersten Sekunde (FEV1): 1,4 l(39% des Erwartungswertes); forcierte Vitalkapazität (FVC): 2,2 l(47%)). Der Mann kehrte unter lokaler und systemischer Corticoid-Medikation erneut in das Haus zurück, wo er die Medikation nach 2 Wochen, während derer die gestrichenen Räume ausgiebig gelüftet wurden, abbrach, ohne dass ein Rezidiv der Symptomatik eintrat (FEV1: 3,0 l; FVC: 4,0 l). Provokationstests oder andere immunologische Untersuchungen wurden nicht durchgeführt (Lundov et al a).

13 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on Reproduktionstoxizität Hierzu liegen keine Angaben vor. 4.6 Genotoxizität Hierzu liegen keine Angaben vor. 4.7 Kanzerogenität Hierzu liegen keine Angaben vor. 5Tierexperimentelle Befunde und In-vitro-Untersuchungen 5.1 Akute Toxizität Inhalative Aufnahme In einer vierstündigen Inhalationsstudie wurden jeweils sechs männliche und sechs weibliche Sprague-Dawley-Ratten gegen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,8%) in Konzentrationen von 46, 129, 150, 1070 oder 2090 mg/m 3 nur über die Nase exponiert. Die beiden hohen Konzentrationen waren für alle Tiere letal. Die makroskopische Untersuchung zeigte bei allen (k. w. A.) Tieren leichte bis starke Rötungen der Lungenlappen, vereinzelte rote, stecknadelkopfgroße Foci in der Lunge und gasgefüllte Mägen. Die LC 50 dieser Untersuchung betrug 110mg/m 3 (Burnett et al. 2010). Bei männlichen Swiss-Webster-Mäusen war die RD 50 nach einer zehnminütigen Exposition größer als 157 mg/m 3.Eswurden jeweils vier männliche Tiere gegen 2-Methyl- 2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 98,6%) in Konzentrationen von 3,12; 6,76; 10,5; 27,8; 64,6; 74,9; 90,7; 92,2 oder 157 mg/m 3 exponiert (Partikelgröße nicht berichtet). Die Respirationsraten waren bei der niedrigsten Konzentration um 25% und bei der höchsten um 44% vermindert. Die größte Atemdepression fand mit 47% bei 74,9 mg/ m 3 statt (Burnett et al. 2010). I - M Orale Aufnahme Männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,5%) in Dosierungen von 0, 75, 150, 180 oder 225 mg/kg KG mit der Schlundsonde verabreicht. Die männlichen Tiere erhielten eine zusätzliche Dosis von 300 mg/kg KG. Die Nachbeobachtungszeit betrug 14 Tage. Die weiblichen Tiere zeigten ab der niedrigsten Dosis, die männlichen ab 150 mg/kg KG Vergiftungssymptome (k. w. A.), die nach sechs Tagen bei den überlebenden Tieren reversibel waren. Bei der makroskopischen Untersuchung wiesen die gestorbenen Tiere einen gerö- MAK, 55. Lieferung, 2013

14 14 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on teten Magen und Darm mit rötlichem Inhalt auf. Die LD 50 betrug für die männlichen Tiere 235 mg/kg KG, für die weiblichen Tiere 183 mg/kg KG (Burnett et al. 2010). An jeweils sechs männliche und sechs weibliche CD-1-Mäuse wurde 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,5%) in Dosierungen von 0, 150, 200 oder 250 mg/ kg KG mit der Schlundsonde verabreicht und die Tiere wurden 14 Tage lang nachbeobachtet. Die höchste Dosis war für alle Tiere letal. In allen Gruppen waren ab einer Stunde nach der Substanzgabe klinische Vergiftungssymptome zu beobachten. Bei der makroskopischen Untersuchung zeigten die verendeten Tiere Veränderungen am Gastrointestinaltrakt. Die LD 50 betrug 167 mg/kg KG (k. w. A.; Burnett et al. 2010). Die LD 50 des Hauptmetaboliten N-Methylmalonaminsäure beträgt bei männlichen Ratten 3550 mg/kg KG und bei weiblichen Ratten 4100 mg/kg KG (Burnett et al. 2010) Dermale Aufnahme Jeweils sechs männlichen und sechs weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde 24 Stunden lang 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,5%) in Dosierungen von 0, 100, 200, oder 400 mg/kg KG dermal okklusiv appliziert. Eine zusätzliche Gruppe von sechs männlichen Tieren erhielt 300 mg/kg KG. Ab dem ersten Tagnach der Behandlung traten klinische Vergiftungssymptome auf (k. w. A.). Die überlebenden Tiere erholten sich bis zum 5. Tag der insgesamt 14-tägigen Nachbeobachtungszeit. Die Körpergewichtszunahme war ab 200 mg/kg KG vermindert. An allen behandelten Hautflächen wurden Ausbleichungen, Ödeme, dunklere Bereiche, Krusten, Verschorfungen und Austrocknungen beobachtet. Die Tiere, für die die Behandlung letal war, wiesen Veränderungen des Gastrointestinaltraktes auf. Die dermale LD 50 dieser Untersuchung betrug 242 mg/kg KG (k. w. A.; Burnett et al. 2010). 5.2 Subakute, subchronische und chronische Toxizität Inhalative Aufnahme Hierzu liegen keine Angaben vor Orale Aufnahme Ratte In einer dreimonatigen Studie erhielten jeweils zehn männliche und zehn weibliche Sprague-Dawley-Ratten 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,5%) in Dosierungen von 0, 75, 250 oder 1000 mg/l Trinkwasser (0, 6,5 9,8; 19 25; mg/kg KG und Tag). Nach der 13. Woche wurden Neurotoxizitäts-Tests (Functional Observational Battery) und während der letzten Studienwoche eine Prüfung der motorischen Aktivität mit einem Infrared Motion Activity Cage System durchgeführt. Eine ophthalmologische Untersuchung erfolgte am Ende der Studie. Die Behandlung war für keines der Tiere letal. In der hohen Dosisgruppe war bei den männlichen Tieren die Futteraufnahme und bei beiden Geschlechtern die Körpergewichtszunahme reduziert. Eine verminderte Trinkwasseraufnahme wurde bei den weiblichen Tieren bei mg/kg KG und Tag beobachtet, bei den männlichen Tieren in allen Behandlungsgruppen. Die Autoren vermuten, dass die reduzierte Körpergewichtszunahme, Futter-

15 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 15 und Wasseraufnahme auf den schlechten Geschmack der Substanz zurückzuführen ist. Es traten weder neurotoxische noch andere systemische substanzbedingte Effekte auf. Die makro- und mikroskopischen Untersuchungen, Ophthalmoskopie, Hämatologie und klinische Chemie waren ohne auffälligen Befund. Der NOAEL betrug nach Angaben der Autoren 1000 mg/l im Trinkwasser (66 94 mg/kg KG und Tag) (Burnett et al. 2010). Hunde Gruppen von jeweils vier männlichen und vier weiblichen Beagle-Hunden erhielten drei Monate lang 0, 100/130, 400 oder 1500 mg 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on/ kg Futter (Reinheit 51,4%), entsprechend 0, 3, 10 bzw. 41 mg/kg KG und Tag. Eine ungenügende Wiederfindung (k. w. A.) in der niedrigen Dosisgruppe führte zu einer Erhöhung der Dosis von 100 auf 130 mg/kg Futter. Ophthalmologische Untersuchungen wurden am Ende der Studie durchgeführt. Hämatologische und klinisch-chemische Untersuchungen wurden vor der Behandlung, in der 7. Woche und am Ende der Studie durchgeführt. Es traten weder behandlungsbedingte Mortalität, klinische Symptome, veränderte Organgewichte noch histopathologische Befunde auf. Eine verminderte Körpergewichtszunahme wurde bei den männlichen und weiblichen Tieren der hohen Dosisgruppe in der ersten Woche beobachtet. Der Effekt war in der dritten bzw. vierten Woche reversibel. Die Futteraufnahme in dieser Dosisgruppe war während der gesamten Behandlungszeit reduziert, aber nicht statistisch signifikant. Auch traten in dieser Gruppe keine signifikanten Änderungen der hämatologischen Parameter auf (k. w. A.). Nach Ansicht der Autoren beträgt daher der NOAEL 1500 mg/kg Futter (41 mg/kg KG und Tag; Burnett et al. 2010) Dermale Aufnahme Hierzu liegen keine Angaben vor. I - M 5.3 Wirkungauf Haut und Schleimhäute Haut In einer Untersuchung zur hautreizenden Wirkung wurde 0,5 ml 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 97,8%) auf die rasierte intakte Haut von Weißen Neuseeländer-Kaninchen gegeben und anschließend eine oder vier Stunden semi-okklusiv oder drei Minuten lang offen exponiert. Die Haut wurde eine Stunde nach der Behandlung und nach weiteren 24, 48 und 72 Stunden sowie nach sieben und 14 Tagen begutachtet. Zeichen systemischer Toxizität traten nicht auf. Ein und zwei Wochen nach ein- und vierstündiger Exposition trat an der behandelten Stelle ausgehöhlter Schorf auf. Die dreiminütige Exposition verursachte sehr leichte bis deutliche Erytheme, die bis zu 48 Stunden lang nachweisbar waren, und sehr leichte bis mäßige Ödeme, die bis zu 24 Stunden, bei einem Tier bis zu 72 Stunden lang nachweisbar waren. Die Autoren schlossen, dass die einstündige semi-okklusive Exposition gegen unverdünntes 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auf der Haut ätzend wirkt (Burnett et al. 2010). MAK, 55. Lieferung, 2013

16 16 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on In weiteren Untersuchungen mit verdünntem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (0,01%) war eine vierstündige semi-okklusive Exposition auf der rasierten intakten Haut von Weißen Neuseeländer-Kaninchen nicht reizend. Auch die vierzehntägige tägliche Applikation von bis zu 0,1%igem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on führte nicht zu kumulativen Reizwirkungen (Burnett et al. 2010). Phototoxizität 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in einer Konzentration von 0,02% in Wasser zeigte an weiblichen Hartley-Meerschweinchen keine phototoxische Wirkung. In dieser Untersuchung wurden den Tieren 20 μl der Zubereitung topisch appliziert und die Applikationsstelle anschließend mit langwelligem UVA-Licht bestrahlt ( nm; 10,0 bis 11,9 J/cm 2 ). Vier, 24und 48 Stunden später wurden keine Hautreaktionen beobachtet (Burnett et al. 2010) Auge Eine 0,01%ige wässrige 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Lösung, hergestellt aus 9,69% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Neolone 950, wurde bei sechs Kaninchen in je einen Konjunktivalsack appliziert (k. A. zum Volumen). Die Augen wurden nach 24 Stunden ausgewaschen und eine Stunde, 24, 48 und 72 Stunden nach der Instillation begutachtet. Die Autoren bewerteten 0,01%ige wässrige 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Lösung als nicht reizend (Burnett et al. 2010). Eine in anionischer Körperlotion auf 0,01% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on verdünnte Neolone-950-Lösung (hergestellt aus 9,69% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on in Neolone 950) wurde an sechs Kaninchen auf Reizwirkung am Auge untersucht. Die Instillation von je 0,1 ml in je einen Konjunktivalsack führte nicht zu Effekten an Cornea, Iris und Konjunktiven. Eine entsprechende Untersuchung mit Sonnencreme führte ebenfalls nicht zur Augenreizung (Burnett et al. 2010). 5.4 Allergene Wirkung Hautsensibilisierende Wirkung In einem modifizierten Maximierungstest (intradermale Induktion mit 0,076% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Propylenglykol; epikutane Induktion mit 0,038% 2- Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on nach vorangehender topischer Behandlung mit Natriumlaurylsulfat in Dimethylacetamid/Aceton/Ethanol (4:3:3); Auslösung mit 0,015% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Ethanol) zeigten vier von 24 weiblichen Dunkin-Hartley-Meerschweinchen eine positive Reaktion. In einer zweiten Gruppe reagierten elf von 24 Tieren positiv, während bei zwölf Kontrolltieren keine Reaktionen beobachtet wurden. Zwei Tage nach der Auslösebehandlung erhielten die Tiere der zweiten Gruppe eine nochmalige intradermale Injektion der 0,076%igen 2-Methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on-zubereitung und wurden weitere 5Tage später nochmals einer epikutanen Auslösebehandlung unterzogen, wobei acht positive Reaktionen auftraten. Drei Tiere der mit 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on vorbehandelten zweiten Gruppe zeigten eine Kreuzreaktion auf 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on, aber

17 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on 17 nur bei einem von 24 mit 5-Chlor-2-methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on vorbehandelten Tieren trat eine Reaktion auf 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on auf (Bruze et al b). In einem ähnlich durchgeführten Maximierungstest wurden bei 24 mit 4,5-Dichlor-2- methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on vorbehandelten weiblichen Dunkin-Hartley-Meerschweinchen keine Kreuzreaktionen auf 0,015%iges 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3- on in Ethanol beobachtet (Bruze et al c). Wässrige 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitungen (Gruppe 1: 0,1%; Gruppe 2: 0,5%; Gruppe 3: 1,5% und Gruppe 4: 3%; Reinheit 99,8%) wurden in einem modifizierten Buehler-Test zur zehnmaligen, jeweils sechsstündigen okklusiven Induktionsbehandlung dreimal pro Woche an Gruppen zu je 10 Hartley-Meerschweinchen verwendet. Nach einer zweiwöchigen Pause erfolgte die Auslösebehandlung mit 0,1%, 0,5% und 1,5% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Wasser.Auf die 0,1%ige Zubereitung zeigte nur ein Tier der Gruppe 3 eine positive Reaktion. In den Gruppen 2, 3 und 4 reagierten 2, 1 bzw. 2 Tiere positiv auf die Auslösebehandlung mit 0,5% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Mit der höchsten Testkonzentration wurden positive Reaktionen bei 1von 10 (Gruppe 1), 6von 10 (Gruppe 2), 3von 10 (Gruppe 3) und 5 von 10 (Gruppe 4) Tieren ausgelöst (Burnett et al. 2010). 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in einer Reinheit von 99,7% wurde in einem Maximierungstest sowohl für die intradermale als auch für die epikutane Induktions- und Auslösebehandlung von jeweils 20 weiblichen Hartley-Meerschweinchen in Konzentrationen von 0,055% und 0,08% eingesetzt. Auf die niedrige Konzentration trat keine und auf die höhere Konzentration nur eine positive Reaktion auf. Bei der erneuten Auslösebehandlung mit 0,1%iger 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde bei weniger als 30% der Tiere eine gering ausgeprägte erythematöse Reaktion beobachtet (Burnett et al. 2010). Gruppen zu je acht weiblichen HsdPoc:DH-Meerschweinchen erhielten in einem offenen Epikutantest während vier aufeinanderfolgender Wochen 20 Applikationen von jeweils 100 μl einer 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung in Ethanol/Wasser (Gruppe 1: 0,15%; Gruppe 2: 0,25%; Gruppe 3: 0,4%; Gruppe 4: 0,6%; Gruppe 5: 1,5%; Gruppe 6: 18%). Drei Tage nach der letzten Induktionsbehandlung erfolgte die sechsstündige offene Auslösebehandlung mit 25 μl der Zubereitungen. Hierbei zeigten 1von 8(Gruppe 2), 3von 8(Gruppe 3), 1von 8(Gruppe 4), 1von 8(Gruppe 5) und 4 von 8(Gruppe 6) Tieren eine positive Reaktion. Eine erneute Auslösebehandlung wurde in den Gruppen 1bis 4mit der parallelen Applikation von 0,4%, 0,6%, 1,5% und 18% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on durchgeführt. Die Tiere der Gruppe 5erhielten 0,25%, 0,6%, 1,5% und 18% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on und die Tiere der Gruppe 6 0,15%, 0,6%, 1,5% und 18% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on. Positive Reaktionen wurden nur bei 2 von 8 Tieren der Gruppe 5(1,5%ige Auslösekonzentration) sowie bei 1 von 8(1,5%ige Auslösekonzentration) und 6 von 8(18%ige Auslösekonzentration) Tieren der Gruppe 6beobachtet (Burnett et al. 2010). I - M Local Lymph Node Assay Das Sensibilisierungsvermögen von 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on wurde auch in mehreren Local Lymph Node Assays (LLNA) mit CBA/J-Mäusen untersucht. Mit 0,1-; 1- und 3%igem 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Reinheit 99,8%) in Aceton wurden nach Applikation der Substanz an vier aufeinanderfolgenden Tagen bei MAK, 55. Lieferung, 2013

18 18 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on CBA/J-Mäusen Stimulationsindices von < 1,0; 2,3 sowie 3,2 ermittelt, entsprechend einer zu einer Verdreifachung der Lymphozytenproliferation notwendigen Konzentration (EC 3 -Wert) von etwa 2,5% (Potter und Hazelton 1995). In einem weiteren LLNA mit Substanzapplikation an drei aufeinanderfolgenden Tagen wurde 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on (Handelsprodukt mit einem 2-Methyl-2,3- dihydroisothiazol-3-on-gehalt von 10,37%) in 0,15-, 0,45-, 0,76-, 1,35-, 1,57- und 1,80%iger Konzentration in Aceton/Olivenöl (4:1) eingesetzt. Die ermittelten Stimulationsindizes betrugen etwa 2,1; 2,4; 2,2; 6,6; 4,7 sowie 6,6. Der EC 3 -Wert wurde mit 0,86% errechnet (Burnett et al. 2010). Die dreimalige Substanzapplikation führte in einem LLNA mit etwa 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,5% sowie 1% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Aceton/Olivenöl (4:1) oder 1%, 2%, 4,9% sowie 9,9% 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on in Propylenglykol zu Stimulationsindices von 1,5; 1,5; 1,8; 3,8 sowie 2,5 bzw. 1,9; 2,6; 7,0 sowie 7,6. Hieraus wurden EC 3 -Werte von 0,4% bzw.2,2% errechnet (Basketter et al. 2003). Photokontaktsensibilisierende Wirkung In einem modifizierten Split-Adjuvant-Test (intradermale Injektion von 100 μl Freundschem kompletten Adjuvans; Klebebandabriss der Hornschicht; offene Applikation von 100 μl einer 0,02%igen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung in Wasser) wurden die Applikationsareale nach 30 Minuten mit langwelligem UVA bestrahlt ( nm; 9,9 bis 11,2 J/cm 2 ). Die Substanzapplikation und die UVA-Bestrahlung wurden an fünf aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Die Auslösebehandlung mit 20 μl der Testzubereitung erfolgte 16 Tage später, gefolgt von einer UVA-Bestrahlung mit 10,0 bis 10,2 J/cm 2.Nach 24 und 48 Stunden wurden weder auf den unbestrahlten, noch auf den bestrahlten Hautarealen Reaktionen beobachtet (Burnett et al. 2010). Atemwegssensibilisierende Wirkung In einer Untersuchung zur 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-induzierten Zytokin- Sekretion wurde weiblichen BALB/c-Mäusen am 1. und 6. Tagje50μleiner 0,5%igen 2-Methyl-2,3-dihydroisothiazol-3-on-Zubereitung in Aceton/Olivenöl (4:1) auf die geschorenen Flanken appliziert. Am 12., 13. und 14. Tag erhielten die Tiere jeweils Applikationen von 25 μl der Zubereitung auf beide Ohren. Die aurikulären Lymphknoten wurden entnommen, aus ihnen Zellsuspensionen mit 10 7 Zellen/ml hergestellt und diese sechs Tage mit sowie ohne das T-Zell-Mitogen Concanavalin A kultiviert. Im Zellüberstand wurden die Zytokine IFN-γ, IL-10, IL-5 und IL-13 zum Zeitpunkt der maximalen Sekretion nach 96 bis 120 Stunden sowie das Concanavalin-A-induzierte IL-4 nach 24 Stunden mittels ELISA bestimmt. Hierbei fanden sich zwar 2,5 ng/ml IFN-γ als Indiz für eine Th1-Antwort neben 0,6 ng IL-10/ml, 0,9 ng IL-13/ml und 0,2 ng IL-5/ml, aber im Gegensatz zu dem parallel getesteten Trimellitsäureanhydrid (1,3 ng IFN-γ/ml, 2,9 ng IL-13/ml, 9 ng IL-4/ml) kein IL-4 als Indiz für eine Th2-Antwort (Basketter et al. 2003).