Nachweis von Pregnancy Associated Glycoproteins (PAG) zur serologischen Trächtigkeitsdiagnostik beim Rind

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1 Symbolbild: dpi/carsten Rehder 28 Nutztierpraxis Nachweis von Pregnancy Associated Glycoproteins (PAG) zur serologischen Trächtigkeitsdiagnostik beim Rind Im Rahmen einer Validierungsstudie wurde ein seit Kurzem kommerziell verfügbarer ELISA zur Trächtigkeitsdiagnostik beim Rind ausgetestet und auf seine Praxistauglichkeit hin überprüft. Von Dr. Michael Dünser, Dr. Eva Geisbauer und HR Dr. Heinrich Breuer

2 Nutztierpraxis 29 Abb. 1 Michael Dünser Abb. 1: Blutprobenentnahme aus der Vena caudalis mediana mittels Vacuette System. Einleitung Eine Reihe verschiedener Methoden zur Trächtigkeitsdiagnostik wurde entwickelt, wobei neben der bewährten klassischen rektalen Palpation die transrektale Ultrasonografie mittlerweile zunehmende Verbreitung gefunden hat. Der Nachweis einer Trächtigkeit mittels rektaler Palpation ist je nach Untersucher bzw. tierspezifischen Faktoren um den 35sten Trächtigkeitstag möglich, während mittels transrektaler Ultrasonografie die Diagnose bereits ab dem 25. Tag post conceptionem festgestellt werden kann. Zum labordiagnostischen Nachweis der Trächtigkeit werden seit geraumer Zeit verschiedene Arten von Progesterontests herangezogen, deren positive Testergebnisse 19 bis 21 Tage nach der Besamung bzw. Belegung allerdings mehrere Interpretationsmöglichkeiten geben. Während beim Nachweis hoher Progesteronwerte die Trächtigkeitsrate in der Literatur mit einer ca. 80%igen Wahrscheinlichkeit gegeben ist, können bei embryonalem Fruchttod, Endometritiden, verzögerter Rückbildung des Corpus luteum periodicum ohne Gravidität, irrtümlicher Besamung bzw. Belegung während der Gelbkörperphase sowie bei abnorm kurzen Brunstintervallen Progesterontests ebenfalls positiv ausfallen. Somit ist bei einem negativen Progesterontestergebnis kein funktionelles Corpus luteum vorhanden und die Trächtigkeit ausgeschlossen, während bei einem positiven Ergebnis ein rein labordiagnostischer Nachweis der Trächtigkeit aufgrund der vielfältigen Ursachen hoher Progesteronwerte nur mit Einschränkung möglich ist. Obwohl der Nachweis von Östronsulfat einen zuverlässigen Hinweis auf Trächtigkeit liefert, hat sich der Einsatz aufgrund des späten Nachweiszeitpunkts (> 105. Trächtigkeitstag) in der Praxis nicht durchgesetzt. Progesterontests sind keine geeigneten Trächtigkeitsdiagnostika, sondern geben wertvolle Hinweise auf endokrine Ovarfunktionen. Die Anforderung an einen praxistauglichen, labordiagnostischen Trächtigkeitstest ist der Nachweis einer Indikatorsubstanz, die möglichst früh und spezifisch Aufschluss über eine erfolgreiche Konzeption und Nidation gibt. Von den mono- und binuklearen Zellen des Trophoblasten werden Glykoproteine synthetisiert, die während der Fusion mit den uterinen Epithelzellen in den maternalen Blutkreislauf abgeben werden und

3 30 Nutztierpraxis erstmals von Butler et al. im Jahr 1982 beschrieben wurden. Es handelt sich dabei um eine Gruppe saurer Aspartat-Proteasen, die neben der Bezeichnung Pregnancy Associated Glycoproteins (PAG) von anderen Autoren auch als Pregnancy Specific Protein B (PSPB), Pregnancy Specific Protein 60 (PSP-60) oder SBU-3 Antigen bezeichnet wurden und bei Wiederkäuern während der gesamten Trächtigkeit gebildet werden (Sousa et al., 2006). Aufgrund der besonderen Plazentation des Rindes gelangen diese Proteine in nachweisbarer Konzentration ins Blut der Muttertiere und bieten somit eine entsprechende Möglichkeit zum Nachweis vitaler Trophoblasten bzw. Embryonen. PAG werden ausschließlich von intakten Trophoblasten gebildet und sind somit während des physiologischen Hormonzyklus nicht trächtiger Tiere nicht vorhanden. Im Verlauf der Embryonalentwicklung des Rindes beginnt die Implantation am 18. bzw. am 19. Graviditätstag. Untersuchungen haben gezeigt, dass ab dem 22. Tag nach Besamung bzw. Belegung erstmals PAG mit immunologischen Verfahren nachweisbar sind (Zoli et al., 1992), wobei mit zunehmendem Trächtigkeitsstadium ein kontinuierlicher Anstieg der PAG- Konzentration im Blut erfolgt. Während für den Nachweis von Progesteron aufgrund der lipophilen Eigenschaften die Probenmatrix Milch besonders geeignet ist, erreichen die PAG- Konzentrationen in der Milch nur etwa 3 bis 5% der Serumkonzentration (Friedrich u. Holtz, 2010). Material und Methode Zur Austestung wurden Serumproben von 436 besamten Exportrindern sowie von 274 nicht besamten/belegten Exporttieren herangezogen, die im Rahmen der Exportdiagnostik am Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (IVET Linz) untersucht wurden. Zusätzlich wurden drei Rinder, die zur Abklärung auf infektiöse Abortuserreger an das IVET Linz gesandt wurden, ebenfalls untersucht. Zur Austestung wurden Serumproben von 436 besamten sowie 274 nicht besamten/ belegten Exportrindern herangezogen. Die Blutprobenentnahme erfolgte mittels Vacuette-System (Fa. Greiner Bio One, Kremsmünster, Österreich) aus der Vena caudalis mediana (Abb. 1). Der labordiagnostische Nachweis der Trächtigkeit wurde aus Serum mittels Bovine Pregnancy ELISA der Fa. Idexx (Westbrook, USA) nach den Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Mikrotiterplatten des Testsystems sind mit Anti-PAGspezifischen Antikörpern beschichtet. Nach Inkubation der Probe werden die gebundenen PAG mit einem PAG-spezifischen Antikörper in Verbindung mit Meerrettichperoxidase

4 NEU! Nutztierpraxis 31 Wohlbefinden in schwierigen Situationen *z.b. bei Reisen Zylkène 75 mg Ergänzungsfuttermittel für Hunde und Katzen; Zylkène 225 mg / Zylkène 450 mg Ergänzungsfuttermittel für Hunde. Zusammensetzung: Zylkène 75 mg / Zylkène 225 mg: Caseinhydrolysat, Maltodextrin, Magnesiumstearat. Zylkène 450 mg: Caseinhydrolysat, Magnesiumstearat. Allgemeine Angaben: Zylkène enthält das Caseinhydrolysat Alpha S1 trypsinisiertes Casein, ein Peptid mit positiver Wirkung auf das Wohlbefi nden des Hundes. Handelsform: Faltschachtel mit 10 Blistern zu je 10 Kapseln. Hersteller: ORSCO Laboratoire Vétérinaire, Frankreich. Inverkehrbringer: Intervet GesmbH, Siemensstraße 107, A-1210 Wien. für Katzen und Hunde

5 32 Nutztierpraxis Abb. 2 Michael Dünser Abb. 2: Blutproben zum serologischen Trächtigkeitsnachweis. (HRPO)-Konjugat bzw. Tetramethyl Benzidin (TMB)-Substrat nachgewiesen (Abb. 2, 3). Die Messung und Auswertung erfolgt mittels Fotometer, wobei die Farbentwicklung proportional zur PAG-Konzentration im Serum erfolgt. Gemäß Herstellerangaben berechnete Ergebniswerte unter 0,300 werden als nicht trächtig und Werte größer oder gleich 0,300 als trächtig ausgewiesen. Von den 436 belegten/besamten Rindern wurde bei 434 Tieren ein mit der rektalen Untersuchung übereinstimmendes Ergebnis erzielt. Die manuelle Trächtigkeitsdiagnostik erfolgte bei den 436 besamten bzw. belegten Exportrindern ausschließlich mittels rektaler Palpation. Die Belegzeitpunkte bzw. das Trächtigkeitsstadium wurden von den Einsendern bereitgestellt. Ergebnisse Von den 436 belegten bzw. besamten Rindern wurde bei 434 Tieren ein mit der rektalen Untersuchung übereinstimmendes Ergebnis festgestellt. Bei zwei Rindern mit einer Trächtigkeitsdauer von 82 bzw. 133 Tagen zeigte der ELISA ein falsch negatives Ergebnis. Fünf mittels Palpation als nicht trächtig eingestufte Tiere wurden vom ELISA korrekt negativ erfasst (Tab. 1). Aus der Gruppe der 274 nicht besamten Rinder wurden 273 mittels ELISA korrekt als nicht trächtig bestimmt. Bei einem nicht trächtigen Rind zeigte der ELISA ein falsch positives Ergebnis (Tab. 1). Bei drei Rindern aus den Diagnostikeinsendungen des IVET Linz mit vorhergehendem Abortus war bei einem Tier der Test positiv, bei zwei Tieren war das Ergebnis negativ. Diskussion Dem zuverlässigen und frühzeitigen Trächtigkeitsnachweis kommt in der Rinderproduktion entscheidende Bedeutung zu. Feststellung oder Ausschluss einer Gravidität sollten möglichst früh und mit bestmöglicher Sicherheit erfolgen, um eine ökonomische Betriebsführung zu gewährleis- Trächtigkeitsstatus ELISA trächtig ELISA nicht trächtig Trächtig Nicht trächtig Tab 1: ELISA-Ergebnisse im Vergleich zum Trächtigkeitsstatus bei 710 Rindern (436 besamte und 274 nicht besamte Rinder).

6 Nutztierpraxis 33 Abb. 3 ten. Mit der Etablierung standardisierter ELISA zum Nachweis der PAG besteht nun erstmals die Möglichkeit, neben den bewährten Verfahren der manuellen rektalen Palpation bzw. transrektalen Ultrasonografie insbesondere bei Massenuntersuchungen einen labordiagnostischen Trächtigkeitstest aus Blutproben durchzuführen. Im Rahmen dieser am AGES-Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz durchgeführten Validierungsstudie konnte bei 707 von 710 untersuchten Exportrindern eine labordiagnostische Übereinstimmung mit dem Trächtigkeitsstatus ermittelt werden. Anhand des aus der Routinediagnostik herangezogenen Probenmaterials wurden für das verwendete Testsystem eine Sensitivität von 99,54% und eine Spezifität von 99,64% ermittelt. Seitens des Herstellers wird die Sensitivät mit 99,3% angegeben und liegt somit in ähnlichem Bereich, während die Spezifität vom Hersteller mit 95,1% etwas niedriger angegeben wird. Im Hinblick auf Bewertung und Vergleich von Validierungsstudien unterschiedlicher Autoren ist zu berücksichtigen, dass die Ergebnisse entscheidend von der gewählten Stichprobenauswahl beeinflusst werden und somit Abweichungen hinsichtlich der ermittelten Werte der Spezifität und Sensitivität erklärt werden können. Abb. 3: Teilautomatisierte ELISA-Diagnostik mittels Pipettier-Roboter. Bei frühem Embryonaltod bzw. bei Abortus können über eine bestimmte Zeit noch PAG- Restmengen im maternalen Blutkreislauf sein. Insbesondere das Trächtigkeitsstadium, der zeitliche Abstand zur letzten Abkalbung sowie embryonaler Fruchttod bzw. Aborte der untersuchten Tiere in der Stichprobenauswahl haben einen maßgeblichen Einfluss auf die Ergebnisse des Testsystems. So zeigte ein Tier mit vorhergehendem Abortus ein falsch positives Ergebnis, da über einen bestimmten Zeitraum nach Abortus bzw. Abkalbung noch PAG im Serum nachgewiesen Abb. 4 Michael Dünser (2) Abb. 4: Frühaborte werden oftmals nicht erkannt.

7 34 Nutztierpraxis Abb. 5 Michael Dünser Abb. 5: Spätabortus. werden können. Da für diese Studie ausschließlich Tiere mit einer Trächtigkeitsdauer von 50 bis 219 Tagen zur Verfügung Die ermittelten Ergebnisse erbrachten einen brauchbaren labordiagnostischen Nachweis zur Feststellung des Trächtigkeitsstatus. Literatur Butler, JE, Hamilton WC, Sasser, RG, Ruder, CA, Hass, GM, Williams, RJ (1982): Detection and partial characterization of two bovine pregnancy specific proteins. Biol. Reprod. 26, Friedrich, M, Holtz, W (2010): Establishment of an ELISA for measuring bovine pregnancy associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection. Reprod. Dom. Anim. 45, Sousa, NM, Ayad, JF, Beckers, JF, Gajewsky, Z (2006): Pregnancy associated glycoproteins (PAG) as pregnancy markers in the ruminants. J. Physiol. Pharmacol., 57, Suppl. 8, Zoli, AP, Guilbault, LA, Delahaut P, Ortiz, WB, Beckers, JF (1992): Radioimmunoassay of a bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum: its application for pregnancy diagnosis. Biol. Reprod. 46, standen, konnte der vom Hersteller angegebene frühestmögliche Untersuchungszeitpunkt von 28 Tagen nach der Besamung bzw. Belegung nicht in die Validierungsstudie respektive Bewertung einbezogen werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass aufgrund der in der gewählten Stichprobenauswahl ermittelten Ergebnisse ein brauchbarer labordiagnostischer Nachweis zur Feststellung des Trächtigkeitsstatus gegeben war. Für den Einsatz in der Praxis ist zu berücksichtigen, dass aufgrund der langen Halbwertszeit der peripartal ins Serum sezernierten PAG ein Abstand von ca. 60 bis 90 Tagen zur letzten Abkalbung gegeben sein sollte. Bei frühem Embryonaltod bzw. bei Abortus können über einen bestimmten Zeitraum noch Restmengen von PAG im maternalen Blutkreislauf vorhanden sein (Abb. 4 u. 5). Aufgrund der deutlich niedrigeren PAG-Konzentration in der Milch ist diese Probenmatrix nicht geeignet, weshalb zur Diagnostik ausschließlich Serum bzw. Plasma eingesandt werden muss. Dr. Michael Dünser ist Institutsleiter am AGES-Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz sowie Fachtierarzt für Klinische Laboratoriumsdiagnostik und für Schweine Kontakt: michael.duenser@ages.at Dr. Eva Geisbauer ist Abteilungsleiterin für Serologie-BSE-PCR am AGES- Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz und befasst sich insbesondere mit infektiösen Erkrankungen bei Wiederkäuern. Kontakt: eva.geisbauer@ages.at HR Dr. Heinrich Breuer ist Amtstierarzt bei der BH Ried im Innkreis Kontakt: heinrich.breuer@ooe.gv.at

8 Nutztierpraxis 35.EUôZURô"EHANDLUNGôVONô/STEOARTHROSE Der Weg zur dauerhaften Schmerzlinderung EINMALôMONATLICHô4ROCOXILØ ôô$urchô/steoarthroseôverursachteô3chmerzenôk NNENôZUôEINERô IRREVERSIBLENô3CHMERZSENSIBILISIERUNGô (YPERALGESIE ôf HREN ôô$urchbrechenô3ieôdieô3piraleôderô3chmerzsensibilisierungô MITôDERôNEUENô%IN -ONATS $OSIERUNG.%5!NHALTENDEô7IRKUNGôBEIô/STEOARTHROSEô ABôDERôZWEITENô$OSIS "EZEICHNUNGôDESô4IERARZNEIMITTELS ô4rocoxiløô ômgô+autablettenôf Rô(UNDEô4ROCOXILØô ômgô+autablettenôf Rô(UNDEô4ROCOXILØô ômgô+autablettenôf Rô(UNDEô4ROCOXILØô ômgô+autablettenôf Rô(UNDEô4ROCOXILØôôô ômgô+autablettenôf Rô(UNDE ô!rzneilichôwirk SAMERô"ESTANDTEILôUNDôSONSTIGEô"ESTANDTEILE ô7irkstoff ô-avacoxibô ômgô-avacoxibô ômgô-avacoxibô ômgô-avacoxibô ômgô-avacoxibô ômg ô$ieô4ablettenôenthaltenôau ERDEMôDIEôFOLGENDENôSONSTIGENô"ESTANDTEILE ô3ucroseô-ikrokristallineô#elluloseô3ilicium DIOXID BESCHICHTETô&LEISCHAROMAô#ROSCARMELLOSE.ATRIUMô.ATRIUM DODECYLSULFATô-AGNESIUMSTEARAT ô$reieckigeôbraunôgesprenkelteô4abletteô!ngabeôderô4ablettenst³rkeôaufôderô6orderseiteôundô0kôzer,ogoôaufôderô2 CKSEITE ô!nwendungsgebiete ô4rocoxilø +AUTABLETTENô WERDENôF RôDIEô"EHANDLUNGôVONô3CHMERZôUNDô%NTZ NDUNGôINô:USAMMENHANGôMITôDEGENERATIVENô'ELENKERKRANKUNGENôBEIô(UNDENôANGEWENDETôWENNôEINEô"EHANDLUNGô BERôEINENô:EITRAUMôVONôMEHRôALSôEINEMô-ONATôERFORDERLICHôIST ô4rocoxiløôgeh RTôZURô!RZNEIMITTELGRUPPEôDERô SOôGENANNTENôNICHTSTEROIDALENô!NTIPHLOGISTIKAô.3!)$ ôdieôzurô"ehandlungôvonô3chmerzôundô%ntz NDUNGôANGEWENDETôWERDEN ô'egenanzeigen ô.ichtôbeiô4ierenôanwendenôdieôj NGERôALSô ô-onateôsindôund ODERôUNTERô ôkgôwiegen ô.ichtôbeiô4ierenôanwendenômitôgastrointesti NALENô3T RUNGENôDAZUôGEH RENô'ESCHW REôODERô"LUTUNGEN ô.ichtôanwendenôbeiô(inweisôaufô"lutgerinnungsst RUNG ô.ichtôanwedenôbeiôeingeschr³nkterô.ieren ôoderô,eberfunktion ô.ichtôanwendenôbeiô(erzinsufkôzienz ô.ichtôanwendenôbeiô:uchttierenôtr³chtigenôoderôlaktie RENDENô4IEREN ô.ichtôanwendenôbeiôbekannterôºberempkôndlichkeitôgegen BERôDEMô7IRKSTOFFôODERôEINEMôDERôSONSTIGENô"ESTANDTEILE ô.ichtôanwendenôbeiôbekannterôºberempkôndlichkeitôgegen BERô3ULFONAMIDEN ô.ichtôgleichzeitigôanwendenômitô'lukokortikoidenôoderôanderenô.3!)$ ô.ebenwirkungen ô'elegentlichôwurdeô BERôTYPISCHEô.EBENWIRKUNGENôVONô.3!)$ôWIEô!PPETITLOSIGKEITô$URCHFALLô%RBRECHENô!PATHIEôODERô6ER³NDERUNGôVONôBIOCHEMISCHENô.IERENFUNKTIONSPARAMETERNôBERICHTETôDIEôINôSELTENENô&³LLENôT DLICHôSEINôK NNEN ô7ennôderartigeô.ebenwirkungenôauftretenôdieô!nwendungôdesô4ierarzneimittelsôabbrechenôundôdenô4ierarztôzuô2ateôziehen ô"eachtenô3ieôdassôdieô7irkungôvonô4rocoxiløô BERôEINENôL³NGERENô:EITRAUMô ANH³LTô DIESEôERSTRECKTôSICHôNACHô!NWENDUNGôDERôZWEITENôUNDôALLERôNACHFOLGENDENô$OSENô BERôBISôZUô ô-onate ô.ebenwirkungenôk NNENôW³HRENDôDIESESô:EITRAUMSôJEDERZEITôAUFTRETEN ô 7ARTEZEIT ô.ichtôzutreffend ô6erschreibungsplôichtig ô0harmazeutischerô5nternehmerô0kôzerô,imitedô2amsgateô2oadô3andwichô+entô#4 ô.*ô'ro BRITANNIEN ô RTLICHERô6ERTRETER ô Pfizer GmbH Tiergesundheit 0kôZERô'MB(ô,INKSTRA Eô ô$ ô"erlin ô0kôzerô#orporationô!ustriaô'es M B ( ô&loridsdorferô(auptstra Eô ô! ô7ien