Molekulare Diagnostik, Plattformen, analytische Ansätze, Funktionsweise, Bioinformatik bei Next Generation Sequencing

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1 Molekulare Diagnostik, Plattformen, analytische Ansätze, Funktionsweise, Bioinformatik bei Next Generation Sequencing Humangenetik Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) bei Seltenen Erkrankungen (simultane Sequenzierung mehrer Gene, die bisher nur stufenweise mit großem Aufwand untersucht werden konnten) Multi-Gen-Panels bei hereditären Tumorerkrankungen (simultane Sequenzierung von Core Genes (Hauptgenen) und weiteren krankheitsassoziierten Risiko-Genen) Multi-Gen-Panels bei schweren Erkrankungen des Neugeborenen neonatalis (Sequenzierung von Genen des Neugeborenen-Screenings und eines modifizierten Kingsmore -Panels) Exom-Sequenzierung (Clinical Exome [CES] oder Whole Exome [WES] Sequencing bei klinisch und genetisch sehr heterogenen Krankheitsbildern wie z.b. schweren Entwicklungsstörungen) Ultratiefe Sequenzierung (Deep Sequencing) einzelner Gene (z.b. mit facher Abdeckung) zum Nachweis von Mutationen im geringgradigen Mosaik (1-5%) bei Seltenen Erkrankungen Multi-Gen-Panels bei Leukämien und Lymphomen (simultane Sequenzierung von mehreren molekularen Markern mit mindestens facher Abdeckung zur Erfassung von Mosaiken) Nicht-invasive Pränataldiagnostik, NIPT (ultratiefe Sequenzierung von zellfreier mütterlicher und fetaler DNA [cffdna] aus mütterlichem Blut zur Detektion fetaler Trisomien) Pathologie Targeted Cancer Panels (simultane Sequenzierung von mehreren Genen im Tumorgewebe mit mind facher Abdeckung auf klinisch relevante somatische Mutationen) Companion Diagnostics (Erfassung von Minoritäten somatischer Mutationen therapeutisch relevanter Gene im Tumorgewebe). Transfusionsmedizin HLA-Typisierung (simultane Sequenzierung von HLA-Merkmalen zur Beurteilung der Gewebeverträglichkeit in der Transplantationsmedizin) Mikrobiologie/Virologie Mikrobiom-Analyse (simultane Sequenzierung der Gesamtheit der enteralen Bakteriengenome zur Erfassung von bakteriellen Fehlbesiedelungen) HCV/HIV-Genotyp (ultratiefe Sequenzierung von HCV/HIV-RNA zur frühzeitigen Entdeckung von Therapieresistenzen) Laboratoriumsmedizin Cell-free DNA (ultratiefe Sequenzierung von zellfreien Nukleinsäuren im Blut auf somatische Mutationen in krankheitsassoziierten Genen - RNA Profiling). # Der generelle Einsatz von NGS in der Regelversorgung ist derzeit noch Gegenstand von Verhandlungen mit den Kostenträgern. Eine Untersuchung ist derzeit nur nach Rücksprache und mit einer Kostenübernahmeerklärung möglich Laboratoriumsmedizin Mikrobiologie/Virologie Transfusionsmedizin Pathologie Humangenetik 1

2 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) bei Seltenen Erkrankungen Aortenerkrankungen/Bindegewebserkrankungen Marfan Syndrom (MFS) und Marfan-ähnliche Erkrankungen 16 Thorakale Aortenerkrankungen (TAAD) 17 Bikuspide Aortenklappe mit Risiko für Aortenstenose/-dilatation 18 Kollagen 4-assoziierte intrazerebrale Blutungen 19 Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS) 19 Augenerkrankungen Retinitis pigmentosa 22 Usher-Syndrom 24 Stickler-Syndrom (STL) 24 Senior-Løken-Syndrom 24 Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) und Alström-Syndrom 25 Bindegewebserkrankungen/Skeletterkrankungen Osteogenesis Imperfecta (OI) 26 Stickler-Syndrom (STL) 27 Skelettdysplasien 27 Jeune-/Kurzrippen-Polydaktylie-Syndrom 28 Kraniosynostosen 28 Blut und blutbildendes System Sphärozytose, hereditäre (HS) 30 Fiebersyndrome Hereditäre periodische Fiebersyndrome (HPF) 31 Gerinnungsstörungen Blutungsneigung 32 Thromboseneigung/Thrombophilie 32 Herzerkrankungen Arrhythmogene Erkrankungen 33 Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVD) 34 Brugada-Syndrom (BrS) 35 Catecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) 35 Dilatative Kardiomyopathie (DCM) 36 Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) 37 Long-QT-Syndrom (LQTS) 38 Non-compaction Kardiomyopathie (NCCM) 38 Angeborene Herzfehler 39 Immundefekte (im Kindesalter), primäre Kombinierte T- und B-Zellimmundefekte 43 Schwere kombinierte Immundefekte T-B- 45 Schwere kombinierte Immundefekte T-B+ 46 Omenn-Syndrom 46 Agammaglobulinämie, hereditär 47 Neutropenie, kongenital 47 Lungenerkrankungen Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) 49 Surfactant Dysfunktion 49 Brain Lung Thyroid-Syndrom 49 FLNA-assoziierte Lungenerkrankung 49 Kongenitale alveolar-kapilläre Dysplasie (ACDMPV) 49 Cystische Fibrose (Mukoviszidose, CF) 49 2

3 Muskelerkrankungen Muskelatrophien, spinale (SMA) 50 Myopathien, kongenitale 51 Muskeldystrophien 53 Myopathien, myofibrilläre (MFM) 54 Muskeldystrophien, progressive 54 Nicht-dystrophische Myotonien und periodische Paralysen 56 Stoffwechselmyopathien 56 Neurologische Erkrankungen Ataxien 58 Hyperekplexie 61 Epilepsien, genetisch bedingt 62 Frühkindliche epileptische Enzephalopathien 64 Benigne Neugeborenenkrämpfe 65 Fokale Epilepsien 66 Generalisierte, juvenile, myoklonische Epilepsien 66 Epilepsien mit erhöhter Therapierelevanz 66 Familiäre hemiplegische Migräne (FHM) 67 Rett-Syndrom/Rett-Syndrom ähnliche Erkrankungen 67 Autosomal-rezessive primäre Mikrozephalien (MCPH) - Mikrozephalie-Kleinwuchs-Syndrome 68 Alzheimer Erkrankung, familiär 68 Nierenerkrankungen Angeborene Fehlbildung der Nieren und ableitenden Harnwege (CAKUT) 70 Fehlbildungen der ableitenden Harnwege 73 Nierenagenesie/Hypoplasie 74 Renale tubuläre Dysgenesie 74 Nierenerkrankungen, polyzystische 75 Nephronophthise (NPHP) 76 Nephrotisches Syndrom (NS)/Fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS) 77 Alport-Syndrom 77 Hyperoxalurie 77 Pankreatitis, hereditäre RASopathien Cardio-Facio-Cutanes-Syndrom 80 LEOPARD-Syndrom 81 Noonan-Syndrom 81 Schwerhörigkeit/Taubheit Taubheit, autosomal-dominant 82 Taubheit, autosomal-rezessiv 84 Taubheit, syndromal 86 Taubheit, mitochondrial 87 Usher-Syndrom (USH) 87 Stoffwechselerkrankungen Congenitale Defekte der Glykosylierung (CDG) 88 Harnstoffzyklus-Defekte 89 Hyperoxalurie 89 Maligne Hyperthermie (MH) 89 Maturity-onset-Diabetes of the Young (MODY) 90 Mukopolysaccharidosen (MPS) 90 Porphyrien 91 Ziliopathien Joubert-Syndrom 94 Meckel-Gruber-Syndrom 94 Jeune-/Kurzrippen-Polydaktylie-Syndrom 95 Laboratoriumsmedizin Mikrobiologie/Virologie Transfusionsmedizin Pathologie Humangenetik 3

4 Senior-Løken-Syndrom 95 Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) 96 Oro-facio-digitales Syndrom (OFS) 96 Primäre ziliäre Dyskinesie 97 Heterotaxie 98 Nephronophthise (NPHP) 98 Polyzystische Nierenerkrankungen 99 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) bei hereditären Tumorprädispositionserkrankungen Tumorerkrankungen, familiäre Familiäres Mamma- und Ovarialkarzinom 100 Kolonkarzinom, familiär 100 neonatalis - Neugeborenen-Screening Erkrankungen des Neugeborenen und Säuglings neonatalis basic [18 Gene] neonatalis extended [> 600 Gene] Clinical Exome Sequencing (CES)/Whole Exome Sequencing (WES) bei kindlicher Entwicklungsverzögerung CES/WES Ultradeep Sequencing einzelner Gene bei Seltenen Erkrankungen Mosaik-Diagnostik Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) und Ultradeep Sequencing (UDS) bei Leukämien und Lymphomen Erkrankungen der myeloischen Zellreihe Akute myeloische Leukämie (AML) 106 Myelodysplastisches Syndrom (MDS) 106 Chronische myelomonozytäre Leukämie (CMML) 107 Atypische chronische myeloische Leukämie (acml) 107 Chronische myeloische Leukämie (CML) 107 Chronische Neutrophilenleukämie (CNL) 107 Polyzythämia vera (PV) 107 Primäre Myelofibrose (PMF) 107 Essentielle Thrombozythämie (ET) 108 Mastozytose 108 Erkrankungen der lymphatischen Zellreihe Akute lymphatische Leukämie (ALL) 108 Chronische lymphatische Leukämie (CLL) 108 Haarzellleukämie (HZL) 108 Morbus Waldenström (MW) 108 Lymphom allgemein 109 Großzellige granuläre Lymphozyten-Leukämie (T-LGL, NK-LGL) 109 Prenatalis - Nicht-invasiver Pränataltest (NIPT) Nachweis einer Trisomie 21, 18, 13 Fehlverteilungen der Geschlechtschromosomen X und Y Prenatalis : Befundübermittlung innerhalb 8-10 Werktagen Prenatalis Prior: Befundübermittlung innerhalb 5 Werktagen 4

5 Targeted Cancer Panels an Tumormaterial Tumoren des Gastrointestinaltraktes Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) Kolorektales Karzinom (CRC) Pankreaskarzinom Tumoren des endokrinen Systems Schilddrüsenkarzinom Ovarialkarzinom Tumoren des Gehirns Glioblastom Tumoren der Haut Malignes Melanom Tumoren der Lunge Lungenkarzinom, nicht-kleinzellig (NSCLC) Tumoren der Niere und der ableitenden Harnwege Harnblasenkarzinom Companion Diagnostics an Tumormaterial DNA -Signatur-Tests im Rahmen einer Therapieindikation Gastrointestinale Stromatumoren (KIT, PDGFRa) - Imatinib, Sunitinib, Regorafinib Glioblastom (IDH1, IDH2) - AGI5198, AGI6780, Temozolomid Kolorektales Karzinom (BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA) - Bevacizumab, Cetuximab, Panitumumab, Regorafenib Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges [NSCLC] (EGFR, KRAS, BRAF, RET-, ALK-, ROS1-Rearrangements) - Afatenib, Binimetinib, Cabozantinib, Ceritinib, Combimetinib, Crizotinib, Dabrafenib, Encorafinib, Erlotinib, Gefitinib, Selumetinib, Trametinib, Verumafenib Malignes Melanom (BRAF, KIT, NRAS) - Bimetinib, Combimetinib, Dabrafenib, Dasatinib, Encorafinib, Imatinib, Nilotinib, Sunitinib, Trametinib, Vemurafenib Ovarialkarzinom (BRCA 1/2) - Olaparib Schilddrüsenkarzinom (RET, BRAF, KRAS) - Cabozantinib, Dabrafenib, Trametinib, Vandetanib HLA-Typisierung Hochauflösende HLA-Typisierung Ultrahochauflösende HLA-Typisierung Mikrobiologie/Virologie Mikrobiom-Analyse HIV/HCV Genotypisierung und Resistenztestung Laboratoriumsmedizin cf-dna-analyse Liste der Erkrankungen/Syndrome 122 Laboratoriumsmedizin Mikrobiologie/Virologie Transfusionsmedizin Pathologie Humangenetik Liste der Gene 131 5

6 Impressum Alle Rechte vorbehalten Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsdiagnostik (MVZ) Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen Leistungsverzeichnis und Leitfaden für die Praxis Herausgegeben von Dr. med. Hanns-Georg Klein und Dr. med. Imma Rost Redaktion: Dr. med. Hanns-Georg Klein Grafische Gestaltung: Rüdiger Schmautz (Herrsching) Verlag: Dr. Klein, München Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die der Übersetzung, des Nachdrucks und der Vervielfältigung des Buches oder Teilen daraus, vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm, Datenträger oder anderen Verfahren) reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Wichtiger Hinweis: Wissenschaft unterliegt einem ständigen Fluss. Für die Richtigkeit des Inhalts der einzelnen Kapitel kann keine Garantie übernommen werden. Soweit möglich, wurden die wichtigsten Quellen für die wissenschaftlichen Laborinformationen angegeben. Der Kenntnisstand entspricht dem Zeitpunkt der Drucklegung im November

7 Next Generation Sequencing oder die Evolution der molekularen Diagnostik Die technischen Möglichkeiten, das Erbgut von Mensch, Tier und Pflanzen, aber auch das von Infektionserregern, Mikroorganismen oder Parasiten - kurz der gesamten belebten Materie - zu analysieren, haben sich seit 2007 durch Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Methoden, die unter dem Begriff Next Generation Sequencing (NGS) zusammen gefasst werden, dramatisch weiterentwickelt. Wurde der vorläufige Abschluss des Humanen Genom-Projekts (HGP) im Jahr 2000 noch als Durchbruch in der biomedizinischen Forschung durch Tausende beteiligter Wissenschaftler gefeiert, kann heute ein Humanes Genom von einem technisch versierten Mitarbeiter innerhalb von 1 Woche in hoher Qualität sequenziert werden. Die Kosten für die Sequenzierung von einem kompletten menschlichen Genom haben sich in den vergangenen 15 Jahren von 100 Mio US$ auf nunmehr etwas mehr als US$ reduziert. Gleichzeitig hat sich der Durchsatz der Geräte unter der Annahme einer 100-fachen Abdeckung/Base ebenfalls um den Faktor erhöht. Zu berücksichtigen sind allerdings Leseweiten, schlecht abgedeckte Bereiche (geringe Coverage) und ca. 10% Lücken (Gaps), so dass der Einsatz der Gesamt-Genomsequenzierung für die Diagnostik derzeit noch nicht empfohlen wird (Klein HG et al., J Lab Med 38:221, 2014). Die gewaltigen technologischen Fortschritte in den DNA-Sequenziertechnologien übertreffen sogar die Geschwindigkeit der Weiterentwicklung von Speichermedien in der IT-Industrie (sog. Moor sches Gesetz) und ein Ende der Entwicklung ist derzeit noch nicht abzusehen (Klein HG und Rost I, Bundesgesundheitsbl 58:113, 2015). Auch für die Anwendungen in der Diagnostik haben die Hochleistungs-Sequenziertechnologien erhebliche Bedeutung. So wird in der Humangenetik bereits darüber diskutiert, seltene Erkrankungen anstatt der bisher üblichen Zieldiagnostik grundsätzlich einer Genomanalyse zu unterziehen. Aber wie geht man mit Zusatzbefunden um, die ein Risiko für eine spätmanifestierende neurodegenerative Erkrankung erkennen lassen? Wie kommuniziert man die zahlreichen unklaren genetischen Varianten, deren Interpretation zum heutigen Zeitpunkt noch nicht möglich ist? Wie klärt man Patienten im Sinne des Gendiagnostikgesetzes (GenDG) über Wesen, Bedeutung und Tragweite einer Genomanalyse auf? Kann ein Recht auf Nichtwissen oder Datenschutz im Zeitalter des Data Sharing und der Digitalisierung der Medizin überhaupt noch gewährleistet werden? Auch in der Pathologie tun sich bisher ungekannte Fragen auf: Inwieweit sind somatische Neumutationen, die in geringer Anzahl im Tumor nachweisbar sind, überhaupt therapierelevant? Die Liste der offenen Fragen könnte man nach Belieben verlängern. Weder die medizinischen Fachgesellschaften noch die Ärztliche Selbstverwaltung, geschweige denn der Gesetzgeber oder die Regulierungsbehörden kommen der Dynamik der Prozesse hinterher. Dies wird jedoch die Entwicklung nicht stoppen, sondern sollte Ansporn für eine aktive Mitgestaltung der Zukunft sein. 7

8 Next Generation Sequencing (NGS) - Plattformen am MVZ Martinsried Illumina HiSeq 2500 (Leseweite ca. 2 x 125 bp) Illumina NextSeq 500 Leseweite ca. 2 x 150 bp MiSeq Benchtop Sequencer Leseweite ca. 2 x 300 bp Ion Torrent PGA (Leseweite ca. 1 x 200 bp) Roche GS FLX (Leseweite ca. 600 bp) Roche GS FLX+ (Leseweiten > bp) Roche 454 Junior (Leseweite ca. 600 bp) Durchsatz*: Gb/Lauf (6 Tage) Durchsatz*: Gb/Lauf (48 Std.) Durchsatz*: 15 Gb/Lauf (65 Std.) Durchsatz*: 3 Gb/Lauf (24 Std.) Durchsatz*: 1 Gb/Lauf (10 Std.) Durchsatz*: 1 Gb/Lauf (10 Std.) Durchsatz*: 0,05 Gb/Lauf (8 Std.) *Durchsatz bei NGS bezieht sich auf 1-fache Abdeckung (Coverage) je Base. Für die Diagnostik wird mindestens 20-fache Coverage gefordert. Zum Vergleich das bisher leistungsfähigste Gerät, mit dem das Human Genomprojekt (HGP) durchgeführt wurde: ABI 3730xl 96-Kapillar-Sequencer (Leseweite ca. 800 bp) Durchsatz: < 0,0001 Gb/Lauf (8 Std.) Analytische Ansätze in der Humangenetik Multi-Gen-Panel Sequenzierung (MGPS) Der Panel-Ansatz stellt im Grunde die Weiterentwicklung der bisherigen Stufendiagnostik mittels Sanger- Sequenzierung dar. In den vergangenen 15 Jahren wurden immer neue Gene in Assoziation mit seltenen Erkrankungen beschrieben, was dazu geführt hat, dass auch immer mehr Gene diagnostisch untersucht wurden. Viele der neu beschriebenen Gene sind jedoch weit seltener ursächlich als die bereits bekannten Hauptgene ( Core Genes ). Daher werden auch heute noch die einzelnen Gene beginnend mit den am häufigsten betroffenen Regionen stufenweise analysiert, um den Aufwand auf ein sinnvolles Maß zu begrenzen. Nun können aufgrund des enormen Durchsatzes der NGS-Methoden alle bekannten krankheitsassoziierten Gene in einem Panel-Ansatz parallel analysiert werden, wodurch der technische Aufwand deutlich reduziert wird. In gleichem Maße steigt allerdings der Aufwand für die Interpretation der zahlreichen Varianten, die bei der simultanen Analyse von mehreren Genen anfällt, deutlich an. Dennoch stellen die Panel-Ansätze in der Diagnostik von seltenen Erkrankungen heute die Methode der Wahl dar, eine Tatsache, die leider in Deutschland vom Gemeinsamen Bundesausschuß (G-BA) und den Spitzenverbänden seit Jahren völlig ignoriert wird. Die Vorteile der Panel-Ansätze gegenüber Exom- oder Genom-weiten Ansätzen liegen derzeit noch 1) in der Qualität der analysierten Genabschnitte (keine Lücken, alle Bereiche sicher abgedeckt*), 2) in geringeren Kosten für die Reagenzien und 3) in der Vermeidung von unerwünschten Zusatzbefunden. * eine lückenlose Abdeckung und diagnostische Qualität kann nur erreicht werden, wenn die Panel-Gene gleichzeitig auch mittels MLPA auf das Vorliegen von Mikrodeletionen untersucht werden (Klasse A-Analysequalität) 8

9 Clinical Exome Sequenzierung (CES) Im Vergleich zu Whole Exome Sequencing (WES), bei der alle proteincodierenden Bereiche angereichert und sequenziert werden, wird bei Clinical Exome Sequencing (CES) ein Subset des Exoms angereichert. Hierbei wird auf krankheitsassoziierte Gene fokussiert, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD) beschrieben sind. Die angereicherte Region umfasst hierbei derzeit, je nach Anbieter, zwischen Gene (Agilent Inherited Disease) und Gene (Illumina TruSightOne) und damit bis zu Exons (weitere Informationen und vollständige Genliste siehe auf bzw. Der Vorteil der CES liegt in der Vorauswahl von krankheitsrelevanten Genen, die die Interpretation der identifizierten Varianten erleichtert und gleichzeitig das Auftreten von Varianten unklarer Signifikanz und das Vorkommen von Zusatzbefunden minimiert. CES ist flexibel einsetzbar für verschiedene Indikationen wie ursächlich ungeklärte Entwicklungsstörungen sowie Erkrankungen, die durch Mutationen in mehreren verschiedenen Genen bedingt sein können. Eine vollständige, lückenfreie Analyse ist allerdings bei CES nicht möglich, da - mit vertretbarem Aufwand - weder für alle untersuchten Gene eine MLPA durchgeführt werden, noch in allen Bereichen eine vollständige Abdeckung erreicht werden kann. Die Untersuchung mit CES ist derzeit keine Regelleistung der Krankenkassen. Vor der Untersuchung muss daher eine Kostenübernahme bei der Krankenversicherung beantragt werden. CES unterliegt den Regelungen des Gendiagnostik-Gesetzes (GenDG), d.h. es ist eine ausführliche Aufklärung und eine schriftliche Einwilligung, sowie vor prädiktiven Analysen (d.h. Untersuchung von Gesunden) zusätzlich eine genetische Beratung erforderlich. Da der Untersuchungsansatz sehr viele krankheitsassoziierte Gene umfasst, bieten wir für bestimmte Erkrankungen (z.b. hereditäre Krebserkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen) im Rahmen der Aufklärung und/oder genetischen Beratung eine Wahlmöglichkeit, diese Gene in die Auswertung mit einzubeziehen oder auszublenden (Opt-in/Opt-out). Exom 50 Mb (ca Gene) Genom 3 Gb Clinical Exom 7-12 Mb ( Gene) Schematische Darstellung der großen analytischen Ansätze in der Humangenetik: Clinical Exome ( Gene, 7-12 Mb), Whole Exome (ca Gene, 50 Mb), Whole Genome (ca Gene plus nicht-codierende Genregionen, Mb). Whole Exome Sequencing (WES) Whole Exome Sequencing (WES) umfasst die Anreicherung und Sequenzierung aller proteincodierenden Bereiche (ca Gene), wohingegen bei Clinical Exome Sequencing (CES) nur ein Subset des Exoms (krankheitsassoziierte Gene) angereichert wird. WES hat sich in der jüngeren Vergangenheit als hervorragendes Mittel zur Identifikation von krankheitsverursachenden Mutationen in bisher unbekannten Genen etabliert, sowohl im Fall von autosomal-rezessiven Erkrankungen (Ng, SB et al, Nat Genet 2009) wie auch bei autosomal-dominanten Erkrankungen (Hoischen, A et al, Nat Genet 2010). Seitdem wird WES auch immer mehr in der Diagnostik eingesetzt, vor allem bei Indikationen bei denen Mutationen in einer Vielzahl von Genen als krankheitsverursachend in Frage kommen. 9

10 Mehrere Studien in den letzten beiden Jahren, in denen Patienten mit schwerer Intelligenzminderung (IQ<50) mittels neuer Hochdurchsatz-Techniken wie der Exom-Sequenzierung untersucht wurden, konnten bestätigen, dass autosomal-dominante Neumutationen offenbar in erheblichem Umfang zur Ursache der schweren Intelligenzminderung beitragen (z. B. Vissers L. et al, Nat Genet, 2010, de Ligt, J. et al, NEJM, 2012 und Rauch, A. et al, Lancet, 2012). Während bei chromosomalen Trisomien das Risiko mit dem mütterlichen Alter steigt, nimmt die Rate an autosomal-dominanten Neumutationen mit dem väterlichen Alter zu (Veltman JA et al, Nat Rev Genet, 2012). Bei den untersuchten Patienten wurden Varianten in verschiedenen Genen gefunden, wobei in der Studie von de Ligt et al bei 16% der Patienten eine kausale Mutation in einem bereits im Zusammenhang mit Entwicklungsstörungen beschriebenen Gen gefunden wurde, bei Rauch et al bei 35% der Patienten. Man geht daher nach diesen Studien davon aus, dass bis zu 50% der schweren, nicht-syndromalen Entwicklungsstörungen durch de novo-punktmutationen und kleine Indels verursacht werden, wobei eine große genetische Heterogenität zu beobachten ist. Mutationen in noch unbekannten bzw. nicht im Zusammenhang mit Entwicklungsstörungen bekannten Genen erfordern allerdings noch einen immensen Aufwand an integrierter Diagnostik (einschließlich funktioneller Tests), um den ursächlichen Zusammenhang zu beweisen, weshalb WES nur in besonderen Fällen für den Routineeinsatz geeignet ist. Zusätzlich zu der Diagnostik von Entwicklungsstörungen kann WES genutzt werden, um die bestehende Diagnostik zu erweitern. Im Bereich der Epilepsien, Ziliopathien (Joubert-Syndrom) und weiteren Indikationen ist der Einsatz von WES nach Rücksprache möglich. Die Untersuchung mit WES ist derzeit keine Regelleistung der Krankenkassen. Vor der Untersuchung muss daher eine Kostenübernahme bei der Krankenversicherung beantragt werden. WES unterliegt den Regelungen des Gendiagnostik-Gesetzes (GenDG), d.h. es ist eine ausführliche Aufklärung und eine schriftliche Einwilligung sowie vor prädiktiven Analysen (d.h. Untersuchung von Gesunden) zusätzlich eine genetische Beratung erforderlich. Da der Untersuchungsansatz sehr viele krankheitsassoziierte Gene umfasst, bieten wir für bestimmte Erkrankungen (z.b. hereditäre Krebserkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen) im Rahmen der Aufklärung und/oder genetischen Beratung eine Wahlmöglichkeit, diese Gene in die Auswertung mit einzubeziehen oder auszublenden (Opt-in/Opt-out). Whole Genome Sequencing (WGS) Im Vergleich zum Clinical Exome Sequencing (CES), bei dem ein Subset des Exoms angereichert und sequenziert wird oder Whole Exome Sequencing (WES), bei dem alle proteincodierenden Bereiche analysiert werden, handelt es sich bei Whole Genome Sequencing (WGS) um die Sequenzierung des gesamten Genoms, d.h. auch aller nicht codierenden Regionen (weitere Informationen siehe auf Der Vorteil der WGS liegt vor allem darin, dass keine Anreicherungsartefakte entstehen, da es sich um die direkte Analyse einer aus genomischer DNA hergestellten Library handelt. Hierdurch ist auch ein Nachweis von Copy Number Variations (CNVs) möglich. Aufgrund der Kosten, der Datenqualität und vor allem der zu erwartend besonders hohen Anzahl von unklaren Varianten (VUS) hat sich der Einsatz von WGS in der Routine-Diagnostik noch nicht durchgesetzt. Eine umfassende Aufklärung nach den Vorgaben des Gendiagnostikgesetzes (GenDG) ist bei WGS kaum noch möglich. WGS wird derzeit daher vor allem in der Erforschung von seltenen Erkrankungen und in der Onkologie (Tumorgenome) eingesetzt (Klein HG et al, J Lab Med 38:221, 2014; Klein HG und Rost I, Bundesgesundheitsbl 58:113, 2015). Die Untersuchung mit WGS ist derzeit keine Regelleistung der Krankenkassen. Vor der Untersuchung muss daher eine Kostenübernahme bei der Krankenversicherung beantragt werden. WGS unterliegt den Regelungen des Gendiagnostik-Gesetzes (GenDG), d.h. es ist eine ausführliche Aufklärung und eine schriftliche Einwilligung sowie vor prädiktiven Analysen (d.h. Untersuchung von Gesunden) zusätzlich eine genetische Beratung erforderlich. Da der Untersuchungsansatz sehr viele krankheitsassoziierte Gene umfasst, bieten wir für bestimmte Erkrankungen (z.b. hereditäre Krebserkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen) im Rahmen der Aufklärung und/oder genetischen Beratung eine Wahlmöglichkeit, diese Gene in die Auswertung mit einzubeziehen oder auszublenden (Opt-in/Opt-out). Wie funktionieren NGS-Technologien? Bei der Illumina Sequencing-by-Synthesis (SBS)-Methode wird die fragmentierte Template DNA über spezifische Adaptoren kovalent an einen Glasobjektträger (FlowCell) gebunden, auf dem die Sequenzierreaktion stattfindet. Von dem gebundenen Startmolekül ausgehend werden durch einen PCR-ähnlichen Schritt 10

11 Cluster aus identischen Molekülen gebildet (Bridge Amplification). Die Sequenzierung erfolgt zyklisch und nutzt reversible Terminatorchemie sowie fluoreszenzmarkierte Nukleotide. In jedem Zyklus wird genau ein Nukleotid komplementär zu der Template-DNA eingebaut. Ein besonderes Merkmal der SBS-Methode ist die sog. paired-end-sequenzierung. Hierbei werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente von jeder Seite mit einer vorher festgelegten Leseweite von bp sequenziert. Je nach Größe der DNA-Fragmente können diese Reads überlappen oder durch einen nicht-sequenzierten DNA-Teil (Insert) getrennt sein. Dieser Ansatz bietet Vorteile bei der bioinformatischen Auswertung und kann die Genauigkeit der Analysen signifikant erhöhen. Roche 454 Sequenziersysteme verwenden Emulsions-PCR (empcr) für die klonale Amplifikation der Proben, gefolgt von hoch-parallelem Pyrosequencing. Während der empcr wird die zu sequenzierende DNA an spezifische Beads gebunden und klonal amplifiziert. Die DNA tragenden Beads werden dann angereichert und in spezielle Reaktionskammern auf sog. Pico Titre Plates (PTP) befördert, welche alle für die Sequenzierung benötigten Reagenzien enthalten. Anschließend werden sequenziell Fluoreszenz-Desoxyribonucleotide (datp, dttp, dctp, dgtp) zugegeben. Bei Komplementarität zur Base des Templates erfolgt der Einbau des korrespondierenden Desoxy-Nukleotids und die Emission eines Lichtsignals. Sind in der zu sequenzierenden DNA mehrere aufeinanderfolgende, identische Nukleotide (Homopolymere) vorhanden, werden mehrere gleiche Nukleotide nacheinander eingebaut und das korrespondierende Lichtsignal ist proportional stärker. Life Technologies Sequenziersysteme (z.b. Ion Torrent PGA oder Proton) basieren auf einer ph-vermittelten Sequenzierung und werden auch als Post-Light -Sequenzierung bezeichnet. Die Methode folgt einem Sequenzierung-durch-Synthese-Ansatz insofern, dass ein DNA-Template durch sequentiellen Nukleotideinbau komplementiert wird. Die Methode zur Detektion der eingebauten Nukleotide unterscheidet sich allerdings substantiell von den vorher beschriebenen Methoden durch den Verzicht auf ein optisches Signal. Der Einbau eines Nukleotids involviert das Formen einer kovalenten Bindung unter Freisetzung eines Pyrophosphats und eines positiv geladenen Wasserstoffions. Der Einbau eines Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird bei dem Ion Torrent-System durch eine Änderung des ph-wertes, ausgelöst von dem freigesetzten Wasserstoffion, detektiert. Die zu sequenzierende DNA wird in Mikroreaktionskammern auf einen Halbleiterchip gebracht. Diese Reaktionskammern enthalten die DNA Polymerase, die verschiedenen Nuleotide werden sequentiell zugesetzt. Komplementäre Nukleotide werden von der Polymerase eingebaut und die freigesetzten Wasserstoffionen werden von einer ionensensitiven Schicht unter den Reaktionskammern detektiert. Wie bei der Roche 454 Technologie kann es zum Einbau von multiplen Nukleotiden in den Template-Strang kommen, falls eine Homopolymer-Region vorliegt. Auch hier ist das detektierte ph-signal proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Die Sequenzierung eines Halbleiterchips dauert 2-4 Stunden, die Leseweite beträgt je nach eingesetztem Kit durchschnittlich 100, 200 oder 300 bp. Es werden verschiedene Chip-Größen angeboten, die einen flexiblen Durchsatz ermöglichen: bis 10 Mb mit dem 314 Chip, bis 100 Mb mit dem 316 Chip und bis zu 1 Gb mit dem 318 Chip. Bioinformatik - Management von Big Data Die Bioinformatik ist ein interdisziplinäres Feld der Naturwissenschaft, das Methoden für die computergestützte Analyse, Organisation und Speicherung von biologischen Daten entwickelt und implementiert. Ein wichtiges Aufgabenfeld der modernen Bioinformatik ist die Entwicklung von spezifischer Software für die Analyse und Extraktion von biologisch oder klinisch relevanten Daten aus großen Mengen an Rohdaten. Die Bioinformatik hat sich zu einem essentiellen Gebiet innerhalb der molekularen Biologie entwickelt und wird besonders in der Genetik und Genomik eingesetzt. Mithilfe von bioinformatischen Methoden und Software wird die Sequenzierung und Annotation von Genen und Genomen und die Identifikation der enthaltenen genetischen Varianten unterstützt. Auch die Auswertung von weiteren genomweiten Untersuchungen wie Array-CGH, Identifikation von Repeat-Regionen, die Suche nach speziellen Sequenzmustern (Promoterregionen, Transkriptionsfaktor- oder MikroRNA-Bindestellen) oder die Erstellung von Protein- Interaktionsnetzwerken wird mittels bioinformatischer Methoden und Algorithmen durchgeführt. Die Bioinformatik benutzt und integriert dabei Methoden aus der Informatik, Mathematik und (Bio-) Statistik. Die Auswertung und Speicherung von biologischen Daten kann Algorithmen aus den Feldern Data Mining, maschinelles Lernen, Datenbanktheorie und künstliche Intelligenz beinhalten. Häufig benutzte Programmiersprachen für die Implementierung von bioinformatischer Software sind zum Beispiel Java, Perl, Python, R, SQL oder MATLAB. 11

12 Insbesondere bei der Auswertung von NGS-Daten kommt die Bioinformatik zum Einsatz. Einzelne Auswerteschritte werden hierbei zu einer Pipeline zusammengeführt, um eine Automatisierung der Datenanalyse zu erreichen. Die Rohdaten der Sequenzierung liegen im sogenannten.fastq Format vor, das alle Sequenzen und deren korrespondierende Qualitätswerte enthält. Als erstes werden die Reads den jeweiligen Patientenproben zugeordnet, die über einen eindeutigen Barcode identifiziert werden (Demultiplexing). Danach werden die Sequenzen der einzelnen Proben an das Humangenom (hg19) aligniert (Mapping). Mit diesem Mapping als Grundlage wird ein Variant Call durchgeführt, der alle Abweichungen der zu analysierenden Sequenzen von der Referenzsequenz in Form einer Tabelle ausgibt. Diese werden neben Exonnummerierung, cdna- und Aminosäreaustausch mit verschiedenen externen Ressourcen und Datenbanken wie HGMD, dbsnp, COSMIC, dbnsfp, PGX, sowie Daten aus großen, internationalen Sequenzierprojekten wie dem Exome Variant Server (EVS) und dem Exome Aggregation Consortium (ExAC), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ) Informationen und experimentell verifizierten transcription factor-binding sites (TFBS) annotiert. Des Weiteren werden Bereiche, die nicht ausreichend für eine diagnostische Beurteilung abgedeckt sind detektiert (Coverage < 20). Diese Bereiche können gegebenenfalls mittels Sanger-Sequenzierung nachanalysiert werden. Die Ergebnisse dieses Variant Calls werden in ein relationales Datenbankschema importiert. Die MIDAS- Datenbank nützt Informationen von allen sequenzierten Proben in anonymisierter Form zur internen Qualitätskontrolle, der Detektion von potentiellen Artefakten der Sequenzierung und zur Bestimmung der Frequenz jeder Variante in dem hausinternen Patientenkollektiv. Die Datenbank ist über ein Webinterface abfragbar und erlaubt ein dynamisches Filtern der Daten während der Auswertung. "Core Genes in der humangenetischen Diagnostik "Core Genes oder Hauptgene beziehen sich auf ein oder mehrere klinische Kernsymptome und umfassen alle erforderlichen Gene, die obligatorisch bei der diagnostischen Abklärung einer Erkrankung oder Verdachtsdiagnose untersucht und beurteilt werden müssen. Alle "Core Genes müssen zu 100% abgedeckt sein, d.h. sie dürfen keine diagnostischen Lücken (Gaps) aufweisen (s. auch Guidelines for diagnostic nextgeneration sequencing, EuroGenTest 2014, sog. Klasse A-Analysequalität, s. auch Rehm HL et al, Genet Med 15:733, 2013) Merkmale von "Core Genes - Gene aus etablierter Standard-/Stufendiagnostik, für die prophylaktische oder therapeutische Konsequenzen bereits bekannt und/oder etabliert sind (z.b. Gene aus existierenden Leitlinien oder Empfehlungen von Fachgesellschaften), - Gene, die aufgrund von Literatur- und Datenbank-Recherchen als (sehr wahrscheinlich) krankheitsassoziiert eingestuft werden müssen, - Gene, bei denen die Befundrückführungszeit 12 Wochen nicht übersteigt, - Gene, deren Qualifikationskriterien regelmäßig überprüft werden. Einschlußkriterien für "Core Genes - möglichst mehrfach beschrieben, auch in verschiedenen Familien, - wissenschaftlich belegte funktionelle Signifikanz im Zusammenhang mit der Erkrankung, - diagnostische Sensitivität > 1% der klinisch gesicherten Fälle, - diagnostische Sensitivität 0,1 1% bei sehr seltenen Erkrankungen und bei therapeutischer Konsequenz. Ausschlußkriterien für "Core Genes - isolierte Evidenz aus Assoziationsstudien, - genetische Varianten mit hoher Frequenz in der Normalbevölkerung in Abhängigkeit von der jeweiligen Erkrankung und dem Vererbungsmodus. 12

13 Variantenklassifikation Ein weitere wichtige Forderung der Fachgremien sind transparente und nachvollziehbare Regelungen, nach welchen Kriterien genetische Varianten beurteilt und eingeordnet werden. Hier hat sich in den vergangenen Jahren eine Klassifikation aus 5 Kategorien durchgesetzt, die jeder Anbieter entsprechend seines Leistungsspektrums definieren soll (Richards S et al. Genet Med, March 2015, doi: /gim /sukhai MA et al, Genet Med, April 2015,doi: /gim ). Klasse Bezeichnung Beschreibung 5 pathogene Mutation a) In der Literatur bzw. in genspezifischen Mutationsdatenbanken als eindeutig pathogen klassifizierte Mutationen, b) nicht in der Literatur beschriebene Mutationen: - Nonsense- und Frameshift-Mutationen - Spleißmutationen in hochkonservierten Bereichen (+1+2/-1-2) - Deletionen (eines oder mehrerer Exons) - Klasse-4-Variante deren Ursächlichkeit durch Segregations- bzw. Funktionsanalysen nachgewiesen wurde. 4 wahrscheinlich pathogene Variante 3 Variante unklarer Signifikanz 2 wahrscheinlich benigne Variante 1 benigne Variante/ Polymorphismus a) Spleißvarianten in mäßig konservierten Bereichen, bei denen in silico- Programme einen Spleißdefekt vorhersagen, b) nicht beschriebene Varianten, die von mindestens 3 in silico-programmen übereinstimmend als pathogen deklariert werden und die mit einer Häufigkeit <1% (krankheitsabhängig) in der Normalbevölkerung auftreten, c) nicht beschriebene Missense-Varianten, die von mindestens 3 in silico-programmen unterschiedlich bewertet werden und die mit einer Häufigkeit <1% (krankheitsabhängig) in der Normalbevölkerung auftreten, für deren Position aber eine vergleichbare eindeutig pathogene Aminosäuresubstitution bekannt ist. a) Nicht beschriebene Varianten, die von mindestens 3 in silico-programmen nicht übereinstimmend bewertet werden und die mit einer Häufigkeit 1% (krankheitsabhängig) in der Normalbevölkerung auftreten b) in der Literatur kontrovers diskutierte Varianten c) Varianten, die keiner anderen Klasse zugeordnet werden können. a) Nicht beschriebene Varianten, die von mindestens 3 in silico- Programmen übereinstimmend als nicht pathogen deklariert werden und die mit einer Häufigkeit <1% (krankheitsabhängig) in der Normalbevölkerung auftreten b) Klasse-3- oder 4-Varianten, die nicht mit der Erkrankung kosegregieren c) Varianten, die gemeinsam mit einer Klasse-5-Mutation in trans auftreten (autosomal-dominante Erkrankungen). a) Varianten, die in der Literatur oder den Datenbanken als solche beschrieben sind b) Varianten mit einer im Verhältnis zur Prävalenz der Erkrankung zu hohen Frequenz in der Normalbevölkerung. 13

14 Qualitätsmerkmale entsprechend EuroGenTest-Leitlinie Guidelines für den Einsatz von NGS in der Diagnostik Durch die Einführung von neuen Sequenziertechnologien werden auch neue Herausforderungen an bestehende Prozesse wie die Validierung von genetischen Untersuchungen gestellt. Bisherige Guidelines für die Test-Validierung (wie zum Beispiel Mattocks et al., 2010) können nicht ohne Anpassungen übertragen werden. Es ist notwendig Qualitätskriterien und Standards für diese Technologien neu zu definieren (Guidelines for diagnostic next generation sequencing, Matthijs et al., 2015, Eur J Hum Genet, accepted, Je nach angelegten Qualitätskriterien lassen sich NGS-basierte Tests in drei Gruppen einteilen: Typ A Test Diese Art von Test bietet die vollständigste Analyse die mit dem derzeitigen Stand der Technik durchführbar ist. Das bedeutet, dass alle Zielregionen entweder ausreichend mittels NGS-Reads abgedeckt sind (Coverage >= 20x). Ist eine Zielregion nicht ausreichend abgedeckt werden alle Lücken mittels Sanger-Sequenzierung geschlossen. Bei einem Typ A Test werden alle Gene des Panels vollständig abgedeckt. Typ B Test Bei sehr großen MGPS-Analysen (> 50 Gene) ist es oft nicht mehr möglich für alle Gene eine lückenlose Abdeckung zu garantieren. Deswegen werden hier nur die jeweiligen Core-Gene vollständig abgedeckt. Nur für diese Gene werden eventuelle Lücken mittels Sanger-Sequenzierung geschlossen, Lücken in Nicht- Core-Genen bleiben bestehen. Es handelt sich hierbei um Tests die dafür bestimmt sind Verdachtsdiagnosen zu bestätigen, nicht jedoch um Diagnosen ausschließen zu können. Typ C Test Typ C Tests verwenden ausschließlich NGS-Sequenzierdaten, eventuelle Lücken werden nicht mit Sanger- Sequenzierung geschlossen. Ein Beispiel hierfür wäre die Whole-Exome Sequenzierung bei Entwicklungsverzögerungen, bei der hunderte von potenziell ursächlichen Genen bekannt sind. Aufgrund der Heterogenität dieser Erkrankungsgruppe ist es kaum möglich Core-Gene zu definieren. Die Einteilung in Typ A, B und C Tests bezieht sich ausschließlich auf Sequenziertechnologien. Je nach Erkrankung und Indikationsgruppe kann es nötig sein einzelne oder mehrere Gene zusätzlich auf Mutationen, die mit Sequenziertechnologien nicht erkannt werden können, zu untersuchen. Hier müssen andere Analyseverfahren wie MLPA oder Blotting-Analysen eingesetzt werden. Zusatzbefunde Der Umgang mit Zusatzbefunden, das heißt die Identifikation von pathogenen Varianten einer nicht-angeforderten Indikation, muss klar geregelt sein. Diese Art von Zusatzbefunden tritt am häufigsten bei genomweiten Untersuchungen wie WES oder WGS auf, ist allerdings auch bei MGPS nicht vollständig ausgeschlossen. Der Umgang mit diesen Daten wird derzeit kontrovers diskutiert und reicht bis zu Empfehlungen des American College of Human Genetics, 56 Gene z.b. für Tumordispositions-Syndrome bei jedem Patienten aktiv zu begutachten (Berg et al., 2013; Christenhusz et al., 2013; McGuire et al., 2013; van El et al., 2013; ACMG, Green et al., 2013). Einigkeit besteht darüber, dass eine aktive und gründliche Aufklärung der Patienten erfolgen muss, und diese eine Wahlmöglichkeit besitzen müssen ob Zusatzbefunde mitgeteilt werden sollen oder nicht. 14

15 Aufklärung und Genetische Beratung bei NGS (MGPS, CES, WES, WGS) Die Analyse zahlreicher oder aller Gene in einem Ansatz erfordert eine besondere bzw. erweiterte Aufklärung des Patienten im Vorfeld. Bei CES, WES und v.a. WGS ist eine umfassende Aufklärung, wie sie das GenDG vorsieht und die möglichst alle Eventualitäten einer Untersuchung erfasst, nicht mehr möglich. Umso wichtiger ist es, die im Folgenden genannten Punkte anzusprechen und eine genetische Beratung durchzuführen. Es muss auf die Möglichkeit von Zufalls- oder Zusatzbefunden aufmerksam gemacht werden und auf die Möglichkeit unklarer Befunde. Beispiel: MGPS bei der Fragestellung arrhythmogene Herzerkrankung. Es wird eine pathogene Mutation in einem Ionenkanalgen gefunden, die auch bereits im Zusammenhang mit Epilepsie beschrieben wurde. Das Resultat kann für die Beurteilung der Symptomatik (Synkope oder Krampfanfall?), Diagnostik und Therapie des Patienten von Bedeutung sein. Es muss im Vorfeld besprochen werden, welcher Art solche Zusatzbefunde sein können, ob bestimmte Gene (z.b. für erbliche Tumordispositionssyndrome bei CES/WES) nicht untersucht werden (sollen), welche Zusatzbefunde mitgeteilt werden können oder sollen (s.a. Stellungnahme der GfH zu Zusatzbefunden, Newsletter/Archiv/gfh_newsletter_2013_01.htm). Unklare Befunde: bei der Analyse einer Vielzahl von Genen nimmt die Wahrscheinlichkeit, eine Vielzahl von Varianten nachzuweisen, zu. Darunter werden auch solche sein, die mit dem derzeitigen Kenntnisstand nicht eindeutig als krankheitsverursachend oder als nicht relevanter Polymorphismus einzuordnen sind. Der Patient sollte also darauf aufmerksam gemacht werden, dass die erweiterte Diagnostik nicht unbedingt gleichbedeutend mit einer sicheren Diagnose ist. CES und WES sollten außerdem im Rahmen einer genetischen Beratung und in enger Kooperation mit den betreuenden Ärzten erfolgen, um wichtige klinische Daten zu erfassen, den Untersuchungsmodus (z.b. Trioanalyse mit Erfassung von Varianten in Proben der Eltern, Erfassung des wahrscheinlichsten Vererbungsmodus) festzulegen und eine erweiterte Aufklärung (s.o.) vorzunehmen. Humangenetik 15

16 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) bei Seltenen Erkrankungen Aortenerkrankungen/Bindegewebserkrankungen Dr. rer. nat. Karin Mayer EDS COL3A1 FLNA Marfan-ähnlich ADAMTSL4 MED12 SKI UPF3B ZDHHC9 Marfan FBN1 TAAD syndromal dominant TAAD syndromal rezessiv LDS EFEMP2 FBLN5 SLC2A10 SMAD3 TGFBR1 TGFB2 TGFBR2 TGFB3 TAAD nicht syndromal ACTA2 GATA5 MAT2A MFAP5 MYH11 MYLK PRKG1 bikuspide Aortenklappe NOTCH1 SMAD6 Intrazerebralee Blutungen COL4A1 COL4A2 Schematische Darstellung der phänotypischen und genetischen Heterogenität bei Aortenerkrankungen. Die einzelnen Subpanels sind farblich voneinander abgegrenzt, Core Genes sind fett gedruckt. Master-Panel Aortenerkrankungen (22 krankheitsassoziierte Gene): ACTA2, COL3A1, COL4A1, COL4A2, EFEMP2, FBLN5, FBN1, FLNA, GATA5, MAT2A, MFAP5, MYH11, MYLK, NOTCH1, PRKG1, SLC2A10, SMAD3, SMAD6, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2 Marfan-Syndrom und Marfan-ähnliche Erkrankungen (Sub-Panel, 6 krankheitsassoziierte Gene) Dr. rer. nat. Karin Mayer Die häufigste Bindegewebserkrankung ist das klassische Marfan-Syndrom (MFS), das durch Mutationen in Fibrillin-1 bedingt ist. Bei den klinischen Symptomen stehen die Beteiligung von Herz- und Gefäßsystem, Skelett und die Augen (Linsenluxation) im Vordergrund. Anhand der revidierten Ghenter Nosologie von 2010 kann bei Vorliegen einer isolierten Aortenwurzeldilatation bzw. -dissektion oder einer isolierten Linsenluxation mit dem Nachweis einer Mutation im FBN1-Gen die Diagnose MFS gesichert werden, wenn diese im Zusammenhang mit einer Aortenwurzelerweiterung beschrieben ist. Dagegen führt eine Linsenluxation mit dem Nachweis einer heterozygoten FBN1-Mutation, die nicht mit Aortenwurzeldilatation assoziiert ist, zur Diagnose eines Ektopia Lentis-Syndroms (ECTOL1), während Mutationen im ADAMTS4-Gen die Ursache der rezessiv vererbten isolierten Linsenluxation (ECTOL2) sind. Differenzialdiagnostisch zum klassischen MFS ist aufgrund der phänotypischen Überlappungen der kraniofazialen, kardiovaskulären, Skelett- und Hautmanifestationen das Shprintzen-Goldberg-Syndrom (SGS) zu nennen, wobei mentale Retardierung und Hypotonie der Skelettmuskulatur zusätzlich vorkommen. SGS ist hauptsächlich durch Mutationen im SKI-Gen bedingt. Lujan-Fryns-Syndrom, das auch als X-chromosomale geistige Retardierung 16

17 (XLMR) mit marfanoidem Habitus bezeichnet wird, weist mit marfanoidem Habitus, kraniofazialen Merkmalen, generalisierter Muskelhypotonie und Verhaltensproblemen sowohl Überlappungen mit MFS als auch mit SGS auf. Die Vererbung ist X-chromosomal-rezessiv mit Mutationen in den Genen MED12, UPF3B und ZDHHC9. Literatur Loeys et al, J Med Genet 47:476 (2010)/Ahram et al, Am J Hum Genet 84:274 (2009)/Doyle et al, Nature Genet 44:1249 (2012)/Schwartz et al, J Med Genet 44: 472 (2007). Sub-Panel MFS, MFS-ähnliche Erkrankungen (Sub-Panel, 6 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Marfan-Syndrom (MFS) Q87.4 AD FBN1*,** Ektopia lentis, familiär, isoliert (ECTOL1) Q12.1 AD FBN1*,** Ektopia lentis, isoliert (ECTOL2) Q12.1 AR ADAMTSL4* Shprintzen-Goldberg-Syndrom (SGS) Q87.8 AR SKI Lujan-Fryns-Syndrom Q87.8 XR MED XLMR mit marfanoidem Habitus Q87.8 XR UPF3B XLMR mit marfanoidem Habitus Q87.8 XR ZDHHC * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Core Genes sind fett gedruckt ** Deletions-/Duplikationsanalyse durch MLPA Humangenetik Thorakale Aortenerkrankungen Thorakale Aortenaneurysmen und Dissektionen (TAAD) können in Verbindung mit einem genetisch bedingten Syndrom oder isoliert vorkommen. Etwa 10-20% sind autosomal-dominant vererbt. Zu den syndromalen Bindegewebserkrankungen mit einem hohen Risiko der Aortenbeteiligung zählen Marfan-Syndrom (MFS), Loeys-Dietz-Syndrom Typ 1 bis 5 (LDS1-5), sowie das vaskuläre Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS Typ IV) und EDS mit periventrikulärer Heterotopie (PVNH4). Für isolierte familiäre TAAD wurden in Kopplungsanalysen bisher neun Genorte lokalisiert und sieben Gene identifiziert: AAT3 auf Chromosom 3p24-25 (TGFBR2- Gen), AAT4 auf Chromosom 16p13.13-p13.12 (MYH11-Gen), AAT5 auf Chromosom 9q33-q34 (TGFBR1- Gen), AAT6 auf Chromosom 10q22-24 (ACTA2-Gen), AAT7 auf Chromosom 3q21 (MYLK-Gen), AAT8 auf Chromosom 10q11.2-q21.1 (PRKG1-Gen) und AAT9 auf Chromosom 12p13.31 (MFAP5-Gen). Für AAT1 auf Chromosom 11q23-24 und AAT2 auf Chromosom 5q13-14 wurde bisher kein Gen identifiziert. Weitere Gene mit Mutationen bei TAAD sind MAT2A und GATA5, sowie NOTCH1 und SMAD6, als Ursachen für eine bikuspide Aortenklappe darstellt. Seltene rezessive Syndrome mit Risiko für TAAD sind das Arterial Tortuosity Syndrom (ATS) und die Cutis laxa Typ 1, während Mutationen in den Genen für die α1- und α2-kette des Typ IV-Kollagens zu intrazerebralen Blutungen führen. Literatur Arslan-Kirchner et al, Eur J Hum Genet, in press/pyeritz et al, Curr Opin Cardiol 29:97 (2014)/Paterick et al, Am J Med 126:670 (2013)/Pyeritz et al, Genet Med 16:641 (2014)/Milewicz et al, in: GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; [Updated 2012 Jan 12]. 17

18 Thorakale Aortenerkrankungen dominant, syndromal (Sub-Panel, 8 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Marfan-Syndrom (MFS) Q87.4 AD FBN1*,** EDS vaskulärer Typ (EDS Typ IV) Q79.6 AD COL3A1*,** EDS mit periventrikulärer Heterotopie (PVNH4) Q79.6 AD FLNA Loeys-Dietz-Syndrom Typ 1 (LDS1) Q87.4 AD TGFBR1*,** Loeys-Dietz-Syndrom Typ 2 (LDS2) Q87.4 AD TGFBR2*,** Loeys-Dietz-Syndrom Typ 3 (LDS3); Aneurysmen Q87.4 AD SMAD3* Osteoarthritis Syndrom (AOS) Loeys-Dietz-Syndrom Typ 4 (LDS4) Q87.4 AD TGFB2* Loeys-Dietz-Syndrom Typ 5 (LDS5) Q87.4 AD TGFB * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Core Genes sind fett gedruckt ** Deletions-/Duplikationsanalyse durch MLPA Thorakale Aortenerkrankungen rezessiv, syndromal (Sub-Panel, 3 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Arterial Tortuosity Syndrom (ATS) I73.8 AR SLC2A10* Cutis laxa, Typ 1B (ARCL1B) Q82.8 AR EFEMP2* Cutis laxa, Typ 1A (ARCL1A) Q82.8 AR FBLN * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Thorakale Aortenerkrankungen familiär, nicht-syndromal (Sub-Panel, 9 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Aortenaneurysma thorakal, familiär, 3 (AAT3) I71.1; I71.2 AD TGFBR2*,** Aortenaneurysma thorakal, familiär, 4 (AAT4) I71.1; I71.2 AD MYH11* Aortenaneurysma thorakal, familiär, 5 (AAT5) I71.1; I71.2 AD TGFBR1*,** Aortenaneurysma thorakal, familiär, 6 (AAT6) I71.1; I71.2 AD ACTA2* Aortenaneurysma thorakal, familiär, 7 (AAT7) I71.1; I71.2 AD MYLK* Aortenaneurysma thorakal, familiär, 8 (AAT8) I71.1; I71.2 AD PRKG1* Aortenaneurysma thorakal, familiär, 9 (AAT9) I71.1; I71.2 AD MFAP Aortenaneurysma thorakal, familiär (AAT) - I71.1; I71.2 AD MAT2A Aortenaneurysma thorakal, familiär (AAT) - I71.1; I71.2 AD GATA * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Core Genes sind fett gedruckt ** Deletions-/Duplikationsanalyse durch MLPA Bikuspide Aortenklappe mit Risiko für Aortenstenose/-dilatation (Sub-Panel, 2 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Bikuspide Aortenklappe 1 (AOVD1) Q23.1 AD NOTCH1* Bikuspide Aortenklappe 2 (AOVD2) Q23.1 AD SMAD * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Core Genes sind fett gedruckt 18

19 Kollagen 4-assozierte intrazerebrale Blutungen (Sub-Panel, 2 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen Zerebrale Mikroangiopathie mit Hämorrhagie, I67.3 AD COL4A1* vermehrte Schlängelung der Netzhautarterien; Porenzephalie 1 Zerebrale Hämorrhagie; Porenzephalie Q04.6 AD COL4A * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS) Subtypen, allelische Erkrankungen und Differenzialdiagnosen (Sub-Panel, 27 krankheitsassoziierte Gene) Dr. rer. nat. Karin Mayer Unter Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS) wird eine klinisch und genetisch heterogene Gruppe von seltenen Erkrankungen des Bindegewebes zusammengefasst, die durch Hyperelastizität der Haut, Gewebebrüchigkeit, Überstreckbarkeit der Gelenke und eine unterschiedliche Beteiligung von Skelett-, Kardiovaskular-, und Gastrointestinalsystem sowie Lunge und Augen charakterisiert sind. Auf der Grundlage von klinischen, biochemischen und molekulargenetischen Daten sowie dem Vererbungsmodus (autosomal-dominant, -rezessiv oder X-chromosomal) kann EDS in 13 Subtypen differenziert werden. Nach der vereinfachten Villefranche-Klassifikation werden diese in 6 Haupttypen unterteilt, wobei hier Mutationen in Genen für fibrilläre Kollagene oder Enzyme des Kollagenstoffwechsels vorliegen. Während der letzten Jahre wurden zusehends neue EDS-Varianten molekulargenetisch und biochemisch identifiziert und charakterisiert, was zu einem erweiterten Verständnis der Pathogenese bei EDS geführt hat, die über den Aufbau und den Stoffwechsel von Kollagenen und der extrazellulären Matrix hinausgeht. Da die klinische Abgrenzung der einzelnen EDS-Subtypen oft schwierig ist und Überlappungen mit anderen Bindegewebserkrankungen bestehen können, kann eine genetische Diagnostik unter Einsatz von NGS die Einordnung erleichtern. Humangenetik Literatur Van Damme et al, Expert Opin Orphan Drugs [Early online] (2015)/Malfait and de Paepe, Adv Exp Med Biol 802:129 (2014)/Mayer in els 2012, John Wiley & Sons Ltd: Chichester (November 2012) [DOI: / a ] (2012)/de Paepe and Malfait, Clin Genet 82:1 (2012)/Beighton et al, Am J Med Genet 77:31 (1998) Schematische Darstellung der phänotypischen und genetischen Heterogenität bei EDS. Die einzelnen Subpanels sind farblich voneinander abgegrenzt, Core Genes sind fett gedruckt. 19

20 Master-Panel EDS (27 krankheitsassoziierte Gene): ADAMTS2, B3GALT6, B4GALT7, CHST14, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, DSE, EFEMP2, ELN, FBLN5, FKBP14, FLNA, LTBP4, PHYKPL, PLOD1, PLOD3, PRDM5, SLC2A10, SLC39A13, TNXB, ZNF469 EDS, dominante Formen (Sub-Panel, 10 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen EDS, Arthrochalasis Typ (EDS Typ VIIA) Q79.6 AD COL1A1*,** EDS, Arthrochalasis Typ (EDS Typ VIIB) Q79.6 AR COL1A2*,** EDS, hypermobiler Typ (EDS Typ III) Q79.6 AD TNXB*,** EDS, klassischer Typ (EDS Typ I) Q79.6 AD COL1A1*,** EDS, klassischer Typ (EDS Typ I) Q79.6 AD COL5A1*,** EDS, klassischer Typ (EDS Typ I) Q79.6 AD COL5A2* EDS, klassischer Typ (EDS Typ II) Q79.6 AD COL5A1*,** EDS, klassischer Typ (EDS Typ II) Q79.6 AD COL5A2* EDS, Variante mit periventrikulärer Heterotopie Q79.6 AD FLNA (PVNH4) EDS, vaskulärer Typ (EDS Typ IV) Q79.6 AD COL3A1*,** * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar Core Genes sind fett gedruckt ** Deletions-/Duplikationsanalyse durch MLPA EDS, rezessive Formen (Sub-Panel, 11 krankheitsassoziierte Gene) Erkrankung OMIM-P ICD-10 Vererbung Gen OMIM-Gen EDS mit Kyphoskoliose, Myopathie, und Hörverlust Q79.6 AR FKBP14* (EDSKMH); FKBP14-defizienter EDS Typ; (EDS Typ VID) EDS mit Tenascin-X-Defizienz (EDS mit TNXB-Defizienz) Q79.6 AR TNXB*,** EDS, Dermatosparaxis Typ (EDS Typ VIIC) Q79.6 AR ADAMTS2* EDS, kyphoskoliotischer Typ (EDS Typ VIA) Q79.6 AR PLOD1*,** EDS, muskulokontraktureller Typ 1 (EDSMC1); Q79.6 AR CHST14* D4ST1-defizienter EDS Typ (EDS Typ VIB); Daumen-adduzierte Arthrogrypose, Typ Dundar (ATCS) EDS, muskulokontraktureller Typ 2 (EDSMC2) Q79.6 AR DSE EDS, Progeroide Form Typ 1 (EDSP1); EDS mit Q79.6 AR B3GALT6* XGPT Defizienz EDS, Progeroide Form Typ 2 (EDSP2); EDS mit Q79.6 AR B4GALT7* XGPT Defizienz EDS, Spondylocheirodysplastische Form (SCD Q79.6 AR SLC39A EDS); (EDS Typ VIC) Ehlers-Danlos-Syndrom mit Herzklappenbeteiligung Q79.6 AR COL1A2*,** (EDS mit COL1A2 Defizienz) Spondyloepimetaphysäre Dysplasie mit Überstreckbarkeit Q77.7 AR B3GALT6* der Gelenke (SEMDJL1) * auch einzeln als Sanger-Sequenzierung (Regelleistung) anforderbar ** Deletions-/Duplikationsanalyse durch MLPA 20