INSTITUT FÜR BIOTECHNOLOGIE IN DER PFLANZENPRODUKTION DER UNIVERSITÄT FÜR BODENKULTUR

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1 INSTITUT FÜR BIOTECHNOLOGIE IN DER PFLANZENPRODUKTION DER UNIVERSITÄT FÜR BODENKULTUR Vorstand: Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. nat. techn. Hermann Bürstmayr Betreuer: Ao. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. nat. techn. Marc Lemmens MASTERARBEIT Kolbenfusariosebestimmungen bei Mais am Feld: Untersuchung verschiedener künstlicher Inokulationsmethoden Eingereicht von Peter Pokorny Wien, im März

2 DANKSAGUNGEN An erster Stelle bedanke ich mich bei meinem Betreuer, Herrn Prof. Dr. Marc Lemmens, der mein Interesse der mein Interesse an der Erforschung der Resistenzmechanismen von Fusarium spp. geweckt hat und auch ermöglichte, dass ich mich mit einem so interessanten Thema auseinandersetzen konnte und auch stets eine Antwort auf meine Fragen parat hatte, mir bei den vielen Stunden am Feld zur Seite stand und auch nie den Überblick für das Wesentliche verloren hat. Weiters bedanke ich mich auch beim gesamten IFA Team der Biotechnologie in der Pflanzenproduktion für ihre Unterstützung. Des weiteren bedanke ich mich noch von ganzem Herzen bei meinen Eltern, die mir meine Ausbildung ermöglichten und mir den finanziellen und geistigen Rückhalt geboten haben, der für einen erfolgreichen Abschluss eines Studiums notwendig ist. Schließlich richtet sich mein Dank auch noch an meine Großeltern, die mich während meines gesamten Studiums freundlicherweise bei sich wohnen ließen, sodass ich mich nicht um eine Unterkunft zu sorgen hatte, und mir auch mit Rat und Tat während des gesamten Studiums beiseite standen. 2

3 Einleitung, Problemstellung, Ziele der Arbeit und experimentelle Vorgangsweise!... 6 Einleitung und Problemstellung!... 6 Ziele der Arbeit!... 7 Experimentelle Vorgangsweise!... 7 Literatur!... 7 Die Gattung Fusarium!... 7 Krankheitsbild und Symptome!... 8 Negative Effekte durch Kolbenfusariose!... 9 Zyklus der Krankheit! Umweltabhängigkeit der Krankheit! Kontrolle von Kolbenfusariose! Resistenzmechanismen der Maispflanze! Inokulationsmethoden und Resistenzkomponenten! Molekulare Genetik und QTL-Mapping! QTL-Mapping für Resistenz gegen Gibberellafäule! QTL-Mapping für Resistenz gegen Fusariumfäule! Zusammenhang zwischen QTL für Resistenz gegen Fusariumfäule, gegen andere Kolbenfäulen und ackerbaulichen Eigenschaften! Molekulargenetik von Gibberella-Kolbenfäule und Mykotoxinanreicherung!.. 16 Molekulargenetik von Fusarium-Kolbenfäule und Mykotoxinanreicherung! Verwendung der QTL-Kartierung in der praktischen Züchtung! Aspekte der Pflanzenzucht! Material und Methoden! Maishybriden! Versuchsaufbau für die Resistenzuntersuchung mit künstlicher Inokulation!19 Versuchsaufbau für die Untersuchung der natürlichen Infektion! Herstellung und Eigenschaften der Isolate!

4 Inokulationsmethoden! Bonituren der Krankheit! Statistische Datenverarbeitung! Ergebnisse! Injektion in den Seidenkanal! Zahnstochermethode! Natürliche Infektion! Korrelationsanalysen! Vergleichbarkeit der Wirkung der Resistenzmechanismen gegen verschiedene Fusariumarten! Korrelation des Gesamtbefalls nach Injektion von F. graminearum und F. verticillioides! Korrelation des Gesamtbefalls nach mechanischer Verletzung von F. culmorum und F. verticillioides! Vergleichbarkeit verschiedener Inokulationstechniken! Korrelation des Gesamtbefalls nach mechanischer Verletzung und nach Injektion in den Seidenkanal! Korrelation der Befallshäufigkeit nach Injektion in den Seidenkanal mit jener nach mechanischer Verletzung mittels Zahnstocher! Vergleich der Resistenzmechanismen nach künstlicher Inokulation mit jenen der Feldresistenz nach natürlichen Infektionsbedingungen! Korrelation des Gesamtbefalls aller Kolben nach natürlicher Infektion und nach Injektion in den Seidenkanal als auch nach mechanischer Verletzung!.. 35 Korrelation der Befallshäufigkeit nach mechanischer Verletzung mittels Zahnstocher mit jener nach natürlicher Infektion! Diskussion! Genotypen! Umwelt! Vergleich der Inokulationsmethoden! Auswertung der Gesamtresistenz! Resistenzrangreihung nach Injektion in den Seidenkanal!

5 Resistenzrangreihung nach mechanischer Verletzung! Vergleich der Resistenzrangreihungen! Wirksamkeit der Resistenzen gegenüber verschiedenen Fusariumarten! Wirksamkeit der Resistenzen bei natürlicher und künstlicher Infektion! Zusammenfassung! Literaturverzeichnis! Anhang! Tabellenverzeichnis! Abbildungsverzeichnis!

6 1. Einleitung, Problemstellung, Ziele der Arbeit und experimentelle Vorgangsweise 1.1. Einleitung und Problemstellung Mais, inklusive CCM (Corn Cob Mix), ist mit einer Fläche von ha (2011) 15,63 % der Ackerflächen Österreichs die zweitwichtigste Ackerfrucht der heimischen Landwirtschaft. Innerhalb der EU-27 wird Mais mit einer Fläche von 18 Mio. ha auf 17,3% der Ackerflächen angebaut. Weltweit wird mit 150 Mio. ha Mais auf fast einem drittel aller Getreideanbauflächen angebaut. Mit der Ausbreitung und Intensivierung des Maisanbaus hat jedoch auch das Auftreten der Kolbenfusariose durch Fusarium spp. bei ungünstigen Umweltbedingungen zu massiven Problemen geführt (Lew, 1993). Die Bedeutung der Kolbenfäulen ist weniger in den kaum in Zahlen zu fassenden Massenverlusten zu sehen, sondern in den bisweilen ganz erheblichen Qualitätsverlusten des Erntegutes. Da mehrere Fusariumarten Mykotoxinbildner sind, kann ein höherer Anteil befallenen Erntegutes zu Gesundheitsproblemen bei Mensch und Tier führen wenn befallenes Gut als Nahrungsoder Futtermittel verwendet wird (Hurle et al., 1996). Da eine direkte Bekämpfung der Krankheit mit chemischen Mitteln nicht möglich ist, und auch sonstige pflanzenbauliche Maßnahmen nur zum Teil greifen, steht der Anbau resistenter Sorten zur Ertragssicherung und vor allem Qualitätssteigerung beim Maisanbau im Vordergrund. Das Vorkommen der Kolbenfusariosen ist jedoch unter natürlichen Bedingungen sehr stark von den vorherrschenden Klimaverhältnissen abhängig, die zu jährlichen Schwankungen im Fusariumbefall führen. Eine genaue Überprüfung der Kolbenfusarioseresistenzen diverser Genotypen ist auf Grund des unregelmäßigen Auftretens der Krankheit extrem schwierig. Eine mögliche Lösung bietet der Einsatz künstlicher Inokulationsmethoden, die den Umwelteinfluss einschränken und trotzdem praxisrelevante Daten zur Prüfung der Fusariumresistenzen erlauben. Diese Inokulationsmethoden beruhen auf den beiden natürlichen Infektionswegen des Krankheitserregers, über die Seiden oder nach Verletzung des Kolbens und der Körner. Gegenüber diesem Infektionsverlauf sind die auftretenden Resistenzmechanismen der Maispflanze in bereits vorhandener Literatur beschrieben (Reid und Hamilton, 1996). Die durch künstliche Inokulationsmethoden erhaltenen Informationen, sollten jedoch auch das genetische Resistenzniveau der geprüften Hybride unter natürlichen Umweltbedingungen wieder spiegeln. 6

7 1.2. Ziele der Arbeit Die Ziele der Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: Die Untersuchung der verschiedenen Resistenzmechanismen gegenüber Kolbenfusariose bei Mais Ein Vergleich dieser Resistenzmechanismen an einem Maissortiment bestehend aus 18 Genotypen ungarischer Herkunft und 19 Genotypen österreichischer Herkunft Der Vergleich der Resistenzdaten, erhoben nach künstlichen Inokulationen mit Resistenzdaten, erhoben nach natürlicher Infektion Herausarbeitung der Kombinationseignung dieser Genotypen hinsichtlich der Möglichkeit der Züchtung neuer Sorten um die Resistenzeigenschaften zu verbessern Experimentelle Vorgangsweise Um ein möglichst breites Spektrum an Sorten zu prüfen, wurden insgesamt 37 verschiedene Genotypen ausgewählt. Diese Hybride wurden sowohl unter natürlichen Umwelt- und Infektionsbedingungen als auch unter kontrollierten Bedingungen angebaut, künstlich inokuliert und bonitiert. Die Inokulationen wurden mit zwei verschiedenen Methoden durchgeführt (Reid und Hamilton, 1996), um natürliche Infektionswege optimal nachzuahmen, und die daraus resultierenden unterschiedlichen Resistenzverhalten der Sorten zu ermitteln. Dabei wurden sämtliche Genotypen bonitiert und selbst ermittelt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Diplomarbeit ungefähr 7210 Kolben künstlich inokuliert und Einzelpflanzen bonitiert. Um einen Vergleich der Resistenzdaten zu erhalten, wurden anschließend die gesammelten Daten mit Hilfe statistischer Programme ausgewertet, analysiert und interpretiert. 2. Literatur 2.1. Die Gattung Fusarium Für den weitaus größten Anteil der Erkrankungen an unseren Kulturarten sind die phytopathogenen Pilze verantwortlich. Die von den Pilzen hervorgerufenen Ertragsausfälle und Qualitätseinbußen sind von Kultur zu Kultur unterschiedlich und werden außerdem maßgeblich durch den Witterungsablauf bestimmt (Börner, 1997). Auch viele Fusarienarten werden zu den pflanzenpathogenen Pilzen gezählt. In der künstlichen Gruppe der Deuteromycotina, auch als Fungi imperfecti bezeichnet, sind alle jene Pilze zusammengefasst, deren sexuelle Fruchtform noch nicht gefunden ist, oder nicht vorhanden ist. Es werden daher nur asexuelle Konidien gebildet. Die Deuteromycotina machen etwa 30% aller Pilze aus, und zu ihnen gehören phytopathogene Pilze von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Auch die Gattung Fusarium zählt man zur Gruppe der Deuteromycotina. Die Konidien entstehen in den Sporodochien und sind hyalin, mehrzellig und meist typisch sichelförmig. Außer diesen sichelförmigen Makrokonidien, werden auch hyaline Mikrokonidien und unter bestimmten Bedingungen Dauerhyphen oder Chlamydosporen gebildet (Bedlan, 1988). 7

8 Nach der Taxonomie von Nirenberg (1989) können laut Untersuchungen von Adler (1993), in Österreich mittlerweile zwölf verschiedene Fusariumarten bei Getreide und Mais isoliert werden. Diese sind: F. avenaceum, F. cerealis, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F. poae, F. proliferatum, F. subglutinans, F. sporotrichioides, F. tricinctum und F. verticillioides (F. moniliforme), wobei je nach Umweltbedingungen F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae und F. subglutinans am häufigsten vorkommen (Lew, 1993). Von einigen Arten sind auch sexuelle Formen bekannt. So gilt z.b. die Art Gibberella zeae, vor allem verantwortlich für Kolbenfäule am Mais in Österreich, als die sexuelle Form von F. graminearum Schwabe (Nelson et. al., 1983) Krankheitsbild und Symptome Fusarium-Pilze können Schäden an allen Pflanzenorganen (Blatt, Stengel, Kolben) hervorrufen, aber vor allem der Befall der Kolben wird als gravierend betrachtet. Kolbenfäulen sind häufig bereits äußerlich an den Lieschen durch weißliche, lachsfarbene bis zimtfarbene Beläge zu erkennen. Unter den oftmals verklebten Lieschen sind die Kolben von einem dichten Pilzgeflecht partiell oder ganzflächig überzogen, das bei Vorherrschen von F. poae rein weiß bei F. subglutinans weiß bis hellrosa und bei F. culmorum oder F. graminearum mehr rosapurpur bis rot gefärbt ist. Unter dem Pilzgeflecht befinden sich rot bis braun verfärbte Körner, die zum Teil aufgeplatzt sind. Bei fortgeschrittener Infektion ist auch die Spindel bräunlichrot verfärbt und verrottet (Hurle et al., 1996). Hauptverantwortlich für Kolbenfusariosen bei Mais in Österreich sind F. graminearum und F. subglutinans, die meist auf Pflanzenrückständen der Wirtspflanze wie Maisstengel, Kolben oder sonstigen Erntebruchstücken an der Bodenoberfläche zu finden sind. Von hier aus kann entweder direkt ein infektiöses Myzel wachsen oder es werden Sporen gebildet, die vom Wind oder über andere Vektoren, wie z.b. Insekten verteilt und somit auf neue Wirtspflanzen gelangen. In Maisbeständen wächst F. graminearum ursprünglich auf den Seidenfäden, erst später folgt auch eine Infektion der Körner und des Kolben. In den meisten Fällen bildet sich hierbei ein weißlicher bis roter Schimmelpilzbelag auf den Körnern (Lemmens und Krska, 1996). Bei sehr stark befallenen Kolben treten oft Verklebungen der Seiden und der Lieschen mit den Körnern auf, und eine Erkrankung ist bereits an den verfärbten Lieschen und an der Kolbenspitze zu erkennen. Bei verzögerter Abreife und feuchtnassen Umweltbedingungen, bilden sich oft auch kleine, schwarze, runde Peritezien (entsprechen den Produktionsstätten der Ascosporen) von Gibberella zeae an der Oberfläche der infizierten Lieschen (Ried und Hamilton, 1996). Infektionen mit F. subglutinans, die zu einer Erkrankung des Kolbens führen, werden normalerweise durch natürlich auftretende Wunden direkt am Kolben (z.b. durch Insektenfraß (z.b. Maiszünsler,Ostrinia nubilalis, Hagel oder Vogelschäden) gefördert. Auch hier ist eine Ausbreitung des Myzels am gesamten Kolben möglich, meist werden jedoch nur einzelne Körner oder abgegrenzte Regionen befallen. Charakteristisch für diese Fusariumart ist ein weißes bis hellrosanes Myzel zwischen den Körnern und unter den Lieschen. In den meisten Fällen erfolgt eine Infektion im Korn am Embryo, so dass oft Anfangs keine äußerlichen Symptome sichtbar sind (Snijders, 1994). Eine Infektion von Mais, als auch von Weizen wird durch wärmere Temperaturen und anhaltender Feuchtigkeit vor allem zur Zeit der Blüte und der Milchreife begünstigt. Wurde eine Pflanze erfolgreich infiziert, folgt ein rasches Wachsen des Schimmelpilzes bei steigender Pilzgiftproduktion. 8

9 Nach der Ernte kann sowohl ein Weiterwachse des Pilzes, als auch eine fortlaufende Mykotoxinproduktion stattfinden, wenn nicht rasch sachgemäß getrocknet oder eingelagert wird Negative Effekte durch Kolbenfusariose Obwohl Auftreten und Stärke der Kolbenfäule von Jahr zu Jahr schwankt, ist dennoch mit einer Reduktion des Erntepotentials der Hybride durch mangelnde Kornausbildung und eine Minderung der Erntequalität durch die Mykotoxinbildung dieses Pathogens zu rechnen. Dies ist vor allem für Tierproduzenten von Bedeutung, ins Besondere für die Schweinezucht, da diese Tiere am stärksten auf die gebildeten Mykotoxine reagieren. Die zwei wichtigsten von F. graminearum produzierten Mykotoxine sind das Zearalenon (ZON) und das Desoxynivalenol (DON, Vomitoxin). Zearalenon ist ein Östrogen wirksames Fusarientoxin, das nach kanadischen Untersuchungen leicht kanzerogen ist (Kuiper-Goodman, 1989). Zearalenonvergiftungssymptome sind Schwellungen und Entzündungen der Vulva, Vergrößerung des Uterus und Fruchtbarkeitsstörungen. Weiters ist mit einer verminderten Wurfgröße und Futterverweigerungen zu rechnen. Das bei Mais in den höchsten Konzentrationen auftretende Fusarientoxin ist das trichothecene Gift Vomitoxin. Es besitzt zwar nur eine geringe akute Toxizität, ist aber deshalb für die Landwirtschaft bedeutsam, weil es Freßunlust bzw. Futterverweigerung bei Haustieren, insbesondere bei Schweinen, hervorruft. Zusätze von 1mg Vomitoxin/kg Futter führen bei Schweinen bereits zu einer Verringerung der Futteraufnahme, ab 5 mg/kg Futter zu Erbrechen oder Futterverweigerung (Schuh, 1982). Zusätzlich ist Vomitoxin immunsuppressiv (Tryphonas et al., 1983; Pestka et al., 1987) und es hemmt die Protein-, DNS- und RNS-Synthese (Adler, 1987). Eine weitere wichtige Fusariumart in Österreich ist F. subglutinans, dessen Auftreten häufig mit dem des Maiszünslers beobachtet wurde (Lew et al.,1991). Diese Fusariumart bildet das Toxin Moniliformin (MON), welches als äußerst giftig und herzschädigend einzustufen ist, (Chelkowski et al., 1995) und das Zellgift Beauvericin (BEA) (Logrieco et al., 1993; Krska et al., 1996). Stärker toxische Fusarienmetaboliten wie T-2 Toxin oder HT-2 Toxin, sowie die krebsfördernden Fumonisine werden von Fusarienarten gebildet, die in Österreich eine geringere Rolle spielen (Lew, 1993). Folgende Tabelle 2.1. stellt eine Übersicht der in Österreich vorkommenden Fusarienarten dar und zeigt zusätzlich die gebildeten Mykotoxine und deren Wirkungen: 9

10 Tab.2.1.: Fusarien und Fusarientoxine bei Mais in Österreich. (nach Lew, 1993) F. subglutinans F. graminearum DOMINIERENDE FUSARIENARTEN BEI MAIS Moniliformin Beauvericin Zearalenon GEBILDETE TOXINE Desoxynivalenol (Vomitoxin) Acetyldesoxynivalenol* WIRKUNG myokardschädigend zytotoxisch östrogenaktiv,carcinogen immunsuppressiv,emetisch F. verticillioides Fumonisine carcinogen Zusätzlich auftretende Fusarienarten F. avenaceum Moniliformin myokardschädigend F. poae Nivalenol* emetisch,hämorrhagisch F. tricinctum Moniliformin myokardschädigend F. equiseti Zearalenon T-2 Toxin* HT-2 Toxin* F. culmorum Zearalenon Desoxynivalenol östrogenaktiv, carcinogen immunsuppressiv,zytotoxisch hämorrhagisch östrogenaktiv, carcinogen immunsuppressiv,emetisch F. croockwellense (F. cerealis) Zearalenon, Nivalenol östrogenaktiv, carcinogen emetisch, hämorrhagisch F. oxysporum Moniliformin* myokardschädigend F. sporotrichioides T-2 Toxin HT-2 Toxin immunsuppressiv,zytotoxisch hämorrhagisch *wird nur von einer Minderheit der Isolate gebildet 2.4. Zyklus der Krankheit Da Fusariumarten nicht nur parasitisch, sondern auch saprophytisch zu leben vermögen, ist mit allgegenwärtigem Auftreten zu rechnen. Die Überwinterung erfolgt am Saatgut und saprophytisch an befallenen Pflanzenresten im und auf dem Boden. Im Sommer werden von freiliegenden Myzelpolster durch den Wind Sporen abgeweht, deren weiterer Infektionsweg, nach der Besiedlung der Narben durch Fusarium, über den Seidenkanal in die Kolbenspitze zu verfolgen ist. Dabei dringen die auskeimenden Hyphen entweder direkt in die sich entwickelnden Körner ein, oder sie besiedeln diese äußerlich. Hier kann das Schadbild entweder sofort entstehen, oder nach einer Latenzphase bei Einsetzen günstigerer Entwicklungsbedingungen für den Pilz, später zum Ausbruch kommen (Hurle et al., 1996). 10

11 Vorraussetzungen, die den Infektionsvorgang erleichtern, sind einerseits regnerische und kühle Spätsommer- und Herbstwochen mit hoher Luftfeuchtigkeit, sowie alle Faktoren, die dazu führen, dass der natürliche Schutz des Kolbens durch geschlossene Lieschen durchbrochen wird, z.b. bei Befall der Kolben durch den Maiszünsler, durch Frühfröste, Hagelschäden oder sonstige mechanische Verletzungen der Kolben (e.g. Wind-, Vogelschäden). In all diesen Fällen werden die Lieschen geöffnet und Regenwasser schwemmt die Pilzsporen bis tief an die Kolbenbasis. Dort finden sie bei hoher Luftfeuchtigkeit unter den Lieschen ideale Keim- und Entwicklungsbedingungen (Lew, 1993). Weiters werden rissige oder weißrissige Körner, die sich bei ungleichmäßigem Wasserhaushalt bilden, rasch infiziert. Kolbenfäulen sind auch Folgeerscheinungen von Frostschäden und dem Umbrechen der Pflanzen durch Stengelverrottung. Als Wirtspflanzen der genannten Fusariumarten kommen alle Getreidearten, Mais und zahlreiche Gräser, sowie, je nach Fusariumart, zahlreiche Arten weiterer Pflanzenfamilien in Betracht. Eine direkte Bekämpfung im Bestand ist nicht möglich. Die weitere Ausbreitung der Fäulen im Lager muss durch unmittelbar nach dem Drusch einsetzende Trocknung unterbunden werden. Weitere Maßnahmen, die ein Auftreten der Kolbenfäule verhindern sollen, sind eine optimale Standort- und Sortenwahl auch in Bezug auf die Stengelbruchresistenz, eine möglichst rechtzeitige Ernte, eine ausgeglichene Düngung, eine vielseitige Fruchtfolge und eine mischende und wendende Bodenbearbeitung (Hurle et al, 1996). Die Wahl und der Anbau einer resistenten Sorte zählt zu den biologischen oder integrierenden Maßnahmen gegen Krankheiten wie etwa Fusarium und bietet daher eine günstige Möglichkeit zur Ertragssicherung und vor allem Qualitätssteigerung bei der Maisproduktion. Hierbei werden sogenannte biologische Abwehrmechanismen, die auf bestimmten Resistenzgenen lokalisiert sind aktiviert. Je nach Sorte bzw. Genotyp, unterscheiden sich die Resistenzeigenschaften und damit auch die Widerstandskraft einer Sorte gegenüber einem Krankheitsbefall Umweltabhängigkeit der Krankheit Infektionen durch Fusarium sind unter natürlichen Umweltbedingungen sporadisch und von Jahr zu Jahr stark von den jeweiligen Klimaverhältnissen abhängig (Reid et al., 1995). Eine Reihe von Faktoren wie Morphologie oder Physiologie der Pflanze, Sortenund Standortwahl, Fruchtfolge, Düngung und Bodenbearbeitung können den Fusariumbefall beeinflussen, die wichtigsten jedoch sind vor allem Temperaturverlauf, Feuchtigkeit und Beschädigungen an der Pflanze und des Kolbens. Als optimale Wachstumstemperatur für F. graminearum werden Temperaturen zwischen 24 C und 26 C angegeben, gekoppelt mit andauernder Feuchtigkeit. Regen und warmes Wetter im Juli und August zur Zeit der Blüte, des Seidenschiebens und der frühen Kornentwicklung sind wichtige Faktoren, die zu einer raschen Erkrankung führen (Reid et al., 1996). Schäden an den Kolben durch Vögel und Insekten führen auch zu einer erhöhten Infektion durch F. graminearum (Sutton, 1981). Hier wird angenommen, dass die natürliche Schutzfunktion der Lieschen oder Seiden durchbrochen wird und damit eine Infektion ungehindert erfolgen kann. Auch aufgeplatzte oder beschädigte Körner sind anfälliger. Untersuchungen von Lew at al. (1991) zeigten z.b., dass die Larve des Maiszünslers durch ihre Freßschäden eindeutig einen Befall mit F. subglutinans begünstigte. Morphologische Kriterien wie hängende Kolben oder nur locker anliegende Lieschen sollen eine Infektion erschweren. 11

12 Andererseits fördern aufrechte Kolben und eng anliegende Lieschen eine Erkrankung (Enerson und Hunter, 1980). Physiologische Faktoren können auch einen Einfluss auf eine Infektion ausüben: so sollen Körner, die rascher reifen eine geringere Anfälligkeit besitzen, da sie dem Pilz eine kürzere Zeit zur Infektion bieten. Auch indirekte Resistenzmechanismen, wie eine erhöhte Resistenz gegenüber Insekten, können zu einer Verminderung der Anfälligkeit führen Kontrolle von Kolbenfusariose Eine direkte Bekämpfung der Kolbenfäulen im Bestand ist nicht möglich. Die weitere Ausbreitung der Fäule im Lager muss durch unmittelbar nach dem Drusch einsetzende Trocknung unterbunden werden. Weitere Maßnahmen die ein Auftreten der Kolbenfäule verhindern sollen, sind eine optimale Standort- und Sortenwahl auch in Bezug auf die Stengelbruchresistenz, eine möglichst rechtzeitige Ernte, eine ausgeglichene Düngung, eine vielseitige Fruchtfolge und eine mischende und wendende Bodenbearbeitung (Hurle et al., 1996). Die Wahl und der Anbau einer resistenten Sorte zählt zu den biologischen oder integrierenden Maßnahmen gegen Krankheiten wie Fusarium und bietet daher eine günstige Möglichkeit zur Ertragssteigerung und vor allem Qualitätssteigerung bei der Maisproduktion. Hierbei werden so genannte biologische Abwehrmechanismen, die auf bestimmten Resistenzgenen lokalisiert sind aktiviert. Je nach Sorte bzw. Genotyp, unterscheiden sich die Resistenzeigenschaften und damit auch die Widerstandskraft einer Sorte gegenüber einem Krankheitsbefall. Schwere Schäden durch Fusarium treten oft in Gebieten mit hohen Monokulturanteil auf, oder wenn Weizen nach Mais angebaut wird und vice versa. Daher soll auf eine ordentliche Fruchtfolge geachtet werden, das bedeutet jene Pflanzen, die als Zwischenwirte für das Pathogen in Frage kommen nicht in die Fruchtfolge mit einbeziehen. Weiters ist auch eine sachgemäße Bodenbearbeitung sinnvoll, befallene Pflanzenteile sollten in den Boden eingepflügt werden und eine Stickstoffüberdüngung vermieden werden (Snijders, 1994). Bei der Wahl der Sorten sollten jene mit bereits bekannten guten Resistenzeigenschaften gewählt werden, die auch nicht zu spät reifen Resistenzmechanismen der Maispflanze Es gibt drei verschiedene Infektionswege, auf denen Fusarium spp. die Maiskolben befallen kann: 1. durch auf den Seiden landende und keimende Pilzsporen und die Seiden hinunter wachsendem Pilzmyzel um die Körner und die Spindel zu infizieren. (Koehler, 1942) 2. durch Insektenfraß, Vögel oder Hagel verursachte Verletzungen der Lieschen und Körner direkt in den Kornbereich (Sutton, 1982) 3. einige Fusarienarten sind auch systemisch, z.b. F. verticillioides, und können den Kolben durch infizierte Stängel befallen (Foley, 1959; Munkvold et al. 1997b). Welcher Infektionsweg wichtiger ist hängt von der vorherrschenden Fusarienart und dem Insektendruck in der gegebenen Umgebung ab. 12

13 In manchen Umgebungen hängen Ausbrüche von Kolbenfusariose mit einer Infektion durch die Seiden zusammen und in anderen Umgebungen, wo maisanbohrende Insekten ein Problem darstellen und nicht durch andere Maßnahmen kontrolliert werden, ist die Infektion durch die Körner vorherrschend. Der Seidenkanal, die Lieschen und die Körner bilden somit eine mechanische Barriere, die der Pilz überwinden muss, um ins Innere des Kolbens eindringen zu können, und um sich dort weiter auszubreiten. Eine Resistenz gegenüber Fusarium bei Mais wird daher von zwei Hauptkomponenten bestimmt (Snijders, 1994): 1. Eine Resistenz gegen das Eindringen des Pathogens über die Seiden und den Seidenkanal (= Eindringungsresistenz / resistance to initial penetration ) 2. Eine Resistenz gegen einer weiteren Ausbreitung des Erregers nach bereits stattgefundener Verletzung der Kolben (= Ausbreitungsresistenz / resistance to spreading of the pathogen in host tissue ) Bei einer Prüfung der Hybridsorten auf ihre Resistenzeigenschaften gegenüber Kolbenfusariosen, müssen beide Infektionswege untersucht werden, da diese Resistenzfaktoren nicht miteinander gekoppelt sind (Reid und Hamilton, 1996) Inokulationsmethoden und Resistenzkomponenten Obwohl Fusarien durch ihre Mykotoxinbildung zu hohen Qualitätsverlusten führen, ist ein Befall unter natürlichen Umweltbedingungen stark schwankend und von einer Saison zur nächsten relativ sporadisch. Daher sind auch für die Untersuchung von Resistenzverhalten verschiedener Hybridsorten geeignete Methoden notwendig, um bei einem Feldversuch sichere und vergleichbare Infektionen an verschiedenen Orten und zu bestimmten Zeiten zu erzielen. Da der Schweregrad der natürlichen Infektion von Jahr zu Jahr Schwankungen unterliegt, muss man um auf künstliche Inokulationsmethoden zurückgreifen um das Pflanzenmaterial mit Pilzsporen zu inokulieren (Schaafsma et al., 1997). Der einzige Weg um auf Gibberella-Kolbenfäule (GER) zu überprüfen ist im Feld. Zufriedenstellende Befallsgrade und eine verlässliche genotypische Differenzierung wurden unter Glashausbedingungen noch nicht erreicht und es gibt auch keine Labortechnik oder Keimungstest der verwendet werden könnte um auf Resistenz zu testen die in ausgewachsenen Pflanzen gefunden wird (Reid et al., 1996a). Derzeit hebt die Literatur die Seidenkanalmethode der Inokulation gegenüber der Körnerverwundungsinokulation durch kolonisierte Zahnstocher oder Injektion einer Sporensuspension hervor. Beide Methoden resultieren in einer Ausbreitung der Infektion von infizierten Körnern zu benachbarten Körnern: mit der Seidenkanalmethode muss sich die Infektion erst durch die Seiden hin zu den Körnern ausbreiten. Welche der beiden Methoden auch Verwendung findet, als erstes muss der Hauptinfektionsweg der jeweiligen Fusariumart in der aktuellen Region ermittelt werden. Die Methoden zur künstlichen Inokulation und die Evaluierung der Resistenzen sind sowohl für die Gibberella-Fäule als auch für die Fusarium-Fäule und für die verschiedenen anderen Fusariumarten die selben. (Löffler et al., 2010a; Reid et al., 2002, 2009). Maiszüchter können bis heute nicht auf ein geeignetes Merkmal gegen Kolbenfäule durch Fusarien selektieren. Um dennoch die verschiedenen Resistenzverhalten der Hybride darzulegen, werden Sorten an Orten mit bekannt hohem Infektionsdruck angebaut. 13

14 Nach Abreife der Hybride folgt eine visuelle Bonitur der Pflanzen, und eine relative Resistenz der einzelnen Sorten wird für den Zeitpunkt festgelegt (Farrar und Davis, 1991). Da jedoch das Auftreten der Kolbenfäule unter natürlichen Infektionsdruck im Feld stark variieren kann, wird eine Methode, die eine künstliche Epidemie hervorruft und dadurch die Selektion von resistenteren Sorten ermöglicht bevorzugt. Allgemein könne die Inokulationsmethoden für Kolbenfäule bei Mais in zwei Methoden unterteilt werden: 1. Inokulation mit mechanischer Verletzung (Methode 1) (=> Messung der Ausbreitungs- oder Körnerresistenz nach Verletzung der Körner) 2. Inokulation ohne mechanische Verletzung (Methode 2) (=> Messung der Eindringungs- oder Seidenresistenz über den Seidenkanal) Eine weitere Differenzierung ergibt sich aus dem Inokulationszeitpunkt und der Inokulationsstelle am Kolben. Methode 1 bezieht sich auf die Zahnstocher-Methode und dessen Abwandlungen, die erstmals von Young (1943, siehe Snijders, 1994) beschrieben wurde. Etwa zehn Tage nach 50%igem Seidenschieben werden die Kolben inokuliert. Dies geschieht mit einem Fusarium inokuliertem Zahnstocher, Kügelchen oder Nagel, die durch die Lieschen in die Mitte des Maiskolbens gebohrt werden, wo sie bis zur Abreife steckenbleiben können (Gulya et al., 1980). Hierbei kann nach erfolgreicher Infektion die Ausbreitungsresistenz der Pflanze evaluiert werden. Bei der Arbeit mit dieser Methode konnten bereits mehrere Fortschritte erzielt werden (Mesterházy, 1982, 1983). Die Zahnstocher werden drei Mal in kochendem Wasser entionisiert um Tannine und andere das Pilzwachstum inhibierenden Komponenten auszuwaschen. Danach werden sie getrocknet und für eine Stunde in ein geeignetes flüssiges Medium (z.b. Czapek-Dox) in einem Erlenmeyerkolben eingetaucht. Das meiste des Mediums wird dann weggelehrt bis auf 5-10 mm Mediumtiefe im Kolben um eine hohe Feuchtigkeit zu gewährleisten; danach wird der Zahnstocher für eine Stunde bei 120 C autoklaviert. Ein kleiner Teil des Myzels wird in den sterilisierten Kolben gegeben und drei Wochen später ist der Pilz durch die Zahnstocher gewachsen, welche dann bereit zur Verwendung sind (Mesterházy, 1982, 1983). Die Zahnstocher werden im Allgemeinen zur Inokulation der Kolben auf zwei Arten verwendet (Plienegger und Lemmens, 2002; Reid et al., 1996a): 1. Einstecken in die Mitte des Kolbens (Körnerresistenz) oder 2. Einstecken in den Seidenkanal (Seidenresistenz) Nach 7 bis 9 Wochen wird der Schweregrad der Infektion über den Anteil der sichtbar infizierten Körner entweder direkt oder mittels einer Boniturskaler ermittelt (Enerson and Hunter, 1980; Mesterházy, 1978; Reid et al., 1996a). Eine der Nachteile der Seidenkanalmethode zur Resistenzermittlung ist bei Maisgenotypen bei denen die Kolbenspitze aus den Lieschen herauswächst wodurch der Zahnstocher herausfällt und so den Schweregrad der Infektion reduziert. Eine andere Kritik an der Zahnstochermethode ist, dass die Infektionsgrade zu hoch sein können, da der Zahnstocher selbst ein Substrat fürs Pilzwachstum wodurch die Körnerinokulation in einer schweren Infektion sowohl mehrerer Körner als auch der Spindel resultiert. Inokulationen der Methode 2 verwenden eine Sporensuspension, die entweder auf die Seiden gesprüht wird oder im Seidenkanal injiziert wird. 14

15 Dabei werden die Seiden entweder unbedeckt gelassen (Gulya et al., 1980), oder sofort nach Inokulation mit befeuchtetem Papier umwickelt und eingesackt (Ullstrup, 1970). Diese Methode soll eine natürliche Infektion am Feld nachahmen und Resistenzunterschiede bezüglich des Eindringungswiederstands des Genotyps verdeutlichen. Die Menge an injiziertem Inokulum kann von einigen μl bis zu 5 ml variieren, wobei die größeren Mengen für die Seidenresistenz verwendet werden (Reid et al., 2006a, 2009). Die Konidienkonzentration kann variieren: (Presello et al., 2008 and Löffler et al., 2010a) verwendeten 1x10 6 Konidien/ml für Fusariumfäule, während (Löffler et al., 2010a) 1x10 5 für die Gibberellafäule verwendet. Ausreichend Feuchtigkeit in den Seiden und an den Körnern ist für ein Auskeimen der Konidien und eine weitere Ausbreitung der Infektion am Kolben unbedingt notwendig, da bei einer Austrocknung der Seiden keine bis geringe Infektionen zu erwarten sind Molekulare Genetik und QTL-Mapping QTL-Mapping für Resistenz gegen Gibberellafäule In einer F5 RIL Population hat Ali et al. (2005) 11 QTL für Kolbenfäule nach einer Seideninokulation und 18 QTL nach Körnerinokulation (welche 6-35% der phenotypischen Variation erklären) gefunden. Es konnten aber nur 2 QTL gefunden werden welche quer durch die Umgebungen aktiv für Seidenresistenz waren und nur 1 für Körnerresistenz was einen starken Umgebungseinfluss zeigt. Die Mehrheit der günstigen Allele kommt vom resistenten Elter CO387. Es konnten an die 100 Gene identifiziert werden, darunter jene für Chitinase und Proteinkinase welche ähnlich wie jene Genmarker waren die gemeinsam mit den QTL für Fusariumresistenz abgegrenzt wurden. Erst kürzlich hat Martin et al. (2011a, b) am gleichen Ort lokalisierte QTL für Gibberellafäule und reduzierte DON-Mengen in verschiedenen Mapping-Populationen identifiziert QTL-Mapping für Resistenz gegen Fusariumfäule Eller et al. (2008b) hat festgestellt, dass Fusariumresistenz von mehreren Genen bestimmt wird. Robertson-Hoyt et al. (2006c) testeten zwei Populationen auf Resistenz gegen F. verticillioides. In der Fusariumfäule-Population wurden 7 QTL identifiziert welche 47% der phenotypischen Variation erklären und 9 für den Fumonisingehalt welche 67% der Variation erklären. In der NCB Population erklärten 5 QTL 31% der Fusariumfäulevariation und 6 QTL mit 3 epistatischen Interaktionen erklärten 81% der phenotypischen Variation. In den beiden Populationen wurden 3 QTL für Fusariumfäule und 2 für Fumonisin an ähnlichen Positionen kartiert. Jene QTL, die auf den Chromosomen 4 und 5 lokalisiert sind, schienen in beiden Populationen übereinzustimmen. Ding et al. (2008) testeten eine RIL Population bestehend aus 187 Genotypen auf Resistenz gegen F. verticillioides. Die Phenotypisierung wurde in 4 verschiedenen Umwelten durchgeführt (Orte-Jahre-Kombinationen). Bei 2 QTL am Chromosom 3 wurde eine Stabilität über mehrere Umwelten festgestellt. Das Haupt-QTL erklärte 13 bis 22 % der phenotypischen Variation für Resistenz gegen Fusariumfäule. Perez-Brito et al. (2001) identifizierten 9 und 7 QTL in zwei Populationen, drei von diesen waren ortsgleich angeordnet. Kozhukhova et al. (2007) fand einen codominanten Marker RGA11 am kurzen Arm von Chromosom 1 für Resistenz gegen Fusariumfäule bei 18.3 cm zum Resistenzort in einer F2-Population. 15

16 Zusammenhang zwischen QTL für Resistenz gegen Fusariumfäule, gegen andere Kolbenfäulen und ackerbaulichen Eigenschaften Robertson-Hoyt et al. (2007a) fanden dass QTL für Resistenz gegen F. verticillioides auch gegen A. flavus effektiv waren. Die genotypische Korrelation zwischen den Kolbenfäuledaten der beiden Pathogene (rg = 0,99) war sehr eng. Am Chromosom 5 wurde ein QTL mit großem Effekt identifiziert. Die Resistenz-QTL gegen A. flavus und F. verticilioides waren zeitweise gekoppelt auf den selben Chromosomen. Es wurde berücksichtigt, dass ein genetisches kartieren mit feiner Gradeinteilung notwendig sein wird um verknüpfte QTL zu unterscheiden, so wie jene in einem Resistenzcluster von pleiotropischen QTL welche die Resistenz beeinflussen. Dies unterstützt das Bild der allgemeinen Resistenz gegen verschiedene Fusariumarten (Robertson-Hoyt et al., 2007b). Robertson-Hoyt et al. (2007b) kartierten 2 Fumonisin-QTL zu ähnlichen Positionen wie denen für Getreideertrag, aber diese 2 QTL wurden zu eindeutigen genomischen Positionen kartiert. Es konnten keine engen Beziehungen zwischen der Resistenz und ackerbäulichen Eigenschaften gefunden werden und die Selektion auf höhere Resistenz sollte daher keine übermäßigen Effekte auf die ackerbäuliche Effizienz haben. Ein neuer Versuch ist die Meta-Analyse von QTL welche mit der Resistenz gegen Kolbenfäule verbunden sind (Xiang et al., 2010). Die Daten von 14 Studien welche F. graminearum, F. verticillioides und A. flavus QTL representieren wurden analysiert; Resistenz-QTL gegen diese drei Pilze waren auf den selben Chromosomen zusammengefasst. Diese Daten scheinten die Idee der gemeinsamen Resistenz auf QTL-Ebene zu unterstützen. Von den 87 individuellen QTL wurden 29 meta-qtl identifiziert bei denen je 2-6 individuelle QTL zusammengefasst waren. Eine Resistenzquelle kann bei verschiedenen Gruppen mitwirken, z.b. beeinflusste CO der 27 meta-qtl (Mesterházy et al., Molekulargenetik von Gibberella-Kolbenfäule und Mykotoxinanreicherung Yuan et al. (2008) fanden ein Guanylylzyklase ähnliches Gen (Zmgc1) welches Resistenz gegen G. zeae sicherstellt; es ist beinahe ident mit einem Resistenzgen der G. zeae Resistenzlinie CO387. Jenczmionka und Schaefer (2005) beschrieben Gpmk1 MAP- Kinase Unterbrechungsmutanten und folgerten, dass der Infektionsprozess mit der Aussonderung von Zellwand abbauenden Enzymen, insbesondere während der frühen Infektionsstadien, zusammenhängt. Igawa et al. (2007) testeten ein ZEA Entgiftungsenzym in transgenen Pflanzen. Es wurde in der Vegetationsperiode exprimiert und war auch bis zu 16 Wochen während der Einlagerung aktiv. Das Problem ist, dass die Krankheit nicht oder nur gemäßigt unterdrückt war und andere Toxine Mais kontaminieren könnten Molekulargenetik von Fusarium-Kolbenfäule und Mykotoxinanreicherung Resistenz gegenüber Kolbenfusariosen ist quantitativ und wird polygenetisch vererbt, eine komplette Resistenz einer Pflanze wurde jedoch bisher nicht entdeckt (Snijders, 1994). Vielmehr bestimmt die Interaktion zwischen Wirtspflanze, Pathogen und Umweltbedingungen das Ausmaß der Infektion. Alexander et al. (2009) verglichen die Biosynthese von Trichothecene und Fumonisin und folgerten, dass die Gene welche an diesen Prozessen beteiligt sind unter Umständen zur Erhöhung der Resistenz gegen Krankheiten und Reduktion der Toxinanreicherung verwendet werden könnten. 16

17 Lanubile et al. (2010) fanden dass in einer Resistenzlinie, die untersuchten, in Beziehung zur Resistenz stehenden Gene (b-tubulin und FUM21 Gene von F. verticillioides) in großen Mengen vor der Infektion transkribiert wurden und eine Basisabwehr gegen diesen Pilz bereitstellten. In der empfindlichen Linie, werden die selben Gene qualitativ von einem Basislevel induziert und reagieren spezifisch auf die Pathogeninfektion. Zhang et al. (2011) identifizierten das FvMK1 mitogenaktivierte Proteinkinasegen in F. verticillioides welches die Konidienproduktion, die Pathogenese reguliert und auch die Aktivität der FUM1 und FUM8 Gene herabsetzt Verwendung der QTL-Kartierung in der praktischen Züchtung Die Existenz der Meta-QTL ändert nichts an der Tatsache, dass die meisten der bisher gefunden QTL nicht bestätigt sind und nur kleine Effekte haben (Eller et al., 2008; Robertson-Hoyt et al., 2006c, 2007a). Die 19 Meta-QTL (Xiang et al., 2010) erklären einen Großteil der Resistenzen, aber die individuellen QTL haben nur kleine Effekte. Nur 1 oder 2 QTL können in Betracht gezogen werden mittlere bis große Effekte zu haben (Robertson-Hoyt et al, 2007a). Deren additiver (in einigen Fällen epistatischer Effekt) scheint gesichert zu sein. Folglich, ist ihre Verwendung für markergestützte Selektion eingeschränkt. Weitere Komplexität ergibt sich aus der Tatsache, dass in einigen Hybriden ein mütterlicher oder väterlicher Effekt dominant war. Der Hybrideffekt kann bis zu einem gewissen Umfang erklärt werden, aber die Resistenzgrad in Hybriden kann nicht mit äußerster Gewissheit vorhergesagt werden. Dies ist ähnlich der Situation bei Weizen (Buerstmayr et al., 2009). Die Ergebnisse von Wilde et al. (2007) bei Weizen zeigten, dass markergestützte Selektion resultierte in einer zweizählig höheren Prädisposition in den Nachkommen als in der phenotypisch selektierten Variante. Wir ziehen in Betracht, dass eine starke Selektion auf erhöhte Resistenz neues Material für die Entwicklung neuer Kartierungspopulationen bringen könnte, was 1) die Bestimmung neuer QTL mit stärkeren Effekten oder 2) die Identifizierung von QTL welche eine transgressive Abspaltung ermöglichen würde Aspekte der Pflanzenzucht Die Entwicklung genetischer Resistenz gegen F. graminearum, F. verticillioides und andere Fusariumarten in Mais sollte eine hohe Dringlichkeitsstufe sein in anbetracht der Toxine, mit welchen diese Arten die Maispflanzen kontaminieren (Munkvold 2003b, Reid et al. 1996a). Duvick (2001) schlug drei theoretische Annäherungen die Fumonisin- Kontamination zu verringern vor. Resistenz wird zuerst genannt, aber die Resourcen mögen begrenzt sein. Molekulare Marker können ebenfalls angewandt werden um QTL zu identifizieren, aber bestätigte Marker mit hohen Effekten sind selten. Eine zukünftige Möglichkeit wäre es Resistenzgene in Mais zu transferieren und auf diesem Weg eine höhere Resistenz zu gewährleisten, aber zur Zeit sind keine Resistenzgene verfügbar. Presello et al. (2005) schlug die Stammbaumselektion vor um die Resistenz gegen F. graminearum zu verbessern. Sowohl Seiden- als auch Körnerresistenz wurden untersucht: Die Selektion auf Körnerresistenz war effektiver und die Selektion auf Seidenresistenz stabiler. Reid et al (2001ab, 2003) verwendete eine modifizierte Stammbaumselektion um 8 Nachkommen mit GER Resistenz zu züchten, einige mit hohen Graden an Seiden- und Körnerresistenz. Deutsche Forscher verwenden die Doppelhaploidentechnologie um GER resistente Nachkommen zu züchten (Martin et al., 2011b). 17

18 Robertson-Hoyt et al. (2007a) fanden keine enge Korrelation zwischen FER Resistenz und anderer Eigenschaften wie z.b. dem Ertrag; deshalb hoffen sie dass eine strenge Selektion auf Resistenz nicht in einem niedrigeren Ertrag und anderen unerwünschten Konsequenzen resultieren wird. Reid et al. (2003) entwickelten eine Inzuchtlinie, CO441, mit hoher Resistenz gegen GER und exzellenter Kombinationseignung für Ertrag. Mesterházy et al. (2000) berichteten dass resistente Hybriden gezüchtet werden können, wenn beide Eltern gute oder exzellente Resistenzeigenschaften hätten; andererseits kann die Höhe der Resistenz in den Hybriden nicht mit hoher Genauigkeit vorhergesagt werden. Die Züchtung auf Kolbenfäuleresistenz beinhaltet zwei wichtige Schritte. Munkvold (2003a) legt den Schwerpunkt auf die Identifikation und Verwendung natürlicher Resistenzquellen. Züchtungsprogramme könnten auf diesen Quellen aufgebaut werden, weil sie bereits angepasst und in den Züchtungsstationen verfügbar sind. De Oliveira et al. (2009) fügten hinzu, dass wertvolles Züchtungsmaterial unter den Landrassen gefunden werden kann; allerdings kann die Züchtung mit Landrassen zeitaufwendig sein, weil viele unerwünschte Eigenschaften zuerst weggezüchtet werden müssen. Die Züchtung kann ausgehend von Kreuzungshybriden, welche zwei oder mehr Linien mit guter Resistenz beinhalten, oder bereits existierenden Hybriden mit geprüfter ausgezeichneter Resistenz gestartet werden, vorausgesetzt dass keine proprietären Probleme involviert sind die eine Verwendung der Hybriden in Züchtungsprogrammen beschränken würden. In den meisten Inzucht-Züchtungsprogrammen erfolgt die Prüfung der Kombinationseignung in den S3, S4 oder späteren Generationen, demzufolge kann die erste Resistenzevaluation von Testkreuzungen erst zu dieser Zeit erfolgen. Allerdings berichteten Löffler et al. (2010b), dass viele Inzuchtlinien anfällig wären obwohl der Infektionsdruck während der Inzüchtung nicht stark genug war. Reid (1999) sammelte Protoplasma von rund um der Welt (angepasstes und nicht angepasstes) mit mittlerer bis hoher Resistenz gegen verschiedene Kolbenpathogene, aber es wurden keine Angaben gemacht wie die Inzuchtlinien hergestellt wurden. Allerdings wie in Reid et al. (2001ab, 2003) hingewiesen wird, wurden Inzuchtlinien in jeder Generation ihrer Entwicklung inokuliert mit der Ausnahme von wenigen Generationsfortschritten die in nicht-saisonalen Winterzuchtstationen erreicht wurden. Einige dieser Inzuchtlinien resultierten von Kreuzungen zwischen resistenten Inzuchtlinien und Inzuchtlinien mit guter ackerbäuerlicher Leistung, andere Inzuchtlinien wurden geselbstet außerhalb von reziproken wiederkehrenden Populationen, welche Gegenstand intensiver Evaluierungen auf Inokulation mit künstlichen Inokulums und Toxinen sind. Eller et al. (2010) berichteten auch über Inokulation während der Inzucht; Sie schlossen dass die Rückkreuzungsmethode, die normalerweise dazu verwendet wird um einzelne Hauptgene zu transferieren, ebenfalls zur Verbesserung der Resistenz gegen FER erfolgreich war. Das mag für Haupt-QTL-Gene zutreffen, aber für die normalerweise polygenischen Eigenschaften ist sie weniger geeignet da QTL verloren gehen könnten. In diesem Fall mag die reziproke sich wiederholende Selektion vorgeschlagen von Boling und Grogan (1965) besser funktionieren. Bolduan et al. (2010) schlugen vor, dass der Fokus mehr auf dem Testen der Hybriden als auf Inzucht liegen sollte. Künstliche Inokulationsmethoden müssen extensiv beim Testen neuer Hybriden und ihrer Eltern eingesetzt werden. Zur Zeit verwenden die meisten Züchter eine Konidiensuspension, aber Zahnstocher werden auch von einigen verwendet. Das Interesse an künstlicher Inokulation wächst. Es ist auch interessant, dass sich der Fumonisingehalt als verlässlichere Eigenschaft bestätigt hat als visuelle Auswertung (Eller et al, 2008). Für beide Kolbenfäulen ist die Korrelation zwischen den sichtbaren Symptomen und der Fumonisinkontamination bis auf wenige Ausnahmen eng. Demzufolge werden die sichtbaren Auswertungen fürs Screening vorgeschlagen. 18

19 Um die Toxinreaktion der neuen Hybriden zu verifizieren, sollten die Toxine am Ende des Züchtungsprozesses evaluiert werden (Bolduan et al. 2009). Viele Züchter überprüfen entweder nur auf GER oder nur auf FER und einige überprüfen auf beide. Löffler (2010a) und Miedaner et al. (2008) testen Inzuchtlinien und Hybriden an mehreren Orten mit einem einzigen Isolat oder einer Mischung von Isolaten. Da keine Spezialisierung bekannt ist, existiert theoretisch kein Unterschied zwischen einzelnen Isolaten und Mischungen von Isolaten der selben Fusariumart. Deshalb sollten die Isolate getrennt verwendet werden, und so kann (im Fall von vier z.b. Isolaten) der Betrag an Resistenz präziser untersucht werden als mit einer einzelnen ansteckenden Situation. Eben deshalb werden Resistenzuntersuchungen zwei bis drei Jahre lang durchgeführt (Kovács et al. 1988, Mesterházy 1983). Einige bevorzugen Isolatmischungen um die Möglichkeit, dass ein einzelnes Isolat in einer gegebenen Feldsituation weniger aggressiv ist, zu vermeiden was zu einem Krankheitsbefall führen würde der zu niedrig wäre um exakte Resistenzuntersuchungen über zwei bis drei Jahre durchzuführen (Ried et al. 1993). Eine Mischung von Isolaten reduziert die Umgebungsinteraktion. Der Grad an Resistenz wird der Mittelwert der Resistenzgrade bei Verwendung von mehreren Isolaten sein sodass das Ausmaß an Resistenz deshalb besser eingeschätzt werden kann. Eine Vorselektion der Isolate auf Aggressivität ist sehr wichtig (Miedaner et al. 2009). Da die Aggressivität variiert (Mesterházy 2000) erhöht die Verwendung mehrerer Isolate die Verlässlichkeit der Evaluierungen. 3. Material und Methoden 3.1. Maishybriden Die Inokulationsversuche wurden im Zeitraum von sieben Monaten von April bis Oktober 2011 auf dem Versuchsgelände des IFA Tulln durchgeführt. Um Vergleiche zwischen den Resistenzverhalten zu ermöglichen, und auch gleichzeitig Eigenschaften und Wirkung der Inokula zu überprüfen, wurden zusätzlich zu den gängigen österreichischen Genotypen auch bekannt anfällige Sorten, als auch Hybride, die bereits aus früheren Versuchen eine hohe Resistenz gegenüber Kolbenfusariosen zeigten, mit angebaut. Tabelle 3.1. zeigt sämtliche verwendeten Genotypen. Es wurden 19 Genotypen von Saatbau Linz (SBL1 bis SBL19) und 18 Genotypen von Cereal Research Non-profit Ltd. (GK1, GK3 bis GK13 und GK15 bis GK20) zur Verfügung gestellt. Diese Genotypen variieren alle in der Resistenz Versuchsaufbau für die Resistenzuntersuchung mit künstlicher Inokulation Sämtliche Versuchsorte wurden in Tulln in Form einer Spaltanlage mit drei Wiederholungen angelegt, die dabei entstandenen Parzellen waren zweireihig und jeweils 8,2 m lang. Jeder Genotyp wurde in zwei Reihen zu ungefähr fünfzig Einzelpflanzen mit einer Einzelkornsähmaschine angebaut. Der Abstand in der Reihe betrug 17cm und zwischen den Reihen wurden 75cm Platz freigelassen um eine gezielte Inokulation und problemlose Bonitur zu ermöglichen. Drei weitere Wiederholungen für jeden Einzelnen Genotyp wurden nach dem selben Prinzip zusätzlich angelegt. Insgesamt wurden daher rund 300 Einzelpflanzen pro Genotyp auf ihre Körnerresistenzeigenschaften hin untersucht. Vor jedem neuen Genotyp (jeweils nach zwei Reihen) wurde eine Kennzeichnungsplakette in den Boden gesteckt, um spätere Verwechslungen der Sorten auszuschließen. 19

20 Nach 50%igem Seidenschieben wurde dieses Etikett der entsprechenden Hybridsorte markiert, um den Inokulationszeitpunkt zu fixieren. Danach wurden die einzelnen Pflanzen bis zur Inokulation nicht weiter behandelt Versuchsaufbau für die Untersuchung der natürlichen Infektion Zur Kontrolle wurden auch sämtliche Genotypen in 8,2m langen Parzellen in Form einer Blockanlage unter natürlichen Umweltbedingungen angebaut. Es wurden pro Sorte zwei Reihen zu je fünfzig Einzelpflanzen angelegt und eine zweite Wiederholung analog durchgeführt. Zwischen 40 und 50 Pflanzen wurden pro Wiederholung auf typische Krankheitssymptome hin untersucht und zwecks Vergleiche mit Daten der künstlichen Inokulation notiert. Sämtliche Bonituren der natürlichen Infektion fanden nach Abreife der Sorten statt. Der gesamte Versuch wurde von einem Maismantel umgeben, um Randeffekte und äußere Einflüsse möglichst gering zu halten Herstellung und Eigenschaften der Isolate Fusarienisolate (F. graminearum, ein Desoxynivalenil (DON) und Zearalenon (ZON) Produzent, und F. culmorum, ein DON-Produzent, F. verticillioides ein Fumonisinproduzent) wurden für die künstlichen Inokulationsversuche verwendet. Die Isolate für die Inokulumproduktion wurden aus Dauerkulturen, welche in sogenannte Erdröhrchen über mehrere Jahre aufbewahrt werden (Dhingra und Sinclair, 1985), entnommen und isoliert. Für Infektionsversuche am Feld werden größere Mengen an Inokulum benötigt, welche mit der Bubble-Breeding Methode nach Mesterházy und Rowaished (1977) hergestellt werden können. Die benötigten Fusariumspezies (in diesem Fall F. graminearum und F. verticillioides) wurden in ein Gefäß mit sterilem flüssigem Mungbohnen-Nährmedium überimpft. Anschließend wurden die Gefäße bei Zimmertemperatur eine Woche lang mit steriler Luft durchblasen. In dieser Zeit bildete sich genügend gebrauchsfertiges Makrokonidien-Inokulum (F. graminearum) oder eine Mischung von Makro- und Mikrokonidien Inoculum (F. verticillioides). Die Anzahl der enthaltenen Makro- und Mikrokonidien wurde mit Hilfe der Bürker- Thomas Zählkammer ermittelt. Eine genaue Übersicht der verwendeten Pathogene für die jeweilige Resistenzuntersuchung, ist aus der Tabelle 3.1. zu entnehmen. Tab. 3.1.: Eigenschaften der Inokula für die Körnerresistenzuntersuchung Isolat Fusarium Spezies Ursprung Lebende Vermehrungseinheiten / ml 1 Fusarium verticillioides Zea mais 2 * 10 6 (Konidien) 2 Fusarium graminearum T. durum 5 * 10 5 (Konidien) Zur Herstellung der mit F. culmorum und F. verticillioides inkrustierten Zahnstocher, wurden die Zahnstocher drei mal in kochendem Wasser entionisiert um Tannine und andere das Pilzwachstum inhibierenden Komponenten auszuwaschen. Danach wurden sie getrocknet und für eine Stunde in einen mit Czapek-Doxin befülltem Erlenmeyerkolben eingetaucht. Das meiste des Mediums wird dann weggelehrt bis auf 5-10 mm Mediumtiefe im Kolben um eine hohe Feuchtigkeit zu gewährleisten; danach wird der Kolben mit den Zahnstochern für eine Stunde bei 120 C autoklaviert. 20