Biochemieseminar 5.3: RNA Struktur und Translation. Anticodon

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1 5.3 RNA Wie die DNA besteht die RNA aus vier verschiedenen Nukleotiden mit den Basen Adenin, Guanin, Uracil und Cytosin. Der wesentliche Unterschied besteht in der Art des Zuckers. Wie der Name besagt, enthält die Ribonukleinsäure den Zucker Ribose, der noch die 2 -OH-Gruppe enthält, die der DNA (= Desoxyribonukleinsäure) fehlt. Dieser scheinbar kleine Unterschied hat weit reichende Konsequenzen für die Struktur und die Stabilität der RNA. Der Gebrauch der Base Uracil gegenüber Thymidin in der DNA ist dagegen von untergeordneter Bedeutung und wurde in dem Seminarthema 5.1 DNA Reparatur angesprochen. Die 2 -OH-Gruppe ist nicht in die Phosphodiesterbindungen eingebunden und stellt somit eine zusätzliche Möglichkeit für die RNA dar, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Diese werden dazu genutzt, komplexe dreidimensionale Strukturen zu stabilisieren, in die sich die RNA-Stränge falten Phenylalanin Akzeptorstamm Anticodon Chemische Struktur eines kurzen RNA-Strangs mit den vier verschiedenen Basen Mg C13 G22 Tripelbasenpaar 7mG46 Struktur der Hefe trna Phe mit Beispielen für eine Tripelbasenpaarung und eine Mg 2+ -Position können. Dabei gibt es eine Optimierung von Doppelstrangbereichen, die durch Rückfalten des RNA-Stranges auf sich selbst ausgebildet werden. Dazu werden auch Paarungen nicht komplementärer Basen genutzt, sowie Kontakte von drei Basen gleichzeitig (Tripelbasenpaare) und Kontakte der Basen - 1 -

2 mit der 2 -OH-Gruppe. Für eine dichte Packung dieser dreidimensionalen Struktur ist eine teilweise Neutralisation der negativen Ladungen an den Phosphaten notwendig, die durch fest gebundene zweiwertige Kationen (in der Regel Mg 2+ -Ionen) bewerkstelligt wird. Diese sind durch ihre doppelt positive Ladung in der Lage, die Phosphate (je eine negative Ladung) zweier sich nahe kommender Bereiche eines RNA-Stranges überbrückend zu verbinden. Durch solche komplexen Strukturen ist es möglich, verschiedenste Moleküle fest zu binden und sogar eine Katalyse an ihnen durchzuführen. Diese katalytisch wirksamen RNAs nennt man Ribozyme. Man nimmt an, dass die RNA in der sehr frühen Evolution die Rollen des genetischen Materials (heute DNA) und der Katalyse chemischer Reaktionen (heute Proteine) gleichzeitig wahrgenommen hat. Allerdings sind Proteine mit den sehr unterschiedlichen Aminosäureseitenketten für den Aufbau katalytischer Zentren deutlich vielseitiger und die Vielzahl der Strukturen und Stoffwechselreaktionen komplexer Zellen benötigte eine große Menge an Genen. Die für die Struktur so wichtige 2 -OH-Gruppe macht RNA aber in schon leicht alkalischer Lösung instabil, da über sie eine Spaltung der benachbarten Phosphodiesterbindung eingeleitet werden kann (nukleophiler Angriff der 2 -OH-Gruppe auf den benachbarten 3 -Phosphoester). Lange Ketten, wie wir sie heute in der DNA finden, sind deshalb mit RNA nicht möglich. Die größten RNA-Genome finden wir heute in Viren, die ca Nukleotide nicht überschreiten. Als Hinweis auf die ursprüngliche Funktion der RNA kann man werten, dass die Bausteine der DNA aus den RNA-Bausteinen durch Reduktion der Ribose zur Desoxyribose und Methylierung des UMP zum TMP entstehen. Außerdem hat die RNA zentrale Funktionen bewahrt, die der Umsetzung der genetischen Information in Proteinstrukturen dient: Als mrna (messenger RNA) stellt sie eine kurze Abschrift des großen Genoms im Bereich eines Gens dar, dessen kodierende Sequenz in ein Protein übersetzt werden soll. Dabei ist die erste Abschrift (Prä-mRNA) in der Regel noch zu lang, da im Gen kodierende Exons und nicht kodierende Introns abwechseln. Die Introns müssen herausgespleißt werden. Aminosäuren SRP-RNA DNA Prä-mRNA mrna trna rrna snrna Protein mirna tmrna Bedeutung der RNA für die Umsetzung der Geninformation in Proteine. blau = Weg der genetischen Information, rot = Proteinsynthese, grün = beteiligte und beeinflussende RNA-Spezies - 2 -

3 Die snrnas (small nuclear RNAs) sind kurze ( Nukleotide lang), im Zellkern vorkommende RNAs, die hauptsächlich am Spleißen beteiligt sind. Sie sind zwar an Proteine gebunden und bilden so die snrnps (small nuclear ribonucleoprotein particles), aber sie erkennen die Intron- Exon-Grenzen durch Basenpaarung und katalysieren die zwei Umesterungen, die zum Herausschneiden eines Introns führen. Circa 150 Proteine (die genaue Identifizierung ist noch nicht abgeschlossen) stabilisieren und helfen sicher auch beim Auflösen von Doppelstrangbereichen, so dass die Reaktionen schnell und effizient erfolgen. Allerdings kennt man Introns, die sich selbst aus der umgebenden RNA herausschneiden können. Detaillierter Ablauf des Spleißens der prä-mrna: Auf der linken Seite sind schematisch die snrnps gezeigt, während rechts die Bindungen der snrnas mit den Sequenzen im Intron und untereinander dargestellt sind. Die U1snRNA erkennt die Anfangssequenz des Introns an der 5 - Spleißstelle, die U2snRNA den Verzweigungspunkt und das Ende des Introns an der 3 -Spleißstelle. Über ihre Proteinkomponenten werden diese beiden snrnps zusammengeführt. Dann wird ein ternärer Komplex aus U4/U6 und U5 angelagert. Die U6snRNA wird aus ihrer Bindung an die U4snRNA gelöst und auf die U2snRNA gebunden. U4 wird frei und U1 kann verdrängt werden, während die U5snRNA eine lockere Assoziation mit den Exonsequenzen eingeht. Jetzt wird die Umesterung des 5 -Endes vom Intron auf die 2 -OH-Gruppe am A der Verzweigungsstelle unter Freisetzung des 5 -Exons katalysiert. Anschließend folgt die Umesterung der 3 -Spleißstelle auf das Ende des 5 -Exons unter Freisetzung der Lassostruktur und Bildung der Exon- Exonverknüpfung. Dies stellt dann aber eine einmalige Reaktion dar und die notwendigen Ribozymsequenzen hängen in einer Struktur zusammen, während sie im Spleißosom der Zellen auf 5 Teilstücke aufgeteilt sind (U1, U2, U4, U5 und U6 mit ca Kopien pro Zelle; ein alternatives Spleißosom mit U11, U12, U4 ATAC, U5 und U6 ATAC erkennt die über 200 mal selteneren ATAC -Introns und ist entsprechend geringer konzentriert). Trotzdem geben diese selbstspleißenden Introns einen eindeutigen Hinweis darauf, dass die beiden Umesterungen von den kurzen U

4 RNAs katalysiert werden. Darauf deutet auch hin, dass diese Schritte in vitro durch U2 und U6 alleine durchgeführt werden können. Die snrnas haben also Ribozymfunktion. Eine Maskierung der für das Spleißen notwendigen Erkennungssequenzen oder eine Verstärkung der Bindung des Spleißosoms an solche Sequenzen nutzen die Zellen für die Regulation von alternativem Spleißen, das die Zahl möglicher gebildeter mrnas deutlich erhöht. In der Regel erfüllen RNA-Bindungsproteine diese Aufgaben. Es wurden in Eukaryonten aber auch sogenannte Riboswitches gefunden, die über die Bindung zum Beispiel von Thiaminpyrophosphat Spleißstellen maskieren oder freigeben können. In Klinischen Studien der Phase I hat man zeigen können, dass antisense Oligonukleotide geeignet sind, definierte Spleißstellen zu maskieren und so eine Duchenne Muskeldystrophie durch Herausspleißen defekter Exons zu mildern. Eine solche Spleißkorrektur- Therapie hat immer dann Aussicht auf Erfolg, wenn ein verkürztes Protein zumindest noch einen Teil seiner Aufgaben erfüllen kann. Proteine rrnas trnas (Akzeptorende) Struktur des Ribosoms mit drei trnas. Links nur Proteine und rechts nur rrna. Die rrna (ribosomale RNA) bildet das Grundgerüst der Ribosomen, an denen die Proteine gemäß der mrna-vorschrift synthetisiert werden. Sie ist zwar mit vielen Proteinen besetzt, die aber wieder nur die Effizienz der Reaktion steigern. Nach dem Lösen der dreidimensionalen Struktur der Ribosomen ist ganz eindeutig, dass das Peptidyltransferasezentrum, also das katalytische Zentrum des Ribosoms, alleine von der RNA gebildet wird. Das Ribosom ist also auch ein Ribozym. snornas (small nucleolar RNAs) sind im Nukleolus an der Reifung der ribosomalen RNA beteiligt. Darunter ist vor allem die Modifikation diverser Nukleotide der rrna zu verstehen, bei denen Basen methyliert oder zum Beispiel Uridine durch Pseudouridine ersetzt werden. So werden falsche Sekundärstrukturen destabilisiert und richtige bevorzugt. Die snornas definieren durch ihre Sequenzhomologie die zu modifizierenden - 4 -

5 Nukleotide, während Proteine die Modifikationen katalysieren. Im Menschen kennt man ca. 130 snornas, die zum überwiegenden Teil aus Introns herausgespalten werden. Die trnas (transfer RNAs) dienen bei der Translation als Adaptoren, die die Tripletts des genetischen Codes in die zugehörigen Aminosäuren übersetzen. Für jede Aminosäure haben wir mindestens eine trna, die zum Teil mehrere Codons erkennen kann. Sie sind wie die rrnas hoch konserviert, sodass bei leichten Sequenzvariationen eine sehr ähnliche L-förmige Gesamtstruktur resultiert, die an einem Ende das Anticodon und am anderen Ende die kovalent gebundene Aminosäure trägt. So ist gewährleistet, dass alle trnas gleichmäßig mit den Elongationsfaktoren und dem Ribosom und sehr spezifisch mit der für sie zuständigen Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die nur die zu ihrem Codon passende Aminosäure anknüpft, wechselwirken. Die Translation ist in Pro- und Eukaryonten sehr ähnlich, wobei die Strukturen der beteiligten RNA- und Proteinkomponenten aber so unterschiedlich sind, dass sie Ziel für viele Antibiotika sind. Allerdings hemmen diese häufig auch die der bakteriellen sehr ähnliche mitochondrielle Translation. Der allgemeine Ablauf lässt sich wie folgt beschreiben: o Initiation: Um die Translation zu starten, muss von der kleinen Untereinheit des Ribosoms mit Hilfe von Initiationsfaktoren (GTP abhängig) das Startcodon (in der Regel AUG, das für Methionin codiert) auf der mrna gefunden werden. Dieser Prozess ist deutlich unterschiedlich zwischen Pro- und Eukaryonten. Auf das Startcodon wird dann durch einen weiteren Initiationsfaktor die spezielle mit Methionin beladene Start-tRNA gesetzt. Wenn die große Untereinheit darauf bindet, können die Initiationsfaktoren abdissoziieren. mrna und Start-tRNA werden dabei in der P-Stelle (Peptidyl- Stelle) positioniert. o Elongation: Ein Elongationsfaktor (EFTu bzw. eef1) passt die nächste Aminoacyl-tRNA auf der A-Stelle (Akzeptorstelle) ein. Nur wenn Codon und Anticodon eine stabile Basenpaarung eingehen (wobei durch Modifikationen Elongationszyklus auf dem Ribosom - 5 -

6 der Basen im Anticodon der trna auch Wobble-Basenpaare zugelassen sind, sodass diese trna dann zu mehreren, in der dritten Position unterschiedlichen Codons passt), hydrolysiert der Elongationsfaktor das gebundene GTP, macht dadurch eine Konformationsumwandlung und dissoziiert ab. Etwaige nicht passende Aminoacyl-tRNAs nimmt er direkt wieder mit, ohne das GTP zu hydrolisieren. Ein anderes Elongationsfaktor-Aminoacyl-tRNA-Paar assoziiert, bis die richtige Aminoacyl-tRNA gebunden wurde. Jetzt kann das Ribosom durch die ribosomale RNA den Peptidyltransfer katalysiseren. Chemisch gesehen ist diese Reaktion ein nukleophiler Angriff der Aminogruppe der Aminosäure an der A-Stelle auf die Esterbindung zwischen der trna an der P-Stelle und der an sie geknüpften Aminosäure (hier das Methionin). So resultiert eine Petidyl-tRNA auf der A-Stelle und eine freie trna auf der P-Stelle. Ein weiterer Elongationsfaktor (EFG bzw. eef2) bindet an das Ribosom und bringt es dazu, sich relativ zur mrna um genau 3 Nukleotide = 1 Codon weiter zu bewegen (GTP-Hydrolyse). So landet die Peptidyl-tRNA in der P-Stelle und die freie trna in der E-Stelle (Exit-Stelle). Erst wenn in der nächsten Elongationsrunde an der A-Stelle eine neue Aminoacyl-tRNA erfolgreich eingepasst worden ist, dissoziiert die freie trna aus der E-Stelle ab. o Termination: Taucht am Ende der kodierenden Sequenz eines der drei Stopp-Codons in der A-Stelle auf, kann keine passende trna gefunden werden. Allerdings gibt es Terminationsfaktoren, die diese Situation erkennen und sich auf die A-Stelle setzen. Sie bringen das Ribosom dazu, sich zu öffnen, sodass in das Peptidyltransferase- Zentrum Wasser eindringen und statt des Peptidyl-Transfers eine Hydrolyse der Esterbindung zwischen dem gebildeten Protein und der trna katalysiert werden kann (GTP-Hydrolyse). Die Untereinheiten des Ribosoms fallen auseinander und die mrna wird frei. Die in vielen Teilschritten der Translation durch die Hilfsfaktoren stattfindende GTP- Hydrolyse ist mit der Genauigkeit der entsprechenden Schritte verknüpft. Das Ribosom wird so lange in einer Konformation festgehalten, bis das GTP hydrolysiert und der helfende Faktor abdissoziiert ist. Bis dahin wird die genaue Passform (zum Beispiel der Aminoacyl-tRNA auf dem Anticodon) überprüft, die dann die GTP-Hydrolyse einleitet. Außerdem wird der Prozess durch die Irreversibilität der GTP-Hydrolyse vorangetrieben. Die tmrna (zusammengesetzt aus trna und mrna) ist in Bakterien hoch konserviert und wird gebraucht, wenn ein Ribosom an das Ende einer verkürzten bzw. gespaltenen mrna gelangt, ohne dass ein Stopp-Codon die Synthese beendet hat. Das Ribosom kann - 6 -

7 sich aus dieser Situation nicht befreien. Die tmrna hat aber einen Strukturanteil, der wie eine Alanyl-tRNA aussieht und auch mit einem Alanin beladen ist. Sie bindet damit an die A-Stelle und das Alanin Arbeitsweise der tmrna in Prokaryonten wird in die Kette eingebaut. Der weitere Teil der tmrna legt sich jetzt wie eine mrna in das Ribosom und wird als solche auch weitere 10 Aminosäuren bis zu einem Stoppcodon genutzt. Die so am Ende eingebaute Aminosäuresequenz signalisiert aber zellulären Proteasen, dass dieses Protein schnell abgebaut werden soll. Somit kann ein durch mrna-bruch artifiziell verkürztes Protein keinen Schaden anrichten. Ein Pendant zu der tmrna konnte in Eukaryonten bisher nicht gefunden werden. Allerdings sind Cap- Struktur und Poly-A-Ende beide notwendig für eine Initiation der Translation, sodass verkürzte mrnas gar nicht auf das Ribosom gelangen. Die mirnas (micro- RNAs oder µrnas) sind regulatorische RNAs, die das Ausmaß der Translation einer mrna herunter regeln können. Sie wurden erst vor kurzem entdeckt. Deshalb kennt man zwar aus Sequenzanalysen und dem nachfolgenden Nachweis ihres Vorkommens inzwischen wohl alle Wirkung von mirna und sirna - 7 -

8 menschlichen mirnas, es gibt aber wenig gesicherte Beispiele für ihre Wirkung. Die Ergebnisse vor allem aus Modellorganismen zeigen, dass sich die mirna nach der Transkription zu einer Haarnadelstruktur faltet, die noch im Zellkern aus der Vorläufer- RNA durch die Nuklease Drosha herausgespalten, von Exportin 5 ins Cytosol transportiert und von der Nuklease Dicer zu einem 21 Nukleotide langen Doppelstrang mit überstehenden 3 -Enden verkürzt wird. Dieser Doppelstrang wird von einem Proteinkomplex (RISC) übernommen, ein Einzelstrang davon ausgewählt und an mrnas angepasst. Wird eine Stelle gefunden, an der eine weitgehende Komplementarität und damit eine feste Bindung besteht, wird die entsprechende mrna in der Translation behindert (reprimiert). Wird sogar vollständige Basenpaarung über die gesamten 21 Nukleotide gefunden, so wird die mrna vom RISC gespalten und durch Nukleasen abgebaut. Eine solche vollständig passende mirna wird sirna (small interfering RNA) genannt. Während die rein regulatorischen mirnas eigene Gene besitzen (wobei sie auch in Introns lokalisiert sein können) ist für die sirnas, die einen mrna-abbau einleiten, der eher eine Rolle in der Virusabwehr zu spielen scheint, noch nicht geklärt, wie der Doppelstrang, der dann von Dicer bearbeitet wird, ursprünglich gebildet wurde. Allerdings kommen natürlich gerade bei RNA-Viren, auch wenn sie ein einzelsträngiges RNA-Genom haben, während ihrer Replikation doppelsträngige Intermediate vor. Der Vergleich der mirna-expression in verschiedenen Tumoren mit ihrem Ausgangsgewebe hat unerwartet gute Korrelationen für die Klassifizierung der Tumoren ergeben, die man hofft auch prognostisch nutzen zu können. Außerdem zeigte sich für die Mehrzahl der getesteten mirnas eine Abnahme der Expression im Tumor, was auf eine generelle Bedeutung der mirnas in der Differenzierung hindeuten könnte. Prof. Thum an der MHH konnte zeigen, dass die Multiple Sklerose mit dem Auftreten einer spezifischen mirna im Nervenwasser einhergeht und somit diagnostische Bedeutung hat. Aufgrund der Tatsache, dass nicht einmal die Hälfte der Nukleotide einer mirna komplementär zur Ziel-mRNA sein müssen, gibt es sehr viele potentiell von ihnen regulierte mrnas (jeweils ca für eine mirna), sodass eindeutige Interpretationen solcher mirna- Identifikationen im Hinblick auf die Ziel-mRNA bisher nicht möglich sind. Die sirna macht man sich bei der RNA-Interferenz zu nutze. Man bringt doppelsträngige RNA mit der Sequenz der zu zerstörenden mrna in Zellen ein und kann so spezifisch die Expression eines Proteins unterbinden. Während es bei vielen Organismen ausreicht, einen längeren RNA-Doppelstrang mit einer entsprechenden Zielsequenz in die Zellen einzubringen (so können Pflanzenzellen gegen Viren geimpft werden), löst bei - 8 -

9 Säugerzellen ein solches Vorgehen die Interferonantwort mit der Bildung einer durch RNA-Doppelstränge aktivierten RNAse und somit einer allgemeinen Zerstörung zellulärer RNA und dem Zelltod aus. Setzt man aber schon die 21 Nukleotide kurzen Doppelstränge ein, die Dicer produzieren würde, werden sie direkt in den RISC-Komplex übernommen und führen zur Spaltung der komplementären mrna. Es empfiehlt sich, mehrere solcher sirnas, die an verschiedenen Stellen der mrna hybridisieren, auszuprobieren, da nicht alle gleich wirksam sind. In Zellkulturen hat sich diese Form des Knock outs definierter Gene schon weitgehend durchgesetzt. Man ist aber auch dabei, sie auf möglichen therapeutischen Nutzen zu untersuchen. So ist es gelungen, durch kovalentes Anknüpfen eines Cholesterinmoleküls nicht nur die Membrangängigkeit der sirnas zu erhöhen, sondern auch ihre Halbwertszeit im Blut. Offensichtlich wird eine solche hydrophobere sirna dem wässrigen Kompartiment und damit den RNAsen im Blut weitgehend entzogen. Auch gentherapeutische Ansätze sind in der Erprobung, bei denen in den Zellen eine shrna (small hairpin RNA) exprimiert wird, die dann direkt von Dicer verarbeitet werden kann. Die therapeutischen Ziele sind natürlich die Abwehr von Viren und Bakterien mit ihren zellfremden mrnas, aber auch der Kampf gegen Krebs durch Abschaltung von Onkogenen. Im Tierexperiment an Rhesusaffen konnte mit in Nanopartikel verpackten sirnas eine sonst tödliche Ebola-Infektion erfolgreich bekämpft werden. Allerdings wurde die Therapie schon 30 Minuten nach der Infektion gestartet. Grundlegende Literatur: Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S , Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S , , , Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S , Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten: Struktur der RNA Ribose, 2 -OH-Gruppe Rückfaltung zu doppelsträngigen Bereichen Tripelbasenpaare Ribozyme RNA-Arten und ihre Aufgaben mrna snrna (alternatives) Spleißen rrna snorna trna - Translation tmrna mirna sirna - RNA-Interferenz - 9 -