NMR-spektroskopische Untersuchung der Lithiumaggregate von organischen Verbindungen und von Cyclosporin A

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1 Zusammenfassung der wissenschaftlichen Ergebnisse zur Dissertation NMR-spektroskopische Untersuchung der thiumaggregate von organischen Verbindungen und von Cyclosporin A Der Fakultät für Chemie und Mineralogie der Universität Leipzig vorgelegt von Diplom Chemiker Beat Schneider im April 2010 Angefertigt im Institut für Analytische Chemie

2 Einleitung Die vorliegend Arbeit hatte zum Ziel, neue Erkenntnisse über neutrale organische Verbindungen und Cyclosporin A in der Gegenwart von thiumchlorid zu gewinnen. Der Grund hierfür ist zum einen, dass thiumsalze das Potential besitzen, organische Reaktionen auf vielerlei Arten, zu verbessern. Beispiele hiefür sind gesteigerte Ausbeute, niedrigere Reaktionstemperatur oder Druck, und Regio- bzw. Stereokontrolle. Vom Mechanismus dieser lithiumgestützen Reaktionen ist bis heute vieles nicht verstanden. Insbesondere die Wechselwirkung neutraler organischer Verbindungen mit thiumsalzen ist unklar. Abschließend wurden die Ergebnisse von zwei Substanzen (Benzaldehyd und L-Tyrosinmethylester) um DFT-Rechnungen erweitert. Die daraus gewonnenen Strukturen dienten zur Verifizierung und zur weiteren Interpretation der experimentellen Ergebnisse. Zum anderen war die einzigartige Wirkung von thiumchlorid auf Cyclosporin A insbesondere in den 1990er Jahren Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Weil die Konformationsänderung von Cyclosporin A bei der in vivo Aktivierung durch Cyclophilin und die durch die thiumchloridzugabe hervorgerufene Konformationsänderung sehr ähnlich sind, ist es in guter Nährung möglich, das Cyclosporin A-thiumchlorid-Modell als Mimikry für den Cyclosporin A-Cyclophilin-Komplex zu bezeichnen. Ergänzend zu den auf diesem Gebiet bereits veröffentlichten Arbeiten sollte hier überprüft werden, ob mit ilfe aktueller Spektrometertechnik und NMR-Experimente weitere Informationen zugänglich sind. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf eine mögliche Unterscheidung der Cyclophilin- Bindungsstelle (Amino-säuren 1-2 und 10-11) und dem Calcineurin-Interaktionsbereich (Aminosäuren 4 bis 8) mittels der verwendeten Methoden gelegt. Zusätzlich sollten Informationen über die Nähe der jeweiligen Cyclosporin A-Protonen zu den komplexierten thiumionen mittels ESY-Experimenten gewonnen werden. Insgesamt wurden 27 Verbindungen in TF d8 gelöst und in abgeschmolzenen Proben mit und ohne thiumchlorid untersucht. Es wurde dabei auf folgende NMR-spektroskopische Methoden zurückgegriffen: ESY, DSY, die Änderung der T 1 -Zeiten, die Änderung der chemischen Verschiebung, Job Plots und Titrationen.

3 Ergebnisse Im Folgenden werden die Ergebnisse von ausgesuchten Substanzen zum Teil wiedergegeben. Benzaldehyd Chemische Verschiebung Die Änderung der 1 -chemischen Verschiebung nach der Zugabe von thiumchlorid veranschaulicht die Auswirkung der sterischen inderung in der Umgebung der Aldehydgruppe. Der Einfluss auf die chemische Verschiebung nimmt von Benzaldehyd zu 2- Dimethylbenzaldehyd zu 2,6-Dimethylbenzaldehyd ab. Außerdem zeigt sich bei 2- Dimethylbenzaldehyd, dass die methylierte Seite wegen der sterischen inderung weniger stark beeinflusst ist. Abb. 1: Die Änderung der 1 -chemischen Verschiebung nach der Zugabe von thiumchlorid; alle Werte sind ((mit Cl)-(ohne Cl))*(-100) ppm Job Plot Der Job Plot von Benzaldehyd legt eine Stöchiometrie von 1:1 (Aldehyd:Cl) nahe. Außerdem konnte die Assoziationskonstante abgeschätzt werden; sie liegt im Bereich von 10 M -1. Abb. 2: Job Plot von Benzaldehyd

4 Die T 1 -Relaxationszeiten Die T 1 -Zeiten von Benzaldehyd haben sich durch die Zugabe von thiumchlorid alle verkleinert. Diese Änderung deutet auf eine Verlangsamung der Rotationsdiffusionszeit hin. Die Erklärung hierfür ist eine Erhöhung der Rotationsdiffusionszeit durch die Komplexierung von Benzaldehyd mit thiumchlorid und Tetrahydrofuran. Abb. 3: Die Änderung der T 1-Relaxationszeiten durch der Cl-Zugabe Die Diffusionskoeffizienten Auch die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten mittels DSY-Experimenten bestätigt die Annahme, dass sich die in der Lösung befindenden Aggregate durch die Zugabe des thiumsalzes vergrößert haben. Diffusion coefficients 1a (relative) D 1 Benzaldehyd allein ( ) 6.4 D 1 Benzaldehyd mitcl( ) 3.9 Abb. 4: Auf den Diffusionskoeffizienten von TMS normierte Diffusionskoeffizienten von Benzaldehyd Die Diffusionskoeffizienten dienten außerdem dazu, die Molmasse der Benzaldehyd-- Komplexe abzuschätzen.

5 + TF D D 1 2 M 2 = M 1 M 2 =360 g/mol 365 g/mol Abb. 5: Molmasse des Benzaldehyd--Komplexes nach Waldeck et al. A.R. Waldeck, P.W. Kuchel, A.J. Lennon, B.E. Capman, Prog. NMR Spectrosc. 1997, 30, Die ESY Experimente Zur Aufklärung der Struktur der thiumaggregate wurden ESY-Serien aufgenommen. Anschließend wurden die Integrale der einzelnen Signale in Abhängigkeit von der Mischzeit aufgetragen und die Steigungen entnommen. Diese Steigungen sind ein Maß für die relativen Abstände zwischen den thiumkernen und den jeweiligen Protonen und sie sind proportional zu 1/r 6. Abb. 6: ESY Aufbaukurven von Benzaldehyd Um die Ergebnisse unterschiedlicher Proben vergleichen zu können, wurden alle Steigungen durch den Wert des Wassersignals dividiert. Für das Aldehydproton ergab sich ein Wert von 0,74; für die o-protonen einer von 0,23; für die m-protonen einer von 0,17 und für das p- Proton ein Wert von 0,10. Um diese relativen Werte zu verifizieren und weiter zu interpretieren, wurden DFT-Rechnungen angefertigt.

6 distances in [ Å ] structure electronic energies (0.0 kj/mol) structure 2 distances in [ Å ] electronic energies (+2.2 kj/mol) Abb. 7: DFT-Strukturen der Benzaldehyd-thium-Komplexe (angefertigt von Dr. S. Immel, Universität Darmstadt) Die --Abstände wurden aus zwei berechneten Strukturen entnommen. Anschließend wurden, dem Molenbruch entsprechende, Durchschnittswerte der Abstände in den beiden DFT-Rechnungen bestimmt. Im nächsten Schritt wurde nach der besten Übereinstimmung zwischen den experimentellen ESY-Ergebnissen und den berechneten Durchschnittswerten gesucht. Der auf diese Weise ermittelte Molenbruch wurde in die Boltzmann-Formel eingesetzt und die korrespondierende Energiedifferenz zwischen den beiden Zuständen bestimmt. Dieser Wert beträgt 1,99 kj. Aus den DFT-Rechnungen konnte eine Energiedfifferenz der beiden Strukturen von 2,2 kj entnommen werden. Die experimentellen Daten passen somit hervorragend zu den berechneten Strukturen und die bestimmten Strukturen können als sehr wahrscheinlich angesehen werden. TYRSINMETYLESTER: In den Spektren von L-Tyrosinmethylester wurden zwei Signalsätze gefunden. Me N ppm ppm Abb. 8: Beide Signalsätze von L-Tyrosinmethylester (die aromatischen Protonen und die Protonen der C 2-Gruppe) Zur Aufklärung der Unterschiede zwischen den beiden Peakserien A und B wurden ESY- Serien aufgenommen und entsprechend der Experimente mit Benzaldehyd ausgewertet.

7 Abb. 9: Aufbaukurven von L-Tyrosinmethylester Die entnommenen Steigungen unterscheiden sich lediglich für ein Signal. Der Wert der Methoxyprotonen von Peakserie B beträgt 0,62 und derjenige der Serie A 0,11. Eine Erklärung für diesen Unterschied ist die Rotation der Estergruppe. Diese führt dazu, dass das thiumion entweder von der Aminogruppe und der Carbonylgruupe komplexiert wird (Peakserie B), oder von der Aminogruppe und der Methoxygruppe (Peakserie A). Nach etwa einem Monat hatte sich die Serie A vollständig in Serie B umgewandelt. Daraus lässt sich ableiten, dass der komplex A, aus thermodynamischer Sicht nicht stabil ist. Um die Rolle der ydroxygruppe in den thiumaggregaten zu klären, wurden Titrationen von L-Tyrosinmethylester und L- Phenylalaninmethylester durchgeführt. In diesen Experimenten wurde die thiumchloridkonzentration schrittweise erhöht. Abb.10: Titration von L-Tyrosinmethylester mit schrittweiser Erhöhung der -Konzentration

8 Bei L-Tyrosinmethylester ist die Änderung der chemischen Verschiebung der aromatischen Protonen zu Beginn der Titration sehr stark. Für die anderen Protonen ist der Verlauf der Titration linear. In der Titration des Phenylalaninesters verhielten sich alle Protonen identisch. Aus diesem Vergleich lässt sich schlussfolgern, dass im Fall von L-Tyrosinmethylester in einem Schritt ein thiumion an die Aminoesterfunktion koordiniert wird und in einem zweiten, die ydroxygruppe besetzt wird. In Übereinstimmung mit den anderen Experimenten (ESY, DSY, T 1 -Zeit-Bestimmung und die Änderung der 1 - und 13 C-chemischen Verschiebung) können die beiden folgenden Komplexe als sehr wahrscheinlich angesehen werden: Me Me 2 N 2 N 2a 2b Abb. 11: thiumkomplexe von L-Tyrosinmethylester Cyclosporin Bei der Untersuchung von Cyclosporin A wurden eindeutige Unterschiede zwischen der Cyclophilin-Bindungsstelle (Amino-säuren 1-2 und 10-11) und dem Calcineurin-Interaktionsbereich (Aminosäuren 4 bis 8) gefunden (Differenzen der 1 -/ 13 C-chemischen Verschiebung; Unterschied der T 1 -Zeiten und ESY-Experimente). Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, wonach thiumchlorid als Mimikry für Calcineurin in dem Komplex mit Cyclosporin A angesehen werden darf. Zusammenfassung Von den verwendeten Methoden haben sich die ESY-Experimente, die Job Plots und die Titrationen (konstante Stoffmenge der untersuchten Substanz und schrittweise Erhöhung der Stoffmenge von thiumchlorid) als besonders erfolgreich herausgestellt. Dies gilt vor allem für die Fälle, in denen zusätzlich berechnete Strukturen angefertigt wurden. Die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten hat sich als hilfreich herausgestellt, ist aber für die Abschätzung von Komplexmassen wegen des großen möglichen Fehlers nur in Verbindung mit anderen Methoden sinnvoll. Die Differenzen der 1 - und 13 C-Spektren waren in manchen Fällen als Ergänzung hilfreich, dennoch muss man sagen, dass es eher nicht möglich ist, daraus verlässliche strukturelle Informationen zu gewinnen. Ähnlich sind die T 1 -Zeiten einzuordnen. Sie liefern eher ergänzende inweise.