Praktikum Pflanzenphysiologie I. Teil C. Untersuchungen zur Physiologie heterotropher Plastiden

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1 Praktikum Pflanzenphysiologie I Teil C Untersuchungen zur Physiologie heterotropher Plastiden

2 2 Inhaltsverzeichnis: Seite Untersuchungen zur Physiologie heterotropher Plastiden Isolierung von Amyloplasten aus Blumenkohlinfloreszenzen Ansätze zur Synthese plastidärer Stärke... 7 Einleitung Plastiden kommen in allen lebenden Zellen der höheren Pflanze vor. Plastiden sind außerordentlich vielfältig im Hinblick auf ihre Struktur und Funktion im Stoffwechsel. Die Fixierung von Kohlendioxid, die Synthese von Stärke und Fettsäuren sowie die Erzeugung von Pigmenten und Aminosäuren sind typische Funktionen von Plastiden. Alle Plastiden sind von einer Doppelmembran umgeben, wobei die innere Membran Transportproteine besitzt und somit für die meisten Substanzen die eigentliche Permeabilitätsbarriere darstellt. Aufgrund ihrer Struktur und Farbe lassen sich Plastiden in unterschiedliche Gruppen klassifizieren: -Proplastiden oder Eoplasten findet man in meristematischen Geweben, sie sind Vorläufer der weiter differenzierten Plastiden, -Chloroplasten sind die Orte der Phostosynthese und finden sich außer in Blättern auch in unreifen Früchten, Speicher-Kotyledonen und Embryos, -Chromoplasten enthalten größere Mengen an Carotinoiden und sind für die Farbgebung von Blütenblättern und Früchten verantwortlich, -Etioplasten entwickeln sich in Blättern die in Dunkelheit gehalten werden und enthalten grosse Mengen an Protochlorophyll in Form kristalliner Prolamellarkörper. Nach Belichtung kann dieses schnell in Chlorophyll umgesetzt werden und -Leukoplasten werden vollständig differenzierte aber farblose Plastiden genannt,. Zu ihnen zählen Elaioplasten und Amyloplasten. Alle Plastidentypen sind ineinander umwandelbar. Dies ist eine Folge der Tatsache, dass Plastiden nicht de novo gebildet werden, sondern sich durch Teilung vermehren. Die Stärkebiosynthese ist ein Stoffwechselweg der exklusiv in Plastiden lokalisiert ist. Die zuvor genannten Amyloplasten sind auf Stärekebiosynthese und Speicherung spezialisierte Plastiden und in Speichergeweben von großer Bedeutung. Ihnen fehlt die Kapazität Photosynthese zu betreiben. Stattdessen importieren sie Zucker aus dem Zytosol, was ihre Bezeichnung als heterotrophe Plastiden erklärt. Figur 1 erläutert den Zusammenhang zwischen photosynthetischer CO 2 -Fixierung im source -Gewebe und der Kohlenhydratversorgung der entsprechenden sink Gewebe.

3 3 Ziel des Praktikums ist zu untersuchen welche Zucker in die Amyloplasten importiert werden und damit der Stärkebiosynthese dienen. Weiterhin wird analysiert welche Cosubstrate/Effektoren die Rate der Stärkebiosynthese in diesen Organellen beeinflussen. Figur1: Kohlenhydratverteilung von Source- zu Sink- Geweben. Kreise symbolisieren Transportproteine TP: Triosephosphat

4 4 Ein Schlüsselenzym der Stärkebiosynthese ist die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase). Das Enzym katalysiert die Umsetzung von Glucose-1-Phosphat (G1P) zu ADP-Glucose (ADP-Glc) unter Verbrauch von ATP (siehe Figur 2). Strukturell ist das Enzym als Heterotetramer aus zwei kleinen und zwei großen Untereinheiten aufgebaut. Sowohl die Substratbindung als auch die wesentlichen Effektorbindestellen sind auf den kleinen Untereinheiten lokalisiert. Eine wesentliche Funktion der großen Untereinheiten liegt in der Stabilisierung des Gesamtklomplexes. Glc-1-P 3-PGA + P i - ATP PP i ADP-Glc Figur 2: vereinfachtes Funktionsschema der AGPase-katalysierten Stoffwechselreaktion. Kursiv: Effektoren; 3- PGA = 3-Phosphoglycerinsäure; P i = anorganisches Phosphat, PP i = Pyrophosphat Der Nukleotidzucker ADP-Glc ist Substrat von verschiedenen Stärke-Synthase Isoformen und wird zur Verlängerung der vorhandenen Stärkepolymere unter Abspaltung von ADP verwendet. Der geringere Wissensstand über die Physiologie von heterotrophen Plastiden, im Gegensatz zu der von Chloroplasten, ist unter anderem darauf zurückzuführen, daß diese Plastiden relativ schlecht in intakter Form anzureichern sind. Im Rahmen dieses Praktikums soll eine Methode angewendet werden, die zur Reinigung einer Reihe heterotropher Plastiden erfolgreich Anwendung findet.

5 5 1. Isolierung von Amyloplasten aus Blumenkohlinfloreszenzen Isolierung von Blumenkohl-Plastiden: Folgende Medien werden für eine Aufarbeitung benötigt: Medium A: Medium B: Medium C: 3 Liter 0,3 M Mannitol 20,0 mm Na-Pyrophosphat, mit H 3 PO 4 auf ph 7,6 einstellen 4,0 mm Cystein 1,0 mm EDTA 0,1 % (w/v) BSA, zuvor mit Aceton entfetten (Entfettung entfernt Fettsäuren, Fettsäure wirkt entkoppelnd) 1 Liter 0,3 M Saccharose 10,0 mm K 2 HPO 4, mit H 3 PO 4 auf ph 7,2 einstellen 1,0 mm EDTA 0,1 % (w/v) BSA, entfettet 250 ml 0,3 M Sorbitol 15,0 mm Hepes-KOH, ph 7,2 1,0 mm EDTA 2,0 mm MgCl 2 Frage: Welche Funktion haben die einzelnen Bestandteile der Puffermedien? Die Spitzen (obere 5-7 mm) vom frischen Blumenkohl-Blütenstand werden abgeschnitten und in einem 5-Liter-Becherglas auf Eis gesammelt. Ca. 1-1,5 kg werden für eine Aufarbeitung verwendet, was in etwa 6 Blumenkohlköpfen entspricht. Das Material wird geteilt, in einem Mixer 3 mal 7 sec lang homogenisiert und anschließend durch 6 Lagen Mull und 1 Lage Miracloth filtriert. Das Filtrat wird in einem eisgekühlten Becherglas gesammelt. Anschließend erfolgt eine erste Zentrifugation zur Entfernung von Stärke und Zelltrümmern (10 min, 1100 rpm, Sorvall GS3-Rotor). Der Überstand wird zur Gewinnung des ersten Sediments 20 min lang bei 4300 rpm erneut zentrifugiert. Die erhaltenen Sedimente werden in ca. 100 ml Medium B resuspendiert und auf 3-4 Zentrifugenröhrchen (Sorvall SS34) verteilt. Zur Entfernung von Stärke, die aus aufgebrochenen Plastiden stammt, wird diese Suspension erneut niedertourig zentrifugiert (5 min, 1300 rpm, SS34- Rotor). Der Überstand wird bei 5400 rpm 10 min lang zentrifugiert und das erhaltene Sediment in ca. 6 ml Medium B aufgenommen. Frage: Warum erfolgen alle Schritte unter gekühlten Bedingungen?

6 6 Isopyknische Zentrifugation: Diese Suspension wird auf 3-4 Percoll-Gradienten verteilt. Hierzu werden ausreichend Ultra- Zentrifugationsröhrchen mit einer 35%igen Percoll-Medium B-Suspension gefüllt und mit jeweils 3-4 ml der Plastidensuspension überschichtet (Plastik-Pasteurpipette verwenden). Anschließend erfolgt die "Isopyknische" Zentrifugation bei rpm im T1065 Rotor in der Ultrazentrifuge (25 min). Die noch kontaminierte Plastidenfraktion sammelt sich in der unteren Phase des Gradienten und kann mit einer Pasteurpipette vorsichtig entnommen werden. Die gewonnene Suspension wird 1:5 verdünnt (mit Medium B) und im SS34-Rotor 10 min lang bei 5400 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 3-4 ml Lösung B aufgenommen und auf ein Polypropylen-Ultrazentrifugations-Röhrchen, das eine 35%ige Percoll/Medium B-Lösung enthält, vorsichtig aufgetragen. Die nachfolgende Raten-zonale Zentrifugation erfolgt 15 min lang bei rpm in der Ultrazentrifuge (Sorvall AH 629-Rotor, Swing out). Erneut sammeln sich die Plastiden am Boden des Röhrchens und werden vorsichtig mit der Pasteurpipette entnommen. Die erhaltene Lösung wird durch Zugabe vom Medium C ca. 1:8-10 verdünnt und anschließend durch Zentrifugation (Sorvall, SS34-Rotor, 16 ml Einsätze verwenden, 10 min, 5400 rpm) von überschüssigem Percoll befreit. Der erhaltene Niederschlag wird in 1 ml Medium C aufgenommen; ein aliquoter Anteil dient zur Proteinbestimmung und wird entnommen. Frage: Was ist der Unterschied zwischen einer isopyknischen und einer Raten-zonalen Zentrifugation?

7 7 2. Ansätze zur Synthese plastidärer Stärke unter Verwendung radioaktiver Stoffe: Die isolierten Plastiden können nun zur Analyse der Stärkebiosynthese verwendet werden. Dazu werden die Plastiden in einem Medium inkubiert, welches alle notwendigen Komponenten für die Stärkebiosynthese enthält. Die Kohlenhydratvorstufen werden als radioaktiv markierte Substanz zugegeben um die Menge an neusynthetisierter Stärke quantifizieren zu können. Nach einer festgelegten Inkubationszeit wird die Reaktion durch Hitzeeinwirkung abgestoppt und nicht eingebaute Radioaktivität durch mehrere Waschschritte entfernt. Da die Menge inkorporierter radioaktiver Glukosemoleküle in der unlöslichen Stärke nicht quantifiziert werden kann, werden die Stärkekörner zunächst physikalisch aufgebrochen und anschließend enzymatisch weiter bis zur Glukose abgebaut. In einem Szintillationszähler kann die Radioaktivität der einzelnen Proben nun quantifiziert werden. Gemäß nachfolgendem Schema werden die Versuche durchgeführt: Versuchsansätze zur Stärkesynthese unter Verwendung radioaktiver Vorstufen ermittelter Proteingehalt der isolierten Plastiden: 500µl Versuchsansatz werden auf 3 x 150 µl aufgeteilt aufgeteilt Puffermedium mit Vorstufe (kalt) u.effektoren + 14 C-markierter Vorstufe Reaktionsstart durch Zugabe von 150µl Plastidensuspension Plastidensuspension einstellen auf 1mg Protein/ml mit Medium C 50µl des Originalansatzes werden zur Bestimmung der spezifischen Aktivität zurückgehalten Inkubation bei Raumtemperatur, danach Abstoppen der Reaktionen bei 95 C und nach Anleitung fortfahren

8 8 Grundsätzlich wird jeder Messpunkt aus drei unabhängigen Proben errechnet (Triplikate). Jeder Ansatz wird unter Verwendung von 150 µg Plastidenenzym durchgeführt. Die Inkubation der isolierten Amyloplasten erfolgt - wenn nicht anders besprochen - 30 min lang in Medium C, dem spezifische radioaktiv markierte Vorstufen und Effektoren zugesetzt sind. Ansatz ATP UTP PGA Glc6P Glc1P Glc 1 2 mm - 1 mm *1 mm mm *1 mm mm 1 mm *1 mm mm - - *1 mm mm - 1 mm - *1 mm mm - 1 mm - - *1 mm 7 2 mm 1 mm *1 mm 1 mm 8 2 mm 1 mm 1 mm *1 mm Tabelle 1: Übersicht über die verschiedenen Versuchsansätze zur Stärkesynthese. Ansatz 1 wird mehrfach hergestellt und für die Bestimmung der Zeitabhängigkeit der Stärkesynthese eingesetzt, Inkubationszeiten: 0, 10, 20, 30, 60 min. Weiterhin werden Ansätze mit lysierten bzw. hitzedenaturierten (95 C) Plastiden vorbereitet. Alle Ansätze enthalten Vorstufen und Effektoren in doppelter Konzentration! *radioaktiv markierte Vorstufe Gruppe 1: Ansätze 1-6, lysierte und hitzedenaturierte Plastiden Gruppe 2: Ansätze 1, 7, 8, Zeitabhängigkeit der Stärkesynthese Gruppe 3: Ansätze Substratabhängig der Stärkesynthese (0,1 mm, 0,25mM, 0,5 mm, 1mM, 2mM Glc6P) Herstellung der Ansätze: 150 µl der Plastidenlösung (= 150 µg Protein) werden zu 150 µl Medium C gegeben, das Effektoren und Vorstufen in doppelter Konzentration enthält. Da jeder Messpunkt aus drei Proben besteht (3 x 150 µl), werden 500 µl Effektor- und Vorstufen-enthaltendes Medium C angesetzt. In diese 500 µl werden 2-4 µl radioaktive Vorstufe, wie etwa [ 14 C]Glc6P oder [ 14 C]Glc1P gegeben. Von dieser Lösung wird anschließend auf jeweils 150 µl in 3 Eppendorf-Gefäße vorgelegt. Die verbleibenden 50 µl dienen später der Ermittlung der spezifischen Radioaktivität (dpm/nmol Vorstufe). Aus diesem Pipettierschema wird deutlich, dass Effektoren und Vorstufen zunächst in doppelter Konzentration in das Medium C gegeben werden, da sie durch die Zugabe von 150 µl Plastiden zu 150 µl Medium C (incl. Vorstufe und Effektoren) 1:1 verdünnt werden.

9 9 Die Inkubation wird durch die Zugabe der Plastiden gestartet (Stoppuhr benutzen) und durch das Überführen des Eppendorfgefäßes in den 95 C Thermoblock beendet. Anschließend wird in der Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl 2 min lang sedimentiert und der Überstand (nicht eingebaute Radioaktivität) in den wässrigen 14 C-Abfall gegeben. Das Sediment wird mit 1 ml H 2 O bidest. aufgenommen, gemischt (Vortex) und erneut 2 min sedimentiert. Es erfolgt ein weiterer Waschschritt mit H 2 O, gefolgt von einem Waschschritt mit 90%-igen EtOH. Das schließlich erhaltene Sediment wird mit 200 µl 0,1 M Na-Acetat (ph 4,7) aufgenommen und im Tischautoklaven 1-1,5 h lang autoklaviert (Stärke wird solubilisiert). Nach Abkühlen der Proben werden jeder Probe Amyloglucosidase und -Amylase (je 5 Units) in 100 µl Acetatpuffer zugegeben und bei 37 C mindestens 1 h lang inkubiert. Danach werden die nichtgelösten Bestandteile in der Tischzentrifuge sedimentiert. Die Radioaktivität im Überstand wird durch Zugabe von 4 ml Szintillationscocktail im Szintillationszähler quantifiziert. Zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivität werden 2 x 5 µl aus der doppelt konzentrierten Suspension gezählt. Frage: Was versteht man unter der spezifischen Aktivität einer radioaktiven Lösung?

10 10 Beispiel zur Berechnung der Inkorporation von 14 C-Hexose(P) in Stärke: Die Zählergebnisse des Szintillationszählers werden in dpm (disintegrations (Zerfälle) per minute) angegeben. Diese Werte errechnen sich aus den ebenfalls angegebenen cpm (counts per minute). a) spezifische Aktivität einer 4 mm Glc-6-P-Lösung; 5 µl gezählt: Standard: 4000 dpm 6000 dpm Mittelwert: 5000 dpm/5 µl Eine 4 mm Lösung enthält 4 mmol Teilchen pro Liter = 4 nmol / µl 5 µl dieser Lösung enthalten demnach 20 nmol Teilchen spezifische Aktivität = 5000 dpm 20 nmol = 250 dpm/nmol b) Zählergebnis der dazugehörigen Probe: 1800 dpm 2000 dpm Mittelwert = 2000 dpm 2200 dpm Radioaktivität in der Probe spezifische Aktivität = Menge inkorporierter Precursor 2000 dpm nmol 250 dpm = 8 nmol Eine Inkorporation von 8 nmol Glc-6-P erfolgte bei Einsatz von 150 µg Amyloplastenprotein und einer Inkubationszeit von 30 min. 8 nmol 0,15 mg Protein 0,5 h = 106,7 nmol mg Protein -1 h -1 In Ansatz x konnte eine Stärkesyntheserate von 106,7 nmol mg Protein -1 h -1 nachgewiesen werden.

11 11 Empfohlene Literatur: Neuhaus H.E., Henrichs G. & Scheibe R. (1993) Characterization of glucose-6-phosphate incorporation into starch by isolated cauliflower-bud plastids. Plant Physiol. 101: Neuhaus H.E., Wagner R. (2000) Solute pores, ion channels, and metabolite transporters in the outer and inner envelope membranes of higher plant plastids. Biochim. Biophys. Acta 1465: Bräutigam A., Weber A. (2009) Proteomic Analysis of the Proplastid Envelope Membrane Provides Novel Insights into Small Molecule and Protein Transport across Proplastid Membranes. Mol. Plant. 2: