Identifizierung eines Cercospora beticola responsiven Bereichs innerhalb des Kernpromotors des pal

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1 Identifizierung eines Cercospora beticola responsiven Bereichs innerhalb des Kernpromotors des pal-gens der Zuckerrübe sowie eines daran bindenden, neuen Transkriptionsfaktors Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) genehmigte D i s s e r t a t i o n von Klaus Schmidt aus Groß Lafferde

2 1. Referent: Prof. Dr. Reinhard Hehl 2. Referent: Prof. Dr. Michael Wettern eingereicht am: mündliche Prüfung am:

3 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG Die Zuckerrübe Pflanze Pathogen Interaktion Die Phenylalanin Ammonium Lyase (PAL) Die Transkriptionsinitiation Interaktion Cercospora beticola- Zuckerrübe Ziel der Arbeit 18 2 MATERIAL UND METHODEN Chemikalien Medien Bakterienanzuchtmedien LB-Medium YEB Medium Pflanzenkulturmedium MS-Medium Bakterienstämme Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Molekularbiologische Standardtechniken Allgemeine molekularbiologische Techniken Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli Transformation von Agrobacterium tumefaciens Herstellung kompetenter A. tumefaciens Zellen Chemische Transformation von Plasmid-DNA in A. tumefaciens Extraktion von Plasmid-DNA aus A. tumefaciens mit dem Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten Elektroporation von E.coli Quantifizierung von Nukleinsäuren Photometrische Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration Quantifizierung im Agarosegel 24 - i -

4 Inhaltsverzeichnis Quantifizierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Proteinbestimmung PCR-Analysen Primerdesign LD-PCR Routinemäßige PCR Transkriptionelle Untersuchungen von infizierten Zuckerrübenblättern RNA Extraktion aus Zuckerrübenblättern Formaldehyd-Agarosegele Blotten der RNA auf eine Nylonmembran Hybridisierung immobilisierter Nukleinsäuren mit radioaktiv markierten Sonden Radioaktive Markierung der Sonden Hybridisierung Entfernen der Sonden von Nylonfiltern Southern Blot Untersuchungen Gewinnung genomischer DNA Southern Blot Screening von DNA-Banken Screening einer cdna-bank Screening einer genomischen λ-bank Gewinnung eines einzelnen λ-klons Gewinnung von DNA aus λ-phagen Bestimmumg des Bvpal- Transkriptionsstartpunktes Labeling des Primers Vorbereitung der RNA Primer Extension Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese cdna-synthese Sequenzmarker Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) Herstellung eines Ganzzellextraktes aus Zuckerrübenblättern Radioaktive Markierung der dsdna-oligonukleotide Annealing komplementärer ssoligonukleotide 40 ii

5 Inhaltsverzeichnis radioaktive Markierung der dsoligonukleotide Bindungsansatz: Transiente, biolistische Transformation von Pflanzengewebe Vorbereiten des Goldes Herstellung der Microcarrier Beladung der Microcarrier (für 6 Schuß) Transiente, biolistische Transformation von Blattrondellen Bestimmung der Luciferaseaktivitäten mit dem Dual Luciferase Reporter Assay Einbettung von Blattrondellen zur mikroskopischen Untersuchung Infektion von Zuckerrüben mit Cercospora beticola Pflanzenmaterial Anzucht des Pilzes Inokulation von Zuckerrüben Histologische Untersuchungen von infiziertem Blattgewebe PAL-Enzymassay Enzymextraktion Enzymtest Erstellung von Reportergenkonstrukten mit dem Bvpal-Promotor Erstellung von 5 -Promotordeletionen Erstellung vom 3 -Deletionskonstrukten Erstellung des Plasmids p-34/+45palluc Fusionen zwischen Bvpal-5 -UTR Bereich und d35s-promotor Einfügen von Punktmutationen im Bereich von 23 bis +3 des Bvpal-Promotors im Reportergenkonstrukt p-34palluc Umklonierung des Bereichs 23 bis +3 des Bvpal-Promotors in den d35s- Promotor Amplifikation der Einzelfragmente Ligation der PCR-Fragmente Erstellung einer stabil transformierten Zuckerrüben-Suspensionskultur Stabile Transformation von Zuckerrübenkallus Erstellung von stabilen transgenen Tabakpflanzen Blattscheibentransformation von Tabak (SR1) One Hybrid Screen 58 iii

6 Inhaltsverzeichnis Erstellung eine cdna Bank im Vektor pgad Screening der cdna Bank im One Hybrid Screen Überexpression eines Proteins in E. coli Statistische Verrechnung von Meßwerten 61 3 ERGEBNISSE Reduktion der Bvpal-Transkriptmenge nach Infektion von Zuckerrüben mit Cercospora beticola Verlauf der Bvpal-Transkriptakkumulation bei Sporen/ml Verlauf der Bvpal-Transkriptakkumulation bei Sporen/ml Reduktion der BvPAL-Enzymaktivität nach Infektion von Zuckerrüben mit C. beticola Induktionsverlauf der BvPAL-Enzymaktivität bei Sporen/ml Induktionsverlauf der BvPAL-Enzymaktivität bei Sporen/ml Korrelation zwischen Transkriptmenge und Enzymaktivität Korrelation zwischen der Bvpal-Transkriptmenge und der Bvc4h- Transkriptmenge Isolierung des Promotors des pal-gens der Zuckerrübe Southern Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des pal-gens im Genom der Zuckerrübe Isolierung eines Vollängen cdna Klons des Bvpal-Gens aus dem Zuckerrübengenotyp 4B Isolierung des pal-gens der Zuckerrübe Isolierung eines λ-phagen mit dem Bvpal-Gen DNA-Sequenzbestimmung des isolierten genomischen Fragmentes Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes des Bvpal-Gens Identifizierung von möglichen Proteinbindungsstellen im putativen Bvpal- Promotor Charakterisierung des Bvpal-Promotors Erstellung von translationellen Fusionen des putativen Bvpal-Promotors mit unterschiedlichen Reportergenen Erstellung eines internen Standards für die transiente, biolistische Transformation Bestimmung der relativen Promotoraktivität von 5 Deletionskonstrukten des Bvpal-Promotors 90 iv

7 Inhaltsverzeichnis Aktivität der Reportergenkonstrukte mit unterschiedlichen Bvpal- Promotorfragmenten Bestimmung der Eindringtiefe der Microcarrier bei der biolistischen Transformation Einfluß des Bvpal 5 -UTR auf die Expressionshöhe des Bvpal-Promotors und des d35s-promotors Transiente Expressionsstudien Verkleinerung des Bvpal-5 -UTR in den Bvpal-Reportergenkonstrukten Einfluß des Bvpal-5 -UTR Bereichs auf die Aktivität des 35S-Promotors Einfluß des Bvpal-5 -UTR auf die Aktivität des d35s-promotors in stabil transformiertem Tabak Transiente Testung der d35s-promotor::bvpal-5 -UTR Reportergen-konstrukte Aktivität der d35s-promotor::bvpal-5 -UTR Reportergenkonstrukte im transgenen Tabak Einfluß eines Wundreizes auf die Luciferaseaktivität im transgenen Tabak transformiert mit dem Konstrukt pbi70s+11/+248luc/70sruc Eingrenzung des Bereichs auf dem Bvpal-Promotor, der für die transkriptionelle Repression nach Infektion mit C. beticola verantwortlich ist Eignung des transienten Testsystems Eingrenzung des verantwortlichen Promotorbereichs Testung des Plasmids p-97palluc Testung des Plasmids p-34palluc Testung des Plasmids p-34/+45palluc Bestimmung von Proteinbindungsstellen am eingegrenzten Promotorbereich Nachweis der Bindung von Proteinen an die verwendeten Oligonukleotide Reaktion der L-Box auf unterschiedliche Ganzzellextrakte Nachweis der sequenzspezifischen Bildung des Komplexes S am ds- Oligonukleotid r14b Eingrenzung der Proteinbindungsstelle im ds-oligonukleotid r14b Einfluß von Punktmutationen an Position 15 und 20 auf die Ausbildung des Komplexes S Bildung des Komplexes S an mutierten ds-oligonukleotiden von r14b im EMSA 122 v

8 Inhaltsverzeichnis Einfluß von Punktmutationen im Bereich 23 bis +3 auf die Expressionshöhe des Reportergenkonstruktes p-34palluc nach transienter, biolistischer Transformation in Zuckerrübenblätter Konstruktion von chimären 35S-Bvpal-Promotoren Funktionalität der Konstrukte p70s-23/+248luc und p70s-23/+10luc Nachweis des Repressionsphänomens mit dem Plasmid p70s-23/+10luc Identifizierung möglicher Transkriptionsfaktoren, die am Bereich 23 bis +3 des Bvpal-Promotors binden One Hybrid Screen mit r14b als Köder Überexpression des möglichen Transkriptionsfaktors BvOH15 in E. coli Nachweis der spezifischen DNA-Bindung des Proteins BvOH15 an die Sequenz -23 bis +3 des Bvpal-Gens 139 Nachweis der Interaktion von BvOH15 mit dem Bvpal-Promotor in vivo Identifizierung des möglichen von C. beticola während der Infektion abgegebenen Suppressors DISKUSSION Repression der Phenylalanin Ammonium-Lyase und der Zimtsäure-4- Hydroxylase Expression in Zuckerrübenblättern nach Infektion mit C. beticola Identifizierung des für die Repression verantwortlichen cis-elementes auf dem Promotor des Bvpal-Gens Charakterisierung des Bvpal-Promotors Eingrenzung des für die Repression verantwortlichen Promotorbereichs Identifizierung möglicher DNA-bindender Proteine Modell zur Interaktion zwischen der C. beticola Infektion und der Bvpal- Transkription ZUSAMMENFASSUNG LITERATURNACHWEIS ANHANG 195 vi

9 Abkürzungen ABA Abscisinsäure Abb. Abbildung APS Ammoniumpersulfat BAP Benzylaminopurin BNYVV beet necrotic yellow vein virus bp Basenpaar BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) cdna komplementäre DNA cfu colony forming units (koloniebildende Einheiten) cpm counts per minute CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid d.h. das heißt datp Desoxyadenosintriphosphat DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dntp Desoxynukleosidtriphosphat dpi Tage nach Infektion ds doppelsträngig dsdna doppelsträngige DNA DTT 1,4-Dithiothreit EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol gus ß-Glucuronidase- Gen HR Hypersensitive Reaktion IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactosid kb kilo-basenpaare KOAc Kaliumacetat luc Luciferase-Gen aus Photinus pyralis LUC Luciferase aus Photinus pyralis MB Mega-Basenpaare MeOH Methanol MES 4-Morpholinethansulfonsäure - vii -

10 Abkürzungen MOPS 4-Morpholinpropansulfonsäure mrna messenger-rna MUG 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronoid n. I. nach Infektion NAA Naphthylessigsäure NaAc Natriumacetat Na-Pi Natriumphosphatpuffer nrlu normalisierte relative Lichteinheiten o.a. oben angegeben OD optische Dichte PCR polymerase chain reaction PEG Polyethylenglykol pfu plaque forming units (Plaque bildende Einheiten) psi pounds per square inch PVP Polyvinylpyrrolidon RLU relative light units (relative Lichteinheiten) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur Ruc Luciferasegen aus Renilla reniformis RUC Luciferase aus Renilla reniformis s.o. siehe oben SA Salicylsäure SAR systemic acquired resistance (systemisch erworbene Resistenz ) SDS sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) ss einzelsträngig ssrna single-stranded-rna (Einzelstrang-RNA) TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TMV tobacco mosaic virus u.a. unter anderem ÜK Übernachtkultur ün über Nacht usw. und so weiter UTR untranslated region (nicht-translatierte Region) - viii -

11 Abkürzungen v/v Vol w/v z.b. z.t. volume per volume (Volumen pro Volumen) Volumen weight per volume (Gewicht pro Volumen) zum Beispiel zum Teil - ix -

12 - x - Abkürzungen

13 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die Zuckerrübe Die Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) ist eine relativ junge Kulturpflanze entdeckte Andreas Sigismund Marggraf, daß die bisher zu Futterzwecken angebaute Runkelrübe den gleichen Zucker enthielt, wie der im Zuckerrohr, nämlich Saccharose. Ein Schüler Marggrafs, Franz Carl Achard, prüfte die bis dahin angebauten Runkelrübenvarietäten auf ihren Zuckergehalt und entwickelte aus diesen die Weiße Schlesische Zuckerrübe, mit etwa 4,5 % Zuckergehalt. Sie gilt als Ausgangsform aller heutigen Zuckerrübensorten. Schon früh wurde die Zuckerrübe züchterisch bearbeitet, immer mit dem Ziel der höheren Zuckerausbeute und eines höheren Rübenertrages. Zunächst wurde ein sehr einfaches Zuchtverfahren angewendet, indem man aus einer Zuckerrübenpopulation diejenigen Rüben aussuchte, die das höchste spezifische Gewicht hatten. Diese ließ man frei untereinander abblühen, so daß man dadurch eine verbesserte Population erhielt (positive Massenauslese). Nach Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln konnte die Pflanzenzüchtung, und damit auch die Zuckerrübenzüchtung, auf eine wissenschaftliche Grundlage gestellt werden. In den folgenden Jahrzehnten wurden wesentliche Zuchtfortschritte erzielt, die zu einer Verbesserung der agronomischen Eigenschaften der Rübe führten. Folgende Meilensteine in der Zuckerrübenzucht führten zu den heutigen Hochleistungssorten: Einführung der Polyploidie und damit Steigerung des Rübenertrags und des Zuckerertrags Einführung der Hybridzüchtung nach Auffinden von männlich sterilen Linien; damit Ertragssteigerungen durch Nutzung des Heterosiseffektes Erzeugung von genetisch monogermen Saatgut, zur Arbeitserleichterung auf dem Feld Somit waren bis in die 70er Jahre des 20. Jahrhunderts die Zuchtziele auf eine Erhöhung des Zuckerertrags und Verbesserung der agronomischen Eigenschaften der Zuckerrübe ausgerichtet. In den folgenden Jahren nahm die Bedeutung der Krankheiten im Zuckerrübenanbau zu. Dementsprechend wurde verstärkt die Krankheitsresistenz als Zuchtziel formuliert. Insbesondere sind hier die Resistenz gegen Virosen (Rizomania, hervorgerufen durch das beet necrotic yellow vein virus (BNYVV)), die Resistenz gegen Wurzelnematoden (Heterodera schachtii) und die Resistenz gegenüber Pilzen (u.a. Cercospora beticola) zu nennen. Gegen die genannten Pathogene ist es in den letzten Jahren gelungen, tolerante Sorten zu entwickeln, wobei die Toleranz gegen die Rizomania am weitesten vorangeschritten ist

14 Einleitung Erreicht wurde die Toleranz durch Einkreuzung von Wildmaterial in die Kultursorten und intensive Rückkreuzung, um die Wildmaterialeigenschaften zu minimieren. Diese Zuchtmethode ist sehr zeitaufwendig und bedarf einer strikten Selektion auf die gewünschte Eigenschaft. Die Selektion konnte durch Einführung molekularbiologischer Techniken (markergestützte Selektion) deutlich verbessert und verkürzt werden. Eine neue Möglichkeit zur Schaffung von Resistenz gegenüber Pathogenen bietet der Einsatz der Gentechnik, d.h. die Übertragung von einzelnen Resistenz vermittelnden Genen in das Kulturmaterial. Dadurch können die negativen Eigenschaften, die durch Übertragung großer genetischer Abschnitte aus Wildmaterial in das Hochleistungsmaterial auftreten, vermieden werden. Ein weiterer Vorteil ist, daß neben Resistenzfaktoren aus Wildmaterial der gleichen Art oder eng verwandter Arten, auch Resistenz vermittelnde Gene aus entfernt verwandten Arten in die Kulturart eingebracht werden können und damit die Möglichkeiten zur Erhöhung der genetischen Variabilität deutlich verbessert werden. Ein Beispiel für solch ein Resistenz vermittelndes Gen wäre das Hüllproteingen aus dem BNYVV. Die Übertragung dieses Gens in die Zuckerrübe führt zu einer deutlichen Resistenz der Rübe gegenüber dem Virus (Mangold et al., 1998). Bei pilzlichen Schaderregern konnte durch das Einführen von Fremdgenen in Zuckerrüben bisher nur bedingt eine erhöhte Resistenz festgestellt werden (D. Stahl, persönliche Mitteilung). Dies mag daran liegen, daß hier die Pathogenese wesentlich komplizierter ist als bei virusbedingten Erkrankungen. Voraussetzung für eine erfolgreiche Manipulation der Pflanze und damit die Erhöhung der Resistenz gegenüber einem Pathogen ist somit die genaue Kenntnis des Infektionsvorgangs. Um die Interaktion zwischen Pathogen und Pflanze zu verstehen, müssen somit folgende Fragen geklärt sein: Wieso ist ein Pathogen in der Lage, eine bestimmte Pflanze zu infizieren, andere aber nicht? Wie erkennt die Pflanze das Pathogen und leitet Abwehrmaßnahmen ein? Ist das Pathogen in der Lage, die eingeleiteten Abwehrmaßnahmen zu unterdrücken oder zu umgehen? - 2 -

15 Einleitung 1.2 Pflanze Pathogen Interaktion Pflanzen kommen während ihrer Entwicklung mit zahlreichen Mikroorganismen in Kontakt. Nur der geringste Anteil dieser Mikroorganismen sind jedoch potentielle Pathogene. Von den geschätzten, mehr als eine Million Bakterienarten sind lediglich 200 als phytopathogen beschrieben (Kempken and Kempken, 2000). Bei den Pilzen sind ca phytopathogene Arten beschrieben, aus einer Gesamtzahl von etwa Arten (Müller and Loeffler, 1992). Nur ein Bruchteil der potentiell pathogenenen Mikroorganismen mit denen eine Pflanze in Berührung kommt löst tatsächlich eine Krankheit aus. Die übrigen Pathogene werden durch die sogenannte Nicht-Wirtsresistenz abgewehrt (Heath, 2000). Bei dieser Form der Resistenz spielen mehrere Faktoren eine Rolle. Eine besondere Bedeutung haben die vorgeformten Resistenzbarrieren einer Pflanze. Hierzu zählen die physikalischen Barrieren, wie zum Beispiel die Cuticula und die Epidermis mit ihren verdickten Zellwänden. Diese müssen zunächst vom Pathogen durchdrungen oder überwunden werden, um an den Nährstoffvorrat der Zelle zu gelangen (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Des weiteren enthalten Pflanzen zahlreiche Peptide, Proteine und Sekundärmetabolite, die den Wirtspflanzenkreis zahlreicher Pathogene einschränken, da diese Substanzen das Wachstum des Pathogens inhibieren (Heath, 2000). Neben den vorgeformten Resistenzmechanismen gibt es außerdem die induzierten Resistenzmechanismen. Diese werden durch Substanzen aktiviert, die vom Pathogen während der Pathogenese abgegeben werden, sogenannte Elizitoren. Zum einen kann es sich hierbei um allgemein wirksame Elizitoren handeln, die von zahlreichen Pflanzen erkannt werden und somit zur Nicht-Wirtsresistenz führen. Daneben gibt es rassenspezifische Elizitoren, die zur Avirulenz des jeweiligen Pathogens auf bestimmten Pflanzenarten führen, die das korrespondierende Resistenzgen (R) tragen. Der rassenspezifische Elizitor wird durch ein Avirulenz (Avr)-Gen auf Seiten des Pathogen codiert. Diese sehr spezifische Interaktion wird rassenspezifische Resistenz oder gene for gene resistance (Keen, 1990) genannt. Zellwandbestandteile von Pilzen sind allgemein wirksame Elizitoren in zahlreichen Pflanzen (Ebel and Mithöfer, 1998; Nürnberger and Scheel, 2001). Als allgemein wirksamer Elizitor aus der Oberflächenstruktur von Bakterien konnte ein 22 Aminosäuren langes Peptid aus dem Flagellin, dem Hauptbestandteil des bakteriellen Flagellums, identifiziert werden (Felix et al., 1999)

16 Einleitung Für die Erkennung des Eliztors sind Rezeptoren verantwortlich. Zunächst wurde vermutet, daß dieser Rezeptor bei der rassenspezifischen Resistenz durch das korrespondierende R-Gen codiert wird (Bent, 1996). Mittlerweile sind aus verschiedenen Pflanzen zahlreiche R-Gene isoliert worden. Diese lassen sich auf Grund ihrer Struktur in mehrere Klassen einteilen. Die Einteilung erfolgt durch das Vorhandensein von funktionellen Domänen, die innerhalb der Proteinstruktur gefunden werden. Alle R-Gene enthalten einen leucine rich repeat (LRR). Alle intrazellulären R-Gene enthalten außerdem eine nucleotide binding site (NBS) und manchmal einen leucine zipper (LZ) oder eine Domäne, die Homologien zu dem TOLL und Interleukin-Rezeptor (TIR) aus Mammalia zeigt. Bei extrazellulären Proteinen ist der LRR-Teil am N-Terminus des Proteins lokalisiert. Diesem folgt eine Transmembrandomäne (TM) mit der das Protein in der Cytoplasmamembran verankert ist (Takken and Joosten, 2000). Die LRR-Domäne ist für die Interaktion mit anderen Proteinen verantwortlich. Dabei kann es zu einer direkten Interaktion mit dem Avr-Genprodukt kommen, was allerdings sehr selten ist und bisher nur zwischen dem LRR des Pi-ta-Proteins aus Reis und dem korrespondierenden AVR-Pi-Ta aus Magnaporthe grisea gezeigt wurde (Jia et al. 2000). In den meisten anderen R-Gen/Avr-Gen Interaktionen findet keine direkte Interaktion statt, sondern das R-Gen ist Teil eines größeren Rezeptorkomplexes (Luderer et al., 2001; Nürnberger and Scheel, 2001). Sowohl die allgemeinen, als auch die spezifischen Elizitoren aktivieren Signalkaskaden innerhalb der Zelle, in die Proteinkinasen, Elemente des mitogen activated protein (MAP) Kinaseweges sowie Protein-Phosphatasen involviert sind. (Heath, 2000). Dabei werden durch unterschiedliche Elizitoren unterschiedliche Signalkaskaden aktiviert (Zhang and Klessig, 2001). Nach Erkennung des Avr-Genproduktes bzw. des allgemeinen Elizitors finden zahlreiche, physiologische Reaktionen der Zelle statt (Abb. 1). So ändert sich die Permeabilität der Plasmamembran. Es kommt zu einem verstärkten Ausfluß von Kalium- und Chloridionen und zu einem verstärkten Einfluß von Calcium- und verminderten Ausfluß von Wasserstoffionen (Nürnberger and Scheel, 2001; Ebel and Mithöfer, 1998). Die Änderung der Membranpermeabilität ist notwendig und ausreichend, um die folgenden Schritte der Pathogenabwehr der Pflanze einzuleiten. Diese Schritte beinhalten die Auslösung des sogenannten oxidative burst, Aktivierung der Transkription von Pathogenabwehrgenen sowie die Produktion von Phytoalexinen (Scheel, 1998)

17 Einleitung Beim oxidative burst entsteht durch Übertragung eines Elektrons vom NADPH auf molekularen Sauerstoff ein Superoxidanion (O.- 2 ). Dieses wird durch die Superoxiddismutase (SOD) in Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) überführt (Hammond-Kosack and Jones, 1996). H 2 O 2 kann Radikale bilden, die mit Bestandteilen der Plasmamembran interagieren. Durch die Oxidation von Lipiden in der pflanzlichen Plasmamembran werden Signalmoleküle freigesetzt, die zur Aktivierung von weiteren Abwehrmaßnahmen führen (Scheel, 1998). Bei ausreichend hohen H 2 O 2 Konzentrationen wird die Struktur der Zelle aufgelöst, was zum Zelltod führt. Da H 2 O 2 unspezifisch wirkt, hat es in höheren Konzentrationen, die auch im Pflanzengewebe gefunden werden, eine toxische Wirkung auf die Zellen des eindringenden Pathogen (Peng and Kuc, 1992). Außerdem wird H 2 O 2 für die Polymerisation von Lignin benötigt und führt zu einer Verknüpfung von Zellwandproteinen (Bradley, 1992), so daß eine erhöhte H 2 O 2 - Konzentration zu einer Verstärkung der Zellwände führt und diese damit vor dem Eindringen von Pathogenen besser geschützt sind. Wie oben bereits erwähnt, kann die erhöhte Bildung von H 2 O 2 zum Absterben von pflanzlichen Zellen als Reaktion auf den Pathogenbefall führen. Dieses Phänomen wird als Hypersensitive Reaktion (HR) bezeichnet. Sie tritt in der inkompatiblen Reaktion auf und bewirkt, daß eine Ausbreitung des Pathogen gestoppt wird. Daneben werden in den benachbarten Zellen zahlreiche Abwehrmaßnahmen eingeleitet, die ebenfalls eine Ausbreitung des Pathogen verhindern sollen. So werden zahlreiche sogenannte pathogenesis related (PR) Proteine gebildet. Diese werden in vierzehn Gruppen eingeteilt (van Loon, 2001). Darunter sind 1,3-ß-Glucanasen (PR-2), Chitinasen (PR-3, PR-4, PR-8 und PR-11) und Proteinasen (PR-7). Die PR-1 Gruppe enthält die ersten identifizierten PR-Proteine von kda, deren Funktion noch immer nicht geklärt ist. Die PR-5 Gruppe enthält Thaumatin- ähnliche Proteine, die in vitro eine starke antifungale Aktivität zeigen (Stintzi et al., 1993). Die Proteinase-Inhibitoren aus der PR-6 Gruppe spielen eine Rolle in der Abwehr von Insekten und Nematoden. Die Proteinasen der Gruppe PR-7 können bei der Auflösung pilzlicher Zellwände eine Rolle spielen, die Lysozyme der PR-8 Gruppe bei der Auflösung bakterieller Zellwände (van Loon, 2001). Die antifungale Wirkung der Chitinasen und Glucanasen basiert ebanfalls auf der Auflösung pilzlicher Zellwände (Collinge et al., 1993; Melchers et al., 1994). In der Gruppe PR-9 sind Peroxidasen zusammengefaßt, in PR-10 Ribonuklease-ähnliche Proteine und in PR permeabilisierende Proteine der Plasmamembran unterschiedlicher Proteinklassen (van Loon, 2001)

18 Einleitung Neben den PR-Proteinen werden auch Proteine des Sekundärstoffwechsels aktiviert, die für die Bildung von niedermolekularen, antimikrobiellen Substanzen verantwortlich sind, sogenannten Phytoalexinen. Diese akkumulieren in sehr hohen Konzentrationen um die Infektionsstelle (Hammond-Kosack and Jones, 1996). All diese physiologischen Änderungen in der Nähe der Infektionsstelle bewirken eine erhöhte Resistenz des Gewebes, nicht nur gegen das Pathogen, welches die Resistenzreaktion ausgelöst hat, sondern gegen eine große Anzahl von Pathogenen. Dieses Phänomen wird als Localized Acquired Resistance (LAR) bezeichnet (Costet et al. 1999). Neben der LAR kann man aber auch in den nicht infizierten Blättern einer Pflanze, also weit entfernt von der ursprünglichen Infektionsstelle, eine erhöhte Resistenz gegenüber zahlreichen Pathogenen feststellen. Dieses Phänomen wird als Systemic Acquired Resistance (SAR) bezeichnet (Ryals et al., 1996). Die SAR bewirkt, daß die gesamte Pflanze über einen gewissen Zeitraum (mehrere Wochen) vor weiteren Infektionen geschützt ist. Der Schutz ist universell und betrifft nicht nur das Pathogen, welches die SAR ausgelöst hat. Eine wichtige Signalsubstanz in diesem Zusammenhang ist die Salicylsäure (SA). Sie wird in infizierten Blättern und in denen durch die SAR aktivierten in erhöhten Konzentrationen gefunden (Malamy et al., 1996). Wird SA von außen auf die Pflanze appliziert, so kommt es zu einer erhöhten Resistenz des behandelten Gewebes gegen zahlreiche Pathogene (White, 1979; Ward et al. 1991). Transgene Arabidopsispflanzen, die nicht in der Lage sind SA zu akkumulieren, da Ihnen das bakterielle nahg-gen eingebaut wurde, was zu einem Abbau der SA zum nicht mehr aktiven Catechol führt, sind nicht in der Lage eine SAR zu etablieren und daher verstärkt anfällig gegenüber Pathogenen (Bi et al.,1995; Delaney et al., 1994; Gaffney et al., 1993). SA wird in der Pflanze aus Benzoesäure gebildet, die wiederum aus trans-zimtsäure hervorgeht (Yalpani et al., 1993). Trans- Zimtsäure ist das Produkt der Desaminierung von L- Phenylalanin, katalysiert durch die Phenylalanin Ammonium Lyase (PAL). Da die PAL auch an der Bildung von Phytoalexinen und Lignin beteiligt ist, besitzt sie eine besondere Bedeutung bei der Pathogenabwehr

19 Einleitung ROS O 2 E Cl - K+ Oxidase R Kinasen/Phosphatasen Ca2+ ATP Plasmamembran Protein Phosphorylierung /Dephosphorylierung ADP+Pi H + Genaktivierung Resistenzfaktoren Abbildung 1: Vereinfachtes Modell der Signaltransduktion innerhalb der Pflanzenzelle nach Bindung eines Elizitors. Ein Elizitor (E) bindet an einen membrangebundenen Rezeptor (R). Dies hat zur Folge, daß zahlreiche Signalwege aktiviert werden. Es kommt zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), dem Ausfluß von Cl - und K + -Ionen, sowie dem Einfluß von Ca 2+. Dieses bewirkt die Aktivierung von Kinasen oder Phosphatasen, die direkt durch eine Bindung an Promotoren Resistenzfaktoren aktivieren können. Sie können aber auch andere Proteine (Transkriptionsfaktoren) aktivieren, die an die Promotoren von Resistenzfaktoren binden und deren Transkription einleiten. Der Ca 2+ -Influx inhibiert eine plasmamembrangebundene H + -ATPase, was zu einem verminderten Ausfluß von Protonen und damit zu einer Alkalisierung des Apoplasten führt. (Modifiziert übernommen aus Ebel and Mithöfer, 1998) 1.3 Die Phenylalanin Ammonium Lyase (PAL) Die PAL (EC ) ist im Cytosol lokalisiert. Das Enzym ist ein Tetramer und besitzt zwei aktive Zentren. Es katalysiert die Desaminierung von L-Phenylalanin zu trans-zimtsäure (Abb. 2). Das Produkt dieser Reaktion ist Ausgangsstoff für zahlreiche Metabolite des Sekundärstoff-wechsels der Pflanze. Das Enzym stellt damit eine wichtige Verbindung des Primär-stoffwechsels (Shikimatweg) mit dem Sekundärstoffwechsel her. Da der nachfolgende Schritt des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels, die Hydroxylierung der trans-zimtsäure zu para-cumarsäure durch die Zimtsäure-4-Hydroxylase (C4H), jedoch an der Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) stattfindet, wird auch eine Assoziation der PAL mit der C4H an der Membran des ER unter Bildung eines Multienzymkomplexes nicht ausgeschlossen (Czichi und Kindl, 1975)

20 Einleitung In den meisten Pflanzen wird die PAL durch eine kleine Genfamile codiert, z.b. vier in Petersilie (Lois et al., 1989), vier bis fünf in Arabidopsis (Ohl et al., 1990) und in der Kartoffel (Joos and Hahlbrock, 1992). Da PAL ein Tetramer ist, können durch die Kombination der verschiedenen Proteine Heterotetramere entstehen, die in ihrer Aktivität variieren und deren Bildung durch einen auslösenden Reiz gesteuert wird (Dixon and Paiva, 1995). Dazu muß die Transkription der Gene unterschiedlich gesteuert sein. Dies geschieht zum einen gewebespezifisch, kann aber auch entwicklungsabhängig oder durch Streß passieren (Lois and Hahlbrock, 1992). Die Expression der unterschiedlichen Gene des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels wird koordiniert gesteuert, d. h. eine Zunahme der PAL-Aktivität führt auch u.a. zu einer Zunahme der C4H-Aktivität und umgekehrt (Dixon and Paiva, 1995, Logemann et al., 1995). Die Enzymaktivität wird über die Transkriptmenge gesteuert (Dixon and Paiva, 1995). Aufgrund der Bedeutung der PAL liegen von zahlreichen Pflanzen sowohl DNA-Sequenzen als auch die abgeleiteten Amiosäuresequenzen vor. Außerdem sind in den pal-promotoren zahlreiche regulatorische Elemente identifiziert worden (u.a. Logemann et al. 1995). Dies macht die Arbeit mit der PAL angenehm. Dem gegenüber steht die komplexe Bedeutung der PAL, die auf eine komplexe Regulation der Transkription schließen läßt. Bei der Interaktion Pflanze-Pathogen kommt der PAL eine besondere Bedeutung zu, da sie die Vorstufen für zahlreiche Abwehrsubstanzen (Lignin, Phytoalexine), als auch für Signalsubstanzen (Salicylsäure) liefert. Eine Reduzierung der PAL-Aktivität in transgenem Tabak durch Expression einer heterologen cdna aus Bohne (Co-Suppression) führt zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber dem Pilz Cercospora nicotianae (Maher et al., 1994). Derselbe Tabak ist nicht mehr in der Lage, nach Infektion mit dem tobacco mosaic virus (TMV), eine SAR zu etablieren (Pallas et al., 1996). Somit ist es nicht verwunderlich, daß einige Pathogene einen Mechanismus entwickelt haben, um die Aktivierung der pal- Transkription zu unterdrücken, um damit ihre Pathogenität zu erhöhen. Lee et al. (1992) konnten in Tomate nach Infektion mit dem Pilz Verticillium albo-atrum bereits nach 4 h eine Induktion der pal-transkriptmenge feststellen. Dies jedoch nur in der inkompatiblen Interaktion. Wurde eine anfällige Tomatenlinie verwendet, so konnte auch nach 24 h noch keine deutliche Induktion festgestellt werden. Bei der kompatiblen Interaktion von Pseudomonas syringae pv. tomato mit Arabidopsis thaliana konnte ebenfalls das Fehlen einer Induktion von Abwehrgenen, darunter auch pal, festgestellt werden. Wurde ein Bakterienstamm verwendet, der das Phytotoxin Coronatin nicht mehr produzieren kann, so wurde eine deutlich schwächere Symptomausbildung beobachtet, begleitet mit einer deutlich - 8 -

21 Einleitung erhöhten Induktion der Transkriptmenge von Abwehrgenen, insbesondere pal (Mittal and Davis, 1995). Mittal und Davis konnten damit das Fehlen der Induktion von Pathogenabwehrgenen auf einen bestimmten Stoff zurückführen, der als Suppressor bezeichnet werden kann. Die bisher am besten charakterisierten Suppressoren, das Suppresscin A und B aus der Keimflüssigkeit des pilzlichen Erbsenpathogen Mycospharella pinodes sind niedermolekulare Glykopeptide mit einer Größe von ~ 5 kda. Die Applikation der beiden Glykopeptide auf Erbsenblätter führt zu einer deutlich verspäteten Induktion der pal-transkription und daran anschließend zu einer verspäteten Induktion der PAL-Enzymaktivität und einer geringeren Akkumulation des Hauptphytoalexins der Erbse, des Pisatins (Yamada et al., 1989). COOH COOH COOH COSCoA NH 2 PAL C4H 4CL OH OH L-Phenylalanin trans-zimtsäure p-cumarsäure 4-Cumaroyl-CoA Abbildung 2: Darstellung des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels, wie er in allen Pflanzen vorkommt. PAL: Phenylalanin Ammonium Lyase C4H: Zimtsäure-4-Hydroxylase 4CL: p-cumaroyl-coa-ligase 1.4 Die Transkriptionsinitiation Da im Zellkern einer Zelle das gesamte genetische Material eines Organismus vorliegt, müssen die einzelnen Gene entwicklungsabhängig, gewebespezifisch und auf äußere Reize hin aktiviert bzw. herunterreguliert werden. Diese Regulation erfolgt größtenteils über die Transkription. Ohne Transkript kann kein Protein an den Ribosomen gebildet werden. In Eukaryoten wird die Transkription von Protein codierenden Genen von der RNA-Polymerase II durchgeführt. Die Polymerase bindet an die DNA-Sequenz des Gens und synthetisiert die komplementäre mrna. Die RNA-Polymerase II ist ein äußerst komplex aufgebautes Holoenzym aus mehreren, unterschiedlichen Untereinheiten. Aufgrund ihrer zentralen Stellung im Stoffwechsel einer - 9 -

22 Einleitung jeden Zelle ist ihre Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Eukaryoten hoch konserviert. Sie besteht aus zwei großen Untereinheiten (220 und 150 kda) und bis zu 10 kleineren Untereinheiten (Aso et al., 1994). Die zwei großen Untereinheiten sind für die Bindung an die DNA und die Bindung der Nukleotide zuständig, die Funktion der kleineren Untereinheiten ist nur teilweise aufgeklärt. Dieses große Enzym ist jedoch nicht alleine in der Lage, die punktgenaue Transkription einzelner Gene zu gewährleisten. Der Startpunkt und die Richtung der Transkription sind auf der DNA-Sequenz vorgegeben. Etwa 30 bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes liegt eine T/A- reiche Sequenz von etwa 6-8 bp, die TATA-Box, die bei allen regulierbaren Genen gefunden wird. Sie bestimmt den Startpunkt der Transkription. Die Transkription wird eingeleitet, wenn ein allgemeiner Transkriptionsfaktor (TFII-D) an die TATA-Box bindet. TFII-D besteht zum einen aus dem TATA-Bindungsprotein (TBP) und zahlreichen weiteren TBP-assoziierten Faktoren (TAF s) (Orphanides et al., 1996). Während das TBP gut untersucht ist, liegen über die TAF s nur relativ wenige Erkenntnisse vor, und diese überwiegend aus dem humanen- und Hefe-Bereich. Allerdings scheinen die TAF s eine Rolle in der Genregulation zu spielen. So konnte für den humanen TAF105 eine B-Zelltyp spezifische Expression festgestellt werden (Verrijzer and Tjian, 1996). Der C-terminale Bereich des TBP ist hochkonserviert und für die Bindung an die DNA (TATA-Box) zuständig (Poon et al., 1991). Er besteht aus 180 Aminosäuren. Die dreidimensionale Struktur des Proteins aus A. thaliana wurde analysiert (Nikolov et al., 1992). TBP zeigt im aminoterminalen Bereich nur eine geringe Konservierung zwischen den einzelnen Eukaryoten. Das Protein aus A. thaliana enthält nur 18 Aminosäuren im N- terminalen Bereich des Proteins, während das humane Protein 159 Aminosäuren im nicht konservierten N-Terminus enthält. Die Funktion des N-terminalen Bereichs liegt wahrscheinlich in der Interaktion mit den TAF s. Durch die Bindung des TBP an die TATA-Box treten starke Konformitätsänderungen an der DNA auf. Die DNA wird in einem Winkel von ~100 geknickt. Der Bindung des TFII-D folgt die Bindung weiterer allgemeiner Transkriptionsfaktoren, des TFII-A und des TFII-B. Die Bindung dieser beiden Faktoren stabilisiert die Bindung des TFII-D und bildet die Plattform für die Bindung der RNA-PolymeraseII (Pol II). Nachdem die Pol II gebunden hat, beginnt allerdings noch immer nicht die Transkription, da zunächst der Doppelstrang der DNA gespalten und entwunden werden, und die Polymerase durch Phosphorylierung des C- Terminus (CTD) der größten Untereinheit aktiviert werden muß

23 TFII-A TFII-A Einleitung Für die Entwindung der DNA ist der TFII-H zuständig. Ebenso übernimmt dieser Faktor die Phosphorylierung des CTD der Pol II. Damit der TFII-H an den Multiproteinkomplex binden kann, bedarf es einen weiteren Faktors, des TFII-E. Erst wenn alle die genannten Faktoren an den Promotorbereich um die TATA-Box gebunden haben und die RNA-Polymerase II phosphoryliert ist, kann die Transkription beginnen. Insgesamt sind am Aufbau des basalen Transkriptionskomplexes mehr als 40 Polypeptide beteiligt. Die Gesamtgröße des Komplexes beträgt ~ kda (Singh, 1998) und damit ~ 70 % der Größe eines prokaryotischen Ribosoms. TATA TFII-D TBP TFII-F POL II TFII-B CTD TFII-B TFII-D TBP TFII-D TBP TFII-F POL II CTD TFII-B TFII-D TBP TFII-E TFII-F TFII-H POL II TFII-A CTD Transkription Abbildung 3: Einleitung der Transkription. An die TATA-Box des Gens bindet das TATA-bindende Protein (TBP) als Teil des TFII-D. Dies führt zu einer starken Konformationsänderung der DNA. Der gebildete Komplex wird durch Bindung von TFII-A und TFII-B stabilisiert, so daß die RNA-Polymerase II (Pol II) zusammen mit TFII-F binden kann. Durch Bindung der Faktoren TFII-H und TFII-E wird der C-Terminus (CTD) der Pol II phosphoryliert, die DNA entwunden und der Doppelstrang gespalten. Somit kann die Transkription beginnen. Modifiziert übernommen aus Knippers (1997)

24 Einleitung Wird bei den meisten Genen die Transkription eingeleitet, wenn der TFII-D an die TATA- Box bindet, so gibt es aber auch proteincodierende Gene, die keine TATA-Box besitzen. Bei diesen Genen ist die Sequenz um den Transkriptionsstratpunkt für die Einleitung der Transkription von entscheidender Bedeutung. Dieser als Initiationselement (Inr) bezeichnete Sequenzabschnitt bindet den Transkriptionsfaktor TFII-I. TFII-I interagiert mit TFII-D, so daß sich nun der basale Transkriptionskomplex ausbilden kann. Somit haben TATA-Box und Inr Element die gleiche Funktion. TATA-Box lose Promotoren findet man bei sogenannten Haushaltsgenen, die konstitutiv transkribiert werden. Es gibt aber auch Gene, die sowohl ein Inr-Element, als auch eine TATA-Box besitzen. In diesen kann auch ohne Bindung des TBP an die TATA-Box eine Transkription beobachtet werden. Die Transkription ist aber wesentlich stärker, wenn sowohl das TBP als auch Transkriptionsfaktoren am Inr-Element binden (Martinez et al., 1995; Roy et al., 1993). Bereits die Einleitung der Transkription ist also äußerst komplex und bisher erst wenig verstanden. Durch die zahlreichen Proteine, die im basalen Transkriptionskomplex vorhanden sind, können zahlreiche Regulationsmechanismen vermutet werden. Zusätzlich wird die Regulation der Transkription aber auch von weiteren Faktoren beeinflußt. Stromaufwärts der TATA-Box findet man auf der DNA weitere Sequenzabschnitte, die für die Regulation der Transkription des Gens von Bedeutung sind. An diesen DNA-Abschnitten binden Transkriptionsfaktoren, die in Wechselwirkung mit dem basalen Transkriptionskomplex stehen. Diese Wechselwirkung kann positiver oder negativer Art sein, d.h. der Komplex wird durch die Wechselwirkung stabilisiert oder destabilisiert und dementsprechend die Transkription aktiviert oder herunterreguliert. Auf einem Promotor befinden sich zahlreiche Transkriptionsfaktorbindungsstellen, so daß die Summe aller Wechselwirkungen zwischen den Proteinen, die an der Expression eines Gens beteiligt sind, die Spezifität des Promotors ausmachen. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Transkriptionsfaktoren isoliert und charakterisiert. Man bemüht sich nun, diese Transkriptionsfaktoren nach ihrer Funktion bzw. homologen Domänen zu ordnen. Für Pflanzen sind typische Transkriptionsfaktoren gefunden worden, die eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription von streß- und pathogenspezifischen Genen spielen. Ein Beispiel wären die WRKY-Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte Promotorelemente (W-Box) binden. Diese Promotorelemente werden in Genen gefunden, die in Pflanzen eine Rolle bei der Pathogenabwehr spielen, so daß WRKY-Transkriptionsfaktoren für die Pathogenantwort der Zelle wichtig zu sein scheinen (Rushton and Somssich, 1998). Alle

25 Einleitung WRKY-Proteine enthalten eine konservierte Aminosäureabfolge von WRKYGQK und ein Zink-Finger ähnliches DNA-Bindungsmotiv. Eine weitere Gruppe von pflanzenspezifischen Transkriptionsfaktoren sind die ERF-Proteine. Diese sind durch ihre Aminosäuren lange ERF-Domäne charakterisiert, die für die Bindung an die DNA verantwortlich ist. Die ERF-Proteine binden an die GCC-Box, die in den Promotoren zahlreicher PR-Gene gefunden werden und für die Antwort auf einen Ethylenreiz benötigt werden. Außerdem binden diese Proteine an dem CRT/DRE-Motiv von Genen, deren Transkription durch Trockenstreß und Kälte induziert wird (Singh et al., 2002). Eine große Gruppe von Transkriptionsfaktoren stellen die bzip-transkriptionsfaktoren. Sie sind nicht pflanzenspezifisch, sondern werden auch in anderen Organismen gefunden. Die Proteine sind durch einen Leucinezipper charakterisiert, der für die Interaktion mit anderen Proteinen verantwortlich ist. Meistens kommt es dabei zu einer Dimerbildung zwischen den Leucinezippern von zwei bzip-transkriptionsfaktoren. Dadurch können Homo- oder Heterodimere entstehen, die spezifische Bindungsaffinitäten zu bestimmten DNA-Motiven auf den Promotoren haben (Strathmann et al., 2001). Die bzip-transkriptionsfaktoren sind daher an zahlreichen Regulationsprozeßen in der Pflanze beteiligt. So spielen sie eine Rolle bei der Signalweiterleitung von UV-Streß, Salz- und Trockenheitsstreß sowie dem biotischen Streß, ausgelöst durch Pathogene einer Pflanze (Singh et al., 2002)

26 Einleitung 1.5 Interaktion Cercospora beticola- Zuckerrübe In der vorliegenden Dissertation wurde die Interaktion zwischen dem Pilz C. beticola und der Zuckerrübe untersucht. C. beticola ist der wichtigste Schadpilz der Zuckerrübe, der in den wärmeren Anbaugebieten der Zuckerrübe zu starken Ertragsausfällen führt. Er verursacht typische, 2-3 mm große Blattflecken, die bei starken Befall ineinanderlaufen und das Blatt zum Absterben bringen. Durch die Verminderung der Assimilationsfläche reduziert sich der Zuckerertrag. Gleichzeitig wird die Pflanze durch das Absterben der Blätter zum Neuaustrieb veranlaßt, was auf Kosten des bereits eingelagerten Zuckers geht (Rieckmann und Steck, 1995). C. beticola gehört zur Klasse der Deuteromyceten. Es sind also nur vegetative Formen des Pilzes bekannt und die Vermehrung erfolgt über asexuell gebildete Konidien (Agrios, 1997). Die Konidien des Pilzes keimen auf der Blattoberfläche und produzieren mehrere Keimschläuche, die durch die Stomata in das Blatt eindringen (Abb. 4, Abb. 5A). Im Falle einer kompatiblen Interaktion breitet sich der Pilz im apoplasmatischem Raum aus, und an den Kontaktstellen zwischen Pilz und Blattzelle werden typische Infektionsstrukturen ausgebildet (Feindt et al.,1981, Abb. 5B). In resistenten Zuckerrüben zeigt sich dabei eine andere Reaktion als in anfälligen Linien. Zum einen dringt in resistenten Zuckerrüben die Infektionshyphe nicht über die Atemhöhle hinaus in das Blattparenchym ein (Abb. 5C), zum anderen zeigt sich in dieser inkompatiblen Reaktion sehr schnell die Kollabierung der an die Hyphen angrenzenden Pflanzenzellen und die Ablagerung einer extrazellulären Substanz (Abb. 5D; Feindt et al. 1981). In einer kompatiblen Interaktion hingegen bleiben die an die Infektionshyphen angrenzenden Pflanzenzellen noch lange intakt (Abb. 5B), es kann aber eine spezifische Reaktion dieser Parenchymzellen beobachtet werden (Abb. 5B). Erst sehr spät im Infektionsverlauf, nachdem die typischen Nekrosen entstanden sind, kann am Rand der Nekrose die Ablagerung von extrazellulärem Material beobachtet werden, also die gleiche Reaktion wie in resistenten Zuckerrüben in einer früheren Infektionsphase (Abb. 5E). C. beticola produziert in vitro mehrere Toxine, Cercosporin und eine Familie weiterer Toxine, die Beticoline. Bei beiden Toxinen wird vermutet, daß sie eine Rolle in der Pathogenität des Pilzes spielen (Ballio, 1991). Cercosporin führt unter Lichteinfluß zur Bildung von Sauerstoffradikalen, die unspezifisch Zellen zum Absterben bringen. Beticoline haben ebenfalls einen cytotoxischen Effekt, indem sie Poren in Membranen bilden und so den Ausfluß von Elektrolyten, Aminosäuren und Betacyaninen bewirken (Goudet et al., 2000), von denen sich dann der Pilz ernähren kann. Der Pilz braucht somit nicht die Zelle zum

27 Einleitung Absterben zu bringen, sondern zapft den Nährstoffvorrat der lebenden Zelle an. Dadurch lassen sich die Verdickungen der Zellwand erklären, die in einer kompatiblen Reaktion im Blattparenchym gebildet werden (Abb. 5 B). Der Infektionszyklus des Pilzes ist abgeschlossen, wenn die Konidienträger aus den Stomata austreten und sie somit durch den Wind verbreitet werden können. Aufgrund des hohen wirtschaftlichen Schadens, der jährlich durch den Befall von Zuckerrüben mit C. beticola entsteht, besteht ein starkes Interesse der Zuckerrübenzüchter an der Entwicklung resistenter Linien. Die dabei gefundene Resistenz ist jedoch nicht absolut, so daß besser von einer Toleranz gesprochen wird. Auch auf den toleranten Linien können Symptome beobachtet werden. Die Symptome sind jedoch nicht so zahlreich wie bei den anfälligen Linien und die sich bildenden Nekrosen bleiben meist kleiner. Durch klassische Zuchtmethodik ist es bisher nicht gelungen, einzelne Resistenzgene zu lokalisieren. Es sind lediglich nur grob eingegrenzte Bereiche (Quantitative Trait Loci, QTL s) im Genom der Zuckerrübe lokalisiert, die zu einer erhöhten Resistenz führen (Nilsson et al., 1999, Schafer-Pregl et al., 1999, Setiawan et al., 2000). Diese QTL s sind jedoch mit negativen Eigenschaften (geringer Zuckergehalt, geringer Rübenertrag) gekoppelt, so daß die Bereitstellung von isolierten Resistenzfaktoren durch die Molekularbiologie von Vorteil wäre. Um Resistenzfaktoren für die biotechnologische Nutzung zur Verfügung zu stellen, wurden zahlreiche Abwehrgene der Zuckerrübe molekular analysiert. (Nielsen et al., 1993; Nielsen et al., 1994a; Berglund et al., 1995). Darunter sind mehrere Chitinasen (Ch1 (X79301), Ch4 (X75945), SP2 (L25826) und SE2 (S66038)) und eine ß-1,3-Glucanase (Glu2 (X75946)), deren Transkriptionsraten nach Befall von Zuckerrüben mit C. beticola analysiert wurden. Es konnte bei allen getesteten PR-Genen ein ähnlicher Verlauf der Transkription festgestellt werden. In der frühen Infektionsphase um den Tag 3/ 4 n. I. konnte eine leichte Induktion der getesteten Gene festgestellt werden. Diese Induktion war in teilweise resistenten Linien deutlich stärker nachweisbar als in anfälligen Linien. Zum Ende der Infektion, am Tag 9 n. I. wurden dann alle Transkripte sehr stark induziert, jedoch brach am Tag 10 n. I. die Induktion kurzzeitig ein, so daß kein oder aber nur geringe Mengen des jeweiligen Transkripts nachgewiesen werden konnten. Ab Tag 11 n. I. bis zum Versuchsende konnten dann aber sehr hohe Transkriptmengen nachgewiesen werden (Nielsen et al., 1994b). Nielsen beschreibt diesen Verlauf der Transkription als biphasisch. Neben den klassischen PR-Genen, wie Chitinasen und Glucanasen wurden durch die Arbeitsgruppe noch weitere Proteine gefunden, die eine antifungale Wirkung gegenüber C. beticola besitzen. Diese Proteine wurden aus dem Interzellularraum infizierter

28 Einleitung Zuckerrübenblätter ausgewaschen (Nielsen et al., 1996, Nielsen et al., 1997) und führen in einem in vitro Testansatz zu vermindertem Wachstum von C. beticola. Die Zuckerrübe besitzt somit ein reiches Arsenal an möglichen Pathogenabwehrgenen. Trotzdem ist C. beticola in der Lage, die Blätter zu infizieren und sich unter günstigen Umständen epidemisch im Bestand zu verbreiten. Es besteht also weiterer Forschungsbedarf, um die Interaktion Zuckerrübe- C. beticola näher aufzuklären ST Cb ST Cb ST ST Abbildung 4: Aufsicht auf ein Zuckerrübenblatt, infiziert mit C. beticola. Das Blatt wurde 13 Tage nach Infektion geerntet, fixiert, entfärbt und mit Anilinblau angefärbt ( ). Deutlich sind die angefärbten Pilzhyphen (Cb) auf der Blattoberfläche zu erkennen. Auch das Eindringen durch die Stomata (ST) ist zu sehen ( )

29 A B Einleitung anfällig, 4-7 dpi anfällig, 2-4 dpi C D resistent, 4-7 dpi resistent, 8-12 dpi E anfällig, 8-12 dpi Abbildung 5: Schematische Darstellung des Infektionsverlaufs von C. beticola auf Blättern anfälliger (A, B und E) und resistenter (C+D) Zuckerrübengenotypen. A) Wachstum der Pilzhyphe auf der Blattoberfläche und Penetration durch ein Stoma B) Hyphenwachstum im Blattparenchym bei kompatibler Interaktion; = Reaktion der Parenchymzellen nach Kontakt mit dem Pilz C) Reduziertes Hyphenwachstum im resistenten Wirtsgewebe D) Infektionsbereich bei inkompatibler Interaktion. Py = Plasmolyseerscheinungen der angrenzenden Parenchymzellen; K = kollabierte Parenchymzelle; = extrazelluläres Material E) Querschnitt durch eine Nekrose mit sklerotialem Pilzgewebe 8-12 Tage nach Infektion. Die Zellen innerhalb der Nekrose sind kollabiert, am rechten Rand sind kollabierte Parenchymzellen zu sehen, die extrazelluläres Material angelagert haben. = extrazelluläres Material Modifiziert übernommen aus Feindt (1977) dpi = Tage nach Infektion

30 Einleitung 1.6 Ziel der Arbeit Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Wechselwirkung zwischen dem Pilz Cercospora beticola und der Phenylalanin Ammonium Lyase (PAL) der Zuckerrübe untersucht. Als Ausgangspunkt diente eine Diplomarbeit von Brigitte Heberle, die bei der PLANTA GmbH, Einbeck durchgeführt wurde. Diese Arbeit setzte sich mit dem Verlauf der Transkription des pal-gens, einem wichtigen Resistenzfaktor in Pflanzen, nach Infektion der Zuckerrübe mit C. beticola auseinander (Heberle, 1998). B. Heberle stellte fest, daß die Transkriptmenge des Bvpal-Gens des Zuckerrübengenotyps 1K0088 in der frühen Phase der Infektion reduziert wird und darin möglicherweise die Ursache für die Anfälligkeit der Zuckerrübe gegenüber C. beticola liegt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst, die Allgemeingülitgkeit des Phänomen der transkriptionellen Repression des Bvpal-Gens in der Frühphase der Infektion von Zuckerrüben mit C. beticola zu prüfen. Außerdem sollten die erhaltenen, transkriptionellen Daten mit der tatsächlich vorliegenden Enzymaktivität des BvPAL-Proteins verglichen werden. Nachfolgend sollte der Bvpal-Promotor aus dem Zuckerrübengenom isoliert und charakterisiert werden. Der für das Repressionsphänomen verantwortliche Bereich sollte näher eingegrenzt und wenn möglich genau bestimmt werden. Die an den identifizierten Promotorbereich bindenden Proteine sollten identifiziert und isoliert werden. Mit Hilfe der gewonnen Erkenntnisse soll versucht werden, die Signalkette zur Aulösung des Repressionsphänomens aufzuklären