In vitro detection of contact (photo-) allergens:

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1 In vitro detection of contact (photo-) allergens: Development of an optimized protocol and performance of an international ring study using human Peripheral Blood Monocyte Derived Dendritic Cells Hendrik Reuter, PhD Experimental Toxicology, Beiersdorf AG December 2011

2 DANKE Dr. Andreas Schepky, Silke Gerlach, Jochem Spieker, Nadine Karschuk, Uwe Pfannenbecker, Dr. Walter Diembeck, Dr. Wolfgang Pape, Dr. Horst Wenck Experimental Toxicology; Hendrik Reuter December 2011

3 Toxikologischer Endpunkt: Sensibilisierung Hintergründe Allergische Kontaktdermatitis, Typ IV- Allergy: T-Zell vermittelt Verursacht durch niedermolekulare reaktive Chemikalien (Haptene) Haptene können sein: Antibiotika, Antimykotika, Metallionen, kosmetische Inhaltsstoffe

4 Kontaktallergie - Grundlagen Stratum corneum Epidermis Langerhans Cells Dermis Dendritic Cells Subcutis Dr. Hendrik Reuter

5 Kontaktallergie - Grundlagen Stratum corneum Epidermis Hapten (Testsubstanz) Hapten-Peptid- Komplex Dermis Subcutis

6 Kontaktallergie Grundlagen: Prozessierung/MHC II Stratum corneum Epidermis Dermis Dendritic Cell Hapten Hapten-Peptid- Komplex MHCII HLA-DR/P/Q Subcutis

7 Kontaktallergie: Wanderung zum Lymphknoten Sensibilisierung?

8 Kontaktallergie - Grundlagen Dendritic Cell CD8 + CD8 + CD8 + CD8 + CD8 + CD4 + CD4 + CD4 + TCRαβ MHCII/Hapten

9 Kontaktallergie - Grundlagen CD4 + CD4 + CD4 + CD4 +

10 Kontaktallergie - Grundlagen CD8 + CD8 + CD8 + CD8 + CD8 + CD4 + CD4 + CD4 +

11 Kontaktallergie - Grundlagen Sensibilisierung Auslösung CD8 +

12 Kontaktallergie - Grundlagen Stratum corneum Epidermis Auslösung der Allergie Hapten CD8 + Dermis Subcutis

13 Endpunkt: Sensibilisierung Klassische Tierversuchsmethoden gemäß Chemikalienprüfung Klassische Methoden zur Identifizierung des Sensibilisierungspotenzials einer Substanz: Bühler Test (normale Applikation) Guinea Pig Maximization Test (GP MT) (provokativer Test mit Adjunvanz) Local Lymph Node Assay (LLNA) (mechanistisch basierter Test (Refinement))

14 Endpunkt Sensibilisierung - Klassische Tierversuchsmethoden Klassische Tierversuchsmethoden, durch die eine sensibilisierende Substanz identifiziert werden kann: Bühler Test Guinea Pig Maximization Test (GP MT) Local Lymph Node Assay (LLNA)

15 Local Lymph Node Assay (LLNA) 3 x Test Substance 3 H Methyl- Thymidin 5 days 5 hours Lymph Node Analysis in β-scintillation Counter EC3

16 Endpunkt Sensibilisierung - Neue Alternative Methoden An optimized protocol using human Peripheral Blood Monocyte Derived Dendritic Cells

17 Experimental Setup Ficoll gradient and magnetic bead separation Differentiation with IL4 and GM-CSF Blood Donor CD14 enriched Monocytes Unmature PBMDCs Incubation with test substance Antibody staining Analysis Activated PBMDCs Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 18

18 Differentiation of Monocytes to PBMDCs influence of IL4 concentrations Reuter et al. Toxicology in vitro 2011 Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 19

19 Differentiation of Monocytes to PBMDCs influence of IL4 concentrations CD86 induction decreases with [IL-4] Reuter et al. Toxicology in vitro U/ml Interleukin-4 and 200 U/ml GM-CSF for differentiation Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 20

20 Basal CD86 expression on differentiated PBMDCs obtained from 397 donors Reuter et al. Toxicology in vitro 2011 Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 21

21 Cytotox Limit ΔCD 86 [%] Viability > 80% Dead Cells Reuter et al. Toxicology in vitro 2011 Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 22

22 Experimental Setup Ficoll gradient and magnetic bead separation Differentiation with IL4 and GM-CSF (5d) Blood Donor CD14 enriched Monocytes Unmature PBMDCs Incubation with test substance (48h) Antibody staining Analysis ΔCD86 = % CD86 + treated cells - % CD86 + untreated cells Activated PBMDCs ΔCD86 > 20% Sensitizer Reuter et al. Toxicology in vitro 2011 Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 23

23 Versuchsaufbau Photosensibilisierungs-Assay Ficoll gradient and magnetic bead separation Differentiation with IL4 and GM-CSF (5d) Blood Donor CD14 enriched Monocytes Unmature MoDCs Incubation with test substance (2d) UV irradiation Antibody staining Analysis Activated MoDCs Experimental Toxicology; Hendrik Reuter Dec 2011 Seite 24

24 Experimental Toxicology; Hendrik Reuter June 2011 Seite 25

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