RESOLUTION OIV-OENO MONOGRAPHIE ZU INAKTIVIERTEN HEFEN, DIE EINEN GARANTIERTEN GEHALT AN GLUTATHION AUFWEISEN

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1 RESOLUTION OIV-OENO MONOGRAPHIE ZU INAKTIVIERTEN HEFEN, DIE EINEN GARANTIERTEN GEHALT AN GLUTATHION AUFWEISEN Die Generalversammlung, GESTÜTZT auf Artikel 2 Absatz 2 iv des Übereinkommens vom 3. April 2001 zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein, GESTÜTZT auf die RESOLUTIONEN OIV-OENO Behandlung von Mosten mit inaktivierten Hefen, die einen garantierten Gehalt an Glutathion aufweisen und OIV-OENO Behandlung von Weinen mit inaktivierten Hefen, die einen garantierten Gehalt an Glutathion aufweisen, BESCHLIESST, folgende Monographie anzunehmen und in Kapitel 1 des internationalen önologischen Kodex aufzunehmen: INAKTIVIERTEN HEFEN, DIE EINEN GARANTIERTEN GEHALT AN GLUTATHION AUFWEISEN 1. GEGENSTAND, URSPRUNG UND ANWENDUNGSBEREICH Inaktivierte Trockenhefen mit einem garantierten Gehalt an Glutathion zeichnen sich dadurch aus, dass sie einen höheren Gehalt an reduziertem Glutathion aufweisen als inaktivierte Standardhefen. Sie werden zur Einschränkung von Oxidationsphänomenen in Mosten und Weinen verwendet. Neben reduziertem Glutathion (GSH) können auch Vorläufer von Glutathion wie Cystein und insbesondere Gamma- Glutamylcystein vorhanden sein. Wie auch klassische inaktivierte Hefen liefern sie den Hefen zu Beginn und während der alkoholischen Gärung ebenfalls Nährstoffe. In den Phasen des Ausbaus und der Klärung der Weine können sie zur Reduzierung des Ochratoxin-A-Gehalts beitragen 1 (Resolution OENO ). Sie werden aus Biomasse von Saccharomyces spp. und/oder Nicht-Saccharomyces-Hefen gewonnen, deren Produktion kontrolliert wird, um die natürliche Produktion von reduziertem Glutathion (GSH) zu erhöhen. Sie werden somit aus Reinkulturen und ohne jegliche Zusätze von Glutathion oder Cystein und Gamma- Glutamylcystein zum Enderzeugnis gewonnen, was durch einen Anteil von Gamma-Glutamylcystein an GSH belegt ist, der über 20 % betragen muss. Sie werden durch Wärme und/oder Veränderung des ph-werts inaktiviert. Sie können durch endogene Enzyme anfangs autolysiert werden. Es werden weder Antibiotika noch andere als für das Wachstum der Hefe notwendige Stoffe zugesetzt. Sofern die inaktivierten Hefen aus gentechnisch veränderten Hefen gewonnen werden, unterliegen diese 1 Kodex der guten weinbaulichen Praxis zur Minimierung von OTA in Weinbauerzeugnissen. Sekretär der Generalversammlung 1

2 der vorherigen Genehmigung durch die zuständigen Behörden. 2. KENNZEICHNUNG Das Etikett muss folgende Angaben enthalten: Gattungs- und Artbezeichnung der inaktivierten Hefen, die einen garantierten Gehalt an Glutathion aufweisen Mindestgehalt in mg/g inaktivierte Trockenhefe, reduziertes Glutathion, Höchstgehalt in mg/g inaktivierte Trockenhefe, Cystein Höchstgehalt in mg/g inaktivierte Trockenhefe, Gamma-Glutamylcystein Gehalt an organischem Stickstoff ggf. Zusatzstoffe Gebrauchsanweisung Chargen-Nummer, Mindesthaltbarkeitsdatum und Lagerbedingungen wie Temperatur-, Feuchtigkeits- und Belüftungsbedingungen ggf. die Angabe, dass die inaktivierten Hefen aus gentechnisch veränderten Hefen gewonnen wurden sowie die veränderte Eigenschaft 3. EIGENSCHAFTEN Die Hefen sind meist als Granulat, Pulver oder Flocken von hellgelber bis ockergelber Farbe erhältlich und haben einen charakteristischen Hefegeruch. Sie sind teilweise wasserlöslich, der unlösliche Anteil beträgt mindestens 60 % m/m der Trockensubstanz. 4. GRENZWERTE UND VERSUCHSMETHODEN 4.1 Gehalt an oxidiertem Glutathion (GSSG) Der Gehalt an Glutathion in oxidierter Form, Glutathiondisulfid (GSSG), die nach unserem Kenntnisstand die einzig nachgewiesene Form ist, wird anhand des in Anhang 1 beschriebenen HPLC-Verfahrens bestimmt Herstellung der Versuchslösung Genau 2 g inaktivierte Trockenhefe in ein 20 ml Zentrifugenröhrchen einwiegen, 1 ml Glasperlen ( Mikron) und 4 ml Phosphat-Pufferlösung (ph 7) zugeben. 20 min bei 4 C in den Vortex-Labormixer geben und dann 20 min bei mindestens g bei 4 C zentrifugieren. Der Überstand ist die Versuchslösung, die lichtgeschützt bei 4 C höchstens 4 Stunden vor der Bestimmung aufzubewahren ist. Das Verhältnis zwischen reduziertem Glutathion und oxidiertem Glutathion sollte höher als 3 : 1 sein. 2

3 4.2 Gehalt an reduziertem Glutathion (GSH), Cystein und Gamma-Glutamylcystein Die Gehalte an reduziertem Glutathion, Cystein und Gamma-Glutamylcystein werden anhand des in Anhang 4 beschriebenen HPLC-Verfahrens nach Derivatisierung bestimmt. Der Gehalt an reduziertem Glutathion muss mehr als 1 %, d.h. 10 mg/g inaktivierte Trockenhefe betragen. Der Gehalt an endogenem Cystein muss weniger als 0,3 %, d.h. 3 mg/g inaktivierte Trockenhefe betragen. Der Gehalt an Gamma-Glutamylcystein muss weniger als 1 %, d.h. 10 mg/g inaktivierte Trockenhefe betragen Stickstoffgehalt Der Gehalt an Gesamtstickstoff (ausgedrückt als elementarer N) beträgt weniger als 10 % der Trockensubstanz und wird gemäß der Analysemethode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex bestimmt, d.h. Nt Der Gehalt an Ammoniumstickstoff (ausgedrückt als elementarer N) muss weniger als 0,5 % der Trockensubstanz betragen und wird gemäß der Methode in Anhang 2 bestimmt und als Na bezeichnet Der Gehalt an organischem Stickstoff ergibt sich aus der Differenz zwischen dem Gehalt an Gesamtstickstoff und dem Gehalt an Ammoniumstickstoff: Organischer Stickstoff = Nt-Na Der Gehalt an freien und löslichen Aminosäuren und kleinen Peptiden muss weniger als 10 % der Trockensubstanz in Glycin-Äquivalent betragen und wird gemäß der DNFB-Methode in Anhang 3 bestimmt, d.h. 1,9 % der Trockensubstanz ausgedrückt als Element N Feuchtigkeit Die Feuchtigkeit wird anhand des Gewichtsverlusts von 5 g Produkt gemessen, das bei 105 C bis zur Gewichtskonstanz (ca. 3 Stunden) getrocknet wird. Der Gehalt muss weniger als 7 % betragen Blei Die Bestimmung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 2 mg/kg Trockensubstanz betragen Quecksilber Die Bestimmung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 1 mg/kg Trockensubstanz betragen Arsen Die Bestimmung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 3 mg/kg Trockensubstanz betragen. 3

4 4.8 - Cadmium Die Bestimmung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 1 mg/kg Trockensubstanz betragen Lebensfähige Hefen Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt darf höchstens 10 2 KBE/g Trockensubstanz betragen Schimmel Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 10 3 KBE/g betragen Milchsäurebakterien Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 10 3 KBE/g betragen Essigsäurebakterien Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 10 3 KBE/g betragen Salmonellen Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Nachweis des Nichtvorhandenseins von Salmonellen muss an einer Probe von 25 g Trockensubstanzerfolgen Escherichia coli Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Nachweis des Nichtvorhandenseins von Escherichia coli muss an einer Probe von 1 g Trockensubstanz erfolgen Staphylokokken Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Nachweis des Nichtvorhandenseins von Staphylokokken muss an einer Probe von 1 g Trockensubstanz erfolgen Coliforme Bakterien Die Auszählung erfolgt nach der Methode in Kapitel II des internationalen önologischen Kodex. Der Gehalt muss weniger als 10 2 KBE/g betragen. 4

5 5. ZUSATZSTOFFE Zusatzstoffe müssen den geltenden Vorschriften entsprechen. 6. LAGERUNG Nicht in offenen Verpackungen lagern. Inaktivierte Hefen, die einen garantierten Gehalt an Glutathion aufweisen, sind luftgeschützt in versiegelten Beuteln an einem kühlen und trockenen Ort aufzubewahren. In jedem Fall sind die Herstellerangaben zu beachten. Eine unangemessene Lagerung kann zu einer Abnahme des Gehalts an reduziertem Glutathion führen. 5

6 Anhang 1 Bestimmung von reduziertem und oxidiertem Glutathion mittels HPLC Die Bestimmung erfolgt nach der Methode zur Bestimmung von Glutathion in pharmazeutischen Zubereitungen gemäß Soliman et al. (2014). 1. Anwendungsgebiet Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von reduziertem Glutathion, oxidiertem Glutathion oder Glutathiondisulfid (GSSG) in einem Konzentrationsbereich von mg/l Analysepräparat. 2. Prinzip Es wird die Methode der Hochleistungsflüssigchromatographie angewendet, die auf dem Prinzip der Umkehrphasen (C18 Säule) und der Spektralphotometrie unter Verwendung eines Diodenanarray- Detektors ( nm) beruht. 3. Chemikalien und Reagenzien 3.1 Produktliste Glutathion (GSH, > 98 %), Methanol (HPLC-Qualität) Ameisensäure (Reinheit > 98 %) Ultrareines Wasser, spezifischer Widerstand >18 M.cm bei 25 C 3.2 Mobile Phase Für die mobile Phase wird ultrareines Wasser (3.1.4) verwendet, das 0,1 % des Gemischs aus Ameisensäure (3.1.3) und Methanol (3.1.2) im Verhältnis 90: 10, v/v enthält. 4. Geräte 4.1 Hochleistungsflüssigchromatograph 4.2 Diodenarray-Spektrofotometer 4.3 Datenerfassungsgerät 4.4 Säule des Typs Octadecyl, 150 mm x 2 mm, Partikeldurchmesser 3 µm (als Anhaltspunkt) 4.5 Probenschleife, 230 µl 4.6 Entgasungsanlage für Lösungsmittel (Ultraschall) 4.7 Membranfilter von 0,45 µm Porendurchmesser 5. Vorbereitung der Proben 5.1 Zur Vorbereitung der Glutathionprobe wird die Versuchslösung (Ziffer der Monographie) mit der mobilen Phase (3.2) verdünnt, um eine Endkonzentration von 20 mg/l zu erhalten. 5.2 Die Proben werden vor der Einspritzung durch eine Membran (4.7) filtriert. 6. Durchführung Die isokratische Analyse wird bei Umgebungstemperatur und mit einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Die Detektion erfolgt im Scan-Modus bei nm. Sekretär der Generalversammlung 6

7 7. Ergebnisse Unter diesen analytischen Bedingungen wird reduziertes Glutathion (GSH) von oxidiertem Glutathion (GSSG) gut getrennt. Anhand dieser Methode können somit die beiden Formen von Glutathion bestimmt werden. Unter diesen analytischen Bedingungen beträgt die Retentionszeit von Glutathion 7,5 min und von oxidiertem Glutathion 9,5 min. 8. Eigenschaften der Methode Die Konzentrationen werden anhand Mittelwerts dreier Bestimmungen sowie der Regressionsgeraden der Kalibrierkurve berechnet. Die Ergebnisse werden in mg/l angegeben. Die lineare Regression und der Korrelationskoeffizient werden nach der Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Linearität Linearitätsbereich: mg/l, Korrelationskoeffizient: R= 0,9998 Genauigkeit Die Genauigkeit der Methode wird anhand von 3 Glutathion-Lösungen (1,0, 50,0 und 100,0 mg/l) am selben Tag sowie an drei verschiedenen Tagen beurteilt. Tabelle 1: Eigenschaften der Methode zur Bestimmung von reduziertem Glutathion anhand der Wiederfindungsraten Genauigkeit an einem Tag Genauigkeit an drei Tagen Konzentration % Wiederfindung, SD VK % % Wiederfindung, SD VK % GSH mg/l 1 99,88 ± 0,68 0,68 99,76 ±1,89 1, ,04 ± 0,39 0,39 100,09 ± 0,73 0, ,93 ± 0,57 0,57 99,85 ± 0,86 0,86 Anwendungsbereich Je nach der durchzuführenden Bestimmung kann die Methode für Konzentrationen von mg/l angewendet werden. Die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze von Glutathion, die entsprechend den Leitlinien der Internationalen Harmonisierungskonferenz (ICH) (3,3 und 10 Mal die Standardabweichung des Leerwertes, 7 Analysen) für die Steigung der Kalibriergeraden festgelegt sind, betragen 20 µg/l (LD) und 68 µg/l (LQ). 9. Literatur Soliman R.M, Hadad G.M, Abdel Salam R.A., Mesbah M.K., (2014) Quantitative determination of glutathione in presence of its degradant in a phamaceutical preparation using HPLC-DAD and identification by LC-ESI-MS. J. Liquid Chromatography and related technologies 37:

8 Anhang 2 Bestimmung von Ammoniumstickstoff 1. Reagenzien 1.1 Kaliumchlorid (0,5 M KCl,) 18,64 g KCl in 500 ml demineralisiertem, reinen Wasser lösen 1.2 Natriumhydroxid (30 %) 30 g Natriumhydroxid in einen 100 ml-messkolben geben, 70 ml demineralisiertes, reines Wasser zugeben und auf 100 ml auffüllen 1.3 Borsäure (4 %) (R) siehe R Teil II des internationalen önologischen Kodex 1.4 0,1 M Salzsäure für die Titration (gebrauchsfertige Lösung) 1.5 Mischindikator aus Methylrot und Methylenblau, siehe R Teil II des internationalen önologischen Kodex 2. Geräte 2.1 Laborglasgeräte 2.2 Wasserdampfdestillationsapparatur gemäß Kapitel II des internationalen önologischen Kodex für die Bestimmung des Gesamtstickstoffs 3. Bestimmung g Trockensubstanz inaktivierter Hefen in 100 ml 0,5 M KCL (1.1) geben und min schütteln; 3.2 die 100 ml in die Wasserdampfdestillationsapparatur (2.2) geben und 50 ml Natriumhydroxid (30 %) (R); 3.3 Destillieren und 250 ml Destillat in einem Erlenmeyerkolben auffangen, der 5 ml 4 %ige Borsäure (1.3), 10 ml Wasser und 2-3 Tropfen Mischindikator aus Methylrot und Methylenblau (1.5) enthält; das Destillat mit 0,1 M Salzsäure (1.4) titrieren, bis sich der Indikator violett-rosa verfärbt. 1 ml Salzsäurelösung entspricht 1,4 mg Stickstoff (N). Wobei n die Anzahl der zugegebenen ml ist: 100 g inaktivierte Trockenhefen enthalten 0,14 n g Ammoniumstickstoff ausgedrückt als Element N, und als Na bezeichnet. Sekretär der Generalversammlung 8

9 Anhang 3 Aminostickstoff-Methode 1. Einleitung Diese Methode ermöglicht eine schnelle Bestimmung von Amino-Stickstoff in einer biologischen Lösung in Bezug auf eine Standardreihe, die mit einer Glycinlösung hergestellt wurde. 2. Geltungsbereich Önologische Erzeugnisse pflanzlichen oder tierischen Ursprungs 3. Definition Dinitrofluorbenzol (DNFB) reagiert mit den freien NH 2-Gruppen, die in den Aminosäuren enthalten sind. Es entsteht eine hellgelbe Verbindung, die durch Messung der Extinktion bei 420 nm bestimmt wird. Die Reaktion erfolgt bei einem ph-wert von > 9,3. 4. Reagenzien Reagenzien: 4.1 Borax oder Natriumtetraborat, 4.2 Dinitrofluorbenzol (Vorsicht bei der Handhabung von DNFB) M Salzsäure, 4.4 Glycin, Reinheit 98 % 4.5 Ethanol 95 % vol. 5. Geräte 5.1 Hämolyseröhrchen, 5.2 Mikropipetten, 5.3 Spektrophotometer für Messungen im sichtbaren Bereich, 5.4 Wasserbad, 60 C. 6. Probenahme 6.1 Eine 5 %ige Natriumtetraborat-Lösung in ultrareinem Wasser herstellen; 6.2 DNFB-Lösung herstellen: 130 µl DNFB in 10 ml Ethanol (95 % vol.) geben; 6.3 Herstellung einer 2 M Salzsäurelösung; 6.4 eine Standardreihe mit einer Glycin-StammLösung (2 g/l) (M=75,07 g) z.b. 0,50 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l, 500 mg/l vorbereiten; 6.5 eine Suspension mit 2 g/l des zu bestimmenden Produkts herstellen, nach 30 min zentrifugieren und den Überstand auffangen. 9

10 7. Durchführung - In ein Hämolyseröhrchen geben: μl Borax 5% (6.1) - 20 μl der zu bestimmenden Probe (6.5) - 20 μl DNFB-Lösung (6.2) - Gleichermaßen mit der Glycin-Standardreihe verfahren: 8. Ergebnisse - Schütteln und 30 Minuten ins Wasserbad (60 C) stellen (5.4), - 3 ml 2M HCL zugeben (6.3), - Schütteln und den Extinktionswert der Probe bei 420 nm ablesen (5.3), - eine Kalibriergerade mit der Glycin-Standardreihe erstellen (6.4). Den Extinktionswert der Probe bei 420 nm auf der Kalibriergeraden eintragen. Die Ergebnisse werden in g Glycin/l angegeben 10

11 Anhang 4 Bestimmung von reduziertem Glutathion, Cystein und Gamma-Glutamyl-Cystein mittels HPLC nach Derivatisierung Präambel Bei dieser Methode werden Aminosäuren und Thiolpeptide mittels HPLC-CLUP-UV nach Derivatisierung an einer Umkehrphasen-Säule bestimmt. Die Methode ist für komplexe Matrices wie Hefen und Hefederivate geeignet. 1. Anwendungsgebiet Die Methode ermöglicht die Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH), Cystein (CYS) und Gamma- Glutamyl-Cystein (GluCys) in den folgenden Konzentrationsbereichen: - von 2 bis 24 mg/l für GSH und GluCys, - von 0,5 bis 6 mg/l für Cys 2. Prinzip Die Methode beruht auf der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (C18-Säule) und dem spektrophotometrischen Nachweis bei 320 nm. 3. Chemikalien und Reagenzien 3.1 Chemikalien GSH: Glutathion, CAS-Nr (Reinheit > 98 %) Cys.HCl.H 2 O: L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat, CAS-Nr (Reinheit > 98 %) GluCys: γ-l-glutamyl-l-cystein, CAS-Nr (Reinheit > 80 %) Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2PO 4,H 2O), rein Wasserfreies Natriumacetat, rein ,4 M Essigsäure, rein Methanol (HPLC-Qualität) 11

12 3.1.8 Konzentrierte Phosphorsäure (Reinheit > 98 %) Ultrareines Wasser, spezifischer Widerstand >18.cm bei 25 C Acetonitril, rein ,2 -Dithiobis(5-nitropyridin) (DNTP), CAS-Nr (Reinheit > 96 %) Lösung aus konzentrierter Trichloressigsäure (25-30 %) 3.2 Acetat-Puffer (für die Derivatisierung) - 8,1 g Natriumacetat (3.1.5) abwiegen und in etwa 100 ml ultrareinem Wasser (3.1.9) lösen, - ph mit Essigsäure auf 6,3 (3.1.6) einstellen ( µl), - mit 1L ultrareinem Wasser (3.1.9) auf 1 L auffüllen. 3.3 Reagenz 2,2 -Dithiobis(5-Nitropyridin) (DNTP) (frisch herstellen) - 30 mg de DNTP (3.1.11) abwiegen und in 10 ml Acetonitril (3.1.10) lösen 3.4 Trichloressigsäure, 5,7 % - 19 g Trichloressigsäure, 30 % (3.1.12) in 100 ultrareinem Wasser (3.1.9) lösen 3.5 Mobile Phase - Elutionsmittel A: 3,4g NaH 2PO 4,H 2O (3.1.4) in 898 g ultrareinem Wasser (3.1.9) lösen, 79 g Methanol (3.1.7) zugeben, durch Zugabe von konzentrierter Phosphorsäure (3.1.8) (etwa 0,8 1 ml) ph von 4,45 auf 2,5 einstellen - Elutionsmittel B: Methanol (3.1.7). 4. Geräte 4.1 Hochleistungsflüssigchromatograph 4.2 Spektrophotometer, Nachweis bei 320 nm 4.3 Datenerfassungsgerät 4.4 Säule, Octadecyl, Abmessungen 250 mm 4,6 mit einer Partikelgröße von 5 µm (z.b. RP Supelcosil ABZ+Plus, Waters XTerra RP18 oder gleichwertig) 4.5 Injektorschleife 12

13 4.6 System zur Entgasung von Lösungsmitteln (Ultraschall) 4.7 Membranfilter, Porengröße 0,45 µm 4.8 Magnetrührer 4.9 Zentrifuge 4.10 ph-meter 4.11 übliche Laborglasgeräte 5. Vorbereitung der Proben 5.1 Herstellung der Standardlösungen GSH-Lösung, ~400 mg/l In einen 200 ml-kolben eine genau gewogene Menge (~ 80 mg) GSH (3.1.1) geben und mit ultrareinem Wasser (3.1.9) auf 200 ml auffüllen GluCys-Lösung, ~400 mg/l In einen 50 ml-kolben eine genau gewogene Menge (~20 mg) GluCys (3.1.3) geben und mit ultrareinem Wasser (3.1.9) auf 50 ml auffüllen Cys.HCl.H 2 O -Lösung, ~100 mg/l 5.2 Vorbereitung der Proben In einen 100 ml-kolben eine genau gewogene Menge (~130 mg) Cys. HCl.H 2 O, HCl (3.1.3) geben und mit ultrareinem Wasser auf 100 ml auffüllen, dann mit ultrareinem Wasser (3.1.9) 1:10 verdünnen. Die Probenmenge ist anzupassen, damit die Konzentration im Kalibrierbereich liegt und zwischen 2 und 24 mg/l GSH beträgt. Für inaktivierte Trockenhefe mit einem garantieren Gehalt an GSH ist zuvor eine Extraktion nach dem folgenden Protokoll durchzuführen: - ~1g inaktivierte Trockenhefe genau abwiegen, 17,5 ml Trichloressigsäure, 5,7 % (3.4) zugeben, - 20 Minuten bei Umgebungstemperatur schütteln (4.8), - mit ultrareinem Wasser (3.1.9) auf 50 ml (=V) auffüllen, - 10 Minuten bei 5500 UpM zentrifugieren (4.9). 13

14 6. Derivatisierung - Die Derivatisierung erfolgt in Reagenzgläsern anhand der Standardlösungen (5.1) wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. - Die Reagenzgläser werden durch Umschwenken geschüttelt. Die Reaktion ist nach 5 Minuten beendet. Die verschiedenen Lösungen werden nach Filtration (4.7) mittels HPLC analysiert. Doppelt Standard Standard Standard Standard Standard GSH et GSH et GSH et GSH et GSH et GluCys: GluCys: GluCys: GluCys: GluCys: Ver-such 2mg/L 4mg/L 8mg/L 16mg/L 24 mg/l Cys 0,5 Cys 1 Cys 2 Cys 4 Cys 12 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Acetatpuffer (ml) 8,85 8,7 8,4 7,8 7,2 8 Standardlösung (μl) GSH (400 mg/l) Cys (100 mg/l) GluCys (400 mg/l) Probe (μl) 1000 DNTP (μl)

15 Hinweis: Die Probemenge muss je nach Färbung angepasst werden. Es ist zu überprüfen, ob die Ergebnisse der Analyse innerhalb des Kalibrierbereichs liegen. 7. Chromatographische Bedingungen Säulentemperatur: 30 C Dauer der Analyse: 34 min Probentemperatur: 5 C Gleichgewichtseinstellung am Ende der Durchfluss mobile Phase: 1 ml/min Analyse: 10 min Einspritzvolumen: 5 μl Spülung: Wasser Druck: hpa (ca psi) Aufbewahrung: Wasser / Methanol 80:20 v/v Nachweis: 320 nm Zeit nach der Einspritzung (min) % Eluent A % Eluent B

16 OENO-SPECIF Et8 Ausführung 11/ Kalibriergeraden Die Kalibriergerade ist für jeden Analyten zu erstellen C (mg/l)= f[a], wobei folgendes zu berücksichtigen ist: - die Konzentrationen in mg/l für Cys, GSH und GluCys, - der Verdünnungsfaktor, - die erhaltenen Peakflächen. Hinweis: Für Cys HCl berücksichtigen: PE (g/l) * M Cys rein (121,16 g/mol) / M Cys HCl.H2 O,HCl (175,63g/mol) Berechnung der Konzentrationen: - bezogen auf die Trockenmasse (TM): g/100g TM = Aire= Peakfläche, pente=steigung, MS=TM - oder auf das Produkt als solches: g/100g = 9. Literatur - Rahman et al ; Nature Protocols 1, (2007) - Katrusiac et al., Pre-column derivatization high-performance liquid chromatographic method for determination of cysteine, cysteinyl glycine, homocysteine and glutathione in plasma and cell extracts. Journal of chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 758-2; (2001): Raju N.Appala et al., A Simple HPLC-UV Method for the Determination of Glutathione in PC- 12 Cells, Scientifica, Volume 2016 (2016) 16