RESOLUTION OIV-OENO gestützt auf Artikel 2, Absatz 2 iv des Übereinkommens zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein,

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1 RESOLUTION OIV-OENO BESTIMMUNG VON NATAMYCIN IN WEIN Die GENERALVERSAMMLUNG, gestützt auf Artikel 2, Absatz 2 iv des Übereinkommens zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein, auf Vorschlag der Unterkommission Analysemethoden von Most und Wein, unter Berücksichtigung dessen, dass die Aktivitäten der OIV einen Beitrag zur Lebensmittelsicherheit leisten sollen, stellt fest, dass keine offiziellen spezifischen Methoden für die Bestimmung von Natamycin in Wein vorgeschrieben sind und dass bereits verfügbare Methoden angewandt werden können, BESCHLIESST, die beiden nachfolgend angeführten Typ IV-Methoden zur Bestimmung von Natamycin in Wein zu verabschieden: 1. EINLEITUNG Es werden verschiedene Methoden für die Bestimmung von Natamycin angewendet, die hauptsächlich auf der HPLC in Verbindung mit DAD- oder MS-Detektion beruhen. Die Einschätzung der Leistungsgrenzen hier die Nachweis- und Quantifizierunsgrenze - hängt davon ab, welchen Akkreditierungssystemen die Labore unterliegen, d.h. z.b. ISO/EN 17025/2005 oder Empfehlungen der OIV (OENO 7/2000, E-AS1-10-LIMDET) bzw. andere normative Richtlinien. Da keine zuverlässigen Schätzungen der kritischen Konzentration zwischen Laboratorien vorliegen, wird eine vorläufige Eingreifgrenze von 5 µg/l akzeptiert, bis eine zuverlässige Ermittlung durch einen Ringversuch oder andere aussagekräftige Indikatoren zur Verfügung stehen. 2. METHODEN 2.1 Bestimmung von Natamycin (Pimaricin) in Wein mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie 1

2 2.1.1 ANWENDUNGSBEREICH Diese Methode beschreibt ein Analysenverfahren für die Bestimmung von Natamycin (Pimaricin) in Wein. Der Natamycin-Gehalt wird in Mikrogramm pro Liter (μg/l) Wein ausgedrückt. Eine laborinterne Validierung wurde in einem Konzentrationsbereich von μg/l durchgeführt und unter Berücksichtigung des Einflusses der Matrix Wein (z. B. Weißwein, Rotwein) validiert PRINZIP Der Natamycin-Gehalt in Wein wird durch Direkteinspritzung der Probe in ein HPLC- System, gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HR/MS) bestimmt. Die Quantifizierung erfolgt nach der Methode der Standardaddition. Zunächst wird eine erste Analyse der Probe durchgeführt. Anschließend wird die Analyse mit Kalibrierstandards wiederholt, die der Konzentration von Natamycin in der Probe entsprechen REAGENZIEN Analyten Natamycin (Pimaricin) > 95 % Chemikalien Methanol, HPLC-Fluoreszenz-Qualität (CAS-Nr ) Reinstwasser für Laborzwecke z.b. nach ISO 3696 (Wasser für analytische Zwecke Spezifikation und Versuchsmethode - [ISO 3696 :1987]) Essigsäure, 100 %, (CAS-Nr ) Lösungen Natamycin-Stammlösung (1000 μg/ml) 10 mg Natamycin ( ) bis auf 0,1 mg genau in einen 10 ml-messkolben aus Braunglas einwiegen und bis zur Marke mit Methanol : Wasser : Essigsäure ( ) auffüllen. Verschließen und im Ultraschallbad behandeln. Die tatsächliche Konzentration in Mikrogramm Natamycin pro Milliliter Lösung berechnen Arbeitslösung Eins: Natamycin (10 μg/ml) 100 μl der Stammlösung ( ) in einen 10 ml- Messkolben aus Braunglas pipettieren und bis zur Markierung mit Methanol:Wasser:Essigsäure ( ) auffüllen Arbeitslösung Zwei: Natamycin (0,5 μg/ml) 2

3 500 μl der Stammlösung ( ) in einen 10 ml-messkolben aus Braunglas pipettieren und bis zur Markierung mit Methanol : Wasser : Essigsäure ( ) auffüllen Lösung aus Methanol, Wasser und Essigsäure (50:47:3, v/v) Unter Verwendung eines Messzylinders 500 ml Methanol ( ) in einen 1-L- Messkolben abmessen. 470 ml Wasser ( ) hinzufügen und durch Schütteln mischen. 30 ml Essigsäure ( ) hinzufügen und gut schütteln Methanol, 3 % Essigsäure Unter Verwendung eines Messzylinders 30 ml Essigsäure ( ) in einen 1-L- Messkolben geben. Bis zur Marke mit Methanol ( ) auffüllen und gut schütteln Wasser, 3 % Essigsäure Unter Verwendung eines Messzylinders 30 ml Essigsäure ( ) in einen 1-L- Messkolben geben. Bis zur Markierung mit Wasser ( ) auffüllen und gut schütteln GERÄTE HINWEIS: Ein Instrument oder Gerät wird nur aufgeführt, wenn es sich um ein Spezialgerät handelt oder wenn es eine spezielle Leistung aufweist. Es wird davon ausgegangen, dass übliche Laborglaswaren und Hilfsmittel verfügbar sind Flüssigkeitschromatograph (LC) Ausgerüstet mit einem automatischen Probengeber, einer 100 µl-probenschleife und einem hochauflösenden Massenspektrometer LC-Säule Geeignet, um reproduzierbare Natamycin-Peaks zu erzielen und Natamycin-Peaks von Störpeaks zu trennen, die von der Probenmatrix und/oder den verwendeten Lösungsmitteln herrühren. HINWEIS: Je nach Art der für die Analyse verwendeten Ausrüstung sollten die Betriebsbedingungen optimiert werden HPLC-Analyse Folgende Säule und folgende Parameter erwiesen sich als geeignet:: Säule: Waters Sunfire C18, 150 x 2,1 mm, 3,5 µm Säulentemperatur: Durchfluss: 30 o C Injektionsvolumen: 20 µl 0,25 ml/min Mobile Phase A: Wasser: Essigsäure, 97:3 (v/v) ( ) 3

4 Mobile Phase B: Methanol: Essigsäure, 97:3 (v/v) ( ) Laufzeit: Probenteller des automatischen Probengebers: 30 Min. bei 8 o C Gradientenprogramm: Zeit (Min) Mobile Phase A (%) Mobile Phase B (%) Massenspektrometrische Detektion (LC-HR/MS) Ionisierungstechnik: Positiver Elektrospray Massenauflösung: m/z/ m/z AGC-Ziel: Hoher Dynamikbereich Max. Einspritzzeit: 50 ms Scanbereich: m/z Spülgas: 60 L/Min. Hilfsgas: 5 L/Min. Sprühspannung: 3,75 V Natamycin: m/z [M+H] +. Bestätigung Ion m/z Verweilzeit: 16,5 Min VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Die Proben sind vor der Entnahme von Teilproben zu schütteln, um ihre Homogenität zu gewährleisten Screening 4

5 Für jeden Wein 2 ml Probe in zwei 2 ml-eppendorf-zentrifugenröhrchen pipettieren. Jeweils 0 µl und 20 µl Natamycin-Arbeitslösung 2 (0,5 μg/ml) ( ) in die Röhrchen geben. Dies entspricht einer Zugabe von 0 μg/l und 5 μg/l Natamycin. Die Röhrchen eine Minute schütteln und dann 10 Min. bei U/min zentrifugieren. Ein Aliquot über ein PFTFE- Filter mit einem Porendurchmesser von 2 µm filtrieren und in eine 2 ml-braunglasampulle überführen. LC-HR/MS-Analyse durchführen (siehe Ziffer 6) und die Natamycin- Konzentration in der Probe ermitteln (Ziffer 7). Wenn die grob ermittelte Natamycin-Konzentration weniger als 5 μg/l beträgt, das Ergebnis mit < 5 μg/l angeben. Wenn die Natamycin-Konzentration über 5 μg/l liegt, nach Ziffer 5.2 weiter verfahren Quantifizierung Bestimmung von Natamycin für Proben mit einer grob ermittelten Konzentration von mehr als 5 μg/l. 2 ml Wein in fünf 2 ml-eppendorf-zentrifugenröhrchen geben und jeweils 0 µl, 5 µl, 10 µl, 20 µl und 50 µl Natamycin-Arbeitslösung 1 ( ) in die Röhrchen geben. Dies entspricht Konzentrationen von 0 μg/l, 25 μg/l, 50 μg/l, 100 μg/l und 250 μg/l Natamycin. Die Röhrchen eine Minute schütteln und dann 10 Min. bei U/min zentrifugieren. Ein Aliquot über ein PFTFE-Filter mit einem Porendurchmesser von 2 µm filtrieren und in eine 2 ml-braunglasampulle überführen. LC-HR/MS-Analyse durchführen (Ziffer 6) und die Natamycin-Konzentration in der Probe berechnen (Ziffer 7) ANALYSE HINWEIS: Zu Beginn der Messungen sollten die Grundlinienstabilität und die Linearität des Detektorsignals sowie die Nachweisgrenze überprüft werden. Für die Messungen aller Proben und Kalibrierstandards sind die gleichen Betriebsbedingungen einzuhalten. Die Natamycin-Peaks über die Retentionszeit und ihre genauen Massen identifizieren und die Peakflächen bestimmen. Jede der vorbereiteten Lösungen in die LC-Säule einspritzen. Die Peakflächen von Natamycin in jedem Quantifizierungs- und Bestätigungsschritt messen. Ein typisches Chromatogramm ist in Abbildung 1 als Beispiel angeführt. Abbildung 1. Typisches LC-HR/MS-Chromatogramm und Massenspektrum für Natamycin, das einer Weißweinprobe in einer Konzentration von 50 μg/l zugegeben wird. 5

6 Relative Abundance Relative Abundance C:\Xcalibur\...\data\10043_039 1/28/2010 4:12:34 AM white wine 100 rep 1 RT: SM: 7B RT: MA: NL: 4.94E4 m/z= MS 10043_ RT: AA: NL: 2.78E4 m/z= MS ICIS 10043_ Time (min) 10043_039 # RT: AV: 45 SB: , NL: 2.22E4 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [ ] m/z Die Peakflächen für das Hauptmassenfragment gegen die Konzentrationen von Natamycin auftragen, die in Mikrogramm pro Liter (μg/l) zugegeben wurden. Die Steigung, den Achsenabschnitt und den Korrelationskoeffizienten der Regressionsgeraden bestimmen. Die Kalibrierkurve muss linear sein und der Korrelationskoeffizient mindestens 0,99 betragen DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE Berechnung des Gehalts Durch folgende Formel kann die Natamycin-Konzentration in der Probe in Mikrogramm pro Liter (μg/l) errechnet werden: C = b/a dabei sind: C = Natamycin-Konzentration im Wein (μg/l), a = Geradensteigung, b = y-achsenabschnitt BESTÄTIGUNG Natamycingehalte in den Proben werden durch folgende Kriterien bestätigt: Anwesenheit eines Peaks für die beiden Massen m/z und m/z bei jeweils gleicher Retentionszeit. Das Peakflächenverhältnis der Masse des Hauptfragments im Verhältnis zur Peakfläche der Referenzmasse berechnen. Die 6

7 Verhältniszahlen sollen zu ± 25 % mit denjenigen übereinstimmen, die durch die Standards beim Additionsverfahren erhalten wurden VERFAHRENSKENNGRÖSSEN Linearität Die Methode ist in einem Kalibrierbereich von 1 bis 2640 μg/l in reinen Lösungen sowie in Weißwein- und Rotwein-Matrizes linear (Abbildungen 2, 3 und 4). Abbildung 2. Kalibrierkurve (10 Punkte) von Natamycinlösungen von 1 bis 2600 μg/l Tabelle 1: Residuen bei der Kalibrierung mit Standardlösungen Erwartete Natamycin Konzentration (µg/l) (µg/l) Residuen Standardresiduen

8 Abbildung 3: Kalibrierkurve (10 Punkte) von Natamycin, in Weißwein im Bereich von 1 bis 2600 μg/l Tabelle 2: Residuen bei der Kalibrierung in Weißwein-Matrix Erwartete Natamycin Konzentration (µg/l) (µg/l) Residuen Standardresiduen

9 Abbildung 4. Kalibrierkurve (10 Punkte) von Natamycin in Rotwein im Bereich von 1 bis 2600 μg/l. Tabelle 3: Residuen bei der Kalibrierung mit Rotwein-Matrix Erwartete Natamycin Konzentration (µg/l) (µg/l) Residuen Standardresiduen Genauigkeit und Präzision Die Wiederholbarkeit der Methode wurde für einen Anwendungsbereich von 5 μg/l bis 200 μg/l in reinem Lösungsmittel, in Weißwein- und in Rotwein-Matrizes (Tabellen 4,5 und 6) ermittelt. Die Bestimmung der Genauigkeit erfolgte, indem Weiß- und Rotwein mit einer bekannten Menge Natamycin in zwei unterschiedlichen Konzentrationen versetzt wurde. Die Analyse wurde anschließend von einem zweiten Analytiker durchgeführt, dem die 9

10 Konzentrationen des zugegebenen Natamycins nicht bekannt waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 4: Wiederholbarkeit der Methode, bei der dem Lösungsmittel (Methanol:Wasser:Essigsäure, 50:47:3 v/v) Natamycin in zwei Konzentrationen (5 und 200 μg/l) zugegeben wird Konzentration Natamycin ug/l Wiederfin dung (%) 5 ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung Mittelwert Standardabweichung RSD (%) ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung ng/ml Wiederholung

11 200 ng/ml Wiederholung Mittelwert Standardabweichung RSD (%) Tabelle 5: Wiederholbarkeit der Methode, bei der Weißwein Natamycin in zwei Konzentrationen (5 und 200 μg/l) zugegeben wird Konzentration Natamycin ug/l Wiederfindung (%) Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Weißwein 5,3 ng/ml Wdhg Mittelwert Standardabweichung RSD (%) Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Weißwein 211 ng/ml Wdhg Mittelwert Standardabweichung RSD (%)

12 Tabelle 6: Wiederholbarkeit der Methode, bei der Rotwein Natamycin in zwei Konzentrationen (5 und 200 μg/l) zugegeben wird Konzentration Wiederfindung Natamycin ug/l (%) Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Rotwein 5,3 ng/ml Wdhg Mittelwert Standardabweichung RSD (%) Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Rotwein 211 ng/ml Wdhg Mittelwert Standardbweichung RSD (%)

13 Tabelle 7: Genauigkeit der Methode, bei der Weißwein und Rotwein Natamycin in zwei Konzentrationen (125 und 220 μg/l) zugegeben wird Zusatz (µg/l) Gemessene Konzentration (µg/l) Wiederfindung (%) Z-Score Weißwein A Wdhg Weißwein A Wdhg Weißwein A Wdhg Weißwein B Wdhg Weißwein B Wdhg Weißwein B Wdhg Rotwein A Wdhg Rotwein A Wdhg Rotwein A Wdhg Rotwein B Wdhg Rotwein B Wdhg Rotwein B Wdhg Berechnungen Z-Scores = (gemessene Konzentration - zugefügte Konzentration)/Zielstandardabweichung Berechnung nach Horwitz: Zielstandardabweichung = 0,16 x zugefügte Konzentration 2.2 Bestimmung von Natamycin in Wein mittels HPLC/DAD Geltungsbereich Diese Methode beschreibt ein Analysenverfahren für die Bestimmung von Natamycin in Wein mittels HPLC. Der Natamycin-Gehalt wird in Mikrogramm pro Liter (μg/l) Wein ausgedrückt. Die beschriebene Methode wurde laborintern unter Berücksichtigung des Einflusses der Matrix Wein (z. B. Weißwein, Rotwein) validiert Prinzip Nicht schäumende Wein proben werden direkt in das HPLC-System eingespritzt. Schäumende Weinproben werden zunächst durch Filtration oder durch Verwendung eines Ultraschallbades entgast. Der Analyt wird von der Matrix auf einer C8-Säule getrennt. Das Fraktionsfenster mit dem Analyten wird automatisch auf die C18-Säule für eine weitere Trennung übertragen. Natamycin wird bei 304 nm und 319 nm nachgewiesen. Zusätzlich 13

14 wird das DAD-Spektrum für die Identifizierung verwendet. Die Quantifizierung erfolgt nach der Methode des externen Standards Reagenzien und Material Reagenzien Wasser, entionisiert Methanol, HPLC-Qualität (CAS-Nr ) Ameisensäure, p.a. (CAS-Nr ) Essigsäure, p.a. (CAS-Nr ) Salzsäure, p.a., 0,1 N (CAS-Nr ) Matrix Wein, Natamycin nicht nachweisbar Natamycin, > 95 % (CAS-Nr ) Die Reinheit wird durch photometrische Messung bei 291 nm, 304 nm und 319 nm einer Natamycin-Lösung in Salzsäure, 0,1 N, gegen eine Blindprobe von Salzsäure, 0,1 N, überprüft: Referenzdaten gemäß Literatur 291 nm 304 nm 319 nm Extinktion (1 Gew.% Natamycin, 1 cm- Zelle) Alternative: Nach entsprechender Verdünnung (z. B. Verdünnungsfaktor 20) kann auch die Stammlösung ( ) für die photometrische Messung verwendet werden, z. B. 1,0 ml Stammlösung in einen 20-ml-Messkolben pipettieren und bis zur Marke mit Salzsäure, 0,1 N, auffüllen. Gegen eine Blindprobe mit der gleichen Zusammensetzung an Lösungsmitteln wie die verdünnte Stammlösung messen Vorbereitung der mobilen Phase Lösungen für die mobile Phase: ml Essigsäure mit 2 l Methanol ml Essigsäure mit 2 l entionisiertem Wasser mischen Eluent 1: Methanol-Essigsäure / entionisiertes Wasser-Essigsäure (65 / 35) Eluent 2: Methanol-Essigsäure / entionisiertes Wasser-Essigsäure (80 / 20) 14

15 Vorbereitung der Stamm- und Standardlösungen Alle Lösungen haben eine begrenzte Stabilität und müssen im Dunklen und im Kühlschrank gelagert werden. Die Stammlösung ( ) hat eine Haltbarkeit von bis zu mehreren Wochen, wobei die Konzentration kurz vor der Verwendung überprüft werden muss (z. B. siehe "Alternative" ). Die Verdünnungen I ( ) und II ( ) und die Standardlösungen ( ) müssen an jedem Arbeitstag neu angesetzt werden Herstellen der Stammlösung und der Verdünnungen Stammlösung (ca. 100 mg/l) Etwa 5 mg Natamycin ( ) werden genau eingewogen und mit Methanol in einen 50 ml-messkolben überführt. Man fügt 0,5 ml Ameisensäure hinzu und achtet darauf, dass das Natamycin vollständig aufgelöst wird, temperiert auf 20 C und füllt bis zur Marke mit Methanol auf Verdünnung I (ca. 5 mg/l) 2,5 ml Stammlösung ( ) in einen 50-ml-Messkolben pipettieren und bis zur Marke mit entionisiertem Wasser auffüllen Verdünnung II (ungefähr 1 mg/l) 4 ml der Verdünnung ( ) in einen 20-ml-Messkolben pipettieren und bis zur Markierung mit der Matrix Wein auffüllen ( ) Herstellung der Standardlösungen Für die Standardlösungen die Verdünnung II ( ) auf die gewünschten Konzentrationen mit der Matrix Wein ( ) verdünnen, z. B. 50 µl in einem 10 ml-messkolben pipettieren, ergibt eine Endkonzentration von 5 µg/l: Messkolben 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml Volumen der Verdünnung II (µl) Menge an Natamycin (µg/l) Geräte Übliches Labormaterial, insbesondere Folgendes: HPLC-DAD-Anlage mit einem 6-Wege-HPLC-Ventil und zwei isokratischen Pumpen oder einer Gradientenpumpe zur Durchführung der Fraktionierung HPLC-Säule RP-8 15

16 HPLC-Säule RP Photometer Probenvorbereitung Nicht schäumende Weinproben werden direkt in das HPLC-System eingespritzt. Schäumende Weinproben werden zunächst durch Filtration oder durch Verwendung eines Ultraschallbades entgast. Die Proben sind kühl und dunkel zu aufzubewahren Verfahren Betriebsbedingungen der HPLC Folgende Säulen und Trennbedingungen erwiesen sich als geeignet: Säule 1: C 8-Säule (z. B. Select B 125*4mm/5µm endcapped, Merck) Mobile Phase: Flussrate: Eluent 1 ( ) bei Raumtemperatur 1 ml/min Säule 2: C 18-Säule (z. B. Lichrospher 125*4mm/5µm, Merck) Mobile Phase: Eluent 2 ( ) bei 30 C Flussrate: 1 ml/min Injektionsvolumen: 500 µl UV-Detektion: Fraktionsfenster: 304 nm und 319 nm Die Position des Fraktionsfensters muss vor der Analyse (Abb.1) überprüft werden. Die Breite des Fraktionsfensters wird auf jeweils 0,5 Min. vor und. nach der Elution des gewünschten Peaks aus der C 8- Säule festgelegt. 16

17 Abb. 1 Säule 1 Abb. 2 Säule 2 Fraktionsfenster Weißwein, mit Natamycin (50 µg/l) versetzt Identifizierung/ Bestätigung Die Identifizierung der Peaks erfolgt durch den Vergleich der Retentionszeiten der Standards mit den Proben für die beiden Wellenlängen 304 nm und 319 nm. Bei der Verwendung des unter beschriebenen chromatographischen Systems und unter den dort angeführten Bedingungen beträgt die Retentionszeit für Natamycin ca. 12,9 Min. (Abb. 2). Das DAD-Spektrum wird für die weitere Bestätigung positiver Ergebnisse verwendet (Abb. 3 und Abb. 4). 17

18 Abb. 3 3D-DAD-Spektrum von Natamycin Abb. 4 DAD-Spektrum von Natamycin Berechnung und Darstellung der Ergebnisse Zur Erstellung einer Kalibrierkurve mit den Standardlösungen ( ) werden die bei 304 nm gemessenen Chromatogramme verwendet. Die Quantifizierung von Natamycin erfolgt über externe Standards. Aus den jeweiligen Peakflächen und den entsprechenden Konzentrationen wird eine lineare Kalibierkurve erzeugt. Der Korrelationskoeffizient sollte mindestens 0,99 betragen. Die Ergebnisse werden in µg/l angegeben Verfahrenskenngrößen Nachweisgrenze, Quantifizierungsgrenze Die Nachweis- und die Quantifizierungsgrenze wurden gemäß DIN bestimmt (direkte Bestimmung: Mehrfachmessung einer Matrix-Blindprobe, n=10, und eine Kalibrierkurve, die den Gesamtmessbereich abdeckt). Nachweisgrenze: 2,5 µg/l Quantifizierungsgrenze: 8,5 µg/l Linearität Die Linearität der Messungen in der Wein-Matrix wird im Kalibrierbereich von 5 µg/l bis 100 μg/l bestätigt (Abb. 5). 18

19 Abb. 5 Sechspunkte-Kalibrierkurve von Natamycin, Weißwein-Matrix, Kalibrierbereich 5 bis 100 μg/l, R 2 =0, Richtigkeit und Präzision Die Richtigkeit und Wiederholbarkeit wurden ermittelt, indem eine bekannte Menge Natamycin in Weiß-, Rosé- und Rotwein gegeben wurde und diese Proben jeweils fünf Mal gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Matrix Natamycin-Gehalt in der Matrix (µg/l) Natamycin- Zugabe (µg/l) Weißwein n. d. 5,02 Gemessener Natamycin- Gehalt (µg/l) Wiederfindungs rate (%) Z- Score 5,04 100,4 0,0 4,70 93,6-0,2 5,12 102,0 0,1 5,29 105,4 0,2 4,97 99,0 0,0 Mittelwert 5,02 100,1 Standardabw. 0,22 RSD (%) 4,3 Wiederholbarkeit r Rosé-Wein n. d. 5,02 0,85 4,79 95,4-0,1 4,83 96,2-0,1 4,76 94,8-0,1 4,79 95,4-0,1 19

20 4,73 94,2-0,2 Mittelwert 4,78 95,2 Standardabw. 0,04 RSD (%) 0,78 Wiederholbarkeit r Rotwein n. d. 5,02 0,15 4,61 91,8-0,2 4,65 92,6-0,2 4,89 97,4-0,1 4,67 93,0-0,2 4,34 86,5-0,4 Mittelwert 4,63 92,3 Standardabw. 0,20 RSD (%) 4,2 Wiederholbarkeit r Rotwein n. d. 21,2 0,77 19,73 93,1-0,2 20,66 97,5-0,1 21,16 99,8 0,0 19,73 93,1-0,2 19,58 92,4-0,3 Mittelwert 20,17 95,2 Standardabw. 0,70 RSD (%) 3,5 Wiederholbarkeit r Rotwein n.d. 53,2 2,7 51,84 97,4-0,1 51,91 97,6-0,1 51,42 96,7-0,1 50,12 94,2-0,2 50,62 95,2-0,2 Durchschnitt 51,18 96,2 Standardabw. 0,78 RSD (%) 1,5 Wiederholbarkeit r Tabelle 1: Genauigkeit von Natamycin, das in Weiß-, Rosé- und Rotwein gegeben wird; n.d. "not detected" (nicht nachgewiesen), Nachweisgrenze 2,5 µg/l Berechnungen (Tabelle 1): Wiederholbarkeit r = Standardabw. * t 4;0,95 * 2 1/2 Z-Score = (gemessene Menge-zugegebene Menge)/ Zielstandardabweichung * 3,1 * nach Horwitz 20

21 (1-0,5 log zugegebene Menge) Zielstandardabweichung = 1/100 * zugegebene Menge * 2 Literatur DIN 32645: UV- und IR-Spektren wichtiger pharmazeutischer Wirkstoffe, Editio Cantor Aulendorf, 1978, Herausgeber/ Editior Hans-Werner Dibbern in Zusammenarbeit mit E. Wirbitzki Macarthur R, Feinberg M, Bertheau Y, 2010, Construction of measurement uncertainty profiles for quantitative analysis of genetically modified organisms based on interlaboratory validation data, Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 93(3), FV Dominic Roberts and Adrian Charlton. Determination of natamycin in wine by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry: standard operating procedure and method performance data. OIV SCMA March FV Tomasz Brzezina. Natamycin in Wein. OIV SCMA March