Wissenschaftlicher Ergebnisbericht

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1 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2004 Wissenschaftlicher Ergebnisbericht

2 2 Kurzfassung Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht des Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) wird alle zwei Jahre alternierend zum englischsprachige Research Report herausgeben. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat die Aufgabe, die Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großforschungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden- Württemberg) zu erfüllen. Das DKFZ hat diesen Bericht so konzipiert, daß neben dieser Aufgabe die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Der Research Report, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet, wurde 2003 für die Periode 2001 / 2002 erstellt. Der Bericht wurde nach den seit 2002 bestehenden sechs Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Die neue deutsche Rechtschreibung wurde von einer Reihe von Autoren angewandt. Eine Vereinheitlichung der Rechtschreibung wurde nicht vorgenommen, so daß beide Formen vorkommen. Die Berichte des DKFZ werden künftig in veränderter Form fortgeführt. Abstract The Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ, German Cancer Research Center) publishes alternating every year the Wissenschaftlicher Ergebnisbericht (in German) and the Research Report (in English). Both volumes are reports on the present state of research activities of the DKFZ as a National Research Center to the funding federal and state authorities [Federal Republic of Germany, Land (state) Baden-Württemberg]. Furthermore they shall inform colleagues and the scientifically interested public. The report is structured according to the center s six research programs. The last Research Report was published in The Reports of the DKFZ will be continued in a new form. In Germany a new orthography has been accepted. Some authors used the new form others the traditional one. The orthography was not standardized. Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002/2003 DKFZ 2004 Herausgeber: Deutsches Krebsforschungszentrum Postfach , D Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D Heidelberg Tel. (06221) 42-0; Fax (06221) Internet: Bearbeitung: Dr. Horst Metzler, Zentralbibliothek ( H.Metzler@DKFZ.de) Satz: DKFZ (Adobe Page Maker) Druck: Druckerei Dr. Johannes Hörning GmbH, Dischingerstr. 5, D Heidelberg Printed in the Federal Republic of Germany ISSN

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Vorwort... 5 Stellung und Auftrag... 7 Forschungsschwerpunkt Zell- und Tumorbiologie...14 Abteilung Zellbiologie (A010)...17 Embryologie (A015)...24 Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A020) Abteilung Molekularbiologie der Zelle II (A030)...29 Abteilung Entwicklungsgenetik (A040) Abteilung Molekulare Embryologie (A050) Abteilung Pathochemie (A060) Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (A070)...44 Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (A080)...47 Abteilung Tumorbiochemie (A090) Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (A100)...59 Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion (A105)...64 Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese (A110) Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung Strukturelle Genanalyse (A120)...70 Modellversuche zur Tumorinvasion und Metastasierung (A125) Arbeitsgruppe Epigenetik (A130) Biochemische Zellphysiologie (A135) Arbeitsgruppe Eicosanoide und Epitheliale Tumorentwicklung (A140) Differenzierung von normaler und neoplastischer Epidermis (A145)...87 Systembiologie der Signaltransduktion (A150) Arbeitsgruppe Redoxregulation (A160) Arbeitsgruppe Molekulare Stoffwechselkontrolle (A170) Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (V270) Forschungsschwerpunkt Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung Medizinische und Biologische Informatik (B010) Abteilung Molekulare Biophysik (B020) Abteilung Tumorgenetik (B030) Abteilung Biophysik der Makromoleküle (B040) Abteilung Molekulare Genomanalyse (B050) Molekulargenetik des Mammakarzinoms (B055) Abteilung Molekulare Genetik (B060) Abteilung Funktionelle Genomanalyse (B070) Abteilung Theoretische Bioinformatik (B080) Zentrale Spektroskopie (B090) Zentrale Proteinanalytik (B100) Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (B120) Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C010) Abteilung Klinische Epidemiologie (C020) Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie (C030) Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese (C040) Abteilung Molekular-Genetische Epidemiologie (C050) Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) (C060) Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (M019) Stabsstelle Krebsprävention (M050)

4 Inhaltsverzeichnis 4 Forschungsschwerpunkt Tumorimmunologie Abteilung Zelluläre Immunologie (D010) Abteilung Immunchemie (D020) Abteilung Immungenetik (D030) Apoptose-Regulation (D040) Abteilung Molekulare Immunologie (D050) Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D060) Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D070) Arbeitsgruppe Angeborene Immunität (D080) Forschungsschwerpunkt Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung Radiologie (E010) Abteilung Medizinische Physik in der Radiologie (E020) (früher Biophysik und medizinische Strahlenphysik) Abteilung Radiopharmazeutische Chemie (E030) Abteilung Medizinische Physik (E040) Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050) Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060) Abteilung Molekulare Toxikologie (E080) Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (E090) Toxikologie und Chemotherapie (E100) Gentherapie von Tumoren (E110) Pharmakologie der Krebsbehandlung (E120) Rekombinante Antikörper (E130) Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie/Onkologie (E160) Klinische Kooperationseinheit Molekulare Onkologie/Pädiatrie (E170) Klinische Kooperationseinheit Gastroenterologische-Onkologie (E180) Zentrales Tierlabor (ZTL, V230/V231) Forschungsschwerpunkt Infektion und Krebs Abteilung Tumor Virologie (F010) Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese (F020) Abteilung Virale Transformationsmechanismen (F030) Projektgruppe Pathogenitätsmechanismen (F040) Zellzykluskontrolle und Carcinogenese (F045) Zelldifferenzierung (F050) Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (F060) Molekulare Therapie virusassoziierter Tumore (F065) Abteilung Tumorvirus-Charakterisierung (F070) Retrovirale Genexpression (F080) Autoren Schlagwortindex Nachwort

5 Vorwort Vorwort Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg legt hiermit seinen Wissenschaftlichen Ergebnisbericht für die Jahre 2002/2003 vor. Auch in den zurückliegenden Jahren hat sich das DKFZ dynamisch weiterentwickelt. Der aufstrebende Schwerpunkt Genomforschung verfügt mit dem Bezug eines neuen Gebäudes im Neuenheimer Feld nun über hervorragende Arbeitsbedingungen. Mit dem Theodor-Boveri-Nachwuchsprogramm haben wir ein wertvolles neues Förderinstrument für hochqualifizierte Nachwuchswissenschaftlerinnen und Nachwuchswissenschaftler eingeführt. Mittlerweile konnten vier exzellente Kandidaten die ersten Gruppen etablieren. Gemeinsam mit dem Universitätsklinikum Heidelberg und der Thoraxklinik in Rohrbach wurde das Comprehensive Cancer Center Heidelberg in Angriff genommen. Dieses ehrgeizige Projekt soll nicht nur die Basis für die Versorgung von Krebspatienten im Heidelberger Raum grundlegend verbessern, sondern auch neue Voraussetzungen für die präklinische Krebsforschung schaffen. Wir erhoffen uns daraus entscheidende Impulse für die Übertragung von Erkenntnissen aus den Forschungslabors in neue diagnostische und therapeutische Anwendungen in der Onkologie. Durch das Inkrafttreten der Programm-orientierten Forschung innerhalb der Helmholtz-Gemeinschaft werden unsere wissenschaftlichen Arbeiten nach einem neuen System begutachtet. Die erste Evaluationsrunde wurde dabei sehr erfolgreich absolviert. Schließlich ist als markanter Einschnitt über die Verabschiedung von Herrn Professor Harald zur Hausen als Wissenschaftlicher Stiftungsvorstand nach über 20-jährigem, segensreichem Wirken für das DKFZ zu berichten. Er hat dem Zentrum ein Vermächtnis hinterlassen, welches uns mit großem Optimismus in die Zukunft blicken lässt. Der Bericht informiert über die in den vergangenen beiden Jahren gewonnenen Ergebnisse und Fortschritte der Arbeiten im Rahmen des Forschungsprogrammes des DKFZ. Damit wollen die Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen auch gegenüber dem Kuratorium, den Zuwendungsgebern und den Parlamenten Rechenschaft über ihre Forschungsarbeit ablegen. Die zusammenfassenden Darstellungen wenden sich darüber hinaus an die wissenschaftlich interessierte Öffentlichkeit und dienen dem Überblick über die am DKFZ vertretenen Forschungsrichtungen für Studenten und Wissenschaftler, die eine Mitarbeit im DKFZ erwägen. Neben der durch die kurzen Artikel gegebenen Übersicht bieten die dazu zitierten Publikationen dem an Einzelheiten interessierten Leser die Möglichkeit zur Vertiefung der Information. Eine vollständige Liste aller Veröffentlichungen der Mitarbeiter des DKFZ wird jährlich in Buchform und im Internet vorgelegt. Wir hoffen, daß dieser Wissenschaftliche Ergebnisbericht dazu beiträgt, die von den Mitarbeitern und Kooperationspartnern des Deutschen Krebsforschungszentrums erarbeiteten Ergebnisse über den Kollegenkreis hinaus zu verbreiten. 5 Prof. Dr. med. Otmar D. Wiestler Vorsitzender des Stiftungsvorstands

6 Organigramm 6 Kuratorium Vorsitzender MinDirig. Priv. Doz. Dr. rer. nat. Peter Lange Bundesministerium für Bildung und Forschung Stellvertretender Vorsitzender MinDirig. Dr. phil. Heribert Knorr Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg Vorsitzender des Wissenschaftlichen Komitees Prof. F. Ralf Peterson MD, PhD Stabsstellen Presse- und Öffentlichkeitsarbeit Dr. med. Julia Rautenstrauch! Krebsprävention Dr. med. Martina Pötschke-Langer! Sicherheit Dipl.-Ing Edgar Heuss! Innenrevision Dipl. Kfm. Dietmar Elspaß! Zentrale Einrichtungen Zentralbibliothek Dr. phil. nat. Horst Metzler! Zentrales Tierlabor Dr. med. vet. Uwe Zillmann! Zentrale Datenverarbeitung Dr. rer. pol. Kurt Böhm! Stiftungsvorstand Vorsitzender und Wissenschaftliches Mitglied Prof. Dr. med. Otmar D. Wiestler! Administrativ-kaufmännisches Mitglied Dr. rer. pol. Josef Puchta! Forschungsschwerpunkte Zell- und Tumorbiologie Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs! Funktionelle und strukturelle Genomforschung Sprecherin: Prof. Dr. (PhD) Annemarie Poustka! Krebsrisikofaktoren und Prävention Sprecher: Prof. Kari Hemminki MD, PhD! Tumorimmunologie Sprecher: Prof. Dr. med. Peter Krammer! Innovative Krebsdiagnostik und - therapie Sprecher: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Wolfhard Semmler! Infektion und Krebs Sprecher: Prof. Dr. (PhD) Jean Rommelaere! Wissenschaftlicher Rat Vorsitzender Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Wolfhard Semmler! / Verwaltung Leiter Dr. jur. Wolfgang Henkel! Admin. Projektmanagement/Gremien Bettina Crispin! Personal- und Sozialwesen Klaus Pregartner! Finanz- und Rechnungswesen Winfried Schwarz! Beschaffung/Materialwirtschaft Dr. jur. Rolf Zimmermann! Technik Dr. Ing Carsten Wildemann! Technologie Transfer Büro Dr. rer. nat. Ruth Herzog! FAX R.Herzog@DKFZ.de Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) in der Helmholtz-Gemeinschaft Postfach , D Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D Heidelberg! (Zentrale); FAX Internet: (Stand:Januar 2004)

7 Stellung und Auftrag Einführung Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), Stiftung des öffentlichen Rechts des Landes Baden-Württemberg, wurde 1964 mit Sitz in Heidelberg gegründet. Als eine überregionale Forschungseinrichtung ist das DKFZ Mitglied der Hermann von Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) und wird im Rahmen der institutionellen Förderung finanziell zu 90% vom Bund und zu 10 % vom Bundesland Baden-Württemberg getragen. Seit 1977 ist das DKFZ Mitglied der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Darüber hinaus wird ein wesentlicher Anteil der Projekte durch Mittel der Projektförderung finanziert. Das Ziel der Stiftung Krebs ist ein weltweites Problem von enormem Ausmaß. Auch wenn sich seit den 90er Jahren mit dem leichten Rückgang der Krebssterblichkeit eine mögliche Trendwende in Deutschland anzeigt, wird unter Berücksichtigung der steigenden Lebenserwartung voraussagbar jede dritte lebende Person an Krebs erkranken und jede vierte an Krebs sterben. Der klar definierte und programmorientierte Forschungsauftrag des Zentrums läßt sich daher wie folgt umreißen: 1. Erforschung der Krebsursachen 2. Identifizierung von Krebsrisikofaktoren 3. Verbesserung der Krebsvorbeugung 4. Verbesserung der Frühdiagnostik von Krebserkrankungen 5. Optimierung der Krebstherapie und Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Die Organe der Stiftung sind: Das Kuratorium überwacht die Rechtmäßigkeit, Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit der Führung der Stiftungsgeschäfte. Es besteht aus Vertretern des Bundes und des Landes Baden-Württemberg, der Universität Heidelberg, Mitarbeitern der Stiftung sowie dem Wissenschaftlichen Komitee, welches aus externen Fachwissenschaftlern zusammengesetzt ist. Das Wissenschaftliche Komitee bereitet die Entscheidungen des Kuratoriums in allen wissenschaftlichen Angelegenheiten vor und trägt die Verantwortung für die fortlaufenden Ergebnisbewertungen der Forschungsschwerpunkte und Abteilungen durch wissenschaftliche Begutachtungen. Der Stiftungsvorstand leitet die Stiftung und setzt sich aus einem wissenschaftlichen Mitglied (Vorsitz) und einem kaufmännisch-administrativen Mitglied zusammen. Der Wissenschaftliche Rat ist ein DKFZ-internes Gremium zur Beratung des Stiftungsvorstands und des Kuratoriums in allen bedeutsamen wissenschaftlichen Angelegenheiten. Erforschung der Krebsursachen Die Krebsforschung hat in den letzten Jahren stark von der Entdeckung der genetischen Grundlagen der Krebserkrankungen profitiert. Dennoch stellt die detaillierte Aufklärung der molekularen Ereignisse bei der Entstehung eines Tumors nach wie vor eine große Herausforderung in der Krebsforschung dar. Eingeleitet wird die Entartung zur Krebszelle durch eine Veränderung im Erbgut und den damit verbundenen Folgen im funktionellen Zellgeschehen. Entgeht die so veränderte Zelle einer Erkennung durch das Immunsystem, wird in der nächsten Zellteilung die mutierte Information an die Tochterzellen weitergegeben. In den folgenden Zellzyklen können sich schrittweise weitere Mutationen akkumulieren. Wenn schließlich einzelne veränderte Zellen den Primärtumor über angrenzende Blut- oder Lymphgefäße verlassen und sich an anderer Stelle im Körper ansiedeln, ist es zu der in der Klinik so gefürchteten Metastasierung gekommen. Eine vergleichende Analyse der genetischen Veränderungen von Tumoren gibt Hinweise darauf, daß unterschiedliche Krebserkrankungen auf verschiedenartigen Mustern von Genveränderungen beruhen. Hinter dem eingängigen Begriff Krebs versteckt sich somit die Tatsache, daß es sich um viele unterschiedliche Erkrankungen handelt, von denen jede über ihre eigenen Charakteristiken verfügt. Aus der Entschlüsselung der zentralen Ereignisse bei der Entstehung von Tumoren und bei der Metastasierung werden neue Ansatzpunkte sowohl für eine verbesserte Diagnostik wie auch für die gezielte Entwicklung neuer Therapien erwartet. In den letzten Jahren haben Untersuchungen der Differenzierung embryonaler Zellen zur Identifizierung von Entwicklungskontrollgenen geführt, die zum Verständnis von pathophysiologischen Ereignissen in der Zelldifferenzierung beigetragen haben. Auch in Zukunft verspricht die Entwicklungsgenetik weitere, wertvolle Anhaltspunkte für die Krebsforschung. Über die Identifizierung von neuen Krankheitsgenen hinaus bietet die Analyse des Expressionsprofils embryonaler Entwicklungsvorgänge auch Potential für medizinische Anwendungen, wie beispielsweise im Stammzellbereich. Da umgekehrt die Transformation einer Zelle zur Krebszelle als Auflösung der Alterungsvorgänge verstanden werden kann, wird gleichermaßen aus der Analyse der genetischen Steuerung von Alterungsprozessen mit aufschlußreichen Erkenntnissen für die Krebsforschung gerechnet. Gegenwärtig wird im Zentrum zudem den Mechanismen der Metastasierung sowie der Tumorangiogenese, der Induktion der Gefäßversorgung eines Tumors, großes Interesse entgegen gebracht. Die Aufklärung beider Prozesse profitiert stark von weitreichenden Kenntnissen über krebsrelevante Signaltransduktionsprozesse und vom zunehmenden Verständnis für die Regulation der Genexpression. Gemeinsam mit den grundlagenwissenschaftlichen Disziplinen wie der Zellbiologie, der Histologie und den Techniken der Molekularbiologie soll Einblick in die Mechanismen erlangt werden, mit deren Hilfe in Zukunft dem Tumor die notwendige Anbindung an die Gefäßversorgung des Körpers unterbunden werden soll. Aus dem Human-Genom-Projekt liegt umfangreiches Datenmaterial aus den DNA-Sequenzanalysen vor. Um eine sinnvolle Interpretation dieser Informationen im Kontext von Ereignissen wie Krankheit, Alterung oder Tumorgenese zu ermöglichen, sind den jeweiligen physiologischen Rahmenbedingungen angepaßte funktionelle Testsysteme erforderlich. Da auf zellulärer Ebene Proteine die eigentlichen Funktionsträger sind, muß bei der Analyse der veränderten Genexpression konsequenterweise die Frage nach qualitativen und quantitativen Unterschieden in der Proteinbiosynthese berücksichtigt werden. In jüngerer Zeit sind verschiedene Verfahren zur umfassenden Untersuchung von Proteinen im Kontext von physiologischen Fragestellungen unter dem Begriff Proteomics zusammengefaßt worden. Die Mutation in der DNA-Kodierung eines bestimmten Proteins wirkt sich in krebsrelevanten Ereignissen nicht nur auf die posttranslationale Modifizierung und Aktivität anderer Proteine aus, sondern beeinflußt auch deren relative Konzentration. Der Analyse 7

8 8 Einführung von Protein-Expressionsmustern in der Krebsforschung wird daher im Hinblick auf die Analyse von Ereignissen bei Tumorgenese und Metastasierung große Bedeutung beigemessen. Die Erfahrungen im genomischen Informationsmanagement im Zentrum werden der Auswertung des zu erwartenden umfangreichen Datenmaterials aus den Proteomics zu Gute kommen. Die frühzeitig erfolgte, aktive Förderung der Genomforschung im Zentrum hat bereits ausgezeichnete Entwicklungen hervorgebracht, hier sind insbesondere die DNA- Chip-Technologie wie auch die Entwicklung zytogenetischer Techniken (Matrix-CGH) zu erwähnen. Gegenwärtig profitieren von dieser nicht nur die biomedizinische Grundlagenforschung, sondern auch epidemiologische Forschungsansätze. Virale Onkogene beeinflussen die Zellproliferation. Sie werden gleichzeitig durch intrazelluläre und extrazelluläre Kontrollmechanismen in ihrer Expression reguliert. Da bei Krebserkrankungen durch Viren in der Regel Mutationen in den zellulären Regulationsgenen vorliegen, wird daher im Zentrum auch der Entschlüsselung von genetischen bzw. epigenetischen Kontrollmechanismen nachgegangen. Ferner existiert im Zentrum ein Programm zur Identifizierung von neuen, noch nicht als tumorigen beschriebenen Viren und deren molekulargenetischer Charakterisierung. Identifizierung von Krebsrisikofaktoren und Verbesserung der Krebsvorbeugung Als Ursache von Krebserkrankungen sind genetische Veränderungen im Erbgut wie Mutationen, Infektionen, Einwirkung Strahlen oder Chemikalien nachgewiesen worden. Die Krebsvorbeugung erfordert daher eine rationale Strategie zur Aufklärung von Krebsrisikofaktoren und wurde frühzeitig als eine besonders wichtige Aufgabe des Deutschen Krebsforschungszentrums definiert. Bei der Prävention von Krebserkrankungen gewinnen zwei Bereiche Bedeutung, dies sind zum einen vorbeugende Impfungen bei Virus-bedingten Krebserkrankungen sowie die sogenannte Chemoprävention. Die Entwicklung von präventiven Impfstoffen gegen humanpathogene Viren ist im DKFZ fest etabliert. In der sogenannten Chemoprävention steht die Identifizierung von pharmakologisch wirksamen Substanzen mit dem Ziel, eine potentiell mögliche Tumorgenese zu verhindern, im Vordergrund. Die zunehmende Anzahl neu isolierter Verbindungen aus verschiedenen Nahrungsmitteln gibt Hoffnung auf ihren künftigen Einsatz zum Schutz gegen Krebs. Ergänzung finden diese Untersuchungen in der breit angelegten Studie Gesundheit, Ernährung und Krebs, die Teil der großen europäischen EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition)-Studie ist und die Zusammenhänge zwischen Ernährungsgewohnheiten und Krebs in verschiedenen Ländern Europas erforscht. Neben Ernährungsfaktoren wird in der Studie auch der Einfluß von Alkohol- und Tabakkonsum sowie der Lebensstil erfaßt. Wissenschaftler des DKFZ sind aktiv an der Durchführung und Auswertung der Heidelberger Komponente dieser Studie beteiligt, die allein Personen einschließt. In Untersuchungen zu umweltrelevanten Krebsursachen werden Wechselbeziehungen zwischen krebserzeugenden Stoffen und genetischen Faktoren berücksichtigt. Die Aufklärung der Bevölkerung über die Risiken des Tabakkonsums ist seit einigen Jahren aktiver Bestandteil des Forschungsprogramms im DKFZ und umfaßt Befragungen von Schülern zu Rauchverhalten, Passivrauchen und Gesundheitsproblemen, die Gründung eines wissenschaftlichen Netzwerks zur Tabak- und Krebsprävention und den Aufbau eines nationalen Rauchertelefons zur Raucherentwöhnung. Mit der Einrichtung des Krebsinformationsdienstes (KID) und eines Krebs-Schmerztelefons werden über den Stiftungsauftrag hinausgehende, projektfinanzierte Aufgaben der nationalen Gesundheits-fürsorge wahrgenommen. Diagnostik und Therapie - Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Im Hinblick auf eine Optimierung der Krebstherapie und die erforderliche Entwicklung neuer effizienter Konzepte in der Krebsbehandlung wird die Interaktion zwischen den grundlagenwissenschaftlich orientierten Disziplinen im Zentrum und den behandelnden Ärzten in der Klinik als wichtige Schnittstelle angesehen, da nur so ein direkter Transfer wissenschaftlicher Erkenntnisse in die klinische Anwendung möglich ist. Im Zentrum wurde daher ein Konzept zur Etablierung von klinischen Kooperationseinheiten aufgelegt, deren weiterer Ausbau in den nächsten Jahren als eine wichtige Aufgabe gesehen wird. Neben einem Kooperationsprojekt mit der Chirurgischen Klinik der Universität Heidelberg sind gegenwärtig fünf klinische Kooperationseinheiten im DKFZ etabliert. Aus der Zusammenarbeit des Zentrums mit der GSI in Darmstadt und dem Forschungszentrum Rossendorf ist ein strahlentherapeutischer Ansatz hervorgegangen: Inzwischen wurden Schwerionenstrahlen zur Behandlung sonst nur mit unbefriedigenden Ergebnissen zu therapierender Tumoren eingesetzt. Dieses innovative Verfahren gestattet es, auch tiefliegende Tumore, wie Glioblastome, ohne Beschädigung des umliegenden Nervengewebes zu bestrahlen. Bislang hat die eingeschränkte Kapazität der Pilotanlage nur eine Behandlung von 30 Patienten pro Jahr erlaubt, der Aufbau einer entsprechenden Anlage durch die Universitätsklinik Heidelberg ist begonnen. Weiterhin wird im Rahmen neuartiger Entwicklungen in der Medizintechnik die Visualisierung von CT-, MR- und Ultraschall- Darstellungen, die gleichzeitig eine interventionelle Steuerung zulassen, verfolgt. Von der Gen- und Immuntherapie, d.h. der Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten mittels Gentransfer, wurde lange Zeit erwartet, daß sie Möglichkeiten zu einer gezielten und lokalisierten Behandlung eröffnet. In der jüngeren Vergangenheit sind im Hinblick auf eine verbesserte Genvektortechnologie einige Fortschritte erzielt worden, die damit verbundenen Erwartungen lassen die Gen- und Immuntherapie wieder in eine größere Anwendungsnähe rücken. Im Zentrum werden dazu in erster Linie die Helferunabhängigen Parvoviren sowie Adeno-assoziierte Viren, Herpes-Viren, HI- und Spumaviren verwendet. Die Entwicklung therapeutischer Strategien wird voraussichtlich in den nächsten Jahren von aktuellen Erkenntnissen zum programmierten Zelltod, der Apoptose, profitieren können. Auf diesem Gebiet ist der Transfer herausragender Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in anwendungsorientierte Fragestellungen gelungen: Er führte nicht nur zu einem Einblick in die Pathogenese von AIDS und Sepsis, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Schlaganfällen, die gegenwärtig auf ihre generelle Anwendbarkeit überprüft

9 Einführung werden. Mit der Entdeckung der TRAIL-induzierten Apoptose (TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie) haben sich auch für die Krebstherapie wertvolle Möglichkeiten für vielversprechende therapeutische Ansätze ergeben: TRAIL induziert den Zelltod in Tumorzellen, wohingegen eine Wirkung auf normale Körperzellen, mit Ausnahme der Leber, nicht nachweisbar ist; ein Ansatz, der in Zukunft für die Entwicklung rationaler Therapien ausgeschöpft werden soll. Die Kenntnis der Ursachen ist eine grundlegende Voraussetzung für die Frühdiagnostik ebenso wie für die Entwicklung neuer Konzepte und Strategien in der Krebstherapie. Sie ist neben der Erfassung der Krebsrisikofaktoren auch entscheidend für Entwicklungen auf dem Gebiet der Krebsvorbeugung. Da Probleme der Krebsforschung im Zusammenwirken vieler für die Krebsforschung relevanter Fachrichtungen besser bearbeitet werden können, wird das gemeinsame Forschungsziel mit dem jeweiligen Instrumentarium der einzelnen wissenschaftlichen Disziplinen angegangen. Vor diesem Hintergrund hat sich das Forschungsprogramm des DKFZ entwickelt und wird konsequent fortgeführt. Die Forschungsaufgaben werden von 50 Abteilungen und zeitlich befristeten Abteilungen sowie von Projekt- und Arbeitsgruppen im Rahmen der Forschungsschwerpunkte wahrgenommen. Die Mehrzahl der Abteilungsleiter wurde dabei gemeinsam mit der Universität Heidelberg berufen. Unterstützt werden die Projekte und die Arbeit der Abteilungen durch die Zentralen Einrichtungen und Dienste wie Tierlabor, Zentralbibliothek, Strahlenschutz und Dosimetrie, Histodiagnostik, Cytometrie, Tumorbank, Spektroskopie, Proteinanalytik, Biostatistik, Zentrale Datenverarbeitung und verschiedene Informationssysteme sowie durch die Abteilungen der Verwaltung. Für die kommenden Jahre werden durch den multidisziplinären Einsatz des Forschungspotentials, konzentriert auf die Forschungsschwerpunkte, vielversprechende Möglichkeiten gesehen, in der Analyse der Tumorentstehung und -entwicklung sowie in Krebsdiagnostik und -therapie wesentliche Fortschritte zu erreichen. Gegenwärtig werden die vielfältigen Aufgaben in der Krebsforschung und Prävention im Rahmen von sechs (bis 12/ 02 acht) Forschungsschwerpunkten wahrgenommen. Forschungsschwerpunkte des DKFZ (A) Zell- und Tumorbiologie (B) Funktionelle und Strukturelle Genomforschung (C) Krebsrisikofaktoren und Prävention (D) Tumorimmunologie (E) Innovative Krebsdiagnostik und -therapie (F) Infektion und Krebs In der Haushaltsplanung sind für die Forschungsarbeiten 2004 ein Personaleinsatz von 1440 Personenjahren (PJ) und ein Finanzmitteleinsatz von 129,6 Mio Euro vorgesehen. Nationale und internationale Zusammenarbeit Der nationalen und internationalen Zusammenarbeit widmet das Zentrum besondere Aufmerksamkeit. So weist dieser Ergebnisbericht über 900 Kooperationen mit Wissenschaftlern in 45 Ländern aus. Daraus resultiert auch der hohe Anteil (etwa 60%) von gemeinsamen Veröffentlichungen aus dem DKFZ mit anderen Forschungsinstituten. Erwähnt seien hier national die Kooperationen innerhalb der DFG-Sonderforschungsbereiche 352 Molekulare Mechanismen intrazellulärer Transportprozesse, 405 Immuntoleranz und ihre Störungen, 601 Molekulare Genese hepato-gastroenterologischer Erkrankungen, 414 Informationstechnik in der Medizin - Rechner- und sensorgestützte Chirurgie, sowie im Tumorzentrum Heidelberg/ Mannheim und mit weiteren Instituten und Forschungsstätten im Heidelberger Raum. Einzelkontakte bestehen zu über 60 Universitäten und außeruniversitären Forschungsinstituten in der Bundesrepublik Deutschland. Als HGF-Zentrum ist das DKFZ Mitglied im Forschungsverbund Gesundheit der sich in drei Forschungsbereiche gliedert: die biomedizinische Forschung, die Medizintechnik und den Bereich Public Health. Der Forschungsverbund Gesundheit wird sich auf HGF-Ebene medizinischen Fragestellungen widmen, die wissenschaftliche Netzwerke und interdisziplinäre Ansätze zu ihrer Bearbeitung erfordern. Das DKFZ war am Aufbau der 1980 gegründeten Sektion und heutigen Arbeitsgemeinschaft Experimentelle Krebsforschung (AEK) der Deutschen Krebsgesellschaft deutlich beteiligt und veranstaltet alternierend zum Deutschen Krebskongreß alle zwei Jahre AEK-Symposien in Heidelberg, die ein Diskussionsforum der verschiedenen Sektoren der experimentellen und klinischen Krebsforschung darstellen. Die internationale Zusammenarbeit entwickelt sich ebenfalls in erfreulicher Weise weiter und wurde durch aktive Zusammenarbeit im Rahmen der Organisation of European Cancer Institutes (OECI) verstärkt. Diese Organisation, die zur Zeit etwa 70 europäische Krebszentren umfaßt, hat insbesondere auf dem Gebiet der Datenverarbeitung und -übertragung eine enge Kooperation begonnen und gleichzeitig den Ausbau von Krebsinformationsdiensten, vor allem auch im osteuropäischen Raum vorgesehen. Darüber hinaus ist das DKFZ Mitglied der UICC (International Union against Cancer). Nach gemeinsamem Beschluß der UICC wird die Herausgabe des International Journal of Cancer, einer internationalen Fachzeitschrift auf dem Gebiet der Krebsforschung, ab dem Jahre 2000 an das DKFZ übertragen. Wissenschaftler des DKFZ arbeiten in der EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer), der EACR (European Association for Cancer Research) und in der WHO (World Health Organization) mit. Mit der IARC (International Agency for Research on Cancer) der WHO in Lyon, Frankreich, arbeitet das DKFZ eng zusammen. Die Projekte der Forschungskooperation mit dem MOS (Ministry of Science) Israels wurden von Gutachtern hervorragend beurteilt und werden fortgesetzt bzw. erweitert werden. Weiter bestehen besondere institutionalisierte Kooperationen mit dem NCI (National Cancer Institute) der USA. Durch Aufnahme einer Forschergruppe, die gleichzeitig zum INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) gehört, sollen die traditionell guten Kontakte zu französischen Forschern in Universitäten und CNRS (Centre Nationale de la Recherche Scientifique) weiter vertieft werden. Mit verschiedenen Einrichtungen der Volksrepublik China und dem Chulabhorn Research Institute, Thailand, bestehen Kooperationsverträge. Im Rahmen der deutsch-japanischen Forschungskooperation wird die wissenschaftliche Zusammenarbeit durch den Aus- 9

10 10 Einführung tausch von Wissenschaftlern weiter intensiviert und durch die Organisation Deutsch-Japanischer Workshops (beispielsweise 1996 in Heidelberg, 1998 in Kumamotu, Japan) unterstützt. Gemeinsame Forschungsarbeiten von Wissenschaftlern aus Indien und dem DKFZ werden fortgesetzt. In Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Kooperationsprojektes zwischen dem DKFZ und der Semmelweis Universität in Budapest werden Kurse und Austauschprogramme zur Harmonisierung der Ausbildung medizinischer Doktoranden in Ungarn durchgeführt. Die internationalen Kooperationen werden erheblich durch Gastaufenthalte von Wissenschaftlern aus aller Welt ( Gäste aus 38 Ländern, Gäste aus 37 Ländern) gefördert. Aufgrund der begrenzten Finanzierungsmöglichkeiten mußte die Anzahl der DKFZ-finanzierten Gastwissenschaftleraufenthalte trotz stetig steigender Nachfrage leicht abgesenkt werden. Das DKFZ bemüht sich, trotz dieser Problematik insbesondere den Staaten Osteuropas und Asiens durch Gastwissenschaftler-Finanzierungen Hilfestellung zu leisten. Die Förderung gemeinsamer wissenschaftlicher Projekte im Rahmen der Europäischen Union hat darüber hinaus zu zahlreichen Kooperationen mit Forschern anderer Länder der Gemeinschaft geführt, die hier nicht im Detail aufgeführt werden. Prüfung und Bewertung des Forschungsprogramms Das Forschungsprogramm des DKFZ unterliegt einer permanenten Überprüfung: Die internen Begutachtungen finden auf der Basis von Präsentationen sämtlicher Abteilungen eines Forschungsschwerpunktes (etwa alle zwei Jahre für jede Abteilung) statt. Diese Präsentationen sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen führen zu einer vergleichenden Bewertung der Qualität der wissenschaftlichen Arbeit der Abteilungen, welche unter Berücksichtigung des Erfolgs bei der Drittmitteleinwerbung Einfluß auf die Höhe der leistungsabhängigen Mittelzuweisung an die Abteilungen hat. Nach den internen Begehungen wird auch beraten, welche der laufenden Forschungsaktivitäten in dem Ausmaß der Förderung oder in der Laufzeit begrenzt werden sollen. Bei den externen Begutachtungen der Forschungsschwerpunkte (alle 5 Jahre) werden unter der Federführung des Wissenschaftlichen Komitees des Kuratoriums des DKFZ unabhängige, wissenschaftlich besonders ausgezeichnete und überwiegend ausländische Gutachtergruppen benannt. Während der 2-tägigen Begutachtung machen sich die Gutachter durch eine Vielzahl von Gesprächen mit Mitgliedern der jeweiligen Abteilungen und durch die Präsentationen des Forschungsschwerpunktes ein Bild über die wissenschaftliche Qualität der betreffenden Abteilungen. Die Eindrücke dieser Gespräche sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen dienen dann als Basis für die Erstellung des schriftlichen Gutachtens. Struktur und Stellung des Wissenschaftlichen Ergebnisberichts Die Arbeiten der Wissenschaftler des DKFZ werden in wissenschaftlichen Zeitschriften, Sammelbänden, Monographien und durch Beiträge zu Kongressen sowie Vorträge veröffentlicht. Die Literaturliste wird jährlich in den Veröffentlichungen des DKFZ als Buch und im Internet ( publiziert. Das DKFZ erstellt jährlich einen zusammenfassenden wissenschaftlichen Bericht für die zurückliegenden zwei Jahre: Alternierend den Wissenschaftlichen Ergebnisbericht und den englischen Research Report. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat primär die Aufgabe, eine Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großforschungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden-Württemberg) zu erfüllen. Das DKFZ hat diesen Bericht von Anfang an so konzipiert, daß neben diesen Adressaten die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Seit 1986 wird ein englischer Research Report erstellt, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet. Die letzte Ausgabe des Research Reports erschien 2003 für die Jahre 2001/2002. Die Berichte werden nach den Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Stabsstelle Presse- und Öffentlichkeitsarbeit Aufgaben der Stabsstelle Presse- und Öffentlichkeit sind im Rahmen der externen Kommunikation die Zusammenarbeit mit den Medien und die Information der Öffentlichkeit über Aktivitäten und Ergebnisse des DKFZ. Darüber hinaus obliegen der Abteilung die Betreuung von Besuchern, die Organisation von Veranstaltungen, die Herausgabe von Informationsschriften für verschiedene Zielgruppen sowie derzeit die vollständige Neukonzeption des Web- Auftritts des Zentrums. Pressearbeit, Anfragen In den Jahren 2002 und 2003 wurden rund 100 Pressemitteilungen herausgegeben und 26 Pressespiegel zusammengestellt. Die über das DKFZ veröffentlichten Beiträge in Printmedien erreichten eine Gesamtauflage von über 250 Millionen. Journalisten wurden zu vier Pressekonferenzen eingeladen. Bei einem Hintergrundgespräch für Journalisten informierten Stiftungsvorstand und einige Wissenschaftler über aktuelle Entwicklungen des Hauses, das gemeinsam mit dem Universitätsklinikum Heidelberg und der Thoraxklinik Heidelberg eingerichtete Comprehensive Cancer Center und die neuen Boveri-Nachwuchsgruppen. Im Berichtszeitraum wurden rund 1400 Presseanfragen bearbeitet, die zu zahlreichen Interviews, Hintergrundgesprächen oder Filmaufnahmen führten. Aus der Bevölkerung kamen über 2000 Anfragen nach Informationen oder Schriften, die bearbeitet wurden. Veröffentlichungen Im Berichtszeitraum erschienen acht Ausgaben von einblick, der Zeitschrift des DKFZ. Sie wird insbesondere an externe Abonnenten verschickt. Für die interessierte Öffentlichkeit ist auch der Sammelband Krebsforschung heute (englische Fassung Current Cancer Research ) (beide Steinkopff Verlag Darmstadt) bestimmt. 2002/2003 wurden beide Bücher neu veröffentlicht.

11 Einführung 21 Ausgaben von dkfz intern wurden herausgebracht. Die Zeitschrift geht am Monatsanfang allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Zentrums zu. Besucher Zahlreiche Besucher aus dem In- und Ausland wurden begrüßt, darunter der südkoreanische Minister für Wissenschaft und Technologie Dr. Ho-Koon Park, eine Gruppe Physiker von der ukrainischen Charkov-Universität und eine Delegation vom Shaukat Kanum Memorial Cancer Hospital and Research Center in Lahore, Pakistan. Vom International Graduate Programme Molecular and Cell Biology, das gemeinsam von der Universität Heidelberg und vom DKFZ durchgeführt wird, besuchten im Rahmen ihrer Campus Tour zwei Kurse das DKFZ. Im Rahmen des EICOS-Programms der Max-Planck-Gesellschaft hielten sich insgesamt drei Stipendiaten im Zentrum auf, im Jahr 2002 ein Wissenschaftsjournalist aus der Türkei, 2003 zwei Wissenschaftsjournalistinnen aus den USA bzw. aus Italien. Veranstaltungen Die Abteilung organisiert die Verleihungen des Meyenburg- Preises und des Walther und Christine Richtzenhain-Preises. Darüber hinaus wirkte sie an sechs Meyenburg Lectures organisatorisch mit. An der Reihe Science goes public war die Abteilung konzeptionell beteiligt und organisatorisch und pressemäßig verantwortlich. Zu Kunstausstellungen und zu einer Ausstellung von Schülerarbeiten zum Thema Bewegung wurde eingeladen. Der Tag der offenen Tür am Sonntag, dem wurde inhaltlich und organisatorisch intensiv vorbereitet. Orientiert an den Bedürfnissen der interessierten Bürger, entstand ein umfassendes Programm mit Führungen, Präsentationen und allgemein verständlichen Vorträgen. Mit Themen für verschiedene Zielgruppen richtete sich das ganztägige Vortragsprogramm im Kommunikationszentrum an ein breites Publikum, unter anderem mit Krebs und Psyche oder Schwerpunkten für Frauen (Brustkrebs) und Männern (Prostata), gestaltet von Wissenschaftlern des Zentrums und kooperierenden Einrichtungen. 110 Führungen boten den Besuchern Einblick in Labors oder interaktive Angebote zum Mitmachen. Ergänzt wurde das Angebot durch ein Kinderparadies, u.a. mit betreuten Spielmöglichkeiten, einem Puppentheater und dem Schüler- Kurs Chemie-Magie im Zauberlabor, in Zusammenarbeit mit dem Gläsernen Labor Berlin. Pressearbeit und eine große Plakataktion an den Straßen sowie in Schulen, Behörden und Geschäften im gesamten Umkreis machten auf den Tag der offenen Tür aufmerksam. Die zur Verfügung stehenden räumlichen und organisatorischen Möglichkeiten wurden durch den Besucherandrang - geschätzt wurden 8000 bis mehr als ausgeschöpft. Die langjährige Leiterin der Stabsabteilung Presse- und Öffentlichkeitsarbeit und des Krebsinformationsdienstes KID Hilke Stamatiadis-Smidt wurde im Rahmen eines Symposiums im Januar 2003 in den Ruhestand verabschiedet. Seit 1. Januar 2003 wird die Abteilung Presse- und Öffentlichkeitsarbeit von Dr. med. Julia Rautenstrauch geleitet. Die Presseabteilung arbeitete darüber hinaus mehrere Monate intensiv mit in einem Organisationskomitee, das die Verabschiedung des Stiftungsvorstands Prof. Harald zur Hausen im März 2003 inhaltlich und organisatorisch vorbereitete. Die Durchführung selbst oblag der Presseabteilung. Ein großes Programm mit einem internationalen wissenschaftlichen Symposium am Vormittag, einem Festakt am Nachmittag und einem Abschiedsfest am Abend führte weit über 1000 Gäste ins Zentrum. Um die Kontakte mit den Parlamentariern der Region in Landtag, Bundestag und Europäischem Parlament zu pflegen, wurden sie Mitte 2003 zu einem Informationsgespräch eingeladen. Der Stiftungsvorstand und Wissenschaftler des DKFZ berichteten über wichtige Ereignisse und skizzierten Planungen für zukünftige Schwerpunkte und Aktivitäten. PRÖ organisierte die Beteiligung des Krebsforschungszentrums beim Schülertag der Universität Heidelberg, der in der Region über die Landesgrenzen hinweg großen Zuspruch fand. Projekte Seit Mitte 2003 arbeitet die Abteilung intensiv an einem neuen Internetauftritt des DKFZ. Das Programm DKFZ Alumni International und die Abteilung Presse- und Öffentlichkeitsarbeit erstellten die erste Ausgabe des DKFZ Alumni-Newsletters. Dieser informiert früher am DKFZ tätige Wissenschaftler und Gastwissenschaftler über Neuigkeiten aus Forschung und Administration des Zentrums. Darüber hinaus berichten Alumni über ihre Erfahrungen im DKFZ. Die englischsprachige Publikation erscheint in gedruckter Form und als pdf-dokument im Internet. Kongresse, Ausstellungen Bei der Ausstellung zur konstituierenden Sitzung des Senats der Helmholtz-Gemeinschaft e.v. in Berlin präsentierte sich das DKFZ mit einem Exponat zur Intensitätsmodulierten Strahlentherapie. Im Rahmen des Gemeinschaftsstands Gesundheitsforum Baden-Württemberg bei der Fachmesse MEDIZIN 2002 in Stuttgart stellte das Zentrum ein Projekt zur spontanen Tumorrückbildung bei Kindern vor. Mitarbeiter des KID und des KSID informierten das Fachpublikum über die beiden Informationsdienste. Beim Deutschen Krebskongress in Berlin war das Zentrum mit einem eigenen Informationsstand vertreten. Am Gemeinschaftsstand der Helmholtz-Gemeinschaft bei der Hannover Messe 2002 beteiligte sich das Zentrum mit Projekten zur Computergestützten Operationsplanung. Die Abteilung konzipierte und organisierte die Beteiligung des DKFZ am Wissenschaftsmarkt der Universität Heidelberg im Juli 2002 und am Gemeinschaftsstand der Helmholtz-Gemeinschaft bei der Medica 2002 vom im November 2002 in Düsseldorf. Chancengleichheit im DKFZ Ende der 90er Jahre einigten sich Bund und Länder darauf, daß die außeruniversitären Einrichtungen Frauenbeauftragte bestellen konnten. Mit ihrer Hilfe soll es Frauen durch geeignete Maßnahmen ermöglicht werden, Wege in Führungspositionen zu finden. Bei den Stellenbesetzungsverfahren sollen die Beauftragten die Transparenz der Auswahlverfahren erhöhen - angesichts des in den kommenden Jahre anstehenden Generationswechsels und daraus ergebenden Neubesetzungen von Professuren eine große Chance wurde die erste Vorstandsbeauftragte für Chancengleichheit im DKFZ, Dr. Barbara Bertram, von den Frauen des Zentrums gewählt und vom Vorstand für 2 Jahre bestellt, in der Folge für weitere 3 Jahre wurde Dr. Bertram zur Vorsitzenden des Arbeitskreis Frauen in Forschungszentren der HGF gewählt. Der Arbeitskreis Chan- 11

12 12 Einführung cengleichheit im Haus steht Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern aus allen Beschäftigungsbereichen offen. Maßnahmen zur Förderung der Chancengleichheit Personalentwicklungsplan Im Mai 2001 trat der Plan zur Förderung der Chancengleichheit in Kraft. Der Plan bezieht sich auf Männer und Frauen aus dem wissenschaftlichen und dem nichtwissenschaftlichen Bereich und regelt u.a. Wiedereinstieg, Fortund Weiterbildung, Arbeitszeit, Teilzeit, Beurlaubung, Auswahl von Bewerberinnen und Bewerbern sowie Rechte und Pflichten der Beauftragten für Chancengleichheit. Dieser Plan soll demnächst durch die Vereinbarung zur Förderung der Chancengleichheit in Umsetzung der Ausführungsvereinbarung Chancengleichheit ersetzt werden. Ein dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) vorgelegter Plan zu Wiedereinstiegsmaßnahmen ist noch nicht bewilligt. Die vom BMBF zur Verfügung gestellten Stellenermächtigungen sind an hervorragende Wissenschaftlerinnen des Hauses vergeben worden. Insgesamt 18 Stellen konnten so besetzt werden. Kinderbetreuung Am 2. Juni 2003 fand das Symposium Beruf und Familie: unvereinbar? im Haus statt. Finanziell unterstützt wird der Verein Die Wichtel, eine vom Haus mitgenutzte Kindertagesstätte in Heidelberg. Die im April 2003 durchgeführte Umfrage zum Bedarf an Kinderbetreuungsplätzen führte zum Beschluß des Sitftungsvorstands, die KiTa um Plätze zu erweitern. Netzwerke / Vorbilder Das im Haus etablierte Mentoring Programm MuT (Mentoring und Training) des Landes Baden-Württemberg soll durch ein eigenes Programm ergänzt werden. In Kooperation mit der Pädagogischen Hochschule Heidelberg wurde in den Jahren 2002 und 2003 Science goes public durchgeführt, eine Veranstaltungsreihe, die jungen, hervorragenden Wissenschaftlerinnen die Gelegenheit gab, ihre Forschung einem breiten Publikum vorzustellen und mit ihm zu diskutieren. Information / Transparenz Im Frauen-INFO wird vierteljährlich über gleichstellungsrelevante Themen und Termine berichtet und die Vortragsreihe zu (nicht nur) frauenspezifischen Themen wird fortgeführt. Stabsstelle Technologietransfer Die Infrastruktur der Stabstelle Technologietransfer am Zentrum stellt den Schutz von geistigem Eigentum am Zentrum sicher und trägt dazu bei, Fortschritte aus der Krebsforschung zur klinischen Anwendung zu bringen. Die aktive Verwertung von Ergebnissen der Grundlagenforschung hilft die Lücke zwischen wissenschaftlicher Forschung und kommerzieller Entwicklung zu überbrücken. Mit der Industrie bestehen vielfältige Kontakte, so durch Materialaustausch, Prototypentwicklung und wissenschaftliche Kooperationen, Lizenzen, sowie vielfältigen Netzwerkaktivitäten wie z.b. in der BioRegion Rhein-Neckar-Dreieck. Weltweit werden Kooperations- und Lizenzvereinbarungen mit kleinen, mittleren und großen Unternehmen geschlossen. Das Zentrum unterstützt Wissenschaftler darüber hinaus bei der Gründung von Spin-off-Unternehmen. Die Stabsstelle Technologietransfer sensibilisiert die Wissenschaftler für die kommerzielle Verwertbarkeit ihrer Ergebnisse und motiviert sie, ihre Erfindungen parallel zu einer Publikation zum Patent anzumelden. Bei einer Patentanmeldung werden die Forscher von der Stabsstelle beraten und unterstützt und die Kommerzialisierung von Ideen bereits zu einem frühen Stadium mit den Wissenschaftlern abgestimmt und vorbereitet. Erfindungen des Deutschen Krebsforschungszentrums werden an den bestmöglichen Industriepartner lizenziert, der von der Stabsstelle Technologietransfer hinsichtlich einer möglichst raschen Entwicklung von Produkten identifiziert wurde. Von den lizenzierten Patenten des Zentrums, die schließlich als Produkte auf dem Markt verkauft werden, wie beispielsweise ein neues Medikament gegen Krebs, profitieren die Erfinder und das Zentrum und letztlich insbesondere die Krebspatienten. In Jahr 2003 reichte das DKFZ 22 neue Anmeldungen zum Patent ein. Derzeit verfügt das DKFZ über einen Gesamtbestand von 1314 angemeldeten (darunter 640 erteilten) Schutzrechten weltweit. Weitere Informationen zur Stabsstelle Technologietransfer und den Technologieangeboten des DKFZ sind im Internet zu finden unter: Tierschutz und Tierversuche Trotz zunehmender Entwicklung von Ersatzmethoden haben Tierexperimente im DKFZ ihren Stellenwert; dies spiegelt sich in Hinweisen auf die Verwendung von Versuchstieren oder tierischen Geweben und Zellen in nahezu jeder dritten Publikation des Zentrums wieder. Der Tierbestand im DKFZ beträgt durchschnittlich ca Tiere pro Jahr (2003), wobei ein stetiger Anstieg - bedingt durch die zunehmende Generierung transgener Mausmodelle - (1997: T., 1999: T., 2001: T,) zu verzeichnen ist. Die Zahl der genehmigten und angezeigten Versuchsvorhaben in den Jahren 1993 bis 2003 schwankte zwischen 160 und 198 Vorhaben (davon bis zu 65 % genehmigungsund bis zu 53 % anzeigepflichtige Versuchsvorhaben). Der Hauptanteil der Versuchstiere (ca. 98 % Mäuse, ca. 1 % Ratten) wird zur Erforschung oder Erprobung von Methoden zur Diagnostik Prophylaxe oder Therapie, in der Grundlagenforschung, zur Entnahme von Geweben und Organen und zur Aus-, Fort- und Weiterbildung eingesetzt. Die Tierschutzbeauftragten (TSB) des DKFZ werden vom Stiftungsvorstand bestellt und sind nebenamtlich tätig, sie vertreten die Berufsgruppen der Veterinärmedizin, Humanmedizin und Biologie. Sie sind nach dem Tierschutzgesetz von 1998 verpflichtet, auf die Einhaltung von Vorschriften, Bedingungen und Auflagen im Interesse des Tierschutzes zu achten und die Einrichtung und die mit den Tierversuchen und mit der Haltung der Versuchstiere befassten Personen zu beraten. Des weiteren müssen sie zu jedem Antrag auf Genehmigung eines Tierversuches Stellung nehmen und innerbetrieblich auf die Entwicklung und Einführung von Verfahren und Mitteln zur Vermeidung oder Beschränkung von Tierversuchen hinwirken. Jeder Antrag (Genehmigung oder Anzeige von Versuchsvorhaben) wird in der Internen Tierschutzkommission (ITSK) zur Beurteilung seiner wissenschaftlichen und statistischen Relevanz vorgelegt. Die ITSK wurde 1986 vom Stiftungsvorstand des DKFZ einberufen und setzt sich aus Wissenschaftlern verschiedener Fachrichtungen zusammen. Die Stellungnahme und das Votum der ITSK werden dem

13 Einführung TSB mitgeteilt, der dann in seiner Stellungnahme zum Antrag darauf Bezug nimmt. Darüber hinaus sind die TSB des DKFZ Mitglieder der,arbeitsgemeinschaft der Tierschutzbeauftragten Baden- Württembergs (ATBW). Diese Arbeitsgruppe erarbeitet und veröffentlicht gemeinsam mit Behördenvertretern Richtlinien und Empfehlungen, wie: Empfohlene maximale Injektionsvolumina, Kriterien zur vorzeitigen Tötung tumortragender Ratten und Mäuse, Blutentnahme und Immunisierung von Versuchstieren, Herstellung transgener Mause und Ratten, etc.. Zu dem ist ein Großteil der TSB aktiv am,einführungskurs in das tierexperimentelle Arbeiten beteiligt, in dem Doktoranden, Diplomanden und weitere interessierte Mitarbeiter auf das fachkundige und damit tierschutzgerechte tierexperimentelle Arbeiten vorbereitet werden. Biologische Sicherheit am DKFZ Fragen der biologischen Sicherheit werden durch eine Vielzahl von Gesetzen, Verordnungen und Vorschriften geregelt. Für die am DKFZ weitverbreiteten molekularbiologischen Arbeiten spielen neben dem Infektionsschutzgesetz, der Tierseuchenerregerverordnung und der Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung) das Gentechnikgesetz (GenTG), und die Gentechniksicherheitsverordnung eine besondere Rolle. Gentechnische Arbeiten und solche mit biologischen Agenzien werden an Hand des Risikopotentials in vier Sicherheitsstufen eingeteilt. Am DKFZ werden nur Arbeiten der Stufen S1, S2 und S3 durchgeführt: - Sicherheitsstufe S1 (ohne Risiko für Mensch und Umwelt) gilt z. Z. für über 40 Laborbereiche des DKFZ. - Sicherheitsstufe S2 umfaßt Arbeiten mit geringem Risiko für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt in 24 besonders gekennzeichneten Laborbereiche des DKFZ, in denen ca. 100 S2-Projekte angemeldet sind. - Sicherheitsstufe S3 beinhaltet Arbeiten mit krankheitserregenden Organismen, bei denen von einem mäßigen Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist. Dem DKFZ stehen vier S3 Laboratorien für Untersuchungen z.b. an HI-Viren und für Hepatitis-Viren zur Verfügung. Zur Beratung der Projektleiter im Sinne des GenTG und des Stiftungsvorstands hat dieser einen Ausschuß für Biologische Sicherheit (ABS) bestellt. Dieser unmfaßt derzeit 18 Wissenschaftler, die selbst im Labor arbeiten und die Funktion von Beauftragten für Biologische Sicherheit (BBS) nebenamtlich wahrnehmen. Die fachnahen BBS betreuen die gentechnische Projekte und Projektleiter, beraten die Antragsteller und empfehlen Sicherheitsmaßnahmen. Der ABS verfaßt Muster-Betriebsanleitungen für die gentechnischen Anlagen und setzt seine fachliche Kompetenz zur Aufstellung hausinterner Sicherheitsregelungen ein. Voraussetzung für eine erfolgreiche Arbeit ist dabei die Unterstützung aus dem Bereich des Stiftungsvorstands und die enge Zusammenarbeit aller für die Arbeitssicherheit verantwortlichen Gremien am DKFZ. Die gentechnischen Bereiche des Hauses werden regelmäßig durch das Regierungspräsidium Tübingen als zuständiger Aufsichtsbehörde begangen. Bei diesen Begehungen, die über die Kontrolle hinaus auch der fachlichen Diskussion zwischen den verschiedenen Verantwortungsebenen dienen, fungieren die BBS als Anlaufstelle für Behörde und Projektleiter. Ein enges Zusammenwirken mit der Stabsstelle Sicherheit ermöglicht die fruchtbare Zusammenarbeit mit dem Regierungspräsidium. Seit Inkrafttretens des Gentechnikgesetzes (1990) ist nach anfänglichen Schwierigkeiten die Lösung vieler organisatorischer und bürokratischer Probleme zur Routine geworden. Die Risikobewertung wurde durch die ständig erweiterten Empfehlungen der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit und die von ihr erstellten Listen bereits bewerteter Organismen und Arbeiten vereinfacht. Die bisherigen Novellierungen der gentechnikrechtlichen Bestimmungen haben für den Bereich der Grundlagenforschung nicht zu den von vielen Wissenschaftlern erhofften Erleichterungen der Arbeitsbedingungen geführt. Als problematisch empfindet der ABS die geltenden Vorschriften für gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe S1, also für Arbeiten, bei denen von keinem Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist. Der ABS befürwortet daher eine kritische Überprüfung aller S1-Arbeiten mit dem Ziel, diese weitgehend aus dem Regulierungsbereich des Gentechnikgesetzes herauszunehmen, da ausreichende Sicherheitsbestimmungen außerhalb des GenTG vorhanden sind. Dies könnte zur Konzentration auf die eigentlich risikobehafteten Arbeiten führen und letztlich die biologische Sicherheit erhöhen. In diesem Sinne versucht der ABS auf nationaler und europäischer Ebene auf die Gesetzgebung Einfluß zu nehmen. 13

14 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Übersicht Forschungsschwerpunkt Zell- und Tumorbiologie Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs 14 Zellbiologie (A010) Prof. Dr. rer. nat. Werner W. Franke Tel.: , FAX W.Franke@DKFZ.de Molekularbiologie der Zelle I (A020) Prof. Dr. med. Günther Schütz Tel.: , FAX G.Schuetz@DKFZ.de Molekularbiologie der Zelle II (A030) Prof. Dr. rer. nat. Ingrid Grummt Tel.: , FAX I.Grummt@DKFZ.de Entwicklungsgenetik (A040) Prof. Dr. rer. nat. Bernard Mechler Tel.: , FAX dev.genetics@dkfz.de Molekulare Embryologie (A050) Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs Tel.: , FAX Niehrs@DKFZ.de Pathochemie (A060) Prof. Dr. med. Volker Kinzel Tel.: , FAX V.Kinzel@DKFZ.de Molekulare Biologie der Mitose (A070) Prof. Dr. phil. Herwig Ponstingl Tel.: , FAX Ponstingl@DKFZ.de Differenzierung und Carcinogenese (A080) Prof. Dr. med. Norbert Fusenig Tel.: , FAX N.Fusenig@DKFZ.de Tumorbiochemie (A090) Prof. Dr. med. Dietrich Keppler Tel.: , FAX D.Keppler@DKFZ.de Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (A100) Prof. Dr. rer. nat. Peter Angel Tel.: , FAX P.Angel@DKFZ-Heidelberg.de Hormonwirkung und Signaltransduktion (A105) Prof. Dr. rer. nat. Doris Mayer Tel.: D.Mayer@DKFZ.de Genetik der Hautcarcinogenese (A110) Prof. Dr. rer. nat. Petra Boukamp Tel.: , FAX P.Boukamp@DKFZ.de Strukturelle Genanalyse (A120) Prof. Dr. Michael Trendelenburg Tel.: , FAX M.Trendelenburg@DKFZ.de Modellversuche zur Invasion und Metastasierung (A125) Prof. Dr. Eberhard Spiess Tel.: , FAX E.Spiess@DKFZ.de Epigenetik (A130) Dr. rer. nat. Frank Lyko Tel.: , FAX F.Lyko@DKFZ.de Biochemische Zellphysiologie (A135) Prof. Dr. rer. nat. Walter Pyerin Tel.: , FAX W.Pyerin@DKFZ.de Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung (A140) Dr. rer. nat. Gerhard Fürstenberger Tel.: , FAX G.Fuerstenberger@DKFZ.de Normale und neoplastische epidermale Differenzierung (A145) Dr. rer. nat. Jürgen Schweizer Tel.: , FAX J.Schweizer@DKFZ.de Systembiologie der Signaltransduktion (A150) PD Dr. Ursula Klingmüller Tel.: , FAX U.Klingmueller@DKFZ.de Redoxregulation (A160) Dr. rer. nat. Tobias Dick Tel.: , FAX T.Dick@DKFZ.de Molekulare Stoffwechselkontrolle (A170) Dr. Stephan Herzig Tel.: S.Herzig@DKFZ.de In den Abteilungen und Gruppen des Forschungsschwerpunktes werden - vorwiegend mit zell- und molekularbiologischen Methoden und auch in transfizierten Zellen bzw. transgen veränderten Tieren - verschiedene Aspekte der Spezialisierung von Zellen und Geweben (Differenzierung) erforscht. Insbesondere die Regulationsmechanismen der Synthese Zelltyp-spezifischer Proteine und ihrer Funktionen sowie funktionell bedingte bzw. die Tumorbildung fördernden Veränderungen in den Genen bzw. im Chromatin des Zellkerns stehen dabei im Mittelpunkt der Untersuchungen. Die den Arbeiten der Abteilung Zellbiologie zugrundeliegende Frage ist die nach den molekularen Grundlagen der zelltypischen Architektur normaler und maligne veränderter Zellen. Hierbei stehen zur Zeit die Filamente des Cytoskeletts und ihre Verankerungsstellen an der Plasmamembranen im Vordergrund, besonders die transmembranen Cadherine der Desmosomen als duale Ordnungsmoleküle. Die hierbei gefundenen zelltypischen Unterschiede in der molekularen Ausstattung der jeweiligen Intermediärfilamente und der Zellverbindungen (Junctions) werden systematisch auf ihr mögliches Einsatzpotential als molekulare Leitmerkmale (Marker) in der histologischen Diagnostik untersucht. In entsprechender Weise wie die Cytoskelettproteine werden auch die strukturbildenden Proteine des Zellkerns (Karyoskelett) untersucht, vor allem die der Kernhülle und des Nukleolus, vor allem auch mit dem Ziel, molekulare Prinzipien der intranukleären Topogenese und der Kerncytoplasma-Kompartimentierung und ihre funktionelle Bedeutung aufzuklären.

15 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie In der Abteilung Molekularbiologie der Zelle I werden Untersuchungen zum Mechanismus der signalabhängigen Genexpression durchgeführt, die der Wirkung nukleärer Rezeptoren sowie der Proteine der CREB Familie zugrunde liegen. Um die Funktion dieser regulatorischen Proteine in der Entwicklung und Physiologie verstehen zu lernen, wurden die Gene für diese Proteine in der Keimbahn und in ausgewählten Zellen und Geweben gezielt zerstört und die Auswirkungen dieser Mutationen auf die Differenzierung und physiologischen Vorgänge analysiert. Die Zielgene dieser signalabhänigen Transkriptionsfaktoren werden unter Einsatz von DNA-Chips bestimmt, um die Funktion dieser regulatorischen Proteine molekular zu charakterisieren. Von einem Vergleich der Expressionsmuster in normalen Mäusen und in Mutanten werden wichtige Einblicke in die Rolle dieser regulatorischen Proteine in Abhängigkeit von Differenzierung und Entwicklung erwartet. In der Abteilung Molekularbiologie der Zelle II werden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Genregulation in Säugerzellen durchgeführt. Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt auf der Analyse der Prozesse, durch die extrazelluläre Signale in den Zellkern übertragen werden und dort die Transkriptionsrate positiv oder negativ beeinflussen. Dies erfordert die funktionelle Charakterisierung der am Transkriptionsprozess beteiligten Proteinfaktoren, die Analyse der Signalübertragungswege, die Genexpression in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen bzw. während des Zellzyklus regulieren sowie die Aufklärung der Kontrollmechanismen, die Genaktivitäten auf epigenetischer Ebene steuern. Derartige Untersuchungen sind die Voraussetzung für das Verständnis der Prozesse, die kontrollierte Genexpression außer Kraft setzen und somit ursächlich für maligne Entartung und eine Vielzahl genetischer Krankheiten verantwortlich sind Die Zielsetzung der Abteilung Entwicklungsgenetik ist die Identifizierung und funktionelle Analyse von Tumorsuppressorgenen bei Drosophila. Die Anwendung der gegenwärtig verfügbaren molekularen Methoden für die rasche Isolierung derartiger Gene und von Techniken der Analyse ihrer Funktion sollen neue Einsichten in die Mechanismen, die die Zellproliferation steuern, gewähren. Es konnte gezeigt werden, daß das erste Tumorsuppressorgen, welches für ein Cytoskelettprotein kodiert, mit nichtmuskulärem Myosin II interagiert. Beide Proteine sind Komponenten des Cytoskelettnetzwerkes, welches das gesamte Cytoplasma der Zellen durchzieht und mit der peripheren Matrix, die an die Plasmamembran angelagert ist, assoziiert ist. Ein weiteres Ziel der Abteilung ist die Identifizierung der anderen Zellbestandteile, die mit den identifizierten Tumorsuppressorgenen interagieren, um so die Regulationsmechanismen für die Zellproliferation aufzuklären. Die Abteilung Molekulare Embryologie beschäftigt sich mit der Frage, wie die Differenzierung embryonaler Zellen während der Frühentwicklung der Wirbeltiere reguliert wird, um zum Verständnis der Grundlagen pathologischer Zelldifferenzierungsvorgänge beizutragen. Hierzu werden Entwicklungskontrollgene und die molekularen Netzwerke, in die sie eingebunden sind, identifiziert und charakterisiert. Die Abteilung Pathochemie befaßt sich mit folgenden Aspekten der zellulären Signaltransduktion: (1) Molekulare Übersicht Mechanismen und funktionelle sowie strukturelle Konsequenzen von Proteinphosphorylierung/Dephosphorylierung; (2) Mechanismen der Katalyse, Regulation und Hemmung von Proteinkinasen mit dem Ziel der Entwicklung und Verbesserung klinisch anwendbarer Proteinkinase- Inhibitoren; (3) Struktur und Dynamik aktuell interessanter Proteindomänen, speziell die Wechselwirkung des HIV Glykoproteins 120 (gp 120) mit dem T-Zellrezeptor CD4, mit dem Ziel, diese zu hemmen. Hier befinden sich HIV- Hemmstoffe zu therapeutischen Zwecken in Entwicklung. Die Abteilung Molekulare Biologie der Mitose hat sich zum Ziel gesetzt, molekulare Mechanismen nachzuweisen, die den Ablauf von Zellteilungen regeln, ihre Störungen in Tumoren aufzuklären und neue Wege zur therapeutischen Hemmung unkontrollierter Zellteilungen zu finden. Die Charakterisierung deregulierter Gene in Ovarialtumoren soll zur Identifizierung neuer Tumormarker, Tumorsuppressoren und therapeutischer Zielmoleküle führen. Zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen werden hochkomplexe Peptid-Arrays entwickelt. Die Aufklärung der Transportmechanismen von Makromolekülen in der Zelle, die auch an der Kontrolle der DNA-Replikation und der Zellteilung mitwirken, soll zum Verständnis beitragen, wie Transportdefekte die Entwicklung von Tumoren fördern und die therapeutische Nutzung der Transportwege ermöglichen. Die Untersuchungen der Abteilung Differenzierung und Carcinogenese konzentrieren sich auf Fragen zum molekularen Mechanismus der Zell-Zell Interaktion in der normalen Haut und ihrer Veränderungen im Rahmen der Hautcarcinogenese, insbesondere zur Tumor-Stroma-Wechselwirkung. Derzeit stehen in den Karzinogenesestudien molekulargenetische Analysen zum Mechanismus der Immortalisierung im Vordergrund, insbesondere die Identifizierung von Seneszenzgenen sowie Studien zur Rolle der Telomerase. Im Rahmen der Untersuchungen von Epithel- Mesenchym-Wechselwirkungen bei der Geweberegeneration konnte ein neuer Mechanismus wechselseitiger Regulation über die Induktion parakriner Faktoren aufgezeigt werden. Die Detailanalyse dieser Steuerungsmechanismen und ihrer zunehmenden Entgleisung bei der Tumorprogression soll helfen, das autonome Wachstum von Tumorzellen in vivo besser verstehen und beinflussen zu können. An einem von uns entwickelten Hautcarcinogenese- Modell wird die Wachstumsregulation und Tumor-Stroma- Wechselwirkung an verschiedenen Tumor-Entwicklungsstadien an Transplantations- und Zellkultur-Modellen untersucht. Derzeit im Vordergrund stehen Arbeiten zum Mechanismus der Tumor-Angiogenese und deren Blockade als Tumor-therapeutisches Prinzip. Diese neuen Tumortherapieverfahren sollen in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen und Industriefirmen mechanistisch analysiert und für den praktischen Einsatz vorbereitet werden. Das Forschungsprogramm der Abteilung Tumorbiochemie konzentriert sich auf die molekulare und kinetische Charakterisierung von Membrantransportern. Die Hemmung dieser Transporter (MRP-Familie), die für eine Mehrfachresistenz gegen Zytostatika verantwortlich sind, ist ein wichtiges Ziel bei der Verbesserung der klinischen Chemotherapie von Tumoren. Die Produkte von Resistenz-Genen und die Produkte der MRP-Genfamilie, welche mehrere Konjugat- Exportpumpen normaler und maligner Zellen umfaßt, werden nach gezielter Mutagenese mit zellbiologischen und transportkinetischen Methoden untersucht. Die Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Membran- 15

16 16 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Übersicht transportern umfaßt auch Proteine, die für die Aufnahme physiologischer und zytotoxischer Substanzen in die Zelle verantwortlich sind und zur Familie der organic anion transporting polypeptides (OATPs) zählen. In der Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle werden die Reaktionen von Organismen und ihren Zellen auf Umwelteinflüsse (Strahlung, chemische Karzinogene) untersucht und mit den Reaktionen auf körpereigene Substanzen verglichen. Ziel ist es zu verstehen, über welche Wege die Zelle auf solche äußeren Signale mit Veränderungen der Aktivität spezifischer Gene reagiert und welche Funktionen die dabei beteiligten Genprodukte spielen. Die Arbeiten konzentrieren sich darauf, die Funktionen verschiedener Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 (Fos, Jun und ATF-Proteine) mit Hilfe von Zellkultursystemen und einem Tumormodell (Maus) aufzuklären und ihre Rolle bei komplexen Prozessen wie Zellproliferation, Transformation, Differenzierung, Angiogenese und programmiertem Zelltod (Apoptose) zu studieren. Ziel ist es die molekularen Vorgänge bei der Genregulation zu verstehen, durch die eine normale Zelle in eine Krebszelle umgewandelt wird. Die Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion befaßt sich mit dem Einfluß von Steroidhormonen auf die Entstehung von Tumoren. Das Ziel der neu gegründeten Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese ist, genetische Veränderungen zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren, die bei der Entwicklung von UV-bedingten Hautcarcinomen eine Rolle spielen wurde am DKFZ eine Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung eingerichtet, die im Bereich der modernen licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren die Abteilungen des DKFZ unterstützt. Sie gliedert sich jetzt wie folgt: Die Arbeitsgruppe Strukturelle Genanalyse setzt in Modellsystemen wie Amphibien Oozyten und Embryonen elektronenspektroskopische Methoden zur Analyse von Nano-Strukturen ein. Ein begrenztes Serviceangebot besteht für folgende Gebiete: Konfokale Laserscan Mikroskopie, Videomikroskopie, Automatisierte Mikroinjektion, Elektronenspektroskopische Strukturanalysen im Nanometer-Bereich durch Elektron Spectroscopic Imaging (ESI). Die Arbeitsgruppe Modellversuche zur Invasion und Metastasierung beschäftigt sich mit technischen Problemen der lebend-zell-mikroskopie und dem Einfluss von Proteinen auf den Zelltod. Die Arbeitsgruppe Epigenetik wechselte Ende 2000 an das DKFZ. Sie entdeckte vor kurzem ein einfaches DNA- Methylierungssystem in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster: Diese Entdeckung eröffnet die Möglichkeit, komplexe Regulationsmechanismen in einem einfachen Modellorganismus zu untersuchen. Dazu etabliert die Gruppe transgene Tiere mit definierten Mutationen in den Kernkomponenten des Drosophila DNA-Methylierungssystems. Außerdem werden Hypermethylierungs-induzierte Phänotypen in Fliegen untersucht. Darüberhinaus entwickelt die Gruppe spezifische Hemmstoffe für DNA-Methyltransferasen, um die Hypermethylierung in Krebspatienten zu blockieren. Die Projektgruppe Biochemische Zellphysiologie arbeitet an der Aufklärung von Pathomechanismen proliferativer Prozesse. Zum einen werden Mechanismen untersucht, die durch Proteinkinase CK2 (Caseinkinase II) kontrolliert werden. Zum anderen hat die Gruppe mit Untersuchungen zur zellulären und molekularen Biologie normaler und entarteter Knochenzellen begonnen und versucht mittels Chips-basierter Verfahren Gene zu identifizieren und in ihren zellulären Rollen zu charakterisieren, deren Expression mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen und Knochenschmerz korrelieren. Damit sollen Ansatzpunkte für individualisierte Diagnose- und Therapieverfahren gefunden werden. Die Arbeitsgruppe Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung untersucht molekulare Mechanismen der Eicosanoidwirkung in einfachen und stratifizierten Epithelien von Mensch und Maus. Insbesondere interessieren in diesem Zusammenhang die Funktionen dieser Gewebshormone bei der Wundheilung, entzündlich-degenerativen Erkrankungen und der Entwicklung von Haut-, Blasen-, Brust- und Pankreastumoren. Die Arbeitsgruppe Normale und neoplastische epidermale Differenzierung untersucht die Differenzierung des humanen Haarfollikels auf der Basis der Haarkeratinexpression sowie der Expression Haarkeratin-assoziierter Proteine, KAP. In laufende Untersuchungen befasst sich die Arbeitsgruppe mit der Identifizierung weiterer androgenkontrollierter Gene sowie ihrer möglichen Rolle bei der Ätiologie der androgenetischen Alopezie. Die im Juli 2003 eingerichtete Arbeitsgruppe Systembiologie der Signaltransduktion erforscht im hämatopoetischen System am Beispiel der erythroiden Linie Kontrollmechanismen der Signaltransduktion, die Proliferation und terminale Differenzierung erythroider Vorläuferzellen steuern. Ziel dieser systembiologischen Studien ist es, das dynamische Verhalten von Signalleitungsnetzwerken vorherzusagen, um Ansatzpunkte für eine effiziente Intervention zu identifizieren und die gezielte Entwicklung neuer Therapiestrategien für die Krebsbekämpfung zu unterstützen. Die im März 2003 eingerichtete Arbeitsgruppe Redoxregulation untersucht Redox-basierte Kontrollmechanismen, die auf fundamentale Weise an der Regulation der Zelle beteiligt sind, unter anderem an Proliferation, Differenzierung und Zelltod. Krebsentstehung, diverse andere Krankheiten und auch der Alterungsprozess gehen mit Veränderungen von zellulären Redoxzuständen einher. Die Arbeiten der im Oktober 2003 etablierten Arbeitsgruppe Molekulare Stoffwechselkontrolle beschäftigen sich mit transkriptionellen Kontrollmechanismen, die an der Regulation biochemischer Stoffwechselwege beteiligt sind und deren Dysfunktion zur Entstehung metabolischer Erkrankungen, wie Typ II Diabetes, Tumor-Kachexie oder Alterungsprozess, beitragen können.

17 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A010 Zellbiologie Abteilung Zellbiologie (A010) Leiter: Prof. Dr. Werner W. Franke Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Harald Bär (8/03-) Dr. Hans Heid PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon Dr. Ilse Hofmann Prof. Dr. Jürgen Kartenbeck Dr. Sandra Kneissel (3/02-) Dr. Lutz Langbein Dr. Ulrich-Frank Pape (3/02-) Dr. Wiebke Peitsch Dr. Michaela Reichenzeller (½; 3/03-) PD Dr. Marion Schmidt-Zachmann Doktoranden Kemal Akat (med.) Angelika Alonso (med.) Judit Boda Christine Dreger Jens Eilbracht Stephanie Geiger (10/03-) Bettina Hämmerling (med.) Cathleen Hanisch (12/02-) Alexandra König Ute Patzelt (6/02-) Holger Schlüter (4/02-) Jens Schumacher (2/02-) Beate Straub (med.) Susanne Voltmer (8/02-) Technisches Personal Jutta Bulkescher (7/03-) Peter Eichhorn (-6/03) Christine Grund (80%) Uta Haselmann-Weiß (3/02-) Michaela Hergt Astrid Hofmann Cäcilia Kuhn Edeltraut Noffz (½) Jutta Osterholt Silke Prätzel Tanja Schlechter (2/02-) Heiderose Schumacher (½) Tatjana Wedig Stefanie Winter-Simanowski (¾) Ralf Zimbelmann Die Abteilung Zellbiologie arbeitet über zelluläre Strukturelemente und architektonische Proteine - sowohl des Zellkerns als auch des Cytoplasma - und deren Verankerungsstrukturen an der Kernhülle wie an Zell-Zell-Verbindungen ( Junctions ). Mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und morphologischer Untersuchungen (hier insbesondere Elektronenmikroskopie und Immunlokalisierung) werden die beteiligten Proteine charakterisiert und ihre Wechselwirkungen sowie Funktionen aufgeklärt, sowohl durch in vitro als auch in vivo Experimente, zum Beispiel Transfektion von Kulturzellen. Neben der Aufklärung grundsätzlicher zellbiologischer Fragestellungen sollen diese Erkenntnisse einem besseren Verständnis entwicklungsbiologischer Vorgänge der Zell- und Gewebsdifferenzierung sowie der malignen Transformationen dienen, aber auch Grundlagen für eine verbesserte Tumordiagnostik liefern. Mehrere im Rahmen dieser Forschungsarbeiten gewonnene Reagenzien, besonders monoklonale Antikörper, werden bereits - und zunehmend mehr - zur Zelltypisierung in der Tumordiagnostik und zur Früherkennung von Metastasen eingesetzt. Cytoskelett und Karyoskelett von normalen und transformierten Zellen: Molekulare Charakterisierung der Hauptkomponenten und funktionellen Domänen W.W. Franke, L. Langbein, H. Herrmann, I. Hofmann In Zusammenarbeit mit: U. Aebi, P. Burkhard, Biozentrum, Basel, Schweiz; H. Baribault, La Jolla Cancer Research Foundation, USA; R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; A. Ben Ze ev, Dept. of Molecular Genetics and Virology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; B. Bernard, L Oréal, Paris, Frankreich; W. Birchmeier, P. Ruiz, MDC Berlin; V. Bosch, Abt. F020, DKFZ; D. Fürst, P. van der Ven, Universität Potsdam; B. Geiger, Dept. of Chemical Immunology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; R.D. Goldman, V.E. Gould, Department of Pathology, Rush-Presbyterian-St. Luke s Medical Center, Chicago, USA; T. Hashimoto, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan; N. Hernandez, S. Sepehri Chong, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA; G. Krohne, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; P. Krammer, Abt. D030, DKFZ; H. Kurzen, W. Hartschuh, Hautklinik, Universität Heidelberg; B. Lane, CRC Labs, Dundee, Scotland; I. Leigh, Royal College London, U.K.; R. Leube, Anatomisches Institut, Universität Mainz; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; J. Markl, Institut für Zoologie, Universität Mainz; I. Moll, Haut- und Poliklinik, UKE Hamburg; R. Moll, Zentrum für Pathologie, Universität Marburg; D. Olins, A. Olins, Foundation for Blood Research, Scarborough, USA; D. Parry, Massey University, Palmerston North, New Zealand; R.G. Roeder, M. Teichmann, Z. Wang, Rockefeller University, New York, USA; R. Schröder, C. Klasen, J. Reimann, Abt. Neurologie, Universitätskrankenhaus Bonn; J. Schweizer, M. Rogers, A145, DKFZ; K. Sperling, A. Reis, Institut für Humangenetik, FU Berlin; P.M. Steinert, NIH, Bethesda, USA; J.-P. Thiery, CNRS, Laboratoire de Physiopathologie du Développement, Paris, Frankreich; M. Trendelenburg, H. Tröster, A120, DKFZ; S.M. Troyanovsky, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA; K. Weber, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen; K. Zatloukal, H. Denk, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich. Die Architektur der einzelnen Zelle und ihre Wechselwirkung mit Nachbarzellen oder nicht-zellulären Komponenten wird u.a. durch komplexe, zelltyp-spezifische Anordnungen verschiedener cytoplasmatischer Strukturen bestimmt, die als Cytoskelett zusammengefaßt werden. Die Mechanismen der zelltyp-spezifischen Synthese der verschiedenen Cytoskelett-Proteine, ihrer Polymerisation ( Assembly ) und der Anordnung der so gebildeten Strukturen in der jeweiligen Zelle können folglich in unterschiedlichen Zell- und Gewebetypen - normalen wie transformierten - voneinander abweichen. Eine Grundvoraussetzung für das Verständnis dieser Entwicklungsprozesse ist die Identifizierung und Lokalisierung der beteiligten Proteine, ihrer Synthese und Modifikation sowie die Charakterisierung ihrer funktionellen Domänen. Deshalb ist es ebenfalls von großer Wichtigkeit, die Mechanismen der Topogenese solcher cytoskeletärer Proteine aufzuklären, da sie in unterschiedlichen Zellkompartimenten durchaus unterschiedliche Funktionen übernehmen können. Hatten wir früher schon gezeigt, daß Mutationen in typischen cytoplasmatischen Proteinen oder auch ihre ektopische Expression in bestimmten Zelltypen zu einer Fehllokalisation im Zellkern führen kann, so konnten wir nun sogar zeigen, daß bestimmte Cytoskelett-Proteine sowohl in Zell-Zell-Verbindungen als auch im Zellkern - und zwar in einer Vielzahl unterschiedlicher Zellarten - konstitutiv vorkommen. Die Bedeutung 17

18 18 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie dieser spezifischen Doppellokalisation für die Regulation des Differenzierungsgeschehens gilt es nun aufzuklären. I. Organisationsfaktoren und strukturbestimmende Prinzipien zellulärer Filamentsysteme Im jetzigen Zeitraum wurden in der Ermittlung der Molekülstruktur von Intermediärfilament-Proteinen und der Auswirkung von Punkt-Mutationen einzelner IF-Proteine auf das Filament-Assembly entscheidende Fortschritte gemacht [12, 17, 20, 53]. Weiterhin ergaben sich neue Hinweise auf die Bedeutung assoziierter Proteine für die Integration von IFs ins Cytoskelett, insbesondere für die Lamine. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen im Lamin-B-Rezeptor zur schweren erblichen Krankheiten führen, die mit Fehlorganisationen des Chromatins einhergeben [10, 25, 46, 51]. Zur weiteren Charakterisierung der Interphase- Chromosomen wurde der Interchromatin-Raum mit Hilfe von mikroinjizierten, fluoreszenzmarkierten Dextran-Partikeln in lebenden Zellen untersucht [16]. Der Einfluss von Protein-Phosphorylierungsreaktionen auf die Dynamik von Zell-Strukturelementen wurde schließlich anhand des Vimentin-Nestin-Systems demonstriert [7]. Diese Ergebnisse wurden in mehreren Übersichtsartikeln zusammengefasst und im Zusammenhang diskutiert [19, 21, 22, 30, 54]. II. Keratin-Intermediärfilamente und keratinassoziierte Proteine - Expression und Funktion in speziellen epithelialen Bereichen Die Proteine der Intermediärfilamente werden von einer großen Multigen-Familie mit mehr als 60 Mitgliedern gebildet und in mehrere Unterfamilien unterteilt. Sie bilden ein filamentöses Netzwerk im Cytoplasma (IF-Cytoskelett) und sind so wesentlich am Aufbau und der Erhaltung der Zellform, der zellulären Stabilität und damit auch des Gewebeverbandes beteiligt. Ihr Vorkommen kennzeichnet in charakteristischer Weise bestimmte Zelltypen: z.b. Vimentin mesenchymale Zellen, Desmin Muskelzellen, Gliaund Neurofilamente Gliazellen bzw. Nervenzellen. Die größte Unterfamilie bilden die Keratine, die in die Typ I (saure) und Typ II (basische) Keratine unterteilt werden. Die Keratin-Familie umfasst beim Menschen bis heute bekanntermaßen mehr als 40 funktionelle Gene, zu denen die Cytokeratine (epitheliale Keratine) und die Haarkeratine ( harte Keratine) gehören. Während die Cytokeratine cytoskelettale Komponenten der Keratinocyten und anderer epithelialer Zellen sind, finden sich die Haarkeratine vorwiegend in den Trichocyten des haarbildenden Kompartiments. Somit sind Keratine typische Strukturproteine aller epithelialer Zellen. Ihr Expressionsmuster kennzeichnet aber nicht nur die epitheliale Herkunft der Zellen, sondern auch ihren Differenzierungszustand. Diese Eigenschaft macht sie als Marker -Proteine in der Tumordiagnostik, insbesondere für Carcinome, heute unentbehrlich ([32, 42]; s. a. Kap. V.). In den vergangenen Jahren konnten wir die Expression der menschlichen Typ I- (9 Gene; hha1-hha8, incl. zweier Isoformen) und der Typ II- (6 Gene; hhb1-hhb6) Haarkeratine aufklären. In umfangreichen Gen-Expressionsstudien zeigten wir mittels in situ Hybridisierung und Immunhistochemie (gegen alle Haarkeratine wurden spezifische Antiseren hergestellt), dass die Haarkeratine - wie die Cytokeratine - in einer differentiellen Abfolge z.t. in bestimmten Strukturen (z.b. die Haar-Cuticula) gebildet werden. Diese Expressionsstudien wurden auf Haarfollikel in vitro [56] erweitert und die Filamentbildung in vitro [28] Abteilung A010 Zellbiologie untersucht. Ferner wurden Arbeiten zur Genregulation der Haarkeratine über den Transkriptionsfaktor HoxC13 [31] und über den Einfluß von Androgenen begonnen [66]. Eine weitere detaillierte Studie befasst sich mit den Expressionsmustern der Haarkeratine im Nagel, wodurch die verschiedenen Differenzierungsbereiche des Nagels erstmals molekularbiologisch charakterisiert werden konnten (Perrin et al., Manuskript im Druck). Innerhalb unserer Studien wurden weitere neue Cytokeratine entdeckt: K6irs1, K6irs 2, K6irs3 und K6irs4. Wir konnten zeigen, dass ihre Synthese auf eine genau definierte Struktur des Haarfollikels beschränkt ist, die innere Wurzelscheide (IRS). K6irs1 wird in allen Bereichen der IRS, der Henle- wie der Huxley-Schicht und der IRS-Cuticula synthetisiert. K6irs2 und K6irs3 werden in sequentieller Abfolge speziell in der IRS-Cuticula gebildet, während K6irs4 auf die Huxley-Schicht beschränkt ist [39, 41]. K6irs 4 ist auch in spezialisierten Zellen ( Flügelzellen ) nachweisbar, die die Henle-Schicht durchdringen und mit diesem Marker eindeutig als Huxley-Zellen identifizierbar sind. Ferner konnte das vor einiger Zeit von uns entdeckte Cytokeratin K6hf, das den sog. Companion Layer des Haarfollikels charakterisiert, auch in der Haar-Medulla nachgewiesen werden [58]. Dies ist somit die erste Struktur des Haarfollikels, in der sowohl Haarkeratine als auch Cytokeratine nebeneinander vorkommen. Die Arbeiten wurden erweitert, indem auch die Mitglieder der großen Genfamilie der Keratin-assoziierten Proteine (KAPs) einbezogen und deren Expressionsmuster dargestellt wurde [47-50, 68]. KAPs vernetzen die Keratinfilamente zu einer sehr festen Struktur, wie sie besonders im Haar auftritt. Die Arbeiten zur Synthese der Haarkeratine und die neu entdeckten Cytokeratine im Haarfollikel sind Grundlagen für Untersuchungen an Tumoren und anderer, genetisch bedingter Krankheiten des haarbildenden Systems ([5, 61, 71]; s. a. Kap. V.). III. Tight Junctions und Tight Junction-verwandte Strukturen als wesentliche Zell-Zell- Verbindungsstrukturen des epithelialen Barriere-Systems Tight Junctions (TJ) sind der wesentliche Bestandteil des epithelialen Barrieresystems und dienen der Abgrenzung innerer Körperhohlräume gegen ihre entsprechenden äußeren Bereiche und somit gegen die freie Diffusion von Stoffen. Das Vorkommen von Tight Junction-Strukturen, einschließlich von Zonula occludentes in stratifizierten verhornten und nicht-verhornten Epithelien, wird seit langer Zeit kontrovers diskutiert und ihre Existenz bisher zweifelsfrei nur für polare (einschichtige) Epithelien akzeptiert. Erste, unerwartete Anhaltspunkte für das Vorkommen solcher Strukturen in geschichteten Epithelien veranlassten uns, eine Vielzahl dieser Epithelien verschiedener Spezies sowie daraus abgeleiteter Zellkulturen systematisch zu untersuchen. Dabei wurden vor allem die Elektronenmikroskopie und die Immuncytochemie, sowohl auf licht- als auch auf elektronenoptischer Ebene, eingesetzt. Der Schwerpunkt lag hierbei auf den TJ-Proteinen Occludin, verschiedenen Claudinen, Cingulin, ZO-1 und Symplekin [3, 38, 40]. Völlig unerwartet fanden sich, vor allem in den oberen Schichten stratifizierter Epithelien, neben den klassischen TJ-Protein positiven Strukturen, den membrane kisses, eine Reihe neuer und in Größe sowie Struktur verschiedener TJ-verwandter Strukturen: (a) Lamellated TJs

19 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie (coniunctiones laminosae): Zellverbindungen mit relativ breiten bänderförmigen Membrankontakten, die sich im Querschnitt als pentalaminar mit einer elektronendichten Mittellamelle darstellen. (b) Sandwich Junctions (iuncturae structae): Zellverbindungen mit einer ca nm breiten dichten Lamina zwischen den beiden Membranen. (c) Cross-Bridged Cell Walls ( parietes transtillati ): Zellverbindungen mit einem deutlichen inter-membranösen Abstand, der durch zahlreiche stäbchenförmige Strukturelemente überbrückt wird. All diese Strukturen kommen vielfach auch in wechselnder Abfolge vor und füllen in der Regel die Membranbereiche zwischen den Desmosomen. Elektronenoptisch erinnern die neuen TJ-Strukturen teilweise an andere Zell-Zell-Verbindungselemente, wie z.b. an Gap Junctions [38]. Nur der heute mögliche immunhistochemische Nachweis von TJ-Proteinen (und das Fehlen von Connexinen) berechtigt jetzt die Zuordnung zu den TJ-Zellverbindungen. Obwohl ihre Zahl sehr groß ist und in manchen Epithelien nahezu die der Desmosomen erreicht, wurden sie in der Vergangenheit offenbar meistens übersehen oder eben den gap junctions zugeordnet. Unsere Ergebnisse zeigen, daß TJ und TJ-verwandte Strukturen Bestandteil der Barriere aller geschichteten Epithelien, einschließlich der Epidermis, sind. In weiteren Untersuchungen wurden ebenfalls Carcinome, die von stratifizierten Epithelien ausgehen - Plattenepithelcarcinome - eingeschlossen ([40]; s. Kap. V.). Ferner wurden Aspekte der lipidvermittelten epidermalen Barriere an FATP4-defizienten Mäusen untersucht. Die Mäuse sterben an einem starken Wasserverlust kurz nach der Geburt. Die Haut zeugt dabei dramatische Veränderungen in den obersten Schichten [23]. Unter einem ähnlichen Aspekt stehen die Ergebnisse zur Regulation des Corneodesmosin Gens. Hierbei konnte gezeigt werden, daß ein Teil des Promotors dieses Gens die Expression im Haarfollikel, aber nicht in der interfollikulären Epidermis reguliert [63]. IV. Dual Location -Proteine Neuere Studien über die subzelluläre Verteilung von Zell- Zell-Verbindungsproteinen haben gezeigt, dass eine Reihe solcher Proteine auch im Kern zu finden sind. Diese Lokalisation im Kern und Zell-Zell-Verbindungsplaque impliziert, daß diese Proteine neben ihrer adhäsiven Funktion im Plaque auch eine direkte Rolle in Kernprozessen spielen, und so möglicherweise Signale von der Membran in den Kern transferieren. Hierbei muss jedoch zwischen einer transienten Anhäufung im Kern in bestimmten Stadien des Zellzyklus oder der Differenzierung und einer konstitutiven Lokalisation im Kern und an Zellverbindungen unterschieden werden. So wurde für die die desmosomalen Plakophiline (PKP1- PKP3) und das tight junction Protein Symplekin eine duale konstitutive Lokalisation in Kern und Cytoplasma beobachtet. In löslichen Zellextrakten konnten die Plakophiline PKP1 3 in Partikeln von S und S nachgewiesen werden. Die PKP2-Komplexe waren in Immunselektions- Experimenten mit Untereinheiten der RNA-Polymerase III assoziiert. Die Interaktion von PKP2 mit RNA-Polymerase III Untereinheiten, auch in in vitro Bindungstests, und der Nachweis von PKP2 im RNA-Polymerase III Holoenzym legen eine Beteiligung von PKP2 an der RNA-Polymerase IIIabhängigen Transkription nahe (Mertens et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, ). Für das Protein Symplekin, das im Kern und in Tight Junctions lokalisiert, konnten, unter Benutzung des biologischen Systems der Abteilung A010 Zellbiologie Xenopus laevis Oocyten, neuartige Symplekin enthaltende Proteinkomplexe im Karyo- und Cytoplasma identifiziert werden. Symplekin war in beiden Extrakten mit Untereinheiten des Cleavage and Polyadenylation Factors (CPSF) assoziiert. Diese Befunde implizieren eine Beteiligung von Symplekin an den beiden zellulären Vorgängen, 3 -Ende Prozessierung von prä-mrna im Kern und regulierter Polyadenylierung im Cytoplasma. V. Cytoskelett-Proteine und Zell-Zell Verbindungsproteine als Zelldifferenzierungsmerkmale in der Tumordiagnostik Antikörper gegen bestimmte Cytoskelett-Proteine werden heute weltweit zur Unterstützung der histologischen Zelltyp- und Differenzierungsgrad-Ansprache in der pathologischen Diagnostik eingesetzt [32, 42]. Nach Ergebnissen, die zur Aufklärung einer genetisch bedingten Haarerkrankung durch Mutation eines Haarkeratins führten, sind die Ergebnisse der Expression der Typ I- und Typ II-Haarkeratine, von CK6hf und von Ck6irs1-4 Bestandteil laufender Untersuchungen zur Charakterisierung und Diagnose trichocytärer Tumoren (z.b. Pilomatricom; [61]) und anderer Tumoren der Haut sowie weiterer genetische bedingter Erkrankungen der Haut (z.b. Loose Anagen Syndrome, [5]; Pseudofolliculitis barbae, [71]). Ferner wird die ektopische Expression von Haarkeratinen und den neuen Cytokeratinen in Plattenepithelcarcinomen und Teratomen untersucht (zusammen mit Prof. Dr. Roland Moll, Klinisches Zentrum für Pathologie, Universität Marburg). Plattenepithelcarcinome gehen von neoplastisch transformierten Zellen geschichteter Epithelien aus. Deshalb sind Untersuchungen der Zell-Zell-Verbindungen solcher Tumoren für die Charakterisierung des Tumors, seines Differenzierungsstatus und insbesondere der Eigenschaften seines Barrieresystems von großer Bedeutung. Dieses nimmt wahrscheinlich bedeutsamen Einfluss auf die Diffusion von Substanzen während des Tumorwachstums und somit sicherlich auch auf die Penetration von Pharmaka (z.b. Cytostatika) während der Tumorbehandlung. Dies ist auch für die Auswahl von Substanzen, die die Barriere innerhalb eines Tumors überwinden müssen, wichtig. In ersten Untersuchungen konnten wir ein Barrieresystem in Plattenepithelcarcinomen nachweisen, das vergleichbar dem der normalen stratifizierten Epithelien ist und somit in Bezug auf die Diffusion unterschiedliche Tumorareale begründet [40]. Diese Studien werden nun auf weitere und insbesondere auf unterschiedlich hoch differenzierte Carcinome ausgeweitet. Struktur und Funktion des Nukleolus und anderer Substrukturen des Zellkerns M.S. Schmidt-Zachmann In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, M.-C. Dabauvalle, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; J. Gall, Carnegie Institution, Baltimore, USA; A. Krämer, Universität Genf, Schweiz; Michael Stoehr, A016, DKFZ; M. Schnölzer, B100; DKFZ. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen eukaryotischer Zellen ließen schon früh erkennen, dass der Zellkern eine ganze Reihe distinkter Substrukturen ( Kernbodies ) enthält. Während in den letzten Jahren gezeigt werden konnte, dass diese Kernbodies eine für den jeweiligen Subtyp charakteristische biochemische Zusammensetzung aufweisen, sind ihre biologischen Funktionen noch weitestgehend unbekannt. Das besondere Interesse an 19

20 20 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie diesen Kernstrukturen liegt auch darin begründet, dass ihre Anzahl, Struktur und Zusammensetzung offensichtlich mit Veränderungen in der Genexpression, dem Differenzierungsgrad einer Zelle sowie pathologischen Veränderungen einhergeht. Die morphologisch auffälligste intranukleäre Substruktur ist der Nukleolus. Diese charakteristische Kernstruktur ist ein Beispiel für eine multifunktionelle Kerndomäne. Neben seiner bekannten Grundfunktion in der Ribosomenbiosynthese konnten dem Nukleolus in jüngster Zeit zusätzliche Funktionen sowohl bei der Zellzyklus-Kontrolle, dem Kernexport von Proteinen, bei Alterungsprozessen als auch bei der Bildung oder dem Transport verschiedenster Ribonukleoproteinpartikel nachgewiesen werden. Der Nukleolus ist seit Jahrzehnten der prominenteste Zellkernmarker für die Krebsdiagnose. Sowohl die Nukleolusstruktur als auch die dort stattfindenen Prozesse unterliegen signifikanten Veränderungen in malignen Zellen. Daher sind detaillierte Kenntnisse der Funktion und Struktur des Nukleolus, seiner molekularen Zusammensetzung sowie der Regulationsmechanismen der Ribosomenbiogenese von großer Bedeutung auch für das Verständnis der molekularen Ereignisse, die während der Entstehung von Tumorzellen stattfinden. Aufbauend auf früheren und aktuellen Ergebnissen ist eines der Hauptziele dieser Arbeitsgruppe, neue nichtribosomale Proteine des Nukleolus zu identifizieren, biochemisch und molekularbiologisch zu charakterisieren und in ihrer strukturellen Anordnung innerhalb des Nukleolus aufzuklären. Als biologisches Ausgangsmaterial dienen dafür häufig die Oocytenkerne des Krallenfrosches Xenopus laevis. Diese enthalten eine hohe Anzahl extrachromosomaler, amplifizierter Nukleolen (ca. 1000/Kern) und sind somit prädestiniert für die Untersuchung topologischer Prinzipien der Ribosomen-Biosynthese sowie der strukturellen Organisation dieser intranukleären Hauptkomponente. Ein spezieller Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die Identifizierung bzw. Charakterisierung von Strukturproteinen (Karyoskelett-Proteine) des Zellkerns. Von besonderer Bedeutung war daher die kürzlich gelungene Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines neuartigen, nukleolären Proteins NO145 aus Oocytenkernen, das sich in seinen Eigenschaften und insbesondere in seiner Topologie von allen bisher bekannten Nukleolusproteinen unterscheidet. Die biochemischen Eigenschaften von NO145 (resistent gegen Extraktionen mit Puffern hoher Ionenstärke und Detergenz) lassen den Schluss zu, dass es sich Abb. 1: (A): Differenzielle Interferenzkontrast-Aufnahme (DIC) eines Nukleolus einer Kerninhaltsspreitung von Xenopus laevis Oocyten. (B): Entsprechende konfokale Laserscan Aufnahme einer Doppelimmunfluoreszenz von Protein NO145 (grün) und Protein xnopp180 (rot). Eichstrich: 5 µm (aus: Kneissel et al Mol Biol Cell 12: ) Abteilung A010 Zellbiologie hierbei um ein Nukleolus-spezifisches Karyoskelett-Protein handelt. Die Analyse seiner Primärsequenz zeigte, dass es sich um ein neuartiges Protein handelt, das interessanterweise in einem kurzen N-terminalen Abschnitt auffällig hohe Sequenzhomologie zum Protein SCP2 der Ratte, einem strukturbildenden Protein des meiotischen Synaptonemalkomplexes, aufweist. Letzteres deutet auf eine funktionelle Verwandtschaft dieser beiden strukturbeteiligten Kernproteine hin. Die Gewinnung NO145-spezifischer Antikörper ermöglichte eine detaillierte Untersuchung dieser neuen Nukleoluskomponente. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Immunlokalisierungsstudien konnte gezeigt werden, dass NO145 spezifisch in einem filamentösen Netzwerk im Cortex der amplifizierten Nukleolen vorliegt, wobei seine Anordnung von der Konzentration bivalenter Ionen abhängig ist. Protein NO145 ist in allen Stadien der Oogenese vorhanden. Kommt es allerdings zur Eireifung und damit zur Auflösung der Kernhülle und der Nukleolen, ist es nicht mehr nachweisbar. Northern-Blot -Analysen haben allerdings gezeigt, dass das Verschwinden von NO145 nicht auf der RNA-Ebene reguliert wird. Zur Zeit wird der für die spezifische Degradation von NO145 verantwortliche Mechanismus auf molekularer Ebene analysiert. Da Protein NO145 bisher nur in den Nukleolen der Xenopus-Oocyte nachgewiesen werden konnte, sollen künftige Untersuchungen zeigen, ob eine ähnliche nukleoläre Gerüststruktur in anderen Zelltypen und Spezies durch ein homologes oder analoges Protein gebildet wird. Als Arbeitshypothese zur Funktion dieses Proteins wird eine tragende Rolle als topogenes Karyoskelett-Element vorgeschlagen: Protein NO145 bildet unter physiologischen Bedingungen ein filamentöses Netzwerk, das den nukleolären Cortex bestimmt, der nukleoläre Strukturen zu einem spezifischen Reaktionsraum (Subkompartiment) umschließt und so Größe und Aussehen der amplifizierten Oocyten-Nukleolen beeinflußt (Kneissel, 2001, Doktorarbeit an der Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg; Kneissel et al., 2001, Mol. Biol. Cell 12, ) (Abb 1). Es wurde auch damit begonnen, die nukleären bzw. nukleolären Bindungspartner gut charakterisierter, in ihrer Primärsequenz bekannter und während der Evolution hochkonservierter Nukleolusproteine (NO38, NO29, NOH61, xnopp180 etc.) sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Proteinebene zu identifizieren, um Aufschluss über mögliche Wechselwirkungen und biologische Funktionen dieser Proteine zu erhalten und die Charakterisierung topogener Komplexe des Nukleolus zu ermöglichen. Darüber hinaus wird die architektonische und/oder funktionelle Bedeutung dieser Proteine mittels RNA-Interferenz-Technik untersucht. Kürzlich gelang die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines neuartigen, evolutionär hoch konservierten Nukleolusproteins (Protein NO66). Dieses zeigt ein interessantes intrazelluläres Verteilungsmuster: neben einer signifikanten Anreicherung in den Nukleolen akkumuliert es in den meisten Zelltypen zusätzlich in distinkten nukleoplasmatischen Substrukturen. Ko-Lokalisierungsstudien mit den Proteinen Ki-67, HP1α und PCNA zeigten, dass Protein NO66 innerhalb des Kernplasmas mit bestimmten Bereichen spät replizierendem Chromatin assoziiert ist. Während biochemische Analysen daraufhinweisen, dass Protein NO66 im Komplex mit Vorläufermolekülen der großen Ribosomenuntereinheit vorliegt, ist seine Funktion bei der Bildung/ Aufrechterhaltung heterochromatischer Bereiche noch unklar. Offensichtlich übt dieses Protein neben einer wich-

21 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie tigen Funktion während der Ribosomenbiosynthese zusätzliche Funktionen während der Replikation bzw. Strukturbildung bestimmter heterochromatischer DNA-Abschnitte aus [62]. Mechanismen der Biogenese und Dynamik von Membrandomänen J. Kartenbeck In Zusammenarbeit mit: Angel Alonso, Abt. F050, DKFZ; Ursula Bantel-Schaal, Abt. F040, DKFZ; Franz Bosch, HNO-Klinik, Universität Heidelberg; Nikolaus Gassler, Institut für Pathologie, Universität Heidelberg; Ari Helenius, ETH Zürich, Schweiz; W.W. Just, Biochemie-Zentrum, Universität Heidelberg; Paul Kremer, Abt. für Neurochirurgie, Universität Heidelberg; Rudolf Leube, Institut für Anatomie, Universität Mainz; Hans-Dieter Mennel, Abt. für Neuropathologie, Philipps-Universität Marburg; Melanie Ott, Gladstone Institute of Virology and Immunology, San Francisco, USA. Abteilung A010 Zellbiologie Partielle oder vollständig reduzierte Synthese von Proteinen, die interzelluläre Kontakte aufbauen, wie z.b. die Zonula adhaerens oder die Desmosomen, wird als Hinweis auf eine maligne Entartung angesehen. In einer klinischen Studie wurde an Gewebeproben von Plattenepithelkarzinomen die Synthese von E-Cadherin, Desmoplakin und Desmoglein 2 im Hinblick auf eine potentielle prognostische Bedeutung untersucht. Dabei war zwar eine generelle Reduktion dieser Proteine, abhängig vom Differenzierungsgrad der Tumore, zu sehen, E-Cadherin aber stärker von dieser Reduktion betroffen. Umfangreiche statistische Untersuchungen zeigten, dass desmosomale Proteine als unabhängige prognostische Faktoren nicht geeignet sind. Dagegen war es möglich, einen hochsignifikanten Zusammenhang zwischen reduzierter E-Cadherin-Synthese und schlechter Prognose des Patienten herzustellen. Die prognostische Bedeutung von E-Cadherin war dabei unabhängig und stärker als der Differenzierungsgrad, der Lymphknotenstatus bei Erstdiagnose, Tumorlokalisation und sogar stärker als das Tumorstadium. Der Nachweis der E-Cadherin-Synthese sollte daher als Routineuntersuchung bei Plattenepithelkarzinomen vorgenommen werden, um das Risiko des Patienten besser beurteilen zu können und mögliche Therapiemaßnahmen direkt einleiten zu können (Bosch et al., Manuskript eingereicht). Bei der Untersuchung von Meningiomen, Tumoren, die sich von arachnoidalem Gewebe ableiten, wurden die für diese Gewebe charakteristischen desmosomalen Strukturen molekular charakterisiert. Es zeigte sich, dass sich diese Strukturen in der Arachnoidea und in den verschiedenen untersuchten meningiomalen Tumor-Subtypen aus dem vollständigen Satz desmosomaler Proteine Desmoplakin, Plakophilin 2, Desmocollin 2 und Desmoglein 2 zusammensetzen. Damit sind sie alle in gleicher Weise zum diagnostischen Nachweis von Meningiomen einsetzbar. In den arachnoidalen Zellen, die an die Dura mater grenzen ( dural border cells ) und in 60 % der untersuchten Tumore wurde außerdem noch Desmocollin 3 nachgewiesen, ein Protein, das bei Epithelien als Hinweis einer Differenzierung angesehen wird [1]. Bei der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen kommt es zu einer partiellen Aufhebung der Barrierefunktion der Enterozyten. Aus diesem Grunde wurde nach einer möglichen Fehlregulation der an den Zell-Zellverbindungen beteiligen Proteine gesucht. Bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa konnte bei Vorliegen einer aktiven Entzündung eine deutlich erniedrigte Synthese von zahlreichen Proteinen der Zell-Zell-Verbindungen beobachtet werden, während bei Vorliegen inaktiver Entzündungen nur die Proteine der Zonula adhaerens, E-Cadherin und β-catenin, betroffen waren, nicht aber desmosomale Proteine oder Proteine der Zonula occludens [14]. In einer Reihe von Kooperationen wurden (i) die Sekretion und interzelluläre Übertragung des Zelloberflächenrezeptors CD81 von Lymphozyten untersucht [13], (ii) ein Mechanismus aufgezeigt, bei dem durch einen osmotischen Schock der Rezeptor des Wachstumsfaktors über den small Rho GTPase-p38 -Stress-Kinase-Weg aktiviert wird [6], (iii) die intrazelluläre Zusammensetzung und Sekretion von rekombinaten subviralen Partikeln des Tick-Born Encephalitis Virus untersucht [43], und (iv) die Beteiligung von Anteilen des Golgi-Apparates bei der Endocytose von AA5 gezeigt [2]. Besondere zelltyp-spezifische Cytoskelett- Proteine H. Heid, W.W. Franke In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; H. Denk, K. Zatloukal, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich; H.-J. Gröne, Abt. E090, DKFZ; W. Kriz, Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; I. Moll, Hautklinik des Universitätsklinikums Hamburg- Eppendorf, Hamburg; M. Schnölzer, B100, DKFZ; W. Schulze, Abt. für Andrologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf. Das Cytoskelett des Spermienkopfes: Spezifische Strukturproteine der perinukleären Kalyx In Weiterführung unserer früheren Untersuchungen zur molekularen Zusammensetzung der Kalyxstruktur der Spermienköpfe von Säugetieren - besonders von Bullen und Menschen - und zur Identifizierung und Charakterisierung der Spermien-spezifischen basischen Proteine Cylicin I, Cylicin II und Calicin sowie des Capping Protein β3 haben wir aus Spermien-Präparationen u.a. zwei Actin-verwandte Proteine ( Actin-related proteins, Arps), das Arp-T1 und das Arp-T2, und das Selenoprotein PHGPx entdeckt und mit Hilfe spezifischer Antikörper in der Kalyx-Struktur lokalisiert [18]. Bei beiden Proteinen, Arp-T1 und Arp-T2, handelt es sich um neuartige Proteine, die hier offenbar auch eine neuartige Funktion haben, jedenfalls keine Kristallkeimbildung für Aktinfilamente. Die Bedeutung und genaue Anordnung dieser spezifischen Proteine bei der Bildung der Cytoskelettstruktur des Spermienkopfes und die Regulation ihrer Synthese soll näher untersucht werden. Von der Andrologie-Abteilung der Haut- und Poliklinik des UKE in Hamburg sollen diverse Hodenbiopsien erhalten werden, z.b. von Azoospermie-Patienten bzw. bestimmten Fertilisierungsstörungen, und u.a. auf Anomalien bezüglich der genannten Proteine untersucht werden. Berichte zu Spermien-Missbildungen (Teratozoospermien; u.a. bei dem Globozoospermie-Syndrom, sog. Rundköpfe ) bei Fehlen oder falscher Anordnung einiger dieser Proteine geben in jüngerer Fachliteratur Hinweise auf die Wichtigkeit solcher Proteine. Drebrin-haltige Strukturen in nichtneuronalen Zellen und ihre Funktionen Ausgehend von unserem Befund, daß das Actin-bindende Protein Drebrin keineswegs auf Neuronen beschränkt ist, sondern in vielen verschiedenen Zelltypen z.t. in beträchtlichen Mengen und in bestimmten Strukturen (vgl. Peitsch 21

22 22 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie et al., 1999, Eur. J. Cell Biol., 78, ; 2001, Eur. J. Cell Biol., 80, ) auftritt, ist die Form des Vorkommens in verschiedenen Geweben, u.a. auch in Nieren biochemisch bestimmt worden, wobei auch Hinweise auf besondere Drebrin-haltige Partikel ( Drebrosomen ) gefunden wurden. Drebrin wurde vor allem auch in den Nierenglomeruli stark angereichert, vor allem in Mesangialzellen sowie in foot processes von Podocyten [45]. Durch Mikrosequenzierung von Proteinen und Peptiden wurden in Kooperation mit verschiedenen Arbeitsgruppen weitere neue Proteine entdeckt und mittels spezifisch hergestellter Antikörper charakterisiert sowie lokalisiert [8, 11, 27, 35, 45, 52, 55, 59, 62, 69]. Publikationen (* = externer Koautor, Mitglieder der Abteilung sind durch Fettdruck hervorgehoben) [1] Akat, K., *Mennel, H.-D., *Kremer, P., *Gassler, N., Bleck, C.K.E., Kartenbeck, J Molecular characterization of desmosomes in meningiomas and arachnoidal tissue. Acta Neuropathol. 106, [2] Bantel-Schaal, U., Hub, B., Kartenbeck, J Endocytosis of adeno-associated virus type 5 leads to accumulation of virus particles in the Golgi compartment. J. Virol. 76, [3] *Brandner, J.M., *Kief, S., Grund, C., *Rendl, M., *Houdek, P., Kuhn, C., *Tschachler, E., Franke, W.W., *Moll, I Organization and formation of the tight junction-system in human epidermis and cultured keratinocytes. Eur. J. Cell Biol. 81, [4] Cerdà, J., Grund, C., Franke, W.W., *Brand, M Molecular characterization of calymmin, a novel notochord sheath-associated extracellular matrix protein in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 224, [5] *Chapalain, V., Winter, H., Langbein, L., *LeRoy, J.M., *Labrèze, C., *Nikolic, M., Schweizer, J., *Taïeb, A Is the loose anagen hair syndrome a keratin disorder? A clinical and molecular study. Arch. Dermatol. 138, [6] Cheng, H., Kartenbeck, J., Kabsch, K., Mao, X., Marqués, M., Alonso, A Stress kinase p38 mediates EGFR transactivation by hyperosmolar concentrations of sorbitol. J. Cell. Physiol. 192, [7] *Chou, Y.-H., *Khuon, S., Herrmann, H., *Goldman, R.D Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol. Biol. Cell 14, [8] Cui, Y., König, J., Nies, A.T., Pfannschmidt, M., Hergt, M., Franke, W.W., *Alt, W., *Moll, R., Keppler, D Detection of the human organic anion transporters SLC21A6 (OATP2) and SLC21A8 (OATP8) in liver and hepatocellular carcinoma. Lab. Invest. 83, [9] Dorr, A., *Kiermer, V., Pedal, A., Rackwitz, H.-R., *Henklein, P., *Schubert, U.,*Zhou, M.-M., *Verdin, E., Ott, M Transcriptional synergy between Tat and PCAF is dependent on the binding of acetylated Tat to the PCAF bromodomain. EMBO J. 21, [10] Dreger, C.K., König, A.R., Spring, H., Lichter, P., Herrmann, H Investigation of nuclear architecture with a domain-presenting expression system. J. Struct. Biol. 140, [11] Eshkind, L., Tian, Q., Schmidt, A., Franke, W.W., *Windoffer, R., *Leube, R.E Loss of desmoglein 2 suggests essential functions for early embryonic development and proliferation of embryonal stem cells. Eur. J. Cell Biol. 81, [12] Freidekind, O Funktionelle Analyse der Filamentbildung von humanem Vimentin mittels Mutagenese der Intermediärfilament-Konsensussequenz in Helix 1A. Diplomarbeit. Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg. Abteilung A010 Zellbiologie [13] Fritzsching, B., Schwer, B., Kartenbeck, J., Pedal, A., *Horejsi, V., Ott, M Release and intercellular transfer of cell surface CD81 via microparticles. J. Immunol. 169, [14] *Gassler, N., Schnölzer, M., *Rohr, C., *Helmke, B., Kartenbeck, J., *Grünewald, S., *Laage, R., *Schneider, A., *Kränzlin, B., *Bach, A., *Otto, H., *Autschbach, F Expression of calnexin reflects Paneth cell differentiation and function. Lab. Invest. 82, [15] *Gassler, N., *Schneider, A., *Kopitz, J., Schnölzer, M., *Obermüller, N., Kartenbeck, J., *Otto, H.F., *Autschbach, F Impaired expression of Acyl-CoA-synthetase 5 in epithelial tumors of the small intestine. Hum. Pathol. 34, [16] Görisch, S.M., Richter, K., Scheuermann, M.O., Herrmann, H., Lichter, P Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Exp. Cell Res. 289, [17] *Haubold, K., Herrmann, H., *Langer, S.J., *Evans, R.M., *Leinwand, L.A., *Klymkowsky, M.W Acute effects of desmin mutations on cytoskeletal and cellular integrity in cardiac myocytes. Cell Motil. Cytoskel. 54, [18] Heid, H.W., Figge, U., Winter, S., Kuhn, C., Zimbelmann, R., Franke, W.W Novel actin-related proteins Arp-T1 and Arp-T2 as components of the cytoskeletal calyx of the mammalian sperm head. Exp. Cell Res. 279, [19] Herrmann, H., *Aebi, U Stress-Fänger und Chromatin-Organisatoren: Hochdynamischen intrazellulären Filamentsystemen auf der Spur. BIOSpektrum 8, [20] Herrmann, H., Wedig, T., *Porter, R.M., *Lane, E.B., *Aebi, U Characterization of early assembly intermediates of recombinant human keratins. J. Struct. Biol., 137, [21] Herrmann, H., *Foisner, R Intermediate filaments: novel assembly models and exciting new functions for nuclear lamins. Visions and Reflections. Cell. Mol. Life Sci. 60, [22] Herrmann, H., *Hesse, M., Reichenzeller, M., *Aebi, U., *Magin, T.M The functional complexity of intermediate filament cytoskeletons: from structure to assembly to gene ablation. Int. Rev. Cytol. 223, [23] *Herrmann, T., van der Hoeven, F., Gröne, H.-J., *Stewart, A.F., Langbein, L., *Kaiser, I., *Liebisch, G., *Gosch, I., *Buchkremer, F., *Drbonik, W., *Schmitz, G., *Stremmel, W Mice with targeted disruption of the fatty acid transport protein 4 (Fatp 4, Slc27a4) gene show features of lethal restrictive dermopathy. J. Cell Biol. 161, [24] *Hofemeister, H., Kuhn, C., Franke, W.W., *Weber, K., *Stick, R Conservation of the gene structure and membrane-targeting signals of germ cell-specific lamin LIII in amphibians and fish. Eur. J. Cell Biol. 81, [25] *Hoffmann, K., Dreger, C.K., *Olins, A.L., *Olins, D.E., *Shultz, L.D., *Lucke, B., *Karl, H., *Kaps, R., *Müller, D., *Vayá, A., *Aznar, J., *Ware, R.E., *Cruz, N.S., *Lindner, T.H., Herrmann, H., *Reis, A., *Sperling, K Mutations in the gene encoding the lamin B receptor produce an altered nuclear morphology in granulocytes (Pelger-Huët anomaly). Nat. Genet. 31, [26] Hofmann, I Interaktionen von Cytoskelett- und Zell-Zell-Verbindungsproteinen. Habilitationsschrift. Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg. [27] Hofmann, I., Schnölzer, M., *Kaufmann, I., Franke, W.W Symplekin, a constitutive protein of karyo- and cytoplasmic particles involved in mrna biogenesis in Xenopus laevis oocytes. Mol. Biol. Cell 13, [28] Hofmann, I., Winter, H., Mücke, N., Langowski, J., Schweizer, J The in vitro assembly of hair follicle keratins: comparison of cortex and companion layer keratins. Biol. Chem. 383,

23 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie [29] *Hollnagel, A., Grund, C., Franke, W.W., *Arnold, H.-H The cell adhesion molecule M-cadherin is not essential for muscle development and regeneration. Mol. Cell. Biol. 22, [30] *Janmey, P.A., *Leterrier, J.-F., Herrmann, H Assembly and structure of neurofilaments. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 8, [31] Jave-Suarez, L.F., Winter, H., Langbein, L., Rogers, M.A., Schweizer, J HOXC13 is involved in the regulation of human hair keratin gene expression. J. Biol. Chem. 277, [32] Kartenbeck, J., Langbein, L Epithelien. In: Lehrbuch Vorklinik (H.G. Schmidt, K. Unsicker, eds.), Deutscher Ärzteverlag, Köln; Vol. B, Kap. B16, pp [33] Kartenbeck, J., *Leube, R Zellkontakte. In: Lehrbuch Vorklinik (H.G. Schmidt, K. Unsicker, eds.), Deutscher Ärzteverlag, Köln; Vol. A, Kap. A18, pp [34] *Kirfel, J., *Peters, B., Grund, C., *Reifenberg, K., *Magin, T.M Ectopic expression of desmin in the epidermis of transgenic mice permits development of a normal epidermis. Differentiation 70, [35] Koeser, J., *Troyanovsky, S.M., Grund, C., Franke, W.W De novo formation of desmosomes in cultured cells upon transfection of genes encoding specific desmosomal components. Exp. Cell Res. 285, [36] *Kurzen, H., *Manns, S., Dandekar, G., Schmidt, T., Prätzel, S., Kräling, B.M Tightening of endothelial cell contacts: a physiologic response to cocultures with smoothmusle-like 10T1/2 cells. J. Invest. Dermatol. 119, [37] *Kuznetsov, N.V., *Sandblad, L., *Hase, M.E., Hunziker, A., Hergt, M., *Cordes, V.C The evolutionarily conserved single copy gene for murine Tpr encodes one prevalent isoform in somatic cells and lacks paralogs in higher eukaryotes. Chromosoma 111, [38] Langbein, L., Grund, C., Kuhn, C., Praetzel, S., Kartenbeck, J., *Brandner, J.M., *Moll, I., Franke, W.W Tight junctions and compositionally related junctional structures in mammalian stratified epithelia and cell cultures derived therefrom. Eur. J. Cell Biol. 81, [39] Langbein, L., Rogers, M.A., Praetzel, S., *Aoki, N., Winter, H., Schweizer, J A novel epithelial keratin, hk6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells (Flügelzellen) of the human hair follicle. J. Invest. Dermatol. 118, [40] Langbein, L., Pape, U.-F., Grund, C., Kuhn, C., Praetzel, S., *Moll, I., *Moll, R., Franke, W.W Tight junction-related structures in the absence of a lumen: Occludin, claudins and tight junction plaque proteins in densely packed cell formations of stratified epithelia and squamous cell carcinomas. Eur. J. Cell Biol. 82, [41] Langbein, L., Rogers, M.A., Praetzel, S., Winter, H., Schweizer, J K6irs1, K6irs2, K6irs3, and K6irs4 represent the inner-root-sheath-specific type II epithelial keratins of the human hair follicle. J. Invest. Dermatol. 120, [42] *Leube, R.E., Langbein, L., Kartenbeck, J Differenzierungsmarker in der Gewebe- und Tumordiagnostik: Molekulare Komponenten der Intermediärfilamente und ihrer Verankerungsstrukturen in Epithelzellen. In: Onkologie (W.J. Zeller, H. zur Hausen, eds., 1995) Ecomed Verlagsgesellschaft, Landsberg/Lech; Chapter II-1, Supplement 15/03, pp [43] *Lorenz, I.C., Kartenbeck, J., *Mezzacasa, A., *Allison, S.L., *Heinz, F.X., *Helenius, A Intracellular assembly and secretion of recombinant subviral particles from tick-borne encephalitis virus. J. Virol. 77, [44] Peitsch, W.K Drebrin und Drebrosomen Weit verbreitete Zellkomponenten des Aktin-Cytoskelett-Systems. Doktorarbeit. Fachbereich Medizin, Universität Hamburg. Abteilung A010 Zellbiologie [45] Peitsch, W.K., Hofmann, I., *Endlich, N., Prätzel, S., Kuhn, C., Spring, H., Gröne, H.-J., *Kriz, W., Franke, W.W Cell biological and biochemical characterization of drebrin complexes in mesangial cells and podocytes of renal glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 14, [46] Reichenzeller, M Strukturelle und dynamische Analyse des Interchromosomalen Domänen-Kompartiments. Doktorarbeit. Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg. [47] # Rogers, M.A., # Langbein, L., Winter, H., Ehmann, C., Praetzel, S., Schweizer, J Characterization of a first domain of human high glycine-tyrosine and high sulfur keratin-associated protein (KAP) genes on chromosome 21q22.1. J. Biol. Chem. 277, ( # equal contribution) [48] *Shimomura, Y., *Aoki, N., Rogers, M.A., Langbein, L., Schweizer, J., *Ito, M hkap1.6 and hkap1.7, two novel human high sulfur keratin-associated proteins are expressed in the hair follicle cortex. J. Invest. 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Cell Sci. 116, [53] *Strelkov, S.V., Herrmann, H., *Geisler, N., Wedig, T., Zimbelmann, R., *Aebi, U., *Burkhard, P Conserved segments 1A and 2B of the intermediate filament dimer: their atomic structures and role in filament assembly. EMBO J. 21, [54] *Strelkov, S.V., Herrmann, H., *Aebi, U Molecular architecture of intermediate filaments. BioEssays 25, [55] *Stumptner, C., *Fuchsbichler, A., Heid, H., *Zatloukal, K., *Denk, H Mallory body - a disease-associated type of sequestosome. Hepatology 35, [56] *Thibaut, S., *Collin, C., Langbein, L., Schweizer, J., *Gautier, B., *Bernard, B.A Hair keratin pattern in human hair follicles grown in vitro. Exp. Dermatol. 12, [57] *Walther, T.C., *Pickersgill, H.S., Cordes, V.C., *Goldberg, M.W., *Allen, T.D., *Mattaj, I.W., *Fornerod, M The cytoplasmic filaments of the nuclear pore complex are dispensable for selective nuclear protein import. J. Cell Biol. 158, [58] *Wang, Z., *Wong, P., Langbein, L., Schweizer, J., *Coulombe, P.A Type II epithelial keratin 6hf (K6hf) is expressed in the companion layer, matrix, and medulla in anagenstage hair follicles. J. Invest. Dermatol. 121, [59] *Zatloukal, K., *Stumptner, C., *Fuchsbichler, A., Heid, H., Schnölzer, M., *Kenner, L., *Kleinert, R., *Prinz, M., *Aguzzi, A., *Denk, H p62 is a common component of cytoplasmic inclusions in protein aggregation diseases. Am. J. Pathol. 160, [60] *Zhou, Q., *Toivola, D.M., *Feng, N., *Greenberg, H., Franke, W.W., *Omary, M.B Keratin 20 helps maintain intermediate filament organization in intestinal epithelia. Mol. Biol. Cell 14, [61] *Cribier, B., *Peltre, B., *Grosshans, E., Langbein, L., Schweizer, J On the regulation of hair keratin expression: Lessons from studies in pilomatricomas. J. Invest. Dermatol. 122,

24 24 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie [62] Eilbracht, J., Reichenzeller, M., Hergt, M., Schnölzer, M., Heid, H., Stöhr, M., Franke, W.W., Schmidt-Zachmann, M NO66 - a highly conserved dual location protein in the nucleolus and in a special type of synchronously replicating chromatin. Mol. Biol. Cell 15, [63] *Gallinaro, H., *Jonca, N., Langbein, L., *Vincent, C., *Simon, M., *Serre, G., *Guerrin, M A 4.2 kb upstream region of the human corneodesmosin gene directs site-specific expression in hair follicles and hyperkeratotic epidermis of transgenic mice. J. Invest. Dermatol. 122, [64] *Gassler, N., *Kopitz, J., *Tehrani, A., *Ottenwälder, B., Schnölzer, M., Kartenbeck, J., Lyer, S., *Autschbach, F., Poustka, A., *Otto, H.F., Mollenhauer, J Expression of acyl-coa synthetase 5 reflects the state of villus architecture in human small intestine. J. Pathol. 202, [65] Herrmann, H., *Aebi, U Intermediate Filaments: Molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular scaffolds. Annu. Rev. Biochem. 73, [66] Jave-Suarez, L.F., Langbein, L., Winter, H., Praetzel, S., Rogers, M.A., Schweizer, J Androgen regulation in the human hair follicle: The type I hair keratin hha7 is a direct target gene in hair follicle trichocytes. J. Invest. Dermatol. 122, [67] Mücke, N., *Kreplak, L., Kirmse, R., Wedig, T., Herrmann, H., *Aebi, U., Langowski, J Assessing the flexibility of intermediate filaments by atomic force microscopy. J. Mol. Biol. 335, [68] Rogers, M.A., Langbein, L., Winter, H., Beckmann, I., Praetzel, S., Schweizer, J Hair keratin associated proteins: Characterization of a second high sulfur KAP gene domain on human chromosome 21. J. Invest. Dermatol. 122, [69] *Strand, S., *Vollmer, P., *van den Abeelen, L., *Gottfried, D., *Alla, V., Heid, H., *Kuball, J., *Theobald, M., *Galle, P.R., *Strand, D Cleavage of CD95 by matrix metalloproteinase-7 induces apoptosis resistance in tumour cells. Oncogene, 23 (20), [70] *Werner, N.S., *Windoffer, R., *Strnad, P., Grund, C., *Leube, R.E., *Magin, T.M Epidermolysis bullosa simplextype mutations alter the dynamcis of the keratin cytoskeleton and reveal a contribution of actin to the transport of keratin subunits. Mol Biol. Cell 15, /published online Dec [71] Winter, H., *Schissel, D., *Parry, D.A.D., *Smith, T.A., *Liovic, M., *Lane, E.B., Edler, L., Langbein, L., Jave-Suarez, L.F., Rogers, M.A., *Wilde, J., *Peters, G., Schweizer, J An unusual Ala12Thr polymorphism in the 1A α-helical segment of the companion layer-specific keratin K6hf: Evidence for a risk factor in the etiology for the common hair disorder pseudofollicultis barbae. J Invest Dermatol, 122, Abteilung A010 Zellbiologie Embryologie (A015) Leiter: Prof. Dr. Klaus Wayß (bis Mai 2003), danach PD Dr. Johannes Schenkel (kommissarisch) Mitarbeiter Andrea Rausch Marie Schubert In der Embryobank des DKFZ wurden bisher im Auftrag vieler Arbeitsgruppen als Serviceleistung etwa Mausembryonen eingefroren. Die Kryokonservierung von 150 transgenen Mausstämmen wurde abgeschlossen, weitere 40 sind derzeit in Arbeit. Auf eine weitere Zucht kann dann verzichtet werden, die meistens wissenschaftlich sehr wertvollen Linien lassen sich jederzeit wieder revitalisieren und sind somit auch gegen einen überraschenden Verlust gesichert. Eine reine Erhaltungszucht dieser so gesicherten Linien würde einen zusätzlichen Tierbedarf von bis Tiere pro Jahr bzw. die permanente Belegung von etwa 450 Käfigen bedeuten. Dies ist auch ein wesentlicher Beitrag zum Tierschutz und zur 3R -Systematik von Russel und Burch. Zudem ist die Embryologie an der Durchführung von hygienischen Sanierungsprogrammen beteiligt. Die Erfahrungen mit der Kryokonservierung während der vergangenen acht Jahre sind als Manuskript zur Publikation eingereicht und wurden im Jahr 2003 beim Annual Symposium von Scand-LAS (skandinavische versuchstierkundliche Gesellschaft) in Lahti in Finnland, im Rahmen einer versuchstierkundlichen Veranstaltung an der Univ. Basel sowie als Poster im Rahmen der 41. wissenschaftlichen Tagung der Gesellschaft für Versuchstierkunde in Göttingen präsentiert. Seit Herbst 2003 beteiligt sich die Embryobank an der Ausbildung zum Tierpfleger des DKFZ. Publikationen Wayss, K., Klefenz, M. and Schenkel, J.: Cryopreservation of transgenic mouse embryos (2003) Mice and Men for Science, 33rd Scand-LAS Annual Symposium, Lahti, Finland, 49. Wayss, K., Klefenz, M. and Schenkel, J.: Kryokonservierung transgener Mausembryonen (2003) 41. wissenschaftliche Tagung der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS), 137. Wayss, K., Klefenz, M. and Schenkel, J.: Cryopreservation of transgenic mouse embryos - an eight years experience (2004) submitted for publication.

25 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A020 Molekularbiologie der Zelle I Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A020) Leiter Prof. Dr. med. Günther Schütz Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Wolfgang Schmid Dr. Christiane Otto (- 8/02) Dr. Erich Greiner (- 6/02) Dr. Stefan Berger Dr. Emilio Casanova (- 7/02) Dr. Lukas Schwake (- 12/02) Dr. Thomas Lemberger Dr. Marc Kenzelmann Dr. Jan Tuckermann Dr. Tim Wintermantel (12/02 -) Dr. Thorsten Belz (9/03 -) Dr. Maja Vujic (7/02-10/03) Dr. Anna Kleyman (8/02 -) Dr. Daniel Gau (- 6/02) Dr. Susanne Bleckmann (-12/02) Dr. Brenda Stride (4/03 -) Dr. Minqiang Chai (12/03 -) Stipendiaten Dr. Brenda Stride, Kanada (- 3/03) Gastwissenschaftler Dr. Minqiang Chai, China (- 11/03) Dr. Rosanna Parlato (6/02-6/04) Diplomanden Yvonne Begus (10/03 -) Sven Wichert (12/03 -) Gitta Erdmann (7/02-2/03) Doktoranden Maja Vujic (- 7/02) Milen Kirilov (1/01-) Joachim Elzer (3/03 -) Gitta Erdmann (3/03 -) Stephanie Ridder (7/03 -) Caroline Ronzaud (9/02 -) Myriam Grüner (8/02-1/03) Tim Wintermantel (- 12/02) Technisches Personal Dagmar Bock Ralf Klären Frank Exner Heike Alter Myriam Grüner (- 7/02) Stefanie Stotz Magdalena Westphal Andrea Takacs (9/02 -) Annette Klewe-Nebenius (- 4/02) Daniela Nebenius-Oosthuizen (- 4/02) Sekretariat Monika Bock Die Abteilung Molekularbiologie der Zelle I untersucht mit genetischen Methoden die Rolle von hormonabhängigen Signalketten in der zell- und entwicklungsspezifischen Genaktivierung. Durch gezielte Geninaktivierung in ausgewählten Zellen und Geweben werden Komponenten in den Signalwegen für Gluko-/Mineralokortikoide und Östrogen sowie camp inaktiviert und die Auswirkung dieser Mutationen auf Differenzierung, Physiologie in der Maus im einzelnen untersucht. Um die Funktion dieser regulatorischen Proteine in spezifischen Zellen besser zu verstehen, führen wir Expressionsanalysen durch, um die unmittelbaren Zielgene für diese signalabhängigen Transkriptionsfaktoren zu bestimmen. Von diesen Untersuchungen erwarten wir wichtige Einblicke in die Mechanismen des normalen und entarteten Zellwachstums, der Differenzierung und der Funktion von Zellen und Geweben. Rolle hormonabhängiger Signalketten in der Entwicklung und Funktion von Zellen und Geweben G. Schütz Ziel unserer Arbeiten ist die Charakterisierung von Mechanismen, die zur Aktivierung von Genen in spezifischen Zellen und Geweben in Abhängigkeit von externen Signalen führen. Hormonabhängige Signalketten sind in vielen Zellen vorhanden, viele davon sind ubiquitär. Eine Frage, die uns seit langem beschäftigt, ist, wie solche ubiquitären Signale letztlich zu zellspezifischen Antworten führen. Von besonderem Interesse für uns ist die Rolle der camp-abhängigen und der Glukokortikoid-/Mineralokortikoid- und Östradiolvermittelten Genexpression während der Entwicklung und in der Physiologie. Um die Rolle dieser Rezeptoren und von camp-abhängigen Transkriptionsfaktoren in der Entwikklung und in physiologischen und pathologischen Prozessen zu verstehen, haben wir die Gene, die für diese Proteine kodieren, in der Maus gezielt zerstört. Da Mutationen in diesen Genen häufig zur Lethalität führen (dies gilt für den Gluko- und Mineralokortikoid-Rezeptor und für CREB), haben wir mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems organspezifische Mutationen erzeugt. Selektive Inaktivierung des CREB-Gens und des Glukokortikoid- und Mineralokortikoid-Rezeptorgens erlauben uns nun, die Funktion dieser Signalmoleküle genau zu beschreiben. Diese Mutationen werden genuzt, um Zielgene für diese Transkriptionsfaktoren in den jeweiligen Zielzellen mit Hilfe von Expressionsprofilanalysen zu definieren und zu charakterisieren. Mit Hilfe der RNA Interferenz in Zellen und im Tier wird die Funktion ausgewählter Zielgene molekulargenetisch definiert. Analyse der Funktion von camp-abhängigen Transkriptionsfaktoren durch gezielte Gen- Inaktivierung E. Casanova, D. Gau, T. Lemberger, R. Parlato, W. Schmid, S. Wichert Extrazelluläre Signale steuern die Genaktivität durch Kontrolle von intrazellullären Signaltransduktionswegen. Während Steroidhormone durch die Bindung an ihren Rezeptor direkt die Genaktivität beeinflussen, wirken Hormone, die an Rezeptoren an der Zelloberfläche binden, durch intrazelluläre Signalkaskaden. Viele Hormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter regulieren die Genaktivität über Aktivierung der Proteinkinase A und anderer Kinasen, die die Proteine CREB, CREM und ATF-1 modifizieren. Diese Proteine enthalten eine bzip-dna Bindungsdomäne und wirken als Homo- oder Heterodimere. Um die Rolle dieser drei Proteine in der signalabhängigen Genexpression zu definieren, haben wir Mausmutanten erzeugt, bei denen die Gene für CREB, CREM und ATF-1 gezielt zerstört wurden. Inaktivierung der Gene für CREB und ATF1 führen zur frühen Lethalität auf Grund ausgedehnter Apoptosen [1]. Da Tiere ohne CREB kurz nach der Geburt sterben, haben wir mit Hilfe des Cre/loxP Systems zell- und gewebsspezifische Mutationen in den drei Mitgliedern der CREB-Familie erzeugt [2-8]. Expression der Cre-Rekombinase in der Leber erlaubte Analyse der hepatozytenspezifischen Proliferation und der Entwicklung des Gallengangsystems [9, 10]. 25

26 26 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Mit Hilfe dieses Ansatzes wurden mehrere Mutationen im zentralen Nervensystem gesetzt. Wir haben das CREB-Gen mit Hilfe des Nestin-Promoters für die Expression der Cre- Rekombinase während der Entwicklung inaktiviert oder postnatal durch Expression unter Kontrolle des CaMKIIα- Gens oder des Dopamin-1 Rezeptorgens [4]. Wird das CREB- Gen früh in der Entwicklung in Abwesenheit von CREM inaktiviert, so beobachten wir ausgedehnte Apoptosen im zentralen Nervensystem. Wird das CREB-Gen nach der Geburt inaktiviert durch entsprechende Wahl der Expressionskassette für die Expression der Cre, sehen wir im CREM -/- Hintergrund progressive Neurodegeneration in ausgewählten Regionen des Hippocampus und des dorsolateralen Striatums [4]. Diese Ergebnisse weisen auf die Rolle dieser Proteine in der Regulation des zellulären Überlebens von Neuronen hin und geben mögliche Hinweise auf die Entwicklung der Huntington schen Erkrankung. Wir betrachten diese Mäuse als wertvolles Mittel, um die Abläufe zu definieren, die für das Überleben von Neuronen wichtig sind. Um diese Funktion genauer zu definieren, führen wir ausgedehnte Expressionsprofilanalysen mit Oligo-DNA-Chips durch [11]. Auf diese Weise konnten wir starke Veränderungen im Cholesterinstoffwechsel der Hirnzellen erkennen - die mrnas für alle Cholesterin synthetisierenden Enzyme sind bei stark erhöhtem Cholesterin erniedrigt - und viele der Gene, die an der oxydativern Phosphorylierung beteiligt sind, sind signifikant erniedrigt. Für diese Analysen war die sog. gene set enrichment analysis, wie sie vor einigen Monaten für die Interpretation von Expressionsprofilanalysen vorgeschlagen wurde, extrem hilfreich. Neben der Phosphorylierung von CREB am Serinrest Ser 133 beobachteten wir eine Phosphorylierung am Ser 142. Wir konnten zeigen, daß diese Modifikation für die circadiane Uhr wichtig ist. Im suprachiasmatischen Nukleus (SCN) wird CREB nicht nur an Ser 133, sondern auch an Ser 142 phosphoryliert. Um die Signifikanz dieser Modifikation in vivo zu definieren, haben wir eine Punktmutation in der Maus an Ser 142 erzeugt, sodaß keine Phosphorylierung mehr ablaufen kann. Licht-abhängige Phasenverschiebung sowie Expression von Zielgenen von CREB sind in der CREB S142A Mutante stark abgeschwächt. Diese Beobachtungen zeigen eine neue phosphorylierungsabhängige Regulation der CREB-Aktivität an [12]. Der PACAP-type-I-receptor (PAC1) ist ein im G-Protein gespeicherter Rezeptor, dessen Funktion und Beeinflussung des camp-abhängigen Signalwegs wir durch Mutationen charakterisiert haben [13, 14]. Mäuse ohne PACAP im Hippocampus zeigen eingeschränktes assoziiertes Lernen, ähnlich wie Dm-Mutationen im PACAP-verwandten Gen amnesiac! Analyse der Funktion des Rezeptors für Glukokortikoide, Mineralokortikoide und Östradiol T. Belz, S. Berger, J. Elzer, E. Greiner, M. Kenzelmann, A. Kleyman, S. Ridder, C. Ronzaud, W. Schmid, B. Stride, J. Tuckermann, M. Vujic, T. Wintermantel Die Wirkung von Steroiden wird über spezifische Rezeptoren, die die Transkription von Zielgenen aktivieren oder hemmen, vermittelt. Kortikosteroide kontrollieren die Expression von überlappenden Genen durch zwei verwandte Rezeptoren [15]. Der Glukokortikoidrezeptor ist in der Abteilung A020 Molekularbiologie der Zelle I Lage, Glukokortikoide und Mineralokortikoide zu binden [15]. Ein spezifischer enzymatischer Mechanismus, der zur Inaktivierung von Glukokortikoiden in bestimmten Zielzellen wie z.b. der Niere führt, garantiert, daß in diesen Zielgeweben nur Mineralokortikoide an den Mineralokortikoidrezeptor binden können. Im zentralen Nervensystem und im Gefäßsystem können Kortikosteroide zur Aktivierung beider Rezeptoren führen. Mäuse ohne Glukokortikoidrezeptor sterben kurz nach der Geburt wegen schwerer Atelektase der Lunge und wegen fehlender Aktivierung glukoneogenetischer Gene. Tiere ohne Mineralokortikoid-Rezeptor sterben wegen extremen Salzverlustes kurz nach der Geburt. Wir vermuten, daß Mineralokortikoide die Stabilität bzw. Aktivität des Natriumkanals in einer bisher unbekannten Weise regulieren [16]. Wichtige Einblicke in die Regulationsmechanismen des Glukokortikoidrezeptors konnten durch eine von uns erzeugte funktionsselektive Mutation im Rezeptor erreicht werden [17]. Diese Mutante erlaubte die antiinflammatorische Wirkung des Rezeptors genauer zu definieren. Der dimerisierungsdefekte Glukokortikoidrezeptor ist in der Lage, die Aktivierung von Genen für Zytokine nach LPS-Behandlung in T-Zellen und in Makrophagen zu verhindern [18]. Überexpression des Rezeptors durch Einführung zusätzlicher Kopien über Transgenese mit künstlichen Hefechromosomen führte zu Tieren, die eine vermehrte Resistenz gegenüber dem endotoxischem Schock nach LPS-Behandlung aufzeigen [19]. Mit dieser funktionsselektiven Mutation überprüfen wir z.z. die außerordentlich wichtige Frage, ob selektive Rezeptorliganden die gewünschten antiinflammatorischen Wirkungen zeigen, ohne die Nebenwirkungen wie z.b. Osteoporose aufzuweisen. Die bisher gewonnenen Daten zeigen, daß bakterielle Infektionen und der daraus folgende endotoxische Schock durch den dimerisierungsdefekten Glukokortikoidrezeptor nicht aufgehoben werden kann (M. Vujic, W. Schmid, unveröffentlicht). Für diese Analyse ist die von uns weiter entwickelte Methodik des expression profiling mit hoher Sensitivität mit Affymetrix-Chips von großem Nutzen [20]. Interessanterweise ist der Rezeptor auch in der Lage, Vorgänge zu beeinflussen, die ausschließlich im Zytoplasma ablaufen [21]. Mäuse ohne Glukokortikoidrezeptor im Gehirn zeigen eine stark beeinträchtigte Regulation der HPA-Achse [22-25] Eine weitere Mutation, bei der der Glukokortikoidrezeptor nicht nur im zentralen Nervensystem, sondern auch in Zellen der vorderen Hypohphyse inaktiviert wurde, führen zur frühen Lethalität der Mäuse bei stark verändertem Thymus und der Niere. Diese Veränderungen sind vermutlich bedingt durch die etwa tausendfach erhöhten Spiegel von Kortikosteroiden im Serum. Um die Funktion des Rezeptors im ZNS genauer erfassen zu können und die frühe Lethalität zu vermeiden, entwickeln wir eine induzierbare Mutation mit Hilfe eines Fusionsproteins der Cre-Rekombinase mit der Ligandenbindungsdomäne des Östradiolrezeptors (G. Erdmann, unveröffentlicht). Mit Hilfe dieser regulierbaren Cre-Rekombinase erwarten wir, daß wir die Mutation unter Vermeidung der frühen Lethalität besser studieren können. Diese Maus soll uns Einblicke in die Funktion des Rezeptors in der Entwicklung der Sucht gewähren. Analyse der Rolle des Glukokortikoidrezeptors in der Sucht nach Inaktivierung im ZNS zeigt, daß Glukokortikoid-abhängige Regulation von großer Bedeutung für die Ausbildung der Sucht ist [26]. Leberspezifische Inaktivierung des Glukokortikoidrezeptors führt zur starken Beeinträchtigung des Wachstums [27].

27 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Diese Ergebnisse legen eine wichtige Funktion des Glukokortikoidrezeptors in der Regulation des Größenwachstums nahe. Interessanterweise erfolgt die Hemmung des Wachstums nicht in der dimerisierungsdefekten Glukokortikoidrezeptor-Mutante. Detaillierte Analyse der Rolle des Rezeptors in der Wachstumsregulation zeigt, daß der Rezeptor als Co-Aktivator für Stat5 wirkt, ohne DNA binden zu müssen. Weiter führt Verlust des Glukokortikoidrezeptors in der Leber zur schweren Hypoglykämie in experimentell gesetztem Diabetes. Diese Beobachtungen weisen auf einen wichtigen Beitrag der Glukokortikoid-abhängigen Genexpression in der Entwicklung der diabetischen Stoffwechsellage hin [28]. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von U. Schibler, Universität Genf, konnten wir zeigen, daß Glukokortikoide und der Rezeptor an der Regulation der circadianen Uhr [29] sowie bei der Regulation der Brustdrüse (T. W intermantel, eingereicht) beteiligt sind. Um zellspezifische Inaktivierung des Östradiolrezeptors zu erreichen, wurde Exon 3 durch Insertion von loxp-sequenzen markiert [30]. Mit Hilfe dieser Mutante haben wir das Gen für den Rezeptor in der Brustdrüse und im zentralen Nervensystem inaktiviert (T. Wintermantel, unveröffentlicht). Verlust des Östradiolrezeptors in epithelialen Zellen der Brustdrüse führt zu einer verzögerten Brustdrüsenentwicklung. Inaktivierung des Östradiolrezeptors im Gehirn wird uns wichtige Hinweise über die zentrale Steuerung der ovariellen Funktion geben. Um die Funktion des Mineralokortikoidrezeptors (MR) in vivo verstehen zu lernen, haben wir das Gen inaktiviert. MR Knockout-Mäuse sterben etwa 10 Tage nach der Geburt und zeigen verminderte Amilioride-sensitive Natrium-Rückresorption. Um die Funktion besser verstehen zu lernen, haben wir ein konditionales MR-Allel erzeugt (MR flox ). Durch Expression der Cre-Rekombinase wurde eine Mutation im Hippocampus entwickelt. Diese Tiere zeigen eine stark verminderte Gedächtnisleistung (S. Berger, unveröffentlicht). Mit diesen Mutanten konnte zum ersten Mal eine Funktion des Mineralokortikoidrezeptors im Hippocampus gezeigt werden. Wie der Mineralokortikoidrezeptor mit dem Glukokortikoidrezeptor im Hippocampus zusammenwirkt, wird eine wichtige Frage für zukünftige Arbeiten sein. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Bleckmann, S., Blendy, J.A., Rudolph, D., Monaghan, A.P., Schmid, W., and Schütz, G. (2002). ATF-1 and CREB are important for cell survival during early mouse development. Mol. Cell. Biol. 22, [2] Casanova, E., Fehsenfeld, S., Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Greiner, E., Stewart*, A.F., and Schütz, G. (2001). A CaMKIIalpha icre BAC allows brain-specific gene inactivation. Genesis 31, [3] Balschun*, D., Wolfer*, D.P., Gass, P., Mantamadiotis, T., Welzl*, H., Schütz, G., Frey*, J.U., and Lipp*, H.-P. (2003). Does CREB have a pivotal role in hippocampal synaptic plasticity and hippocampus-dependent memory? J. Neurosci. 23, [4] Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S., Kern, H., Kretz, O., Villalba-Martin, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer*, J., Otto, C., Schmid, W., and Schütz, G. (2002). Disruption of CREB function in brain leads to neurodegeneration. Nat. Genet. 31, [5] Casanova, E., Lemberger, T., Fehsenfeld, S., Greiner, E., and Schütz, G. (2002). Rapid localisation of a gene within BACs and PACs. BioTechniques 32, [6] Casanova, E., Fehsenfeld, S., Greiner, E., Stewart*, A.F., and Schütz, G. (2002). Construction of a conditional allele of RSK-B/MSK2 in the mouse. Genesis 32, Abteilung A020 Molekularbiologie der Zelle I [7] Casanova, E., Fehsenfeld, S., Greiner, E., Stewart*, A.F., and Schütz, G. (2002). Conditional mutagenesis of CamKIV. Genesis 32, [8] Shimshek*, D.R., Kim*, J.H., Hübner*, M.R., Spergel*, D.J., Buchholz*, F., Casanova, E., Schütz, G., Stewart*, A.F., Seeburg*, P.H., and Sprengel*, R. (2002). Codon-optimized Cre recombinase expression in the mouse. Genesis 32, [9] Behrens*, A., Sibilia*, M., David*, J.-P., Schütz, G., and Wagner*, E.F. (2002). Impaired postnatal hepatocyte proliferation and liver regeneration in mice lacking c-jun in the liver. EMBO J. 21, [10] Coffinier*, C., Gresh*, L., Fiette*, L., Tronche, F., Schütz, G., Babinet*, C., Pontoglio*, M., Yaniv*, M., and Barra*, J. (2002). Bile system morphogenesis defects and liver dysfunction upon targeted deletion of HNF1beta. Development 129, [11] Beißbarth, T., Borisevich, I., Hörlein, A., Kenzelmann, M., Hergenhahn, M., Klewe-Nebenius, A., Klären, R., Korn, B., Schmid, W., Vingron, M., and Schütz, G. (2003). Analysis of CREM-dependent gene expression during mouse spermatogenesis. Mol. Cell. Endocrinol. 212, [12] Gau, D., Lemberger, T., von Gall, C., Kretz, O., Le Minh*, N., Gass, P., Schmid, W., Schibler*, U., Korf*, H.W., and Schütz, G. (2002). Phosphorylation of CREB Ser-142 regulates light-induced phase shifts of the circadian clock. Neuron 34, [13] Otto, C., Kovalchuk*, Y., Wolfer*, D.P., Gass, P., Martin*, M., Zuschratter*, W., Gröne, H.-J., Kellendonk, C., Tronche, F., Maldonado*, R., Lipp*, H.-P., Konnerth*, A., and Schütz, G. (2001). Impairment of mossy fiber long-term potentiation and associative learning in pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type I receptor-deficient mice. J. Neurosci. 21, [14] Otto, C., Martin*, M., Wolfer*, D.P., Lipp*, H.-P., Maldonado*, R., and Schütz, G. (2001). Altered emotional behavior in PACAP-type-I-receptor-deficient mice. Mol. Brain Res. 92, [15] Reichardt, H.M., Tronche, F., Berger, S., Kellendonk, C., and Schütz, G. (2000). New insights into glucocorticoid and mineralocorticoid signalling - lessons from gene targeting. In Hormones & Signalling, Advances in Pharmacology 47 (ed. B. O Malley), Volume 47, B. O Malley, ed. (San Diego: Academic Press), pp [16] Schulz-Baldes*, A., Berger, S., Grahammer*, F., Warth*, R., Goldschmidt*, I., Peters*, J., Schütz, G., Greger*, R., and Bleich*, M. (2001). Induction of the epithelial NA+ channel via glucocorticoids in mineralocorticoid receptor knockout mice. Pflüger s Arch. Eur. J. Histol. 443, [17] Reichardt, H.M., Kaestner, K.H., Wessely, O., Tuckermann, J., Angel, P., Kretz, O., Bock*, R., Schmid, W., Herrlich*, P., and Schütz, G. (1998). DNA binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival. Cell 93, [18] Reichardt, H.M., Tuckermann, J.P., Göttlicher*, M., Vujic, M., Weih*, F., Angel, P., Herrlich*, P., and Schütz, G. (2001). Repression of inflammatory responses in the absence of DNA-binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J. 20, [19] Reichardt, H.M., Umland, T., Bauer, A., Kretz, O., and Schütz, G. (2000). Mice with an increased glucocorticoid receptor gene dosage show enhanced resistance to stress and endotoxic shock. Mol. Cell. Biol. 20, [20] Kenzelmann, M., Klären, R., Hergenhahn, M., Bonrouhi, M., Gröne, H.-J., Schmid, W., and Schütz, G. (2003). High accuracy amplification of nanogram total RNA amounts for gene profiling. Genomics 83, [21] Limbourg*, F.P., Huang*, Z., Plumier*, J.-C., Simoncini*, T., Fujioka*, M., Tuckermann, J., Schütz, G., Moskowitz*, M.A., and Liao*, J.K. (2002). Enhancement of cerebral blood flow and stroke protection mediated by non-nuclear actions of the glucocorticoid receptor. J. Clin. Invest. 110, [22] Tronche, F., Kellendonk, C., Reichardt, H.M., and Schütz, G. (1998). Genetic dissection of glucocorticoid receptor function in mice. Curr Opin Genet Dev 8,

28 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A020 Molekularbiologie der Zelle I 28 [23] Kellendonk, C., Gass, P., Kretz, O., Schütz, G., and Tronche, F. (2002). Corticosteroid receptors in the brain: gene targeting studies. Brain Res. Bulletin. 57, [24] Kellendonk, C., Tronche, F., Reichardt, H., Bauer, A., Greiner, E., Schmid, W., and Schütz, G. (2002). Analysis of glucocorticoid receptor function in the mouse by gene targeting. In Recent advances in glucocorticoid receptor action, Volume 40, H.S. A.C.B. Cato, K. Asadullah, ed. (Berlin: Springer), pp [25] Tronche, F., Kellendonk, C., Kretz, O., Gass, P., Anlag, K., Orban*, P.C., Bock*, R., Klein*, R., and Schütz, G. (1999). Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nat Genet. 23, [26] Deroche-Gamonet*, V., Sillaber*, I., Aouizerate*, B., Izawa*, R., Jaber*, M., Ghozland*, S., Kellendonk, C., Le Moal*, M., Spanagel*, R., Schütz, G., Tronche, F., and Piazza*, P.V. (2003). Glucocorticoid receptors as a potential target to reduce cocaine abuse. J. Neurosci. 23, [27] Tronche, F., Opherk, C., Kellendonk, C., Reichardt, H.M., Stangl*, K., Gau, D., Schwake, L., Hoeflich*, A., Schmid, W., Beug*, H., Moriggl*, R., and Schütz, G. (2004). Glucocorticoid receptor function in hepatocytes is essential to promote postnatal body growth. Genes Dev. 18 (5), [28] Opherk, C., Tronche, F., Kellendonk, C., Kohlmüller*, D., Schulze*, A., Schmid, W., and Schütz, G. (2004). Inactivation of the glucocorticoid receptor in hepatocytes leads to fasting hypoglycemia and ameliorates hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetes mellitus. Mol. Endocrinol. (in press). [29] Le Minh*, N., Damiola*, F., Tronche, F., Schütz, G., and Schibler*, U. (2001). Glucocorticoid signaling inhibits food-induced phase-shifting of peripheral circadian oscillators. EMBO J. 20, [30] Wintermantel, T.M., Mayer, A.K., Schütz, G., and Greiner, E.F. (2002). Targeting mammary epithelial cells using a bacterial artificial chromosome. Genesis 33,

29 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A030 Molekularbiologie der Zelle II Abteilung Molekularbiologie der Zelle II (A030) Leiterin: Prof. Dr. rer.nat. Ingrid Grummt Wissenschaftler PD Dr. Renate Voit Dr. Sebastian Iben (bis 2/02) Dr. Raffaela Santoro Dr. Christine Mayer (3/02-) Dr. Yonggang Zhou (10/02-) Doktoranden Xuejun Yuan (-3/02) Jian Zhao Junwei Li Kerstin Schmitz (02/03-) Holger Bierhoff (02/03-) Technische Assistenten Bettina Dörr Urs Hoffmann-Rohrer Nadine Wagner Die Abteilung Molekularbiologie der Zelle II untersucht die molekularen Mechanismen, die Zellwachstum und Genregulation koordinieren. Der Schwerpunkt der Forschungsarbeiten liegt daher in der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten steuern. Dies erfordert die funktionelle Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, die Aufklärung der Signalübertragungswege, die Genexpression in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen bzw. während des Zellzyklus regulieren sowie die epigenetischen Kontrollmechanismen, diegenaktivitäten steuern. Derartige Untersuchungen sind die Voraussetzung für das Verständnis der Prozesse, die kontrollierte Genexpression außer Kraft setzen und somit ursächlich für maligne Entartung und eine Vielzahl genetischer Krankheiten verantwortlich sind. ( Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die das Anund Abschalten einzelner Gene bzw. ganzer Genfamilien regulieren, steht seit Jahren im Zentrum molekularbiologisch orientierter Krebsforschung. Eine effektive Steuerung der Aktivität verschiedener Gene während zellulärer Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse setzt das Vorhandensein äußerst wirksamer Kontrollmechanismen voraus, die die Genexpression regulieren und somit die Synthese verschiedener zellulärer Proteine dem Bedarf der Zelle anpassen. Die vielfältigen Regulationsvorgänge werden durch extrazelluläre Signale eingeleitet und koordiniert. Bei vielzelligen Organismen spielen dabei durch Zell-Zell-Kontakte vermittelte Signale, aber auch extrazelluläre Faktoren eine wichtige Rolle. Fallen bestimmte Signalübertragungswege oder Steuerungszentralen aus, erleidet die Zelle meist irreversible Schäden, die entweder zum Zelltod oder aber zur Verwandlung in eine Krebszelle führen. Für die experimentelle Analyse der Transkriptionskontrolle bei der Regulation komplexer biologischer Vorgänge sind besonders solche Systeme interessant, bei denen Genaktivitäten in Abhängigkeit von der Vermehrungsrate der Zellen positiv oder negativ beeinflußt werden. Dies geschieht, indem die Aktivität bestimmter Proteine verändert wird, die für die Umschreibung der in den Genen verschlüsselten Information erforderlich sind. Auf dieser Weise wird eine Feinregulation der Transkription definierter Gene erreicht, die es der Zelle ermöglicht, auf eine Vielzahl von Umwelteinflüssen rasch und wirksam zu reagieren. Ein geeignetes Untersuchungsobjekt für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Genaktivität und Zellwachstum miteinander koppeln, stellen die Gene dar, die für ribosomale RNA kodieren. Diese Gene werden von RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert und stellen die aktivsten Transkriptionseinheiten der Zelle dar. Ihre Aktivität fluktuiert in Abhängigkeit von zellulärem Wachstum und Differenzierung. Der Schwerpunkt unserer Forschungsarbeiten liegt auf der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten steuern. Dies schließt zum einen die Identifizierung sowie funktionelle Charakterisierung der Proteine ein, die für Gen-Erkennung und Transkripition notwendig sind, zum anderen die Aufklärung der Signalübertragungswege, die für die Modulation von Genaktivitäten in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen verantwortlich sind. 29 Genregulation durch Wachstumsfaktoren C. Mayer, X. Yuan, J. Zhao In Zusammenarbeit mit H. Zentgraf (DKFZ), M. Frödin (Glostrup, Dänemark) Die Gene, die für ribosomale RNA kodieren, werden von RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert und stellen die aktivsten Transkriptionseinheiten der Zelle dar. Ihre Aktivität fluktuiert in Abhängigkeit von zellulärem Wachstum und Differenzierung. Die Wachstums-abhängige Regulation der rrna Synthese wird durch den basalen TIF-IA vermittelt. Die Aktivität von TIF-IA korreliert mit dem physiologischen Zustand der Zelle, d.h. TIF-IA aus exponentiell wachsenden Zellen weist eine hohe Transkriptionsaktivität auf, während TIF-IA aus Wachstums-arretierten Zellen praktisch inaktiv ist. Die molekularen Mechanismen, die die Aktivität dieses mit RNA Polymerase I-assoziierten Transkriptions-

30 30 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie faktors modulieren und dem Zellwachstum anpassen, sind noch gänzlich unverstanden. Da die Wachstums-abhängige Regulation der rrna Synthese in erster Linie, wenn nicht gar ausschließlich, über TIF-IA erfolgt, ist die funktionelle Analyse dieses regulatorischen Faktors von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Signalübertragungswege, die rdna Transkription und Zellproliferation koppeln. Erste Protein-Protein Interaktionsstudien haben gezeigt, dass TIF-IA eine Schlüsselrolle bei der Bildung des Transkriptions-Initiationskomplexes einnimmt. TIF-IA interagiert sowohl mit dem Promotor-Selektivitätsfaktor TIF-IB/SL1 als auch mit Pol I und vermittelt somit die Bindung von Pol I an den rdna Promotor [1]. Die Interaktion mit Pol I bzw. TIF-IB/SL1 erfordert Phosphorylierung von TIF-IA an mehreren Serin-Resten durch spezifische Proteinkinasen [2]. In Wachstums-arretierten Zellen ist die Phosphorylierung von TIF-IA verändert, was zu verminderter rrna Syntheserate führt. Wir haben den Einfluß von drei Signaltransduktionswegen auf die Phosphorylierung und Aktivität von TIF-IA untersucht und folgende Ergebnisse erhalten: Die Synthese ribosomaler Vorstufen RNA wird durch Serumstimulation rasch und effizient aktiviert. Durch Einsatz von spezifischen Kinase-Inhibitoren sowie zweidimensionalen Phosphopeptid-Kartierungen konnte gezeigt werden, dass zwei Serin-Reste im C-Terminus von TIF-IA nach mitogener Stimulation phosphoryliert werden. Serin 633 (S633) wird durch ERK1/2 und Serin 649 (S649) durch RSK phosphoryliert. Analyse der Transkriptionsaktivität spezifischer Punktmutanten in vivo und in vitro hat gezeigt, dass Phosphorylierung an Position 633 oder 649 essentiell für die Aktivität von TIF-IA ist. Überexpression von TIF-IA, dessen S649 durch Alanin ausgetauscht ist, inhibiert die zelluläre rrna Synthese und hemmt das Zellwachstum [12]. Bei Nährstoffmangel wird TIF-IA durch mtor-abhängige Signaltransduktionswege inaktiviert. Inkubation von kultivierten Zellen mit Rapamycin, einem Inhibitor der mtor-kinase, führt zur Dephosphorylierung an S44 und Phosphorylierung an S199. Diese Veränderung des Phosphorylierungsmusters verhindert die Bildung funktioneller Transkriptionskomplexe am rdna Promoter und bewirkt die Translokation von TIF-IA in das Cytoplasma [16 ]. Für den Transport in das Cytoplasma ist die Assoziation von TIF-IA mit dem molekularen Chaperon sowie Phosphorylierung von S199 erforderlich. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass TIF-IA das Ziel von verschiedenen Signalkaskaden ist, die TIF-IA Aktivität und somit die zelluläre rrna Synthese sowohl positiv als auch negativ beeinflussen. Kopplung von DNA Reparatur und Pol I Transkription S. Iben In Zusammenarbeit mit J.-M. Egly (Strasbourg, Frankreich), H. Tschochner (Heidelberg), P. Hozak (Prag, Tschechische Republik) und D. Hoogstraten (Rotterdam, Niederlande) Frühere Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Initiations-kompetente RNA Polymerase I als Holoenzym vorliegt, d.h. mit einer Vielzahl von regulatorischen Proteinen assoziiert ist. Neben verschiedenen - für die Synthese und Reifung von rrna erforderlicher - Transkriptionsfaktoren und enzymatischer Aktivitäten war in dem Pol I Holoenzym auch TFIIH enthalten. TFIIH ist ein basaler Abteilung A030 Molekularbiologie der Zelle II Transkriptionsfaktor für RNA Polymerase II, der auch eine zentrale Rolle bei der DNA-Reparatur spielt. Defekte in der Aktivität von TFIIH verursachen genetische Krankheiten, wie z.b. Xeroderma pigmentosum, Cockayne s Syndrom, und trichothiodystrophy. Wir konnten mit immunhistologischen Methoden, knock-out Experimenten und funktionellen Studien nachweisen, dass TFIIH mit aktiven rdna Genen ko-lokalisiert, eine integrale Komponente des Pol I Holoenzyms ist und für die spezifische Transkription ribosomaler Gene essentiell ist [4]. Dieser Befund läßt die Schlußfolgerung zu, dass Schäden in zellulärer rdna durch transcription coupled repair (TCR) behoben werden. Die enge Verknüpfung von DNA-Reparatur und rrna Synthese wird auch durch die Beobachtung dokumentiert, dass CSB - ein Protein das in Cockayne s syndrome (CS) defekt ist - für die Transkription ribosomaler Gene benötigt wird. Ähnlich wie TFIIH ist auch CSB im Pol I Holoenzym enthalten, ist mit aktiven ribosomalen RNA Genen assoziiert und ist für die Transkription der rdna in vivo und in vitro erforderlich [5]. Mutationen in CSB wie auch in Untereinheiten von TFIIH verursachen Cockayne s Syndrom und hemmen die zelluläre rrna Synthese. Mechanismen der Transkriptionsregulation während des Zellzyklus R. Voit Die rdna Transkription fluktuiert in Abhängigkeit vom Zellzyklus. Sie erreicht das Maximum in der G 2 -Phase, wird mit Eintritt in die Mitose reprimiert, und steigt nach der Zellteilung im Verlauf der G 1 -Phase langsam an. Die mitotische Inaktivierung der Pol I Transkription beruht auf Phosphorylierung der größten Untereinheit des basalen Transkriptionsfaktors TIF-IB durch die Kinase cdc2/cyclin B. Welche Mechanismen TIF-IB nach Austritt aus der Mitose reaktivieren, sind weitgehend unbekannt. Ein essentieller Regulator für den Austritt aus der Mitose in Hefe ist die nukleoläre Phosphatase cdc14. Um zu untersuchen, ob cdc14 die rdna Transkription beim Übergang von der Mitose in die G1-Phase reaktiviert, haben wir cdc14b sowie eine katalytisch inaktive Punktmutante aus humanen Zellen kloniert und funktionell charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass in humanen Zellen cdc14b im Nukleolus lokalisiert ist und mit Promotor-proximalen rdna Genabschnitten assoziert vorliegt. In Extrakten aus mitotischen Zellen, in denen TIF-IB inaktiviert ist, vermag rekombinante cdc14b Phosphatase TIF-IB spezifisch zu dephosphorylieren und die Transkriptionsrepression während der Mitose aufzuheben. Überexpression von cdc14b verhindert die mitotische Phosphorylierung zellulärer Proteine und hemmt den Eintritt der Zellen in die Mitose. Wird jedoch die katalytisch inaktive cdc14b Mutante überexprimiert, werden die Zellen in der Telophase arretiert, d.h. der Austritt aus der Mitose gehemmt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass cdc14b in Säugerzellen nicht nur eine Schlüsselrolle für die Reaktivierung der RNA Polymerase I-abhängigen Transkription beim Übergang von Mitose in die G1-Phase spielt, sondern eine essentielle Funktion beim Durchlaufen des Zellzyklus ausübt.

31 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Epigenetische Kontrollmechanismen der rdna Transkription R. Santoro, J. Li, Y. Zhou In Zusammenarbeit mit G. Längst (München) Veränderungen bzw. Fehler im Methylierungsmuster bestimmter Gene sind maßgeblich an der Entstehung von Krebs und anderen Krankheiten beteiligt. Solche den Genen übergeordneten, epigenetischen Mutationen sind jedoch im Gegensatz zu Erbänderungen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen reparabel. Wir haben die epigenetischen, Regulationsmechanismen aufgeklärt, die das Anund Ausschalten der Aktivität ribosomaler Gene bewirken. Es wurde gezeigt, dass die Methylierung von einem CpG Rest im upstream control element (UCE) des rdna Promoters die Erbsubstanz dichter packt, so dass der Transkriptionsapparat die Gene nicht mehr ablesen kann. Wir haben durch Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente (ChIP assays) und RT-PCR nachgewiesen, dass inaktive ribosomale Gene methyliert sind und andere Histonmodifikationen aufweisen als aktiv transkribierte Gen-Kopien. In metabolisch aktiven Zellen ist etwa die Hälfte der ribosomalen Gene transkriptionell inaktiv. Diese inaktiven Gene sind an CpG Resten methyliert und liegen in heterochromatischer Konfiguration vor, d.h. die assoziierten Histone sind nicht acetyliert, jedoch an Lysine 9 von Histone 3 methyliert. Aktive Genkopien sind hingegen nicht methyliert, liegen in offener, euchromatischer Struktur vor und die Nukleosomen sind im N-terminalen Bereich der Histone acetyliert. Auf der Suche nach Chromatin-modifizierenden Aktivitäten, die das Chromatin am rdna Promoter verändern, haben wir einen bislang unbekannten Proteinkomplex, genannt NoRC (nucleolar remodeling complex), identifiziert, der im Nukleolus lokalisiert ist, die Mobilität von rekonstitierten Nukleosomen verändert und die rdna Transkription reprimiert. Die Repression der rdna Transkription wird durch Interaktion von NoRC mit Chromatin-modifizierenden Enzymen erreicht, die den rdna Promoter spezifisch methylieren, Histone modifizieren und die Chromatinstruktur verändern [10, 11, 13]. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Chromatinremodellierung, DNA-Methylierung und Histon-Modifikation eng vernetzte Prozesse sind, die sowohl für die Etablierung als auch die Aufrechterhaltung des konstanten Verhältnisses von aktiven und inaktiven Genen verantwortlich sind. Abteilung A030 Molekularbiologie der Zelle II Publikationen (* = externer Koautor) [1] Yuan, Y., Zhao. J., Hoffmann-Rohrer, U., Zentgraf, H. and Grummt, I.: Multiple interactions between RNA polymerase I, TIF-IA and TAF I s regulate preinitiation complex assembly at the ribosomal gene promoter. EMBO Reports (2002) 3, [2] Schlosser, A., Bodem, J., Bossemeyer, D., Grummt, I., and Lehmann, W.D.: Identification of protein phosphorylation sites by combination of elastase digestion, immobilized metal affinity chromatography, and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Proteomics (2002) 2, [3] Dagher*, J.H., Scheer*, U., Voit, R., Grummt, I., Lonzetti*, L., Raymond*, Y. and Senécal*, J.-L.: Autoantibodies to NOR90/ hubf: Long-term clinical and serological followup from childhood to adulthood in a patient with limited systemic sclerosis suggests an antigen-driven immune response. J. Rheumatology (2002) 29, [4] Iben, S., Bier*, M., Tschochner*, H., Hoogstraten*, D., Hozak*, P., Egly*, J.-M. and Grummt, I.: TFIIH plays a role in RNA polymerase I transcription. Cell (2002) 109, [5] Bradsher*, J., Iben, S., Grummt, I. and Egly*, J.-M.: CSB is a component of RNA Pol I transcription. Mol. Cell (2002) 10, [6] Hassepass*, I., Voit, R., and Hoffmann*, I. Phosphorylation at serine 75 is required for UV-mediated degradation of human Cdc25A phosphatase at the S-phase checkpoint. J. Biol. Chem. (2003) 278, [7] Michaelidis, T. M., Grummt, I.: Mechanism of inhibition of RNA polymerase I transcription by DNA-dependent protein kinase. Biol. Chem. (2002) 383, [8] Wachsmuth, M.*, Weidemann, T.*, Muller, G.*, Hoffmann- Rohrer, U.W., Knoch, T.A., Waldeck, W., Langowski, J. Analyzing intracellular binding and diffusion with continuous fluorescence photobleaching. Biophys. J. (2003) 84, [9] Dundr*, M., Hoffmann-Rohrer, U., Grummt, I., Rothblum*, L. I., Phair*, R. D. and Misteli, T*.: A kinetic network for RNA polymerase I in vivo. 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(2003) 17, [15] Strohner, R., Nemeth, A., Nightingale*, K.P., Grummt, I., Becker*, P., Längst*, G.: Silencing of ribosomal genes by targeted recruitment of the nucleolar chromatin remodeling complex NoRC. Mol. Cell. Biol. (2004) 24, [16] Mayer, C., Zhao, J., Yuan, X., Grummt, I. mtor-dependent activation of the transcription factor TIF-IA links rrna synthesis to nutrient availability. Genes & Dev, (2004) 18,

32 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A040 Entwicklungsgenetik 32 Abteilung Entwicklungsgenetik (A040) Leiter: Prof. Dr. Bernard Mechler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Joël Anne (8/02 - ) Dr. Joachim Marhold (8/01-12/02) PD Dr. Heide Schenkel (12 h/mo) Dr. István Török Gastwissenschaftler Dr. Joël Anne (Paris, Frankreich 1/02-7/02) Dr. Robert Farkas (Bratislava, Slowakei 1/02, 5/02, 7/02, 10/02, 2/03, 4-5/03, 10/03) Dr. Matyas Gorjánácz (Szeged, Ungarn, 7-10/02) Dr. István Kiss (Szeged, Ungarn, 2/02, 10/03) Dr. Támas Slanzka (Szeged, Ungarn, 9-12/03) Professor Ivan Raska (Prag, Tschechische Republik, 7/02, 3/03) Satish Sasikumar (Varanasi, Indien, 2-7/02) Doktoranden Jingyang Wu (- 1/03) Fani Papagiannouli (- 12/02) Shangyou He (4/02 - ) Diplomanden Muhammad Kashif (- 3/02) Archana Patel (3-6/02) Drumita Patel (3-6/02) Odunlami Bemi (3-6/03) Olaye Andrew (3-6/03) Techniker Dorothee Albrecht (½) Hartmut Kalisch Katja Kühle (11/01-12/02) Gabriele Robinson Rolf Schmitt Sekretariat Karin Helm Die meisten menschlichen Gene (ca. 80 %) besitzen genetische Gegenstücke in Drosophila melanogaster. Obwohl das Genom der Fruchtfliege nur aus 15 bis Genen - verglichen mit den ca Genen bei höheren Vertebraten -besteht -weiß man, daß viele dieser Gene beim Menschen Duplikationen ihrer Insektenäquivalente sind oder Mitglieder von Multigenfamilien. Da die wesentlichen zellulären Prozesse und multistep pathways im Verlauf der Evolution konserviert wurden, kann man davon ausgehen, daß das Studium von Drosophila unzweifelhaft zum Verständnis der Reaktionsmechanismen der homologen menschlichen Gene beitragen wird. Die Bedeutung von Mutationsereignissen bei der Entstehung von Tumoren konnte bei Drosophila eindeutig nachgewiesen werden. Für eine Reihe von Genen konnte gezeigt werden, daß durch Mutationen maligne Tumoren in bestimmten Geweben im Verlauf der Entwicklung entstehen. Diese Tumore weisen alle charakteristischen Eigenschaften von Krebs des Menschen auf. Die Abteilung für Entwicklungsgenetik untersucht seit einigen Jahren Gene bei Drosophila, die an der Entstehung und Suppression von Krebs beteiligt sind. Hauptziel dabei ist, die Funktion dieser Gene aufzuklären und genetische Interaktionen zu identifizieren. Außerdem wird die Funktion von besonders interessanten Drosophila-Genen sowie der Reparatur-Mechanismus von DNA-Doppelstrangbrüchen in Keimbahnzellen von Drosophila untersucht. 1. Untersuchungen über Tumorsuppressorgene bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster B.M. Mechler, H. Schenkel, I. Török, J. Marhold, F. Papagiannouli und A. Patel In Zusammenarbeit mit: I. Kiss, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn; R. Farkas, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slowakei; I. Raska, Czech Academy of Sciences, Prag, Tschechische Republik; J. Roy, University of Varanasi, Banares, Indien Maligne Tumore in Drosophila sind charakterisiert durch massive Zellproliferation und zerstören normalerweise die Monolayer-Organisation der Imaginalscheiben und die Struktur der optischen Zentren im Gehirn. Mutationen im lethal(2)giant larvae [l(2)gl], discs large [dlg] und scribble [scrib] Gen verursachen neoplastisches Wachstum und alle drei Gene kodieren für Proteine, die in die Organisation des Cytoskeletts und/oder Membran-junctions involviert sind. Die Produkte dieser Gene sind für Aufbau und Erhalt der Polarität von Epithelzellen verantwortlich, indem sie weitere Proteine in die Zellmembran integrieren. Durch Stabilisierung der cytoskeletalen Matrix und der zellulären junctions, tragen diese Proteine nicht nur zur Struktur und Aufrechterhaltung der Zellform bei, sondern auch zu spezifischen signal-pathways. Obwohl es schwierig ist, die Funktionen bei der Signaltransduktion zu demonstrieren, können wir zeigen, daß das p127-protein, das von dem l(2)gl Gen kodiert wird, einen der frühen Schritte des apokrinen Zelltodes direkt reguliert. Dieser findet in den Speicheldrüsen zu Beginn der Metamorphose statt und wird durch das Steroidhormon Ecdyson ausgelöst [1]. Die Analyse der scrib und dlg Gene ergab, daß sie in der späten Embryonalentwicklung eine kritische Rolle bei der Bildung der Gonaden und der Erhaltung der Keimzelllinie [2, 3 unveröffentlichte Daten], spielen. Damit wird die These gestützt, daß beide Gene an der Organogenese und an dem Entwicklungsschicksal bestimmter Gewebe beteiligt sind. Analysen von Mutationen, die durch P-Elementinsertionen im Genom von Drosophila hervorgerufen wurden, führten zur Identifizierung einer Reihe von Insertionen. Eine dieser Mutationen regulierte die Expression des snrnp SmD3 Gens herunter und führte zu overgrowth der Gehirnhemisphären, der Imaginalscheiben sowie der hämatopoetischen Organe [4]. 2. Beteiligung des Tumorsuppressorgens l(2)gl an dem apokrinen Zelltod der larvalen Speicheldrüsen R. Farkas, B.M. Mechler In Zusammenarbeit mit: S. Kuchárová-Mahmood, L. Medved ova, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slowakei; I. Raska, Czech Academy of Sciences, Prag, Tschechische Republik Die Beseitigung von überflüssigem larvalen Gewebe stellt einen komplexen Prozess dar und wird durch das Steroidhormon Ecdyson eingeleitet. Die Inaktivierung des l(2)gl Gens, welches für das mit dem Zytoskelett assoziierte p127 l(2)gl Protein kodiert, verursacht durch den Stillstand der Entwicklung in der larval-pupalen Transitionsphase eine maligne Transformation der Gehirnneuroblasten und der Zellen der Imaginalscheiben. In diesem Stadium wird p127 l(2)gl in den Speicheldrüsen des Wildtyps exprimiert h nach der Verpuppung unterliegen diese der Histolyse. In l(2)gl-defizienten Speicheldrüsen dagegen ist die

33 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Applikation von 20-Hydroxyecdyson nicht in der Lage, Histolyse zu induzieren, segregieren aber trotzdem die in ihnen gespeicherten glue-granules und weisen das charakteristische Puffmuster für Chromosomen im Puppenstadium auf. Diese Befunde zeigen, daß p127 l(2)gl für den Zelltod der Speicheldrüsen erforderlich ist. Um die Funktion von l(2)gl in diesem Gewebe zu klären, benutzten wir transgene Linien, die entweder reduzierten (~ 0.1) oder erhöhten Gehalt an p127 l(2)gl (3.0) exprimieren. Diese Studien zeigen, daß der zeitliche Verlauf der Histolyse der Speicheldrüsen eine l(2)gl-dosis-anwort widerspiegelt. Reduzierte p127 l(2)gl Expression verzögert die Histolyse, während Überexpression diesen Prozess beschleunigt, ohne dabei die Dauer des dritten Larvenstadiums sowie der präpupalen und pupalen Entwicklung zu beeinflussen. Eine ähnliche l(2)gl-abhängigkeit fällt beim timing der Expression der Zelltodgene reaper, head involution defective und grim auf. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, daß p127 eine kritische Rolle bei Hervorrufen eines Ecdyson-induzierten Zelltodes spielt. Unsere Experimente weisen darauf hin, daß das timing des Zelltodes in den Speicheldrüsen manipuliert werden kann, ohne die Normalentwicklung zu beeinträchtigen und Wege zu Untersuchungen über die Natur der Komponenten eröffnet, die an dem Zelltod- pathway in den Speicheldrüsen beteiligt sind. 2.1 Zeitliche Regulation der Histolyse der Speicheldrüsen von Drosophila durch Transkriptionsfaktoren des Broad-Complex Zu den Genen, die bei der Auslösung der Histolyse der Speicheldrüsen eine wichtige Rolle spielen, gehört reduced bristles on palpus gene des Broad-Complex (Br-C) Locus. Um die Rolle des Br-C bei der Auslösung der Speicheldrüsenhistolyse zu verstehen, unternahmen wir eine Analyse der verschiedenen Isoformen des Broad-Complex. Der Br- C Locus kodiert für vier Isoformen von Haupttranskriptionsfaktoren, BR-C Z1 bis Z4, deren Expression direkt von Ecdyson über einen Ecdysonrezeptor (EcR/Usp) reguliert wird. Mit Ausnahme von Mutationen in BR-C Z1, welches für das Überleben der larvalen Speicheldrüsen in mutierten Fliegen verantwortlich ist, bringen alle Mutationen, welche die anderen Br-C-Isoformen betreffen, pupale Letalität hervor. Experimente mit Transgenen, welche jedes der vier Haupt-BR-C-Isoformproteine exprimieren zeigten, daß in Abhängigkeit der Expressionsperiode parallel zu dem Hauptpeak von Ecdyson BR-C Z1, Z2 und Z4 zunächst den Prozess der Speicheldrüsenhistolyse inhibierten und danach stimulierten. BR-C Z3 dagegen übte zu allen Zeitpunkten eine Hemmung des Speicheldrüsenzerfalls aus [1]. 2.2 Zytoskelettproteine regulieren den Chromatin- Zugang des BR-C Z1 Transcriptionsfaktors und des SIN3-RPD3 Histon-deacetylase Complexes beim autophagic Tod der Speicheldrüsen von Drosophila Aus früheren Analysen unserer Gruppe wissen wir, daß p127 l(2)gl physikalisch mit nicht-muskel-myosin II schwere Kette (nmmhc) interagiert. Unsere kürzlich durchgeführten Studien zeigten, daß p127 l(2)gl und nmmhc die Anlagerung des BR-C Z1 Transkriptionsfaktors und des SIN3-RPD3- deacetylase Complexes an das Chromatin regulieren. In Speicheldrüsen von Wildtyp binden diese Faktoren an Chromatin, jedoch in l(2)gl akkumulieren sie im Zytoplasma und der cortical nuclear zone (CNZ). Einen ähnlichen Chromatinausschluss beobachten wir entweder in Speicheldrüsen von Entwicklungs-verzögerten zip E(br) /+ Larven oder er wird durch eine hohe nmmhc-synthese hervorgebracht. Abteilung A040 Entwicklungsgenetik Daraus muß man schließen, daß, p127 l(2)gl und nmmhc gemeinschaftlich die Anlagerung von BR-C Z1 und SIN3-RPD3 an das Chromatin kontrollieren und damit die Kaskade auslösen, die zur Histolyse der SG führt (Arbeit eingereicht). 3. Voraussetzungen für die Gonadenentwicklung und die Erhaltung der Keimbahnzelllinien durch dlg und scrib B.M. Mechler, M. Li, F. Papagiannouli, J. Marhold, A Patel, A. Gatos und I. Török 3.1. Das scribble Gen Das Tumorsuppressorgen scribble (scrib) ist für Epithelpolarität und Wachstumskontrolle bei Drosophila erforderlich. Wir isolierten das scribble Gen durch die Identifizierung der rezessiven Mutation P vartul, welche Letalität im späten Larvenstadium auslöst und ein komplexes Syndrom, vergleichbar dem von Mutationen in Tumorsuppressoren, aufweist. Beide larvalen Gehirnhemisphären und ein Teil der Imaginalscheiben zeigen massives overgrowth und Verlust der Zellpolarität. Das scribble kodiert für zwei Proteinisoformen, die durch alternatives Splicing während der Transkription entstehen [2]. Beide Scrib-Proteine werden zunächst ubiquitär während der frühen Embryonalentwicklung exprimiert. Im weiteren Verlauf der Morphogenese weist jedes der Scrib- Proteine ein spezifisches Verteilungsmuster im zentralen und peripheren Nervensystem, CNS und PNS, auf. Während der Keimstreifextension findet die Expression des größeren Scrib1 vorzugsweise in den Neuroblasten statt, die vom Neuroektoderm abstammen. Später beschränkt sich die Synthese auf Neuronen des CNS sowie auf die Polzellen der Gonaden. Die kürzere Scrib2-Form wird im PNS und einem Teil der CNS-Neuronen [2] stark exprimiert. Wir fanden, daß die Scrib1-Protein-Isoform ganz spezifisch in neu entstandenen Goaden synthetisiert wird und untersuchten daher im Detail die Voraussetzungen für seine Synthese in der Keimbahn und in den somatischen Zellen der Gonaden. Wir konnten zeigen, daß Scrib1-Synthese in Polzellen zum Zeitpunkt der Gonadenbildung stark anstieg und auch in corticalen Domänen der gonadalen Mesodermzellen, die den Polzellen benachbart sind, vorhanden war. Die Scrib1-Synthese in den mesodermalen Zellen war unabhängig von den Polzellen und ließ sich in agametischen valois und capsuléen Gonaden von Embryonen nachweisen. Die Scrib1-Synthese in den Polzellen dagegen, erforderte Kontakt mit gonadalen Mesodermzellen, was wir durch Fehlen von Scrib1 in wunen oder tinman-zinc finger homeodomain-1 Pseudogonaden, die nur aus Aggregaten von Polzellen [3] bestehen, zeigen konnten Das discs large (dlg) Gen Den Beitrag der Tumorsuppressorgene discs large (dlg), scribble (scrib) und lethal (2)giant larvae (l(2)gl) zur Gonadenentwicklung analysierten wir zum Zeitpunkt der Verschmelzung der gonadalen Mesodermzellen. Die Inkorporation der Polzellen in die gonadal pocket erfolgt normal in Embryonen von l(2)gl, scrib und dlg, obwohl eine signifikante Anzahl von Polzellen außerhalb der scrib und dlg Gonaden verbleibt. Das Auftreten von nicht-gonadalen Polzellen könnte eine längere Überlebenszeit der fehlplazierten scrib und dlg Polzellen in den somatischen Geweben widerspiegeln. Untersuchungen von larvalen Testes aus Wildtyp und Mutanten zeigen, daß l(2)gl Testes normale Größe aufweisen, die Testes von scrib-larven dagegen signifikant und Testes von dlg-larven deutlich kleiner sind; selbst kleiner als Ovarien des Wildtyps. Da die Anzahl 33

34 34 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie der Polzellen, die im Verlauf der Gonadenbildung verloren gehen, nicht für das Ausmaß der Reduktion der dlg-testes verantwortlich gemacht werden können, untersuchten wir, ob eventuell andere mesodermale Zellen nicht in der Lage sind, in die dlg-gonaden inkorporiert zu werden. Wie Mark van Doren (Johns Hopkins University) vorschlug, analysierten wir die mesodermalen Zellen, welche Sox100B exprimieren und das posteriore Ende der embryonalen Testes umschließen, jedoch in Ovarien fehlen. Wir fanden, daß in dlg-larven Sox100B Zellen, obwohl sie zu Beginn des Stadiums 14 anwesend sind, verschwinden, sobald sie die forming testes erreichen. Diese Befunde weisen darauf hin, daß dlg eine kritische Rolle für die letzten Schritte bei der Migraiton der Sox100B mesodermalen Zellen spielt. Untersuchungen an frühen larvalen Testes zeigen, daß im Vergleich zu Wildtyp-Testes, die dlg-testes eine reduzierte Anzahl von Stammzellen der Keimbahn, die den hub umgeben, welcher am anterioren Ende liegt, enthalten. Weiterhin wiesen die Testes zahlreiche degenerierende Cysten von Spermatogonien am posterioren Ende auf. In den Testes von Wildtyp-Larven weist die Verteilung von Sox100B- und Dlg-Protein ein dynamisches Muster auf, das von ubiquitärem Auftreten in allen mesodermalen Zellen bis zu einer begrenzten Lokalisation in nur wenigen Zellen reicht. In frühen larvalen Testes finden wir eine intensive Sox100B Expression im Zytoplasma von mesodermalen Zellen, die zwischen den Keimbahnzysten lokalisiert sind. Danach beschränkt sich die Anwesenheit von Sox100B auf die großen Cystenkerne auf der Oberfläche der Testes. Ähnliches gilt für das Dlg-Protein, das zunächst in allen mesodermalen Zellen vorhanden ist und in späten Larvenstadien die anteriore Seite der mesodermalen Zellen, welche die posteriore Hälfte jeder Spermatozyten-Cyste einschließt, umgibt. Mit Blick auf die Rolle, welche Sox9 für die Determination und Differenzierung der Testes in Mammalia spielt, lassen unsere Daten vermuten, daß Sox100B, für das Drosophila Homologe zu Sox9-Protein der Mammalia, in Assoziation mit Dlg Keimzellproliferation und Differenzierung der Testes von Drosophila steht. 4. Funktion von Importin-α während Oogenese und Spermatogenese von Drosophila I. Török, B.M. Mechler In Zusammenarbeit mit: I. Kiss, M. Gorjánácz und T. Szlanka, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn Abteilung A040 Entwicklungsgenetik Die Analyse einer Nullmutation des Importin-α2 Gens, die D14 interstitielle Deletion, zeigt, daß diese Mutation zu einer rezessiven Sterilität der Weibchen führt, die charakterisiert ist durch die Blockade des Nährzell-Oozyten-Transportes während der Oogenese. In Eikammern von Wildtyp ist das Imp-2-Protein gleichmäßig im Zytoplasma der Nährzellen und etwas schwächer entlang der Oozytencortex, verteilt. Behandlung von Wildtyp-Eikammern mit Cytochalasin D, zerstört die in vivo Assoziation von Imp-α2 mit F-Actin und führt zu seinem Transfer in die Nährzellkerne und seine Freisetzung von der Oocytencortex. Bindungsstudien zeigen, daß die Interaktion von Imp-α2 mit F-Actin, dem nonmonomeric actin, die Anwesenheit von NLS-Peptiden erfordert. Die Blockierung des Nährzell-Oocyten-Transportes in imp-α2 D14 Eikammern, ist die Folge des Verschlusses des Ringkanals, welcher aus den Zytoplasma-Brücken zwischen Nährzellen und der Oocyte aufgebaut ist. Immunohistochemische Untersuchungen zeigen, daß unter den bereits bekannten Komponenten des Ringkanals, das Kelch-Protein nicht in den Ringkanal von imp-α2 D14 -Mutanten deponiert werden kann. Da loss-of-function Mutation von kelch einen ähnlichen dumpless Phänotyp zeigen, vermuten wir, daß Imp-α2 eine kritische Rolle für die Funktion von kelch ausübt, indem es seine Deponierung an den Ringkanal während seiner Zusammenlagerung reguliert [5]. In einer zweiten Publikation beschreiben wir das Synthesemuster der drei Importin-α Proteine im Verlauf der Spermatogenese [6]. Jedes der drei Imp-α-Proteine wird während einer spezifischen und begrenzten Periode der Spermatogenese exprimiert. Wir finden eine starke Expression von Imp-α2 in spermatogonialen Zellen, die sich in Spermatozyten fortsetzt und bis zum Abschluß der Meiose andauert. In wachsenden Spermatozyten scheint die intrazelluläre Lokalisation von Imp-α2 von der Zellwachstumsrate abzuhängen. In Testes von Puppen ist Imp-α2 ausschließlich in den Spermatozytenkernen vorhanden, ist aber in den Spermatozyten adulter Testes im Zytoplasma lokalisiert. Sowohl die Imp-α1- als auch die Imp-α2-Expression setzen zu Beginn der Meiose ein und endet während der Differenzierung der Spermatiden. Die Expression von Impα1 reicht bis zum Beginn der Elongationsphase, während die Expresson von Imp-α3 bis zum Abschluß der Kernkondensation, der Zeitpunkt, zu dem sich die Spermatiden individualisieren, dauert. Während der Meiose sind Imp-α1 und Imp-α2 im Karyoplasma verteilt und dort partiell assoziiert mit der Kernspindel, jedoch nicht mit dem Spindelaster. In der Telophase aggregieren sie um das Chromatin. Während der Differenzierung des Spermienkopfes sind Imp-α1 und Imp-α3 im Kern. Diese Daten sprechen dafür, daß jedes Imp-α2-Protein eine bestimmte, zum Teil überlappende Funktion im Verlauf der Spermatogenese von Drosophila ausübt, die möglicherweise auch den Import von Proteinen in den Kern, sowie die Organisation von Mikrotubuli und weitere bisher noch nicht bekannte Prozesse, einschließt [6]. Kürzlich durchgeführte Analysen mit einer Reihe von Substitutionen und Deletionen von spezifischen Domänen im Imp-α2-Protein zeigten, daß dieses Protein eine wichtige Funktion für das Ringkanal- assembly sowie für das assembly/disassembly der mitotischen Spindel während der frühen syncytialen Kernteilungen, ausübt. 5. Drosophila Genomorganisation und Erstellung eines Deletionskits H. Schenkel, C. De Lorenzo, D.H. Lankenau, J. Marhold und B.M. Mechler In Zusammenarbeit mit: F. Lyko, DKFZ; M. Ashburner, Department of Genetics, University of Cambridge, UK; G. Reuter, Institut für Genetik, Martin Luther Universität, Halle; A. Rasmuson- Lestander, Umeå University, Schweden; P. Maroy, Department of Genetics, Attila Jozsef University, Szeged, Ungarn; E. Hafen, Institut für Zoologie, Universität Zürich, Schweiz; G. Pflugfelder, Universität Mainz Obwohl das Genom von Drosophila vollständig sequenziert wurde, ist es notwendig, seine Organisation im Detail zu analysieren und Mutationen exakt individuellen Transkriptionseinheiten zuzuordnen. Unsere Arbeitsgruppe hat Untersuchungen durchgeführt, um genetisch und molekular eine Reihe von Mutationen zu identifizieren, die einen Lokus betreffen, der zwei ineinander liegende Gene trägt, nämlich das snrnp SmD3 und das Ornithinine Decarboxylase Antizyme Gen [4]. Hinzu kommt, daß wir eine neue Technik der homologen Rekombination in Drosophila einsetzen, um das Gen, welches für das Nucleosome Assembly

35 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Protein-1 (NAP1) kodiert, auszuschalten (knockout). Dieses Gen wurde kürzlich als potentiell mit p127 l(2)gl interagierendes Protein identifiziert. Es wird durch die Casein Kinase II [7] phosphoryliert. Eine weitere Zusammenarbeit wurde innerhalb des Netzwerkes eines europäischen Projektes zur Konstruktion einer neuen Drosophila Deletions- und Duplikationskollektion (DrosDel-Projekt) etabliert. Es werden überlappende Deletionen in der Größenordnung von 0,5 bis 1,0-Mb erzeugt, welche das gesamte euchromatische Drosophila Genom in einem isogenen background abdecken sollen. Ungefähr 260 Defiziensen decken ca. 60 % des Genoms ab. Unsere Kollektion von Defiziensen schließt schätzungsweise mehr als 80 % des Drosophila Genoms ein. Eine erste Publikation, welche das Transposonelement, das wir für die Erzeugung der Defiziensen einsetzen, befindet sich im Druck [11] Organisation des SmD3 und Ornithine Decarboxylase Antizyme Gens Das Drosophila Gen für snrnp Sm D3, oder SmD3, ist in umgekehrter Orientierung in dem ersten Intron des Ornithine Decarboxylase Antizyme (AZ) Gens lokalisiert. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß zwei benachbart liegende P-Elemente den gutfeeling Phänotyp verursachen, der durch embryonale Letalität und abnorme Differenzierung der neuronalen Zellen und Muskelzellen charakterisiert ist. Bisher ist die Natur der Gene, die durch den gutfeeling Phänotyp betroffen sind, unbekannt. Unsere Studien zeigen, daß P-Insertionen, die innerhalb der 5 untranslated Region (UTR) von SmD3 oder innerhalb des Promotors liegen, nur die Expression von SmD3 beeinträchtigen. Wir können zeigen, daß der gutfeeling Phänotyp, der mit den P-Element-Insertionen in der 5 UTR-Region von SmD3 assoziiert ist, auf eine amorphe oder hypomorphe Mutation zurückzuführen ist. Dagegen reduzieren P-Insertionen in der SmD3 Promotorregion die Expression von SmD3 und rufen larvale Letalität sowie overgrowth der Imaginalscheiben, der Gehirnhemisphären und des hematopoetischen Organs hervor. Die Letalität dieser Mutationen konnte durch ein SmD3 + Transgen verhindert werden. Die Inaktivierung von AZ trat auf, wenn wir die Df(2R)guf lex47 Defiziens, bei welcher SmD3 und AZ partiell deletiert sind, durch SmD3 + komplementierten. Dabei stellte sich heraus, daß die AZ-Inaktivierung einen neuen Phänotyp hervorbringt, der durch larvale Letalität und Atrophie des Gehirns, der Imaginalscheiben, der hematopoetischen Organe und der Speicheldrüsen gekennzeichnet ist [4] Knockout targeting des Drosophila NAP1 Gens Mittels ends-in gene targeting erzeugten wir Knockout Mutationen im nucleosome assembly protein 1 (Nap1) Gen. Wir erhielten drei voneinander unabhängige Knockout Mutationen. In Proteinextrakten von lebensfähigen adulten escapers konnte kein Wildtyp NAP1 nachgewiesen werden. Die Entwicklung homozygoter Nap1KO Tiere weist polyphasische Letalität auf und kann zu einer geringen Anzahl schwach lebensfähiger adulter escapers führen. Um Informationen über die zugrunde liegenden molekularen Vorgänge bei der homologen Rekombination zu erhalten, erzeugten wir in den rekombinanten Produkten conversion tracts. In fast allen Fällen wurde die Stelle des donor vectors ersetzt durch die Nap1 Sequenz. Das weist auf einen Prozess hin, der Exonucleaseaktivität an der Stelle des Doppelstrangbruches (DSB) einschließt, gefolgt durch replikative Reparatur der donor-target junctions. Die targeting Produkte werden am besten entweder durch Abteilung A040 Entwicklungsgenetik das klassische DSB Reparaturmodell oder durch das breakinduced Rekombinations (BIR)-Modell erklärt. Das von Synthese abhängige strand annealing (SDSA), welches ein weiterer wichtiger, bei Rekombinationsvorgängen stattfindender Reparatur-pathway in der Keimbahn ist, konnte nicht dazu herangezogen werden, um ends-in targeting Produkte zu erklären. Wir schließen daraus, daß dieses Beispiel für Gen-targeting am Nap1 Locus, eine weitere Unterstützung für die Effizienz dieser Methode ist und für ihre Anwendbarkeit zum targeting jedes beliebigen Locus im Drosophila Genom spricht [7]. 6. Weitere Beiträge In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Christof Niehrs haben wir Transgene erzeugt, die den Maus Kremen-2 Rezeptor und den Xenopus-Dickkopf-1 Ligand exprimieren, um nachzuweisen, daß diese Proteine bei dem Wnt/ß- Catenin signalling eine Funktion ausüben [8]. In Zusammenarbeit mit der Gruppe Frank Lyko haben wir die Expression des dmbd2/3 methyl-dna binding Proteins im Verlauf der embryonalen Entwicklung und seine Stadienspezifische chromosomale Assoziation zum Zeitpunkt der Genomaktivierung, untersucht [9]. Schließlich haben wir zur Charakterisierung der cytosolischen Malatdehydrogenase und zu den Untersuchungen über ihre Regulation durch Juvenilhormon während der larvalen und pupalen Entwicklung von Drosophila beigetragen [10]. Publications (* = externer Koautor) [1] *Kuchárová-Mahmood, S.,* Raska, I., Mechler, B. M., and *Farkas, R. (2002) Temporal regulation of Drosophila salivary gland degeneration by the Broad-Complex transcription factors. J. Struct. Biol. 140: [2] Li., Marhold, J., Gatos, A., Török, I., and Mechler, B. M. (2001). Differential expression of two Scribble isoforms during Drosophila embryogenesis. Mech. Dev. 108: [3] Marhold, J., Papagiannouli, F., Li, M., *Patel, A., and Mechler, B. M. (2003) Requirements for scribble expression in newly formed gonads of Drosophila embryos. Gene Expression Patterns 3: [4] Schenkel, H., Hanke, S., De Lorenzo, C., Schmitt, R., and Mechler B. M. (2002) P-elements inserted in the vicinity or within the Drosophila snrnp SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3. Genetics 161: [5] *Gorjánácz, M., *Adam, G., Török, I., Mechler, B. M., *Szlanka, T., and *Kiss, I. (2002) Importin-α2 is critically required for the assembly of ring canals during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 251: [6] Giarrè, M., Török, I., Schmitt, R., *Gorjánácz, M., *Kiss, I., and Mechler, B. M. (2002) Patterns of importin-α expression during Drosophila spermatogenesis. J. Struct. Biol. 140: [7] Lankenau, S., Barnickel, T., Marhold, J., Lyko, F., Mechler, B. M., and Lankenau, D.-H. (2003) Knockout targeting of the Drosophila Nap1 gene and examination of DNA repair tracts in the recombination products. Genetics 163: [8] Mao, B., Wu, W., Davidson, G., Marhold, J., Li, M., Mechler, B. M., Delius, H., Hoppe, D., Stannek, P., Walter, C., Glinka, A., and Niehrs, C. (2002). Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/ß-catenin signaling. Nature 417: [9] Marhold, J., Zbylut, M., Lankenau, D.-H., Li, M., *Gerlich, D.,*Ballestar, E., Mechler, B. M., and Lyko, F. (2002) Stage-specific chromosomal association of Drosophila dmbd2/3 during genome activation. Chromosoma 111: [10] *Farkas, R., *Danis, P.,* Medved ová, L., Mechler, B. M., and *Knopp, J (2002) Regulation of cytosolic malate dehydrogenase by juvenile hormone in Drosophila melanogaster. Cell Biochem. Biophys. 37:

36 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A040 Entwicklungsgenetik 36 [11] *Ryder, E., *Blows, F., *Ashburner, M., *Bautista-Llacer, R., *Coulson, D., *Drummond, J., *Webster, J., *Gubb, D., *Guntun, N., *Johnson, G., *O Kane, C., *Huen, D., *Baisch, H., *Schulze, J., *Kube, M., *Kittlaus K., *Reuter, G., *Maroy, P., *Szidonia, J., *Rasmuson-Lestander, A., *Ekström, K., *Dickson, B., *Hugentobler, C., *Stocker, H., *Hafen, E., *Lepesant, J.A., *Pflugfelder, G., *Heisenberg, M., Mechler, B., *Serras, F., *Corominas, M., *Roote, J., and *Russel, S. The DrosDel collection: a set of P-element insertions for generating custom chromosomal aberrations in Drosophila melanogaster. Genetics (in press).

37 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A050 Molekulare Embryologie Abteilung Molekulare Embryologie (A050) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Mao Bingyu Dr. Gary Davidson Dr. Andrei Glinka Dr. Christoph Hansis Dr. Olga Kazanskaya Dr. Wei Wu Gastwissenschaftler Sonia Pinho (2/03-) Guillermo Barreto (2/03-) Gabriel Kolle (9/03-) Doktoranden Danila Baldessari Ralph Böttcher Ivan Del Barco Barrantes Emil Karaulanov Suresh Kumar Swaminathan (6/02-) Christine Hassler (11/02-) Jinlong Shen (9/03-) Josipa Bilic (9/03-) Technische Assistenten Ursula Fenger Dana Hoppe Nicole Maltry (1/03-) Peter Stannek Carmen Walter Sekretariat Alexandra Heid (4/02-) Die Abteilung beschäftigt sich mit der Frage, wie das Schicksal embryonaler Zellen während der Frühentwicklung der Wirbeltiere reguliert wird. Dazu wird vor allem der Frosch als Modellsystem untersucht, der erlaubt klassische Techniken wie Transplantationen und Explantationen mit modernen molekularbiologischen Techniken zu verknüpfen. Durch Mikroinjektion von einzelnen mrnas in Embryonen wird die Funktion von Genen im Kontext des sich entwickelnden Organismus studiert. Darüber hinaus finden Untersuchungen auch an transgenen Mäusen statt. Im Vordergrund steht die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Achsenentwicklung sowie der Zellinteraktionen, die eine Rolle im Spemann-Organisator spielen. Mit molekularbiologischen Ansätzen werden in diesem Zusammenhang neue Entwicklungskontrollgene identifiziert und charakterisiert. Die in Embyronen gewonnenen Erkenntnisse sind bedeutsam für das Verständnis von Zellwachstum und Differenzierung in normalen und malignen Zellen. Mechanismen der embryonalen Achsenentwicklung C. Niehrs In Zusammenarbeit mit: N.Pollet, Univ. Paris Frankreich; K. Cho, Univ. California, Irvine, USA; C. Kintner, Salk Inst., San Diego, USA; Heiner Westphal, NIH, Bethesda, USA; W. Knöchel, Univ. Ulm; T. Pieler, Uni Göttingen; A. Skerra, TU München; B. Mechler, H. Delius, H.-J. Gröne, R. Eils, G. Schütz, DKFZ. Eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie der Wirbeltiere befasst sich mit der Anlage der embryonalen Achsen, d. h. Kopf-Schwanz- (anterior-posterior) und Rücken-Bauch- (dorsal-ventral) Achse. Für die Achsenentwicklung hat der sogenannte Spemann-Organisator eine herausragende Bedeutung. Dieses Gewebe wurde 1926 von Spemann und Mangold durch Transplantationsexperimente entdeckt. Der transplantierte Organisator ist in der Lage, in einem Embryo einen kompletten sekundären Embryo zu induzieren und somit die Achsenanlagen zu duplizieren. Die Tiere entwickeln sich dann ähnlich siamesischen Zwillingen. Die Arbeitsgruppe analysiert die molekularen Grundlagen, die zu den vielfältigen Eigenschaften des Organisators führen. Insbesondere wird die Frage nach der regional-spezifischen Induktion untersucht [1]. Der Spemann-Organisator wird durch die antagonisierenden Effekte von Wnt- und BMP- Wachstumsfaktoren reguliert. Diese Wachstumsfaktoren spielen auch eine wichtige Rolle in Tumoren. Die Aufklärung dieser Signalwege ist daher für das Verständnis der molekularen Vorgänge im Spemann-Organistaor und für das Krebsgeschehen aufschlußreich. Whole-mount in situ Hybridisierungs Screening N. Pollet, J. Li In einem screening Projekt zur Identifizierung entwicklungsegulatorischer Gene mit Funktion im Mesoderm werden in der Abteilung in großem Maßstab cdnas mit Hilfe von in situ Hybridisierung auf ihr Expressionsmuster hin untersucht. cdnas, die ein interessantes Muster zeigen, werden in Zusammenarbeit mit Dr. Hajo Delius (DKFZ) ansequenziert und gegebenenfalls näher untersucht. In unserem Pilotscreen wurden cdnas einer Neurula cdna Bibliothek aus Xenopus Embyronen isoliert und das Expressionsmuster der entsprechenden Gene in verschiedenen Embryonalstadien untersucht. Es wurden ca cdnas analysiert und differentiell exprimierte Gene ansequenziert. Nach Abzug mehrfach identifizierter Gene resultierten 723 differentiell exprimierte Gene, von denen 388 Gene keine signifikante Sequenzhomologie zu bekannten Genen zeigen. Auf Grund der Erfahrungen mit einem vorangegangenen Pilotscreen wissen wir, daß ca. 300 dieser Gene potentielle Entwicklungskontrollgene darstellen, z. B. Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Komponenten von Signalwegen, Transkriptionsfaktoren. Unter den identifizierten Klonen waren solche mit einer belegten regulatorischen Funktion in der Embryonalentwicklung. Im vorangegangenen Pilotscreen war die Beobachtung sogenannter Synexpressionsgruppen, d. h. Gruppen von Genen, die ein gemeinsames, komplexes Expressionsmuster aufweisen, von besonderer Bedeutung. Interessanterweise sind diese Gene nicht nur durch ihre Expressionen sondern auch ihre potentielle Funktion verknüpft und fungieren 37

38 38 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie häufig als negative feedback Inhibitoren [2]. So zeigen die vier Mitglieder der Delta-Gruppe alle das charakteristische Expressionsmuster von Delta1, einem Liganden des Notch- Rezeptors. Eines dieser Gene, esr9, wurde verwendet um nachzuweisen, daß die sogenannte Segmentations-Uhr auch in Xenopus wirksam ist. Ein molekularer Oszillator sorgt dafür, daß periodisch Gewebssegmente abgeschnürt werden, die sich zu den Somiten entwickeln. Esr9 zeigt diese charakteristische periodische Expression in der Schwanzknospe [3]. Flrt3 als neuer Regulator des FGF Signalwegs R. Böttcher XFLRT3 ist ein differentiell exprimiertes Gen, das im in situ Hybridisierungsscreen indentifiziert wurde. Es ist Mitglied einer kleinen Genfamilie unbekannter Funktion, die für Transmembranproteine kodiert. XFLRT3 weist das charakteristische Expressionsmuster von FGF8 im frühen Xenopuskeim auf und wird auch durch FGF reguliert. Überexpression von XFLRT3 induziert sekundäre Schwänze, ein Phänotyp, der auch durch Aktivierung des FGF-Signalwegs hervorgerufen wird. XFLRT3 induziert typische FGF-Zielgene nach Überexpression. Inaktivierung von XFLRT3 blockiert die FGF8 vermittelte Signalkaskade. FGF-Rezeptoren binden an XFLRT3 und werden daduch vermutlich in ihrer Funktion moduliert. Diese Daten weisen darauf hin, daß es sich bei XFLRT3 um einen neuen Transmembranregulator des FGF- Signalwegs handelt [4]. Abteilung A050 Molekulare Embryologie Dickkopf1 und der Wnt Signalweg im Spemann- Organisator B. Mao, I. del Barco, A. Glinka, O. Kazanskaya, C. Kiecker, W. Wu Der Spemann sche Kopforganisator wird von Mitgliedern der Wnt- und BMP-Wachstumsfaktorfamilie antagonisiert. Dies sind Wachstumshormone, die in zahlreichen Prozessen in der Embryonalentwicklung Zellwachstum und Differenzierung regulieren. Wir haben ein 2-Inhibitor Modell vorgeschlagen, nach dem das wirksame Prinzip des Spemann schen Kopfinduktors die gleichzeitige Inhibition von BMP- und Wnt-Signalen ist. Diese Inhibition wird durch Antagonisten bewirkt, die diese Wachstumsfaktoren hemmen. Ein solcher Antagonist ist Dickkopf (Dkk1), dessen Überexpression zu Kaulquappen mit vergrößerten Köpfen führt. Das Gen kodiert für ein sekretiertes Protein von ca. 30 kda, das spezifisch im Kopforganisator exprimiert ist. Wenn dkk1 zusammen mit BMP-Inhibitoren überexprimiert wird, so führt dies zur Induktion von sekundären Köpfen, mit Augen und Vorhirnstrukturen. Um die Synergie von BMP- und Wnt-Antagonisten im Kopforganisator der Maus zu testen, wurden Mausmutanten hergestellt, in denen sowohl dkk1 als auch der BMP-Antagonist noggin inaktiviert sind. Bereits doppelheterozygote Tiere weisen massive Kopfdefekte auf, während dkk1 heterozygote oder noggin heterozygote Tiere normal sind. Die Kopfdefekte treten bereits in der Gastrula auf, wo die Kopfanlage nicht korrekt gebildet wird. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Doppelinhibition von Wnt- und BMP-Signalen bei der Kopfentwicklung der Maus [5]. Dkk1 Protein inhibiert den Wnt-Signalweg, indem es als Antagonist für den Wnt Korezeptor Lipoprotein-related Abb.1: Heterologe Koexpression von dkk1 und krm2 führt zu defekter Flügelentwicklung bei Drosophila. Xenopus dkk1 (a), krm2 (c) oder dkk1+krm2 (b) wurden in Drosophila als Transgen in Flügelimaginalscheiben überexprimiert. Nur die Koexpression beider Gene inhibiert den Wnt Signalweg (c), so daß es zu Flügeldefekten kommt.

39 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A050 Molekulare Embryologie protein6 (LRP6) fungiert. LRP6 ist zusammen mit dem Wnt Rezeptor Frizzled an der Signalweiterleitung von Wnt Ligand beteiligt, vermutlich indem ein ternärer Komplex zwischen Wnt, LRP6 und Frizzled ausgebildet wird. Zusätzlich zu LRP6 wurde ein weiterer Dkk1 Rezeptor, Kremen, identifiziert. Kremen1 und -2 sind neue Transmembranproteine, die mit hoher Affinität Dkk-Proteine binden und die Wnt-Inhibition von Dkk verstärken [6]. Kremen verstärkt den Effekt von Dkk1 und in Drosophila ist z.b. die Koexpression von Krmen und Dkk1 notwendig, um den Wnt Signalweg effektiv zu blockieren, was zu charakteristischen Flügeldefekten führt (Abb.1). In Xenopus führt die Inhibition von Kremen1 und -2 zu Kaulquappen mit Kopfdefekten, was eine Rolle dieser Gene in der Kopfinduktion belegt [7]. Dkk1 ist Mitglied einer Multigenfamilie. Kremen kooperiert auch mit Dkk2 und -4 aber nicht mit Dkk3, dessen Eigenschaften sich auch in anderer Hinsicht sehr von denen anderer Dkk-Mitglieder unterscheidet [8]. 39 Regulation der Pluripotenz G. Barreto, C. Hansis, S. Swaminathan Merkmal von Stammzellen ist ihre Fähigkeit, sich plastisch zu verhalten und in verschiedene Zelltypen differenzieren zu können. Embryonale Stammzellen können sich prinzipiell zu allen Zelltypen des Organismus entwickeln. Diese Eigenschaft wird als Pluripotenz bezeichnet. Dies wirft die Frage nach den molekularen Mechanismen auf, die die Pluripotenz regulieren. Es werden daher Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, Faktoren zu identifizieren und charakterisieren, die Pluripotenz vermitteln. Hierzu sind verschiedene Screens im Gang, um z.b. Regulatoren des Pluripotenz-Markers oct4 zu finden. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Niehrs C. (2003) Developmental biology: a tale of tails. Nature 24, [2] Niehrs C, Meinhardt H. (2002) Modular feedback. Nature 41, [3] Li, Y., Fenger, U., Niehrs, C. and Pollet, N.(2003) Cyclic expression of esr9 and esr10 genes in Xenopus presomitic mesoderm. Differentiation 71, [4] Böttcher, R.T., Pollet, N., Delius, H., und Niehrs, C. (2004) The transmembrane protein XFLRT3 forms a complex with FGF receptors and promotes FGF signalling. Nat. Cell Biol. 6, [5] del Barco Barrantes I., Davidson G., Gröne H.J., *Westphal H., Niehrs C. (2003) Dkk1 and noggin cooperate in mammalian head induction Genes Dev. 15, [6] Mao, B., Wu, W., Davidson, G, Marhold, J., Li, M., Mechler, B.M, Delius, H., Hoppe, D., Stannek, P., Walter, C., Glinka, A. and Niehrs, C. (2002) Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/β-catenin signalling Nature 417, [7] Davidson, G., Mao, B., Del Barco, I. and Niehrs, C. (2002) Kremen proteins interact with Dickkopf1 to regulate anterior-posterior CNS patterning. Development 129, [8] Mao B, Niehrs C. (2003) Kremen2 modulates Dickkopf2 activity during Wnt/lRP6 signaling. Gene 302,

40 40 Abteilung Pathochemie (A060) Leiter: Prof. Dr. Volker Kinzel (- 3/03) Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Senior Wissenschaftler Dr. Dirk Bossemeyer PD Dr. Dieter Kübler Prof. Dr. Jennifer Reed Post-docs Dr. Michael Gaßel (01-) Dr. Dan Mihailescu Gastwissenschaftler Dr. Saturnino Herrero de Vega (- 1/04) Dr. Zeily Nurachman (3-9/03) Doktoranden Andreas Schlosser (- 3/02 mit Abtlg. B090) Darko Gosenca (- 8/02) Frank Gesellchen (- 10/03) Katrin Weise (10/02-) Katja Gehenn (1/03-) Andrea Erlbruch (7/03-) Techniker/innen: Hannelore Horn (½) Norbert König Ursula Stanior (- 6/02) James Richards (- 7/03) Die Abteilung befaßt sich mit Themen der zellulären Signalgebung auf Proteinebene durch strukturelle und funktionelle Analysen molekularer Interaktionen. Die Projekte umfassen: - Proteinkinasen als therapeutische Targets - Die Zelloberfläche als Reaktionszentrum und Angriffsziel - Steuerung des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang - Strukturelle Kontrollmechanismen molekularer Interaktionen (Krankheitsrelevante Proteindomänen als Target) Die reversible Proteinphosphorylierung ist ein universelles Werkzeug zur schnellen Steuerung der biologischen Aktivität von Proteinen. Auch beim Wachstum von Krebszellen spielt sie eine große Rolle. Das Verständnis dieser Reaktion erfordert die Kenntnis der für Proteinphosphorylierung verantwortlichen Schlüsselenzyme - der Proteinkinasen - auf molekularer Ebene bis hin zu ihrer Regulation, Funktion und Hemmung bei der lebenden Zelle. Proteinkinase-Hemmstoffe werden bereits zur Therapie verschiedener Krebsformen eingesetzt. Die durch Phosphorylierung ausgeübte Kontrolle geschieht häufig durch lokale Strukturänderungen der Substrate, wie dies auch in unseren früheren Arbeiten gezeigt werden konnte. Wir haben diese Art von Konformationskontrolle von isolierten Proteindomänen anhand synthetischer Peptide untersucht. Diese Arbeiten umfassen Untersuchungen zum Aktionsmechanismus von Fusionspeptiden und einen neu entdeckten Dömänentyp, ein β α Polaritäts-abhängiger Konformationsschalter. Abteilung A060 Pathochemie Proteinkinasen als therapeutische Targets D. Bossemeyer, A. Erlbruch, S. Herrero de Vega, Z. Nurachman, M. Gassel, N. König, V. Kinzel In Zusammenarbeit mit: Intern: W.-D. Lehmann und A. Schlosser (B090) Extern: Dr. R.A. Engh, Roche-Diagnostics Penzberg; Prof. Dr. R. Huber und Dr. T. Holak, MPI für Biochemie, Martinsried; Prof. Dr. F.W. Herberg, Univerität Kassel Zusatzfinanzierung: Roche-Diagnostics, Penzberg Die Mehrzahl aller menschlichen Krebserkrankungen und vieler andere Krankheiten ist eng mit der Fehlregulation von Proteinkinasen verknüpft. Proteinkinasen als zentrale Schalter der zellulären Regulation und Signaltransduktion phosphorylieren Proteine, wodurch deren Funktionszustand reversibel geändert wird. Im Grundzustand sind die meisten Proteinkinasen allerdings inaktiv, ihre pathologischen Wirkungen resultieren in der Regel aus ihrer Überexpression oder Daueraktivierung. Hemmstoffe für die Aktivität von Proteinkinasen sind daher äußerst vielversprechende Agenzien in der Tumortherapie mit z. T. überwältigenden therapeutischen Erfolgen bei nur geringen Nebenwirkungen. Dies zeigt eindrucksvoll das Beispiel des Proteinkinaseinhibitors STI571 (Gleevec) bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie. Eine Grundlage für die Entwicklung dieses Therapeutikums war die Struktur der ATP- Bindestelle von Proteinkinasen, wie sie von uns für die campabhängige Proteinkinase 1993 mit als erstes vorgelegt wurde. Ein großes Hindernis bei der strukturbasierten Entwicklung von selektiven Proteinkinaseinhibitoren ist der Mangel an Kristallstrukturen therapeutisch relevanter Proteinkinasen. Von den über 500 verschiedenen Proteinkinasen des menschlichen Genoms sind gerade einmal 6% kristallisiert. Die Arbeitsgruppe versucht daher, auf zwei Wegen räumliche Strukturinformationen von Proteinkinasen für die Inhibitorentwicklung zu gewinnen. Der direkte Weg führt über die rekombinante Expression, Reinigung und Kristallisation von Proteinkinasen, z. Zt. überwiegend aus der Gruppe der AGC-Kinasen, zu der u. a. so wichtige Vertreter wie PKA, PKC, PDK1, PKB gehören. Hierzu werden sowohl bakterielle als auch eukaryontische (Insektenzell-) Expressionsysteme eingesetzt. Der indirekte Weg führt über die katalytische Untereinheit der PKA. Kokristallisationsstudien mit Proteinkinaseinhibitoren lassen Rückschlüsse darauf zu, welche Faktoren und Eigenschaften für die Bindung von Inhibitoren eine Rolle spielen [1,2]. Wegen der hohen Konserviertheit des katalytischen Kerns von Proteinkinasen lassen sich bestimmte Eigenschaften und strukturelle Charakteristika anderer, verwandter Kinasen durch gerichtete Mutagenese von PKA nachahmen (dabei entstehen sogenannte Surrogatkinasen) [3,4]. Dieser Weg bietet den Vorteil der leichten Gangbarkeit, da für PKA von uns vielfältige Aktivierungs- Reinigungs- und Kristallisationssysteme entwickelt wurden, die sich längst im Routineeinsatz bewährt haben. Um eine möglichst breite und solide Basis für die Entwicklung neuer Hemmstoffe zu schaffen, versuchen wir darüber hinaus, die strukturellen und funktionellen Mechanismen der Katalyse und der zellulären Inaktivierungsprozesse von Proteinkinasen zu verstehen. Hierzu kombinieren wir strukturelle Analysen, gerichtete Mutagenesen von ausgewählten Aminosäureresten und konservierten Strukturelementen und funktionelle sowie kinetische Studien, z.

41 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie B. mittels Surface Plasmon Resonanz [6]. Ein natürlicher Regelmechanismus von Proteinkinasen führt über die Phosphorylierung dieser Enzyme. PKAc z. B. verfügt, je nach Isoform, über mindestens 4 Phosphorylierungsstellen. Diese Phosphorylierungen haben wir mittels Massenspektrometrie, Kristallstrukturaufklärung und NMR untersucht [7-9]. Die Wirkung zahlreicher Hormone wird über Änderungen des intrazellulären camp-spiegels vermittelt. Hauptwirkort dieses sekundären Botenstoffes ist das Enzym, PKA. Die vielfältigen und für das jeweilige Hormon spezifischen zellulären Antworten lassen sich nur durch subzellulär unterschiedliche Verfügbarkeiten und individuell besondere Eigenschaften von PKA und PKA-Isoenzymen erklären. Genetisch kennt man Cα, Cβ, Cγ, sowie Cβ2 (entdeckt und kloniert in der Abteilung), und einige andere Splicevarianten. Cβ2 ist insofern ungewöhnlich, als es eine aminoterminale Extradomäne aufweist. Gegenwärtig untersuchen wir die Rolle von Cβ2 und seiner Extradomäne im Hinblick auf biochemische und biologische Wirkungen, wie Regulation, Protein-Proteinwechselwirkung, Translokation und Substraterkennung [10]. Die Zelloberfläche als Reaktionszentrum und Angriffsziel Proteinkinasen der Zelloberfläche und extrazelluläre Proteinphosphorylierung D. Kübler, D. Gosenca, S. Elsner In Zusammenarbeit mit: Intern: Prof. W.D. Lehmann und Dr. M. Wind (B090), Dr. H. Heid (A010) Extern: Prof. W. Jahnen-Dechent (Universität Aachen), Prof. I. Friedberg, (Universität Tel Aviv, Israel). An der Entwicklung von Zellen und ihrer Einbindung in die zelluläre Umgebung sind enzymatische Aktivitäten der Zelloberfläche beteiligt. Durch diese Enzyme können sowohl gebundene Substrate auf der Zelloberfläche als auch fremde Substrate aus der Zellumgebung verändert werden. Die von uns an vielen Zellen nachgewiesenen Ser/ Thr Proteinkinasen an der Zelloberfläche (Ekto-PK) besitzen Eigenschaften camp-abhängiger PK (PKA) und von, Proteinkinasen CK1 und CK2, wobei letztere im Tandem von intakten Zellen in das extrazelluläre Kompartiment freigesetzt werden können. Ekto-PK ermöglichen es Zellen, Substratproteine in ihrer biologischen Wirkung spezifisch und reversibel zu verändern und bestätigen damit, dass das mächtige Werkzeug der Proteinphosphorylierung auch außerhalb der Zellen genutzt wird und als Mechanismus der extra-intrazellulären Signalvermittlung wirkt. Zu den Substraten von Ekto-PK gehören Proteine mit unterschiedlichen Funktionen wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Entzündungsmediatoren oder Komponenten der extrazellulären Matrix. Eine ständig wachsende Zahl von Literaturdaten zu normalen und maligne veränderten Prozessen unterstreicht die zentrale Rolle extrazellulärer Proteinphosphorylierungen. Ekto-PK und ihre Substrate bieten somit wichtige pharmakologische und therapeutische Ziele. Ekto-PK-Substrate der Zelloberfläche können radioaktiv markiert werden und zeigen sich nach SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie als Zelltyp-spezifische Spektren von Phosphoproteinen. Ihre Identifikation sind von hohem Interesse für das Verständnis ihrer biologischen Funktion. Mit immunologischen und biochemischen Methoden einschließlich Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie ließen sich Homologe von bisher nur intrazellulär erwarteten Abteilung A060 Pathochemie Proteinen nachweisen. Die funktionelle Charakterisierung dieser sowie anderer Ekto-PK Substrate, die Mechanismen ihrer Expression als Zelloberflächenproteine und vergleichende Untersuchungen an Normal- und Tumorzellen sind Ziele laufender Arbeiten. Im Zusammenhang mit der Wirkung extrazellulärer Nukleotide (ATP) als Proliferationshemmer transformierter und Tumorzellen wurde das für die Inhibition vermutlich entscheidende Protein aus dem Zellüberstand isoliert und als Plasma-Glykoprotein identifiziert. Die Hemmaktivität dieses extrazellulären Inhibitors wird durch Phosphorylierung reguliert und korreliert mit der Inaktivierung von Wachstumsrezeptor-gekoppelter Tyrosinkinase-Aktivität und nachgeschalteter Signalwege. Die molekulare Struktur des Inhibitors, der vermutlich aus Vorläufern aktiviert wird [11] und die Identifizierung seiner Phosphorylierungsstellen [12] deuten auf ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Proteindomänen hin. Mechanismen zur Aktivierung dieses Wachstumsinhibitors aus Vorläufern, seiner Phosphorylierung sowie die Suche nach Rezeptoren auf Zielzellen bilden Schwerpunkte der weiteren Untersuchungen zum Verständnis der ATP-induzierten Tumorzellhemmung. Diese Kenntnisse werden für die Entwicklung anwendungsbezogener Konzepte von Bedeutung sein. Kontrolle des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang V. Kinzel, N. König, J. Richards In Zusammenarbeit mit Prof. W. D. Lehmann, Dr. M. Wind und M. Salek (Abt. B090) Vielzellige Organismen kontrollieren die Vermehrung ihrer Zellen durch meist reversibles Anhalten im Zellzyklus, unter anderem auch am Übergang von G2 Phase zur Mitose. Zur Steuerung spielen dabei Proteinphosphorylierungs-, Dephosphorylierungsvorgänge und damit natürlich auch die verantwortlichen Katalysatoren - Kinasen und Phosphatasen - eine entscheidende Rolle. Die Kenntnis der Regulation dieser Enzyme ist daher die Voraussetzung für das Verständnis der normalen sowie der gestörten Zellzykluskontrolle. Unser Interesse gilt der Proteinphosphatase 2A (PP2A), deren Aktivitätsminderung wir am G2/Mitose Übergang und in Mitose zeigen konnten. Eine unzeitgemäße Reaktivierung des in G2 Phase schon gehemmten Enzyms führt zum sofortigen Stop des Übertritts der Zelle in die Mitose. Möglicherweise ist für die Aktivitätsminderung der PP2A in G2 Phase und Mitose eine spezielle Phosphorylierung der katalytischen Untereinheit (PP2A C) verantwortlich, wie Befunde mit Antikörpern andeuten. Allerdings gelang es bisher nicht, PP2A C-gebundenen Phosphor bei aus Mitoszellen gereinigtem Enzym direkt nachzuweisen - vermutlich wegen der hohen Kapazität des Enzyms, sich selbst zu dephosphorylieren. Gegenwärtig wird ein Vorgehen ausgearbeitet, die Autodephosphorylierung bei der Analyse. 41

42 42 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Strukturdeterminanten von Proteinen J. Reed, D. Mihailescu, K. Gehenn, K. Weise In Zusammenarbeit mit: Prof. J.C. Smith (Universität Heidelberg), Prof. D. Langosch (Technische Universität München) Zusatzfinanzierung: HGF Strategiefond, VW-Stiftung In jüngster Zeit wurde immer deutlicher, daß in einer Reihe von Fällen Domänen eines Proteins, die für eine bestimmte Funktion verantwortlich sind, in isolierter Form - ohne den Kontext der nativen Proteinmatrix - sowohl ihre Struktur als auch ihre Funktion bewahren. Dies erleichtert Untersuchungen von Struktur / Funktionsbeziehungen bei solchen Domänen ganz erheblich, weswegen solche Studien heute in der medizinischen Grundlagenforschung sowie bei der gezielten Entwicklung von Medikamenten üblich sind. Diese Gruppe benützt biophysikalische Techniken wie Cirkulardichroismus- (CD) und magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR) in Verbindung mit computergestützter Molekülmodellierung zur Analyse kritscher Kontrollaspekte bei Proteindomänen von medizinischem Interesse - zum einen, was Liganden-Rezeptor Wechselwirkungen im allgemeinen betrifft, zum anderen, wie posttranslationale Strukturveränderungen die biologische Aktivität beeinflussen. Der Konformations-Schalter im HIV1 Hüllprotein Der Befund dieser Gruppe, daß die CD4 Bindungsdomäne des Glykoproteins gp120 von HIV1 einen konservierten Konformations-Schalter enthält, d.h. einen Abschnitt, der eine kooperativen Umfaltung von einer β-struktur zu einer 3 10 Helix bei Membranbindung erfährt, ermöglichte zwei Ansätze für eine neue Form anti-viraler Therapie. Beide zielen auf die Blockade des initialen Infektionsschrittes, der Bindung des Virus an den CD4 Rezeptor von Wirtszellen. Die Tatsache, daß die kooperative Umfaltung der Schalterdomäne absolut nötig ist zur Bindung an CD4, führte zur Suche nach Verbindungen, die diese Kooperativität hemmen. Die Suche war erfolgreich. Diese Substanzen verhindern in der Tat die Rezeptorbindung des gp120 Fragments an CD4 exprimierende Zellen. Im Zuge der Verfeinerung mit Hilfe von QSAR und Molekülmodellierung wurden Faltungs-Hemmer hergestellt mit einer ID 50 im niedrigen nanomolaren Bereich, die auch nicht toxisch waren in Zellkulturen. An diesem Punkt schien das Projekt reif für eine industrielle Weiterentwicklung, die mit einer Steinbeis GMBH eingeleitet wurde (Transferzentrum für angewandte Biologische Chemie und Transferzentrum Glykoconjugate). Das hohe Maß der Konservierung der Faltungseigenschaften der CD4 Bindungsstelle von gp120 - trotz einer erheblicher Sequenzvariabilität - eröffnet zusätzlich einen neuen immunologischen Ansatz. Die Strategie besteht in der präzisen Bestimmung des Peptid-Rückgrats dieser Domäne in freier, d.h. nicht an CD4 gebundener Form. Da die Strukturbestimmung durch 1 H-NMR infolge ausgeprägter Aggregatbildung nicht möglich war, wurde eine neue Strategie verfolgt, bei der die NMR-Peptidstruktur in drei unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität bestimmt wurde. Diese Strukturen dienten dann als Grundlage für ein dynamisches Peptidmodelling in einer virtuellen Wasserbox. Im Falle sehr ähnlicher Strukturen, war davon auszugehen, dass diese Struktur energetisch günstig ist und demzufolge die aktuelle Peptidkonformation darstellt. Diese Arbeit war erfolgreich [13,14] und die so definierte Struktur des Peptidrückgrades wurde zur Analyse von Sequenzen aus 19 verschiedenen HIV1 Stämmen Abteilung A060 Pathochemie (8 aus Gruppe M und 1 aus Gruppe O) herangezogen. Die Oberflächenladung in der jeweiligen Lösung für jede Peptidkonformation sowie die Werte für Hydrophobizität/ Hydrophilität wurden bestimmt. Die Oberflächen-Ladungsverteilung für die verschiedenen HIV1 Stämme zeigten sich signifikant verschieden, ein einsichtiger Grund, warum Stamm-unabhängige Immunantwort schwierig auszulösen ist. Im Gegensatz zur Sequenz Variabilität blieb das Hydrophobizität/Hydrophilitäts-Profil relativ unverändert. Der vermutete pharmakophore footprint wurde durch Konstruktion von Durchschnittswerten aus Ladungsverteilungen an der Peptidoberfläche untersucht. Hierbei entfielen Unterschiede innerhalb von HIV1 Stämmen, während konservierte Merkmale erhalten blieben. Die Resultate zeigten, dass die scheinbaren Unterschiede eine innewohnende Identität verdecken. Die Kombination von konstanter Oberflächenladungsprofilen mit Hydrophobizität/Hydrophilitäts-Profilen als Eigenschaft aller Stämme resultierte in der Etablierung des konservierten pharmakophoren footprints [15]. Dieses Ergebnis soll als Vorlage zur entsprechenden Antigengewinnung genutzt werden, die möglicherweise in eine erfolgreiche Stimulation von auf breiter Basis neutralisierender Immunantwort mündet. Fusionsfördernde Peptide Die Fusion von biologischen Membranen ist essentiell bei zahlreichen zellulären Prozessen und unterliegt vielen mikrobiellen Infektionen. Meist wird sie in gezielter Weise durch einen Satz spezialisierter Peptide induziert. Es wäre medizinisch nützlich, diesen Vorgang kontrollieren zu können, doch ist nicht bekannt, wie fusionsfördernde Peptide arbeiten. In einem von der VW Stiftung geförderten Projekt versuchen wir herauszufinden, welche Eigenschaften dieser ziemlich kurzen Peptide für die Fusion verantwortlich sind. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Fusionsfähigkeit der Fusionspeptide aus Synaptobrevin II and Syntaxin 1A von der Konformationsflexibilität und seiner Bindungs-abhängigen Faltung abhängt. Wir haben auf dieser Grundlage versucht, rein synthetische Fusionspeptide zu entwerfen. Eine Familie von Peptiden mit α-helikalen und β-faltblatt fördernden Resten (Leucin und Valin), entweder alternierend oder als Homopolymere, wurde entwickelt. Jede davon enthält drei N-terminale und drei C-terminale Lysinreste zur Förderung der Löslichkeit und einen Tryptophanrest für die rasche Proteinbestimmung. Das Fusionsverhalten dieser Peptide wurde in der Arbeitsgruppe Prof. Langosch und die Korrelation des Fusionsverhaltens mit den jeweiligen Peptidstruktur mittels CD Spektroskopie wurde von uns untersucht. Initiale Ergebnisse zeigen, dass in diesen synthetischen Peptiden die Fusionseigenschaft unabhängig von Selbst-Assoziationen sind. Andererseits ergibt sich eine strenge Korrelation zwischen Konformationsflexibilität und der Fähigkeit mit Membranen zu fusionieren. Die Untersuchungen werden mit Peptidvarianten (Prolin- und/oder Glycinreste werden eingeführt) zur Verbesserung der Präsentation fortgesetzt. Peptidsequenzen mit Schaltereigenschaften Obwohl der β α Konformationsschalter zuerst in gp120 aus HIV1 entdeckt wurde, zeigten Folgeuntersuchungen, dass Polaritäts-abhängige Konformationsschalter dieses Typs weitverbreitete Motive in Proteinen sind. Während der Arbeiten an gp120 konnte ein großer Teil des Mechanismus der kooperativen Rückfaltung erlernt und einige wesentliche Komponenten solcher Sequenzen identifiziert werden. Diese beinhalten a) eine N-terminale Tetrade,

43 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie L-P-C-R, die als Helix-Initiationsstelle wirkt, b) einen Tryptophanrest, der 8-10 Reste C-terminal davon liegt, der die β-hairpin Struktur stabilisiert und der für die Kooperativität entscheidend ist, und c) ein hohes Potenzial für die α-helikale sowie die β-faltblattstruktur der dazwischen liegenden Reste. Versuche einen synthetischen Schalter unter diesen Kriterien zu schaffen, waren jedoch bisher nicht erfolgreich. Dies weist auf eine weitere unentdeckte Eigenschaft hin. In jüngerer Zeit haben wir einige weitere natürlich vorkommende Konformationsschalter identifiziert und getestet durch Zugabe von Pyruvatdehydrogease, Phosphatase und Adenylatzyklase-Regulatorprotein zusätzlich zu jenen Faktoren, die bereits aus HIV1 gp120 und Tomaten Polygalacturonase bekannt sind. Dabei konnten wir ein neues Werkzeug entwickeln, den Seitenketten- Interaktionsindex (SCII). Dieser stellt einen Parameter für die Eigenschaft von Seitenketten dar, innerhalb einer Sequenz energetisch günstige Interaktionen einzugehen. Wir haben gefunden, dass SCII >0.5 ein weiteres Charakteristikum für Konformationsschalter ist und einen exzellenten Prognosefaktor darstellt. Mit der Verwending von SCII als viertes Charakteristikum, waren wir erstmals in der Lage, einen voll funktionsfähigen Konformationsschalter zu entwerfen und synthetisch herzustellen [16]. Dies wiederum eröffnet die Möglichkeit, dieses Motiv für Proteinkonstruktionen zu nutzen, bei denen, wie in natürlichen Proteinen, Protein/Protein- oder Protein/Membran -Assoziation zu kontrollieren oder signalisieren. In der Zwischenzeit setzen wir die Suche fort nach weiteren Familien von Konformationsschaltern, neben jenen mit L-P-C-R. Unsere Entdeckung des Schalters in der Transaktivierungsdomäne von p53 (unveröffentlicht) ist ein Hinweis auf die tatsächliche Existenz solcher Sequenzen. Kooperationen: Die Erfahrungen auf dem Gebiet der CD- Analysen der Sekundärstruktur von Proteinen haben zu einer Reihe Kooperationen geführt, die alle innerhalb des oben skizzierten Forschungsrahmens angesiedelt sind [17,18]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Breitenlechner, C. B., Gaßel, M., *Hidaka, H., Kinzel, V., *Huber, R., *Engh, R. A., Bossemeyer, D (2003). The Catalytic Subunit of camp-dependent Protein Kinase in Complex with Rhokinase Inhibitors Y-27632, Fasudil (HA-1077) and H-1152P - Structural Basis of Selectivity. Structure 11(12), [2] Gaßel, M., *Breitenlechner, C., Herrero, S., *Engh, R. A., Bossemeyer, D.(2004) Inhibitors of PKA and related protein kinases.. In Handbook of Experimental Pharmacology [Inhibitors of Protein Kinases and Protein Phophatases] Lorenzo A. Pinna (Padova, Italy) and Patricia W. Cohen (Dundee, Scotland UK) Eds. Springer Verlag, Heidelberg. (Invited Review, in press) [3] Gaßel, M., *Breitenlechner, C. B., *Ruger, P., *Jucknischke, U., Schneider, T., *Huber, R., Bossemeyer, D., *Engh, R. A. (2003) Mutants of protein kinase a that mimic the ATP-binding site of protein kinase B (AKT). J. Mol. Biol. 329, [4] Gaßel, M., *Breitenlechner, C. B., König, N., *Huber, R., *Engh, R. A., Bossemeyer, D. The Protein Kinase C Inhibitor Bisindolyl-maleimide II Binds with Reversed Orientations to Different Conformations of PKA. (J. Biol. Chem., in press) [5] *Breitenlechner, C., Gaßel, M., *Engh, R. A., Bossemeyer, D.(2004) Structural Insights into AGC kinase inhibition. Oncology Research (Invited Review, in press) [6] *Engh, R. A., Bossemeyer, D. (2002) Structural aspects of protein kinase control - role of conformational flexibility. Pharmacology. and Therapeutics 93, Abteilung A060 Pathochemie [7] *Breitenlechner, C., *Engh, R. A., *Huber, R., Kinzel, V., Bossemeyer, D., Gaßel, M. The typically disordered N-terminus of PKA can fold as A helix and project the myristoylation site into solution. (Biochemistry, in press) [8] Schlosser,A., *Bodem,J., Bossemeyer,D., Grummt,I., Lehmann,W.D. (2002) Identification of protein phosphorylation sites by combination of elastase digestion, immobilized metal affinity chromatography, and quadrupole-time of flight tandem mass spectrometry. Proteomics 2, [9] *Seifert,M.H.J., *Breitenlechner,C.B., Bossemeyer,D., *Huber,R., *Holak,T.A., *Engh,R.A. (2002). Phosphorylation and flexibility of cyclic-amp-dependent protein kinase (PKA) using P- 31 NMR Spectroscopy. Biochemistry 41, [10] Gesellchen, F. (2003) Recombinante Expression und vergleichende biochemische Charakterisierung der IsoformenCß1 und Cß2 der katalytischen Untereinheit der camp-abhängigen Proteinkinase. Dissertation Universität Heidelberg [11] Gosenca D., Wind, M., Lehmann W.D., Heid, H., *Friedberg I., *Jahnen-Dechent,W., Kübler, D. Molecular composition and phospho-acceptor sites in bovine fetuin-a, a putative mediator of cell growth arrest. (Anal. Biochem., submitted) [12] Wind, M., Gosenca, D., Kübler, D., Lehmann, W.D. (2003) Stable isotope phospho-profiling of fibrinogen and fetuin subunits by element mass spectrometry coupled to capillary liquid chromatography. Anal. Biochem. 317, [13] Mihailescu, D., *Smith, J., Reed, J. (2002) Solution structure of a putative HIV1 immunogenic peptide: computer simulation of the principal CD4 binding domain of gp120. J. Med. Chem. 45, [14] Mihailescu, D., Reed, J., *Smith, J. (2003) Convergence in peptide folding simulation: multiple trajectories of a potential AIDS pharmacophore from different starting structures. Biopolymers 70, [15] Pfisterer, C., Mihailescu, D., *Smith, J.C., Reed, J. (2004) A common pharmacophoric footprint for AIDS vaccine design. J. Med. Chem., in press [16] Gehenn, K., Pipkorn, R., Reed, J. (2004) Successful design and synthesis of a polarity-triggered β α conformational switch using the side chain interaction index (SCII) as a measure of local structural stability. Biochemistry 43, [17] *Simons, A., *Ruppert, T., *Schmidt, C., *Schlicksupp, A., Pipkorn, R., Reed, J., *White, A.R., *Bayer, T.A., *Cappai, R., *Multhaupt, G. (2002) Copper binding of APP-family members in an evolutionary reconstruction. Biochemistry 41, [18] *Schmechel, A., Zentgraf, H., *Scheuermann, S., *Fritz, G., Pipkorn, R., Reed, J., *Beyreuther, K., *Bayer, T.A., *Multhaupt, G. (2003) Alzheimer s β-amyloid homodimers facilitate Aβ-fibrillization and the generation of conformational antibodies. J. Biol. Chem. 278,

44 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A070 Molekulare Biologie der Mitose Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (A070) Leiter Prof. Dr. Herwig Ponstingl 44 Wissenschaftliche Mitarbeiter Priv.-Doz. Dr. Ralf Bischoff Dr. Simon Fernandez (BMBF) Dipl.-Ing Klaus Leibe (BMBF) Dr. Hans-Peter Zimmermann Gastwissenschaftler Dr. Alexander Marmé, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg Dr. Mikael Sjölinder, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden Doktoranden Katrin Dellas-Kloor Lilia Schleicher (DFG) Alexander Nesterov Techniker Claudia Dallner Antje Koppe Jürgen Kretschmer Brigitte Seib (½) Sekretariat Sabine Hughes (½) Die Forschungsarbeiten der Abteilung haben zum Ziel: Die Identifizierung neuer Tumormarker, Tumorsuppressoren und therapeutischer Zielmoleküle durch systematische Analyse von Gen-Expressionsprofilen. Die Entwicklung hochkomplexer Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen. Die Aufklärung des Transports von Makromolekülen in der Zelle, um Transportwege therapeutisch zu nutzen und um zu verstehen, wie Transportdefekte zur Entwicklung von Tumoren beitragen. Systematische Analyse der Genexpressionsmuster in Ovarialkarzinomen H.-P. Zimmermann, K. Dellas-Kloor, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit G.. Moldenhauer, Abt. Molekulare Immunologie, M. Schorpp-Kistner, Abt. Signaltransduktion und Wachstumsregulation, Eberhard Spiess, Abt. Modellversuche zur Invasion und Metastasierung, alle DKFZ; A. Marmé, M. Lindner, G. Bastert, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg. Ovarialkarzinome sind die gefährlichsten unter den gynäkologischen Tumoren, da sie ohne charakteristische Frühsymptome sind und in der Regel erst in Spätstadien erkannt werden. In Zusammenarbeit mit der Universitäts- Frauenklinik Heidelberg vergleichen wir deshalb die Genexpressionsmuster von Tumorzellen und gesunden Epithelzellen jeweils derselben Patientin. Anhand wiederkehrender Merkmale werden diese Tumoren molekularbiologisch charakterisiert, mit dem Ziel, neue Kennzeichen von diagnostischer Bedeutung zu finden, die molekularen Ursachen der Tumorentwicklung zu verstehen und der Therapie neue Möglichkeiten zu eröffnen. Das Differential Display ist das bisher empfindlichste Verfahren zur systematischen Analyse von Unterschieden in der Genexpression. Es erlaubt in der Form von cdna-fragmenten den Vergleich, die Identifizierung und die Isolierung von mrnas, die in Tumorzellen erheblich stärker oder geringer repräsentiert sind als in den entsprechenden gesunden Zellen. Zellen werden aus cystisch wachsenden Tumoren und aus Normalepithel durch Abstrich aus frischem Operationsmaterial und durch lasergestützte Mikrodissektion aus Gewebeschnitten gewonnen. Dann wird die mrna aus den Zellen isoliert und in cdna umgeschrieben, die als Matrize für die Herstellung von cdna-fragmenten durch PCR dient. Um dabei Fehler auszuschließen, wird parallel jeder Versuch mehrfach durchgeführt. Die Fragmente werden der Größe nach aufgetrennt und geben einen Überblick über die Gene, die in den verglichenen Zellen exprimiert sind. Fragmente, die im Vergleich zu Normalzellen reproduzierbar mindestens eine Größenordnung über- oder unterrepräsentiert sind, werden kloniert und sequenziert. Die Ergebnisse werden durch unabhängige Kontrollversuche mit anderen, für das jeweilige Gen spezifischen Primern am gleichen Ausgangsmaterial beglaubigt. Die anfangs erhaltenen cdna-fragmente werden dann zu vollständigen offenen Leserastern ergänzt. Durch Northern-Blot-Analyse, Cancer Profiling Arrays mit cdna aus Tumor- und Epithel-Gewebepaaren derselben Patientin und durch Hybridisierung an Gewebeschnitten in situ werden die Resultate nochmals unabhängig kontrolliert. Dabei erwiesen sich einige der so charakterisierten Gene nicht nur in Ovarialtumoren, sondern auch in den Karzinomen anderer Epithelien als dereguliert. Abb. 1 Cancer Profiling Array für Gen 24C/G1/1. Es wurde jeweils links gesamte cdna aus dem Normalgewebe (N)einer Patientin und rechts gleich viel gesamte cdna aus dem Tumor (T) derselben Patientin aufgetragen. Mit einer radioaktiven genspezifischen Sonde wurde die Expression des Gens 24C/G1/1 bestimmt. Es ist in den meisten Ovar- und Lungentumoren überexprimiert.

45 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Wir haben zunächst sechs Gene für die weitere Analyse ausgewählt. Um in ihre weitgehend unbekannten Funktionen Einblick zu erhalten, schalten wir sie durch RNAi in geeigneten Zellinien aus, suchen mit 2-Hybrid-Screens nach Bindungspartnern, und prüfen rekombinant exprimierte einzelne Proteindomänen auf ihre biochemischen Eigenschaften. Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten [1,2], müssen Expressionsunterschiede rasch und an möglichst vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung verknüpft werden. Dazu produzieren wir die codierten Proteine rekombinant in Bakterienzellen und gewinnen gegen sie gerichtete Antikörper, die zur immunhistologischen Färbung von Gewebeschnitten eingesetzt werden. Hochkomplexe diagnostische Peptidarrays F. R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe, A. Nesterov In Zusammenarbeit mit Frank Breitling; Thomas Felgenhauer, Mario Beyer, Annemarie Poustka, Volker Stadler, Abteilung Molekulare Genomanalyse, DKFZ. Es wird ein Verfahren zur Herstellung hochkomplexer Peptidarrays entwickelt, das auf einem modifizierten Laserdrucker beruht, der statt des normalen Farbtoners Partikel druckt, in welche die aktivierten Aminosäuren für die Peptidsynthese eingebettet sind. Durch Erwärmen werden die Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Durch wiederholte Merryfield-Zyklen von Koppeln, Waschen und Abspalten der Schutzgruppe kann eine große Zahl unterschiedlicher Peptide gleichzeitig auf einer Trägerfolie synthetisiert werden. Die Möglichkeit, alle Teilschritte der Synthese, auch die Verdampfung des Lösungsmittels, kontrollieren zu können, ergibt ein einfaches, robustes, schnelles, preiswertes und gegenüber dem bisherigen Stand der Technik bedeutend verbessertes Verfahren zur Herstellung komplexer Peptidarrays. Arrays dieser Art können z.b. dazu benutzt werden, den Antikörperstatus von Patienten zu bestimmen. Durch die Analyse von Peptidbibliotheken, welche die Proteome von Krankheitserregern oder das des Menschen repräsentieren, erhoffen wir Färbemuster zu erhalten, die uns Status und Verlauf von Krankheiten anzeigen. Ferner können mit den Arrays Substrate von Proteinkinasen gesucht werden, wobei etwa Peptide 1000 menschliche Genprodukte als überlappende Peptide repräsentieren. Sobald man diese Substrate identifiziert hat, kann ein entsprechender Array von Kinase-Substraten aktive Signalwege in verschiedenen Geweben oder Zellinien nachweisen. Bisher haben wir 15 Aminosäure- Toner entwickelt, die in einer Dichte von > Spots pro 20 x 20 cm auf Abb. 2: Selektive Toner-Ablagerung auf einem Chip mit Elektroden von 100 x 100 µm Abteilung A070 Molekulare Biologie der Mitose einen festen Träger aufgedruckt werden können. Zusammen mit dem modifizierten Farb-Laserdrucker, der am Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung entwickelt wird, sollte die Synthese hochkomplexer Peptidarrays (> Peptide pro Blatt von 20 x 20 cm) demnächst möglich sein. Als Alternative zum Laserdrucker benutzen wir einen Chip, um Toner-Partikel selektiv auf definierte Flächen von 100 x 100 µm aufzubringen [3]. Dieses Verfahren sollte es ermöglichen, noch deutlich mehr verschiedene Peptide auf einer kleinen Fläche zu synthetisieren. Der Ran-Signalweg im intrazellulären Transport F.R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Schleicher, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität Heidelberg; C. Granzow und M. Kopun-Granzow, Abt. Molekulare Toxikologie, DKFZ. Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und RNA durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Zahlreiche Proteine binden spezifisch die aktive Form, RanGTP. Wir haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere Transportfaktoren aus menschlichen Zellen und aus Hefe isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen am Ausgangspunkt und ihrer Dissoziation am Ziel untersucht. Ran liegt auf der cytoplasmatischen Seite der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein Nukleotidaustauschfaktor, RCC1. Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von RanGTP, indem sie mit der Fracht beladen werden oder sie durch Dissoziation der Transportkomplexe abladen. Importine und Exportine verhalten sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma mit einem klassischen Kernlokalisations-Signal binden in Abwesenheit von RanGTP über einen von mehreren Importin-α-Adaptoren an Importin-β, das für den eigentlichen Import zuständig ist. Die Translokation durch die Kernpore folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar ohne Nukleotidhydrolyse auskommt. Im Kern wird der Import durch Dissoziation des importierten Komplexes beendet. RanGTP bindet mit hoher Affinität an Importin-β oder einen der verwandten Importfaktoren und löst dort eine Konformationsänderung aus, die Importin-α und Substrat freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch die Rückbildung der Import-Komplexe verhindert. Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre Frachten im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit RanGTP. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort sind exportierte Komplexe zunächst nicht für die Stimulation der GTP-Hydrolyse durch RanGAP1 zugänglich. Hier greifen das kleine cytoplasmatische RanBP1 und das RanBP2 der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun erst wird die Hydrolyse des Ran-gebundenen GTP durch RanGAP1 stimuliert, das frei im Cytoplasma vorkommt oder über ein Peptid SUMO-1 an RanBP2 gebunden ist. Die GTP- Hydrolyse verhindert, daß sich der exportierte Komplex wieder zurückbildet, denn die Transportfaktoren haben nur eine sehr geringe Affinität für RanGDP. Damit sind die be- 45

46 46 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie teiligten Faktoren wieder für eine neue Transportrunde bereit. RanGDP wird durch einen besonderen Importfaktor NTF2 in den Kern zurückgebracht, um dort durch Nukleotidaustausch an RCC1 aktiviert zu werden. Während RanBP1 und RanBP2 auf der cytoplasmatischen Seite der Kernpore aktiv sind, haben wir im Zellkern das RanBP1-ähnliche Protein RanBP3 gefunden, das die Bildung von Exportkomplexen steuert. Um die Funktion dieses Proteins im Detail zu klären, suchen wir in 2-Hybrid-Screens nach Bindungspartnern. In S. cerevisiae haben Braunwarth et al. [4] ein Protein Yrb30p gefunden, das an dieselbe Stelle von RanGTP bindet, wie RanBP1, aber die RanGAPvermittelte GTP-Hydrolyse hemmt, statt stimuliert. Es könnte sich um einen neuen, hefespezifischen Regulator des Ran-abhängigen Transports handeln. RanGTP wird nur durch chromatingebundenes RCC1 im Kern regeneriert. Auf der Suche nach einem weiteren Nukleotidaustauschfaktor identifizierten wir DelGEF, ein humanes Homologes zu RCC1. Es wird im Chromosomenabschnitt 11p14 codiert, auf dem man ein Gen für erbliche Formen von Taubheit und Retinitis pigmentosa vermutet. Trotz der ähnlichen Struktur kann es Ran nicht aktivieren. Statt dessen bindet es an das Protein Sec5 des Exocysten und reguliert die Sekretion von Proteinen aus der Zelle [5]. Einen weiteren Bindungspartner, der offenbar an demselben Vorgang beteiligt ist, haben wir in DelGIP1, einem sauren Protein von nur 82 Aminosäureresten identifiziert [6]. Es ist anscheinend in allen Eukaryonten vorhanden, seine Struktur ist hoch konserviert. RCC1 und RanGTP spielen auch in der Zellteilung beim Aufbau der Mitosespindel unabhängig vom Kerntransport eine Rolle. Die Hauptkomponenten der Mitosespindel, die Tubuline, binden Cytostatika vom Typ der klinisch verwendeten Vinca-Alkaloide und der Taxane. Erstere stören den Aufbau der Mikrotubuli und leiten den Zelltod durch Apoptose ein. Häufig entwickeln Tumoren Chemoresistenz gegen diese Substanzen, die dann von Pumpen in der Zellmembran sofort wieder ausgeschleust werden. Wir haben einen Weg gefunden, diesen Typ der Resistenz aufzuheben, indem wir einen lichtempfindlichen Abkömmling der Vinca- Cytostatika, NAPAVIN, synthetisierten, der in den Zellen nach Belichtung mit einem Laser an den Zielmolekülen fest verankert wird und für die Membranpumpen unzugänglich bleibt. Nach einem Verfahren von C. Granzow und M. Granzow-Kopun [7-9] werden die Pumpen vor der Belichtung blockiert, sodaß nach einmaliger Behandlung für längere Zeit ein hoher intrazellulärer Spiegel des Cytostatikums erhalten bleibt. Abteilung A070 Molekulare Biologie der Mitose Publikationen und Patente (* = externer Koautor) [1] Dellas-Kloor, K., Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A. DHHC1, a novel marker for epithelial tumors. Europäische Patentanmeldung vom [2] Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A., Moldenhauer, G., *Bastert, G., Kurek, R., Wallwiener, D. DROP1, a novel marker for carcinomas. Europäische Patentanmeldung [3] Breitling, F., Breitling, F., Felgenhauer, Th., Fernandez, S., Leibe, K., Beyer, M., Stadler, V., Bischoff, F.R. & Poustka, A. (2002) Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips. Transkript Laborwelt 2002/ III, p.4-6. [4] Braunwarth, A., Fromont-Racine, M., Legrain, P., Bischoff, F.R., Gerstberger, T., Hurt, E. & Künzler, M. (2003) Identification and characterization of a novel RanGTP-binding protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 278, [5] Sjölinder, M., Uhlmann, J. & Ponstingl, H. (2002) DelGEF, a homologue of the Ran guanine nucleotide exchange factor RanGEF, binds to the exocyst component Sec5 and modulates secretion. FEBS L. 532, [6] Sjölinder, M., Uhlmann, J. & Ponstingl, H. (2004) Characterisation of an evolutionary conserved protein interacting with the putative guanine nucleotide exchange factor DelGEF and modulating secretion. Exper. Cell Res. 294, [7] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M., Gros, G., Stöhr. M. Pharmaceutical composition for eliminating membrane mediated cell resistance. US-Patent 6,376,224 erteilt am [8] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M., Gros, G., Stöhr. M. Pharmaceutical composition for eliminating membrane mediated cell resistance. Patentanmeldung Japan 10_ (2003). [9] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M., Gros, G., Stöhr. M. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Aufhebung der membranvermittelten Resistenz von Zellen. Europäisches Patent erteilt am

47 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (A080) Leiter: Prof. Dr. med. Norbert E. Fusenig Wissenschaftliche Mitarbeiter PD. Dr. Dirk Breitkreutz PD Dr. Nicole Maas-Szabowski Dr. Margareta Müller Dr. Hans-Jürgen Stark Dr. Silvia Vosseler Dr. Wiltrud Lederle Gastwissenschaftler Dr. Nicolae Mirancea, Rumänien (5-10/02; 6-10/03) Doktoranden Nicole Daum Sofia Depner Claudia Gutschalk Martina Koci Joachim Mertens Eva Obermüller Martina Oehme Cathrine Schmidt Anja Fritsch Michael Willhauck Diplomanden/ Bachelor* Jean Kadathukalam* Sabine Schnur* Technische Angestellte Regina Beck (½) Eva Goedecke Silke Haid (¼) Alexandra Krämer Angelika Krischke Iris Martin Heinrich Steinbauer Sekretariat Martina Kegel Karina Zwehn (50%) Im Mittelpunkt der Untersuchungen der Abteilung stehen zelluläre und molekulare Mechanismen der Zell-Zell und Zell-Matrix-Wechselwirkungen von Hautzellen und ihre steuernde Rolle I. für die Regeneration und Differenzierung des normalen Hautepithels und II. für die Entwicklung und Progression von epithelialen Hauttumoren. Ziel der Forschungsarbeiten ist ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge der Transformation humaner Epithelzellen zu Carcinomzellen und deren veränderter Wachstumsregulation im Vergleich zu den Steuerungsmechanismen im normalen Gewebe. Für diese überwiegend in Zellkultur durchgeführten Studien haben wir zelluläre Modelle und komplexe Kultursysteme entwickelt, die der natürlichen Situation im Organismus weitgehend entsprechen. Ausgehend von normalen Epithelzellen der adulten menschlichen Haut (Keratinozyten) wurde eine spontan immortalisierte Zell- Linie (HaCaT) entwickelt und als annähernd normal funktionierende Keratinozyten-Linie charakterisiert. Ihre weitgehend regulären epidermalen Eigenschaften qualifizierten diese Zellen i) als Paradigma für humane Keratinozyten und machten sie ii) auch auf Grund ihrer vielfältigen Manipulierbarkeit zu einem weltweit begehrten Modellsystem, das derzeit in weit mehr als 2500 Laboratorien für verschiedene Fragestellungen verwandt wird. Nach genetischen (Transfektion des Ha-ras Onkogens und von Wachstumsfaktoren) und epigenetischen Manipulationen (Stresseinwirkung, extensive Passagierung in vitro) der HaCaT-Zellen konnten tumorigene Klone mit benignen, malignen und metastasierenden Wachstumseigenschaften identifiziert werden. Wenn auch die Entstehung von Tumoren sowie ihr autonomes Wachstumsverhalten ursächlich auf genetischen Veränderungen einer Einzelzelle begründet sind, ist das komplexe Phänomen des Tumorwachstums (mit Invasion und Metastasierung) nur im Rahmen der veränderten Wechselwirkung von Tumorzellen und ihrem umgebenden Gewebe im Organismus zu verstehen. Ohne die spezifische Interaktion mit dem veränderten Bindegewebe und seinen Komponenten, wie Blutgefäßen, extrazelluläre Matrix und Entzündungszellen, ist das Wachstum auch der aggressivsten Tumorzellen auf mikroskopisch kleine Tumor-Knoten limitiert. Ebenso wird die Homöostase eines normalen Gewebes wie der Epidermis, d.h. die Balance zwischen Wachstum und Differenzierung der Epithelzellen, über komplexe Zell-Zell und Zell-Matrix- Wechselwirkungen gesteuert. Die zellulären und molekularen Mechanismen dieser epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, durch die Wachstum, Differenzierung und Gewebestrukturierung normaler Keratinozyten, aber auch das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gesteuert werden, waren und sind Gegenstand der Untersuchungen in den einzelnen Arbeitsgruppen der Abteilung. 47

48 48 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie I. Mechanismen der Epithel-Mesenchym- Wechselwirkungen zur Steuerung von Wachstum und Differenzierung normaler Keratinozyten Für den Erhalt der Funktion und Struktur von Geweben ist das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Differenzierung, die Gewebe-Homöostase, unabdingbare Voraussetzung. Dies wird maßgeblich über Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen gesteuert, wobei insbesondere den Epithel-Mesenchym-Wechselwirkungen eine herausragende Rolle zukommt. Im Fall der Haut erfolgt dieser Austausch zwischen der Epidermis und der Dermis als dem zugehörigen Bindegewebe über die Basalmembran, einer speziellen Struktur der extrazellulären Matrix. Entsprechend hatten unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, dass zur Kontrolle epidermaler Wachstums- und Differenzierungs-Vorgänge zwischen beiden Gewebekompartimenten äußerst komplexe Regelkreise existieren. Diese Studien erfolgten in dem in vitro Modell der organotypischen Zellkulturen, in dem eine Haut-ähnliche Situation rekonstruiert wird. Hierbei wachsen Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ 1) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Bindegewebszellen und bilden geschichtete und differenzierende Oberflächenepithelien mit definierter Struktur und Polarität, vergleichbar mit dem Ursprungsgewebe der Epidermis [1, 2]. Als experimentelles Bezugssystem für das Wachstums- und Differenzierungspotential normaler Keratinozyten aus individuellen Zellpopulationen unter in vivo Bedingungen diente standardmäßig das etablierte Oberflächen-Transplantations-Modell auf der Nacktmaus. 1. Cytokine als Mediatoren der dermalepidermalen Interaktion N. Maas-Szabowski, A. Fritsch, E. Goedecke, H.-J. Stark, N.E. Fusenig In Kooperation mit A. Szabowski, P. Angel, DKFZ; A. Bader, Universität Leipzig; T. Groth, GKSS, Teltow; FAB, Abano Terme, Italien Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese Die Aufrechterhaltung der normalen Gewebehomöostase in der menschlichen Haut sowie die Entstehung tumorigener Veränderungen basieren nicht ausschließlich auf zellautonomen Prozessen, sondern werden auch von Zellen des gleichen sowie des umliegenden Gewebes beeinflußt. Als Signalüberträger spielen hierbei Cytokine und Wachstumsfaktoren eine Rolle, wie Untersuchungen am in vitro-hautmodell der organotypischen Cokultur gezeigt haben [3]. Einige dieser an der Interaktion beteiligten Faktoren und ihr Zusammenspiel bei der Regulation von Proliferation und Differenzierung konnten bisher ermittelt werden. So induziert unter anderem das von Keratinozyten sezernierte Interleukin-1 die Expression der Wachstumsfaktoren FGF-7 (fibroblast growth factor-7) und GM- CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) in Fibroblasten. Die dermalen Faktoren FGF-7 und GM-CSF wiederum greifen in den Ablauf der Epithelbildung ein, wobei beide Faktoren die Proliferation der Keratinozyten unterstützen, GM-CSF jedoch zusätzlich die Differenzierung fördert [1, 2, 3]. Zur Aufklärung der Regulation der FGF-7 bzw. GM-CSF-modulierten Proliferations- und Differenzierungsprozesse wurde eine c-dna-array-analyse durchgeführt, bei der unter anderem IL-18 als Zielgen identifiziert wurde. IL-18 wird von Keratinozyten nach Stimulierung mit FGF-7 oder GM-CSF freigesetzt und fördert autokrin die Proliferation der Epithelzellen. Untersuchungen am in vitro-hautmodell haben gezeigt, dass die beobachtete Proliferationssteigerung nach Applikation von GM-CSF auf der nachgeschalteten Freisetzung von IL-18 beruht, FGF- 7 hingegen selbst die Proliferation der Epithelzellen fördert, worin es durch induziertes IL-18 unterstützt wird (Fritsch et al., in Vorbereitung). Für die Aufklärung der funktionellen Bedeutung dieser und weiterer identifizierter Faktoren wurden bislang organotypische Cokulturen mit primären humanen Keratinozyten aus Biopsiematerial verwendet. Durch Modifikation und Optimierung gelang es jedoch, ein adäquates und standardisiertes Hautmodell mit der Keratinozytenlinie HaCaT zu etablieren. Durch die zusätzliche Expression von TGF-α (Transforming growth factor alpha) bilden die HaCaT-Zellen nun im in vitro-hautmodell gut strukturierte und nahezu normal differenzierte Epithelien aus [4]. Die Ergebnisse zeigten, daß in Frühstadien der Carcinogenese die parakrinen Regelkreise noch weitgehend funktionieren, wenn auch einzelne Defekte, z.b. die nahezu fehlende Expression von TGF-α, den steuernden Einfluß stromaler Zytokine außer Kraft setzt. Der derzeitige Stand bei der Herstellung organotypischer Keratinozyten-Fibroblasten-Kokulturen erlaubt ihre reproduzierbare Bereitstellung für experimentelle Zwecke und hat es somit ermöglicht, grundlegende Phänomene der epidermalen Regeneration in vitro zu untersuchen. Neuerdings konnte mit Hilfe von biokompatiblen Gerüstmaterialien und dermalen Fibroblasten Dermisäquivalente in vitro produziert werden, die sich durch autonome Produktion extrazellulärer Matrix auszeichnen und eine gut geeignete mesenchymale Unterlage für Keratinozyten in Kokultur bieten. Neben verbesserter mechanischer Stabilität liegt ihr Vorteil auch darin, dass sie im Hinblick auf klinische Anwendung (Tissue Engineering von Hautersatz) ein immunologisch völlig humanisiertes System ohne artfremdes Strukturprotein wie tierisches Kollagen darstellen. In derartigen Hautäquivalenten werden derzeit die Einflüsse des Epithels auf die ECM-Synthese untersucht, was auch im Kontext der Charakterisierung von (Wund- und Tumor-) Stromabildung in vivo von Bedeutung ist (H.-J. Stark, in Vorbereitung). 2. Epithel-mesenchymale Wechselwirkungen in der Produktion der Basalmembran und Funktion epidermaler Adhäsions-Strukturen D. Breitkreutz, C. Schmidt, N. Daum, S. Depner, J. Kadathukalam, N. Mirancea Kooperationen R. Nischt und T. Krieg, Dermatologie, Universität Köln; U. Werner und M. Gerl, Aventis Deutschland; T. Tennenbaum, Bar-Ilan und E. Wertheimer, Tel-Aviv University, Israel; D. Ron, Technion Institute of Technology, Israel Als weiteres Beispiel für epithel-mesenchymale Wechselwirkungen in der Haut konnte auch die postulierte interaktive Bildung der Basalmembran (BM) durch Keratinozyten und Fibroblasten in organotypischen Kokulturen schlüssig demonstriert werden. Die separate Analyse beider Gewebekompartimente auf mrna-ebene hatte bereits die wechselseitige Induktion und Dynamik der Expression von BM-Komponenten gezeigt, was wir nun auch auf Proteinebene bestätigen konnten [5]. In Übereinstimmung mit den RNA-Daten erfolgte hierbei zellspezifisch lediglich die Synthese der Laminin-Isoform LN-5 in Keratinozyten und

49 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie von Nidogen ausschließlich in Fibroblasten. Für diese Prozesse konnten wir, unter anderem mit chemisch definierten Medien (ohne Serum oder Gewebeextrakte), direkte Effekte externer Faktoren nachweisen, etwa eine deutliche, Dosis-abhängige synergistische Stimulierung der BM- Bildung durch TGFβ und Vitamin A-Säure. Die Rolle der Einzelkomponenten für die BM-Bildung zeigte sich besonders deutlich bei der Verwendung von Fibroblasten aus Knockout-Mausembryos beziehungsweise von antisense-rna exprimierenden HaCaT-Zellen [5]. Für Nidogen konnten wir dabei mit Fibroblasten unterschiedlichen Genotyps einen eindeutigen Dosiseffekt nachweisen. Demzufolge war eine Mindestmenge dieses Quervernetzungs-Moleküls unabdingbar für die Ausbildung regulärer BM-Strukturen. Gemäß unserer elektronenmikroskopischen Untersuchungen galt dies überraschender Weise ebenso für die stabilen epidermalen Adhäsionskomplexen, die so genannten Hemidesmosomen. Nur marginal betroffen waren dagegen epidermale Morphologie und Differenzierung, zumindest für den begrenzten Beobachtungszeitraum. Eine zusätzliche Regulationsebene der BM-Bildung stellt die Verknüpfung ihrer Einzelbau-steine zu stabilen Co-Polymeren dar ( BM-Assembly ), was als wesentliche Voraussetzung für die funktionale Integrität der BM gilt. Mit einem definierten Laminin-Fragment (mit der Bindungsstelle für Nidogen) konnten wir speziell die Interaktion von Laminin- 10 mit der Quervernetzungs-Komponente Nidogen unterbinden und damit gezielt und differentiell die Polymerisation einzelner BM-Komponenten blockieren, vor allem von Laminin-10 und Perlecan [6]). Transmissions- Elektronenmikroskopie (EM), und Immun-EM, zeigten ähnliche Störungen wie bei den Nidogen-knockout Ansätzen, nämlich dass neben dem Verlust definierter BM-Strukturen und der aberranten Lokalisation von BM-Molekülen auch die Hemidesmosomen in den basalen Keratinozyten völlig fehlten. Entsprechend war ebenfalls die Organisation des Keratin-Cytoskeletts erheblich gestört, während Epithelwachstum und Differenzierung nicht nachhaltig beeinflusst waren. Fortgeschrittene Stadien in der Tumorigenese zeigten dagegen weitergehende Veränderungen in der Mesenchym- Wechselwirkung und extrazellulären Matrixproduktion. Besonders augenscheinlich war dies in Oberflächentransplantaten auf der Nacktmaus, wobei maligne Zellen mit invasivem Tumorwachstum einen massiven Verlust der Zellpolarität aufwiesen, mit erheblichen Störungen in der Produktion von BM-Strukturen [7, 8]. Entsprechend waren im Elektronenmikroskop nur marginal BM-Strukturen sichtbar, einschließlich defekter Zellverankerungs-Komplexe (Typ II-Hemidesmosomen) an der Zell-Matrix-Interphase. In Analogie zur Keratinozyten-Rekrutierung bei der Wundheilung mit ähnlichen Veränderungen dürften diese wesentlich zur erhöhten Mobilität der Tumorzellen, vor allem bei invasivem Wachstum beitragen. Eine Schlüsselrolle bei der Zelladhäsion und Migration fällt den Matrix-Rezeptoren der Integrin-β1 Unterfamilie zu, insbesondere aber Integrin α6β4, das eng mit dem Keratin- Cytoskelett assoziiert und ein integraler Bestandteil der Hemidesmosomen ist. Der Beitrag dieses Integrins zur normalen sowie gestörten Signaltransduktion in Tumoren unter Beteiligung von Protein Kinase C (PKC) ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen im Rahmen einer DKFZ-Israel Kooperation. Als nachweislichem Teil dieses Szenarios gilt gegenwärtig unser Augenmerk besonders dem Insulin- Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese Rezeptor, der offensichtlich auch Insulin-unabhängige Interaktionen eingeht und voraussichtlich in zahlreichen physiologischen und pathologischen Hautprozessen involviert ist (weitere Israel Kooperation). Ein erklärtes Ziel dieser Arbeiten ist, die molekularen Schnittstellen zwischen diffusiblen Faktoren, Rezeptoren sowie intra und extrazellulären und Strukturelementen aufzuzeigen. II. Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in der Tumorprogression 1. Parakrine und autokrine Mechanismen in Tumorprogression und Stromamodulation M. Müller, C. Gutschalk, E. Obermüller, M. Oehme, M. Koci, S. Schnur Kooperationen mit F. Kiessling medizinischen Strahlenphysik Ch. Herold-Mende, HNO Klinik Heidelberg; A. Marmé, Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; G. Neufeld, Technion Haifa, Israel Neben den Veränderungen in den Tumorzellen selbst wird die entscheidende Rolle des Tumor umgebende Stromas bzw. Micromilieus für Tumorwachstum und -progression immer deutlicher [9]. Dabei spielt in dieser Tumor-Stroma- Wechselwirkung häufig eine veränderte Wachstumsfaktor bzw. -Rezeptorexpression eine Rolle [10]. Im HaCaT Tumormodell konnte der essentielle Beitrag des Tumorstromas zur Tumorprogression nachgewiesen werden da eine Steigerung der Malignität (Aggressivität) von HaCaT Tumorzellen bis hin zur Metastasierung nur durch Wachstum in der in vivo Umgebung der Nacktmaus nicht aber durch Selektion in vitro induzierbar war [11]. Im Zuge dieser Progression zu einem hochgradig malignen und metastasierenden Tumorphänotyp konnte wir mittels cdna array die veränderte Expression einer Reihe von Wachtumsfaktoren und Rezeptoren nachweisen z.b. de novo Expression von G- CSF und GM-CSF, IGF II und IL-6 und die verstärkte Expression von LIF, Amphilregulin, Osteoprotegerin, VEGFR-2 u.a. Dabei ergibt sich für diese aberranten Wachstumsfaktor und Rezeptor Expression eine duale Rolle im Prozess von Tumorwachstum und -progression die erstmalig einen bisher unbekannten Weg der autonomen Wachstumsregulation von besonders aggressiven (metastasierenden) HaCaT Tumorzellen belegt. Alle genannten Wachstumsfaktor-Rezeptor Systeme zeigen eine autocrin stimulierende Wirkung auf Proliferation und/oder Migration der Tumorzellen. Im Falle von G-CSF und GM-CSF manifestiert sich diese in verstärktem und invasivem Tumorwachstum in vivo und konnte auch für humane Kopf-Hals-Tumore, Gliome und Meningiome bestätigt werden [11, 12; Gutschalk et al. in Vorbereitung]. Dabei gibt es erste Hinweise, dass die Faktoren durch Rückkoppelungsmechanismen ihre Expression wechselseitig regulieren. So induziert z.b. GM-CSF die Expression von IL-6 in den Tumorzellen und umgekehrt. Darüber hinaus tragen diese Wachstumsfaktor-Rezeptor-Systeme durch eine paracrine Modulation der Tumormicroumgebung wesentlich zur Tumorprogression bei. Die Neo-Expression von G-CSF und GM-CSF in benignen HaCaT-ras Zellen resultiert in hochmalignen invasiven Tumoren mit Induktion einer persistierenden Angiogenese und verstärkter Rekrutierung von inflammatorischen Zellen, die wiederum zur verstärkten Expression und Aktivierung stromaler Matrix- Metalloproteinasen beitragen [13]. Die Neoexpression von IL-6 in benignen Tumorzellen induziert eine ähnliche Progression zu einem malignen und invasiven Tumorphänotyp wobei auch hier die Beteiligung stromaler Zellen wie 49

50 50 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Fibroblasten einen entscheidende Rolle zu spielen scheint. Auf der Basis dieser Arbeiten gilt unser Interesse der weiterführenden Entschlüsselung der Rolle aberrant-exprimierter Wachstumsfaktoren in der Tumorprogression der genannten experimentellen (HaCaT) und klinischen Tumorsysteme (Kopf-Hals-Carcinome, Gliome, Meningiome). Hierbei liegt unser Augenmerk sowohl auf der autokrinen Wirkung der Faktoren auf die Tumorzellen, als auch auf ihrer parakrinen Funktion in der Induktion eines Tumor-fördernden Stromas, z.b. durch Induktion von Angiogenese, Rekrutierung von Entzündungszellen und Modulation des ECM- Umbaus durch Proteasen. 2. Tumor-Stroma-Wechselwirkungen steuern Invasion und Angiogenese S. Vosseler, H.-J. Stark, W. Lederle, M.M. Müller, M. Willhauck, J. Mertens In Kooperation mit J. Garlick, SUNY, Stony Brooks, USA; P. Bohlen, ImClone, New York, USA; W. Hartschuh, Universität Heidelberg Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese Zahlreiche Arbeiten aus jüngster Zeit belegen die entscheidende Rolle von stromalen Zell- und Matrix-Elementen für Tumorentstehung, Invasion und Metastasierung. Neben der bekannten induzierenden Rolle von Tumorzellen auf Stromaveränderungen wird die Bedeutung von stimulierenden und hemmenden stromalen Einflüssen auf das Tumorwachstum zunehmend erkannt. Epitheliale Tumore wie Hautcarcinome weisen große Ähnlichkeiten mit der Wundheilungssituation auf, bei der sich der mesenchymale Gewebeanteil in spezifischer Weise zu Granulationsgewebe umbildet. Daher liegt ein Schwerpunkt unserer Forschungsaktivitäten auf der Analyse und funktionellen Charakterisierung solchen Granulationsgewebes. Erste Ergebnisse zeigten, dass die Stroma-Modulation durch Induktion einer Fremdkörperreaktion das invasive Wachstum maligner Tumorzellen entscheidend beeinflusst, je nach chemischer Zusammensetzung der verwendeten Materialien. Von der weiteren eingehenden Untersuchung dieses Phänomens sind wertvolle Erkenntnisse über stromale Parameter, die den Tumorphänotyp kontrollieren, zu erwarten (M. Willhauck, H.-J. Stark et al., in Vorbereitung). Eines der wesentlichsten Elemente der veränderten Tumor-Stroma Wechselwirkung ist die durch Tumorzellen induzierte Angiogenese. Neben ihrer Bedeutung für die Ernährung und Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes werden der Gefäßneubildung zusätzliche, für das Tumorwachstum wesentliche Funktionen zugesprochen. Dementsprechend konnten wir im Transplantationssystem eine bisher nicht bekannte Interaktion von Angiogenese und Tumorinvasion nachweisen. Durch Blockade der Tumor-induzierten Angiogenese mittels Antikörper-vermittelter Inaktivierung eines Rezeptors (VEGF-R2) des potentesten Angiogenesefaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) wurde nicht nur ein Einsprossen der Gefäße in den Tumor (Vaskularisierung), sondern überraschenderweise auch die Invasion der Tumorzellen unterbunden [14]. Dieser bedeutende Befund einer so entscheidenden Wechselwirkung zwischen Gefäßsystem und Tumorinvasion ließ sich inzwischen auch an aggressiven Tumorvarianten, sowohl im Transplantationssystem als auch nach konventioneller subcutaner Injektion, erhärten. Wenn auch die mechanistischen Zusammenhänge noch unklar sind, belegen diese Ergebnisse eindeutig die essentielle Rolle der Gefäßneubildung, d.h. von aktivierten Endothelien, für die Tumorinvasion [9]. Die in drei verschiedenen Systemen mit unterschiedlichen Komponenten nachgewiesene Rolle der einsprossenden Gefäße für die Tumorinvasion spricht für einen komplexen multifaktoriellen Mechanismus der Wechselwirkung, wobei Wachstumsfaktoren, Proteasen und ECM-Komponenten synergistisch wirken, um Tumorinvasion zu ermöglichen. Zur besseren molekularen Analyse der Tumor-Stroma- Wechelwirkungen werden, basierend auf den organotypischen Kokulturen normaler Keratinozyten und Fibroblasten, in vitro Systeme zur Nachbildung der Tumorsituation entwickelt [9]. Hierzu wurden Fibroblasten aus humanen Plattenepithelcarcinomen der Haut isoliert, charakterisiert und ihre Interaktion mit den prämalignen HaCaT Zellen in dreidimensionalen Tumor-Stroma-Äquivalenten in vitro und nach Transplantation auf die Nacktmaus analysiert. Erste Befunde lassen eine veränderte Funktion dieser Zellen erkennen, die HaCaT Zellen zu Tumorwachstum in vivo und dysplastische Strukturen in vitro induziert (J. Mertens, in Vorbereitung). In ähnlichen in vitro Tumormodellen, in denen normale Keratinozyten mit gering-gradig malignen HaCaT-Zellvarianten organotypisch kultiviert werden, konnten intraepitheliale Zell-Zell-Interaktionen (E-Cadherin) als wesentliche Steuerungsmechanismen der frühen Tumorentwicklung identifiziert werden [15]. Ebenso diente dieses Modell zur Untersuchung der UV-bedingten Expansion von Frühstadien der Hautcarcinogenese [16]. Weiterführende Studien zeigten, daß neben einer raschen Gefäßregression nach Blockade des VEGF-Rezeptors [17], die verbleibenden Gefäße Zeichen zunehmender Reifung aufweisen [18]. Darüberhinaus war als Folge der Angiogenesehemmung eine Reifung des unmittelbar benachbarten Tumorstromas zu beobachten bis hin zur Entwicklung einer kompletten strukturierten Basalmembran, die das Tumorepithel von umgebenden Stroma trennte [18]. Diese Stroma-Reifung mit massivem Auftreten von Collagen-Fibrillen-Bündeln dürfte die Folge einer drastisch reduzierten lokalen Expression von zwei stromalen Matrixmetalloproteinasen (MMP-9 und MMP-13) an der unmittelbaren Grenze zum Tumorgewebe sein. Die weitere molekulare Analyse der kausalen Zusammenhänge von der Blockade eines VEGF-Rezeptors mit Proteaseaktivität und veränderten ECM-Turnover mit der Folge einer blockierten Invasion bzw. phänotypischen Tumorreversion ist Gegenstand laufender Untersuchungen im Rahmen eines EU-Kooperationsprojekts. Die bisherigen Ergebnisse weisen auf eine essentielle Rolle des umgebenden Tumorstromas auf das Wachstumsverhalten maligner Zellen hin und lassen weitere therapeutische Zielstrukturen und Moleküle in den normalen Zellen der Tumorumgebung erkennen. Dieses vereinfachte Tumormodell ließ aber auch erkennen, daß Komponenten der Basalmembran wesentlich zur Ausdehnung und Invasion von intraepithelialen Neoplasien beitragen [19]. In einer Kooperationsstudie mit Prof. Hartschuh (Universitätshautklinik, Heidelberg) konnten wir zeigen, daß eine verstärkte Vaskularisierung von epithelialen Hauttumoren erst in Spätstadien auftritt, aber auch in üblicherweise als benigne, bezeichneten Keratoacanthomen zu beobachten ist [20]. Bei der Klassifizierung dieser Tumoren nach weiteren Malignitäts-assoziierten Kriterien (Zell- und Gewebe- Atypie) ergab sich, daß nur Läsionen mit Charakteristika, die für verstärkte Malignität sprechen, erhöhte Vaskularisierung aufwiesen, ein weiteres Anzeichen ihres Potenzial zur malignen Progression [20].

51 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Alle diese Befunde lassen erkennen, dass nicht nur in normalen, sondern auch in Tumorgeweben wechselseitige Interaktionen zwischen Epithelzellen und Zellen des Bindegewebes stattfinden, die Proliferation, Differenzierung und möglicherweise Migration von normalen und Tumorzellen, aber auch die Synthese und Aktivierung von Proteasen steuern. Die detaillierte Analyse dieser Wechselwirkungen und ihrer Rolle bei der Regulation der Invasion ist Aufgabe laufender Untersuchungen, die sowohl an in vivo (Oberflächentransplantaten) wie an in vitro Modellen (organotypischen Hautkulturen) erfolgen. 3. Nicht-invasive bildgebende Verfahren zur Analyse von Tumorvaskularisierung S. Vosseler und M.M. Müller Kooperation mit F. Kiessling, M. Krix, S. Delorme, Abteilung Radiologie, DKFZ So sehr diese in vivo und in vitro Modellsysteme detaillierte Einblicke in komplexe Regelkreise zwischen Tumor und Stroma bieten, sind therapeutische Konsequenzen von Eingriffen in diese Mechanismen nur an Schnittpräparaten, d.h. nach Beendigung der vitalen Vorgänge zu erfassen, z.b. durch Gefäßzählung bzw. die histologische Beurteilung des Tumorgewebes. Diese Untersuchungsmethoden erlauben keine Erfassung funktioneller Kriterien, wie die Vaskularisierung nach fortlaufender Beobachtung von Veränderungen in der Durchblutung. Hierzu wurden verschiedene nicht-invasive indirekte Meßmethoden auf der Basis von Ultraschall und Kernspintomographie (MRT) entwikkelt. Durch die Verwendung von Kontrastmittel-verstärkten Ultraschall-Meßverfahren war es möglich, in Kooperation mit Dr. Krix und Dr. Kiessling Kriterien der Tumorperfusion unter antiangiogener Therapie quantitativ zu erfassen [21, 22]. Mit modifizierten Messverfahren konnte mit dynamischer MRT ebenfalls die Perfusion von Transplantat- Tumoren auf der Nacktmaus erfasst und ihre Veänderungen unter antiangiogener Therapie verfolgt werden [23, 24]. Hierbei zeigte sich, daß mit kontrastmittelverstärkter MRT eine rasche Gefäßrückbildung sehr früh zu erfassen war, eindeutig früher als die folgende Rückbildung der Tumormasse, das bisher übliche Kriterium eines therapeutischen Ansprechens. Bei der in naher Zukunft verstärkt klinisch angewandten antiangiogenen Therapieverfahren werden solche nichtinvasive Erfassungssysteme zur Beurteilung des Therapieverlaufs von entscheidender Bedeutung sein. Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese Publikationen (* externer Koautor) [1] Maas-Szabowski, N., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Cell interaction and epithelial differentiation. In: Culture of Epithelial cells. Second Edition. (R.I. Freshney, M.G., Freshney, eds.) Chapter 2, Wiley Inc., pp (2002) [2] Maas-Szabowski, N., Szabowski, A., Stark, H.-J., Andrecht, S.*, Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P., Fusenig, N.E.: Organotypic cocultures with genetically modified mouse fibroblasts as a tool to dissect molecular mechanisms regulating keratinocyte growth and differentiation. Journal of Investigative Dermatology 116: (2001) [3] Maas-Szabowski, N., Fusenig, N.E., Stark, H.-J.: Experimental models to analyze differentiation functions of cultured keratinocytes in vitro and in vivo: In: Epidermal Cells: Methods and Protocols. K. Turksen (ed), Humana Press, in press (2004) [4] Maas-Szabowski, N., Stärker, A., Fusenig, N.E.: Epidermal tissue regeneration and stromal interaction in HaCaT cells is initiated by TGF-alpha. Journal of Cell Science 116: (2003) [5] Schmidt, C.: Regulation of basement membrane formation in skin-organotypic coculture. Doctoral thesis, University of Kiel (December 2003) [6] Breitkreutz, D., Mirancea, N.*, Beck, R., Werner, U.*. Stark, H.-J., Schmidt, C.., Gerl, M.*, Fusenig, N.E.: Inhibition of basement membrane formation by a nidogen-binding laminin gamma1- chain fragment in human skin-organotypic cocultures. J. Cell Science, under review [7] Mirancea, N.*, Schmidt, C., Daum, N., Tomakidi, P.*, Stark, H.-J., Fusenig, N.E., Breitkreutz, D.: Basement membrane defects in xeno-grafts of malignant human cells. Proceedings of the 2 nd international conference on Tumor Microenvironment, editor I.P. Witz, Monduzzi Editore: (2002) [8] Tomakidi, P.*, Stark, H.-J., Herold-Mende, C.*, Bosch, F,- X.*, Steinbauer, H., Fusenig, N.E., Breitkreutz, D.: Discriminating expression of the differentiation markers evolves in transplants of benign and malignant human skin keratinocytes through stromal interactions. J. Pathology 200: (2003) [9] Mueller M.M. and Fusenig N.E.: Tumor-stroma interactions directing phenotype and progression of epithelial skin tumor cells. Differentiation 70: (2002) [10] Mueller M.M., Werbowetski T.*, and Del Maestro R.F*.: Soluble factors in glioma invasion. Acta Neurochir. 145 (11): (2003) [11] Mueller M.M., Peter W.*, Mappes M.*,Huelsen A.*, Steinbauer H., Boukamp P., Vaccariello M.*, Garlick J.*, Fusenig N.E.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis and autocrine growth regulation by G-CSF and GM-CSF American J. Pathol. 159(4): (2001) [12] Braun B.*, Lange M.*, Oeckler R.*, Mueller M.M.: Expression of G-CSF and GM-CSF in Human Meningiomas Correlates with Increased Tumor Proliferation and Vascularization. J. 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52 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A080 Differenzierung und Carcinogenese 52 [16] Mudgil, A.V.*, Segal, N.*, Andriani, F.*, Wang, Y.*, Fusenig, N.E., Garlick, J.A.*: Ultraviolet-B irradiation induces expansion of intraepithelial tumor cells in a tissue model of early cancer progression. J. Invest. Dermatol. 121: (2003) [17] Kiessling, F., Farhan, N.*, Lichy, M.*, Vosseler, S., Heilmann, M.*, Krix, M., Bohlen, P.*, Miller, D.W.*, Mueller, M.M., Semmler, W., Fusenig, N.E., Delorme, S.: Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging rapidly indicates vessel regression in human squamous cell carcinomas grown in nude mice caused by VEGF receptor 2 blockade with DC101. Neoplasia 6(3) (2004) [18] Vosseler, S., Mirancea, N.*, Bohlen, P.*, Mueller, M.M., Fusenig, N.E.: Angiogenesis inhibition by VEGFR-2 blockade normalizes stromal tissue and reverts tumor phenotype by reduced stromal MMP expression. Cancer Res., submitted [19] Andriani, F.*, Garfield, J.*, Fusenig, N.E., Garlick, J.A*.: Basement membrane proteins promote progression of intraepithelial neoplasia in 3-dimensional models of human stratified epithelium. Int. J. Cancer 108: (2004) [20] Strieth, S.*, Hartschuh, W.*, Pilz, L., Fusenig, N.E.: Carcinoma-like vascular density in atypic keratoacanthoma suggests malignant progression. Br. J. Cancer 87 : (2002) [21] Krix, M., Kiessling, F., Vosseler, S., Kiessling, I.*, Le-Huu, M.*, Fusenig, N.E., Delorme, S.: Comparison of intermittent-bolus contrast imaging with conventional power Doppler sonography: quantification of tumour perfusion in small animals. Ultrasound Med. Biol. 29: (2003) [22] Krix, M., Kiessling, F., Vosseler, S., Farhan, N.*, Mueller, M.M., Bohlen, P.*, Fusenig, N.E., Delorme, S.: Sensitive noninvasive monitoring of tumor perfusion during antiangiogenic therapy by intermittent bolus-contrast power Doppler sonography. Cancer Res. 63: (2003) [23] Kiessling, F., Heilmann, M.*, Vosseler, S., Lichy, M.*, Krix, M., Fink, C.*, Kiessling, I.*, Steinbauer, H.*, Schad, L., Fusenig, N.E., Delorme, S.: Dynamic T1-weighted monitoring of vascularization in human carcinoma heterotransplants by magnetic resonance imaging. Int. J. Cancer 104: (2003) [24] Kiessling, F., Krix, M., Heilmann, M.*, Vosseler, S., Lichy, M,*. Fink, C.*, Farhan, N.*, Kleinschmidt, K.*, Schad, L., Fusenig, N.E., Delorme, S.: Comparing dynamic parameters of tumor vascularization in nude mice revealed by magnetic resonance imaging and contrast-enhanced intermittent power doppler sonography. Invest. Radiol. 38: (2003)

53 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A090 Tumorbiochemie Abteilung Tumorbiochemie (A090) Leiter: Prof. Dr. med. Dietrich Keppler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. sc. hum. Yunhai Cui (- 6/03) Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Hagmann Dr. sc. hum. Gabriele Jedlitschky (- 2/02) Dr. rer. nat. Kathrin Kopplow (5/02 -) Dr. rer. nat. Jörg König Dr. rer. nat. Katrin Letschert (5/02 -) Dr. rer. nat. Anne Nies Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. med. Hideyuki Kojima (Japan, Humboldt-Stipendium, - 12/02) Dr. Masaharu Komatsu (Japan, Forschungsstipendium der Kagoshima Universität Japan, - 9/03) Doktoranden/innen Holger Bronger (8/03 -) Dipl. Biol. Miriam Bortfeld (10/02 -) Young-Min Lee (- 8/03) Christoph Michalski (- 12/02) Dipl. Pharmazeut. Maria Rius Montraveta Technische Assistentinnen Elke Böhm (4/03 -) Manuela Brom Johanna Hummel-Eisenbeiß (halbtags) Daniela Keller (4/02 -) Heike Luft (4-10/02 ) Bettina Walter (halbtags) Melanie Zinkhan (9/02 -) Sekretariat Friederike Kremp Transportproteine kontrollieren die Aufnahme und die Abgabe von körpereigenen und körperfremden Substanzen über Membranschranken von Zellen. ATP-abhängige Membranproteine transportieren körpereigene Substanzen, Toxine, Kanzerogene, Zytostatika und deren Konjugate über die Plasmamembran aus normalen und malignen Zellen in den extrazellulären Raum. Untersuchungen in der Abteilung Tumorbiochemie haben zur Entdeckung der molekularen Identität von ATP-abhängigen Transportern für Konjugate und Komplexe lipophiler Verbindungen mit Glutathion, Glukuronat oder Sulfat geführt. Eine Überexpression dieser Transportproteine der Plasmamembran, zu denen die Mitglieder der Multidrug Resistance-Proteine (MRP1-9) zählen, kann zur Resistenz von Tumoren gegenüber verschiedenen Zytostatika führen. Die MRP-Proteine unterscheiden sich in Sequenz und Substratspezifität weitgehend vom MDR1-P-Glykoprotein, welches ebenfalls eine Zytostatika-Resistenz bewirken kann. Hemmstoffe des Transports von Zytostatika-Konjugaten und -Komplexen durch MRP-Proteine können dazu beitragen, diese neueren Formen der Zytostatika-Resistenz zu überwinden. Zu den physiologischen Substraten von MRP-Proteinen zählen z. B. das Glutathionkonjugat Leukotrien C 4, Glukuronide von Bilirubin, Gallensäuren und Steroidhormonen, zyklische Nukleotide (cgmp, camp), sowie Glutathion selbst, welches durch MRP4 zusammen mit Gallensäuren im Ko-Transport aus Zellen exportiert wird. Das Fehlen von MRP2 in der apikalen Membran der Hepatozyten ist die Ursache des erblichen Dubin-Johnson-Syndroms des Menschen, das durch eine konjugierte Hyperbilirubinämie charakterisiert ist. Die Klonierung von MRP2-MRP6 erlaubte die Herstellung stabil transfizierter Zellen, spezifischer Antikörper, sowie die gewebsspezifische Lokalisation der MRP-Isoformen in apikalen und basolateralen Membrandomänen in normalen und neoplastischen Geweben. Unsere Untersuchungen zeigen, dass MRP2 zur lange bekannten Chemoresistenz von klarzelligen Nierenzellkarzinomen und von hepatozellulären Karzinomen beitragen kann. Neben den Exportpumpen der MRP-Familie stehen die Aufnahme-Transporter der OATP-Familie ( Organic Anion Transporting Proteins ) im Vordergrund des Interesses der Abteilung. Von den bekannten OATP-Mitgliedern sind OATP2 (OATP1B1) und OATP8 (OATP1B3) beim Menschen vor allem in der Leber exprimiert. Zu den bisher charakterisierten Substraten dieser Aufnahme-Transporter zählen Steroid-Sulfate und -Glukuronide, unkonjugiertes Bilirubin, sowie Bromosulfophthalein. Mit Hilfe von doppel-transfizierten Zellen, die sowohl einen basolateral lokalisierten humanen Aufnahme-Transporter der OATP-Familie als auch eine apikale Export-Pumpe (z. B. MRP2) exprimieren, wurde in der Abteilung ein Modell entwickelt, welches die Untersuchung des vektoriellen Transports von Substraten durch Zellen erlaubt (Abbildung). Damit kann der funktionelle Beitrag einzelner Transporter gezielt untersucht werden, vor allem aber die Wechselwirkung mehrerer Transporter, die an unterschiedlichen Membrandomänen polarisiert wachsender Zellen lokalisiert sind. Dieses Modell bietet auch die neue Möglichkeit, eine systembiologische Analyse des vektoriellen Transports durch eine polarisierte Zelle durchzuführen. Homepage: Zusatzfinanzierung: DFG Normalverfahren (Keppler/König); DFG über SFB 352; Kooperation Pfizer - DKFZ; Forschungsschwerpunkt Transplantation; Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim; Deutsch-israelische Zusammenarbeit (DKFZ/NCRD); Fonds der Chemischen Industrie. 53

54 54 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Analyse funktioneller Konsequenzen von Sequenzvariationen in den Genen SLC21A6 und SLC21A8, die für die hepatozellulären Aufnahmetransporter OATP2 (OATP1B1) und OATP8 (OATP1B3) kodieren C. Michalski, K. Letschert, Y. Cui, A.T. Nies, D. Keppler, J. König In Zusammenarbeit mit: M. Eichelbaum, U. Zanger, Institut für Klinische Pharmakologie, Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart, P. Neuhaus und A. Nüssler, Chirurgische Universitätsklinik Charité, Berlin Die humanen Transporter SLC21A6 (auch bezeichnet als OATP2, OATP1B1 oder OATP-C) und SLC21A8 (OATP1B3 oder OATP8) sind in der basolateralen Membran lokalisiert und sind verantwortlich für die Aufnahme organischer Anionen aus dem Blut in die Hepatozyten. Substrate für diese Transporter sind neben konjugiertem und unkonjugiertem Bilirubin auch Gallensäuren und verschiedene Arzneimittel wie Pravastatin, ein Hemmstoff der Cholesterol- Biosynthese und Enalapril, ein ACE-Hemmer. In diesen Untersuchungen sollten die Auswirkungen von häufigen Sequenzvariationen, sogenannten Polymorphismen, und von Mutationen in den Genen dieser Transporter auf die Lokalisation und die Transporteigenschaften der mutierten Proteine analysiert werden [9]. Durch die Untersuchung von 81 humanen Leberproben mittels Immunblot konnte eine Leberprobe identifiziert werden, die eine deutliche Reduktion der Menge des SLC21A6-Proteins, verglichen mit den anderen untersuchten Leberproben, zeigte. Bei der Analyse der SLC21A6- mrna dieser Leberprobe konnte ein Haplotyp des SLC21A6-Gens identifiziert werden, der im Vergleich zum Wildtyp-Allel 5 Basenaustausche zeigte, 3 davon führten nach der Translation zu Änderungen der Aminosäuresequenz. Diese 3 Mutationen im SLC21A6-Gen wurden in der SLC21A6-cDNA nachgestellt und die funktionel- Abteilung A090 Tumorbiochemie len Konsequenzen dieser Austausche auf die Lokalisation und die Transporteigenschaften des mutierten Proteins untersucht. Zusätzlich wurde eine weitere SLC21A6-cDNA konstruiert, die alle 5 Basenaustausche enthielt und somit dem Haplotyp des SLC21A6-Gens entsprach [9]. Die Analyse der Häufigkeiten der Aminosäureaustausche ergab, daß es sich bei den beiden Austauschen SLC21A6- N130D und SLC21A6-P155T um häufige Polymorphismen handelt. Beide Austausche befinden sich in der vorhergesagten zweiten extrazellulären Schleife des SLC21A6-Proteins. Der Austausch SLC21A6-L193R konnte nur in einer Probe nachgewiesen werden, es handelt sich demnach um die erste identifizierte, natürlich vorkommende Mutation im SLC21A6-Gen. Beide SLC21A6-Proteine, welche die Polymorphismen tragen, lokalisierten nach stabiler heterologer Expression in MDCKII-Zellen vergleichbar dem Wildtyp-Protein in der lateralen Membran, wohingegen die größte Menge des mutationstragenden Proteins SLC21A6- L193R intrazellulär lokalisiert wurde. Auch das dem Haplotypen entsprechende Protein SLC21A6-M5 mit allen 3 Aminosäurenaustauschen konnte nur intrazellulär und nicht in der lateralen Membran nachgewiesen werden. Die Analyse der Transportfunktion der verschiedenen SLC21A6- Proteine wurde ebenfalls mit den stabil transfizierten MDCKII-Zellen durchgeführt. Beide mutationstragenden Proteine SLC21A6-L193R und SLC21A6-M5 zeigten keinen Transport der untersuchten Substrate Bromosulfophthalein, 17β-Glukuronosyl-estradiol und von der Gallensäure Cholyltaurin. Zusätzlich konnte für den Polymorphismus SLC21A6-P155T kein Transport von Cholyltaurin nachgewiesen werden, die Transportrate für Cholyltaurin war beim Polymorphismus SLC21A6-N130D im Vergleich zum SLC21A6-Protein reduziert. Diese Untersuchungen zeigen, dass die 2. extrazelluläre Schleife des SLC21A6-Proteins, in der beide häufigen Polymorphismen lokalisiert sind, an der Substraterkennung beteiligt zu sein scheint. Vektorieller Transport von Substanzen durch Aufnahmetransporter (OATP8) und eine apikale Exportpumpe (MRP2) in kultivierten MDCK-Zellen. Apical Tight junction MDCK-Control MDCK-OATP8 Basolateral Transwell membrane OATP8 MDCK-MRP2 MRP2 MRP2 MDCK-MRP2/ OATP8 OATP8

55 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Sequenzvariationen wurden auch im Gen des zweiten hepatozellulären Aufnahmetransporters der OATP-Familie, dem SLC21A8-Gen, untersucht. Diese Variationen wurden durch Datenbankanalysen identifiziert. Bei dieser Untersuchung wurden 3 Polymorphismen und eine Mutation durch gezielte Mutagenese der SLC21A8-cDNA nachgestellt und die Konsequenzen dieser Sequenzvariationen auf Lokalisation und Transporteigenschaften der mutierten Proteine analysiert. Auch bei dieser Untersuchung konnten Auswirkungen von in der Bevölkerung häufig vorkommenden Sequenzvariationen auf Proteinlokalisation und Transportfunktion festgestellt werden. Diese Untersuchungen belegen, daß die detaillierte Analyse von Sequenzvariationen in Genen,die für Transportproteine kodieren, von großer Bedeutung für das Verständnis interindividueller Unterschiede bei der hepatobiliären Elimination endogener und exogener Substanzen ist. Unterschiede in der Transportfunktion von Aufnahmetransporten oder Exportpumpen können somit auch molekulare Grundlagen von Arzneimittelnebenwirkungen sein [9]. Nachweis der humanen organischen Anionentransporter SLC21A6 (OATP2) und SLC21A8 (OATP8) in der Leber und im hepatozellulären Karzinom Y. Cui, J. König, A.T. Nies, M. Pfannschmidt, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: M. Hergt, W.W. Franke, Zellbiologie, DKFZ (Monoklonale Antikörper) und R. Moll, Pathologisches Institut, Universität Marburg (Immunhistochemie) Die humanen hepatozellulären Aufnahmetransporter SLC21A6 (OATP1B1 oder OATP2) und SLC21A8 (OATP 1B3 oder OATP8) sind wichtige Transportproteine bei der hepatobiliären Elimination endogener und exogener Substanzen. Zur immunologischen Detektion des SLC21A6- Proteins wurden zwei monoklonale Antikörper hergestellt und die Expression und Lokalisation von SLC21A6 in humaner Leber und in hepatozellulären Karzinomen untersucht [13]. Der Antikörper mesl ist gegen das carboxyterminale Ende des Proteins, der Antikörper mmdq gegen das aminoterminale Ende des Proteins gerichtet. Da das SLC21A6-Protein eine Aminosäuresequenz-Identität von 80 % mit dem SLC21A8-Protein hat, konnte mit dem mmdq-antikörper auch das SLC21A8-Protein detektiert werden, wohingegen der mesl-antikörper als spezifisch für das SLC21A6-Protein charakterisiert werden konnte. Eine Detektion anderer humaner SLC21A-Familienmitglieder oder entsprechende Transporter von Hund, Ratte oder Maus konnte ausgeschlossen werden [13]. Die beiden Antikörper wurden auf ihre Reaktivität im Immunblot, auf ihre Fähigkeit zur Immunpräzipitation und auf ihre Eigenschaften bei der Immunfluoreszenz untersucht. Im Immunblot können mit dem mmdq-antikörper sowohl das SLC21A6-Protein als auch das SLC21A8-Protein gleichzeitig detektiert werden, da der Antikörper das aminoterminale Epitop beider Proteine aufgrund der sehr ähnlichen Aminosäuresequenz erkennt, sich die beiden Proteine im Molekulargewicht aber unterscheiden. Das konnte durch eine Analyse von Proben aus normaler Leber im Vergleich zu Proben aus hepatozellulären Karzinomen belegt werden. Diese Immunblot-Analyse zeigte, daß im hepatozellulären Karzinom das SLC21A8-Protein stark, das SLC21A6-Protein deutlich im Vergleich zur Proteinmenge in den Normal-Leberproben reduziert ist. Beide Proteine konnten in der humanen Hepatom-Zelllinie HepG2 nicht Abteilung A090 Tumorbiochemie nachgewiesen werden. Ein interessanter Aspekt ist die Analyse von Leberproben, die zuvor in Paraffin eingebettet wurden. Bei diesen immunhistochemischen Analysen von normalen Leberproben konnten sowohl das SLC21A6-Protein als auch das SLC21A8-Protein nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu ließen sich beide Proteine in Lebertumorproben nur fokal nachweisen. Diese Analysen zeigen, dass beide monoklonale Antikörper als Tumormarker für den Nachweis beim hepatozellulären Karzinom Verwendung finden können und dass diese Antikörper auch ein geeignetes Werkzeug darstellen, beide wichtigen Aufnahmetransportproteine unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu untersuchen [13]. Lokalisation von MRP5 (ABCC5) im Urogenitalsystem des Menschen A.T. Nies, G. Jedlitschky, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale Laserrastermikroskopie) und W.F. Thon, Klinikum Hannover- Siloah, Hannover MRP5 (ABCC5) des Menschen ist eine ATP-abhängige, membranständige Exportpumpe für die zyklischen Nukleotide cgmp und camp, die durch Sildenafil und Trequinsin wirksam gehemmt wird (Jedlitschky et al., J. Biol. Chem. 275: , 2000). Beide Substanzen sind als Inhibitoren der cgmp-spezifischen Phosphodiesterase 5 (PDE5) bekannt. Wir haben untersucht, ob in denjenigen Zellen des Urogenitalsystems des Menschen, die PDE5 synthetisieren, auch MRP5 vorhanden ist. Wir konnten durch Immunblot-Analyse zeigen, daß MRP5 in verschiedenen Geweben des Urogenitalsystems (Harnleiter, Harnblase, Harnröhre, Corpus cavernosum) synthetisiert wird [1]. Mit einem MRP5-spezifischen, affinitätsgereinigten Antikörper konnten wir MRP5 in der Zellmembran von glatten Muskelzellen des Harnleiters, der Harnblase, der Harnröhre und des Corpus cavernosum, sowie in der Zellmembran von Urothelzellen des Harnleiters und der Harnröhre nachweisen [1]. Die glatten Muskelzellen und die Zellen des Urothels synthetisieren ebenfalls PDE5 [1]. Diese gleichzeitige Synthese von MRP5 und PDE5 in beiden Zelltypen weist darauf hin, daß intrazelluläre Signale, die durch cgmp ausgelöst werden, nicht nur durch einen PDE5-vermittelten cgmp-abbau, sondern auch durch einen MRP5-vermittelten cgmp-export terminiert werden können. Zelltyp-spezifische Verteilung von MRP- Isoformen im Gehirn des Menschen A.T. Nies, J. König, G. Jedlitschky, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: H.H. Steiner und C. Herold-Mende, Neurochirurgische Universitätsklinik, Heidelberg, und H.P. Schmitt, Neuropathologie, Universität Heidelberg MRP-Isoformen sind Transportproteine in der Zellmembran, welche den Export organischer Anionen aus Zellen vermitteln [10, 17]. Verschiedene Zytostatika und antivirale Medikamente zählen ebenfalls zu den MRP-Substraten. In der Blut-Hirn-Schranke können MRP-Isoformen einerseits dazu beitragen, das Gehirn vor toxischen Substanzen zu schützen; andererseits wurde eine hohe intrinsische Resistenz von Hirntumoren gegenüber Zytostatika beschrieben, die zumindest teilweise auf die Existenz von MRP-Isoformen zurückgeführt werden könnte. Außerdem sind MRP- Isoformen wahrscheinlich für einige physiologische Funktionen des Gehirns, wie dem Efflux von cgmp und camp, 55

56 56 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie von Bedeutung. Unsere Untersuchungen zeigen erstmals eine systematische Analyse der zelltyp-spezifischen Verteilung von MRP1-MRP6 (ABCC1-ABCC6) im Gehirn des Menschen (Nies et al., zur Publikation eingereicht). Durch immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen mit isoform-spezifischen Antikörpern lokalisierten wir MRP1, MRP4 und MRP5 in der luminalen Membran von Epithelzellen der Gehirnkapillaren. MRP4 und MRP5 waren auch in Astrozyten vorhanden. In pyramidalen Neuronen war stets MRP5 nachweisbar, in einigen Fällen auch MRP6. Die Isoformen MRP2 und MRP3 waren im Gehirn nicht detektierbar. Die im Gehirn nachgewiesenen MRP-Isoformen können daher am Export anionischer Konjugate mit Glutathion und Glucuronat (Substrate für MRP1 und MRP6), am Export zyklischer Nukleotide (Substrate von MRP4 und MRP5) und am Export von Glutathion (Ko-Substrat für MRP1 und MRP4) beteiligt sein. Expression und Lokalisation von hepatozellulären Transportproteinen und von Radixin bei der primär-biliären Zirrhose des Menschen H. Kojima, A. Nies, J. König, W. Hagmann, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale Laserrastermikroskopie), und M. Uemura und H. Fukui, Nara Medical University, Kashihara, Japan Die primär-biliäre Zirrhose (PBC) ist eine chronische cholestatische Lebererkrankung des Menschen, die durch eine im Laufe der Jahre zunehmende Zerstörung der Gallengänge charakterisiert ist. Die damit einhergehende chronische Entzündung führt zu Vernarbungen in der Leber und schließlich zu Zirrhose und Ikterus. Unser Interesse galt der Analyse der molekularen Grundlagen der bei der PBC auftretenden Cholestase und der gestörten hepatobiliären Elimination von Substanzen. Wir haben die Expression und Lokalisation verschiedener hepatozellulärer Membrantransportproteine in Nadel-Leberbiopsien von Patienten in frühen PBC-Stadien (I, II, III) untersucht, die eine Cholestase, aber keinen Ikterus hatten [15]. Zu den untersuchten Transportproteinen zählten die Aufnahmetransporter für organische Anionen OATP2 (OATP1B1, SLC21A6) und OATP8 (OATP1B3, SLC21A8), der natriumabhängige Gallensalztransporter NTCP (SLC10A1) sowie die ATP-abhängigen Exportpumpen MRP2 (ABCC2), MRP3 (ABCC3), MRP6 (ABCC6), MDR1-P-Glykoprotein (ABCB1), MDR3-P-Glykoprotein (ABCB4) und die Gallensalz-Exportpumpe BSEP (ABCB11) [15]. Außerdem untersuchten wir die Expression und Lokalisation von Radixin, welches an der Verankerung von Membranproteinen an Aktinfilamente beteiligt ist. Durch den in Mäusen künstlich erzeugten Ausfall von Radixin fehlt die Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate, das Mrp2, in der apikalen Membran der Hepatozyten, sodass es zur konjugierten Hyperbilirubinämie in den Radixin-Knockout-Mäusen kommt [7]. In Leberproben von Patienten mit PBC Stadium I und II war die Expression und Lokalisation der hepatozellulären Transportproteine im Vergleich zu Leberproben aus der Kontrollgruppe unverändert [15]. Für die Leberproben von Patienten mit PBC im Stadium III ergaben sich folgende Veränderungen: 1. Semi-quantitative Immunfluoreszenzund quantitative RT-PCR-Analysen zeigten eine Reduktion der Expression und Synthese aller drei untersuchten Aufnahmetransporter [15]. 2. Während MRP2 und Radixin in der apikalen Membran von normalen Hepatozyten kolokalisierten, war diese Ko-Lokalisation in einigen Bereichen Abteilung A090 Tumorbiochemie der Leberproben von Patienten mit PBC Stadium III nicht mehr zu beobachten [15]. In diesen Bereichen zeigte sich eine diffuse und unregelmäßige Lokalisation von MRP2, welche auf eine Umverteilung von MRP2 aus der apikalen Membran in das Innere der Hepatozyten schließen ließ. Diese Bereiche waren gleichzeitig durch eine starke Reduktion in der Intensität der Radixin-Immunfluoreszenzfärbungen charakterisiert [15]. Unsere Untersuchungen zeigen, daß die verminderte Synthese von Aufnahmetransportern zur gestörten hepatobiliären Elimination in PBC Stadium III beitragen kann. Die teilweise veränderte Lokalisation von MRP2 deutet möglicherweise den Übergang von PBC Stadium III zum PBC-Endstadium an, das mit einem Ikterus einhergeht. Zellbiologische Charakterisierung von carboxyterminalen Trunkierungskonstrukten der apikalen Konjugat-Exportpumpe MRP2 (ABCC2) A.T. Nies, J. König, Y. Cui, M. Brom, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale Laserrastermikroskopie) Der Carboxyterminus einiger Membrantransportproteine enthält ein Aminosäurenmotiv, welches an bestimmte intrazelluläre Ankerproteine, die PDZ-Proteine, binden kann und bei manchen Proteinen als apikales Sortierungssignal benötigt wird. PDZ steht hierbei für den jeweils ersten Buchstaben der Proteine Psd, Dgl und ZO-1-like; in diesen drei Proteinen wurde eine konservierte Proteindomäne identifiziert, die spezifisch an Tripeptide der Struktur S/T - X - V/I bindet. Auch das MRP2-Protein enthält ein vergleichbares carboxy-terminales Tripeptid (TKF), welches mit dem Ankerprotein PDZK1 interagieren kann (Kocher et al., Lab. Invest. 79: , 1999). Wir haben verschiedene cdna-konstrukte hergestellt, die zur Synthese von carboxy-terminal trunkierten MRP2-Proteinen führen, welche gleichzeitig am Aminoterminus mit dem grün-fluoreszierenden Protein markiert sind [3]. Die Lokalisation dieser trunkierten MRP2-Proteine wurde in polarisierten HepG2- Hepatomzellen bestimmt, die sich gut für die Untersuchung der apikalen Sortierung von humanem MRP2 eignen. Es zeigte sich, daß die 11 carboxy-terminalen Aminosäuren von MRP2, einschließlich des Tripeptids TKF, nicht für den intrazellulären Transport von MRP2 zur apikalen Membran erforderlich waren [3]. Erst eine Trunkierung um mindestens 15 carboxy-terminale Aminosäuren führte zu einer Störung des intrazellulären Transports von MRP2 zur apikalen Membran [3]. Es ist denkbar, daß ein apikales Sortierungssignal nicht in der linearen Aminosäurensequenz des MRP2-Proteins begründet liegt, da Membranproteine auch diskrete, voneinander entfernt liegende Elemente enthalten können, die erst im reifen Protein miteinander in Wechselwirkung treten und dadurch die erforderliche Struktur eines Sortierungssignals ergeben.

57 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Funktionelle und zellbiologische Charakterisierung von Mutationen im MRP2-Protein, die zum Dubin-Johnson-Syndrom führen V. Keitel, A. Nies, M. Brom, J. Hummel-Eisenbeiß, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: H. Spring, J. Kartenbeck, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale Laserrastermikroskopie und Immunelektronenmikroskopie) Mutationen im MRP2-Gen, die zu einem Ausfall des MRP2- Proteins in der apikalen Membran der Hepatozyten führen, sind die molekulare Ursache für das Dubin-Johnson-Syndrom des Menschen [10,11,17,20]. Das Dubin-Johnson- Syndrom geht mit einer konjugierten Hyperbilirubinämie einher, da MRP2 die ATP-abhängige Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate in der apikalen Membran von Hepatozyten ist [10,17,20]. In Fortführung unserer Arbeiten (Keitel et al., Hepatology 32: , 2000) haben wir zwei weitere, bei Patienten mit Dubin-Johnson-Syndrom relativ häufig auftretende Nukleotidaustausche (Mor-Cohen et al., J. Biol. Chem. 276: , 2001), in die MRP2-cDNA eingebracht und nach Expression der cdna die Lokalisation der mutierten MRP2-Proteine in polarisierten HepG2-Zellen untersucht [11]. Der größte Anteil des MRP2-I1173F- Proteins akkumulierte als unreifes Protein im endoplasmatischen Retikulum und wurde im Proteasom abgebaut; ein geringer Anteil des Proteins gelangte auch zur apikalen Membran der HepG2-Zellen [11]. MRP2-R1150H hingegen erreichte die apikale Membran zum gleichen Anteil wie nichtmutiertes MRP2 [11]. Sowohl MRP2-I1173F (Mor-Cohen et al. und [11]) als auch MRP2-R1150H (Mor-Cohen et al.) sind funktionell inaktiv. Unsere Untersuchungen haben zur Aufklärung von Konsequenzen von MRP2-Mutationen beigetragen. Diese können zum Verlust eines funktionell aktiven MRP2-Proteins in der apikalen Membran von Hepatozyten und damit zum Dubin-Johnson-Syndrom des Menschen führen. Funktionelle Rekonstitution von gereinigtem MRP2 W. Hagmann, J. Schubert, J. König, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer und T. Kempf, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ Die Reinigung von MRP2 ist eine unabdingbare Voraussetzung zur genauen Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften dieses Transporterproteins. Nach erfolgreicher Klonierung und Reinigung von MRP2 mit Hilfe einer carboxyterminal eingefügten His 6 -Sequenz konnten wir zeigen, dass dieses gereinigte Protein nach Rekonstitution in Proteoliposomen funktionell insoweit intakt war, als es substrat-stimulierbare ATPase-Aktivität aufwies. Die Rekonstitution von transport-aktivem MRP2 erforderte darüberhinaus einer spezifische Auswahl der Solubilisations- und Rekonstitutionsbedingungen. Unsere Arbeiten zeigten, dass das MRP2- Protein alleine in der Lage ist, in der geeigneten Lipidvesikelumgebung als Transporter zu fungieren. Die Transportrate für LTC 4 in rekonstituierten MRP2-Proteoliposomen betrug 2.7 pmol x min -1 x mg MRP2-1 [4], die K m -Werte für ATP und LTC 4 beliefen sich dabei auf 560 µm und 450 nm. Dieser Transport durch gereinigtes MRP2 war hemmbar durch den Leukotrien-Rezeptorantagonisten MK571 mit einer 50%igen Hemmung bei etwa 12 µm. Bindungs- und Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass MRP2 mit dem Chaperon Calnexin assoziieren kann. Allerdings konnten wir Abteilung A090 Tumorbiochemie in Rekonstitutionsversuchen mit gereinigtem Calnexin und MRP2 keinen Einfluss dieses Chaperons auf die Transportfunktion von MRP2 feststellen [4]. Interessanterweise sind sowohl MRP2 als auch das ERM-Protein Radixin in sogenannten Lipid raft-membranfraktionen aus humanen Lebern und Hepatomazellen enthalten. Allerdings konnten wir trotz der in der Immunfluoreszenz beobachteten Kolokalisation von MRP2 und Radixin an der kanalikulären Hepatozytenmembran aus Immunpräzipitationsstudien keine Hinweise für eine direkte oder indirekte Interaktion dieser beiden Proteine in menschlichen Zellen finden. Ko-Transport von reduziertem Glutathion mit Gallensalzen durch den ABC-Transporter MRP4 (ABCC4) M. Rius, A.T. Nies, J. Hummel-Eisenbeiß, G. Jedlitschky, D. Keppler Hepatozyten und Astrozyten sind wichtige Quellen für reduziertes Glutathion (GSH) im Organismus. Die molekulare Identität des Transportproteins, welches GSH freisetzt, war bisher unbekannt. Die Klonierung von menschlichem MRP4 (ABCC4) und seine stabile Expression in V79-Fibroblasten, hat funktionelle Studien zur Substratspezifität von MRP4 ermöglicht [14]. Unsere Untersuchungen zeigten erstmals, dass MRP4 den ATP-abhängigen Ko-Transport von GSH oder S-Methylglutathion zusammen mit mono-anionischen Gallensalzen (Cholyltaurin, Cholylglycin, Cholat u. a.) ermöglicht. Der K m -Wert für reduziertes Glutathion lag bei 2,7 mm, was im Bereich der intrazellulären GSH-Konzentrationen liegt. Der K m -Wert für Cholyltaurin lag bei 3,8 µm. Der Transport von Gallensalzen war in Abwesenheit von GSH oder ATP vernachlässigbar. Die Herstellung von MRP4-spezifischen Antikörpern hat dessen Lokalisation in der basolateralen Membran von Hepatozyten des Menschen, der Ratte und der Maus ermöglicht. Darüber hinaus wurde MRP4 in der Plasmamembran von Hepatomzellen (HepG2) und Astrozyten nachgewiesen [14]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Nies, A.T.; Spring, H.; *Thon, W.F.; Keppler, D.; Jedlitschky, G.: Immunolocalization of multidrug resistance protein 5 in the human genitourinary system. Journal of Urology 167 (2002) [2] Jedlitschky, G; Keppler, D.: Transport of leukotriene C 4 and structurally related conjugates. Vitamins and Hormones 64 (2002) [3] Nies, A.T.; König, J.; Cui, Y.; Brom, M.; Spring, H.; Keppler, D.: Structural requirements for the apical sorting of human multidrug resistance protein 2 (ABCC2). European Journal of Biochemistry 269 (2002) [4] Hagmann, W.; Schubert, J.; König, J.; Keppler, D.: Reconstitution of transport-active multidrug resistance protein 2 (MRP2; ABCC2) in proteoliposomes. Biological Chemistry 383 (2002) [5] Bode, K.A.; Donner, M.G.; Leier, I.; Keppler, D.: Inhibition of transport across the hepatocyte canalicular membrane by the antibiotic fusidate. Biochemical Pharmacology 64 (2002) [6] *Hirrlinger, J.; König, J.; *Dringen, R.: Expression of mrnas of multidrug resistance proteins (Mrps) in cultured rat astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells and neurones. Journal of Neurochemistry 82 (2002) [7] *Kikuchi, S.; *Hata, M.; *Fukumoto, K.; *Yamane, Y.; *Matsui, T.; *Tamura, A.; *Yonemura, S.; *Yamagishi, H.; Keppler, D.; *Tsukita, S.; *Tsukita, Sa.: Radixin deficiency causes conjugated hyperbilirubinemia with loss of Mrp2 from bile canalicular membranes. Nature Genetics 31 (2002)

58 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A090 Tumorbiochemie 58 [8] Uemura, M.; Kojima, H.; Buchholz, U.; *Kikuchi, E.; *Matsumoto, M.; *Kikukawa, M.; *Takaya, A.; *Fukui, H.; *Tsujii, T.; Keppler, D.: Cysteinyl leukotrienes in the bile of patients with obstructive jaundice. Journal of Gastroenterology 37 (2002) [9] Michalski, C.; Cui, Y.; Nies, A.T.; *Nuessler, A.K.; *Neuhaus, P.; *Zanger, U.M.; *Klein, K.; *Eichelbaum, M.; Keppler, D.; König, J.: A naturally occurring mutation in the SLC21A6 gene causing impaired membrane localization of the hepatocyte uptake transporter. Journal of Biological Chemistry 277 (2002) [10] Nies, A.T.; König, J.; Keppler, D.: Zytostatika-Resistenz durch Membranpumpen. TargetForum 2/02 (2002) [11] Keitel, V.; Nies, A.T.; Brom, M.; Hummel-Eisenbeiss, J.; Spring, H.; Keppler, D.: A common Dubin-Johnson syndrome mutation impairs protein maturation and transport activity of MRP2 (ABCC2). American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology 284 (2003) G165-G174. [12] Cui, Y.; Walter, B.: Influence of albumin-binding on the substrate transport mediated by human hepatocyte transporters OATP2 and OATP8. Journal of Gastroenterology 38 (2003) [13] Cui, Y.; König, J.; Nies, A.T.; Pfannschmidt, M.; Hergt, M.; Franke, W.W.; Alt, W.; *Moll, R.; Keppler, D.: Detection of the human organic anion transporters SLC21A8 (OATP2) and SLC21A8 (OATP8) in liver and hepatocellular carcinoma. Laboratory Investigation 83 (2003) [14] Rius, M.; Nies, A.T.; Hummel-Eisenbeiss, J.; Jedlitschky, G.; Keppler, D.: Cotransport of reduced glutathione with bile salts by MRP4 (ABCC4) localized to the basolateral hepatocyte membrane. Hepatology 38 (2003) [15] Kojima, H.; Nies, A.T.; König, J.; Hagmann, W.; Spring, H.; Uemura, M.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Changes in the expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis. Journal of Hepatology 39 (2003) [16] Fehrenbach, T.; Cui, Y.; *Faulstich, H.; Keppler, D.: Characterization of the transport of the bicyclic peptide phalloidin by human hepatic transport proteins. Naunyn-Schmiedeberg s Archives of Pharmacology 368 (2003) [17] König, J.; Nies, A.T.; Cui, Y.; Keppler, D.: MRP2, the apical export pump for anionic conjugates. In: ABC Proteins: From Bacteria to Man. Eds.: I.B. Holland et al. London: Academic Press (2003) [18] König, J.; Michalski, C.; Cui, Y.; Nies, A.T.; *Nuessler, A.K.; *Neuhaus, P.; *Zanger, U.M.; *Klein, K.; *Eichelbaum, M.; Keppler, D.: Mutations in the sodium-independent bile salt transporter of human liver, SLC21A6. In: Bile Acids: From Genomics to Disease and Therapy. Eds.: G. Paumgartner et al. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers (2003) [19] Kojima, H,; Nies, A.T.; König, J.; Uemura, M.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis. In: Bile Acids: From Genomics to Disease and Therapy. Eds.: G. Paumgartner et al. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers (2003) [20] Nies, A.T.; Cui, Y.; König, D.; Keppler, D.: Transport of bilirubin conjugates across hepatocellular membrane domains and the conjugated hyperbilirubinemia of Dubin-Johnson syndrome. In: Molecular Pathogenesis of Cholestasis. (Eds. M. Trauner, P. Jansen). Georgetown / New York: Landes Bioscience / Kluwer Acad. Publishers (2003)

59 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (A100) Leiter: Prof. Dr. Peter Angel Gruppenleiterin Dr. Marina Schorpp-Kistner Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Sabine Gack * Dr. Bettina Hartenstein Dr. Jochen Hess Dr. Frederik Marmé (11/02-)* Dr. Hartmut Richter Dr. Axel Szabowski * Doktoranden Hanna Bierbaum ( - 4/03)* Bernd Dittrich * Lore Florin * Julia Knebel * Regina Müller * Oliver Pein Verena Proft (10/03 - ) Diplomanden Wibke Lips ( - 9/02) Björn Textor (11/03 - ) Technische Angestellte Melanie Sator-Schmitt Sibylle Teurich Tanja Raubinger ( - 6/03) Ingeborg Vogt (1/03 - ) Birgitta Vonderstrass (11/03 - ) Azubi Steffen Bannert ( - 5/02) Nicole Echner ( - 6/02) Nico Keller (2/03 - ) Susanah Heck (6/03 - ) Zentral Jessica Birn (ZTL, 7/02 - ) * Sabrina Zahner, Sekretärin (½) *) finanziert durch Drittmittel Die Funktion und Regulation von Transkriptionsfaktoren und deren Zielgene in der Regulation von physiologischen und pathologischen Prozessen Das Forschungsprogramm der Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle ist an der Schnittstelle von Zell- und Molekularbiologie auf dem Gebiet Genregulation durch extrazelluläre Signale (vor allem Strahlung und andere genotoxische Substanzen mit kanzerogenen oder tumorpromovierenden Eigenschaften) und biomedizinischer Forschung unter Verwendung von krankheitsrelevanten Tiermodellen oder davon abgeleitete in vitro Organsysteme angesiedelt. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 (Fos/Jun) und der Identifizierung und funktionellen Analyse von AP-1 Zielgenen durch Genom-weite Expressionsanalyse. AP-1 ist der Sammelbegriff für verschiedene homo- und heterodimere Proteinkomplexe, deren Untereinheiten sich aus den Mitgliedern der Fos, Jun und CREB/ATF Proteinfamilien zusammensetzten. Zum einen unterscheidet sich die Sequenzspezifität der verschiedenen Dimere leicht voneinander. Zum anderen weist die Transkription der fos und jun Gene, als auch die Transaktivierungsfunktion der davon abgeleiteten Proteine Unterschiede auf. Die bisherigen Arbeiten machen deutlich, dass die einzelnen AP-1 Untereinheiten für die Regulation komplexer biologischer Prozesse (z. B. Zellproliferation, Transformation, Embryonalentwicklung, Angiogenese, Regeneration der Haut, Immunantwort, Apoptose und Schutzwirkungen gegenüber DNA-schädigenden Substanzen) eine entscheidende Rolle spielt (1-4). Schwerpunkte der Arbeiten der Abteilung sind das Verständnis der: a) Aufklärung der Funktion der verschiedenen Jun und Fos Proteine bei physiologischen und pathologischen Prozessen b) Isolierung, Regulation und Funktionsanalyse von AP- 1-abhängigen Zielgene c) Klonierung und Charakterisierung neuer Tumor-assoziierter Gene d) Mechanismen der Aktivitätskontrolle von AP-1 in Abhängigkeit von extrazellulären Signalen Wir wollen durch das Verständnis der durch Grundlagenforschung identifizierten Genprogramme (z.b. die Lokalisation spezifischer Genprodukte in der Zelle, und das Verständnis ihrer natürlichen Funktion in einem Organismus) helfen komplexe Krankheitsbilder beim Menschen diagnostisch zu erfassen. Gleichzeitig wollen wir informative Mausmodelle für menschliche Krankheiten etablieren, um in multidisziplinärer Zusammenarbeit mit Klinikern Möglichkeiten für neue Therapieformen für menschliche Krankheiten zu entwickeln. Internet: 59

60 60 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Zell-autonome Funktionen von c-jun, c-fos und FosB bei der Regulation von Zellproliferation und Antwort auf genotoxische Substanzen A. Kolbus, H. Bierbaum In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer, DKFZ; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich; Michael Karin, UC San Diego, La Jolla, USA Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung, chemische Karzinogene, z.b. alkylierende Agenzien) stark erhöht [1,3]. Dies lässt darauf schließen, dass diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf solche Stressfaktoren spielen. In Fibroblasten, die aus c-jun oder c-fos Knockout-Mäusen etabliert wurden, konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden. c-fos-defiziente Zellen weisen eine Hypersensitivität gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.b. Alkylantien) auf. Dieser Effekt scheint jedoch auf Fibroblasten beschränkt zu sein, da verschiedenste Mutagene und physiologische Induktoren von Apoptose in Thymozyten und aktivierten T-Zellen aus Wildtyp und c-fos-defizienten den programmierten Zelltod mit vergleichbarer Effizienz induzieren [5,6]. Zellen aus c-jun-defiziente Mäusen verlieren die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [7]. Die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle beruht auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen Genen, darunter das Gen, das für CD95-L kodiert. CD95-L bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht. c-jun spielt daher eine essentielle Rolle bei der Synthese von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.b. CD95-L), während die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs, der zur Auslösung von Apoptose führt, unabhängig von c- Jun exprimiert werden [7]. Neben der Stress -induzierten Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion von CD95-L auch bei der induzierten Apoptose in aktivierten T-Zellen eine wichtige Rolle, wobei hier FosB als entscheidender Dimerisierungspartner zu fungieren scheint [8]. Funktion von JunB in vivo und in vitro M. Schorpp-Kistner, S. Andrecht, D. Schmidt, B. Hartenstein, J. Hess, N. Keon, S. Gack, M. Sator-Schmitt, T. Raubinger, S. Teurich In Kollaboration mit Norbert Fusenig, DKFZ; Emanuelle Passegue und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche Hinweise darauf, dass die verschiedenen Mitglieder der Jun Proteinfamilie (c-jun, JunB, JunD) spezifische, zum Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen, der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.b. c-jun, JunD, Fos Proteine) hervorgerufen werden [3]. Die junb -/- Embryonen entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese und sterben dann innerhalb von zwei Tagen auf Grund von Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta), wodurch der notwendige Transport von Nährstoffe von der Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet. Um die molekularen Grundlagen für diesen Phänotyp aufzuklären, haben wir verschiedene in vitro Zellkultursysteme mit Zellen aus Wildtyp und mutierten Mäusen etabliert, darunter Fibroblasten, primäre Endothelzellen, die anschließend durch stabile SV40 T-Antigen Expression immortalisiert wurden (Endothelioma), und JunB-defizienten embryonale Stammzellen (ES). Vor allem mit dem in vitro Differenzierungssystem der ES Zellen zu sog. embryoid bodies, bei denen die in vivo Defekte bei der Ausbildung von Blutgefäßen nachgeahmt werden konnten, war es möglich VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen zu identifizieren [9,10]. Es zeigte sich, dass die Expression dieses Gens unter vermindertem Sauerstoffdruck (Hypoxie), dem Hauptstimulus von Angiogenese und Vaskulogenese, in JunBdefizienten ES Zellen, Fibroblasten und Endothelioma fast vollständig aufgehoben ist. Dies beruht darauf, dass JunB direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit dem Transkriptionsfaktor HIF1α für die positive VEGF Expression benötigt wird [9,10]. Neben der physiologischen Funktion von JunB in der Vaskulogenese und Angiogenese haben unsere Arbeiten auch deutliche Hinweise auf eine wichtige Rolle von JunB bei der Tumorangiogenese erbracht. Nach Injektion von ES Zellen und nachfolgender Ausbildung von Teratokarzinomen zeigte es sich, dass Tumore, die sich von JunB-defizienten Zellen ableiten, ein geringeres Tumorvolumen und kaum vaskuläre Strukturen aufwiesen. Dies ging einher mit einer stark reduzierten Expression von VEGF in den Tumorzellen, was die Ursache für das stark verminderte Einwandern von Blutgefäßen in den Tumor sein könnte [9,10]. Obwohl junb -/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung sterben, ist es uns gelungen daraus primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung permanente Linien zu generieren [11,12]. Diese Zellen wurden für die Aufklärung der Rolle von JunB in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen von der G1 in die S-Phase. Dies beruht auf einer reduzierten Expression des CDK Inhibitors p16 ink einer spontan erhöhten Expression von c-jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression kommt es in JunB-defizienten Zellen zu einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines JunB-ER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert werden [11,12]. Durch den Nachweis i) der Bindung von JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii) der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Cyclin A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes JunB Zielgen identifizieren [11,12]. Veränderte Expression von Zellzyklusregulatoren (Cyclin D1, Cyclin A, p16) ist auch die Ursache für pathologische Veränderungen bei der Knochenentwicklung und -homöostase in sog. JunB rescue Mäusen, die durch Einkreuzen einer junb transgenen Mauslinie in den junb -/- Hintergrund generiert wurden, wodurch der embryonal letale Phänotyp wieder revertiert werden kann [13,14]. Die adulten Tiere

61 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie weisen eine ubiquitäre, jedoch stark verringerte Expression von JunB auf. In vivo sind deutliche Veränderungen in der Anordnung und Differenzierungsgrad der Zellen in der Wachstumszone der Röhrenknochen zu erkennen, was zu einer deutlichen Verringerung der Körperlänge der Mäuse und zur Ausprägung von Osteoporose führt. Auch in in vitro Knochenzellkulturen sind diese Veränderungen der Zellproliferation sichtbar, was JunB als wichtigen Regulator der Knochenzellproliferation und Differenzierung ausweist [14,15]. Die JunB rescue Mäuse wurde auch verwendet, um die kritische Rolle von JunB bei der Differenzierung von T-Helferzellen (Th) zu identifizieren [13]. Hier zeigte sich, dass das Fehlen von JunB die Differenzierung von CD4+ Th Zellen in die Th2 Linie blockiert. Dies beruht auf einer fehlenden transkriptionellen Aktivierung des IL-4 Gens; -einem Schlüsselregulator der Differenzierung von T-Zellen in die Th2 Linie [13]. Um diese in vitro Befunden an isolierten T - Zellen auf ihre in vivo Relevanz zu überprüfen, wurde die Ausprägung einer Th2-abhängigen, experimentell-induzierten allergischen Asthmareaktion in Wildtyp und JunBdefizienten Mäusen bestimmt. Es zeigte sich, dass in den mutierten Mäusen die dafür typischen Symptome (Infiltration von eosinophilen Zellen und Schleimbildung in den Bronchien) in weitaus geringerem Maß ausgeprägt sind, was die Rolle von JunB bei diesem Aspekt der Immunantwort unterstreicht [13]. Mit zunehmendem Alter entwickeln JunB rescue Mäuse einen myeloproliferativen Defekt, der einer chronischen myeloiden Leukämie (CML) beim Menschen ähnelt [3,16]. Der pathologische Phänotyp ist durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten Vorläuferzellen und reifen neutrophilen Granulozyten, die keine JunB Expression aufweisen gekennzeichnet. Diese Daten weisen JunB als kritischer Regulator der Differenzierung von Blutzellen aus und unterstreichen die postulierte Funktion von JunB als Tumorsupressor [3,16]. Trans-regulatorische Funktionen der Jun Proteine in Zellproliferation und Differenzierung A. Szabowski, L. Florin, W. Lips, S. Andrecht, M. Schorpp-Kistner In Kollaboration mit Nicole Maas-Szabowski, Norbert Fusenig, Gunnar Wrobel, Peter Lichter, DKFZ Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle Neben der Aufklärung der Zell-autonomen Funktion der Jun Proteine in der Zellzykluskontrolle und bei positiven oder negativen Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.b. TAF7/TAFii55, [17]; Glucocorticoid Rezeptor und NFκB, [18]; Cbfa1, [19]] konnten wir durch Verwendung der junb -/- und c-jun -/- Fibroblasten erstmals den Einfluss von c-jun und JunB bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung in trans identifizieren [20-22]. Unter Verwendung eines Co-Kultursystems mit primären menschlichen Keratinozyten und murinen Fibroblasten in einem 3-dimensionalen organotypischen in vitro Hautmodell haben wir den Beitrag von c-jun und/oder JunB Zielgenen in Fibroblasten zum Zytokin-abhängigen regulatorischen Wechselspiel zwischen dem dermalen und epidermalen Kompartiment der Haut beschäftigt. Durch Verwendung der genetisch veränderten c-jun -/- und junb -/- Fibroblasten wird die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten massiv verändert. Dies beruht darauf, dass c-jun und JunB gegenläufig die Il-1-abhängige Expression von KGF und GM- CSF regulieren. Den direkten Nachweis der kausalen Rolle dieser AP-1-abhängigen Zytokine konnten wir durch Verwendung von neutralisierenden GM-CSF Antikörper erbringen, die die Epithelbildung in Gegenwart von Wildtyp Fibroblasten drastisch reduzierte und den pathologischen Phänotyp der junb -/- Co-Kulturen fast völlig aufhob. In Übereinstimmung mit früheren Vermutungen führt die Verwendung von neutralisierenden Antikörper gegen IL-1 ebenfalls zu einer partiellen Reversion des Phänotyps der junb -/- Fibroblasten organotypischen Kultur und Kulturen, die auf Wildtyp Fibroblasten basieren, zeigen nur noch eine geringe Epithelbildung [20-22]. Diese Daten unterstreichen noch einmal das Modell des doppelt-parakrinen Wirkmechanismus z.b. bei der Wundheilung, wo durch Synthese und Ausschüttung von IL-1 durch Keratinozyten die Produktion von Zytokinen in Fibroblasten (darunter KGF und GM-CSF) gesteuert wird, die dann parakrin wieder auf Keratinozyten wirken und Proliferation und Differenzierung regulieren. Wir haben jetzt begonnen, durch umfassende Genexpressionsanalyse ( expression profiling ) von Wildtyp und c-jun -/- bzw. junb -/- Fibroblasten bisher unbekannte Zielgene zu identifizieren, deren Expression c-jun und JunBabhängig verläuft und durch IL-1 reguliert wird. Wir konzentrieren uns dabei auf sezernierte Proteine (z.b. stromaderived factor, SDF), die wir jetzt einer funktionellen Analyse in der 3-dimensionalen organotypischen Co-Kultur unterziehen. Parallel dazu haben wir begonnen ein in vivo Mausmodell zu etablieren, um den Beitrag von Genprodukten aus dem Stroma für die Ausbildung oder Reparatur der Epidermis zu untersuchen. Dazu haben wir transgene Mauslinien hergestellt, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Kollagen(I)α2 Gens exprimieren. Nach Kreuzung dieser Linie mit einer ROSA26R Reportermaus, die ein induzierbares LacZ Gen trägt, zeigte es sich, dass Cre Aktivität tatsächlich auf Zellen mit mesenchymalem Ursprung (Fibroblasten, Osteoblasten, Zellen im Bindegewebe verschiedener Organe) beschränkt ist [23]. Diese Mäuse werden jetzt mit floxed c-jun und floxed junb Mäusen (die kürzlich in Zusammenarbeit mit dem Labor von Erwin F Wagner etabliert wurden) verpaart, um den spezifischen Beitrag von c-jun und JunB-abhängigen Genen in vivo zu bestimmen. Wir glauben, dass die weiteren Analysen dieser Mäuse, als auch der Jun-defizienten Fibroblasten (und hier vor allem die junb -/- Fibroblasten) im in vitro 3D Hautmodell neben dem Verständnis der physiologischen Prozesse der Haut (Differenzierung, Wundheilung) auch die Etablierung molekularbiologischer Werkzeuge zur Analyse von pathologischen Veränderungen der Haut (Psoriasis, chronische Entzündungen, verzögerte Wundheilung; Tumorerkrankungen) bringen wird. Klonierung neuertumor-assoziierter Gene in der Maus J. Hess, R. Müller, B. Dittrich, H. Richter, V. Proft, U. Breitenbach, C. Gebhardt, I. Vogt In Kollaboration mit Gerhard Fürstenberger, Gunnar Wrobel, Jörg Schlingemann, Lars Hummerich, Peter Lichter, DKFZ; Cornelia Mauch, Roswitha Nischt, Universitätsklinik Köln, Peter Steinlein, Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich, Babette Heyer, Zena Werb, University of California, San Francisco, USA Sequentielle Behandlung der Maushaut mit TPA führt zur Ausbildung von Papillomen und nachfolgend zum Auftreten von Karzinomen (Mehrstufenmodell der chemisch-induzierten Hautkarzinogenese). In Zellinien, die sich von den verschiedenen Tumorstadien ableiten, wurde eine Korre- 61

62 62 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie lation zwischen basaler Expression der Matrix Metalloproteinase interstitiellen Kollagenase-3 (MMP-13) und zunehmender Malignität der Tumorzellen beschrieben. Daneben wurde beim Menschen in einigen Fällen auch eine Induktion von interstitiellen Kollagenasen im Tumor-angrenzenden Stromagewebe gefunden. Dies lässt vermuten, dass dieses Enzym, dem zusammen mit anderen Mitgliedern der MMP Familie eine essentielle Rolle beim Gewebeumbau zugeschrieben wird [24, und darin angegebene Referenzen), ähnlich wie bei der Entstehung und Ausbreitung von Knochentumoren [25] auch zur Ausbildung und Ausbreitung von Hauttumoren beitragen könnte. Durch Herstellung von konditionalen ( floxed ) MMP-13 Maus Mutanten, in denen spezifisch die Expression in Keratinozyten ausgeschaltet werden kann, versuchen wir zur Zeit diese Frage zu beantworten. Erste Ergebnisse zeigen, dass MMP-13- defiziente Mäuse lebensfähig sind und zur funktionellen Analyse von MMP-13 bezüglich Gewebeumbau (Wundheilung) und Tumorgenese verwendet werden können. Basierend auf den experimentellen Bedingungen, die zu einer deutlich erhöhten Expression des MMP-13 Gens in TPA-behandelter Maushaut führen, haben wir durch subtraktiven cdna Klonierung (SSH) eine Kollektion von 3000 TPA-induzierten cdnas isoliert, und auf solche Gene untersucht, die eine konstitutiv hohe Expression in den Hauttumoren aufweisen. In dieser Subgruppe von zum Teil völlig unbekannten Genen haben wir als neue Tumor-assoziierte Gene die noch wenig charakterisierte Serin Protease BSSP [26] und Mitglieder der S100 Proteine [27] identifiziert. Zusätzlich haben wir im Berichtszeitraum in Kollaboration mit Prof. Peter Lichter (DKFZ Heidelberg) die Methodik des large-scale gene profiling in der Abteilung etabliert und eine umfassende Genexpressionsanalyse der verschiedenen Stadien der Mehrstufenkarzinogenese der Maus durchgeführt. Auch hier konnten wir eine Vielzahl von unbekannten und bekannten Genen finden, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit Tumorgenese beschrieben wurden, und als potentielle Onkogene oder Tumorsupressoren angesehen werden können [28]. Die derzeit laufenden Arbeiten konzentrieren sich zum einen auf die Bestimmung des Expressionsmusters diese cdnas in verschiedenen Stadien der chemisch induzierten Hautkarzinogenese (Papillome, Karzinome) als auch in Tumoren aus anderen Geweben. Zum anderen untersuchen wir die Expression der bisher isolierten, neuen Tumor-assoziierten Gene der Maus in menschlichen Tumoren, um mögliche neue, spezifische Markergene für diese Tumore zu etablieren. Komplettiert werden diese Arbeiten durch funktionelle Studien in Zellkulturen bezüglich Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion, als auch die Etablierung von transgenen und knockout Mausmodelle, um den spezifischen Beitrag dieser Gene zum Prozess der Tumorgenese zu entschlüsseln. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Angel, P. (2001) AP-1. In: Encyclopedic Reference of Cancer, M. Schwab (Ed.). Springer Verlag Heidelberg, p [2] Angel P., Szabowski, A. and Schorpp-Kistner, M. (2001) Function and regulation of AP-1 subunits in skin physiology and pathology. Oncogene, 20, [3] Schorpp-Kistner, M., *Herrlich, P. and Angel, P. (2002). The AP-1 family of transcription factors: Structure, regulation and functional analysis in mice. In: Targets for Cancer Chemotherapy. N.B. La Thangue and L. R. Bandara (Eds.) Humana Press, Totowa, New Jersey. p Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle [4] Angel, P. (2003) The multi-gene family of transcription factor AP-1. In: Handbook of Cell Signaling Vol. 3. R. Bradshaw and E. Dennis (Eds.) Elsevier Science, San Diego, CA, USA, p [5] Bierbaum, H. (2002) Die Funktion des Transkriptionsfaktors AP-1 in der Apoptoseregulation. Dissertation, Universität Bonn. [6] Bierbaum, H., Baumann, S., Herr, I., Tuckermann, J., Hess, J., Schorpp-Kistner, M. and Angel, P. (2004) Early activation and induction of apoptosis in T cells is independent of c-fos. Annals New York Academy of Sciences, 1010, [7] Kolbus, A., Herr, I., *Schreiber, M., Debatin, K.M., *Wagner, E.F. and Angel, P. (2000) c-jun-dependent induction of CD95L is critically involved in the induction of apoptosis by alkylating agents. Mol. Cell. Biol.20, [8] Baumann, S., Eichhorst, S., Hess, J., Krüger, A., Angel, P., Krammer, P. and Kirchhoff, S. (2003) An unexpected function for FosB in activation-induced cell death in T cells. Oncogene, 22, [9] Schmidt, D. (2002) Role of JunB in Hypoxia-mediated Cell Response and Tumour Angiogenesis. Dissertation, Universität Freiburg. [10] Schmidt, D., Andrecht, S., Sator-Schmitt, M., Fusenig, N.E., Angel, P. and Schorpp-Kistner, M. (2004) Hypoxia-mediated VEGF-induction and tumor angiogenesis are JunB-dependent. J Cell Biol., eingereicht [11] Andrecht, S. (2001) Identifikation von positiven und negativen Funktionen des Transkriptionsfaktors JunB bei der Zellzyklusregulation. Dissertation, Universität Hannover. [12] Andrecht S, Kolbus A, Hartenstein B, Angel P, Schorpp- Kistner M. (2002) Cell cycle promoting activity of JunB through cyclin A activation. J Biol Chem.277, [13] Hartenstein B, Teurich S, Hess J, Schenkel J, Schorpp- Kistner M, Angel P. (2002) Th2 cell-specific cytokine expression and allergen-induced airway inflammation depend on JunB. EMBO J. 21, [14] Hess, J., Hartenstein, B., Teurich, S., Schmidt, D., Schorpp- Kistner, M. and Angel, P. (2003) Defective endochondral ossification in mice with strongly compromised expression of JunB, J. Cell Sci, 116, [15] *Kenner, L., *Hoebertz, A., Keon, N., *Beil, T., *Amling, M., *Karreth, F., *Eferl, R., *Szremska, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P. and *Wagner, E.F. (2004) Reduced bone formation and severe osteoporosis in mice lacking JunB J. Cell Biol., 164, [16] *Passegue, E., *Jochum, W., Schorpp-Kistner, M., *Möhle- Steinlein, U. and *Wagner, E.F. (2001) Chronic myeloid leukemia with increased granulocyte progenitors in mice lacking JunB expression in the myeloid lineage. Cell, 104, [17] Munz, C., *Psichari, E., *Mandilia, D., *Lavigne, A., *Spiliotaki, M., Oehler, T., *Davidson, I., *Tora, L., Angel, P. and *Pintzas, A. (2003) TAF7 (TAFii55) plays a role in the transcriptional activation by c-jun. J. Biol. Chem., 278, [18] Reichardt HM, Tuckermann JP, *Gottlicher M, Vujic M, *Weih F, Angel P, *Herrlich P, Schütz G. (2001) Repression of inflammatory responses in the absence of DNA binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J. 20, [19] Hess J, Porte D, Munz C, Angel P. (2001) AP-1 and Cbfa/ runt physically interact and regulate parathyroid hormone-dependent MMP13 expression in osteoblasts through a new osteoblast-specific element 2/AP-1 composite element. J Biol Chem. 276, [20] Szabowski A, Maas-Szabowski N, Andrecht S, Kolbus A, Schorpp-Kistner M, Fusenig NE, Angel P. (2000) c-jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymal-epidermal interaction in skin. Cell. 103, [21] Angel P, Szabowski A, Schorpp-Kistner M. (2001) Function and regulation of AP-1 subunits in skin physiology and pathology. Oncogene. 20, [22] Angel, P. and Szabowski, A. (2002) Function of AP-1 target genes in mesenchymal-epithelial cross-talk in skin. Biochem. Pharmacol. 64,

63 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle [23] Florin, L., Alter, H., Szabowski, A., Schütz, G. and Angel, P. (2004) Genetic targeting of mesenchymal cells in CRE recombinase transgenic mice, Genesis, 38; [24] *Fieber, C., *Baumann, P, Vallon, R., *Termeer, C., *Simon, J.C., *Hofmann, M., Angel, P. *Herrlich, P. and *Sleeman, J (2003) Hyaluronan-oligosaccharide-induced transcription of metalloproteases. J. Cell Sci., 117, [25] Tuckermann JP, Vallon R, Gack S, *Grigoriadis AE, Porte D, *Lutz A, *Wagner EF, *Schmidt J, Angel P. (2001) Expression of collagenase-3 (MMP-13) in c-fos-induced osteosarcomas and chondrosarcomas is restricted to a subset of cells of the osteo-/ chondrogenic lineage. Differentiation. 69, [26] Breitenbach U, Tuckermann JP, Gebhardt C, Richter KH, Furstenberger G, *Christofori G, Angel P. (2001) Keratinocytespecific onset of serine protease BSSP expression in experimental carcinogenesis. J Invest Dermatol.117, [27] Gebhardt C, Breitenbach U, Tuckermann JP, Dittrich BT, Richter KH, Angel P. (2002) Calgranulins S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis. Oncogene. 21, [28] Schlingemann, J., Hess, J., Wrobel, G., Breitenbach, U., Gebhardt, C., *Steinlein, P., Kramer, H., Fürstenberger, G., Hahn, M., Angel, P and Lichter, P. (2003) Profile of gene expression induced by TPA in murine epithelial cells. Int. J. Cancer, 104,

64 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A105 Hormonwirkung und Signaltransduktion Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion (A105) Leiterin: Prof. Dr. rer. nat. Doris Mayer 64 Doktoranden Alexander Hermani (2/02 - ) * Yongde Liao (- 3/03) * Margit Klier (10/03 - ) * Senad Medunjanin (- 12/03) Barbara De Servi (-6/02) * Diplomanden Lin Bai (10/03 - ) Silke Gerstner (11/03 -) Stephanie Geiger (-9/02) Gastwissenschaftler Barbara De Servi, PhD (Mailand, Italien; 1/03 - ) Technische Assistentin Gabriele Rincke (3/02 -) * Sonderfinanzierung Hormone sind körpereigene Substanzen, die bei einer Vielzahl von Wachstums- und Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Synthetisiert in endokrinen Organen erreichen sie ihre Zielorgane auf dem Blutweg. Nach Bindung an spezifische Rezeptoren, die auf der Plasmamembran bzw. im Cytosol oder im Zellkern der Zielzellen lokalisiert sind, werden Signalübertragungsprozesse aktiviert, die u.a. in der Stimulation der Zellproliferation enden. Aufgrund dieser wachstumsfördernden Eigenschaften gelten zahlreiche Hormone als Tumorpromotoren. Dies gilt sowohl für Steroidhormone als auch für Peptidhormone. Die von Steroiden und Peptidhormonen aktivierten Signalkaskaden sind prinzipiell unterschiedlich, Peptidhormone binden an Rezeptoren in der Plasmamembran und setzen dadurch eine Kaskade von Phosphorylierungsreaktionen an Proteinen in Gang. Steroidhormone binden an Rezeptoren, die entweder im Cytoplasma oder im Zellkern lokalisiert sind. Nach Aktivierung und eventueller Translokation in den Zellkern werden sie primär als Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Expression von Zielgenen wirksam. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass es vielfältige Interaktionen zwischen Peptidhormon- und Steroidhormon-vermittelten Signalwegen gibt. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit Mechanismen der Tumorentstehung und Tumorprogression in hormonabhängigen Organen sowie mit der Wechselwirkung hormoninduzierter Signalwege in epithelialen Brust-, Prostata- und Leberzellen. Interaktion des Estrogenrezeptors mit dem IGF Signalweg in Brustkrebszellen S. Medunjanin, S. Geiger, G. Rincke, D. Mayer Brustkrebs ist die häufigste maligne Tumorerkrankung bei der Frau. Steroidhormone, insbesondere die Estrogene, spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und der Progression von Brusttumoren. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind nur unzureichend aufgeklärt. Eine herausragende Rolle bei der Tumorentstehung wird dem Estrogenrezeptor-alpha (ER) zugeschrieben. Der durch Estradiol aktivierte ER wirkt als Ligand-aktivierter Transkriptionsfaktor und bindet an die Estrogen-responsiven Elemente in der Promotorregion der Zielgene. Ein zentraler zellulärer Signaltransduktionsweg, dem ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Initiation und Progression von Brustkrebs zukommt und dessen Komponenten in ERpositiven Brusttumoren verstärkt exprimiert werden, ist der IGF-Signalweg (Abb. 1). Einige Komponenten dieses Signalweg werden durch Estrogene reguliert und verstärkt. Die wichtigsten Gene, deren Expression durch Estradiol induziert wird, sind der IGF-I Rezeptor, ein Plasmamembran-ständiger Tyrosinkinaserezeptor, und sein Substrat Insulinrezeptor- Substrat-1 (IRS-1) [1]. Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), die in zahlreichen Brusttumoren lokal verstärkt synthetisiert werden, aktivieren den IGF-I Rezeptor. Die Zunahme der zellulären Spiegel von IGF-I Rezeptor und IRS-1 unter Estradiol-Einfluss erlaubt eine gesteigerte IGF-induzierte Signaltransduktion und als Konsequenz eine gesteigerte Zellproliferation. Neue Untersuchungen zeigen, dass Proteine der IGF-Signalkaskade auch bei der Aktivierung des ER eine Rolle spielen. Dabei handelt es sich um kurzfristige Effekte, die durch Tyrosin- und Serin-/Threonin-Phosphorylierung der Proteine hervorgerufen werden. Kurzzeitbehandlung von estrogenabhängigen Brustkrebszellen mit Estradiol resultiert in der Phosphorylierung und Aktivierung von Akt/PKB, einem zentralen Signalprotein downstream von IRS-1 (siehe Abb.1). Diese Aktivierung kann durch Wortmannin, einen Inhibitor der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) gehemmt werden. Außerdem kommt es zur Tyrosin- Phosphorylierung des Protoonkogens Src. Die schnelle Phosphorylierung von Akt/PKB und Src ist essentiell für die Aktivierung der Transkriptionsfaktor-Funktion des ER. Hemmung von Akt/PKB und Src sowie Transfektion der Zellen mit dominant negativem Akt/PKB oder dominant negativem Src führt zur Hemmung der Transaktivierung eines ER-kontrollierten Reportergens [1, 2]. Diese Befunde zeigen, dass Src, PI3K und Akt/PKB bei der Aktivierung des ER durch Estradiol in Brustkrebszellen interagieren. Unsere Arbeitshypothese ist, dass ER, Src, PI3K und Akt/PKB einen Proteinkomplex bilden, der die Phosphorylierung/Aktivierung des ER reguliert. Dies eröffnet die Möglichkeit einer Modulation der ER-Aktivität durch zelluläre Signalwege, welche die Zellzyklusprogression und/ oder die Apoptose regulieren.

65 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Interaktion von Protein Kinase Cδ und Estrogenrezeptor in Brustkrebszellen B. De Servi, D. Mayer Estrogene üben ihre Wirkung durch Bindung an den Estrogenrezeptor (ER) aus. Dabei kommt es zur Interaktion mit verschiedenen anderen Signalwegen. Ein Signalmolekül, welches estrogenabhängige Signalwege zu beeinflussen scheint, ist die Proteinkinase Cδ (PKCδ). Dieser wird eine wichtige Rolle bei Zelldifferenzierung, Apoptose und Tumorsuppression zugesprochen. Ziel dieses Projektes ist zu klären, ob Expression, Aktivität und intrazelluläre Lokalisation von PKCδ einen Einfluss auf die Aktivität, die Phosphorylierung und die Expression des ER haben. Behandlung von estrogenabhängigen Brustkrebszellen mit dem Phorbolester TPA resultiert in Phosphorylierung, Aktivierung und anschließendem Abbau des ER. Durch Einsatz geeigneter Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt auf Aktivierung der PKCδ zurückzuführen ist [3]. Des weiteren wurden Expressionskonstrukte generiert, die die vollständige PKCδ-Sequenz bzw. die Sequenz für die regulatorische Domäne des Enzyms (RDδ), die einen inhibitorischen Effekt auf PKCδ hat, enthalten. Die transiente Transfektion dieser Konstrukte in MCF-7-Zellen und eine anschließende Zellfraktionierung soll weiteren Aufschluss über funktionale Mechanismen der Interaktion von PKCδ und ER Signalwegen in Brustkrebszellen geben. Der IGF-Signalweg in Prostatakarzinomen Y. Liao, D. Mayer In Kooperation mit PD Dr. Rainer Grobholz, Pathologisches Institut, Universitätsklinikum Mannheim, Prof. Dr. Peter Angel, Abteilung Signaltransduktion und Wachstumsregulation, DKFZ; Professor Dr. Dr. Ulrich Abel, Institut für Medizinische Biometrie, Universität Heidelberg; PD Dr. Maurice-Stephan Michel und Dr. Lutz Trojan, Urologische Forschung, Universitätsklinikum Mannheim Zusatzfinanzierung Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim Den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Progression des Prostatakarzinoms zugeschrieben. Die Serumspiegel dieser Wachstumsfaktoren ist bei Prostatakarzinompatienten häufig erhöht. Die biologische Aktivität der IGFs wird durch den IGF-I Rezeptor Signalweg vermittelt (Abb. 1). Die lokale Konzentration an freien, biologisch aktiven IGFs wird durch (inhibitorische) IGF-Bindungsproteine (IGFBP) reguliert. IGFBP3 ist ein Substrat für das Prostataspezifische Antigen (PSA), eine Protease, welche in Prostatakarzinomen verstärkt produziert und ins Serum abgegeben wird. Es ist deshalb anzunehmen, dass bei Prostatakarzinompatienten nicht nur die IGF- Gesamtkonzentration, sondern auch die Menge an freien IGFs im Serum erhöht ist. Aktivierung des IGF-Signalweges durch IGFs resultiert in der Stimulation des Zellwachstums und in der Hemmung der Apoptose. Gesteigerte Expression der Proteine des IGF-Signalweges oder eine Dysbalance zwischen IGFs und IGFBP zugunsten der IGFs führt zu gesteigerter Zellproliferation. Wir untersuchten die Expression von IGF-I Rezeptor, IRS-1, Akt/PKB, IGF-I, IGF-II und IGFBP3 mittels Immunohistochemie in 56 menschlichen Prostatakarzinomen, benignem Gewebe von denselben Patienten, sowie in PIN-Läsionen (prostatische intraepitheliale Neoplasien, welche A105 Hormonwirkung und Signaltransduktion Tumorvorstufen darstellen) und korrelierten deren Ausmaß (Intensität und Flächenanteil der positiven Gewebeareale) mit klinisch-pathologischen Parametern (Gleason Score, Tumorstadium (pt) und prä-operative Serumspiegel von PSA). IGF-I Rezeptor, IRS-1, Akt/PKB, IGF-I and IGF-II waren in Karzinomen verstärkt exprimiert, IGFBP3 war unverändert. Die Expression von IGF-I und IGF-II und von Akt/PKB in Prostatageweben korrelierte positiv mit hohen prä-operativen PSA Serumspiegeln. Außerdem korrelierte die Expression von IGF-II mit der Tumorprogression, welche durch den Gleason Score definiert wurde. Die Überexpression von IGF-I und IGF-II bei unveränderter IGFBP3 Expression spricht dafür, dass die IGF/IGFBP3-Balance in Prostatakarzinomen verändert ist (Abb.1). Diese Befunde sprechen für eine wichtige Rolle des IGF- Signalweges bei der Initiation und Progression von Prostatakarzinomen. Weitere Untersuchungen sollen zeigen, ob die Überexpression der Proteine des IGF-Signalweges prognostische Aussagen erlauben und ob sie Ansatzpunkte für die Therapie des Prostatakarzinoms bieten [4, 5]. Abb. 1: Das IGF-Signalsystem besteht aus den Liganden IGF-I und IGF-II, den IGF-Bindungsproteinen (IGFBP), dem IGF-I Rezeptor und seinem Substrat IRS-1, sowie den nachgeordneten Proteinen Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Akt/Proteinkinase B. In Prostatakarzinomen werden IGF-I, IGF-II, IGF-I Rezeptor, IRS-1 und Akt verstärkt exprimiert, während die Expression des regulatorischen / inhibitorischen IGF-Bindungsprotein-3 (IGFBP3) im Vergleich zu benignem Gewebe unverändert bleibt. Proteolyse von IGFBP3 durch Prostata-spezifisches Antigen (PSA) erhöht die Spiegel an freien IGFs. Die Konsequenz ist eine verstärkte Aktivierung des IGF-Signalwegs, die zur Stimulation des Wachstums und zur Hemmung der Apoptose in Prostatakrebszellen führt. Identifizierung und funktionale Analyse neuer Marker für Prostatatumoren. A. Hermani, D. Mayer In Kooperation mit Prof. Dr. Peter Angel und Dr. Jochen Hess, Abteilung Signaltransduktion und Wachstumsregulation, DKFZ, und PD Dr. Rainer Grobholz, Pathologisches Institut, Universitätsklinikum Mannheim. Prostatakrebs ist die zweithäufigste bösartige Tumorerkrankung beim Mann in der westlichen Welt. Eine Prognose für den Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose eines Prostatakarzinoms sowie die Wahl der Behandlungsstrategie gestaltet sich aufgrund des sehr unterschiedlichen klini- 65

66 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A105 Hormonwirkung und Signaltransduktion 66 schen Verhaltens individueller Tumoren als schwierig. Trotz der Assoziation chromosomaler Aberrationen sowie veränderter Expression von Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen mit dem Auftreten und der Progression von Prostatakarzinomen sind die molekularen Mechanismen der Entwicklung von Tumoren und die Ursache für die klinische Variabilität weitgehend unklar. Das Ziel dieses Projektes ist die Identifizierung neuer tumorassoziierter Gene, die bei der Initiation und/oder Progression von Prostatatumoren eine Rolle spielen. Kandidatengene für die Untersuchung der Expression in Prostatagewebe wurden aus einem Set von tumorassoziierten Genen ausgewählt, die bei differentiellen Genexpressionsanalysen an der Maushaut mit Hilfe des experimentellen Hautkarzinogenesemodells identifiziert wurden. Die Expression der Gene wird mittels RNA-in situ Hybridisierung am Gewebeschnitt untersucht. Dabei wird überprüft, ob sich die Expression im Karzinom von derjenigen des benignen Epithels unterscheidet und ob ein verändertes Expressionsmuster bei Tumoren mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad vorliegt. Interessante Kandidaten werden weiterhin immunhistochemisch am Gewebe analysiert und schließlich funktional anhand von Zellkulturexperimenten mit geeigneten Zelllinien näher charakterisiert. Einfluss von Dehydroepiandrosteron auf Leberzellen D. Mayer, K. Forstner, K. Kopplow In Kooperation mit: Prof. Dr. P. Bannasch, Cytopathologie, DKFZ; A. Benner, Biostatistik, DKFZ. Dehydroepiandrosteron (DHEA), das Hauptsekretionsprodukt der Nebennierenrinde beim Menschen und ein Zwischenprodukt in der Biosynthese von androgenen und estrogenen Steroiden, verursacht bei der Ratte die Entwicklung von Leberzelltumoren [6, 7]. Die durch DHEA induzierten Tumoren entstehen in einer glykogenotisch / amphophil / basophilen Zellinie [7]. Die bei weiblichen DHEAbehandelten Tieren beobachtete höhere Tumorinzidenz spricht für einen relevanten Einfluss von Geschlechtshormonen. DHEA wirkt außerdem als Tumorpromotor, es beschleunigt die durch N-Nitrosomorpholin (NNM) induzierte Hepatocarcinogenese. Letztere ist durch eine glykogenotisch / basophile Zellinie charakterisiert (Abb. 2). Der tumorpromovierende Effekt von DHEA beruht auf einer zusätzlichen amphophil / basophilzelligen präneoplastischen Läsionssequenz und auf einem beschleunigten Wachstum der basophilzelligen Läsionen [7]. Außerdem reduziert die DHEA- Behandlung das Wachstum und die Neubildung von Glykogenspeicherherden (GSF) in initial NNM-behandelten Ratten. DHEA-Behandlung führt also sowohl zu einer Wachstumsstimulation (Promotion) von fortgeschrittenen basophilzelligen Herden (BCF) und zu einem zusätzlichen amphophilen Läsionsphänotyp als auch zur Wachstumshemmung früher präneoplastischer Läsionen, insbesondere von GSF [7]. Paradoxerweise wachsen NNM-induzierte hepatozelluläre Karzinome unter DHEA-Behandlung langsamer und zeigen einen weniger malignen Phänotyp als durch NNM allein induzierte Tumoren. DHEA hemmt auch das Wachstum von physiologisch proliferierendem Lebergewebe, z.b. die kompensatorische Proliferation nach Partialhepatektomie [8]. Dies kann zum einen auf einen veränderten Leberstoffwechsel zurückgeführt werden; DHEA-Behandlung führt zu einem signifikant erhöhten Energieverbrauch in der Leber [6; Mayer et al., Int. J. Cancer (Pred. Oncol.), 79 (1998) ]. Zum anderen resultiert die DHEA- Behandlung bei Ratten in Veränderungen der Cytokinund Wachstumsfaktor-Spiegel, welche mit dieser Wachstumshemmung in Verbindung gebracht werden können [8]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Medunjanin, S., Geiger, S., Mayer, D. Interaction of the estrogen receptor with the IGF signalling pathway in estrogen-dependent breast cancer cells. Eur. J. Biochem. 270, Suppl.1, (2003). [2] Geiger, S. (2002) Phosphorylation and activation of pp60src in estrogen-dependent breast cancer cells. Diplomarbeit, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, Humboldt- Universität Berlin. [3] De Servi, B. (2002) Signal transduction in Alzheimer s disease and breast cancer: TGF-β1 plasma levels and nitric oxide synthase activity in leukocytes as potential biomarkers of Alzheimer s disease. Interaction of Protein Kinase C δ with estrogen related signalling pathways in breast cancer cells. Università degli Studi di Milano, Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali. [4] Liao, Y., *Grobholz, R., *Abel, U., *Trojan, L., *Michel, M.S., Angel, P., Mayer, D. (2003). Increase of AKT/PKB expression correlates with Gleason pattern in human prostate cancer. Int. J. Cancer (Cancer Cell Biology) 107, [5] Liao, Y. (2003) Expression patterns of insulin-like growth factor-1, insulin-like growth factor-2, insulin-like growth factor binding protein-3 and AKT/protein kinase B in human prostate cancer. Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg. [6] Mayer, D. (2002) DHEA effects on liver. In: DHEA and the Brain (R. Morfin, ed.), Volume 1, Chapter 5, Harwood Academic Publisher, pp [7] Mayer, D., Forstner, K., Kopplow, K. (2003) Induction and modulation of hepatic preneoplasia and neoplasia in the rat by dehydroepiandrosterone. Toxicol. Pathol. 31, [8] Kopplow, K. (2002) Untersuchung des Einflusses von Dehydroepiandrosteron auf die Proliferationsaktivität von Hepatozyten und die Expression von Zellzyklusparametern in der Rattenleber. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg. Abb.2: Modell zur Beschreibung der Sequenz präneoplastischer und neoplastischer Läsonen in der Rattenleber nach Behandlung mit N-Nitrosomorpholin und DHEA. Schwarze Pfeile: Läsionssequenz nach NNM-Behandlung; offene Pfeile: DHEA-Effekt auf die Läsionssequenz. IC, initiierte Zelle; GSF, Glykogenspeicherherd; BCF, basophilzelliger Herd; AMPF, amphophilzelliger Herd. AMPF können unter DHEA-Behandlung aus GSF entstehen. AMPF können vermutlich auch direkt aus initiierten Zellen entstehen. In beiden Läsionssequenzen ist der BCF die unmittelbare Vorläuferläsion vor dem Tumor.

67 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Abteilung A110 Genetik der Hautcarcinogenese Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese (A110) Leiterin: PD Dr. Petra Boukamp Wissenschaftlische Mitarbeiter Dr. Mara Amoros Alonso (11/03 -) Dr. Sascha Beneke (- 4/03) Dr. Ana Cerezo (- 4/03) Dr. Karin Greulich-Bode (- 6/03) Dr. Susanne Popp Dr. Sabine Rosenberger Doktoranden Sharareh Moshir (7/01 -) Sibylle Ermler (8/01 -) Bettina Jelinek (8/01 -) Sonja Muffler (4/03 -) Felix Bub (6/03 - ) Susanne Bushke (7/03 -) Diplomanden Felix Bub (5/02-2/03) Sonja Muffler (6/02-3/03) Technische Assistenten Alena Jirschik (- 4/03) Iris Martin (11/03 -) Hermann Stammer Gäste Dr. Sabine Mai (12/01-2/02) Marlon Hagity (10/02 3/03) Viktoria Ebsworth (4-8/02) Hautcarcinome (Basalzell- [BCC] und Plattenepithelcarcinome [SCC]) sind nicht nur bereits heute die häufigsten Tumortypen, die Zahl steigt auch ständig und dies speziell in immunsupprimierten Patienten. Darüber hinaus verkehrt sich das Verhältnis von den nahezu nie metastasierenden Basalzell Carcinomenen zu den malignen Plattenepithel Carcinomen, so dass auch die Mortalitätsrate steigt. Obwohl schon seit langer Zeit bekannt ist, dass übermäßige Sonnenbestrahlung (Sonnenbrände) bei der Entstehung von Hautcarcinomen eine wesentliche Rolle spielt, ist noch wenig über die molekularen Mechanismen bekannt. Das Ziel unserer Studien ist es deshalb, die Rolle von Risikofaktoren (UV-A, erhöhte Temperatur) besser verstehen zu lernen, darüber neue genetische Aberrationen zu identifizieren, um dann deren Funktion aufzuklären. 1. Genetische Mechanismen der Hautcarcinogenese (A110-1) P. Boukamp, S. Buschke, K. Greulich-Bode, B. Jelinek, A. Jirschik, S. Popp In Kooperation mit: Prof. Eva Bröcker, Dermatologie Würzburg; Prof. A. Bürkle, Newcastle upon Tyne, UK jetzt Univ. Konstanz; Prof. F. de Gruijl, Utrecht, TN; Prof. N.E. Fusenig, DKFZ; Dr. R. Greiner, Dermatologei Buxtehude; Prof. W. Hartschuh, Dermatology Heidelberg; PD Dr. A. Jauch, Humangenetik Heidelberg; Prof. Sabine Mai, Univ. Manitoba, Winnipeg, Canada; Prof. K. Scharffetter-Kochanek, Dermatology Ulm; Prof. Volker Steinkraus, Dermatologikum Hamburg Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Zugewinn von 11q13 wird durch erhöhte Temperatur sowie UV-A Strahlung induziert und ist ein wichtiges genetisches Ereignis in Hautcarcinomen 2. Hautcarcinome (SCCs) werden durch ein bestimmtes Set von Chromosomen-Aberrationen charakterisiert 3. Ein neuer ras Gen Polymorphismus (Kodon 27) als Kandidatprädispositionsgen 1a. UV-A Strahlung als potentiellen Carcinogen für die Hautcarcinogenese Um Umweltfaktoren zu identifizieren, die für die Entstehung und Progression von Hautcarcinomen relevant sind, benutzen wir unser experimentelles humanes HaCaT Modell, das inzwischen alle Stadien der Hautcarcinogenese repräsentiert [Fusenig, N.E., Boukamp, P. Molecular Carcinogenesis, 23: (1998)]. Dieses Modell ist besonders geeignet, da wir aufgrund von Langzeitstudien davon ausgehen können, dass die parentalen HaCaT Zellen nicht nur einen sehr stabilen Genotyp aufweisen und entsprechend über > 300 Passagen nicht-tumorigen bleiben, sondern auch bezüglich ihrer Differenzierung den normalen Keratinozyten noch sehr ähnlich sind. So konnten wir mit den HaCaT Zellen bereits zuvor zeigen, dass erhöhte Temperatur, wie sie in Sonnenbrandbereichen über mehrere Tage vorherrscht, zur Induktion genetischer Veränderungen und zur tumorigenen Transformation führt [Boukamp, P. et al. Oncogene, 18: (1999)]. Wir haben nun damit begonnen, die Rolle von UV-A Strahlung bei der Entstehung von Chromosomenaberrationen zu studieren und erste Untersuchungen weisen darauf hin, dass auch UV-A Strahlung die HaCaT Zellen tumorigen transformieren kann. Überraschenderweise scheinen ähnliche chromosomale Veränderungen, nämlich der Zugewinn von Chromosom 11q, wie wir sie bereits für die Temperatur-induzierte Tumorigenität beschrieben haben, auch bei der UV- A-induzierten Tumorigenität eine Rolle zu spielen. 1b. Vergleichende Tumorstudien In einer vergleichenden Studie von unterschiedlichen Hauttumoren - den epithelialen Plattenepithel Carcinomen (SCC) und den neuroendocrinen Merkelzell Carcinomen (MCC) - konnten wir mittels Vergleichender genomischer Hybridisierung (CGH) und Multiplex Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH) für die SCCs den Zugewinn des Chromosomenbereiches 11q13 sowie die Verluste von 3p und 9p als spezifische Aberrationen ausmachen [1]. In den MCC herrschten dagegen Aberrationen an anderen Chromosomen vor. Dennoch wurden auch gemeinsame chro- 67

68 68 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie mosomale und molekulargenetische Veränderungen beobachtet. Diese sprechen dafür, dass aufgrund der gleichen Lokalisation auch die gleichen Noxen eine schädigende Wirkung auf die Zellen haben können und es deshalb auch zu ähnlichen Aberrationen in diesen zwei ganz unterschiedlichen Tumortypen kommen kann. Übereinstimmend hiermit herrschte in nicht-hauttumoren ein wesentlich anderes Spektrum von chromosomalen Aberrationen vor [2, 3]. Darüber hinaus fanden wir bei diesen Studien auch einen neuen Polymorphismus im Kodon 27 des Harvey-ras Gens [1]. Dieser Polymorphismus wurde wesentlich häufiger in den Tumorzelllinien beobachtet als in Kontroll-DNA von gesunden Probanden. In einem Fall korrelierte die Tumorentwicklung sogar mit dem Verlust des Wildtyp Allels. Weiterführende Untersuchungen mit einer größeren Zahl von Hautcarcinomen und Kontroll-DNAs müssen nun zeigen, wieweit es sich bei diesem ras Gene Polymorphismus um ein mögliches Prädispositionsgen handelt und wenn ja, welche funktionellen Veränderungen dadurch bedingt sind. 1c. Entstehung von genetischen Aberrationen In ersten Untersuchungen, wie es zu solchen chromosomalen Aberrationen kommen kann und warum spezifische Chromosomen miteinander Austausche (Translokationen) eingehen können, wurden Interphase Kerne von Lymphozyten nach ionisierender Bestrahlung analysiert. Diese Studien zeigten, dass in der Tat Chromosomen-Assoziationen nach Bestrahlung nachweisbar waren, dass aber grundsätzlich die Chromosomenverteilung zufällig zu sein scheint [6]. In neuesten Untersuchungen haben wir nun auch die dreidimensionale (3D) Lokalisation der Telomere mit einbezogen. Mittels hochauflösender Mikroskopie, Dekonvolution und Berechnung der 3D Struktur im Kern können wir nun erstmals nachweisen, dass die Telomere ganz bestimmte Territorien einnehmen, dass deren Lokalisation sich Zellzyklus-abhängig verändert und, von besonderem Interesse für die Tumorentstehung, dass diese Organisation in Tumorzellen gestört ist. Mit diesen Ansätzen hoffen wir nun auch klären zu können, warum für Hautcarcinome Translokationen mit großen Bereichen der verschiedenen Chromosomen charakteristisch sind, während kryptische subtelomerische Rearrangements die Hauptursache für mental Retardation ist [7]. 2. Telomeraseaktivierung eine besondere Form der genetischen Aberration: Telomerase-, und Telomerlängenregulation in normalen and transformierten humanen Keratinozyten (A110-2) P. Boukamp, S. Beneke, F. Bub, A. Cerezo, S. Ermler, S. Moshir, S. Rosenberger, H. Stammer In Kooperation mit: Dr. J. R. Bickenbach, University of Iowa, Iowa City, USA; Dr. M. Hergenhahn, DKFZ; Kirsten Vang Nielsen, DAKO Dänemark, Prof. Holger Kalthoff, Universität Kiel Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Telomerase unterliegt einer komplexen Regulation und ein neuer Regulationsmechanismus ist alternatives Splicing des htert Gens. 2. Die Regulierbarkeit der Telomerase ist essentiell für die normale epidermale Differenzierung. Abteilung A110 Genetik der Hautcarcinogenese Regulation der Telomeraseaktivität und Telomerlänge Normale Zellen verlieren Replikations-bedingt kontinuierlich Sequenzen am Ende der Chromosomen, den Telomeren, und man geht davon aus, daß dieser Telomerverlust für die begrenzte Lebensspanne der normalen Zellen verantwortlich ist. D.h. der Verlust von Telomersequenzen ist der Zählmechanismus, die innere Uhr der zellulären Alterung. Diese Telomerhypothese der zellulären Alterung hat sich inzwischen auch gegenüber allen anderen Hypothesen der Zellalterung als die Wahrscheinlichste durchgesetzt [6]. Um uneingeschränkt proliferieren zu können, müssen z.b. immortale und Tumorzellen einen Mechanismus aktivieren, der es ermöglicht, dass die Telomerverkürzung unterbunden wird. Dies geschieht in den meisten Fällen durch die Aktivierung des Ribonukleoprotein Komplexes Telomerase. Telomerase kann de novo Telomersequenzen synthetisieren und damit den Proliferations-bedingten Telomerverlust, der weiterhin stattfindet, ausgleichen. Ein wichtiger Faktor in der Behandlung dermatologischer Erkrankungen ist die Psoralen Photoaktivierung (PUVA Behandlung). In normalen Fibroblasten kommt es dadurch aber zu einem Langzeitarrest, der mit morphologischen und biochemischen Veränderungen einhergeht. Diese sind sehr ähnlich solchen, die man charakteristischerweise bei der Zellalterung, auch Seneszenz genannt, beobachtet. Ein wesentlicher Unterschied ist aber, dass die PUVA-behandelten Zellen schließlich wieder proliferieren können. Dieser Wiedergewinn der Proliferation ist jedoch kein Zeichen für die Immortalisierung der Zellen, denn wie wir zeigen konnten, blieben diese Zellen Telomerase-negativ [7]. Ebenso kann die Einführung der frühen Gene E6 und E7 des humanen Papillomvirus HPV 38 zwar die Lebensdauer von humanen Keratinozyten verlängern, aber die hohe Telomeraseaktivität, die man normalerweise in Tumorzellen beobachtet, wurde dadurch nicht induziert [8]. D.h. es bleibt weiter ungeklärt, welche Rolle die abnorme Proliferation für die Telomeraseaktivierung spielt. Es ist aber unumstritten, dass die katalytische Untereinheit der Telomerase - htert - der restriktive Anteil des Telomerasekomplexes ist. Interessanterweise ist c-myc, das eine wichtige Rolle in der Proliferation spielt, auch ein wichtiger Aktivator des htert Gens. Durch konstitutive Expression des c-myc Gens in unserem HaCaT Modell konnten wir nachweisen, dass c-myc auch ein wichtiger Aktivator für htert in den Keratinozyten ist [9]. Darüber hinaus war es uns aber auch erstmals möglich, zu zeigen, dass htert nicht nur durch transkriptionelle Aktivierung oder Repression reguliert werden kann, sondern auch durch alternatives Splicing [9]. Die Behandlung der HaCaT Zellen mit dem Transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGFβ1) führt üblicherweise zu Inhibition von c-myc. Dies wiederum bedingt die Repression von htert und damit den Verlust der Telomeraseaktivität. Bei konstitutiver c-myc Expression in den HaCaT-myc Zellen kommt es nicht mehr zur TGF-β-abhängigen Hemmung der Proliferation, aber die Telomerase wird dennoch abgeschaltet. Das htert Gen hat 4 prominente Splicevarianten, von denen aber nur eine katalytisch aktiv ist. In den HaCaT-myc Zellen bleibt aufgrund der unveränderten c-myc Expression auch htert exprimiert, es werden aber nun nur ausschließlich inaktive Varianten exprimiert, d.h. Varianten die im Komplex keine Aktivität und damit auch keine Telomerlängenstabilisierung bewirken können [9]. Damit kann TGF-β1 die Telomerase

69 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie auf zwei unterschiedliche Arten regulieren und es ist jetzt unser Interesse, aufzuklären, über welchen Mechanismus es zur Expression der alternativen Spliceformen kommt. Hieraus gilt es dann auch experimentelle Ansätze abzuleiten, die Telomerase in Tumorzellen trotz anhaltender Proliferation abzuschalten, sodass sich die Tumorzellen aufgrund kontinuierlichen Telomerverlusts schließlich selbst zu Tode proliferieren. Entgegen der vorherrschenden Meinung, dass Telomerase in normalen Zellen nicht aktiv ist, konnten wir schon sehr früh zeigen, dass die Epidermis in situ Telomerase exprimiert und die Expression dort offensichtlich auch sehr streng reguliert wird [Härle-Bachor, C., Boukamp, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 3: (1996)]. Telomerase ist nachweisbar in den proliferativen Basalzellen und ist mit der Differenzierung in den suprabasalen Zellen abgeschaltet. Wird nun in den HaCaT Zellen ein nicht mehr regulierbares htert Gen exprimiert, kommt es nicht nur zu einer erhöhten Telomeraseaktivität in den Basalzellen, sondern auch einer unveränderten Expression in den suprabasalen Zellen. Diese sind nun nicht mehr in der Lage, den terminalen Schritt der epidermalen Differenzierung zu durchlaufen und so bleibt es bei einem mehrschichtigen aber unverhornten Epithel [10]. Da konstitutive Expression von c-myc keine Differenzierungsstörungen bewirkt [10], haben wir nun die geeigneten Zellmodelle, um die Differenzierungs-abhängige Regulation der Telomerase studieren zu können und um zu klären, ob die Differenzierungsinduktion ein weiterer Mechanismus sein könnte, die Telomerase und damit möglicherweise auch das Tumorwachstum zu kontrollieren. Abteilung A110 Genetik der Hautcarcinogenese Publikationen (* = externer Koautor) [1] Popp, S., *Waltering, S., *Herbst, C., *Moll, I. and Boukamp, P.: UV-B-type mutations and chromosomal imbalances indicate common pathways for the development of Merkel- and skin squamous cell carcinomas. Int. J. Cancer, 99: (2002) [2] Weber-Mangal S, *Sinn HP, Popp S, Klaes R, Emig R, Bentz M, Mansmann U, *Bastert G, *Bartram CR, Jauch A.: Breast cancer in young women (< or = 35 years): Genomic aberrations detected by comparative genomic hybridization. Int J Cancer107: (2003) [3] Tremmel SC, Gotte K, Popp S, *Weber S, Hormann K, *Bartram CR, Jauch A.: Intratumoral genomic heterogeneity in advanced head and neck cancer detected by comparative genomic hybridization. Cancer Genet Cytogenet. 144: (2003) [4] *Cornforth, M.N., Greulich-Bode, K.M., *Loucas, B.D., *Arsuaga, J., *Vazquez, M., *Sachs, R.K., *Bruckner, M., *Molls, *M., Hahnfeldt, P., *Hlatky, L. and *Brenner, D.J.: Chromosomes are predominantly located randomly with respect to each other in interphase human cells. J. Cell Biol. 159: (2002) [5] Popp, S., Schulze, B., Granzow, M., Keller, M., Holtgreve- Grez, H., Schoell, B., Brough, M., Hager, H.D., Tariverdian, G., Brown, J., Kearney, L. and Jauch A.: Study of 30 patients with unexplained developmental delay and dysmorphic features or congenital abnormalities using conventional cytogenetics and multiplex FISH telomere (M-TEL) integrity assay. Hum. Genet. 111:31-39 (2002) [6] Boukamp P.: Biological clocks in the aging cell. In Aging at the molecular level (T. von Zglinicki ed) Kluwer Academic Publishers Chapter 8, pp 1-13 (2003) [7] Ma, W., Wlaschek, M., Brenneisen, P., Schneider, L.A., Hommel, C., Hellweg, C., Sauer, H., Wartenberg, M., Herrmann, G., Meewes, C., Boukamp, P.: and Scharffetter-Kochanek K. Human dermal fibroblasts escape from the long-term phenocopy of senescence induced by psoralen photoactivation. Exp Cell Res., 274: (2002) [8] Caldeira S, Zehbe I, Accardi R, Malanchi I, Dong W, Giarrè M, de Villiers E-M, Filotico R, Boukamp P and Tommasino M.: The E6 and E7 proteins of the cutaneous human papillomavirus type 38 display transforming properties. J Virol. 77: (2003) [9] Cerezo A, Kalthoff H, Schürmann M, Schäfer B, and Boukamp P.: Dual regulation of telomerase activity through c-myc-dependent inhibition and alternative splicing of htert. J Cell Science, 115: (2002) [10] Cerezo A, Stark H-J, Moshir S, and Boukamp P.: Constitutive overexpression of htert but not c-myc blocks terminal differentiation in the human HaCaT skin keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 121: (2003) 69

70 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A120 Strukturelle Genanalyse Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung Strukturelle Genanalyse (A120) Leiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg 70 Integriert: V290: Wissenschaftlicher Service: Analytische Mikroskopie und Mikroinjektion Konfokale- und Videomikroskopie Mikroinjektion Analytische Elektronenmikroskopie in Zell- und Molekularbiologie Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Herbert Spring Dr. Karin Schwab ( - 8/02) Dr. Marco Marcello (8/02-12/04) Dr. Helmut Tröster (1-5/04) Technische Mitarbeiter Roger Fischer Gastwissenschaftler Prof. Dr. Luiz H. Monteiro Leal (3/01-2/02) Dr. Aurora Marques Cianciarullo (8/01-4/02) Dr. Marcelo Pelajo Machado (1-12/02) Loraine Campanati Araujo (9/01-2/02) Sekretariat Rosemarie Pflüger (¼; 1/03-1/04) 1993 wurde am DKFZ eine Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung eingerichtet, die im Bereich der modernen licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren die Abteilungen des DKFZ unterstützt. Ein - begrenztes - Service-Angebot (V 290) der Gruppe besteht für folgende Gebiete: Konfokale Laserscan Mikroskopie, Videomikroskopie, Automatisierte Mikroinjektion, Elektronenspektroskopische Strukturanalysen im Nanometer-Bereich durch Elektron Spectroscopic Imaging (ESI). Videomikroskopie und konfokale Mikroskopie erlauben durch die Kombination molekularbiologischer und optischer Detektionsverfahren sowie der Digitalisierung der Bilder eine vielseitige rechnergestützte Auswertung inklusive 3D-Rekonstruktion. Die konfokale Technik ermöglicht eine Erweiterung der Bildinformation auf einen in der Z-Achse definierbaren Focusbereich, der im Sub-Mikrometer-Bereich liegt. Durch Bewegen des Präparats in der optischen Achse sowie durch Unterdrückung der nicht zur Fokusebene gehörenden Bildinformationen durch die sogenannte konfokale Blende werden lichtoptische Schnittserien vom Objekt im Fluoreszenzverfahren möglich, ohne dieses zu beeinträchtigen. Über die computergestützte Rekonstruktion wird dann z.b. ein 3-dimensionales Bild des Objektes errechnet. In Verbindung mit Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen und simultaner Detektion kann auf diese Weise die räumliche Struktur intrazellulärer Kompartimente sichtbar und quantifizierbar gemacht werden. Darüberhinaus ermöglicht diese Technik auch einen Einblick in relativ dicke mikroskopische Präparate wie beispielsweise Zellverbände, Eizellen oder Embryonen. Bedingt durch den raschen Ausbau der GFP (green fluorescent protein) Technologie hat sich die Mikroskopie mehrfach Fluoreszenz markierter lebender Zellen rasch etablieren können: FLIM (fluorescence live cell imaging microscopy). Hierdurch können komplexe intrazelluläre Assembly Prozesse in ihrem charakteristischen räumlichzeitlichen Ablauf dokumentiert und experimentell analysiert werden. Die derzeit überwiegend eingesetzte Fluoreszenz Mehrfach Markierungs-Strategie stellt erheblich erweiterte Anforderungen an die konfokale Detektion: Das in unserer Gruppe installierte ZEIISS LSM 510 META System erlaubt eine sehr gute spektrale Analyse der eingesetzten Fluoreszenz Marker, da lediglich die charakteristischen Hauptmaxima ausgewertet und zum Aufbau des digitalern Bildes verwendet werden, d.h. ohne die zum Teil erheblichen Beiträge des cross-talks überlappender Fluoreszenzspektren, welche ein Charakteristikum vieler Typen von Mehrfach Markierungsexperimenten sind. Das mit der Lichtmikroskopie eng verbundene Gebiet der automatisierten Mikroinjektion ermöglicht einen gezielten Transfer unterschiedlichster Proben (bei kleinsten Probenvolumina) je nach Experimenttyp in das Cytoplasma oder den Zellkern adhärenter lebender Gewebekulturzellen. In Verbindung mit den beiden zuvor genannten Techniken ist die Mikroinjektion ein elegantes Verfahren zum Studium komplexer Regulations- und Transportvorgänge auf zellulärer Ebene. Im Jahr 1995 wurde zusätzlich eine Serviceeinheit Analytische Elektronenmikroskopie für Biomedizinische Proben eingerichtet (Förderung durch das BMBF Programm Biotechnologie 2000: Projektgerät ZEISS/LEO EM 912, mit Omega Energiefilter). In enger Zusammenarbeit mit anderen Abteilungen des DKFZ wurden sowohl Probenvorbereitung als auch Analyseparameter dieser neuartigen Spektroskopie-Technik soweit optimiert, dass ein Einsatz dieses hochauflösenden Analyseverfahrens in weiten Gebieten der molekularen Biomedizin möglich wird. Parallel hierzu werden neuartige molekulare Markierungstechniken für diesen Anwendungsbereich entwickelt. Seit Dezember 2003 wurde das 2. BMBF Projektgerät: ZEISS/LEO SESAM 1 (Sub-Electronvolt-Sub-Angström Microscope) mit dem derzeit leistungsfähigsten Energiefilter: einem 90 Grad Omega Filter installiert.

71 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie V290: Wissenschaftlicher Service: Analytische Mikroskopie und Mikroinjektion Konfokale Mikroskopie und Video-verstärkte Fluoreszenzmikroskopie H. Spring, M. Marcello, R. Fischer, M.F. Trendelenburg Für die konfokale Mikroskopie wird ein Zeiss LSM 510 META- Mikroskopsystem verwendet. Dieses Instrument ist mit drei Lasern (insgesamt sechs Wellenlängen) ausgerüstet. Eine entsprechende Peripherie inklusive 3D-Dekonvolution und Fotodrucker ist vorhanden. Im Bereich der Video-verstärkten Fluoreszenzmikroskopie wird eine digitale 3 Chip Farb CCD Kamera mit Peltierkühlung: Hamamatsu ORCA 3 CCD, Typ C7780 eingesetzt. Durch die 3 Farb CCDs, einem schnellen readout, hoher Auflösung und sehr gutem S/N Verhältnis (4.13 Millionen Pixel) wird die derzeit bestmögliche Farbwiedergabe erreicht. Für die Bildverarbeitung wird die Imaging Software der Fa. Compix, Inc. eingesetzt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Mertens, C., I. Hofmann, Z. Wang*, M. Teichmann*, S.S. Chong*, M. Schnölzer, W.W. Franke: Nuclear particles containing RNA polymerase III complexes associated with the junctional plaque protein plakophilin 2. Proc. Nat. Acad. Sci USA 98, , [2] *Zhang, J.B., H. Spring, M. Schwab: Neuroblastoma tumor cell-binding peptide identified through random peptide phage display. Cancer Letters 171, , [3] Cui, Y.H., J. König, D. Keppler: Vectorial transport by doubletransfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Mol. Pharmacol. 60, , [4] Kneissel, S., W.W. Franke, J.G. Gall*, H. Heid, S. Reidenbach, M. Schnölzer, H. Spring, H. Zentgraf, M.S. Schmidt- Zachmann: A novel karyoskeletal protein: Characterization of protein NO145, the major component of nucleolar cortical skeleton in Xenopus oocytes. Mol. Biol. Cell, 12, , [5] Jave-Suarez, L.F., H. Winter, L. Langbein, M.A. Rogers, J. Schweizer: HOXC13 is involved in the regulation of human hair keratin gene expression. J. Biol. Chem. 277, , [6] Peychl*, J., J. Husak*, H. Spring, M. Cervinka*, E. Rudolf*: 3D-computer based reconstructions od apoptotic nuclei. Front. Biosci. 7, 8-1, [7] Bantel-Schaal, U., B. Hub, J. Kartenbeck: Endocytosis of adeno-associated virus type 5 leads to accumulation of virus particles in the Golgi compartment. J. Virology 76, , [8] Shimomura*, Y., N. Aoki*, M.A. Rogers, L. Langbein, J. Schweizer, M. Ito*: hkap1.6 and hkap1.7, two novel human high sulfur keratin-associated proteins are expressed in the hair follicle cortex. J. Invest. Dermatol. 118, , [9] Girod*, A., C.E. Wobus, Z. Zadori*, M. Ried*, K. Leike*, P. Tijssen*, J.A. Kleinschmidt, M. Hallek*: The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J. Gen. Virol.83, ,2002. (mit Titelbild). [10] Nies, A., H. Spring, W.F. Thon*, D. Keppler, G. Jedlitschky: Immunolokalization of multidrug resistance protein 5 (ABCC5) in human genitourinary system. J. Urology 167, , [11] Schlott*, T., J.G. Scharf*, C. Gorzel*, P. Middel*, H. Spring: Cirrhotic livers reveal genetic changes in the MDM2-P14ARF system of cell cycle regulators. Brit. J. Cancer 86, , [12] Campanati*, L., A. Holloschi*, H. Tröster, H. Spring, W. de Souza*, L.H. Monteiro-Leal*: Video-microscopy observations of fast dynamic processes in the protozoon Giardia lamblia. Cell Motility 51, , A120 Strukturelle Genanalyse [13] Nies, A.T., J. König, Y. Cui, M. Brom, H. Spring, D. Keppler: Structural requirements for the apical sorting of human multidrug resistance protein 2 (ABCC2). Eur.J.Biochem. 269, , (mittitelbild). [14] Marhold, J., M. Zbylut, D.-H. Lankenau, M. Li, D. Gerlich, E. Ballestar*, B.M. Mechler, F. Lyko: Stage specific chromosomal association of Drosophila dmbd2/3 during genome activation. Chromosoma 111,13-21, [15] Langbein, L., M.A. Rogers, S. Praetzel, N. Aoki*, H. Winter, J. Schweizer: A novel epithelial keratin, hk6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells (Fluegelzellen) of the human hair follicle. J. Invest. Dermatology 118, , [16] Brandner*, J.M., S. Kief*, C. Grund, M. Rendl*, P. Houdek*, C. Kuhn, E. Tschachler*, W.W. Franke, I. Moll*: Organization anf formation of the tight junction system in human epidermis and cultured keratinocytes. Eur. J. Cell Biol. 81, , [17] Hofmann, I., M. Schnölzer, I. Kaufmann* W.W. Franke: Symplekin, a constitutive protein of karyo- and cytoplasmic particles involved in mrna biogenesis in Xenopus laevis oocytes. Mol. Biol. Cell 13, , [18] Mao, B.W., W. Wu, G. Davidson, J. Marhold, M.F. Li, B.M. Mechler, H. Delius, D. Hoppe, P. Stannek, C. Walter, A. Glinka, C. Niehrs: Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling. Nature 417, , [19] Hoffmann*, K., C.K. Dreger, A.L. Olins*, D.E. Olins*, L.D. Shultz*, B. Lucke*, H. Karl*, R. Kaps*, D. Müller*, A. Vaya*, J. Aznar*, R.E. Ware*, N. Sotelo Cruz*, T.H. Lindner*, H. Herrmann, A. Reis*, K. Sperling*: Mutations in the gene encoding the lamin B receptor produce an altered nuclear morphology in granulocytes (Pelger-Huet anomaly). Nature Genetics 31, , [20] Langbein, L., C. Grund, C. Kuhn, S. Praetzel, J. Kartenbeck, J.M. Brandner*, I. Moll*, W.W. Franke: Tight junctions and compositionally related junctional structures in mammalian stratified epithelia and cell cultures derived therefrom. Eur. J. Cell Biol. 81, , (mit Titelbild) [21] Schwantes, A., I. Ortlepp*, M. Löchelt: Construction and functional characterization of feline foamy virus-based retroviral vectors. Virology 301, 53-63, [22] Forde, A., R. Constien, H.-J. Gröne, G. Hämmerling, B. Arnold: Temporal Cre-mediated recombination exclusively in endothelial cells using Tie2 regulatory elements. Genesis 33, , [23] Heckl, S., J. Debus, J. Jenne, R. Pipkorn, W. Waldeck, H. Spring, R. Rastert, C.W. von der Lieth, K. Braun: CNN-Gd 3+ enables cell nucleus molecular imaging of prostate cancer cells - The last 600 nm. Cancer Research 62, , [24] Dreger, C.K., A.R. König, H. Spring, P. Lichter, H. Herrmann: Investigation of nuclear architecture with a domain-presenting expression system. J. Struct. Biol., 140, , [25] Shimomura*, Y., N. Aoki*, J. Schweizer, L. Langbein, M.A. Rogers, H. Winter, M. Ito*: Polymorphisms in the human high sulfur hair keratin-associated protein 1, KAP1, gene family. J. Biol. Chemistry 277, , [26] Rogers, M.A., L. Langbein, H. Winter, C. Ehmann, S. Praetzel, J. Schweizer: Characterization of a first domain of human high glycine-tyrosine and high sulfur keratin-associated protein (KAP) genes on chromosome 21q22.1. J. Biol. Chemistry 277, , [27] Shimomura*, Y., N. Aoki*, M.A. Rogers, L. Langbein, J. Schweizer, M. Ito*: hkap1.6 and hkap1.7, two novel human high sulfur keratin-associated proteins are expressed in the hair follicle cortex. J. Investigative Dermatol. 118, , [28] Keitel, V., A.T. Nies, M. Brom, J. Hummel-Eisenbeiss, H. Spring, D. Keppler: A common Dubin-Johnson syndrome mutation impairs protein maturation and transport activity of MRP2 (ABCC2). Am.J.Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 284, G165- G174,

72 72 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie [29] Monteiro-Leal, L.H., H. Tröster, L. Campanati, H. Spring, M. F. Trendelenburg: Gold finder: A computer method for fast automatic double gold labelling detection, counting and color overlay in eletron microscopic images. J. Structural Biology 141, , [30] Peitsch, W.K., I. Hofmann, N. Endlich, S. Prätzel, C. Kuhn, H. Spring, H.-J. Gröne, W. Kriz*, W.W. Franke: Cell biological and biochemical characterization of drebrin complexes in mesangial cells and podocytes of renal glomeruli. J.Am.Soc.Nephrol. 14, , [31] Campanati, L., H. Tröster, L.H. Monteiro-Leal, H. Spring, M.F. Trendelenburg, W. de Souza*: Tubulin diversity in trophozoites of Giardia lamblia. Histochem. Cell Biol. 119, , [32] Straub, B.K., J. Boda, C. Kuhn, M. Schnölzer, U. Korf, T. Kempf, H. Spring, M. Hatzfeld*, W. W. Franke: A novel cell-cell junction system: the cortex adhaerens mosaic of lens fiber cells. J.Cell Sci. 116, , [33] Kojima, H., A.T. Nies, J. König, W. Hagmann, H. Spring, M. Uemura*, H. Fukui*, D. Keppler: Changes in the expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis. J.Hepatology 39, , [34] Heckl, S., R. Pipkorn, W. Waldeck, H. Spring, J. Jenne, C.- W. von der Lieth, H. Corban-Wilhelm, J. Debus, K. Braun: Intracellular visualization fo postate concer unsing magnetic resonance imaging. Cancer Res. 63, , Mikroinjektion in adhärente Gewebekulturzellen und in Amphibien Oocyten und Embryonen R. Fischer, M. Marcello, M.F. Trendelenburg, H. Tröster In Kooperation mit Dr. R. Saffrich (Otto-Meyerhof-Zentrum, Univ. Heidelberg) Mikroinjektionsexperimente an Gewebekulturzellen werden an einem automatisierten Injektionssystem AIS (Carl Zeiss) sowie an einem Eppendorf-System durchgeführt. Injektionsapparaturen und Beratung werden auch für Injektionsexperimente an Amphibien Oocyten und Embryonen zur Verfügung gestellt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. 46, (2002) [2] Dorr, A., Kiermer, V., Pedal, A., Rackwitz, H.-R., Henklein, P., Schubert, U., Zhou, M.-M., Verdin, E., Ott, M.: Transcriptional synergy between Tat and PACF is dependent on the binding of acetylated Tat to the PCAF bromodomain. EMBO J. 21, (2002) A120 Strukturelle Genanalyse Elektronenspektroskopie für die biomedizinische Strukturanalyse H. Tröster, M. Marcello, H. Spring, R. Fischer, M.F. Trendelenburg ZEISS/LEO EM 912, Omega, 2K Slow Scan CCD Kamera, Electron Spectroscopic Imaging System und SIS Esivision Software Programm, EELS Detektor, Komponenten für Kryo- EM. (BMBF Projektgerät; seit Jan. 1995) ZEISS/LEO SESAM 1 C (Sub-Electronvolt-Sub-Angström Microscope) mit 90 Grad Omega Filter (Disp um/ev), 2 K Slow Scan CCD Kamera, Electron Spectroscopic Imaging System und Esivision Software Programm. (BMBF Projektgerät, seit Dez. 2003) Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Hiller, S.A., *Kabius, B., *Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. *Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl. 2, pp , [2] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B , [3] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., *Witz, J., Haking, A., Spring, H., *Troendle, A., Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40 th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, [4] Raddatz, S., Mark, E. P., Haking, A., *Probst, W.,Wiessler, M., Trendelenburg, M.F., Troester, H.: Development of new marker compounds for the detection of chemical element labels by elelctron spectroscopic imaging (ESI). Microscopy & Microanalysis (2001), Vol. 7, Suppl. 2, pp [5] Raddatz, S., Marcello, M., Kliem, H.-C., Tröster, H., Trendelenburg, M. F., *Oeser, P., Granzow, C. and Wiessler, M. Synthesis of new boron-rich building blocks for Boron Neutron Capture Therapy or Energy-Filtering Transmission Electron Microscopy. ChemBiochem. 5(4) , [6] Tröster, H., *Milz, S., Trendelenburg, M.F., *Jorder, F., *Scharf, H.-P., *Schwarz, M.: Detection of Micro- to Nano-Sized Particles in Soft Tissue. Medical Image Computing and Computer- Assisted Intervention - Miccai 2004, Pt 2, Proceeding p Abb. 1: Prinzip und Anwendung der elektronenspektroskopischen Abbildung (ESI) in der biomedizinischen Strukturanalyse. A: Strahlengang im analytischen Mikroskop für das Abbildungsverfahren mit inelastisch gestreuten Elektronen. B: Prinzip der elementarspezifischen Information durch inelastische Streuprozesse, bei welchen elementcharakteristische Energieverluste entstehen. C,D: Beispiele für eine Phosphor-spezifische Abbildung durch Elektronenspektroskopie simultan absorbierten TYMV und TMV Viruspartikeln. C: Typisches P-spezifisches Absorptionskantenbild bei 150 ev, der maximalen P-L 2,3 Absorptionskante. Zusätzlich zu der Information über die spezifische P-Verteilung enthält dieses Bild auch Signalbeiträge aus dem unspezifischen Untergrund. D: Differentiell errechnetes Bild der spezifischen P-Verteilung in TYMV und TMV Viren.

73 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Organisation Internationaler DKFZ Laborkurse und Symposien auf den Gebieten: Digitale Mikroskopie und Proben-Detektion in der Biomedizin Konzept und Koordination: M.F. Trendelenburg und H. Spring M. Marcello, M. Pelajo-Machado, H. Tröster, L.H. Monteiro-Leal, R. Fischer In Zusammenarbeit mit: W.W. Franke, H. Herrmann, J. Kartenbeck, L. Langbein (A010), D. Keppler, A. Nies (A090), P. Lichter, St. Joos (B060), Th. Bächi (Zürich, Schweiz), H. Bauch, D. Brocksch, H. Gundlach, R. Käthner, W. Malkusch (Fa. Carl Zeiss), J.C. Bulinski, M. Sheetz (New York, USA), W. Gräwe, B. Moomaw, M. Oshiro, N. Sugiyama, L. Schleinkofer, K. Weinbuch (Fa. Hamamatsu Photonics), W. Ansorge, J. Ellenberg, R. Pepperkok, E.Stelzer, (EMBL, Heidelberg), R. Leube (Mainz), S.Terakawa (Hamamatsu, Japan), M. White (Liverpool, UK) DKFZ Advanced Practical Courses Oktober 2001: DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Advanced Digital Microscopy, Green Fluorescent Protein Technology, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Multifluorescence Microscopy, Confocal Microscopy, Image Processing, 3-D Procedures, Calcium Imaging, FISH & CHIPS) Oktober 2002: DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Advanced Digital Microscopy, Green Fluorescent Protein Technology, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Multifluorescence Microscopy, Confocal Microscopy, Image Processing, 3-D Procedures, Calcium Imaging, FISH & CHIPS) 29. September - 3. Oktober 2003: DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Automated Microscopy, Calcium Imaging, Evanescence Microscopy (TIRF), Fast Imaging Microscopy, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Green Fluorescent Protein Technology, Multi Parameter Fluorescence, 3-D! 4-D) 26. September - 1. Oktober 2004: DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Automated Microscopy, Calcium Imaging, Evanescence Microscopy (TIRF), Fast Imaging Microscopy, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Green Fluorescent Protein Technology, Multi Parameter Fluorescence, 3-D! 4-D) EMBO Practical Courses M.F. Trendelenburg, R. Fischer: Kursteil Microinjection into Xenopus Oocytes and Eggs. EMBO Practical Courses on Microinjection and Probe Detection EMBL Heidelberg, Juni, 2001 EMBL Heidelberg, Mai, 2003 H. Spring: Kursteil Fluorescent live cell microscopy EMBO Practical Course on Confocal and Multi-Photon Microscopy of Live Specimens EMBL, Heidelberg; April 16-23,1999 A120 Strukturelle Genanalyse Biomedizinische Strukturforschung (A120) Modellsysteme Amphibien Oocyten und Embryonen GFP Stabil Transformierte Zell-Linien Giardia lamblia (Portland strain), ein parasitäres Protozoon. Injektionsexperimente in Amphibien Oocyten R. Fischer, M. Marcello, H. Tröster, M.F. Trendelenburg Mikroinjektionsexperimente viraler und nicht viraler DNA Proben in Xenopus Oocyten und/oder befruchtete Eizellen von Xenopus laevis bieten eine Vielfalt experimenteller Ansätze für detaillierte Untersuchungen zu Transkriptions-Kontrollfaktoren, Chromatin-Rekonstitution und Gen- Replikation. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von G. Sczakiel konnten wir eine neuartige experimentelle Strategie entwikkeln für den Nachweis einer spezifischen funktionellen Selektion karyophiler DNA-Cis-Elemente: Hierzu wurde ein Pool kurzkettiger DNA-Sequenzen mit bekanntem Sequenzgehalt in Xenopus Oocyten injiziert, inkubiert und die Lokalisation der injizierten Sequenzen im Zellkern oder Cytoplasma untersucht. Methodisch wurden die DNA-Sequenzen durch ein modifiziertes PCR-Verfahren nachgewiesen. Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. 46, (2002) Fluorescence Live Cell Imaging Microscopy (FLIM): Charakterisierung dynamischer Prozesse in transformierten Zell-Linien M. Marcello, H. Spring, R. Fischer, H. Tröster, M.F. Trendelenburg In Zusammenarbeit mit: J.C. Bulinski (Columbia University, New York, USA), Y. Ying, G. Rappold (Humangenetik, Universität Heidelberg). Durch die raschen Fortschritte in der Entwicklung von GFPtransformierten Zelllinien können dynamische Prozesse invitro analysiert werden: der hierzu verwendete Arbeitsplatz besteht aus einer hochauflösenden 3 Chip CCD Kamera in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskop, computergesteuertem Shutter und der COMPIX Image Analysis Software. Als Zellsystem verwenden wir eine stabil GFP-transformierte Affennieren-Zelllinie. Nach Inkubation der Zellen mit Pervanadat oder Methyl-Cyclo-Dextrin (MCD) können auf diese Weise spezifische Änderungen der Dynamik des mikrotubulären Systems analysiert werden, welche eine Analogie zu entsprechenden Prozessen in metastasierenden Zellen aufweisen. In einer weiteren Versuchsserie (Kooperation mit dem Institut für Humangenetik, Universität Heidelberg) wird speziell die Dynamik des Aktin-Skelettsystems in neuronalen Zellen analysiert. Von speziellem Interesse ist dabei die Rolle des Rho GTPase aktivierenden Proteins MEGAP. 73

74 74 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Elektronenspektroskopie für die Analyse von Nano-Strukturen Koordination: M.F. Trendelenburg, H. Tröster, H. Spring H. Tröster, L.H. Monteiro-Leal, L. Campanati Araujo, M. Pelajo Machado, A. Marques Cianciarullo M. Wießler, H.C. Kliem, C. Granzow, E. Mark (E080) In Zusammenarbeit mit W.W. Franke, J. Kartenbeck (A010, DKFZ); W. Schlegel (E040, DKFZ); M. Pawlita (F020, DKFZ); E. Delain (Inst. Gustave Roussy, Villejuif/Frankreich); S. Fakan (Univ. Lausanne/Schweiz); P. Oudet, P. Schultz, C. Crucifix, J. Witz (Univ. Strasbourg/Frankreich); Steinbeis Transfer Zentrum (STZ) Analyt. EM in Biomedizin u. Biotechnologie Heidelberg, H. Kohl (Univ. Münster), J. Mayer (RWTH Aachen), M. Schwarz (Orthopädie, Univ. Klinikum Mannheim), S. Milz (Anatomie, Univ. München), M. Hafner (FH Technologie, Mannheim). Grundlage des Electron Spectroscopic Imaging ist die inelastische Elektronenstreuung in den inneren Atomschalen, d.h. es wird ein Hüllelektron durch Energieübertragung angeregt oder ionisiert, als Folge ergibt sich ein Element charakteristischer Energieverlust des Strahlelektrons. Sind in einem elektronenmikroskopischen Präparat Elemente in einer nachweisbaren Masse vorhanden, so entstehen im Energieverlustspektrum definierte Absorptionskanten. Aus diesen Absorptionskanten lassen sich dann Rückschlüsse auf das Element, das Hüllenelektron und die Konzentration ziehen (vgl. Darstellung in Abb.1). A120 Strukturelle Genanalyse Hauptprojekte: Forschung und Entwicklung 1. Quantifizierung erforderlicher Objekt- und Analyse Parameter biomedizinischer Proben für das Electron Spectroscopic Imaging (ESI) und die Electron Energy Loss Spektroskopie (EELS). Hauptsächlich für folgende Präparattypen: Gespreitete DNA/Nukleinsäurekomplexe und nichtkontrastierte Ultradünn-Schnitte durch fixierte Zellen. An diesen Präparaten soll die Elementverteilung von Strukturgebundenem Phosphor quantitativ dargestellt werden. 2. Schritte zur Quantifizierung des Phosphor (P)Gehalts definierter viraler Genome. Ein besonderes Problem bei der Quantifizierung von Phosphor Signalen ist die Definition des Präparat Untergrund Signals. Um die Relation der Beiträge von spezifischem Phosphat (P) Signal gegenüber dem unspezifischen Untergrund Signal zu definieren, haben wir verschiedenen virale Proben auf EM-Träger Kohlenstoff Membranen adsorbiert. Hierbei konnte ein speziell konfigurierter Präparatetyp entwickelt werden, der es erlaubt Virus Partikel, die DNA oder RNA in einer Packungsdichte von 3-5 P-Atomen/um² enthalten, in Bezug auf das P-spezifische Signal reproduzierbar zu analysieren. (Abb 1: C,D) [1-3; PT 2, PT 3] 3. Ein neues Verfahren zur Elementspezifischen Darstellung von Immunogold markierten Ultradünnschnitten. Das gegenwärtig intensivst genutzte EM-Markierungsverfahren besteht in der Verwendung von Antikörpergekoppelter Nanogold Partikel. Abgesehen von den bekannten Problemen der Erreichbarkeit der Antigene für die verwendeten gekoppelten Immuno-Gold-Proben ergibt sich sehr häufig das Problem, dass die genaue Position der spezifisch gebundenen Gold Partikel in vielen Fällen nicht genau definiert werden kann, da der Präparatuntergrund partikuläre Bereiche ähnlich hoher Elektronendichte aufweist, wie die der zur Immundedektion verwendeten Nanogold Partikel. Durch die von uns entwickelte Methode kann der Kontrastbeitrag der Nanogold Partikel selektiv gegenüber dem Präparatkontrast reproduzierbar ermittelt werden. Hiermit ist eine neue Möglichkeit gegeben, Immunogold markierte EM- Präparate quantitativ auszuwerten. [PT 3] 4. Eine besondere Bedeutung für den Einsatz der EM Spektroskopie kann für die direkte Detektion und Lokalisation von zur Therapie applizierten Bor-Verbindungen in Patienten Tumoren erwartet werden (Haritz et al., J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 28,1175, 1994). Seit mehreren Jahren wird das Verfahren der Bor-Neutronen Einfang Therapie (BNCT: Boron Neutron Capture Therapy) im Rahmen eines EG-Vorhabens weiterentwickelt. In den nächsten Jahren werden mehr und mehr speziell konfigurierte (meist höher konzentrierte Pharmaka / Diagnostica) mit höherem Bor Anteil (vgl. Feakes et. al. PNAS 96, 6406,1999) verwendet werden. [4,7; PT 1] 5. Automatisierte Mehrfach EM-Immundetektion: Ein neuer Ansatz zur spektroskopischen Abbildung Gold-markierter Proben. Das derzeit häufigste verwendete Verfahren der ultrastrukturellen Immundetektion ist die Verwendung Nanogold-gekoppelter Antikörper. Im Routineeinsatz tritt häufig das Problem auf, dass die Nanogoldpartikel nur mit großen Schwierigkeiten über einem kontrastierten dichten Präparatuntergrund erkannt werden können. Mit der von uns ausgearbeite- Abb. 2.: Ein neues Verfahren zur automatisierten Auswertung von EM Ultradünnschnitten nach simultaner 2-fach Immun-Markierung. Schema der Systemkonfiguration (A-D): ZEISS EM 912 Omega, mit 2K x 2K Slow Scan CCD Kamera (PROSCAN), in Verbindung mit analysis Software 3.1 (SIS) und Bildverarbeitungsschritte (s. Text). E-F: zeigen das ausgewertete Präparate (E) und nach der Bilderverarbeitung (F, Programm Goldfinder).

75 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie ten Technik können auch kleinste Goldpartikel einwandfrei zur spezifischen Präparatstelle zugeordnet werden [5,6; PT 5]. 6. Detektion und Elementanalyse von Nanopartikeln in Patientengewebe (Hüftimplantate). Auf Grund einer Untersuchung von Urban et al. (J. Bone Joint Surg. Am. 82, 2000, ) ergibt sich die Notwendigkeit Abriebpartikel aus Langzeitimplantaten in ihrer Elementzusammensetzung elektronenspektroskopisch zu charakterisieren, da die Studie von Urban ergeben hatte, dass Abriebpartikel aus der Umgebung von Implantaten systemisch im Körper der Patienten verteilt werden können und daher ein Verdacht auf eine cancerogene Wirkung nicht ausgeschlossen werden kann. [8] Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Hiller, S.A., *Kabius, B., *Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. *Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl. 2, pp , [2] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B , [3] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., *Witz, J., Haking, A., Spring, H., *Troendle, A., *Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40 th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, [4] Raddatz, S., Mark, E. P., Haking, A., *Probst, W.,Wiessler, M., Trendelenburg, M.F., Troester, H.: Development of new marker compounds for the detection of chemical element labels by elelctron spectroscopic imaging (ESI). Microscopy & Microanalysis (2001), Vol. 7, Suppl. 2, pp [5] Monteiro-Leal, L. H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.: A New Computerised Method of Multiple Labelling Detection and Particle Evaluation. Microscopy & Microanalysis (2002), Vol. 8, Suppl. 2, CD 36. [6] Monteiro-Leal, L.H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.F.: Gold Finder: a computer method for fast automatic double gold labelling detection, counting and colour overlay in electron microscopic images. J. Struct. Biol.141, (2003). [7] Raddatz, S., Marcello, M., Kliem, H.-C., Tröster, H., Trendelenburg, M. F., *Oeser, P., Granzow, C. and Wiessler, M. Synthesis of new boron-rich building blocks for Boron Neutron Capture Therapy or Energy-Filtering Transmission Electron Microscopy. ChemBiochem. 5(4) , [8] Tröster, H., *Milz, S., Trendelenburg, M.F., *Jorder, F., *Scharf, H.-P., *Schwarz, M.: Detection of Micro- to Nano-Sized Particles in Soft Tissue. Medical Image Computing and Computer- Assisted Intervention - Miccai 2004, Pt 2, Proceeding p Patente: PT1. Synthese eines Bor-Konstrukts zur Markierung von Oligonukleotiden zur Markierung für die energiefilternde Transmissionselektronenmikroskopie. M. Wießler, S. Raddatz (E080), M.F. Trendelenburg, H. Tröster, (A 120) E. Spiess (A 125) PT2. Element-Detektion im energiefilternden Elektronenmikroskop mit Hilfe eines Untergrundmarkers. A. Haking, K. Richter, M.F. Trendelenburg (A120) PT3. Selektive Kontrastoptimierung für hochauflösende Marker- Detektion in biomedizinischen Ultradünnschnitten. A. Haking, H. Tröster, K. Richter, M.F. Trendelenburg (A120) A120 Strukturelle Genanalyse PT4. Ein molekularbiologischer Marker mit hochrepetitiven DNA- Elementen für die analytische Elektronenmikroskopie. S. Bub, H. Tröster, K. Richter, A. Haking(A120), E. Spiess (A125), M.F. Trendelenburg (A120) S. Raddatz, M. Wießler (E 080). PT5. Eine neue Computer unterstütze Methode zur automatisierten Detektion und Partikel Charakterisierung in mehrfach markierten EM-Präparaten. L.H. Monteiro-Leal, H. Tröster, L. Campanati-Araujo, H. Spring, M.F. Trendelenburg (A120) 75

76 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A125 Modellversuche zur Invasion und Metastasierung Modellversuche zur Tumorinvasion und Metastasierung (A125) Leiter: Prof. Dr. Eberhard Spiess 76 Technische Angestellte Anna Heckel-Pompey (½) ( - 7/03) Die Gruppe hat sich mit technischen Problemen der lebend-zell-mikroskopie und dem Einfluss von Proteinen auf den Zelltod beschäftigt. In Zusammenarbeit mit: Dr. T.A. Knoch, Prof. Dr. D. Werner, DKFZ; Felix Bestvater febit AG, Mannheim; Prof. Dr. H. Acker, MPI für Molekulare Physiologie, Dortmund, PD Dr. T. Feurer, Institut für Quantenphysik und Optik, FSU, Jena; Dr. S. Gil- Parrado, Institut für Klinische Chemie und Biochemie LMU, München. Gene Walking bei Transfektionsexperimenten Zum Studium zellulärer Prozesse in vivo werden in den letzten Jahren als Reporter verschiedene Varianten des Grün- Fluoreszierenden-Proteins (GFP) eingesetzt, die mit dem eigentlichen Zielmolekül in einem Genkonstrukt verbunden sind. Diese GFP Varainten sind in ihren Sequenzen fast identisch. Wir haben bei Ko-transfektionen von Genkonstrukten, die mit unterschiedlichen GFP Varianten markiert sind, festgestellt, dass es zu falsch positiven Ergebnissen kommt. Unter Standard Bedingungen waren bis zu 8 % und unter bestimmten Umständen bis zu 26% der exprimierenden Zellen betroffen. Solche Abweichungen beeinträchtigen die Interpretation der Versuche erheblich. Systematische Untersuchungen zeigten, dass das Phänomen auf einer homologen Rekombination der DNA beruht, die auf der hohen Homologie in den GFP Sequenzen basiert. Dieses Gene Walking hat jedoch auch positive Aspekte: mit quantitativen Auswertungen sind Rückschlüsse möglich auf Prozesse der Replikation-Rekombination-Reparatur (RRR) von DNA, die in Tumorzellen gestört sein können. Darüber hinaus ist die Methode ein eleganter und einfacher Ansatz zur Neukonstruktion von GFP-Fusionsproteinen. [1] Zwei Photonen Spektren von biologisch relevanten Fluorochromen Zwei- bzw. Mehr-Photonen Mikroskopie gewinnt aufgrund mehrer technischer Vorzüge zunehmend Bedeutung in der bio-medizinischen Forschung. Spektren von Fluorochromen, die auf unterschiedliche Anregungsart erzeugt werden, müssen aus theoretischen Gründen nicht notwendigerweise identisch sein. Deshalb ist grundsätzlich für jedes Fluorochrom eine Vermessung in jedem Anregungsmodus notwendig. Solche Messungen für biologisch relevante Fluorochrome lagen bislang für Zwei-Photonen-Anregung nicht vor. Wir haben deshalb Spektren vieler gebräuchlicher Fluorochrome vermessen, wie z.b. Acridin Orange, DAPI; Hoechst 33342, FITC, Rhodamin, Cy2, Cy3. In der Tat kommt es zu Abweichungen zwischen Ein- und Zwei Photonen Anregungs Spektren, die bei der Excitation in der Regel blau, bei der Emission in der Regel rot verschoben sind. Dies gilt auch für die später vermessenen Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins (ECFP, EGFP, EYFP). [2, 3] Funktion von Calpain Calpaine sind Proteasen, die wiederholt mit Apoptose Prozessen in Verbindung gebracht worden sind. Der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch weitgehend unbekannt. Wir untersuchten den Ionomycin-modifizierten Zelltod, der sich durch synthetische und natürliche Inhibitoren von Calpain hemmen lies. Die Abnahme von BiD und Bd2 im Verlauf der Apoptose ist durch Calpain beeinflussbar, in vitro kann Calpain die an apoptotischen Prozessen beteiligten Caspasen 9, 3 und 7 aktivieren und Bd-2, BiD und Bcl xl spalten. Diese Spaltprodukte können aus isolierten Mitochondrien Cytochrom c frei setzten. Wir schlossen daraus auf einen Einfluss des aktivierten Calpain auf eine Auslösung bestimmter apoptotischer Wege. Der Aktivierungsprozess selbst wird durch eine Membranbindung des Calpains eingeleitet. [4, 5] Lokalisation von Prothymosin α Prothymosin α (PTα) ist ein weitverbreitetes, extrem saueres Protein (das sauerst bekannte überhaupt), das entgegen anfänglicher Annahmen keine Verwandtschaft mit Thymosin hat. In seiner 110 Aminosäuren langen Sequenz ist ein Kern-lokalisations-Signal (NLS) enthalten. Über seine Lokalisation, Funktion und über mögliche Interaktionspartner ist wenig bekannt. Es wird mit Zellteilungs- und Zelltot-Prozessen in Verbindung gebracht. Wir untersuchten Lokalisation und Transport des PTα in normalen Zellen und in Tumorzellen in vivo mit Hilfe einer transfizierten PTα- EGFP Chimäre. In zeitlich ausgedehnten Lebendbeobachtungsstudien wurde gezeigt, dass PTα sich zwischen Cytoplasma und Zellkern hin und her bewegt. Die Freisetzung aus dem Kern ist ein schneller Prozess (Sekunden), der umgekehrte Weg verläuft über Stunden. Das für diese Vorgänge notwendige Transportsystem ist noch unbekannt. In bestimmten Tumorzelllinien führte eine Überexpression des PTα zu einem raschen Zelltod. Dies bestätigt ander Untersuchungen, dass PTα in apoptotische Kaskaden involviert ist. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Bestvater, F., Knoch, T.A., Langowski, J., Spiess, E. (2002) Construct conversions caused by simultaneous cotransfection: GFP-Walking. BioTechniques 32, [2 ] Bestvater, F., Spiess, E., *Stobrawa, G., *Hacker, M., *Feurer, T., *Porwol, T., *Berchner-Pfannschmidt, U., *Wotzlaw, C., *Acker, H. (2002) Two-photon fluorescence excitation and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J. Microscopy (Oxford) 208, [3 ] Zusätzlich Publiziert über: front/curvomatic/spectra.php [4] *Gil-Parrado, S., *Fernández-Montalván, A., *Assfalg- Machleidt, I., *Popp, O., Bestvater, F., *Holloschi, A., Knoch, T.A., *Auerswald, E. A., *Welsh, K., *Reed, J.C., *Fritz, H., *Fuentes-Prior, P., Spiess, E., *Salvesen, G., *Machleidt, W. (2002) Ionomycin-activated calpain triggers apoptosis: A probable role for Bcl-2 family members J. Biol. Chem. 277, [5] *Gil-Parrado, S., *Popp, O., Knoch, T.A., *Zahler, S., Bestvater, F., *Felgenträger, M., *Holloschi, A., *Fernández- Montalván, A., *Auerswald, E.A., *Fritz, H., *Fuentes-Prior, P., *Machleidt, W., Spiess, E. (2003) Subcellular localization and in vivo subunit interactions of ubiquitous-calpain. J Biol Chem. 278,

77 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A130 Epigenetik Arbeitsgruppe Epigenetik (A130) Leiter: Dr. Frank Lyko Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Bodo Brückner (10/02-) Dr. Joachim Marhold Doktoranden Regine Garcia Boy Natascha Kunert (6/02-) Cora Mund (5/03-) Frank Weissmann Technische Assistentinnen Katja Kühle (01/03-) Tanja Musch Die epigenetische Regulation der Genexpression spielt eine zentrale Rolle in der Säugerentwicklung sowie in der Entstehung von Krebs. Die Forschungsaktivitäten der Arbeitsgruppe Epigenetik konzentrieren sich auf die zentralen Mechanismen, die epigenetische Programme etablieren und aufrechterhalten. Dies geschieht im wesentlichen durch DNA-Methylierung und bestimmte höhergeordnete Chromatinstrukturen. Diese Mechanismen werden in verschiedenen Modellsystemen untersucht. An zentraler Stelle steht dabei die funktionelle Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In diesem System lassen sich wesentliche Aspekte der epigenetischen Regulation im Menschen in zahlreichen Details und mit hoher Effizienz untersuchen. Darüber hinaus werden auch die DNA- Methylierungsmuster von Krebspatienten eingehend analysiert und Verbindungen zur spezifischen Inhibition menschlicher DNA-Methyltransferasen synthetisiert. Diese Projekte sollen die Entwicklung neuartiger Ansätze zur Diagnose und Therapie von Krebs erlauben. Charakterisierung methylierungsabhängiger Chromatinstrukturen in Drosophila J. Marhold, K. Kühle, F. Lyko In Zusammenarbeit mit A. Brehm, Universität München Methyl-DNA-bindende Proteine fungieren als Bindeglieder zwischen methylierter DNA und repressorischen Chromatinstrukturen. Wir verwenden mehrere Ansätze, um methylierungsabhängige Chromatinstrukturen in Drosophila zu untersuchen. Unsere Forschungsaktivitäten konzentrieren sich derzeit auf das MBD2/3 Protein, das signifikante Homologien zu den methyl-dna-bindenden Proteinen MBD2 und MBD3 aus der Maus aufweist. Unsere Resultate haben gezeigt, dass MBD2/3 hochspezifisch mit den Chromosomen interagiert [1]. Diese Interaktionen werden nun genauer untersucht, um die genaue Funktion von dmbd2/3 und seiner Interaktionspartner aufzuklären. Von den Ergebnissen erhoffen wir uns wichtige Aufschlüsse über die Integration epigenetischer Signale während der Drosophila- Entwicklung [6]. Funktionelle Charakterisierung des Drosophila Dnmt2-Gens N. Kunert, J. Marhold, K. Kühle, F. Lyko In Zusammenarbeit mit G. Reuter, Universität Halle Genomische DNA von Drosophila wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung methyliert. Die Sequenzierung des kompletten Drosophila-Genoms führte zur Identifikation des Dnmt2-Gens, das signifikante Sequenzhomologien mit funktionellen DNA- Methyltransferasen aufweist. Dnmt2 wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung exprimiert, was mit dem beobachteten DNA-Methylierungsmuster übereinstimmt. Um die Funktion der DNA-Methylierung in Drosophila aufzuklären, haben wir das Gen sowohl durch RNA-Interferenz ausgeschaltet als auch in transgenen Fliegen überexprimiert. Dies zeigte, daß das Dnmt2-Protein in der Tat die DNA- Methylierung in Drosophila vermittelt [9]. In weiterführenden Experimenten werden derzeit mutante Dnmt2- Allele hergestellt [3]. Die detaillierte Untersuchung mutanter Fliegen wird einen entscheidenden Beitrag zum funktionellen Verständnis der DNA-Methylierung für die Fliege leisten. 77 Vergleichende Charakterisierung von DNA- Methyltransferasen aus der Maus F. Weißmann, C. Mund, T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit R. Paro, Universität Heidelberg und J. Walter, Universität des Saarlandes Im Rahmen einer vergleichenden Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen haben wir transgene Drosophila- Systeme zur Überexpression aller bekannten Methyltransferasen aus der Maus etabliert. Dies erlaubt uns nun eine detaillierte Analyse ihrer biologischen Funktion. Beispielsweise führt die Überexpression der de novo Methyltransferase Dnmt3a zu schweren Entwicklungsstörungen in der Fliege. Diese Entwicklungsstörungen sind auf die Hypermethylierung des Genoms zurückzuführen. Unsere Experimente zeigen, dass die Hypermethylierung zu einem verzö-

78 78 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie gerten Zellzyklus führt. Darüber hinaus konnten wir auch definierte strukturelle Chromosomenabnormalitäten sowie eine Fehlregulation der epigenetischen Histon-Modifikationen nachweisen [4]. Diese Resultate zeigen, wie Zellen auf die Methylierung ihrer DNA reagieren. Damit können weit reichende Schlussfolgerungen bezüglich der molekularen Wirkungsweise von DNA-Methylierung und ihrer Rolle in der Krebsentstehung gezogen werden [8]. Untersuchung von tumorspezifischen DNA-Methylierungsmustern B. Brückner, T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit M. Wießler, DKFZ, A. Benner, DKFZ, und S. Stilgenbauer, Universität Ulm Die genomischen Methylierungsmuster von Tumoren unterscheiden sich erheblich von denen gesunder Gewebe. Da die DNA-Methylierung die epigenetische Programmierung der Genexpression reflektiert, würde ein Nachweis von tumorspezifischen DNA-Methylierungsmustern eine sehr frühe und präzise Krebsdiagnose erlauben [5]. In einer ersten Serie von Experimenten zur Untersuchung von Methylierungsmustern in Krebspatienten haben wir in Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Toxikologie die DNA- Methylierung von Leukämie (B-CLL)-Patienten untersucht [2]. Die Ergebnisse führten zur Identifikation einer Subgruppe von Patienten bei denen verhältnismäßig starke DNA-Methylierung mit aggressiveren Krankheitsverlaufsformen assoziiert ist. Synthese neuartiger DNA-Methyltransferase- Inhibitoren R. Garcia Boy, F. Lyko In Zusammenarbeit mit S. Suhai, DKFZ, und M. Wießler, DKFZ Die Hypermethylierung des Genoms stellt einen wichtigen Schritt in der Entstehung einer Vielzahl von Tumoren statt. Diese Hypermethylierung führt zu Epimutationen, die in einer Fehlsteuerung der epigenetischen Programmierung resultieren. Im Gegensatz zu genetischen Mutationen sind Epimutationen aber reversibel und können beispielsweise durch die Inhibition der DNA-Methylierung wieder ausgelöscht werden. Dies eröffnet völlig neuartige Möglichkeiten in der Krebstherapie. Der derzeit gebräuchliche Inhibitor, 5-aza-Cytidin, ist äußerst toxisch und kann daher nur in sehr beschränktem Maße eingesetzt werden. In Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Biophysik haben wir deshalb ein 3-dimensionales Modell der humanen DNMT1- Methyltransferase hergestellt [7]. Dieses Modell wird derzeit zum screening von Moleküldatenbanken verwendet. Moleküle mit positiven Bindeeigenschaften können schließlich synthetisiert und in Krebszellinien auf ihre biologische Wirksamkeit getestet werden. A130 Epigenetik Publikationen (* = externer Koautor) [1] Marhold, J., Zbylut, M., Lankenau, D.H., Li, M., Gerlich, D., Ballestar, E.*, Mechler, B.M., and Lyko, F. Stage-specific chromosomal association of Drosophila dmbd2/3 during genome activation. Chromosoma 111 (2002) [2] Stach, D., Schmitz, O.J., Stilgenbauer, S.*, Benner, A., Döhner, H.*, Wiessler, M., and Lyko, F. Capillary electrophoretic analysis of genomic DNA methylation levels. Nucleic Acids Res. 31 (2003) e2. [3] Lankenau, S.*, Barnickel, T.*, Marhold, J., Lyko, F., Mechler, B.M., and Lankenau, D.H.* Knockout targeting of the Drosophila Nap-1 gene and examination of DNA repair tracts in the recombination products. Genetics 163 (2003) [4] Weissmann, F., Muyrers-Chen, I.*, Musch, T., Stach, D., Wiessler, M., Paro, R.*, and Lyko, F. DNA hypermethylation in Drosophila melanogaster causes irregular chromosome condensation and dysregulation of epigenetic histone modifications. Mol. Cell. Biol. 23 (2003) [5] Lyko, F. Epigenetic changes, altered DNA methylation and cancer. In Mechanisms in Carcinogenesis and Cancer Prevention, H.U. Vainio, and E. Hietanen, eds. (Springer, Berlin, 2003), pp [6 Erhardt, S.*, Lyko, F. Ainscough, J.F.*, Surani, M.A.*, and Paro, R.* Polycomb-group proteins are involved in silencing processes caused by a transgenic element from the murine imprinted H19/Igf2 region in Drosophila. Dev. Genes Evol. 213 (2003) [7] Siedlecki, P., Garcia Boy, R., Comagic, S.*, Schirrmacher, R.*, Wiessler, M., Zielenkiewicz, P., Suhai, S., and Lyko, F. Establishment and functional validation of a structural homology model for human DNA methyltransferase 1. Biochem. Biophys. Res. Comm. 306 (2003) [8] Weissmann, F., and Lyko, F. Cooperative interactions between epigenetic modifications and their function in the regulation of chromosome architecture. Bioessays 25 (2003) [9] Kunert, N., Marhold, J., Stanke, J., Stach, D., and Lyko, F. A Dnmt2-like protein mediates DNA methylation in Drosophila. Development 130 (2003)

79 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A135 Biochemische Zellphysiologie Biochemische Zellphysiologie (A135) Leiter: Prof. Dr. Walter Pyerin Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr.Karin Ackermann Dr.Bernd Sorg Doktoranden Thomas Barz Gaelle Dubois (gem. m. Dr. R. Eils, Intelligente Bioinformatiksysteme, DKFZ) Sabine Eisenberger Godehard Hoppe Kerstin Knerr Tanja Neidhart (3/03-) Diplomanden Frauke Focke Techniker Michael Emmenlauer Andrea Waxmann Wir untersuchen Pathomechanismen proliferativer Prozesse in zwei miteinander verzahnten Schwerpunkten, zum einen den Proteinkinase-CK2-Komplex, einen lebenswichtigen Steuerungsmechanismus zellulärer Funktionen, zum anderen Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen. Proteinkinase CK2 ist eine hoch konservierte Ser/Thr- Phosphotransferase bestehend aus zwei katalytischen (CK2α; CK2α ) und zwei regulatorischen (CK2β) Untereinheiten. CK2 verhält sich janusköpfig: Einerseits lebenswichtig, kann CK2 andererseits Onkogencharakter entwickeln - Störungen von Aktivität oder Struktur ändern das Proliferationsverhalten von Zellen und in Modellsystemen wie Hefe oder Maus den Phänotyp. CK2 ist an einer großen Zahl zellulärer Prozesse beteiligt, die grösste Substratgruppe bilden transkriptionssteuernde Proteine. Es unser Ziel, Gene zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die proliferationsrelevant sind. Untersucht werden die Transkriptome des Menschen sowie der Modellsysteme Maus und Hefe. Darüberhinaus wollen wir wissen, wie die Expression des Kontrolleurs CK2 selbst kontrolliert wird. Der Knochen ist nach Leber und Lunge das am dritthäufigsten von der Filialisierung maligner Tumore betroffene Organsystem. Knochenmetastasen sind eine klinisch wie volkswirtschaftlich bedeutende Belastung. Das Wissen über die molekularen Hintergründe ihrer Entwicklung und die Pathogenese des begleitenden Knochenschmerzes sind lückenhaft und widersprüchlich. Wir analysieren Metastasen-verursachte Änderungen im Genexpressionsmuster von Knochengewebszellen und im Zellkultur-Modell den Cross-talk zwischen Tumorzellen und Knochenzellen mit dem Ziel, eine neue Basis für Diagnose- und Therapieansätze zu erarbeiten. Proteinkinase CK2-Komplex im Kontext proliferativer Prozesse W. Pyerin, K. Ackermann, T. Barz, G. Dubois, T. Neidhart In Kooperation mit: O. Filhol, C. Cochet, INSERM Grenoble, Frankreich; C. V. C. Glover, University of Georgia, Athens, USA; J. DeRisi, University of California, San Francisco, USA; P. Lichter, R. Eils, DKFZ. Gefördert von: HGF-Strategiefonds III. CK2-kontrollierte Genexpression Ob eine Zelle den Weg der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einschlägt, entscheidet sich in der Zellzyklus- Anfangsphase und ist das Resultat spezifischer, einander bedingender, temporärer Programme der Expression und Repression von Genen. Bei gestörtem Proteinkinase-CK2- Komplex wird diese Entscheidungsphase nicht oder nicht korrekt durchlaufen und es werden unmittelbar-frühe Gene wie fos reprimiert [Pepperkok et al J. Biol. Chem. 269, ; Lorenz et al FEBS Letters 448, ]. CK2 ist also an der Realisierung von Genexpressionsprogrammen der Zellzyklus-Anfangsphase beteiligt. Wir haben daher mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie, die die Expressionsprofile von hunderten und tausenden von Genen gleichzeitig und unter identischen Bedingungen zu erstellen erlaubt, analysiert, welche Gene CK2-abhängig exprimiert werden. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, haben wir zunächst ein vollständig entschlüsseltes Genom untersucht, das der Hefe Saccharomyces cerevisiae, einem wichtigen Zellzyklus-Modell. Wenn wir die CK2-Gene (CKA1, CKA2; CKB1, CKB2) gezielt mutieren, finden wir eine Reihe von Genen in ihrer Expression erhöht oder erniedrigt. Insgesamt zeigen etwa 5-10% der 6200 Gene in der einen oder anderen Weise Abhängigkeit von CK2 [Ackermann, K. et al Mol. Cell. Biochem. 227, 59-66]. Ein Grossteil dieser Gene kann zu Gruppen mit Promotor-Gemeinsamkeiten geordnet werden. Zwei davon, das Phosphat-Regulon (PHO) und das Flockungs-Regulon (FLO), haben wir bisher näher untersucht. Andere Gene besitzen solche Gemeinsamkeiten nicht, zeigen aber dennoch vergleichbares Expressionsverhalten. Das trifft in der Zellzyklus-Anfangsphase auf etwa ein Viertel der Zellzyklusgene zu und weist der CK2 eine bisher nicht bekannte globale Rolle zu. Das PHO-Regulon interessiert, weil die Versorgung mit Phosphat (P i ) essentiell ist für das Leben aller Zellen und Organismen. Sein Fehlen löst Wachstums- und Teilungsstop aus sowie die Produktion hoch affiner P i -Transporter und sezernierter Phosphatasen zur P i -Rekrutierung aus der Umgebung. Dieser PHO-Stoffwechselweg ist transkriptionsreguliert und umfasst etwa 30 Gene. Knockouts von CK2- Genen führt zu einer massiven Repression der Exekutiv- Gene und des Gens ihres gemeinsamen Transkriptionsaktivators (PHO4), bleibt aber ohne Wirkung auf die Gene des zentralen, zellzyklusorientierten PHO-Regulatorkomplexes, bestehend aus einer Cyclin-abhängigen Kinase (CDK), einem Cyclin, und einem CDK-Inhibitor. Das bedeutet, dass eine Störung der CK2 den Exekutivteil des PHO-Stoffwechselweges von seinem Kontrollteil abkoppelt: die Repression der Exekutivgene kann vom Regulatorkomplex nicht mehr aufgehoben werden (Abb. 1). Zusätzlich scheint CK2 auf der Proteinebene modulierend eingreifen zu können: Pho4 79

80 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A135 Biochemische Zellphysiologie 80 Abb. 1. Proteinkinase CK2 als Regulator des PHO-Stoffwechselweges. (A) Die Deletion von CK2-Genen reprimiert PHO-Exekutivgene und ihren zentralen Aktivator PHO4. DNA-Chip-Analyse der angegebenen Genexpressionen zu verschiedenen Zeiten der Zellzykluseintrittsphase. (B) Schematischer Überblick der Verknüpfung von PHO-Stoffwechselweg, Proteinkinase CK2 und Zellzyklus. Für Details siehe Text. und Regulatorkomplex werden in vitro von CK2 phosphoryliert [1,2]. Das FLO-Regulon kontrolliert das Adhäsionsverhalten von Hefezellen und mehrere seiner Gene haben menschliche Orthologe. FLO-Gene müssen für eine ungestörte Proliferation der Zellen im reprimierten Zustand gehalten werden. Wenn wir CK2 genetisch stören, wird die Repression aufgehoben. Dies geht mit dem Expressionsanstieg eines zentralen FLO-Transkriptionsaktivators (SSN5) sowie einem Flocken der Zellen einher. Daraus kann geschlossen werden, dass CK2 eine essentielle Rolle spielt für die über Zell-Zell-Adhäsion vermittelte Proliferationssteuerung [3]. Um CK2-abhängig regulierte Gene der Zellzyklus-Anfangsphase zu erfassen, haben wir S.cerevisiae mit Hilfe von α-pheromon in der G0-Phase arretiert und die Genexpressionsprofile von Wildtyp- und CK2-Mutanten-Stämmen beim (Wieder)Eintritt in den Zellzyklus vergleichend bestimmt. Wir finden signifikante Expressionsänderungen von Genen aller Zellzyklusphasen, oft CK2-Untereinheiten- und CK2-Isoform-spezifisch. Neben den Genen mit Homologien in den Promoterregionen und gleichgerichteten, permanenten CK2-Abhängigkeiten wie den PHO- Genen (vgl. oben), finden sich vor allem temporär expressionsveränderte Gene, die solche Homologien nicht haben aber vergleichbar auf CK2-Mutationen reagieren sowie Gene, die zwar Homologien besitzen aber unterschiedlich auf CK2-Mutationen reagieren. Funktionell gehören diese Gene zu den Regulonen von Zellzykluseintritt, -progression und -austritt, und sie betreffen Komponenten des Spindelpolkörpers und der Zellzykluskontroll-Maschinerie samt assoziierter Stoffwechselwege, vor allem aber Gene, die an Chromatin-Remodeling und -Modifikation beteiligt sind, einschliesslich Chromatin-Assembly, -Silencing und -Antisilencing, der Histonacetylierung und -deacetylierung (Abb. 2). Interessanterweise sind verschiedene der kodierten Proteine auch nachgewiesene CK2-Substrate. Das Ergebnis ordnet der CK2 eine bisher nicht bekannte globale Rolle zu: Beteiligung an der Kontrolle des transkriptionsverknüpften Chromatin-Remodelings [2,4,5]. Cell cycle Gene Gene product phase G1 CAC2 p60 subunit of chromatin assembly factor I ESC4 Establishes silent chromatin ASF1 Anti-silencing protein S SWI1 Chromatin remodeling zinc-finger transcription factor TEL2 Telomere binding protein S/G2 HOS3 Histone deacetylase CSE4 Similar to histone H3 and to centromere protein CENP-A G2/M SRI1 Swi/SNF and RSC interacting protein 1 AHC1 Component of Ada histone acetyltransferase complex MCM6 ATP-dependent DNA helicase M/G1 HST4 Histone deacetylase Abb. 2. Bei Zellzyklus-Eintritt gestörte CK2-Gene ändern die Expression von Genen, die Faktoren von Chromatin-Remodeling und -Modifikation kodieren und die zu verschiedenen Zellzyklusphasen gehören. Für Details siehe Text. Unsere Daten weisen ferner aus, dass die CK2-Isoformen α und α funktionell unterschiedliche Rollen spielen können, und dass der Untereinheit β nicht immer dieselbe Bedeutung zukommt. Während die Repression der FLO- Gene vom Kinaseaktivitätsniveau abhängt und nicht welche Isoform sie erzeugt oder ob CK2β zugegen ist, ist die Expressionskontrolle der PHO-Gene deutlich Isofomspezifisch und stark CK2β-abhängig. Solche Differenzen finden sich auch bei der Chromatin-verknüpften Expressionskontrolle [1-5]. In welcher Form CK2 auch immer eingreift, sie scheint stets derselben zellphysiologischen Funktion zu dienen, der eines Überlebensfaktors (vgl. auch Ahmed et al Trends in Cell Biology 12, ). Hefe ist nicht nur als zelluläres Modell interessant. Vielmehr können Hefezellen auch als biologische Retorte vorteilhaft sein, etwa für mechanistische Studien der Expression menschlicher Gene unter in vivo-bedingungen im 1H-System (one hybrid system). Wir haben damit beispielsweise die Frage beantworten können, ob der zu beobachtende stimulierende Effekt von CK2α auf die Expression des

81 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie menschlichen Aromatase-Gens direkt oder indirekt ausgeübt wird [Ackermann and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, ]. Die neue Generation von 1H-Systemen verwendet eine Variante des grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) als Reporter anstatt HIS3/lacZ. Das ist zeit- und arbeitssparend. Weil dieser Alternative das Manko einer fehlenden positiven Bezugsgrösse hatte, haben wir ein Kontollvektor-Konstrukt neu entworfen und erfolgreich experimentell umgesetzt, sodass nun genaue DNA-Protein- Interaktionsstudien im GFP-1H-System möglich sind [6,7]. Die Kontrolle des Kontrolleurs: Die CK2-Gene des Menschen und ihre Transkriptionsregulation. Das menschliche Genom besitzt vier CK2-Gene, zwei kodieren a and je eines α und β [Pyerin et al in: Protein phosphorylation, F. Marks ed, VCH Weinheim, ]. Wir konnten alle CK2-Gene isolieren, ihre Strukturen entschlüsseln und erfolgreich umfassende vergleichende Promotorstudien durchführen. Während sich eines der beiden CK2α-Gene als ein prozessiertes, nichttranslatiertes Pseudogen herausstellte, sind die drei anderen Gene aktiv. Interessanterweise zeigen unsere Studien, dass die aktiven Gene Gemeinsamkeiten in ihren Promotoren aufweisen, die für eine koordinierte Regulation in Frage kommen. Die auffälligsten Gemeinsamkeiten sind ein Ets1-Doppelmotiv in den transkriptions-aktivsten Abschnitten der Promotoren (CK2α-Gen: Region -9 bis 46; CK2α -Gen: Region -396 bis -129; CK2β-Gen: Region -42 bis 14) begleitet von Ansammlungen von Sp1-Bindeelementen. Die Transkriptionsaktivierung benötigt die Interaktion von Ets1 und Sp1. Mindestens Sp1 wird von CK2-Holoenzym, nicht jedoch Abb. 3. Hypothese einer Transkriptionskoordination der menschlichen Proteinkinase-CK2-Gene. Die Promotoren der Gene, die für die katalytische Untereinheit CK2α und die regulatorische Untereinheit CK2β kodieren, enthalten in den transkriptionsaktivsten Abschnitten (Regionen -9 bis 46 und -42 bis 14) dasselbe Ets1- Bindeelement (gelb; Doppelmotiv) und Ansammlungen benachbarter Sp1-Bindeelemente (grau). Die Transkriptionsaktivierung benötigt Ets1-Sp1-Interaktion. Generierte CK2α- und CK2βmRNAs werden in die entsprechenden CK2-Untereinheiten translatiert (CK2α, rot ausgefüllter Kreis; CK2β, blau ausgefülltes Oval) und diese komplexieren zu tetramerem CK2-Holoenzym. Das Holoenzym, nicht hingegen katalytische Untereinheit alleine, kann Sp1 (und Ets1?) phosphorylieren und so allmählich die Transkription beider Gene abschalten (negative Rückkopplung). A135 Biochemische Zellphysiologie von CK2α oder CK2α allein, phosphoryliert und dadurch seine Affinität zu DNA vermindert [Pyerin and Ackermann 2001 Mol. Cell. Biochem. 227,45-57]. Das bedeutet, dass eine zunehmende Holoenzymmenge die Expression der CK2-Gene zunehmend vermindert. Daraus haben wir die Hypothese abgeleitet, dass die Expression der CK2-Gene koordiniert erfolgt und einer negativen Rückkoppelung unterliegt: Die aktivierten Gene führen zu CK2-mRNAs, die in die entsprechenden CK2-Untereinheiten translatiert werden und zu tetramerem CK2-Holoenzym komplexieren. Das Holoenzym, nicht hingegen katalytische Untereinheiten alleine, kann dann Sp1 (und Ets1?) phosphorylieren und so die Transkription der CK2-Gene allmählich abschalten (Abb. 3). Eine solcher Kontrolltyp zielt auf Konstanthaltung der CK2-Verfügbarkeit. Tatsächlich finden wir stets gleiche CK2-Untereinheiten-Verhältnisse unabhängig davon, in welchem Stadium von Proliferation oder Differenzierung sich Zellen gerade befinden [5,8,9]. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen K. Ackermann, S. Eisenberger, G. Hoppe, K. Knerr, B. Sorg, W. Pyerin In Kooperation mit: Ch. Kasperk, G. Nöldge, P.J. Meeder, H.J. Bardenheuer, S. Kaul, Universitätsklinik Heidelberg; B. Korn, ResourcenZentrum Heidelberg; W. Weinig, J. Tuckermann, DKFZ; N. Schütze, Universitätsklinik Würzburg; J. Schmidt, GSF München. Gefördert von: Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim. Cross-talk zwischen Knochen- und Tumorzellen Der Knochen ist u.a. bevorzugtes Ziel der Absiedelungen von Tumoren der Prostata, und Knochenmetastasen sind Haupt-Todesursache bei Prostatakrebs. Abgesiedelte Tumorzellen, die erfolgreich ihren Weg in den Knochenmarkraum gefunden haben, lagern sich an die inneren Knochen-Oberflächen an, die von Osteoblasten ausgekleidet sind. Dadurch kommt es zum Cross-talk zwischen Tumorzellen und Osteoblasten. Dieser kann das Verhalten der Tumorzellen massiv verändern mit der Folge, dass beispielsweise herkömmliche Chemotherapeutika ohne Wirkung auf Metastasen bleiben - eine der leidvollen klinischen Erfahrungen bei der Behandlung von Prostatakrebs-Patienten. Als Grund dafür werden Änderungen in der Expression von Genen vermutet, insbesondere solche, die in der Zellzyklus-Anfangsphase Schlüsselrollen spielen [Pinski et al Cancer Res. 61, ]. Davon haben wir die Arbeitshypothese abgeleitet, dass sich der Effekt des Cross-talks zwischen Tumorzellen and Osteoblasten in den Genexpressionsmustern abbilden sollte und dass damit konkrete Hinweise zu Eigenschaftsänderungen der Zellen erkannt und dann näherer Untersuchung zugeführt werden können. Zur Prüfung der Hypothese haben wir ein Zellkultur-Metastasierungsmodell etabliert und Genexpressionsprofile mit Hilfe von DNA-Chip-Technologie und quantitativer RT-PCR ermittelt. Tatsächlich finden wir, dass der Cross-talk in beiden, Osteoblasten wie Prostatakarzinomzellen, Änderungen in der Expression von Genen auslöst. Sie betreffen in den Tumorzellen insbesondere drei Regulone, das Proliferationsregulon, das Adhäsionsregulon und das Knochenzell- Differenzierungsregulon. Gene, die Komponenten der Zellzyklus-Kontrollmaschinerie und mit ihr verknüpfte Stoffwechselwege kodieren werden überwiegend reprimiert, beispielsweise Cyclin-Gene oder das Proliferationsmarker-Gen pcna, was zu einem Stop der Zellproliferation führt und erklärt, warum die gegen proliferierende Zellen gerichteten Chemotherapeutika bei Prostata- 81

82 82 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie metastasen versagen. Gene, die Komponenten zellulärer Verankerungen kodieren, werden hingegen überwiegend erhöht, beispielsweise Cadherin-, Desmocollin- oder Plakophilin-Gene. Gleichzeitig werden Änderungen in den Adhäsionseigenschaften der Tumorzellen erkennbar: Ihre Haftung auf Matrixprotein-beschichteten Oberflächen ändert sich deutlich. Gene schliesslich, die typischerweise in Knochenzellen exprimiert werden, werden auch in den Prostatakarzinomzellen zur Expression gebracht, beispielsweise die Gene für alkalische Phosphatase, Osteonektin oder Osteopontin. Die Tumorzellen zeigen also Osteomimkry, nehmen damit partiell Knochenzelleigenschaften an und gewinnen damit vermutlich Überlebensvorteile. Fazit ist, dass Knochenzellen selbst Änderungen in Prostatakarzinomzellen auslösen, die zur Kolonisierung des Knochens beitragen [10]. Metastasen-verursachte Osteoporose Wie das Metstasierungsmodell zeigt, werden nicht nur Tumorzellen von Osteoblasten im Genexpressionsprofil beeinflusst. Viel mehr werden auch Osteoblasten von Tumorzellen zu Expressionsänderungen veranlasst. Wir gehen daher davon aus, dass auch in vivo Knochenzellen durch Metastasen in ihrem Genexpressionsverhalten verändert werden, und dass dies nicht auf Osteoblasten beschränkt ist, sondern auch für Osteozyten, den knochengewebsbildenden Differenzierungsformen der Osteoblasten gilt. Unsere Arbeitshypothese ist daher, dass der von Metastasen ausgehende Expressions-Änderungsdruck auf Osteozyten das Knochengewebe insgesamt verändern kann und so die Entstehung und Aufrechterhaltung von Krankheitsbildern wie der Osteoporose fördert oder gar verursacht, und dass Genexpressionsanalysen Hinweise auf die mechanistischen Hintergründe geben können. In enger Kooperation mit Klinikern analysieren wir die Genexpressionsmuster von Osteocytenverbänden, die wir mit Hilfe Laser-gestützter Mikrodissektion aus Osteoporose-Proben gewinnen. Dabei ist wegen extremer Härte und Widerstandsfähigkeit des Knochengewebes nicht nur die Mikrodissektion ein höchst schwieriges Unterfangen, auch das Schneiden schockgefrorenen Knochengewebes im Mikrotom und das Aufziehen auf Objektträger ist mit erheblichen Problemen verbunden. Problemverschärfend kommt hinzu, dass Osteozyten weiträumig verteilt und die RNA-Ausbeuten gering sind. Es ist uns nach langwieriger methodischer Pionierarbeit geglückt, gangbare Wege zu finden [12,13]. Neben der Suche nach krankheitsverknüpften Genen, interessieren wir uns für die Regulationsmechanismen einzelner Gene, deren Bedeutung für Krebs und Osteoporose bekannt sind, beispielsweise das Aromatase-Gen, das das Schlüsselenzym der Östrogen-Biosynthese kodiert. Das Gen steht unter Multi-Promotor-Kontrolle und bietet potentielle, therapeutisch interessante Möglichkeiten gewebsspezifischer Expressionsmodulation. Um dies auszuloten, haben wir die Promotorverwendung in verschiedenen Knochen-Arealen und -Typen analysiert sowie in primären und permanenten Knochenzell-Kulturen, und haben sie mit der Promoterverwendung in verschiedenen Mammakarzinomgeweben und -Zellkulturen verglichen. Im Gegensatz zu Angaben in der Literatur finden wir wechselnde und sich breit überlappende Promotor-Verwendungen in den beiden Geweben [14]. A135 Biochemische Zellphysiologie Publikationen (* = externer Koautor) [1] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2003): Perturbation of protein kinase CK2 uncouples executive part of phosphate maintenance pathwayfrom cyclin-cdk control. FEBS Letters 537, [2] Barz, T. (2003): Proteinkinase-CK2-regulierte Genexpression beim Eintritt in den Zellzyklus. Dissertation, Universität Kaiserslautern, Fachbereich Biologie [3] Ackermann, K., *Glover C.V.C., *DeRisi, J., Pyerin, W. (2003): Genome-wide transcript profiling of deletion mutants demonstrates protein kinase CK2-control of flocculation-linked gene expression in Saccharomyces cerevisiae. [4] Barz, T., Ackermann, K., Dubois, G., Eils, R., Pyerin, W. (2003): Genome-wide expression screens indicate a global role for protein kinase CK2 in chromatin remodeling. J. Cell Science 116, [5] Pyerin, W., Ackermann, K. (2003): The genes encoding human protein kinase CK2 and their functional links. Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 74, [6] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002): A positive control for the green fluorescent protein-based one-hybrid system. Analyt. Biochem. 304, [7] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002): A positive control for the green fluorescent protein-based one-hybrid system. License contract L-2392 DKFZ/MoBiTec 10/02 [8] Gerber, J. (2002): Humanes CK2α -Gen (CSNK2A2): Strukturaufklärung und Promotor-Identifizierung. Diplomarbeit, Universität Kaiserslautern, Fachbereich Biologie [9] Neidhart, T. (2003): Promotoranalyse menschlicher Proteinkinase-CK2-Gene. Diplomarbeit, Universität Kaiserslautern, Fachbereich Biologie [10] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2003): Bone metastasis: Osteoblasts affect growth and adhesion regulons in prostate tumor cells and provoke osteomimicry. Int. J. Cancer, in Revision [12] Eisenberger, S. (2002): Gewebsabhängige Transkription von Proteinkinase CK2 und Mikrodissektions-basierte Genexpressionsanalyse. Diplomarbeit, Universität Kaiserslautern, Fachbereich Biologie [13] Eisenberger, S., Hoppe, G., Ackermann, K., *Voggenreiter, G., *Kasperk, C., Pyerin, W.: High quality RNA preparation for osteocyte expression array analysis in microdissections of native human bone tissue. Submitted [14] Hoppe, G., Ackermann, K., *Kasperk, C., *Kaul, S., Pyerin, W.: Tissue-specific therapeutic targeting: Promoter usage of the human aromatase gene (CYP19) in bone and breast tumors. Submitted

83 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A140 Eicosanoide und Tumorentwicklung Arbeitsgruppe Eicosanoide und Epitheliale Tumorentwicklung (A140) Leiter: Dr. rer. nat. Gerhard Fürstenberger Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat. Peter Krieg PD Dr. rer. nat. Karin Müller-Decker Gastwissenschaftler Dr. Svetlana Zoubova,St. Petersburg, Russland (- 5/02) Doktoranden Thorsten Lau (- 4/03) Melanie Neumann Gwendolin Manegold (- 1/03) Dorothea Schweiger Karsten Müller (- 6/02) Anette Zagorski (- 6/03) Technische Mitarbeiter Dagmar Kucher (Teilzeit) Ina Kutschera Sandra Pfrang (- 5/03) Andrea Pohl-Arnold (Teilzeit) Brigitte Steinbauer (Teilzeit) Ingeborg Vogt (- 12/02) Auszubildende (Stand 12/03) Andre Leischwitz Unter den aus Arachidonsäure gebildeten Eicosanoiden sowie den entsprechenden Octadecanoiden (aus Linolsäure) finden sich zahlreiche hochaktive Wirkstoffe, die als Agonisten spezifische Oberflächenrezeptoren sowie Transkriptionsfaktoren des Typs der Peroxisomen-Proliferator-Aktivator-Rezeptoren aktivieren. Eicosanoide sind u.a. Entzündungsmediatoren und Wundfaktoren und werden von gereiztem Gewebe vorübergehend gebildet. Eine dauernde Überproduktion von Eicosanoiden findet man dagegen bei chronisch-degenerativen Prozessen (rheumatische Arthritis, Atherosklerose und Alzheimersche Demenz) sowie bei Krebs. Die biologische Aktivität der Eicosanoide und Octadecanoide wird aufgrund ihrer Kurzlebigkeit in der Regel über die Biosynthese reguliert. Hauptsächlich zwei Enzymfamilien, die Cyclooxygenasen (COX) und die Lipoxygenasen (LOX), katalysieren die Oxidation von Arachidonsäure bzw. Linolsäure, die Stimulus-induziert durch Phospholipasen A 2 (PLA 2 ) aus Phospholipiden freigesetzt werden. Beide Stoffwechselwege können zugleich eine Quelle von reaktiven (gentoxischen) Sauerstoffspezies sein, die bei der enzymatischen Fettsäureoxidation als Nebenprodukte entstehen und zu oxidativem Stress beitragen. Wir untersuchen die Rolle von COX und LOX in normalen Epithelien und bei der Tumorentwicklung in Haut, Kolon, Brustdrüse, Blase und Pankreas von Mäusen. Durch flankierende Studien an Tumorbiopsien schlagen wir eine Brücke vom Tierversuch zur Klinik. Unsere Arbeiten haben das Ziel, das Verständnis der normalen und pathologischen Funktionen des Stoffwechsels ungesättigter Fettsäuren zu vertiefen. Die so gewonnenen Kenntnisse über Mechanismen sollen als rationale Ansätze für die Verbesserung bestehender und die Entwicklung neuer Methoden zur Krebsprävention bzw. -therapie dienen. Für unsere Untersuchungen setzen wir transgene Mausmodelle mit gewebs- und differenzierungs-spezifischer Überexpression oder Inaktivierung von COX und LOX und entsprechende Zellkultursysteme ein, um die spezifischen Funktionen dieser Proteine bei der Entwicklung epithelialer Tumore im Kontext der jeweiligen Gewebe bzw. des Gesamtorganismus zu untersuchen. Hierzu werden auch experimentelle Karzinogenesemodelle in der Maus, insbesondere das Mehrstufenmodell der Hautkarzinogenese, eingesetzt. 1. Cyclooxygenasen K. Müller-Decker, T. Lau, M. Neumann und G. Fürstenberger Zusammenarbeit mit Dr. C. Bayerl, Abteilung für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Medizinisches Zentrum Mannheim der Universität Heidelberg, Dr. habil. I. Berger, Pathologisches Institut der Universität Heidelberg, PD Dr. M. Kaszkin, Institut für Pharmakologie der Universität Frankfurt, Dr. L. Madsen, and Prof. K. Kristiansen, University of Southern Denmark, Odense, Denmark, Prof. Zouboulis, Abteilung Dermatologie, Medizinisches Zentrum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin, Prof. S.M. Fischer, M.D. Anderson Cancer Center, Smithville Division, Smithville, TX, (USA), sowie Drs. K. Seibert und J. Masferrer, Pharmacia/Pfizer, St. Louis, MO, USA. COX katalysieren die Oxidation von Arachidonsäure zu einem Prostaglandin-Endoperoxid (PGH 2 ), das durch weitere Enzyme gewebe- und zelltypspezifisch in bioaktive Prostaglandine sowie Prostacyclin und Thromboxan umgewandelt wird. Einige dieser Wirkstoffe sind entscheidend an der Tumorentwicklung beteiligt: sie hemmen terminale Differenzierung und Apoptose, fördern Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung und wirken immunsuppressiv [1]. Von den beiden bekannten COX-Isoenzymen wird COX-1 in praktisch allen Organen konstitutiv exprimiert, COX-2 dagegen in der Regel nur vorübergehend bei Stress-Situationen (Verwundung, Infektion, Entzündungen) induziert Eine permanente Überexpression von COX-2 wurde in praktisch allen bisher untersuchten epithelialen Neoplasien des Menschen und der Maus beobachtet. Tierversuche und klinische Studien haben eine signifikante Reduktion der Tumorentwicklung durch Hemmung der COX-2-Aktivität gezeigt. Diese Ergebnisse haben dazu geführt, dass der COX-2-selektive Inhibitor Celebrex von der amerikanischen FDA zur Behandlung von kolorektalen Tumoren bei Patienten mit familiärer adenomatöser Polyposis Coli zugelassen wurde [2-4]. Im Einzelnen wurden im Berichtszeitraum die nachfolgend aufgeführten Projekte bearbeitet: 1.1 Prostaglandinbiosynthese und -funktionen Die Freisetzung von Arachidonsäure aus Phospholipiden durch PLA 2 ist ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt für die Biosynthese von Prostaglandinen. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von M. Kaszkin haben wir in der Haut von Mäusen neben der cytosolischen PLA 2 9 sekretorische PLA 2 nachgewiesen, die in einem von der Differenzierung abhängigen Muster exprimiert werden. Die Isoenzyme IB, IIE, IIF, V, and XII-1 sind überwiegend in den suprabasalen Zellschichten zu finden, während die Isoenzyme IIA, IID und X in proliferativ aktiven Basalzellen exprimiert werden. Die PLA 2 IIC ist in allen Zellschichten vertreten [5]. Interessant in diesem Zusammenhang ist, dass auch die unterschiedlichen Isoenzyme der COX und LOX ein differenzierungsabhängiges Expressionsmuster zeigen, was auf eine mögliche Kopplung von bestimmten PLA 2 -Isoformen mit individuellen COX bzw. LOX hinweisen könnte. Mit der Rolle von COX-Isoenzymen bei der Wundheilung in der Haut befasst sich eine Studie, die zeigte, dass die Hei- 83

84 84 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A140 Eicosanoide und Tumorentwicklung lung von Schnittwunden bei unveränderter Expression der COX-1 mit einer transienten Induktion der COX-2 einhergeht und dass die systemische Verabreichung von COX-1- oder COX-2-selektiven Inhibitoren wie die gleichzeitige Hemmung beider Isoenzyme die Wundheilung nicht verzögert [6]. Diese Beobachtung ist von Bedeutung im Hinblick auf den Einsatz von COX-Inhibitoren, insbesondere COX-2- selektiver Inhibitoren, zur postoperativen Schmerzbehandlung und Prävention von kolorektalem Krebs (Zusatzfinanzierung: Industriekooperation). In Zusammenarbeit mit L. Madsen haben wir gezeigt, dass die Induktion der Expression von COX-1 und COX-2 für die durch Arachidonsäure induzierte Hemmung der Adipozyten- Differenzierung in 3T3L1-Präadipozyten verantwortlich ist, den die Hemmung der Aktivitäten beider Enzyme macht diesen Effekt rückgängig [7]. Zwei weitere Kooperationsprojekte befassten sich mit der Induktion der terminalen Sebozytendifferenzierung durch Arachidonsäure [8] bzw. der Expression von Rezeptoren für den Blutplättchen- Aktivierungsfaktor PAF in humanen Keratinocyten [9]. 1.2 Funktion von COX-2 in Epithelien in vivo: Transgene Mausmodelle Wir untersuchen die normalen Funktionen von COX-2 sowie die Rolle dieses Enzyms bei der Tumorentwicklung in von uns entwickelten transgenen Mauslinien, die COX-2 unter Kontrolle des Keratin 5 (K5)-Promotors im proliferativen Basalzellkompartiment der Epidermis und verwandter Epithelien konstitutiv exprimieren. In diesen Tieren zeigen sich in der Epidermis Störungen der Haarfollikelentwicklung, eine starke Talgdrüsenhyperplasie und eine massive epidermale Hyperplasie als Folge einer gestörten epidermalen Differenzierung und Kompartimentalisierung. Fokal auftretende epidermale Dysplasien gleichen präneoplastischen Veränderungen bei der chemisch induzierten Maushautkarzinogenese und bei seborrhoischen Keratosen des Menschen [4]. In einer Studie über die Expression und Funktion von unter Kontrolle des K5-Promotors exprimierten COX-2 konnte die Störung der Haarfollikelentwicklung auf einen verfrühten Eintritt in die erste Katagen-Phase des postnatalen Haarzyklus mit nachfolgenden Zyklusstörungen in Verbindung gebracht werden. Diese Störung führt in erwachsenen Tieren zu einer Alopezie. Die Effekte des COX-Transgens ließen sich durch Hemmung der COX-2-Aktivität rückgängig machen [10]. In Maushautkarzinogeneseversuchen wird die Krebsanfälligkeit durch das COX-2-Transgen extrem erhöht. So bilden sich Hauttumore allein nach Initiation, d.h. unter Bedingungen, bei denen bei Wildtyp-Tieren überhaupt keine Tumore entstehen. Dieser Befund belegt einen Kausalzusammenhang zwischen COX-2 und Tumorpromotion, indem er zeigt, dass die Haut COX-2-transgener Mäuse auto-promoviert ist. Darüber hinaus entwickeln transgene Tiere im Vergleich zu Wildtyptieren eine signifikant erhöhte Zahl von Karzinomen, was auf eine die maligne Progression fördernde Wirkung der transgenen COX-2-Expression hinweist [11]. Die äußerst niedrigen Karzinogendosen, die bei COX-2-Überexpression für eine Krebsentstehung ausreichen, dürften denen in unserer täglichen Umwelt entsprechen. Danach wäre eine aberrante COX-2-Überexpression, wie sie sich nicht nur in manifesten Neoplasien sondern auch in zahlreichen Präneoplasien des Menschen findet, ein Krebsrisikofaktor ersten Ranges, zugleich aber auch ein vielversprechender Angriffspunkt für Chemoprävention (Zusatzfinanzierung: Krebshilfe). Eine interessante Beobachtung ist, dass in anderen Epithelien, in denen der K5-Promoter aktiv ist und damit das COX-2-Transgen aberrant exprimiert wird, ebenfalls Proliferationsstörungen und prämaligen Veränderungen auftreten. Dies gilt unter anderem auch für die Brustdrüse der Mäuse, wo die konstitutive Expression von COX-2 in Myoepithelzellen und K5 positiven Brustvorläuferzellen unabhängig von Schwangerschaft und laktogenen Hormonen zu Hyperproliferation, Adenosen und Fibrosen führt. Ähnliche Veränderungen werden auch in menschlicher Brust mit fibrozystischen Veränderungen (Mastopathie) beobachtet. Auch hier fällt eine im Vergleich zu normalen Brustgewebe deutlich erhöhte COX-2-Expression auf, was auf einen kausalen Zusammenhang zwischen Mastopathie und aberranter Expression von COX-2 hinweist und COX-2-selekteive Hemmstoffe als Therapeutika für diese häufigsten benignen Veränderungen der Brust beim Menschen ausweist [12]. 2. Lipoxygenasen P. Krieg, K. Müller, M. Siebert, A. Zagorski und G. Fürstenberger Kooperation mit Dr. J. Nair und Prof. H. Bartsch, Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C010); Dr. W. D. Lehmann und Dr. von der Lieth, Zentrale Spektroskopie (B090); Prof. B. Marian, Institut für Tumorbiologie der Universität Wien, Österreich; Prof. Dr. Hartmut Kühn, Institut für Biochemie der Charité, Berlin; Dr. M. Leitges, MPI für Experimentelle Endokrinologie, Hannover; Dr. H.C. Hennies, Max-Delbrück-Zentrum, Berlin; Prof. A. Brash, Vanderbilt University, Nashville, USA; Prof. K. Kristiansen, University of Southern Denmark, Odense, Dänemark. Zusatzfinanzierung Deutsche Forschungsgemeinschaft, Deutsche Krebshilfe LOX katalysieren die Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und stellen auf diesem Wege eine Reihe von bioaktiven Lipidmediatoren wie Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE), Leukotriene u.a. bereit. Die LOX-Reaktion ist zugleich eine Quelle für reaktive (gentoxische) Sauerstoffspezies und damit eine mögliche Ursache für oxidativen Stress. Im Maushautmodell zeigen LOX-Hemmstoffe eine ähnliche Antitumorwirkung wie die COX-Inhibitoren. Damit werden auch die LOX zu potentiellen Angriffspunkten für Krebschemoprävention [1,13]. 2.1 Funktion epidermaler LOX Im Rahmen der systematischen Analyse der LOX der Maus haben wir mit der 8S-LOX, der 12R-LOX (die erste Säuger- LOX mit R-Chiralität!) und der Epidermis-Type LOX-3 eine Unterfamilie der LOX, die sog. Epidermis-Typ LOX (elox) entdeckt. Die entsprechenden Gene dieser Unterfamilie befinden sich eng benachbart in einem Cluster auf dem zentralen Abschnitt des Mauschromosoms 11, die orthologen menschlichen Gene auf dem syntenen Locus 17p13.1 [14]. Darüber hinaus findet sich in Maushaut eine strukturell den klassischen 12-LOX verwandte epidermale 12S-LOX (e12s-lox). Den elox gemeinsam ist, dass sie die konventionellen LOX-Substrate Arachidonsäure und Linolsäure nur mit sehr geringer Effizienz umsetzen [14,15]. elox sind überwiegend aber nicht ausschließlich in der Epidermis von Mensch und Maus exprimiert. In Zusammenarbeit mit der Gruppe um K. Kristiansen konnten wir zeigen, dass die elox-3 in Fettgewebe exprimiert wird und bei der Adipozytendifferenzierung im Model der Maus-3T3-L1- Präadipozyten eine kritische Rolle bei der Differenzierung spielt [16]. Mutationen in den Gene der 12R-LOX und der

85 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie elox-3 werden beim Menschen mit der Entstehung von Ichthyosen in Verbindung gebracht. Um den Zusammenhang zwischen den veränderten Proteinen und der Erkrankung aufzuklären, wurden transgene Mäuse hergestellt, bei denen das 12R-LOX-Gen gewebespezifisch ausgeschaltet ist. Die phänotypische Charakterisierung díeser Mäuse wird zur Zeit durchgeführt. 2.2 Funktion von LOX bei der Tumorentwicklung in der Maushaut: Transgene Mausmodelle. Die Haut von Mäusen zeigt ein charakteristisches, von der terminalen Keratinozyten-Differenzierung abhängiges Expressionsmuster von LOX, das sich im Verlauf der Tumorbildung im Mehrstufenmodell der Maushaut isotyp-spezifisch ändert [13,14] So sind in benignen Hauttumoren die 8S-LOX und Blutplättchen-Typ 12S-LOX (p12s-lox) aberrant exprimiert und für die massiv erhöhten Spiegel der Eicosanoide 8- und 12-HETE im Tumorgewebe verantwortlich. Diese LOX-Isoformen können somit als prokarzinogene Enzyme angesehen werden. Die in normaler Maushaut konstitutiv exprimierten e12s- und 12R-LOX sowie die elox-3 sind dagegen in benignen Hauttumoren nicht mehr nachweisbar [14,15]. Dies könnte auf eine eher antikarzinogene Wirkung dieser Isoenzyme bzw. ihrer Produkte hindeuten. Evidenzen für pro- und antikarzinogene LOX-Wirkungen haben wir bei der Analyse von transgenen Tieren erhalten, die e12s-lox unter Kontrolle des Keratin-6 Promotors in Tumoren überexprimieren [17]. Bei solchen Tieren hängt die Tumorentwicklung von der Expressionsstärke des Transgens und einer dadurch veränderten Expression anderer LOX-Isoenzyme ab. So kommt es bei niedriger Transgen-Expression zu einer Induktion der leukozytären 12S- LOX und zu einer Akkumulation ihres Linolsäure-Produktes 13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE), was mit einer im Vergleich zum Wildtyp geringeren Tumorbildung korreliert. Dagegen führt eine hohe Expression des Transgens zu einer verstärkten Expression der p12s-lox gepaart mit einer Akkumulation des Arachidonsäure-Produktes 12-HETE. Dieses korreliert mit einer verstärkten Tumorbildung. Unsere Beobachtungen unterstützen damit nicht nur Berichte anderer Autoren über eine antagonistische Wirkung von 12-HETE und 13-HODE bei der epithelialen Tumorentwicklung, sondern auch zahlreiche Untersuchungen, denen zufolge eine Linolsäure-reiche (pflanzliche) Ernährung eher krebsverhütend, eine Arachidonsäure-reiche (tierische) Diät dagegen eher krebsfördernd wirkt. Wie es zu dem beobachteten Cross-talk zwischen den verschiedenen LOX-Formen kommt, ist allerdings noch völlig unklar [17]. 3. Mehrstufenkarzinogenese-Modell in der Maushaut G. Fürstenberger, P. Krieg und K. Müller-Decker. In Zusammenarbeit mit: Dr. J. Hess und Dr. P. Angel, Abteilung Signaltransduktion/Wachstumsregulation (A100), Prof. P. Lichter, Abteilung Molekulare Genetik (B060), Dr. Iris Helfrich, Abteilung Virale Transformationsmechanismen (F030), alle DKFZ; Dr. J. Reichelt und Prof. T. Magin, Institut für Physiologische Chemie der Universität Bonn. Das Mehrstufenmodell der Maushautkarzinogenese ist das bestcharakterisierte Modell der experimentellen Krebserzeugung, zerlegt es doch den Langzeitprozess der Krebsentwicklung in operationale und mechanistisch gut charakterisierte Teilschritte der Initiation, Promotion und malignen A140 Eicosanoide und Tumorentwicklung Progression. Neues Interesse gewinnt dieses Modell bei der Identifizierung tumorrelevanter Gene [vgl. 18] und der Funktionsanalyse von definierten genetischen Veränderungen (Überexpression oder Ausschaltung von definierten Genen) bei der Krebsentwicklung. So ist z.b. in transgenen Mäusen, die epidermisspezifisch das Papillom-Virus E6 Gen überexpremieren, eine im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen massiv erhöhte Karzinombildung zu beobachten (Zusammenarbeit mit Dr. I. Helfrich, DKFZ, [19]). In Untersuchungen mit Dr. Reichelt und Prof. Magin zeigte sich, dass die Ausschaltung des Keratin 10-Gens bei deutlich beschleunigter terminaler Keratinozyten-Differenzierung zu einer signifikanten Verminderung der epidermalen Tumorbildung führt [20]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Marks, F., Müller-Decker, K.. and Fürstenberger, G.: A causal relationship between unscheduled eicosanoid signaling and tumor development: cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic acid metabolism. Toxicology 153, (2000) [2] Marks, F., Fürstenberger, G., Neufang, G., and Müller-Decker, K:. Mouse skin as model for cancer chemoprevention by nonsteroidal antiinflammatory drugs. Recent. Results in Cancer Res. 163, (2003) [3] K. Müller-Decker, Charyalertsak, S.*, Albert, C., Reinerth, G., Marks, F., and Fürstenberger, G: Cyclooxygenase-2: A molecular target for chemoprevention of epithelial tumors of skin and colon. Adv. Exp. Med. Biol. 507, (2002) [4] Fürstenberger,G., Marks, F., and Müller-Decker, K.: Cyclooxygenase-2 and skin carcinogenesis. In Dannenberg A.J. and DuBois, R.N. (eds): COX-2. Prog. Exp. Tumor Res. 37, (2003) [5] Gurrieri, S. *, Fürstenberger, G., Schadow, A.*,.Haas, U.*, Singer, A.G.*, Ghomashchi, F.*, Pfeilschifter, J.*, Lambeau, G.*, Gelb, M.H.*, and Kaszkin M.*: Differentiation-dependent regulation of secreted phospholipases A 2 in murine epidermis. J. Invest. Dermatol. 121, (2003) [6] Müller-Decker, K., Hirschner, W., Marks, F., and Fürstenberger, G: The effects of COX isozyme inhibition on incisional wound healing in mouse skin. J. Invest. Dermatol. 119, (2002) [7] Petersen, R.K.*, Jorgensen, C.*, Rustan, A.C.*, Froyland, L.*, Müller-Decker, K., Fürstenberger, G., Berge, R.K*., Kristiansen, K.*, and Madsen, L.*: Arachidonic acid-dependent inhibition of adipocyte differentiation requires PKA activity and is associated with sustained expression of cyclooxygenases. J. Lipid Res. 44, (2003) [8] Wrobel, A.* Seltmann, H.* Fimmel, S.* Müller-Decker, K., Tsakuda, M:*, Bogdanoff, B.*,Mandt, N.*, Blume-Peytavi, U.*, Orfanos, C.E.* and Zouboulis, C.C. Differentiation and apoptosis in human immortalized sebocytes. J. Invest. Dermatol. 120, (2003) [9] Bayerl, C.*, Brandt, H.*, Niemezyk, M.*, Müller-Decker, K., and Gretz, N.* PAF-receptor in inflammatory versus non-inflammatory human epidermis, cell cultures and embryonal cells. Inflamm. Res. 52, (2003) [10] Müller-Decker, K., Leder, C. Neumann, M., Neufang, G., Bayerl, C.*, Schweizer, J., Marks, F., and Fürstenberger, G.: Expression of cyclooxygenase isozymes during morphogenesis and cycling of pelage hair follicles in mouse skin: precocious onset of the first catagen and alopecia upon cyclooxygenase-2 overexpression. J. Invest. Dermatol. 121, (2003) [11] Müller-Decker, K., Neufang, G., Berger, I*, Neumann, M., Marks F., and Fürstenberger, G.: Transgenic overexpression of COX-2 sensitizes mouse skin for carcinogenesis. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 99, (2002) 85

86 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A140 Eicosanoide und Tumorentwicklung 86 [12] Müller-Decker, K., Berger, I.*,Ackermann,K., Zoubova, S*., Aulmann, S.*, Pyerin, W. and Fürstenberger, G.: Cystic duct dilatations and epithelial proliferations in mouse mammary glands upon keratin 5 promoter-driven overexpression of cyclooxygenase-2. Am. J. Pathol., submitted [13] Lütteke, T., Krieg, P., Fürstenberger, G., and von der Lieth, C.W.: LOX-DB-a database on lipoxygenases. Bioinformatics 19, (2003) [14] Krieg, P., Heidt, M., Siebert, M., Kinzig, A., Marks, F., Fürstenberger, G.: Epidermis-type lipoxygenases. Adv. Exp. Med. Biol. 507, (2002) [15] Fürstenberger, G., Marks, F., and Krieg, P.: Arachidonate 8(S)-Lipoxygenase. Prostaglandins and other lipid mediators 68/ 69, (2002) [16] Madsen, L.*,. Petersen, R.K.*,. Sorensen, M.B*, Jorgensen, C.*, Hallenborg, P.*, L.Pridal, L.*, Fleckner, J.*, Amri, E.*, Krieg, P., Fürstenberger, G., Berge R.K.*, and Kristiansen, K*.: Adipocyte differentiation of 3T3-L1 preadipocytes is dependent on lipoxygenase activity during the initial stages of the differentiation process. Biochem. J. 375, (2003) [17] Müller, K., Siebert, M., Heidt, M., Marks, F., Krieg, P., and Fürstenberger, G.:. Modulation of epidermal tumor development caused by targeted overexpression of epidermis-type 12Slipoxygenase. Cancer Res. 62, (2002) [18] J. Schlingemann, J. Hess, G. Wrobel, U. Breitenbach, C. Gebhardt, P. Steinlein, H. Kramer, G. Fürstenberger, M. Hahn, P. Angel and P. Lichter. Profile of gene expression induced by the tumor promoter TPA in murine epithelial cells. Int. J. Cancer 104, (2003) [19] I. Helfrich, M. Chen, R. Schmidt, A. Kopp-Schneider, D. Trick, H.J. Gröne, G. Fürstenberger, H. zur Hausen and F. Rösl. Increase incidence of squamous cell carcinomas in Mastomys natalensis papillomavirus E6 transgenic mice during two-stage skin carcinogenesis, J. Virol. 78(9) (2004). [20] J. Reichelt, G. Fürstenberger and T.M. Magin*. Reduced tumorigenesis and stimulation of MAPK signalling in Keratin 10 knockout mice, J.Invest. Dermatol. 123(5) (2004).

87 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A145 Differenzierung Normaler und Neoplastischer Epidermis Differenzierung von normaler und neoplastischer Epidermis (A145) Leiter: Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat. habil. Hermelita Winter PD Dr. rer. nat. Michael A. Rogers Dr. Luis-Felipe Jave-Suarez Technische Mitarbeiter Ulrike Beckhaus Iris Beckmann Anke Wollschläger 1. Aufklärung humaner KAP-Multigenfamilien und Haarfollikel-spezifischer epithelialer Keratine J. Schweizer, M.A. Rogers, H. Winter In Zusammenarbeit mit L. Langbein, Ilse Hofmann, Jörg Langowski, Norbert Mücke, (alle DKFZ), Bruno Bernard, Christine Collin (alle L Oreal, Paris, Frankreich), C. Perrin, Hautklinik Nizza, Frankreich. 87 Die Proteinfamilie der Keratine umfaßt die epithelialen Keratine, die in Zellen der verschiedenen Epitheltypen das 10 nm Intermediärfilamentnetz ausbilden, und die Haarkeratine, die am Aufbau von Haaren und Nägeln beteiligt sind. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht die Charakterisierung der komplexen Multigenfamilien menschlicher Haarkeratine und ihrer assoziierten Proteine, KAP, sowie Haarfollikel-spezifischer epithelialer Keratine. Neben der Expression von Haarkeratinen und KAPs im Haarfollikel und Nagel, untersuchen wir die Regulation der Haarkeratinexpression, die mögliche Involvierung Haarfollikel-spezifischer Keratine bei erblichen Haarerkrankungen, sowie die Rolle von Keratinen als Marker für Haar- und Nageltumoren. Der Haarfollikel ist das morphologisch komplexeste Anhangsorgan der Epidermis. Am Aufbau seiner unterschiedlichen Gewebekompartimente spielen neben den Haarkeratinen deren assoziierte Proteine KAP, sowie Haarfollikel-spezifische epitheliale Keratine als zelluläre Strukturproteine eine wesentliche Rolle. Mit Hilfe genomischer und cdna-banken konnten wir mehrer KAP-Multigenfamilien auf zwei unterschiedlichen Loci des Chromosoms 21 aufklären [1-4]. Augenblicklich arbeiten wir an der Aufklärung der letzten KAP-Multigenfamilien auf chromosom 11. Zudem gelang es uns, vier bisher unbekannte epitheliale Typ II Keratine zu identifizieren, die spezifisch und differentiell in der inneren Wurzelscheide des Haarfollikels exprimiert werden [5,6], sowie das früher als Companion Layer-spezifisch gefundene Keratin K6hf, auch in der Medulla von Sexualhaaren nachzuweisen [7]. Zudem wurde die in vitro Assembly von Haarkeratinen und deren Expression in in vitro kultivierten Haarfollikeln untersucht [8,9]. In einer weiteren Untersuchung wurde die Haarkeratinexpression im menschlichen Nagel bestimmt [10] 2. Keratinmutationen und Haaranomalien J. Schweizer, H. Winter, M.A. Rogers In Zusammenarbeit mit D. Schissel, Department of Dermatologie, US Army Hospital, Heidelberg, D, Parry, Palmerston, Neuseeland, Birgit Lane, Dundee, Schottland, UK. In einer klinischen Kooperation wurde die Haaranomalie Pseudofollicultis barbae als potentielle Keratinkrankheit untersucht. Diese Anomalie manifestiert sich durch entzündlichen Prozesse im Gesichtsbereich, die durch einwachsende Haare verursacht werden. Sie stellt eines der größten Gesundsheitsprobleme in der amerikanischen Armee dar, da sie zumeist Schwarze betrifft, die durch ihre gekräuselten Haare eine genetische Prädisposition für die Anomalie aufweisen. Wir konnten zeigen, dass ein Polymorphismus im Keratin K6hf-Gen, der zu einer Aminosäuresubstitution Ala12Thr im K6hf-Protein führt, einen weiteren genetischen Risikofaktor für Pseudofollicultis barbae darstellt [11,12]. 3. Regulation der Haarkeratinexpression / Untersuchungen in Haartumoren L.F. Jave-Suarez, H. Winter, J. Schweizer In Zusammenarbeit mit Dr. B. Cribier, Hautklinik Strassburg, Frankreich. Zusatzfinanzierung DFG Mit der Aufklärung der Gene der humanen Haarkeratine waren die Voraussetzungen für Studien zur Regulation der Hairkeratinexpression gegeben. Ihm Rahmen einer Doktorarbeit konnten wir nachweisen, daß des das Homöobox-Protein HOXC13 an der Expressionskontrolle von Haarkeratin-

88 88 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie genen beteiligt ist, die während der frühen Differenzierungsphase im haarbildenden Kompartimente exprimiert werden (hha2, hha5). Die Expressionskontrolle verläuft dabei über mehrere Bindungselemente im proximalen Promotorbereich der Gene, von denen eines nicht von anderen HOX13 Paralogen erkannt wird. [13]. Die Kontrolle der Haarkeratine hha2 und hha5 durch Hoxc13 wird auch in benignen und malignen Pilomatricomen aufrecht erhalten [14]. Das bisher nur in Vellushaaren nachgewiesene Haarkeratin hha7, konnte als konstitutiv exprimiertes Haarkeratin in Sexualhaaren identifiziert werden. An seiner Expression ist der Androgenrezeptor, AR, kausal beteiligt [15]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Shimomura Y*, Aoki N*, Rogers MA, Langbein L, Winter H, Schweizer J, Ito M*: Size polymorphisms in members of the human high sulfur keratin associated protein (KAP) family. J Biol Chem 277, (2002). [2] Rogers MA, Langbein L, Ehmann C, Praetzel S, Winter H, Schweizer J.: Characterization of a first domain of high tyrosineglycine and high sulfur hair keratin associated protein (KAP) genes on chromosome 21q22.1 J Biol Chem 277, (2002) [3] Jave-Suarez LF, Winter H, Langbein L, Rogers MA, Schweizer J. HOXC13 is involved in the regulation of human hair keratin gene expression. J Biol Chem 277, (2002). [4] Shimomura Y*, Aoki N*, Rogers MA, Langbein L, Schweizer J, Ito M*.: Characterization of human keratin-associated protein1 family members. J Invest Dermatol Symposium Proceedings 8, (2003). [5] Rogers MA, Langbein L, Winter H, Beckmann I, Praetzel S, Schweizer J. Hair keratin associated proteins (KAP9): Characterization of a second high sulfur KAP gene domain on human chromosome 21. J Invest Dermatol 122(1), (2004). [6] Langbein L, Rogers MA, Praetzel S, Winter H, Schweizer J.: K6irs1, K6irs2, K6irs3 and K6irs4 represent the inner root sheathspecific type II epithelial keratins in the human hair follicle. J Invest Dermatol 120, (2003). [7] Langbein L, Rogers MA, Praetzel S, Winter H, Schweizer J.: A novel epithelial keratin, hk6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells ( Flügelzellen ) of the human hair follicle. J Invest Dermatol 118, (2002). [8] Wang Z*, Wong P*, Langbein L, Schweizer J, Coulombe P*.: The type II epithelial keratin 6hf (K6hf) is expressed in the companion layer, matrix and medulla in anagen-stage hair follicles. J Invest Dermatol, 121, (2003). [9] Hofmann I, Winter H, Mücke N, Langowski J, Schweizer J.: The in vitro assembly of hair follicle keratins: Comparison of cortex and companion layer keratins. Biochem J 383, (2002). [10] Thibaut S*, Collin C*, Langbein L, Schweizer J, Gautier B*, Bernard B*.: Expression of hair keratins in human hair follicles grown in vitro: Validation of the culture model. J Exp Dermatol 12, (2003). [11] Perrin C*, Langbein L, Schweizer J.: Expression of hair keratins in the adult nail unit:an immunohistochemical analysis of the onychogenesis in the proximal nail fold, matrix and nail bed. Brit J. Dermatol 151(2), (2004). [12] Rogers MA.: Keratins and keratin diseases. Nature Encyclopedia of the Human Genome. DN Cooper ed. (London, New York, Tokyo), Nature Publishing Group, pp (2003). [13] Winter H, Schissel D*, Wilde J*, Peters G*, Parry DAD*, Smith TA*, Edler L, Liovic M*, Lane EB*, Langbein L, Rogers MA, Schweizer J.: An unusual Ala12Thrpolymorphism in the 1A α-helical segment of the companion layer-specific keratin K6hf is a risk factor for the common hair disorder pseudofollicultis barbae. J Invest Dermatol, (2004). A145 Differenzierung Normaler und Neoplastischer Epidermis [14] Jave-Suarez LF, Winter H, Langbein L, Rogers MA, Schweizer J.: HOXC13 is involved in the regulation of human hair keratin gene expression. J Biol Chem 277, (2002). [15] Jave-Suarez L, Langbein L, Winter H, Schweizer J. Androgen regulation of the human hair follicle: The type II hair keratin hha7 is a direct target gene in trichocytes. J Invest Dermatol, 122, (2004). [16] Cribier B*, Peltre B*, Grosshans E, Langbein L, Schweizer J.: On the regulation of hair keratin gene expression: Lessons from studies in pilomatricomas.j Invest Dermatol, 122, (2004).

89 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A150 Systembiologie der Signaltransduktion Sytembiologie der Signaltransduktion (A150) Leiterin: PD Dr. U. Klingmüller Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Achim Heinrich (7/03-) Dr. Sergey Yazynin (7/03-1/04) (GIF) Doktoranden Marcel Schilling (7/03-) Verena Becker (7/03-) Technische Assistentin Ute Baumann (7/03-) Diplomanden Anna Geist (7/03-) Sebastian Bohl (8/03-) Der dynamische Prozess der Neubildung hoch spezialisierter reifer Zellen aus multipotenten Stammzellen wird durch eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren kontrolliert, die durch Bindung an Rezeptoren komplexe Signalübertragungsnetzwerke aktivieren. Eine Fehlregulation dieser Vorgänge führt zu Krankheiten wie z. B. Krebs. Wir untersuchen im hämatopoetischen System am Beispiel der erythroiden Linie Kontrollmechanismen der Signaltransduktion, die Proliferation und terminale Differenzierung erythroider Vorläuferzellen steuern. Die Komponenten verschiedener Signaltransduktionskaskaden sind biochemisch gut charakterisiert, aber über die zeitliche Kontrolle und räumliche Organisation der Informationsprozessierung ist noch wenig bekannt. Mit Hilfe eines systembiologischen Ansatzes, der quantitative und zeitaufgelöste Datenerhebung mit dynamischer Modellierung verbindet, konnten wir zeigen, dass Signalkaskaden ein zyklisches Verhalten zeigen können. Dieses Verhalten ermöglicht ein kontinuierliches Abfragen der Aktivierung von Zelloberflächen-Rezeptoren und die proportionale Umsetzung der Aktivierung in Zielgenaktivierung. Durch die Beobachtung von Signalleitungskomponenten in lebenden Zellen sind wir dabei, Prinzipen der räumlichen Organisation von Signalkaskaden zu entschlüsseln. Um die biologische Relevanz der in Zellinien gewonnen Erkenntnisse zu überprüfen, werden Untersuchungen in Primärzellen und im Mausmodell durchgeführt. Ziel dieser Studien ist es, das dynamische Verhalten von Signalleitungsnetzwerken vorherzusagen, um Ansatzpunkte für eine effiziente Intervention zu identifizieren und die gezielte Entwicklung neuer Therapiestrategien für die Krebsbekämpfung zu unterstützen. Dynamische Modellierung von Signaltransduktionswegen M. Schilling, S. Bohl, U. Baumann, U. Klingmüller In Zusammenarbeit mit J. Timmer, Universität Freiburg Im Gegensatz zu bisher rein qualitativen Beschreibungen von Signalübertragungswegen sind quantitative Modelle notwendig, um zuverlässige Vorhersagen über das Verhalten eines Systems zu machen (Abbildung 1). Wir haben ein vier-dimensionales differenzielles Gleichungssystem aufgestellt, das den STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription)5 Aktivierung-Inaktivierungszyklus quantitativ beschreibt [4, 6, 8]. Dabei beruhen die dynamischen Parameter der Gleichungen auf simultan erhobenen experimentellen Daten. Durch dynamische Modellierung konnten wir zeigen, dass STAT5 multiple Aktivierungszyklen durchläuft und für diesen Vorgang der effiziente Kernexport eine wesentliche Rolle spielt, eine Beobachtung, die wir experimentell bestätigen konnten. Das zyklische Verhalten der STAT5-Signaltransduktionskaskade erlaubt eine kontinuierliche Kopplung der Rezeptoraktivierung mit der Transkription von Zielgenen und daher einen raschen, fein abgestimmten Informationsfluss von der Zelloberfläche in den Zellkern. Diese Untersuchungen zeigen, dass durch mathematische Modellierung völlig neue und unerwartete Aspekte der Signaltransduktion identifiziert werden können. Auf der Basis dieser Arbeit sind wir dabei weitere Signalübertragungskaskaden mathematisch zu beschreiben. In vivo Bedeutung von Signaltranduktionsmolekülen A. Heinrich, A. Geist, U. Klingmüller In Zusammenarbeit mit B.G. Neel (Harvard Medical School, USA), L. Hennighausen (NDDK/NIH, USA) und R. Kemler (Max-Planck- Institut für Immunbiologie, Freiburg) Für die biochemische Charakterisierung von Signalübertragungswegen sind Zelllinien ein sehr nützliches Modellsystem. Da aber in Zelllinien zentrale Mechanismen der Wachstumskontrolle und Differenzierung inaktiviert sind, ist es äußerst wichtig, die biologische Bedeutung von Signalübertragungswegen in primären Zellen zu überprüfen. Durch die Expression von dominant negativ oder konstitutiv aktiven Varianten von Signalübertragungsmolekülen in erythroiden Vorläuferzellen untersuchen wir die Rolle von Signalübertragungsmolekülen für die Reifung von Erythrozyten. Dazu haben wir deutlich verbesserte retrovirale Vektoren etabliert, die es uns ermöglichen, sehr rasch und effizient Transgene in Primärzellen zu exprimieren [1]. Um die Bedeutung von Signaltransduktionsvorgängen im Kontext eines Organismus zu analysieren, haben wir erfolgreich eine Maus hergestellt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in der erythroiden Linie exprimiert [10]. Durch Kreuzen dieser Mäuse mit Mäusen, die LoxP flankierte Gen-Loci für Signaltransduktionsmoleküle tragen, werden Signaltransduktionsmoleküle spezifisch in erythroiden Vorläuferzellen eliminiert. Dies ermöglicht es die Rolle von Signaltransduktionsmolekülen für die Erythropoese zu entschlüsseln. 89

90 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A150 Systembiologie der Signaltransduktion 90 Abbildung 1: Mathematische Modellierung der JAK-STAT Signalkaskade. Durch mathematische Modellierung experimenteller Daten konnte das zyklische Verhalten von STAT5 identifiziert werden, das durch weitere Experimente bestätigt werden konnte. Räumliche Organisation der Signaltransduktion V. Becker, U. Baumann, U. Klingmüller In Zusammenarbeit mit S. Kuppig (Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg) Um die räumliche Anordnung von Signalübertragungskomplexen und deren Veränderung als Folge der EpoR-Aktivierung sichtbarzumachen, haben wir Fusionsproteine zwischen grün fluoreszierendem Protein (GFP) und EpoR hergestellt. Die biochemische und funktionelle Charakterisierung dieser Fusionsproteine ergab, daß fluoreszenzmarkierte EpoRs in ihrer biologischen Kompetenz nicht beeinträchtigt sind [2]. Durch genetischen knock-in in embryonalen Stammzellen sind wir dabei diese Moleküle in der Maus zu exprimieren. Außerdem werden Methoden im Labor etabliert, die räumliche Annährung von Proteinen durch Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) in lebenden Zellen zu quantifizieren. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] R. Ketteler, *S. Glaser, O. Sandra, *U. M. Martens, and U. Klingmüller. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy 9 (2002) [2] R. Ketteler, A. C. Heinrich, J. K. Offe, V. Becker, *J. Cohen, *D. Neumann, and U. Klingmüller. A Functional GFP-Tagged Erythropoietin Receptor Despite Separation of JAK2 Binding Sites and Tyrosine Residues. J. Biol. Chem. 277 (2002) [3] R. Ketteler, C. Moghraby, J. G. Hsiao, O. Sandra, *H. F. Lodish and U. Klingmüller. The cytokine-inducible SH2 domain containing protein CIS negatively regulates signaling by promoting apoptosis in erythroid progenitor cells. J. Biol. Chem. 278 (2002) [4] I. Swameye, *T. G. Müller, *J. Timmer, O. Sandra, and U. Klingmüller. Identification of nucleocytoplasmic cycling as a remote sensor in cellular signalling by data-based dynamic modeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) [5] *J. Cohen, *L. Oren-Young, U. Klingmüller, and *D. Neumann. Protein tyrosine phosphatase 1B particitpates in down-regulation of erythropoietin receptor signaling. Biochem J. 15 (2004) [6] *T. G. Müller, I. Swameye, O. Sandra, U. Klingmüller, and *J. Timmer. (2004). Tests for cycling in a signalling pathway. In press in Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). [7] *D. Faller, U. Klingmüller, and *J. Timmer. (2004) Simulation methods for optimal experimental design in systems biology. In press in Simulation: Trans. Soc. Modeling Computer Simulation. [8] *J. Timmer, *T. G. Müller, I. Swameye, O. Sandra, and U. Klingmüller. Modeling the non-linear dynamics of cellular signal transduction. (2004). In press in International Journal of Bifurcation and Chaos. [9] *W. Ruan, V. Becker, U. Klingmüller, and *D. Langosch. (2004). The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membranespanning leucine zipper. In press in J. Biol. Chem. [10] A. C. Heinrich, *R. Pelanda, and U. Klingmüller. (2004). A Mouse Model for Visualization and Targeted Mutations in the Erythroid Lineage. Blood 104(3) (2004)

91 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A160 Redoxregulation Arbeitsgruppe Redoxregulation (A160) Leiter: Dr. Tobias Dick Doktoranden Ulla Schwertassek (6/03-) Alexandra Kienast (11/03-) Technische Assistenten Monique Beumer (5/03-) Redox-basierte Kontrollmechanismen sind auf fundamentale Weise an der Regulation der Zelle beteiligt, unter anderem an Proliferation, Differenzierung und Zelltod. Krebsentstehung, diverse andere Krankheiten und auch der Alterungsprozess gehen mit Veränderungen von zellulären Redoxzuständen einher. Die Forschungsaktivitäten unserer Arbeitsgruppe konzentrieren sich auf die Frage, wie die Funktion wichtiger Signalproteine durch Änderung des Redoxzustands reguliert wird. Wir konzentrieren uns dabei auf Redoxänderungen, die durch Oxidoreduktasen der Thioredoxinfamilie vermittelt werden. Einer unserer Schwerpunkte ist die Rolle von extrazellulärem Thioredoxin-1 als Wachstumsfaktor für normale und neoplastische Zellen. Wir untersuchen, welche Proteine auf Thioredoxine reagieren und wie deren Funktion durch die resultierenden Redoxveränderungen beeinflusst wird. Ebenso möchten wir besser verstehen, wie Thioredoxin selbst reguliert und regeneriert wird. Mit Blick auf die Proliferation von Tumorzellen interessieren uns auch für die Frage, wie mitogene Redoxsignale spezifisch inhibiert werden können. Ein weiteres Projekt beschäftigt sich mit einer Oxidoreduktase (ebenfalls aus der Thioredoxinfamilie), die an der Vermittlung einer immunologisch wichtigen Wechselwirkung beteiligt ist, der Bindung antigener Peptide an MHC- Peptidrezeptoren. Charakterisierung und funktionelle Analyse Thioredoxin-regulierter Proteine auf der Oberfläche von Lymphozyten U. Schwertassek, M. Beumer, T. Dick In Zusammenarbeit mit M. Schnölzer, DKFZ Thioredoxin-1 kann von verschiedenen Zelltypen aktiv sekretiert werden, beispielsweise von Antigen-präsentierenden Zellen während der T-Zell-Aktivierung. Darüber hinaus wird Thioredoxin-1 in vielen Fällen auch von Tumorzellen sekretiert. Außerhalb der Zelle wirkt Thioredoxin als Wachstumsfaktor und verstärkt die Wirkung bestimmter Cytokine. Die extrazelluläre Wirkung von Thioredoxin basiert auf seiner Redoxaktivität und kann nicht durch andere redoxaktive Moleküle ersetzt werden. Wir untersuchen, ob extrazelluläres Thioredoxin den Redoxzustand von Zelloberflächenrezeptoren oder sekretierter löslicher Faktoren so verändert, dass bestimmte Signaltransduktionswege aktiviert oder inhibiert werden. Insbesondere interessiert uns auch die Frage, ob thioredoxin-sekretierende transformierte Zellen ihre Sensitivität gegenüber Wachstumsfaktoren und Cytokinen durch autokrine Redoxmodulation erhöhen. Wir verwenden mehrere Ansätze um die extrazellulären Zielproteine auf der Oberfläche von Lymphozyten zu identifizieren. Einer dieser Ansätze basiert auf einer von uns entwikkelten Thioredoxin-Mutante, die ihre Zielproteine über eine Disulfidbrücke festhält (sog. mechanism based trapping, Abb. 1). Für ausgewählte Zielproteine soll untersucht werden, wie deren Funktion vom Redoxzustand beeinflusst wird. Abb.1: Beispiel für ein kovalentes Intermediat zwischen Thioredoxin und einem Substrat (Graphik erzeugt aus PDB 1CQH mit Chimera). Die intermediäre Disulfidbrücke wird beim mechanism based trapping stabilisiert. 91

92 92 Redoxregulation der MHC Klasse I Peptidbeladung A. Kienast, T. Dick In Zusammenarbeit mit F. Momburg, DKFZ Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Der Zusammenbau funktioneller MHC-I-Peptid-Komplexe im Endoplasmatischen Retikulum ist von zentraler Bedeutung für Entwicklung und Funktion des adaptiven Immunsystems. Die Beladung der MHC-Peptidrezeptoren mit antigenen Peptiden wird durch eine Gruppe von Hilfsproteinen gesteuert, diese bilden den sog. Peptidbeladungskomplex. Die Identifikation der Oxidoreduktase ERp57 als Bestandteil des Beladungskomplexes führte zu einer interessanten Frage: was macht eine thiol-abhängige Oxidoreduktase in einem Komplex, der auf die Zusammenführung von Peptiden und ihren Rezeptoren spezialisiert ist? Zuletzt gelang es uns innerhalb des Beladungskomplex spezifische Disulfidisomerisierungen zu beobachten [1]. Wir versuchen zu verstehen, wie Redoxreaktionen die Assoziation zwischen Rezeptor und Ligand organisieren. Zu diesem Zweck beobachten wir die Redoxzustände der Komponenten des Beladungskomplexes während des Peptidbeladungsvorgangs. Der zugrunde liegende Mechanismus könnte sich als ein allgemeines Prinzip redox-basierter Qualitätskontrolle im Endoplasmatischen Retikulum erweisen. A160 Redoxregulation Publikationen (früheres Labor) [1] Dick, T. P., Bangia, N., Peaper, D., and Cresswell, P. (2002). Disulfide bond isomerization and the assembly of MHC class I- peptide complexes. Immunity 16, [2] Dick, T. P., and Cresswell, P. (2002). Thiol oxidation and reduction in MHC class I-restricted antigen processing and presentation. Methods Enzymol 348, Abb. 2: Die redox-aktiven Komponenten des Peptidbeladungskomplex: Peptidrezeptor (hier HLA-B44), Tapasin und die Oxidoreduktase ERp57. Thiole sind als Kreise hervorgehoben. Unsere Aufmerksamkeit gilt insbesondere den hier grau markierten Thiolen, deren Rolle und Redoxzustand während der Peptidbeladung noch nicht definiert wurde. Disulfidbrücken mit definiertem Status sind durch durchgezogene rote Linien, potentielle Disulfidbrücken durch unterbrochene rote Linien dargestellt.

93 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A170 Molekulare Stoffwechselkontrolle Arbeitsgruppe Molekulare Stoffwechselkontrolle (A170) Leiter: Dr. Stephan Herzig Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Anja Krones-Herzig Technisches Personal Dagmar Metzger Die Arbeiten der im Oktober 2003 etablierten Arbeitsgruppe Molekulare Stoffwechselkontrolle beschäftigen sich mit transkriptionellen Kontrollmechanismen, die an der Regulation biochemischer Stoffwechselwege beteiligt sind und deren Dysfunktion zur Entstehung metabolischer Erkrankungen, wie Typ II Diabetes, Tumor-Kachexie oder Alterungsprozess, beitragen können. Durch gezielte, gewebespezifische Aktivierung oder De- Aktivierung einzelner Transkriptionsfaktoren in der Maus und die mechanistische Analyse ihrer transkriptionellen Aktivität mit Hilfe von DNA-Protein, Protein-Protein oder Gen-Promotor-Funktionsstudien in kultivierten Zellen werden die vom jeweiligen Faktor kontrollierten Zielgene identifiziert und die metabolische Funktion des Transkriptionsfaktors charakterisiert. Bei diesen Versuchen kommen insbesondere adenovirale Gen-Transfer-Systeme in Verbindung mit RNA-Interferenz-Technologie und DNA- Chip-Analysen zur Erstellung von Gen-Expressionsprofilen zum Einsatz. Vorausgehende Arbeiten konnten in dieser Hinsicht erfolgreich neue molekulare Regulatoren des Blutzuckerund Fettstoffwechsels identifizieren. Die weiterführende Charakterisierung dieser Faktoren im Rahmen der neu eingerichteten Arbeitsgruppe verspricht wertvolle Einblikke in die Pathogenese metabolischer Erkrankungen. Bestimmte Transkriptionsfaktor-Familien könnten so als neue Klasse von Kandidatengenen für die Manifestation von Hormon-abhängigen Stoffwechselerkrankungen und als prototypische Zielmoleküle für die Entwicklung alternativer Therapiekonzepte etabliert werden. Kontrolle der hepatischen Glucose-Produktion durch transkriptionelle Co-Aktivatoren A. Krones-Herzig, S. Herzig In Zusammenarbeit mit G. Schütz, DKFZ und Marc Montminy, Salk Institute, La Jolla, USA Die hepatische Gluconeogenese dient normalerweise der Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels in der Postresorptionsphase zur Versorgung lebenswichtiger Organe. Die Aktivierung des gluconeogenetischen Programmes beruht dabei auf dem Absinken des Plasma-Insulin-Spiegels und einem gleichzeitigen Anstieg gegen-regulatorischer Hormone, wie Glucagon und Glucocorticoiden. Unsere Arbeiten konnten zeigen, dass Glucagon die Gluconeogenese im wesentlichen durch die Protein Kinase A vermittelte Phosphorylierung des camp-responsiven Transkriptionsfaktors CREB aktiviert, der seinerseits die Expression gluconeogenetischer Schlüsselenzyme durch Induktion des Hormon-Rezeptor Co- Aktivators PGC-1 stimuliert. In Antwort auf Glucocorticoide aktiviert PGC-1 seinerseits den Glucocorticoid-Rezeptor und gewährleistet so die Kooperativität der camp- und Glucocorticoid-Signalwege bei der Induktion der Gluconeogenese. Die abnormale Aktivierung von PGC-1 durch CREB ist somit wesentlich für die überhöhte Glucose-Produktion im Typ II Diabetes verantwortlich und könnte daher entscheidend zum Phänotyp der Insulin-Resistenz und Hyperglykämie bei diabetischen Patienten beitragen [1]. Die Identifizierung von PGC-1 als zentralem Kontrollpunkt hepatischer Gluconeogenese stellte das erste Beispiel der Regulation eines metabolischen Programmes durch einen transkriptionellen Co-Aktivator dar. Neben PGC-1 konnten weitere Co-Faktoren identifiziert werden, die nach vorläufigen Befunden neuartige molekulare Redoxsensoren darstellen und an der Hormon- und Redox-abhängigen Regulation des Energie- Stoffwechsels beteiligt sind. Durch RNAi Gen-Knock-Down in Mäusen sowie intermolekulare Interaktionsstudien soll der funktionelle Beitrag dieser Co-Faktoren zur Regulation der Blutzuckerhomöostase näher untersucht werden. Da Abweichungen im zellulären Redoxsystem ein wesentliches biochemisches Merkmal metabolischer Störungen sind, sollen diese Untersuchungen zur Redoxsensitivität von transkriptionellen Co-Faktoren neuartige Mechanismen der molekularen Stoffwechselkontrolle aufdecken, deren Dysfunktion an der Pathogenese metabolischer Erkrankungen kausal beteiligt ist. 93 Kontrolle peripherer Insulin-Sensitivität durch molekulare Inhibitoren der Insulin-Signaltransduktion D. Metzger, S. Herzig In Zusammenarbeit mit K. Du, Tufts University, Boston, USA und R. Kulkarni, Joslin Diabetes Center, Boston, USA Primärer Defekt in der Pathogenese Hormon-abhängiger Stoffwechselstörungen ist die Entwicklung der Insulin-Resistenz peripherer Gewebe und die gleichzeitig übersteigerte Aktivierung gegen-regulatorischer Glucagon/cAMP- und Glucocorticoid-Signalwege. Auf molekularer Ebene basiert die Insulin-Resistenz dabei auf der fehlerhaften Kontrolle der Genexpression metabolischer Schlüsselenzyme. Insbesondere molekulare Defekte der Leber und des Fettgewebes tragen wesentlich zum Phänotyp der Dyslipidämie,

94 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie A170 Molekulare Stoffwechselkontrolle 94 Hyperglykämie und Glucose-Intoleranz im Zustand der Insulin-Resistenz bei. Unsere Untersuchungen konnten in dieser Hinsicht ein Homolog des tribbles (Drosophila) Proteins, TRB3, als neues Effektorprotein des camp-/hungersignalweges identifizieren: Durch direkte Bindung an die Protein Kinase Akt, einem wesentlichen Vermittler intrazellulärer Insulin-Wirkung, inhibiert TRB3 die Insulin-Signaltransduktion in der Leber. Wie PGC-1 ist die TRB3 Expression in diabetischen Mäusen dramatisch gesteigert und führt zu Hyperglykämie und Glucose- Intoleranz. Die Aktivierung von TRB3 scheint daher durch Inhibition des Akt-abhängigen Insulin-Signalweges in der Leber wesentlich zur Entwicklung der Insulin-resistenten Stoffwechsellage beizutragen [2]. Neben der PGC-1-abhängigen Induktion hepatischer Gluconeogenese sind Hungersignale, wie camp oder Glucocorticoide, zudem für die gleichzeitige Inhibition Insulin-abhängigen Lipid-Stoffwechsels verantwortlich. Wir konnten als molekulare Grundlage dieses Antagonismus die Repression des Kern-Rezeptors PPARγ durch den camp-responsiven Inhibitor HES-1 nachweisen. Da PPARγ als Effektor des Insulin-abhängigen Fett-Stoffwechsels in der Leber fungiert, repräsentiert HES-1 ein neues Beispiel für einen transkriptionellen Repressor der Insulin-Signalkaskade. Die chronische Aktivierung von HES-1 unter pathophysiologischen Bedingungen kann so zum Phänotyp der Hyperglykämie und Dyslipidämie bei Insulin-resistenten Patienten beitragen [3]. Neben der Leber ist insbesondere das Fettgewebe wesentlich am Erhalt peripherer Insulin-Sensitivität beteiligt. In Fortsetzung unserer Arbeiten soll in zukünftigen Studien daher insbesondere die physiologische Bedeutung der genannten Inhibitoren für den Energie-Haushalt extra-hepatischer Gewebe, insbesondere des Fettgewebes, ihre molekularen Wirkmechanismen sowie ihre Rolle für die Entwicklung peripherer Insulin-Resistenz aufgeklärt werden. Publikationen aus dem bisherigen Labor [1] Herzig, S., Long, F., Jhala, U.S., Hedrick, S., Quinn, R., Bauer, A., Rudolph, D., Schütz, G., Yoon, C., Puigserver, P., Spiegelman, B., and Montminy, M CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature 413: [2] Herzig, S.*, Du, K.*, Kulkarni, R., and Montminy, M TRB-3: a tribbles homolog that inhibits Akt/PKB activation by insulin in liver. Science 300: * Autoren trugen in gleichen Teilen zu dieser Arbeit bei. [3] Herzig, S., Hedrick, S., Morantte, I., Koo, S.-H., Galimi, F., and Montminy, M CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPARg. Nature 426:

95 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie V270 Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (V270) Leiter: Dr. Rüdiger Pipkorn Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit R. Pipkorn und M. Koch Die zentrale Peptidsyntheseeinheit wurde 1992 gegründet. Aufgabe der Einheit ist die Synthese unterschiedlichster funktionaler Peptide zur Durchführung von Studien zum Verständnis der Wechselwirkung von Struktur und Aktivität [2,3,11]. Spezielle Fragen hinsichtlich Identifiaktion von Anti- Epitopen innerhalb Proteinsequenzen können mittels individuell synthetisierter Peptide beantwortet werden. Dynamische zelluläre Prozesse auf DNA-, RNA- und auf Proteinebene [3,12,13] können mittels spezifischer funktionaler Peptideeinheiten simuliert und verstanden werden im Zusammenhang von inter-und intrazellulärem Transport von Proteineinheiten ( BioShuttle ) [5]. Moderne Diagnostikverfahren wie beispielsweise Molecular Imaging in der MRT bzw. PET sind mittels speziell synthetisierter Peptideinheiten möglich [1,10]. Molecular Modeling und Biocomputing Methoden an synthetischen Peptiden tragen zum Verständnis für Struktur und Funktion bei. Die Entwicklung von Therapieansätzen auf molekularer Ebene (Antisense- und Anti- Gen) ist in gleicher Weise zu verwirklichen. Die Synthese sämtlicher Peptide erfolgt vollautomatisiert auf dem AMS 422 Multiple Peptide Synthesizer (Abimed Analysentechnik) [6], Charakterisierung und Aufreinigung mit HPLC-, MALDI Massenspektrometrie-Methoden. Peptide für Drug Delivery (Functionale Peptide für Diagnostic & Therapy) Im Zusammenarbeit mit: K. Braun (E050), W. Waldeck (B045) und J. Debus (E050), DKFZ Der Transport von modernen Drugs durch biologische Membranen ist noch eine offene centrale pharmakologische Frage. Um diese Frage zu beantworten wurde ein neues Transportsystem entwickelt, genannt Bioshuttle, bestehend aus Transportprotein-Adressmolekül-Spacer-Wirkstoff (Abb. 1). Dieser Carrier besitzt hohe Variabilität zum Wirkstofftransport in einzelne Zellkompartimente. Durch Einsatz des neuen Transportsystems soll eine effektive Transkriptionskontrolle durch Hybridisieren von PNA mit DNS zum Blockieren der Fusionsbereiche der entsprechenden Gene erreicht werden. Geplant ist die Applikation verschiedener Peptid Nukleinsäuren (PNA) zur Behandlung verschiedener Krankheiten. Fortschritte auf dem Gebiet zur Untersuchung von Stoffwechselprozessen auf molekularer Ebene werden zunehmend Gegenstand wissenschaftlicher Diskussion und erfordern hochsensitive Kontrastmittel zur Bildgebung. Dazu sind intrazelläre Kontrastmittel notwendig. Das ACGT-Bio- Shuttle wurde zur intrazellären und zielzellspezifischen Bildgebung in der MR entwickelt. Die Synthese und Qualitätssicherung stellen mittlerweile hohe Anforderungen an die Analytik und machen neue Verfahren notwendig. Qualitätskontrolle Metall-komplexierter funktionaler Peptide. In Zusammenarbeit mit: W-D Lehman, R.Krüger, DKFZ B090 Gd-verstärkte Magnetresonanz (MR) ist ein weit verbreitetes Prinzip in der medizinischen Diagnostik. In diesem Zusammenhang wurden Gd-Komplex Substanzen mit Wirkorterkennung entwickelt (Abb. 2). Hier wird die Qualitätskontrolle derartiger multifunktionaler Wirkstoffe mittels einer kombinierten Element- und Massen-Spektrometrie beschrieben. Die untersuchten Peptidkonstrukte bestehen aus einem DTPA-Gd-Komplex-modul, einer Peptidnukleinsäuresequenz (PNA) mit hoher Affinität zur Ziel-RNA als Adressmodul zur Wirkorterkennung, sowie einem Modul, das den Transport vom Extrazellularraum in Cytoplasma erleichtert. Die Bestimmung der Molmassen der funktionalen Peptide erfolgte mit NanoESI-MS-Methoden, In den Proben konnten sowohl Signale für Gd-komplexierte als auch für unkomplexierte Moleküle gefunden werden. Die Validierung der ESI-MS Resultate erfolgte mittels LC-ICP high resolution Massenspektrometrie mit simultaner Detektion von S-32 und Gd-157. Monitoring von S-32 als Marker für den organischen Part der Moleküle war möglich durch die Präsenz der Di-Sulfidbrücke zwischen PNA und Transmembrantransportmodul. Die Kombination LC-ICP-MS und nanoesi- MS liefert die komplementäre Element- und Molekularinformation für eine exzellente Qualitätskontrolle Metallkomplexierter funktionaler Peptide. 95 Abb 1: Bioshuttle - Strukturschema Transport Modul S-S-Adress Modul Spacer Substanz Abb. 2

96 96 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Amyloid Aβ Homodimere erleichtern die Fibrillenbildung und erlauben die Herstellung konformationsspezifischer Antikörper mit Aβ Dimeren als Antigen Zusammenarbeit FU Berlin, Inst. Für Biochemie, Gerd Multhaup. Die Entstehung des Aβ Peptids aus dem Vorläuferprotein APP stellt einen ersten Schritt der Pathogenese dar, die schliesslich mit der Bildung der für die Alzheimer Krankheit typischen Plaques endet. Lösliche Aβ Oligomere, die auch innerhalb von neuronalen Zellen vorkommen, sind bereits als Dimere stabil und finden sich als SDS-stabile Dimere in humanem Hirngewebe. Die Umwandlung des Aβ in fibrilläre Aggregate ist ein energetisch und strukturell weitgehend unverstandener Prozess. Deshalb haben wir spektroskopische Untersuchungen mit dimeren Aβ Peptiden durchgeführt. Das dimere Peptid Aβ42 zeigte gegenüber dem Monomer eine ausgeprägte β-faltblatt Struktur. Der Anteil der über eine Schwefelbrücke erzeugten Dimere war doppelt so hoch wie der von monomeren Formen. Die zusätzlichen Reste Ile-41 und Ala-42 des Aβ42 trugen etwa 30% zum β-faltblattanteil bei. Obwohl das nach α- und γ-sekretase Spaltung entstehende p3 Fragment in frühen Plaques gefunden wird, konnte hier die erzwungene Dimerisierung keine Verstärkung der β- Faltblattstruktur induzieren. Im Gegensatz zum Aβ bildeten sich aus dem dimeren Peptid p3/17-42 kleinere granuläre Partikel als aus dimeren p3/40 Peptiden. Die durchschnittliche Länge der aus p3/17-42 Peptiden gebildeten Fibrillen betrug 2,5µm. Die Untersuchung dimerer Peptide ist wichtig, da Dimere einen Aggregationskeim darstellen, der schliesslich zur Plaquebildung führt. Ausserdem ist es uns gelungen, mit den beschriebenen dimeren Aβ Peptiden polyklonale Antikörper herzustellen, die konformationsspezifisch sind und preferentiell die β-faltblattstruktur erkennen. Diese Antikörper könnten damit in monoklonaler Form als diagnostisches und therapeutisches Werkzeug dienen. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] Heckl S, Debus J, Jenne J, Pipkorn R, Waldeck W, Spring H, Rastert R, von der Lieth CW, Braun K. CNN-Gd 3+ enables cell nucleus molecular imaging of prostate cancer cells: the last 600 nm. Cancer Res Dec 1;62(23): [2] *Simons A, *Ruppert T, *Schmidt C, *Schlicksupp A, Pipkorn R, Reed J, *Masters CL, *White AR, *Cappai R, *Beyreuther K, *Bayer TA, *Multhaup G. Evidence for a copper-binding superfamily of the amyloid precursor protein. Biochemistry Jul 30;41(30): [3] *Multhaup G, *Scheuermann S, *Schlicksupp A, *Simons A, *Strauss M, *Kemmling A, *Oehler C, *Cappai R, Pipkorn R, *Bayer TA. Possible mechanisms of APP-mediated oxidative stress in Alzheimer s disease. Free Radic Biol Med Jul 1;33(1): Review. [4] *Jochum A, *Jackson D, *Schwarz H, Pipkorn R, *Singer- Kruger B. Yeast Ysl2p, homologous to Sec7 domain guanine nucleotide exchange factors, functions in endocytosis and maintenance of vacuole integrity and interacts with the Arf-Like small GTPase Arl1p. Mol Cell Biol Jul;22(13): [5] Braun K, Peschke P, Pipkorn R, *Lampel S, Wachsmuth M, Waldeck W, *Friedrich E, Debus J. A biological transporter for the delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclear compartment of living cells. J Mol Biol Apr 26;318(2): [6] Pipkorn R, *Boenke C, *Gehrke M, *Hoffmann R. Highthroughput peptide synthesis and peptide purification strategy at the low micromol-scale using the 96-well format. J Pept Res Mar;59(3): V270 Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit [7] *White AR, *Multhaup G, *Galatis D, *McKinstry WJ, *Parker MW, Pipkorn R, *Beyreuther K, *Masters CL, *Cappai R. Contrasting, species-dependent modulation of copper-mediated neurotoxicity by the Alzheimer s disease amyloid precursor protein. J Neurosci Jan 15;22(2): [8] Pipkorn R, Waldeck W, Braun K. Synthesis and application of functional peptides as cell nucleus-directed molecules in the treatment of malignant diseases. J Mol Recognit Sep- Oct;16(5): [9] Salek M, Alonso A, Pipkorn R, Lehmann WD. Analysis of protein tyrosine phosphorylation by nanoelectrospray ionization high-resolution tandem mass spectrometry and tyrosine-targeted product ion scanning. Anal Chem Jun 1;75(11): [10] Heckl S, Pipkorn R, Waldeck W, Spring H, Jenne J, von der Lieth CW, Corban-Wilhelm H, Debus J, Braun K. Intracellular visualization of prostate cancer using magnetic resonance imaging. Cancer Res Aug 15;63(16): [11] Schmechel A, Zentgraf H, Scheuermann S, Fritz G, Pipkorn R, Reed J, *Beyreuther K, *Bayer TA, *Multhaup G. Alzheimer beta-amyloid homodimers facilitate A beta fibrillization and the generation of conformational antibodies. J Biol Chem Sep 12;278(37): [12] Braun K, Wolber G, Waldeck W, Pipkorn R, Jenne J, Rastert R, Ehemann V, Eisenmenger A, Corban-Wilhelm H, Braun I, Heckl S, Debus J. The enhancement of neutron irradiation of HeLa-S cervix carcinoma cells by cell-nucleus-addressed deca-pboronophenylalanine. Eur J Med Chem Jun;38(6): [13] *Forsman A, *Uzameckis D, *Ronnblom L, *Baecklund E, *Aleskog A, *Bindra A, Pipkorn R, *Lejniece S, *Kozireva S, *Murovska M, *Blomberg J. Single-tube nested quantitative PCR: a rational and sensitive technique for detection of retroviral DNA. Application to RERV-H/HRV-5 and confirmation of its rabbit origin. J Virol Methods Jul;111(1):1-11. [14] *Strausak D, *Howie MK, *Firth SD, *Schlicksupp A, Pipkorn R, *Multhaup G, *Mercer JF. Kinetic analysis of the interaction of the copper chaperone Atox1 with the metal binding sites of the Menkes protein. J Biol Chem Jun 6;278(23):

97 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Übersicht Forschungsschwerpunkt Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Sprecherin: Prof. Dr. (PhD) Annemarie Poustka Medizinische und Biologische Informatik (B010) Prof. Dr. sc.hum. Hans-Peter Meinzer Tel.: , FAX H.P.Meinzer@DKFZ.de Molekulare Biophysik (B020) Prof. Dr. rer. nat. Sándor Suhai Tel.: , FAX S.Suhai@DKFZ.de Tumorgenetik (B030) Prof. Dr. rer. nat. Manfred Schwab Tel.: , FAX M.Schwab@DKFZ.de Biophysik der Makromoleküle (B040) Prof. Dr. rer. nat. Jörg Langowski Tel.: , FAX Joerg.Langowski@DKFZ.de Molekulare Genomanalyse (B050) Prof. Dr. habil. (PhD) Annemarie Poustka Tel.: , FAX A.Poustka@DKFZ.de Molekulare Genetik (B060) Prof. Dr. rer. nat. Peter Lichter Tel.: , FAX Peter.Lichter@DKFZ.de Funktionelle Genomanalyse (B070) Dr. rer. nat. Jörg Hoheisel Tel.: , FAX J.Hoheisel@DKFZ.de Theoretische Bioinformatik (B080) Dr. rer. nat. Roland Eils Tel.: , FAX R.Eils@DKFZ.de Zentrale Spektroskopie (B090) William E. Hull PhD Tel.: , FAX W.Hull@DKFZ.de Zentrale Proteinanalytik (B100) Dr. rer. nat. Martina Schnölzer Tel.: , FAX M.Schnoelzer@DKFZ.de Um eine effizientere Zusammenarbeit sämtlicher im engeren Sinne der Genomforschung zuzuordnenden Abteilungen zu gewährleisten, wurden 1996 die Aktivitäten zur Genlokalisation, der genetischen Kartierung, der Bioinformatik und vor allem der funktionellen Analyse krebsrelevanter Genombereiche, die bis dahin auf verschiedene Forschungsschwerpunkte verteilt waren, im Forschungsschwerpunkt Genomforschung und Bioinformatik zusammengefaßt. Die theoretisch arbeitenden Arbeitsgruppen des Schwerpunkts verbinden ihre Ansätze aus der Mathematik, Statistik, Physik und Informatik mit computergestützten Simulationsverfahren und schlagen dadurch eine Brükke zwischen diesen theoretischen Disziplinen und den experimentellen Arbeitsrichtungen der Krebsforschung. Durch Kooperationen mit zahlreichen Abteilungen des DKFZ finden die methodischen Entwicklungen des Schwerpunktes direkten Einsatz in der molekularen und genomischen Strukturforschung, in der Krebsdokumentation und in der medizinischen Bildverarbeitung. In der Abteilung Molekulare Genetik werden die zweiund dreidimensionale Struktur des menschlichen Genoms sowie die tumorspezifischen Veränderungen dieser Struktur untersucht. Die räumliche Organisation des Genoms innerhalb der Zellkerne wird in Beziehung zur Genexpression, d.h. in Hinsicht auf eine funktionelle Zellkernarchitektur, untersucht. Die Analyse von tumorassoziierten genomischen Veränderungen zielt auf die Identifikation von genetisch definierten Krankheitssubentitäten und auf die Isolation und Charakterisierung von pathogenetisch relevanten Genen mit onkogenem Potential. Ein wichtiger Aspekt ist auch die Entwicklung neuer Methoden mit Schwerpunkt auf DNA-Chip-Technologie für die Analyse genomischer Imbalancen. Ziel der Abteilung Molekulare Genomanalyse ist die systematische Erforschung der molekularen Ursachen menschlicher Krankheiten. Der Schwerpunkt liegt hierbei auf Krebserkrankungen. Das Verständnis monogener und komplexer Krankheitsprozesse wird durch die detaillierte funktionelle Analyse menschlicher Gene und ihrer Genprodukte fortschreitend erweitert. Hochdurchsatztechnologien zur funktionellen Genomik und Proteomik werden in der Abteilung gezielt entwickelt und ständig optimiert, die in Experimenten gewonnenen Daten durch Einsatz integrierter Bioinformatik ausgewertet und analysiert. In der Abteilung wurde eine Funktions-Pipeline etabliert, die von der Identifizierung potentiell krankheitsrelevanter Gene mittels cdna-microchips und Genexpressionsprofilen, über die systematische Sequenzanalyse humaner Gene (Deutsches cdna Konsortium), bis zur Herstellung automatisierter zellulärer Testsysteme zur funktionellen Charakterisierung der Genprodukte reicht. Die öffentlich zugängliche Datenbank LIFEdb wurde entwickelt, um die hier generierten Informationen der Wissenschaftsgemeinschaft zur Verfügung zu stellen. Die Arbeiten der Abteilung Funktionelle Genomanalyse zielen auf die Entwicklung und unmittelbare Anwendung neuer Technologien zur Produktion und Prozessierung biologischer Information auf ganz-genomischer Ebene mit dem Ziel einer Beschreibung und Analyse der zellulären Umsetzung der genetischen Information und der Regulation dieser Vorgänge. Ein Schwerpunkt liegt dabei im Gebiet der 97

98 98 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung DNA-, Protein- und Peptid-Microarrays. Dabei werden biophysikalische und chemischen Fazetten der Chipherstellung sowie Gesichtspunkte der Datenanalyse weiter entwickelt, um durch das grundlegende Verständnis methodischer Aspekte verbesserte Analyseverfahren zu etablieren. Aufbauend auf den rein technischen Entwicklungen werden die Methoden unmittelbar in biologisch und biomedizinisch motivierten Studien angewandt, die an zahlreichen Organismen durchgeführt werden. Hinsichtlich der Analyse von menschlichem Probenmaterial werden - mit dem Schwergewicht im Bereich bestimmter Tumore - Systeme zur Frühdiagnose, Krankheitsprognose und zur begleitenden Analyse des Behandlungserfolgs etabliert. Viele der Projekte werden im Rahmen nationaler oder internationaler Kooperationen und Programme durchgeführt. Neben anderen Anwendungen arbeiten wir im Bereich der molekularen Epidemiologie zum Beispiel an der Identifizierung und anwendungsbezogenen Umsetzung von krankheitsrelevanten Einzelbasenaustauschen ( single nucleotide polymorphisms ; SNPs). Gleichzeitig wird die Genotypisierung bestimmter pathogener Organismen und Viren verfolgt. Die Analyse epigenetischer Variationen ist ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten. Vergleichende Studien von Veränderungen in den Transkriptmengen aller Gene und der tatsächlichen Proteinexpression mit Blick auf die sich daraus ergebenden (phänotypischen) Konsequenzen sind ebenfalls im Gange und werden weiter vertieft. Dazu werden auch neuartige Prozesse wie Verfahren zur Selektion relevanter Sensormoleküle entwickelt, die beispielsweise die Bereitstellung von Bibliotheken hoch-affiner und spezifischer Antikörper erlauben. Die Abteilung ist im kleineren Maße auch noch in der Kartierung und Sequenzierung ganzer Genome aktiv. Diese Arbeiten stellen meist einen Vorlauf für weitergehende funktionelle Analysen dar. Ein weiteres Ziel ist die Etablierung neuartiger Methoden zur Untersuchungen der Korrelation von DNA-Struktur und Enzymaktivität, mit Perspektiven in der reinen Analytik und dem grundlegenden Verständnis von Protein-Nukleinsäure Wechselwirkungen. Die Forschung der Abteilung Tumorgenetik zielt auf die Ermittlung des Beitrages genetischer Veränderungen zu humanen Krebserkrankungen ab. Dabei spielen sowohl strukturelle Analysen von Chromosomen- und Genveränderungen wie auch funktionelle Veränderungen der Biochemie der Genfunktion eine Rolle. Der Schwerpunkt zukünftiger Arbeiten wird zum einen auf der Analyse des kindlichen Nervenzellkrebses, des Neuroblastoms, zum anderen auf Untersuchungen hereditärer und sporadischer Formen von Colon- und Brustkrebs liegen. Bei Colontumoren gelang der Abteilung der Nachweis eines Tumormodifikationslokus in 1p35, dessen Analyse Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein wird. Die Abteilung Molekulare Biophysik untersucht molekulare und genomische Strukturprobleme mit Hilfe biophysikalischer und computerwissenschaftlicher Methoden und entwickelt computergestützte Simulationsverfahren für ihre Modellierung auf den genomischen, molekularen und elektronischen Ebenen. Auf der phänomenologischen Ebene der Genomforschung konzentriert sie sich auf die Ausarbeitung eines integrierten Datenmodells für die Darstellung aller relevanten Daten für die komplexen Genome höherer Organismen (topologische und genetische Genomkarten, molekulare Sequenz- und Strukturdaten, klinische Daten für krankheitsbezogene Gene usw.), und für die Entwicklung neuer Methoden zur Analyse genomischer Übersicht Sequenzdaten. Diese Aktivitäten bilden einen Teil des europäischen Projektes zur Entschlüsselung des menschlichen Genoms, und die Abteilung entwickelt und pflegt das European Data Resource for Human Genome Analysis am DKFZ. Auf der molekularen Ebene werden artifizielle neuronale Netze, genetische Algorithmen und moleküldynamische Simulationsverfahren entwickelt und zur Modellierung der Raumstruktur von Genprodukten eingesetzt. Das Ziel dieser Forschung ist, aufgrund der genomischen DNA bzw. Aminosäuresequenz durch neuronale Netze zuverlässige Sekundär- und Tertiärstrukturvoraussagen für verschiedene Eiweißmoleküle zu erhalten, und mit Hilfe dieser Strukturdaten Simulationen zu ihrer biologischen Funktion durchzuführen. Die Abteilung arbeitet auch an der Weiterentwicklung mikrophysikalischer Methoden zur Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen in Biopolymeren (DNA- Protein, Protein-Ligand usw.) und verwendet sie zur Simulation spezifischer molekularer Vorgänge in Zusammenarbeit mit verschiedenen experimentellen Gruppen am DKFZ. Das Hauptziel der Arbeit der Abteilung Biophysik der Makromoleküle ist es, die Mechanismen von intramolekularen Wechselwirkungen in großen DNA-Molekülen und deren biologische Bedeutung für die Regulation der Genexpression zu verstehen. Anhand des Modellsystems superhelikaler DNA von einigen kb-größe konnte der experimentell beobachtete Effekt von lokaler DNA-Krümmung erklärt werden. Die strukturelle Basis der sequenzabhängigen DNA- Krümmung wird derzeit mit Hilfe von Zirkulardichroismus und depolarisierter dynamischer Lichtstreuung untersucht. Die in der Abteilung vorhandenen Methoden sind auch für die Untersuchung anderer großer Biomoleküle von Bedeutung; so können z.b. dynamische Lichtstreuung und analytische Ultrazentrifugation für die Messung der Dimensionen der Aggregation und der internen Bewegungen filamentöser Proteine oder für die Optimierung der Kristallisation von Biomolekülen verwendet werden. Die Abteilung Medizinische und Biologische Informatik arbeitet zum einen an Problemen der medizinisch digitalen Bildverarbeitung zur Unterstützung von Diagnose und Therapie wie auch an der Computersimulation von komplexen biologischen Prozessen. Nachdem das Problem der Visualisierung medizinischer Objekte (Organe) aus CT-, MR- und Ultraschallbildquellen verstanden ist, muß es nun in die klinische Routine eingebettet werden. Dazu arbeitet die Gruppe an der Beschleunigung der Bildberechnung durch Parallelisierung und der interaktiven Steuerung der Visualisierungs- und Segmentationsprozesse (Projekt EVIMED). Die Kooperation verschiedener Radiologen, Chirurgen und spezialisierter Bildverarbeiter wird im Projekt MEDICUS vorangetrieben. Gegenstand der Aktivitäten der Gruppe Simulation biologischer Prozesse ist die Untersuchung der Zellpopulationsdynamik des Epithels der interstinalen Krypte. Das Ziel der Untersuchungen ist das Verständnis der strukturellen und funktionellen Organisation des hochproliferativen Gewebes. Die Abteilung Theoretische Bioinformatik arbeitet an der Entwicklung von Technologien in der Bioinformatik und der computergestützten Biologie zur Interpretation komplexer Daten, die durch analytische Prozesse in der Molekulargenetik und Zellbiologie entstehen. In jüngster Zeit ist eine immer größer werdende Menge an Hochdurchsatz- Systemen in der Molekular- und Zellbiologie entwickelt worden. Während in den vergangenen zehn Jahren die meisten dieser Techniken der Sequenzierung des menschlichen Genoms und anderer Organismen galten, sind in jüng-

99 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Übersicht ster Zeit Techniken entstanden, die einen Zusammenhang zwischen genomischer Struktur und Funktion herstellen. Ein Beispiel hierfür ist die DNA-Chip- Technologie, welche das Screening des Expressionslevels aller Gene eines Organismus bei unterschiedlichen Bedingungen in einem Experiment erlaubt. Mit dieser Technologie ist die Untersuchung der genetischen Wirkungsweise bestimmter Medikamente möglich geworden, womit gleichzeitig eine Optimierung der Entwicklung neuer Medikamente und Therapien erreicht werden konnte. Hochdurchsatz-Techniken erzeugen eine immense Datenmenge, die ohne computergestützte Analyse kaum oder gar nicht analysiert werden kann. Die Entwicklung computergestützter Methoden zur Analyse komplexer Daten in der Molekularbiologie und die Entwicklung von Modellen und computerunterstützter Methoden in der Zellbiologie stellen den Kern der Forschung in der im Jahre 2000 am DKFZ etablierten Arbeitsgruppe dar. In der Zentralen Spektroskopie (ZS) wird, neben der routinemäßigen analytischen Dienstleistung (Aufklärung von Molekülstrukturen mittels Kernspinresonanz (NMR), Massenspektrometrie (MS) sowie IR- und UV-Spektroskopie), an der Entwicklung und Anwendung neuer Analyse- Verfahren in der Krebsforschung gearbeitet. Die Schwerpunkte der MS-Anwendungen sind Phospholipid-, Proteinund Peptidanalytik. Mit der MR-Spektroskopie bzw. Hochfeld-MR-Bildgebung in vivo werden u.a. Pharmakokinetik, Tumormetabolismus und Metastasenwachstum untersucht. Im Bereich molecular modeling wird ein computerisiertes Informationssystem bereitgestellt und Untersuchungen zur Konformation und Dynamik von Oligosacchariden und Glykoproteinen, sowie über denen Wechselwirkungen werden durchgeführt. Aufgabenschwerpunkt der Zentrale Proteinanalytik ist die Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung von Proteinen und Peptiden im Subpikomol-Bereich. Für diese Aufgaben werden überwiegend moderne massenspektrometrische Methoden wie MALDI-MS und Electrospray-MS gekoppelt mit nanohplc-techniken eingesetzt. Um den Probendurchsatz zu erhöhen, soll die Probenvorbereitung für die MS-Analyse in verstärktem Maß durch den Einsatz von Robotern automatisiert werden. Die Identifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen in Proteinen werden im Rahmen von Kooperationen mit Arbeitsgruppen des DKFZ durchgeführt. In Kooperation mit klinischen Partnern in Berlin und Mannheim werden Proteomprojekte bearbeitet, um diejenigen Proteine in verschiedenen Tumorzelllinien zu identifizieren, die an der Entwicklung von Chemoresistenz beteiligt sind. 99

100 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik Abteilung Medizinische und Biologische Informatik (B010) Leiter: Prof. Dr. sc. hum. Hans-Peter Meinzer 100 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Uwe Engelmann Dr. Volker Braun* Dipl.Inform.Med. Peter Hassenpflug* Dipl.Inform.Med. Marco Nolden* Dipl.Inform.Med. Tilman Schweitzer* Dipl.Ing. Marcus Vetter* Dipl.Inform. Andre Schröter* Postdocs Dipl.Inform.Med. Matthias Thorn Dr. Ivo Wolf Sekretariat Irmhild Kocks Techn. Mitarbeiter Thomas Wolf Doktoranden* Dipl.Inform. Thomas Böttger Dipl.-Inf. Dipl.Ing. (FH) Mark Hastenteufel Dipl.Ing. Rada Hussein Dipl.Inform.Med. Tobias Kunert Dipl.Inform.Med. Heiko Münch Dipl.Biol. Ute Platzer Diplomanden* Carsten Christoph Amir Eid Tobias Heimann Rolf Lohaus Jochen Neuhaus Max Schöbinger Christian Sonek Mehmed Ali Ucar Ingmar Wegner Baris Yalcin Siwei Yang Auszubildende Carsten Fertig Sven Heisler Thomas Williamson *Finanzierung über Projektmittel Der Begriff Medizinische Informatik (MI) ist sehr weit gefasst und umspannt alles, was mit der Informationsverarbeitung in medizinischen Anwendungen zu tun hat. Die Anfänge der MI gehen auf die Anfänge der 60er Jahre zurück. Eines der acht Gründungsinstitute des DKFZ in jenen Jahren war deshalb folgerichtig auch dieser thematischen Ausrichtung gewidmet. Die Vorläufer der MI sind biomathematische Arbeiten, u.a. angewandte Statistik (z.b. Epidemiologie) und angewandte Mathematik (z.b. Simulation biologischer Experimente). Das wichtigste Arbeitsgebiet der damals jungen MI war die medizinisch-klinische Datenerfassung und -verarbeitung in Richtung Krankenhausinformationssystem (KIS). In den 70ern entwickelte sich eine zweite große Ausrichtung innerhalb der MI: die Signalverarbeitung (EKG, EEG, Bildverarbeitung). Seither ist die MI aufgrund der verwendeten Techniken, Ausbildungen und Anwendungen in der medizinischen Versorgung umfassend und unabdingbar multidisziplinär wie kaum eine andere wissenschaftliche Fachrichtung. Folgerichtig arbeiten heute unter dem Dach der Medizinischen Informatik Mediziner, Naturwissenschaftler und Ingenieure zusammen, oft auch mit doppelten akademischen Ausbildungen. Die Medizinische Informatik ist an den Fakultäten der theoretischen Medizin angesiedelt und leistet nicht nur in der Administration im Gesundheitswesen, sondern auch in Forschung, Diagnostik und Therapie einen wertvollen Beitrag. Die Bioinformatik beschäftigt sich mit der Klärung biologischer Fragestellungen mit Methoden der Informatik. Vor allem wird darunter die Analyse der durch die fortgeschrittene Technik in der Molekularbiologie immer größer werdenden Datenmengen, u.a. Sequenzdaten, verstanden. Des Weiteren gehören aber auch die Analyse und Simulation biologischer Prozesse, wie zum Beispiel Entwicklungsvorgänge, dazu. Die Computersimulation ermöglicht das schnelle und kostengünstige Testen von Hypothesen, die im Experiment nur schwer zu untersuchen sind. Mathematische Modelle biologischer Prozesse führen oft zu einer formalisierten Darstellung komplexer biologischer Sachverhalte, die dann durch eine Computeranalyse leichter durchschaut werden können. Seit ihren Ursprüngen hat sich die Bioinformatik von einer reinen Hilfswissenschaft zu einer selbständigen Forschungsdisziplin entwickelt, in der Informatiker und Biologen, aber auch Mathematiker, Physiker und Chemiker beschäftigt sind.

101 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Virtuelle Planung von Leberresektionen M. Thorn, M. Schöbinger, T. Heimann, B. Yalcin, C. Sonek, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. M. W. Büchler, Dr. P. Schemmer, PD. Dr. W. Lamadé, PD Dr. W. Uhl, Dr. L. Fischer, Chirurgische Universitätsklinik Heidelberg, Prof. Dr. G. Kauffmann, Dr. G.M. Richter, L. Grenacher, Abt. Radiodiagnostik, Chirurgische Universitätsklinik Heidelberg. Ziel des Projektes ist die computer-unterstützte Planung einer Teilentfernung (Resektion) der Leber und die Unterstützung der Leber-Lebendspende. Hierdurch soll sowohl die Auswahl der Patienten durch quantitative Angaben über das geschätzte Operationsrisiko objektiviert werden als auch die eigentliche Operation selbst unterstützt werden. Grundlage für diese präoperative Analyse sind die in der Routine aufgenommenen Computertomographie- (CT) bzw. Magnetresonanztomograhiedaten (MR) [1, 2]. Die bei der Operation verfolgte Strategie hängt von der genauen Lage des zu entfernenden Tumors bzw. des zu spendenen Teilleber im Verhältnis zu den Gefäßbäumen der Leber ab. Je nach Art der Aufnahme werden in diesem Projekt der portale, beide venösen Gefäßbäume oder zusätzlich die intrahepatischen Gallenwege analysiert [3]. Hierfür wurden seit Beginn des Projekts Grundlagen für die quantitative und die qualitative Auswertung der Bilddaten entwickelt. Zu den qualitativen Aspekten zählt die dreidimensionale Visualisierung der Gefäßbaumstruktur, des Tumors, seines Sicherheitsbestandes und der Leberhülle sowie des Resektionsareals. Wichtige quantitative Größen sind die Volumenmessungen der Leber und des Tumors sowie die Abschätzung des nach der Operation verbliebenen gesunden Lebervolumens bzw. des Spendevolumens [4, 5]. Die Operationsstrategie wird am Bildschirm geplant und anhand der aktualisierten Volumenschätzungen beurteilt. Die Ergebnisse stehen dem Chirurgen intraoperativ über einen Touch-Screen-Monitor oder eine Projektion zur Verfügung, so dass während der Operation auf die dreidimensional rekonstruierten CT/MR-Daten und die entsprechenden Volumenauswertungen zugegriffen werden kann [6]. Der gesamte Arbeitsablauf wurde soweit optimiert, dass die vollständige Integration in die klinische Routine, von der Akquisition über die Aufbereitung der Daten und Präsentation bei der präoperativen strategischen Planung des Eingriffes bis hin zur intraoperativen Visualisierung der Ergebnisse, erreicht wurde. Ausserdem wurden Studien zur Validierung der Berechnungsergebnisse wie auch der Analyse der Ver- und Entsorgungsgebiete der Leber durchgeführt [7]. Die zukünftigen Entwicklungen zielen in Richtung der Erweiterung und weiterführenden Evaluierung des entwikkelten Systems. Dabei wird das System derart ausgebaut, dass das Planungsangebot internetbasiert weiteren chirurgischen Zentren zur Verfügung gestellt werden kann. Daneben ist die Verwendung der Software zur Durchführung von Studien zur Anatomie und Regenerationsfähigkeit der Leber am Tiermodell geplant. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Meinzer, H.-P., Thorn, M., Cárdenas, C.: Computerized planning of liver surgery - an overview. Computers & Graphics 26/4 (2002) Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik [2] Meinzer, H.-P., Thorn, M., Vetter, M., Hassenpflug, P., Hastenteufel, M., Wolf, I.: Medical Imaging: examples of clinical applications. ISPRS Journal of Photogrammetry & Remote Sensing 56 (2002) [3] *Fischer, L., Thorn, M., Chiu, P., *Grenacher, L., Meinzer, H.- P., *Lamadé, W.: Virtuelle Operationsplanung in der Leberchirurgie. Chir. Praxis 2003, 61: [4] *Kremer, M., Thorn, M., Schmied, B.M., *Schemmer, P., Meinzer, H.-P., *Richter, G.M., *Uhl, W., *Buechler, M.W., Z graggen, K.: 3D-Volumetrie in der Leberchirurgie: ein zuverlaessiges Hilfsmittel? Transplantationsmedizin Supplement (2003), S [5] Thorn, M., *Schemmer, P., Schöbinger, M., Schmidt, J., *Richter, G.M., *Uhl, W., *Büchler, M.W., Meinzer, H.-P.: Computergestützte Operationsplanung für die Leber- Lebendspende. Z Gastroenterol 2003, 41:610. [6] *Herfarth, C., *Lamadé, W., *Fischer, L., Chiu, P., Cárdenas, C., Thorn, M., Vetter, M., *Grenacher, L., Meinzer, H.-P.: The effect of virtual reality and training on liver operation planning. Swiss Surg. 2002;8(2): [7] *Fischer, L., Cárdenas, C., Thorn, M., Benner, A., *Grenacher, L., Vetter, M., Lehnert, T., Klar, E., Meinzer. H.-P., *Lamadé, W.: Limits of Couinaud s liver segment classification: a quantitative computer-based three-dimensional analysis. J Comput Assist Tomogr Nov-Dec;26(6): Evaluation und Einsatz von interaktiven Segmentierungsverfahren in der klinischen Routine I. Wolf, T. Böttger, T. Kunert, M. Nolden, T. Heimann, I. Wegner, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Prof. S. Hagl, Herzchirurgie, Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg, Prof. J. Mühling, PD Dr. Dr. S. Hassfeld, Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie mit Poliklinik, Heidelberg Im Rahmen des SFB 414 Informationstechnik in der Medizin - Rechner- und sensorgestützte Chirurgie stellt die Planung von chirurgischen Eingriffen sowohl im Herz- als auch im Kopfbereich eine wichtige Aufgabe dar. Dafür werden im hier beschriebenen Teilprojekt Segmentierungsverfahren für medizinische Bilddaten evaluiert und weiterentwickelt. Automatische Segmentierungstechniken versagen häufig. Aus diesem Grund ist es wichtig, dem Mediziner Werkzeuge in die Hand zu geben, die es ihm ermöglichen, den Segmentierungsprozess interaktiv zu beeinflussen. Eventuell auftretende Fehlsegmentierungen sollen einfach und schnell korrigiert werden können. Wichtigste Anforderung an solche Werkzeuge ist die intuitive und vor allem effiziente Bedienbarkeit. Unser Schwerpunkt liegt deshalb auf der Realisierung und der Verbesserung der interaktiven Bedienbarkeit solcher Segmentierungstools. Die in der Vergangenheit implementierten Segmentierungsalgorithmen wurden in ein gemeinsames PlugIn in das CHILI (Tele-)Radiologiesystem integriert und befinden sich somit in einer dem Radiologen vertrauten klinischen Arbeitsumgebung. Dabei wurde ein besonderes Augenmerk auf die einfache Erlernbarkeit und intuitive Bedienbarkeit der einzelnen Tools gelegt. Um die Bedienbarkeit und Effizienz solcher Werkzeuge objektiv beurteilen zu können, wurden Evaluationswerkzeuge entwickelt. Mit diesen lässt sich einerseits die Genauigkeit unterschiedlicher Segmentierungen des gleichen Objektes evaluieren, andererseits kann auch der Segmentierungsprozess als solcher evaluiert werden. Es können beispielsweise Aussagen darüber getroffen werden, welche Tools besonders häufig verwendet werden oder wieviel Zeit zur Erstellung einer kompletten 101

102 102 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Segmentierung benötigt wird. Anhand der auf diese Weise gewonnen Daten können die Segmentierungswerkzeuge verbessert und auch um neue ergänzt werden. Die im Bereich der Segmentierung medizinischer Bilder gesammelten Erfahrungen und die ständig wachsende Menge zu segmentierender Bilddaten (verbesserte Auflösung der bildgebenden Verfahren) und der damit verbundene immer noch sehr hohe Zeitaufwand machen es notwendig, die momentan vorhandenen schichtbasierten 2D-Segmentierungsverfahren durch neue 3D-Verfahren zu ergänzen. So wurde die Entwicklung von dreidimensionalen Segmentierungstools weiter vorangetrieben. Insbesondere wurde damit begonnen, die interaktive Kontrolle deformierbarer Modelle zu realisieren. Des Weiteren werden statistische Formmodelle auf ihre Anwendbarkeit hin - beispielsweise für die Segmentierung von Herzdaten - untersucht. Die untersuchten 3D-Methoden zeigen erste vielversprechende Ergebnisse und lassen somit die weitere Verbesserung des Segmentierungsprozesses erwarten. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Wolf, I., Hastenteufel, M., *De Simone, R., Vetter, M., Glombitza, G., *Mottl-Link, S., Meinzer, H.-P.: ROPES: A Semi-Automated Segmentation Method for Accelerated Analysis of Three-Dimensional Echocardiographic Data. IEEE Transactions on Medical Imaging, (accepted for publication) [2] Kunert, T., Cárdenas, C.E., *Diehl, S., *Duber, Ch., Meinzer, H.-P.: Problems of interactive segmentation, Biomed Tech (Berl) 2002;47 Suppl 1 Pt 2:933-5 [3] Kunert, T., Heiland, M., Meinzer, H.-P.: User-driven segmentation approach: interactive snakes, In: Sonka M, Fitzpatrick JM (Hrsg), SPIE Medical Imaging 2002: Image Proccessing, Bd. 4684, SPIE The International Society for Optical Engineering, Bellingham, , 2002 [4] Wolf, I., Eid, A., Vetter, M., Hassenpflug, P., Meinzer, H.-P.: Extension of 2D segmentation methods into 3D by means of Coons-patch interpolation. In Sonka M, Fitzpatrick JM (eds). Proc. SPIE Medical Imaging 2003: Image Processing, Vol. 5032, p (ISBN ). [5] Wolf, I., Eid, A., Vetter, M., Hassenpflug, P., Meinzer, H.-P.: Segmentierung dreidimensionaler Objekte durch Interpolation beliebig orientierter, zweidimensionaler Segmentierungsergebnisse. In Wittenberg T, Hastreiter P, Hoppe U, Handels H, Horsch A, Meinzer HP (eds). Bildverarbeitung für die Medizin Berlin: Springer (2003) (ISBN: ). [6] Kunert, T., Schröter, A., Heimann, T., Schöbinger, M., Böttger, T., Wolf, I., Meinzer, H.-P.: Interactive Segmentation in the CHILI (Tele-)Radiology System. In: Computer Aided Surgery CURACscience (ISSN ). (2003) Computerunterstützte Operationsplanung in der Herzchirurgie I. Wolf, M. Hastenteufel, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. S. Hagl, PD Dr. R. De Simone, PD Dr. Chr. F. Vahl, Dr. Sibylle Mottl-Link, Herzchirurgie, Chirurgische Klinik, Univ. Heidelberg Das Projekt wird finanziert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Sonderforschungsbereiches SFB 414 Informationstechnik in der Medizin - Rechner- und sensorgestützte Chirurgie. Das Ziel des Projektes ist die Entwicklung und Anpassung neuer Bild-basierter diagnostischer Methoden für die Herzchirurgie. Spezielle Software wird für die funktionelle and anatomische Analyse zur Unterstützung einer Patientenindividuellen Behandlung als auch für die krankheitsspezifische Forschung entwickelt. Großer Wert wird auf die Integration der Software in den klinischen Alltag gelegt. Die Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik Software unterstützt die pre-, intra- als auch die post-operative Visualisierung und Quantifizierung der Herzfunktion sowie der Herzdynamik. Die entwickelten Methoden und Algorithmen basieren auf drei- und vierdimensionalen Ultraschall-, CT und MR-Daten. Aufgrund klinischer Anforderungen werden neue Bildverarbeitungsmethoden, insbesondere Segmentierungsalgorithmen und interaktive Segmentierungstools entwickelt. Zur Bereitstellung der Methoden für die klinische Nutzung wurden die Methoden in eine einheitliche Software-Umgebung integriert. Das entwickelte Software-System Echo- Analyzer enthält zur Zeit interaktive, vierdimensionale Volumenvisualisierung von Morphologie-/Doppler-Information [1], Quantifizierung und Darstellung des zeitlichen Verlaufs des Regurgitationsvolumens, Segmentierungsalgorithmen [4,7] zur Messung von Ejektionsfraktion, Herzzeitvolumen, zur Verbesserung der Genauigkeit der Regurgitationsvolumen-Bestimmung und zur Annulus-Segmentierung, hybride Visualisierung des segmentierten Annulus zusammen mit der Morphologie- und/oder der Blutfluss-Information [2], die Doppler-Signal-basierte Herzzeitvolumen-Quantifizierung der sphärischen Integration von Geschwindigkeitsvektoren (SIVV), sowie die winkelkorrigierte Darstellung von Flussprofilen in Arealen annähernd laminaren Flusses zur Beurteilung verschiedener Bauformen und Implantationsorientierungen von künstlichen Herzklappenprothesen und Methoden zur Bewegungsanalyse der Herzens [3]. Neue Entwicklungen beschäftigen sich mit der Rekonstruktion und Erfassung von vektoriellen Bewegungs- und Fluss- Informationen mittels Doppler-Ultraschall [5,6]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Wolf, I., *De Simone, R., Hastenteufel, M., Kunert, T., *Mottl-Link, S., Meinzer, H.-P.: Visualization techniques for improved orientation in three-dimensional echocardiography. In: Min SK (Hrsg), SPIE Medical Imaging 2002: Visualization, Image- Guided Procedures, and Display, Bd. 4681, SPIE The International Society for Optical Engineering, Bellingham, , 2002 [2] Wolf, I., *De Simone, R., Hastenteufel, M., Kunert, T., Link, S., Meinzer, H.-P.: Virtual Reality in 3D Echocardiography: Dynamic Visualization of Atrioventricular Annuli Surface Models and Volume Rendered Doppler-Ultrasound. In: Westwood J.D., Hoffman H. M., Robb R. A., Stredney D. (eds), Medicine Meets Virtual Reality Washington, DC: IOS Press (2002) [3] Hastenteufel, M., Wolf, I., *De Simone, R., *Mottl-Link, S., Meinzer, H.-P.: Heart wall motion analysis by dynamic 3D strain rate imaging from tissue Doppler echocardiography. In: Anne V. Clough, Chin-Tu Chen (eds), SPIE Medical Imaging 2002: Physiology and Function from Multidimensional Images, Vol. 4683, SPIE - The International Society for Optical Engineering, Bellingham, , 2002 [4] Wolf, I., Hastenteufel, M., *De Simone, R., Vetter, M., Glombitza, G., *Mottl-Link, S., Meinzer, H.-P.: ROPES: A Semi-Automated Segmentation Method for Accelerated Analysis of Three-Dimensional Echocardiographic Data. IEEE Transactions on Medical Imaging, (accepted for publication) [5] Hastenteufel, M., *Mottl-Link, S., Wolf, I., *De Simone, R., Meinzer, H.-P.: A Method for the calibration of 3D ultrasound transducer. In Galloway RL (ed), SPIE Medical Imaging Visualization, Image-Guided Procedures, and Display, Vol. 5029, Bellingham, 2003, p [6] Hastenteufel, M., Wolf, I., *Mottl-Link, S., DeSimone, R., Meinzer, H.-P.: Reconstruction of velocity fields inside the myocardium using Tikhonov regularization. In Clough AV, Amini AA (eds). SPIE Medical Imaging 2003: Physiology and Function: Methods, Systems, and Applications, Vol. 5031, Bellingham, 2003, p

103 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [7] Wolf, I., Eid, A., Vetter, M., Hassenpflug, P., Meinzer, H.-P.: Extension of 2D segmentation methods into 3D by means of Coons-patch interpolation. In Sonka M, Fitzpatrick JM (eds). Proc. SPIE Medical Imaging 2003: Image Processing, Vol. 5032, p Computerunterstützte Lehre in der Kinderkardiologie und Herzchirurgie I. Wolf, M. Thorn, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Harvard Medical School, Children s Hospital Boston (Prof. Dr. Richard Van Praagh, Dr. Stella Van Praagh); Universität Tübingen, Abteilung Kinder-Kardiologie (Dr. Gerald Greil) Angeborene Herzfehler sind eine der häufigsten angeborenen Fehler bei Kindern und besitzen eine komplexe anatomische Struktur. Eine genaue Kenntnis der Herzanatomie ist die Voraussetzung für Diagnose und Therapie von angeborenen Herzfehlern. Statische Bilder sind wenig geeignet zur Darstellung der komplexen dreidimensionalen Anatomie. Nur wenige Zentren weltweit haben Zugang zu Sammlungen von pathologischen Präparaten von angeborenen Herzfehlern. Zur Erhaltung, Reproduzierung und Veröffentlichung der Sammlung am Children s Hospital, Boston, wurden spezielle Bildverarbeitungsmethoden entwickelt [1]. Die Herausforderung dabei ist die Erhaltung aller relevanten Details in den Modellen, welche mittels Laserlithographie (STL) und Laser-Sintering (SLS) erstellt werden. Zusätzlich wurde eine CD-ROM mit 3D Visualisierungen der Herzmodelle erstellt [2]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Wolf, I., Makabe, M., Greil, G., Thorn, M., Geva, T., *Van Praagh, S., *Van Praagh, R., Meinzer, H.-P.: Image Processing Methods for an Exact Reproduction of Unique Waxed Heart Specimens. In: Meiler M, Saupe D, Kruggel F, Handels H, Lehmann T (Hrsg), Bildverarbeitung für die Medizin Algorithmen, Systeme, Anwendungen, Informatik Aktuell, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 33-36, 2002 [2] Greil, G., Makabe, M.: 3D Computer Modeled Rare Congenital Heart Defects. Proceedings of 20th ICDE World Conference on Open Learning and Distance Education, Navigationssystem für ein minimal-invasives Verfahren zur Ablationstherapie von Vorhofflimmern M. Hastenteufel, I. Wolf, M. Vetter, S. Yang, C. Cristoph, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: GeBo Consult, Brüssel, Belgien; Freie Universitaet Brüssel, Belgien; Brugmann Hospitals, Brüssel, Belgien; Université de Franche-Comté, Besançon, Frankreich; Armstrong Healthcare, London, UK; QuaSys, Frankreich In einem europäischen Industrieprojekt mit Partnern aus Belgien, England und Frankreich wird ein neuartiges minimal invasives Instrument zur Therapie von Vorhofflimmern mittels Ablationsverfahren entwickelt. Vorhofflimmern ist eine weit verbreitete Krankheit und wird bei ca. 1% der Bevölkerung vermutet. Eine Gefahr des Vorhofflimmerns besteht in möglichen Schlaganfällen, die zum Tode führen können. Bei ca % aller Schlaganfälle wird Vorhofflimmern als Ursache vermutet. Thromben, die Ursache für Schlaganfälle, entstehen innerhalb des Vorhofes bedingt durch die unregelmäßige Bewegung des Vorhofes bei Vorhofflimmern. Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik Die einzige nahezu 100% kurative Therapie ist die chirurgische Behandlung mit dem Nachteil der hohen Invasivität. Katheterablationen werden seit einiger Zeit eingesetzt, um die chirurgische Operation z.b. mittels Radiofrequenz-Ablation nachzubilden. Katheter haben jedoch nur ein kleines Ablationsgebiet (Katheterspitze) und sind schwer und meist unter hoher Röntgenbelastung für Kardiologe und Patient zu navigieren. Das neuentwickelte Instrument wird minimalinvasiv am schlagenden Herzen eingesetzt und bietet ein wesentlich größeres Ablationsgebiet und kann damit die chirurgische Operation nachbilden. Am DKFZ wird im Rahmen des Projektes eine Navigationssoftware zur exakten Platzierung des Instrumentes innerhalb des linken Vorhofes entwickelt. Basis ist eine intra-operative Bildgebung mittels dreidimensionalem Ultraschall. Hierbei finden Methoden aus der computerunterstützten Operationsplanung in der Herzchirurgie Anwendung [1,2]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Wolf, I., *De Simone, R., Hastenteufel, M., Kunert, T., *Mottl-Link, S., Meinzer, H.-P.: Visualization techniques for improved orientation in three-dimensional echocardiography. In: Min SK (Hrsg), SPIE Medical Imaging 2002: Visualization, Image- Guided Procedures, and Display, Bd. 4681, SPIE The International Society for Optical Engineering, Bellingham, , 2002 [2] Hastenteufel, M., *Mottl-Link, S., Wolf, I., *De Simone, R., Meinzer, H.-P.: A Method for the calibration of 3D ultrasound transducer. In Galloway RL (ed), SPIE Medical Imaging Visualization, Image-Guided Procedures, and Display, Vol. 5029, Bellingham, 2003, p (ISBN ). Navigierte minimal-invasive Radiofrequenzablation für die Tumortherapie in der Leber M. Vetter, I. Wolf, M. Hastenteufel, J. Neuhaus, M. Ucar, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Dr. M. Libicher, (Ärztl. Direktor Prof. Dr. G. W. Kauffmann Abt. Radiodiagnostik, Univ. Heidelberg); GeBo Consult, Brüssel; Belgien; Digestive Surgery Department of Hôpital Erasme (ULB) Belgien; Armstrong Healthcare Limited, UK; Qua Sys Company for CE and FDA certification, Frankreich. In einem europäischen Industrieprojekt mit Partnern aus Belgien, England und Frankreich wird in Zusammenarbeit mit dem Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg ein minimal-invasives Instrument zur Thermoablation von Tumoren in der Leber entwickelt. Das neuentwickelte Instrument wird navigiert in den Tumor eingebracht. Am DKFZ wird im Rahmen des Projektes eine Navigationssoftware zur exakten Platzierung des Instrumentes innerhalb des Tumors entwickelt. Als interventionell bildgebendes Verfahren wird die Computer-Tomographie eingesetzt. Das neues Verfahren zur Echtzeit-Organregistrierung soll eine genaue Platzierung der Thermo-Ablationssonde an geplanter Position ermöglichen werden [1]. Die atmungsbedingte Verschieblichkeit des Tumors kann so mit Hilfe von Navigationshilfen und Deformationsmodellierung bei der Platzierung der Thermo-Ablationssonde berücksichtigt [2]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Vetter, M., Wolf, I., Hassenpflug, P., Hastenteufel, M., Ludwig, R., *Grenacher, L., *Richter, G., *Uhl, W., *Büchler, M., Meinzer, H.-P.: Navigation aids and Real s and Real-time deformation modeling for open liver surgery. Proceedings SPIE Conference Medical Imaging, San Diego, CA, USA,

104 104 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [2] Vetter, M., Hassenpflug, P., Glombitza, G., Wolf, I., Meinzer, H.-P.: Method, device and navigation aid for navigation during medical interventions. International Patent PCT/DE01/03971X, Munich Computer-gestützte Navigation für die onkologische Leberchirurgie M. Vetter, P. Haßenpflug, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: PD Dr. W. Uhl, Prof. Dr. M. W. Büchler, Chirurgische Klinik, Univ. Heidelberg. L. Grenacher, G. M. Richter, Abt. Radiodiagnostik, Univ. Heidelberg. Die computergestützte Navigation soll durch die Kombination aus präoperativer Operationsplanung und intraoperativer Bildgebung auch bei onkologischen Resektionen der Leber ermöglicht werden. Zielsetzung des Projektes ist die Unterstützung des Chirurgen durch eine Bildgestützte Instrumentennavigation bei Tumorresektionen in der Leber und bei Leber-Lebendspenden. Zu Beginn des Projektes wurde eine Systemanalyse der klinischen Abläufe und medizinischen Erfordernisse durchgeführt. Die schritthaltende Organregistrierung ist aufgrund von Verformungen und Topologieveränderungen der Leber wie sie bei chirurgischen Resektionen auftreten, die Grundlage für die Instrumentennavigation in der Leberchirurgie. Anhand zweier Schlüsselexperimenten wurden neue Verfahren zur Organregistrierung untersucht, die eine schritthaltende Registrierung der Leber erstmalig auch während der chirurgischen Resektion ermöglichen sollen. Die neuen Verfahren zur gefäßbasierten Registrierung und Aufrechterhaltung des initial hergestellten Registrierungszustands mittels Navigationshilfen wurden international patentrechtlich geschützt [1,2]. Zur Lagebestimmung des Organs wird intraoperative ein Ultraschalldatensatz aufgenommen und mit präoperativen aufgenommenen CT-Daten registriert [3,4]. Die Registrierung der Leber wird durch Navigationshilfen aufrecht erhalten. Diese werden während der Operation in die Leber eingebracht und ermitteln die Parameter für eine modellbasierte Deformations- und Lagebestimmung [5]. Die Komponenten zur Echtzeit Lage und Deformationsbestimmung wurden anhand eines Leberphantoms bestehend aus Silikon und 1000 Fiducials evaluiert und in den Prototyp ARION (Augmented-Reality for Intra-Operative Navigation) integriert [4]. ARION ermöglicht mittels eines autostereoskopischen Displays die räumliche Darstellung des chirurgischen Instruments in Relation zu intrahepatischen Strukturen wie Gefäße und Tumoren [6]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Vetter, M., Hassenpflug, P., Glombitza, G., Wolf, I., Meinzer, H.-P.: Method, device and navigation aid for navigation during medical interventions. International Patent PCT/DE01/03971X, Munich [2] Glombitza, G., Vetter, M., Hassenpflug, P., Cárdenas, C., Thorn, M., Wolf, I., Braun, V., Giess, C., Evers, H., *Lamadé, W., Meinzer, H.-P.: Method and device for navigation during medical interventions or for localizing a non- osseous structure. International Patent PCT/DE01/03972, Munich [3] *Lamadé, W., Vetter, M., Hassenpflug, P., Thorn, M., Meinzer, H., Herfarth, C.J.: Navigation and image-guided HBP surgery: a review and preview. Hepatobiliary Pancreat Surg, 9:592 9 Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik [4] Hassenpflug, P., Schöbinger, M., Vetter, M., Ludwig, R., Wolf, I., Thorn, M., *Grenacher, L., *Richter, G., *Uhl, W., *Büchler, M., Meinzer, H.-P.: Generation of attributed relational vessel graphs from three-dimensional freehand ultrasound for intraoperative registration in image-guided liver surgery. Proceedings SPIE Conference Medical Imaging, San Diego, CA, USA, [5] Vetter, M., Wolf, I., Hassenpflug, P., Hastenteufel, M., Ludwig, R., *Grenacher, L., *Richter, G., *Uhl, W., *Büchler, M., Meinzer, H.-P.: Navigation aids and Real-time deformation modeling for open liver surgery. Proceedings SPIE Conference Medical Imaging, San Diego, CA, USA, [6] Vetter, M., Hassenpflug, P., Thorn, M., Cárdenas, C., *Grenacher, L., *Richter, G.-M., *Lamadé, W., Herfarth, C., Meinzer, H.-P.: Superiority of autostereoscopic visualization for image-guided navigation in liver surgery. Proceedings SPIE Conference Medical Imaging, San Diego, CA, USA, 2002, Vol [7] Hassenpflug, P., Vetter, M., Schneberger, M., Liebler, T., Thorn, M., *Richter, G.-M., *Lamadé, W., *Büchler, M.-W., Meinzer, H.-P.: Accuracy of Magnetic Tracking for Image-Guided Navigation in Liver Surgery. In: Medicine Meets Virtual Reality Conference, Newport Beach, CA, USA, 2002, Vol. 02/10, Klinische Integration und Telematik-Anwendungen U. Engelmann, A. Schröter, T. Schweitzer, H. Münch, R. Hussein, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Klinikum Nord Nürnberg, Clinica Femenia, Palma de Mallorca, Spanien, Sanatorio del Rosario, Madrid, Spanien, Fa. Pointercom, Rom, Italien, Fa. Matla, Madrid, Spanien, Fa. Sirius, Brüssel, Belgien, Fa. Systemas Espertos, Madrid, Spanien, Universität Avignon, Frankreich, Polytechnical University Madrid, Spanien, E. Borälv, University Uppsala, Schweden, Steinbeis-Transferzentrum Medizinische Informatik (STZ-MI), Heidelberg. Die Forschung auf dem Gebiet der medizinischen Bildanalyse kann nicht nur Selbstzweck sein. Die Ergebnisse sollen entsprechend der Philosophie unserer Abteilung auch den Weg zum Arzt und Patienten finden. Daher wurde Anfang der 90er Jahre der Aspekt der klinischen Integration von Telematik-Anwendungen als Schwerpunktthema dieser Arbeitsgruppe gewählt. In EU-geförderten Projekten der Gruppe wurden und werden technologische Grundlagen für Informationssysteme gelegt, mit denen die Erstellung und der Betrieb von klinischen Informationssystemen erleichtert wird. Diese werden nun in Telematik-Anwendungen (mit Schwerpunkt Teleradiologie) integriert und dienen als Plattform für die in unserer Abteilung entwickelten Prototypen für innovative Methoden der medizinischen Bildanalyse. Damit wird nicht nur der Datenaustausch mit klinischen Partnern erleichtert, sondern auch die Evaluation von neuen Methoden in der Klinik ermöglicht. Das wichtigste Konzept ist hierbei die nachträgliche Erweiterungsfähigkeit von fertigen Programmen. In unserer Abteilung wurde ein sog. PlugIn-Mechanismus konzipiert, der den Zusatzmodulen den Datenaustausch und die nahtlose Integration in eine radiologische Workstation erlaubt. Dieser Mechanismus ist ein Schlüsselelement, um zukünftig Entwicklungen aus der Grundlagenforschung, wie zum Beispiel Operationsplanungssysteme, schnell und ohne viel Aufwand in die Klinik zu integrieren. Es ist und kann nicht Aufgabe einer Großforschungseinrichtung sein, Software auf Produktniveau in der wissenschaftlichen Umgebung zu entwickeln, bei Anwendern einzuführen und in der Routine zu pflegen. Daher wurde aus der Abteilung eine Technologietransfer-Firma ausgegründet: Das Steinbeis-Transferzentrum Medizinische Informa-

105 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik tik (STZ-MI). Dieses hat sich als eines von ca. 500 Transferzentren der Steinbeis-Stiftung als sehr praktikable Lösung erwiesen. In mehreren Projekten konnte so eine Aufteilung der Aufgaben in wissenschaftliche Konzeption und Evaluation auf DKFZ-Seite und Software-Entwicklung, Benutzerschulung, Hotline und Softwarewartung im STZ-MI vorgenommen werden (s. Wir haben eine neue Generation einer allgemeinen radiologischen Workstation (CHILI) konzipiert, die vom STZ-MI realisiert wurde. Diese erlaubt den sicheren und herstellerübergreifenden Datenaustausch und dient in unserer Abteilung bei der Entwicklung neuer Bildverarbeitungsmethoden als erweiterbare Basisplattform. Die im Sonderforschungsbereich 414 von verschiedenen Universitäten entwickelten Softwarekomponenten werden als CHILI-PlugIns realisiert. Auch die vom Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim geförderten Projekte unserer Abteilung setzen auf diesem PlugIn-Konzept auf. So konnten die Entwicklungszeiten verkürzt werden und neue Methoden schneller und einfacher evaluiert und in die klinische Routine eingeführt werden. Außerdem wurden im Rahmen dieser Aktivitäten bestehende Teleradiologie-Netzwerke analysiert. Hierbei standen quantitative Analysen verwendete und notwendige Transferprotokolle Anwendungsszenarien und Auswirkungen der Teleradiologie im Vordergrund. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse geben wichtige Hinweise über den Einsatz der Teleradiolgie und zukünftige Anforderungen [1]. Neue Konzepte von digitalen Bildarchiven (Picture Archiving and Communications Systems: PACS) sind ein weiteres Forschungsgebiet der Abteilung. Insbesondere spielen hier die Speicherung von Daten in unternehmensweiten Archivsystemen und die Integration der institutsübergreifenden Telemedizin als integraler Bestandteil von PACS-Systemen eine wichtige Rolle [2]. In den Berichtsjahren wurde in einem EU-geförderten Projekt (MTM-Projekt im IST-Förderprogramm) an der Konzeption Entwicklung und Evaluation von mobilen (Tele-) Radiologiesystemen gearbeitet [3]. Dies geschah in Zusammenarbeit mit Firmen und Forschungseinrichtungen in Belgien Frankreich Italien und Spanien. Diese Arbeiten wurden mit der deutschen Röntgengesellschaft, dem Europäischen IST-Preis von Eurocase und der Kommission der Europäischen Union und dem Förderpreis der Deutschen Gesellschaft für Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie ausgezeichnet. Es wurde ein neues Konzept für eine Telemedizin-Architektur auf der Basis von verschlüsselten s und dem DICOM-Standard entwickelt vom STZ-MI im Schlaganfall- Netzwerk in Rheinland-Pfalz praktisch umgesetzt [4, 5]. Das System wird inzwischen in klinischer Routine eingesetzt und wird z. Zt. auf weitere Telemedizin-Netzwerke in Baden-Württemberg übertragen. Die Integration medizinischer Bilder in die elektronische Patientenakte ist ein weiteres Arbeitsgebiet der Abteilung im Berichtzeitraum. Hierfür wurde ein neues Konzept entwickelt, von unserem Technologietransfer-Partner in Software umgesetzt und erfolgreich im klinischen Einsatz im Kontext verschiedener Krankenhaus- und Radiologie- Informationssysteme evaluiert und angewendet [6]. Integrating the Healthcare Enterprise (IHE) ist eine wichtige internationale Initiative, die Standardisierung der Interoperabilität von Informationssystemen in der Medizin voranzutreiben. Zukünftige Systeme werden durch IHE-Konformität den Datenaustausch untereinander stark vereinfachen. Daher wendet unsere Abteilung konsequent die dort geforderten Standards an. Auf deren Basis wurden neue Methoden zur herstellerunabhängigen Kommunikation in der Medizin entwickelt, um die nahtlose Integration der innovativen Bildanalysemethoden auch für den breiten klinischen Einsatz verfügbar zu machen [7]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Engelmann, U., Schwab, M., Schröter, A., Rusu, P., Meinzer, H.-P.: Evaluation des CHILI-Teleradiologienetzwerks nach 4 Jahren im klinischen Einsatz. Der Radiologe 2 (2002) [2] Delorme, S., Engelmann, U.: Vom Bild zum Bildschirm - eine Revolution in der bildgebenden Diagnostik. Krebsforschung heute. Berichte aus dem Deutschen Krebsforschungszentrum. Darmstadt: Steinkopf (2002) [3] Schweitzer, T., Engelmann, U., Schroeter, A., *Borälv, E., Grandy, M., Meinzer, H.-P.: Ubiquitous radiology: The scalable CHILI architecture on stationary and mobile devices. Niinimaäki J, Ilkko E, Reponen J (eds). Proceedings of the 20 th EuroPACS annual meeting, 5th-7th September 2002, Oulu, Finland. Publication series of Radiological Society of Finland. Oulu: Oulu University Press (2002) [4] Engelmann, U., Schroeter, A., Schweitzer, T., Meinzer, H.-P.: Kommunikationskonzept für das Schlaganfall-Netzwerk Rheinland-Pfalz. In Jäckel A (ed). Telemedizinführer Ober- Mörlen: Deutsches Medizin Forum (2002) [5] Engelmann, U., Schroeter, A., Schweitzer, T., Meinzer, H.-P.: The communication concept of a regional stroke unit network based on encrypted image transmission and the DICOM-Mail standard. In: Lemke HU, Vannier MW, Inamura K, Farman AG, Doi K, Reiber JHC (eds). CARS Heidelberg: Springer (2002) [6] Münch, H., Engelmann, U., Schröter, A., Meinzer, H.-P.: Webbased distribution of radiological images from PACS to EPR. Lemke HU, Vannier MW, Inamura K, Farman AG, Doi K, Reiber JHC (eds). CARS Computer Assisted Radiology and Surgery. Proceedings of the 17th International Congress and Exhibition. Amsterdam: Elsevier (2003) [7] Hussein, R., Engelmann, U., Schroeter, A., Meinzer, H.-P.: The CHILI implementation plan to comply with the IHE technical framework. Niinimaäki J, Ilkko E, Reponen J (eds). Proceedings of the 20th EuroPACS annual meeting, 5th-7th September 2002, Oulu, Finland. Publication series of Radiological Society of Finland. Oulu: Oulu University Press (2002) Simulation von Entwicklungsprozessen und Analyse von Zellinien U. Platzer, V. Braun, R. Lohaus, H.-P. Meinzer In Zusammenarbeit mit: Dr. Ricardo B. Azevedo, University of Houston, Houston, Texas, USA. Im Bereich der Simulation von Entwicklunsprozessen wurden verschiedene Prozesse aus der Entwicklung des Nematoden Caenorhabditis elegans untersucht. Basierend auf Daten aus der Literatur wurden genetische Regulationsnetzwerke identifiziert, die die Spezifikation der embryonalen Founder -Zellen und die Bildung der Vulva regulieren. Mit Hilfe der in dieser Abteilung entwickelten Software Gene-O-Matic wurden diese Netzwerke simuliert und es konnten wichtige Erkenntnisse über den Ablauf und die Funktionsweise der besprochenen Prozesse gewonnen werden. Es war sogar in einigen Bereichen möglich, Vorhersagen über den Wirkmechanismus einiger Proteine zu machen, z.b. über die Signalweitergabe durch Wnt in der Vulva. Ein weiterer Anwendungsbereich von Gene-O- Matic war die Simulation von Meristemen inm vegetativen Wachstum von Arabidopsis thaliana. Nicht zuletzt stellte 105

106 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B010 Medizinische und Biologische Informatik 106 die Simulation von Hefezellen - Teilung und Paarung - eine wichtige Forschungsrichtung dar, konnte dadurch das erste Mal gezeigt werden, daß die 3D-Zellsimulation, die Gene- O-Matic zugrunde liegt, auch für einzellige Organismen gewinnbringend eingesetzt werden kann. Im Rahmen dieser Projekte wurde die Software Gene-O-Matic weiter ausgebaut und benutzerfreundlicher gemacht. Außerdem wurde dazu eine Erfindungsmeldung gemacht. Der zweite Bereich, die Analyse von Zelllinien, führte zur Entwicklung der Software ALES und der neuen Version Ales-Lite. Mit diesen Programmen ist es möglich, vorhandene Zelllinien bzgl. der Anzahl an Ereignissen zu untersuchen, die notwendig sind, um aus einer Eizelle die ganze Zelllinie aufzubauen. Außerdem ermöglicht ALES die Generierung zufälliger Zelllinien nach verschiedenen Wahrscheinlichkeitsmodellen. Der Vergleich zufälliger und beobachteter Zellinien erlaubt es, Aussgen über die Effizienz oder Komplexität eines Entwicklungsprozesses zu machen. Untersucht wurden vor allem Nematoden, aber auch andere Organismen. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit R.B. Azevedo von der University of Houston in Houston, Texas, durchgeführt. Ein Teil der Arbeit wurde auch dort gemacht.

107 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B020 Molekulare Biophysik Abteilung Molekulare Biophysik (B020) Leiter: Prof. Dr. Sándor Suhai Wissenschaftliche Mitarbeiter Rüdiger Bräuning (- 3/02) Dr. Marcus Elstner Peter Ernst (- 9/03) Dr. Mechthilde Falkenhahn Karl-Heinz Glatting Dr. Agnes Hotz-Wagenblatt (4/02 - ) Michaela Knapp-Mohammady Dr. Mark van der Linden (- 4/02) Dr. Thomas Niehaus Dr. Béla Paizs Dr. Barbara Pardon Dr. Paul Strodel (11/02 - ) Dr. Coral del Val Doktoranden Vinayagam Arunachalam Ana-Nicoleta Bondar Sunitha Jonnakuty (7/02 - ) Christof Köhler (- 3/03) Christoph Pfisterer (1/03 - ) Diplomanden Björn Gaiser (5/02-12/02) Jutta Moormann (11/02-10/03) Gastwissenschaftler Dr. István Andrejkovics (Debrecen, Ungarn, 12/01-11/02, 1/03-1/04) Attila Bende (Debrecen, Ungarn, 1-6/03) Enikö Bende (Debrecen, Ungarn, 12/01-11/02) Anna Gaitova (Novosibirsk, Russland, 1/01-4/02) Dr. Shouguo Gao (Nanjing, China, 4-9/03) Dr. Gábor Halász (Debrecen, Ungarn, 12/02-3/03) Dr. Karl Jalkanen (Lyngby, Dänemark, 12/01-2/02) Zsuzsa Janosfalvi (Debrecen, Ungarn, 1-04/02, 5-8/03) Dr. Anil Kumar (Varanasi, Indien, 2-4/03) Prof. Phool Chand Mishra (Varanasi, Indien, 5/03-6/03) Pawel Siedlecki (Warschau, Polen, 6-7/02; 10-12/02) Dr. Ágnes Vibók (Debrecen, Ungarn, 9/02-9/03) Sekretariat Anke Retzmann Die Abteilung Molekulare Biophysik betrachtet sich innerhalb des Forschungsschwerpunkts Strukturelle und Funktionelle Genomforschung am DKFZ als eine Brücke zwischen der experimentellen molekularbiologischen Grundlagenforschung einerseits und der methodologisch orientierten theoretischen Forschung andererseits. Ihre Hauptziele sind die Entwicklung und Implementierung von theoretischen Verfahren, die das computergestützte Modellieren der Struktur von biologischen Makromolekülen und die Untersuchung der Verbindung zwischen strukturellen Eigenschaften und biologischen Funktionen unterstützen. In Kombination mit modernen, leistungsfähigen Methoden der Bioinformatik und mit neuen Rechnerarchitekturen können diese Methoden die Basis für die Simulation von unterschiedlichen biologischen Phänomena bilden und somit die experimentelle Krebsforschung sinnvoll ergänzen. Bioinformatik in Massenspektrometrie und Proteomik B. Paizs, S. Suhai Die Massenspektrometrie (MS) ist aufgrund ihrer Fähigkeit zur schnellen Bestimmung von Aminosäuresequenzen von Peptiden und Proteinen zu einem Hauptbestandteil der Proteomik geworden. Die Informationen, die in den Tandem MS/MS Spektren von protonierten Peptiden enthalten sind, können auf verschiedene Weise zur Identifizierung von Proteinen verwendet werden. Einige Algorithmen verwenden die MS/MS Daten zur Generierung von Peptide- Sequence Tags, die aus Informationen über einen kurzen Sequenzabschnitt bestehen. Ein anderer Ansatz basiert auf der in silico Generierung von MS/MS Fragmentationsmustern für Peptide, die aus Einträgen in Protein- und/ oder Nukleinsäuredatenbanken und aus dem Vergleich der vorhergesagten mit den experimentell ermittelten Spektren gewonnen werden. Protonierte Peptide dissoziieren mit einem sehr komplizierten Reaktionsmuster [1], wobei die Amidbindungen mit sehr unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten gespalten werden. Dies macht die Vorhersagen von MS/MS Spektren von Peptideinträgen in Datenbanken äußerst schwierig. Ferner zeigen einige Peptide eine selektive und/ oder verstärkte Fragmentation bei einigen der Aminosäureresten, wobei MS/MS Spektren produziert werden, die wenige wertvolle Sequenzionen aufweisen. Angesichts dieser Fakten ist es nicht erstaunlich, dass bestehende Sequenzierungsalgorithmen nur die in den m/z Werten der wichtigsten Sequenzionen inhärenten Informationen verwenden und alle Intensitäts-bezogenen Daten aussortieren. Aufgrund dieser algorithmischen Beschränkungen liefern große Teile der MS/MS Experimente keine nützlichen Informationen, wodurch die Identifizierung nicht häufiger Proteine recht problematisch ist. MS-bezogene Proteomikuntersuchungen könnten zweifelsfrei weiter verbessert werden [1], wenn die Hauptregeln zur Fragmentierung von protonierten Peptiden soweit bekannt wären, dass Vorhersagen über einige der Ionen-Intensitäts-Beziehungen der MS/MS Spektren von protonierten Peptiden möglich wären. 107

108 108 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung In den letzten Jahren konzentrierten sich unsere Aktivitäten im Bereich der MS-bezogenen Proteomik auf die Weiterentwicklung der relevanten Bioinformatik-Methoden. Wie oben beschrieben, ist der problematischste Aspekt bei der Verarbeitung von MS/MS Daten, dass unser Wissen über die Fragmentationswege von protonierten Peptiden noch sehr beschränkt ist. Unsere ursprüngliche Idee war, die sehr komplizierten Reaktionsmuster der Peptidfragmentation mittels eines intensiven Zusammenspiels von theoretischen, experimentellen und auf Bioinformatik basierenden Methoden anzugehen. Es wurden dafür moderne Werkzeuge der theoretischen Chemie angewendet [2-7], um Einblick in die Einzelheiten der wichtigsten Fragmentationswege von protonierten Peptiden zu gewinnen. Unser Hauptziel bei diesen Untersuchungen war, die zugrunde liegende Chemie der Peptidfragmentation auf einer solchen Ebene zu verstehen, die es uns ermöglichen würde, Ionen-Intensitäts-Beziehungen für die MS/MS Spektren von protonierten Peptiden nicht nur zu erklären, sondern auch vorherzusagen. Die abgeleitete Fragmentationseigenschaft wurde kontinuierlich überprüft durch den Vergleich von theoretischen mit experimentellen Daten, die für die gleichen Modellsysteme erzielt worden waren. Aufgrund unserer intensiven Forschungsarbeit in den letzten fünf Jahren sind die wichtigsten Eigenschaften der Peptidfragmentation jetzt bekannt [1]. Wir haben damit angefangen, die Fragmentationschemie von kleinen Peptiden zu untersuchen, um die energetischen und kinetischen Einzelheiten der beteiligten Fragmentationswege zu verstehen. Als eines der wichtigsten Ergebnisse dieser Untersuchungen haben wir die generellen b x -y z Pfade der Peptidfragmentation aufgestellt und sie durch Einschluss der wichtigsten mechanistischen, energetischen und kinetischen Aspekte vollständig charakterisiert. Wir haben gezeigt [2], dass die b x -y z Pfade zum Verständnis und zur Vorhersage der MS/MS Spektren von Peptiden verwendet werden können. Eine approximative DFT-Methode für QM/MM Simulationen von Biomolekülen M. Elstner, K. Jalkanen, M. Knapp-Mohammady, T. Niehaus, S. Suhai Während der letzten Jahre haben wir eine effiziente Annäherung an die Dichtefunktionaltheorie (DFT) entwickelt, das sogenannte Self-Consistent-Charge Density Functional Tight-Binding Scheme (SCC-DFTB) [8-11]. Zur Erweiterung seiner Anwendbarkeit auf biomolekulare Strukturen wurde diese Methode in quantummechanische/ molekularmechanische (QM/MM) und lineare Scalingschemata implementiert und mit einer empirischen Behandlung der Dispersionskräfte angereichert [12]. Es wurden auch mehrere verschiedene QM/QM Kombinationen getestet und die SCC-DFTB QM/MM Methode auf Protontransfer (PT) Reaktionen und Enzyme angewendet. Die Rechengeschwindigkeit von SCC-DFTB ermöglicht nicht nur die Berechnung der Minimumenergiepfade für den PT, sondern auch des Potentials der Durchschnittskraft.Die Entwicklungen ermöglichten zum ersten Mal realistische QM Simulationen von Polypeptiden [16] und einen DNS Dodecamer in der ns Zeitskala [14]. Erste Schritte hin zur Berechnung von angeregten Zuständen waren auch erfolgreich [8, 15]. Abteilung B020 Molekulare Biophysik Intermolekulare Wechselwirkungen in Biopolymeren B. Paizs, S. Suhai Mit Hilfe von empirischen Kraftfeldern, die in der Vergangenheit für dynamische Simulationen von großen Strukturen mit ab-initio Berechnungen parametrisiert wurden, ist es nicht möglich, reale chemische Reaktionen im aktiven Zentrum eines biologischen Systems zu beschreiben, wo effiziente quantummechanische Methoden von entsprechender Genauigkeit benötigt werden. Das Ziel verschiedener Projekte in unserer Gruppe war eine Verbesserung der Leistung und Genauigkeit der Rechenverfahren in diesem Gebiet, einschließlich large-scale Strukturoptimierungen [16] und der Eliminierung des Basis Set Superposition Errors [17-20]. Hydrationseffekte und Simulation von IR, CD, VCD, Raman und Raman optischen Spektren in Peptiden und Proteinen K. Jalkanen, M. Elstner, M. Knapp-Mohammady, S. Suhai Die meisten molekulardynamischen Simulationen von Biopolymeren leiden unter der Tatsache, dass es sehr schwierig ist, die Anwesenheit der wässrigen Umgebung der lebendigen Zelle einzuschließen, die wiederum die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der untersuchten Moleküle substantiell beeinflußt. Zur Verbesserung der Vorhersagekraft solcher Simulationen über die für Vakuum erzielten Ergebnisse hinaus führten wir verschiedene Untersuchungen an Modellsystemen durch, um die Hydrationseffekte auf die strukturellen und spektralen Eigenschaften dieser Moleküle zu verstehen [21-22]. Ferner haben wir auch bei verschiedenen Spektren (vibrational absorption, VA, vibrational circular dichroism, VCD, Raman scattering und Raman optical activity, ROA) die Intensitäten simuliert [21-23]. Das Ziel bei diesen Untersuchungen war die strukturellen und funktionalen Implikationen im Fall von mittelgroßen Peptidmodellen zu verstehen, um in der Lage zu sein, größere Proteinmoleküle zu modellieren und die Ergebnisse von experimentellen Untersuchungen zu interpretieren [23]. Protontransfer in Bakteriorhodopsin (br) N. Bondar, M. Elstner, S. Suhai Der primäre Protontransferschritt in br beinhaltet den Transfer des NH Protons der retinalen Schiff Base nach Asp85 [24]. Zur Bestimmung des Protontransfermechanismus wurden hier kombinierte quantummechanische/molekularmechanische Reaktionspfadberechnungen durchgeführt [25]. Wir haben herausgefunden, dass der Protontransfer ausgeht von einem Zustand, in dem die NH Gruppe der Schiff Base zur zytoplasmatischen Seite hin orientiert ist, d. h. in die entgegengesetzte Richtung zum Protontransfer. Es gibt drei approximative isoenergetische Pfade mit Barrieren in Übereinstimmung mit dem Experiment. Zwei davon erfordern eine erhebliche Proteinflexibilität, wobei eine den direkten Transfer nach Asp 85 beinhaltet und die andere die Reorientierung der Schiff Base zu der extrazellulären Seite gefolgt von einem konzertierten Protontransfer mit einem Wassermolekül und Asp 212. Der dritte Pfad, bei dem die aktive Seite starr bleibt, involviert Thr89 als einen Zwischenprotonträger [26].

109 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Redox-vermittelte funktionelle und strukturelle Änderungen in der Insulinrezeptorkinase A. Hotz-Wagenblatt Signalgebung durch Insulin erfordert eine Autophosphorylierung der Insulinrezeptorkinase (IRK) bei drei Tyr Rückständen, aber die ATP Bindungsseite wird blockiert gemäß der berichteten Kristallstruktur 1irk der nativen nicht-phosphorylierten IRK Domäne. 3D Modelle der IRK-0P Struktur, die man durch Energieminimierung nach Entfernung der zwei Ethyl-Quecksilbergruppen bei zwei Cys Rückständen erhält, unterscheiden sich in wichtigen Details von der ursprünglichen Kristallstruktur. Die Phosphorylierung der drei Tyr Rückstände wird bei diesem Szenario durch drei verschiedene katalytische Aminosäuren (2 Asp, 1 Glu) vermittelt und involviert keine Bindung von ATP an die ATP Bindungsseite der IRK-3P Struktur [27]. Bioinformatik-Infrastruktur P. Ernst, M. Falkenhahn, K.-H. Glatting, A. Hotz-Wagenblatt, B. Pardon, S. Suhai In Zusammenarbeit mit der Abteilung Zentrale Datenverarbeitung (ZDV) haben wir eine umfassende und effiziente Bioinformatik-Infrastruktur am DKFZ aufgebaut. Neben unseren eigenen Entwicklungen bieten wir mehr als 250 Softwareanwendungen und mehr als 200 regelmäßig aktualisierte Datenbanken an. Die Anwendungspakete beinhalten: HUSAR/GCG, SRS, den Bioccelerator, EMBOSS und STADEN. Beispiele für die angebotenen Datenbanken sind die vollständigen EMBL und GENBANK Nukleotiddatenbanken (täglich aktualisiert), die Proteinsequenzdatenbanken SwissProt und PIR (wöchentlich aktualisiert) oder die vollständigen Genome von Organismen wie Mensch, Maus oder Hefe (regelmäßig aktualisiert). Ferner bieten wir Benutzerunterstützung ( und Telefonhotline), Kurse und Workshops an. Es werden zwei Arten von Tutorkursen angeboten: Einführungskurse über die verfügbaren Bioinformatikresourcen (monatlich) und Fortgeschrittenenworkshops über ausgewählte Themen (alle drei Monate). Unsere Gruppe hat durch die Betreuung des Deutschen EMBnet Knotens seit 1986 relevantes Know-how im Bereich der Datenanalyse erworben. Das EMBnet ( besteht aus 26 anerkannten Bioinformatikzentren (Knoten) und bietet der europäischen Molekularbiologiegemeinde einen Bioinformatik-Service an. An einem ähnlichen Projekt beteiligen wir uns im Rahmen des Helmholtz Netzwerks für Bioinformatik ( wobei elf deutsche Bioinformatik- Forschungsgruppen einen bequemen Zugang zu zahlreichen Bioinformatikresourcen durch ein einziges Webportal zur Verfügung stellen. Ferner sind wir beteiligt an Datenanalyse innerhalb des DHGP (Deutsches Humangenomprojekt) und des NGFN (Nationales Genomforschungsnetzwerk), z.b. mit den Gruppen von A. Poustka, S. Wiemann (DKFZ; cdna2genome), E. Schmidt, T. Hankeln (GENENTERPRISE Mainz, ESTAnnotator). Abteilung B020 Molekulare Biophysik Entwicklung von web-basierten Oberflächen für genomisches Computing P. Ernst, K.-H. Glatting, A. Hotz-Wagenblatt, S. Suhai, C. del Val Zusammen mit dem European Bioinformatics Institute (EBI) haben wir eine benutzerfreundliche WWW Oberfläche (W2H) ( entwickelt, die ständig erweitert wird. Das W3H Taskframework ermöglicht die Ausführung von Compoundjobs unter Verwendung der Beschreibung von Work- und Dataflows in einer heterogenen Bioinformatikumgebung mit Hilfe von Metadaten-Informationen. Den Wissenschaftlern stehen zur Zeit acht Tasks zur Verfügung; die meisten von ihnen werden im Kontext von Sequenzannotationen (siehe unten) benutzt, aber es gibt auch Tasks für phylogenetische Analyse [28] oder für die Unterstützung im Primerdesignprozess (PrimerSweep). Entwicklung von Hochdurchsatz- Genomannotationswerkzeugen K.-H. Glatting, A. Hotz-Wagenblatt, S. Suhai, C. del Val Innerhalb des Taskrahmens in HUSAR wurden zahlreiche Annotationswerkzeuge entwickelt und implementiert, um die Hochdurchsatz-Genomannotation zu verbessern [29]. In Zusammenarbeit mit Arbeitsgruppen im NGFN/ DHGP haben wir eine Task für cdna Mapping und die Charakterisierung von cdnas in voller Länge entworfen (cdna2genome), eine weitere für die halb-automatische Analyse von EST Sequenzen [30], die die Suche nach funktionellen Annotationen von neuen Transkriptsequenzen unterstützt (ESTAnnotator), und eine für die Klassifizierung von Proteinsequenzen und Funktionsinferenz, wobei verschiedene Klassifizierungs- und Suchmethoden sowohl der gewöhnlich verwendeten Proteinfamilien-Datenbanken als auch von Interpro und Gene Ontology (DomainSweep) kombiniert werden. Funktionelle Annotation mit Hilfe von Gene Ontology K.-H. Glatting, A. Hotz-Wagenblatt, S. Suhai, C. del Val In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Roland Eils am DKFZ entwickeln wir einen Lernalgorithmus für die automatische Annotation von Genfunktion mit Hilfe der Gene Ontology(GO) Datenbank ( godatabase.org/dev/database/). Mit diesem Ansatz werden viele der gewöhnlichen Probleme bei der automatischen Annotation überwunden, wie z.b. unvollständige oder inkonsistente Annotation oder das Fehlen einer formalisierten Annotationssprache. Die Hauptstrategie dieses Ansatzes besteht im Gebrauch von GO-kartierten Datenbanken, einschließlich Modellorganismus und Domaindatenbanken, die verläßliche und qualitativ hochwertige Informationen in strukturierten GO Begriffen enthalten. Sequenzähnlichkeit, Häufigkeit und unterstützende Informationen werden aus Datenbanksuchen ausgewählt, um Punktzahlen für jede funktionelle Kategorie zu vergeben. Verschiedene Funktionswerte werden durch ein mathematisches Modell kombiniert und ihre Anwendung zeigte eine verbesserte Qualität von Annotationen in einem Trainingsset mit Sequenzen von Hefe, Maus, Drosophila, C.elegans und Arabidopsis. 109

110 110 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Publikationen (* = externer Koautor) [1] B. Paizs and S.Suhai: Fragmentation pathways of protonated peptides, Mass Spectrom. Rev. (in press). [2] B. Paizs and S. Suhai: Combined quantum chemical and RRKM modeling of the main fragmentation pathways of protonated GGG. II. Formation of b 2, y 1, and y 2 ions, Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, (2002). [3] B. Paizs, S. Suhai, *B. Hargittai, *V. J. Hruby and *Á. Somogyi: Ab initio and MS/MS studies on protonated peptides containing basic and acidic amino acid residues. I. Solvated proton vs. salt-bridged structures and the cleavage of the terminal amide bond of protonated RD-NH 2, Int. J. Mass Spectrom. 219, (2002). [4] B. Paizs and S. Suhai: Towards understanding some ion intensity relationships for the tandem mass spectra of protonated peptides, Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, (2002). [5] *I. P. Csonka, B. Paizs and S. Suhai: Modeling of the gasphase ion chemistry of protonated arginine, J. Mass Spectrom. (in press). [6] B. Paizs, S. Suhai and *A. G. Harrison: Experimental and theoretical investigation of the main fragmentation pathways of protonated H-Gly-Gly-Sar-OH and H-Gly-Sar-Sar-OH, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, (2003). [7] B. Paizs and S.Suhai: Towards understanding the tandem mass spectra of protonated oligopeptides. 1: Mechanism of amide bond cleavage, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, (2004). [8] *Th. Frauenheim, *G. Seifert, M. Elstner, T. Niehaus, C. Köhler, *M. Amkreutz, *M. Sternberg, *Z. Hajnal, *A. Di Carlo and S. Suhai: Atomistic simulations of complex materials: groundstate and excited-state properties, J. Phys.: Condens. Matter 14, (2002). [9] *P. Bobadova-Parvanova, *K. A. Jackson, *S. Srinivas, *M. Horoi, C. Köhler and *G. Seifert: Scanning the potential energy surface of iron clusters: A novel search strategy, J. Chem. Phys. 116, (2002). [10] *K. Frimand and K. J. Jalkanen: SCC-TB, DFT/B3LYP, MP2, AM1, PM3 and RHF study of ethylene oxide and propylene oxide structures, VA and VCD spectra, Chem. Phys. 279, (2002). [11] *O. V. Shishkin, M. Elstner, *T. Frauenheim and S. Suhai: Structure of stacked dimers of N-methylated Watson Crick adenine-thymine base pairs, Int. J. Mol. Sci. 4, (2003). [12] *O. V. Shishkin, *L. Gorb, *A. V. Luzanov, M. Elstner, S. Suhai and *J. Leszczynski: Structure and conformational flexibility of uracil: A comprehensive study of performance of the MP2, B3LYP and SCC-DFTB methods, J. Mol. Struct. (Theochem) 625, (2003). [13] *S. Abdali, T. A. Niehaus, K. J. Jalkanen, *X. Cao, *L. A. Nafie, *Th. Frauenheim, S. Suhai and *H. Bohr: Vibrational absorption spectra, DFT and SCC-DFTB conformational study and analysis of [Leu]enkephalin, Phys. Chem. Chem. Phys. 5, (2003). [14] *D. Reha, *M. Kabelác, *F. Ryjácek, *J. Sponer, *J. E. Sponer, M. Elstner, S. Suhai and *P. Hobza: Intercalators. 1. Nature of stacking interactions between intercalators (ethidium, daunomycin, ellipticine, and 4,6-diaminide-2-phenylindole) and DNA base pairs. Ab initio quantum chemical, density functional theory, and empirical potential study, J. Am. Chem. Soc. 124, (2002). [15] F. Tasnádi and *Á. Nagy: Local self-interaction-free approximate exchange-correlation potentials in the variational density functional theory for individual excited states, Chem. Phys. Lett. 366, (2002). [16] *P. Pulay and B. Paizs: Newtonian molecular dynamics in general curvilinear internal coordinates, Chem. Phys. Lett. 353, (2002). Abteilung B020 Molekulare Biophysik [17] G. J. Halász, Á. Vibók, S. Suhai and *I. Mayer: Toward a BSSE-free description of strongly interacting systems, Int. J. Quant. Chem. 89, (2002). [18] A. Bende, M. Knapp-Mohammady and S. Suhai: BSSE-free description of intermolecular force constants in hydrogen fluoride and water dimers, Int. J. Quant. Chem. 92, (2003). [19] A. Bende, Á. Vibók, G. J. Halász and S. Suhai: Ab initio study of the ammonia-ammonia dimer: BSSE-Free structures and intermolecular harmonic vibrational frequencies, Int. J. Quant. Chem. 99, (2004). [20] Á. Vibók, G. J. Halász, *T. Vértesi, S. Suhai, *M. Baer and *J. P. Toennies: Ab-initio conical intersections for the Na + H 2 system: A four-state study, J. Chem. Phys. 119, (2003). [21] *S. Abdali, K. J. Jalkanen, *H. Bohr, S. Suhai and *R. M. Nieminen: The VA and VCD spectra of various isotopomers of L- alanine in aqueous solution, Chem. Phys. 282, (2002). [22] K. J. Jalkanen, *R. M. Nieminen, M. Knapp-Mohammady and S. Suhai: Vibrational analysis of various isotopomers of L-alanyl-Lalanine in aqueous solution: Vibrational absorption, vibrational circular dichroism, Raman and Raman optical activity spectra, Int. J. Quant. Chem. 92, (2003). [23] K. J. Jalkanen, M. Elstner and S. Suhai: Amino acids and small peptides as building blocks for proteins: comparative theoretical and spectroscopic studies, J. Mol. Struct. (Theochem) 675, (2004). [24] H. Zhou, *E. Tajkhorshid, *Th. Frauenheim, S. Suhai and M. Elstner: Performance of the AM1, PM3, and SCC-DFTB methods in the study of conjugated Schiff base molecules, Chem. Phys. 277, (2002). [25] A.-N. Bondar, M. Elstner, S. Suhai, *J. C. Smith and *S. Fischer: The primary proton transfer step in bacteriorhodopsin can follow multiple pathways, Nature Struct. Biol. (in press). [26] N. Bondar, *S. Fischer, *J. Smith, M. Elstner and S. Suhai: Exploration of multiple pathways for primary proton transfer in bacteriorhodopsin, J. Am. Chem. Soc. (in press). [27] A. Hotz-Wagenblatt and W. Dröge: Redox-mediated functional and structural changes in insulin receptor kinase, In: Protein Sensors and Reactive Oxygen Species, Pt B, Thiol Enzymes and Proteins (Methods in Enzymology) 348, (2002). [28] C. d. Val, P. Ernst, R. Bräuning, K.-H. Glatting and S. Suhai: PATH: a task for the inference of phylogenies, Bioinformatics 18, (2002). [29] P. Ernst, K.-H. Glatting and S. Suhai: A task framework for the web interface W2H, Bioinformatics 19, (2003). [30] A. Hotz-Wagenblatt, *T. Hankeln, P. Ernst, K.-H. Glatting, *E. R. Schmidt and S. Suhai: ESTAnnotator: a tool for high throughput EST annotation, Nuc. Acids Res. 31, (2003).

111 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B030 Tumorgenetik Abteilung Tumorgenetik (B030) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Manfred Schwab Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Isabel Büttel (1/03-) Dr. Evgeny Sagulenko (1/03) Dr. Larissa Savelyeva Dr. Frank Westermann Dr. Ruprecht Wiedemeyer (8/02-) Gastwissenschaftler Dr. Michail Repin (3/02-) Moskau, Russland Doktoranden Katrin Arnold Stefan Brouwers Anne Fechter (1/02-) Kai-Oliver Henrich Min-Kyoung Kim Isabel Matzner (-12/02) Tobias Paffhausen (10/02-) Vitaliya Sagulenko Malgorzata Sawinska (6/03-) Jens Schmitt (2/02-) Ruprecht Wiedemeyer (-7/02) Technischer Assistent Young-Gyu Park Sekretariat Cornelia Kirchner Genetische Veränderungen gelten heute als zentraler Mechanismus der Entstehung von Krebserkrankungen. Forschungsthema der Abteilung ist die Ermittlung der Rolle genetischer Veränderungen bei unterschiedlichen humanen Krebserkrankungen. Im Mittelpunkt steht dabei ein Krebs des Nervenzellsystems bei Kindern, das Neuroblastom, sowie erbliche Formen von Brustkrebs. In Hinblick auf die genetische Analyse der humanen Krebszelle und auf die Ermittlung von Mechanismen der Krebsentstehung setzen wir in der Kombination experimentelle Ansätze der klassischen und molekularen Zytogenetik, der Molekulargenetik und der Proteinbiochemie ein. Genetische Veränderungen bei Neuroblastomen und Brustkrebs M. Schwab 1. Neuroblastom In Zusammenarbeit mit: Dr. Javed Khan, NCI, Advanced Technology Center, Gaithersburg, USA; Prof. Frank Berthold, Univ.- Kinderklinik, Köln. Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor bei Kleinkindern. Zwei Arten genetischer Veränderungen sind häufig mit Neuroblastomen assoziiert: a.) Amplifikation des Onkogens MYCN; und b.) Veränderungen, zumeist Deletionen oder Translokationen, im distalen Chromosom 1p-Bereich, welche die Anwesenheit eines Tumorsuppressorgens signalisieren. Amplifikation von MYCN wird klinisch als ein wichtiger molekularer Parameter zur Therapiegestaltung eingesetzt. Patienten mit Amplifikation haben ungünstige Prognose und werden daher intensiver therapiert als Patienten ohne Amplifikation; und Patienten mit einem Neuroblastom bestimmten Stadiums haben keinen Vorteil von einer Chemotherapie, wenn Amplifikation fehlt. Bei der Identifizierung der Funktionen des MYCN Proteins gelang vor allem der Nachweis, daß Überexpression in Kombination mit Interferon-gamma effiziente Apoptose der Neuroblastomzellen auslöst. Wir prüfen, ob sich hieraus Perspektiven für neue Therapieformen ergeben könnten. Veränderungen in distalem 1p-Bereich werden bei etwa 70-80% der diploiden Neuroblastome beobachtet, besitzen aber offensichtlich keine klinische Signifikanz. In der Regel handelt es sich um Deletionen, aber wir haben auch reziproke oder nicht-balancierte Translokationen identifiziert, die uns Zugang zum vermuteten Tumor-Suppressorgen ermöglichen sollten. Das derzeit vor allem hinderliche Problem der geringen Information über die genomische Struktur und die informative Komplexität der distalen 1p Region hoffen wir durch eine konzentrierte Genomanalyse dieser Region zu überwinden. Die Akquisition der notwendigen Materialien in Form von YACs sowie die Ausarbeitung der entsprechenden Strategie zur genetischen Analyse gelang im Berichtszeitraum. 2. Erbliche Formen von Brustkrebs In Zusammenarbeit mit: Prof. Peter Schlag, Prof. Siegfried Scherneck, Max-Delbrück-Centrum, Berlin-Buch. Brustkrebs gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen, er tritt in der Regel bei Frauen auf, zu einem geringen Prozentsatz aber auch bei Männern. Etwa 10-15% aller Brustkrebserkrankungen sind erblich bedingt. Als genetische Determinanten wurden bei einem Teil der Familien Keimbahnmutationen des Gens BRCA1, bei einem anderen Teil Mutationen des Gens BRCA2 identifiziert. Risikopatienten besitzen in allen Körperzellen ein normales und ein mutiertes Allel. Sobald das normale Allel mutiert, kommt es zum Ausfall der betreffenden Genfunktion mit der Konsequenz des Brustkrebs. Die anfänglichen Befunde wiesen auf ein etwa 90%iges Risiko für Brustkrebserkrankung bis zum Alter von 70 Jahren hin. Dementsprechend war die Euphorie anfänglich sehr hoch, einen prädiktiven genetischen Marker für die präsymptomatische Identifizierung von Hochrisiko- Patienten gefunden zu haben. Erst die sorgfältige weitere genetisch-epidemiologische Analyse führte zu der Einsicht, daß dieses hohe Risiko auf Hochrisikofamilien beschränkt 111

112 112 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung ist, ebensolche, die zur Identifizierung der BRCA1/2 Gene als besonders geeignet ausgewählt worden waren, solche Familien sind aber relativ selten. Das statistische Risiko nicht besonders ausgewählter Populationen erwies sich als wesentlich niedriger, etwa 55% bis zum Alter von etwa 70 Jahren. Derzeit läßt sich also das reale Risiko nach Identifizierung einer BRCA1/2 Mutation nicht abschätzen, es kann in Gegenwart derselben Mutation bei der einen Familie hoch, bei der anderen niedrig sein. Offensichtlich wird die Höhe des Risikos durch weitere genetische Faktoren determiniert - sogenannter Modifikationsgenen. Die Existenz solcher Modifikationsgene deutet sich auch durch zwei weitere Phänotypen an: dieselbe BRCA2 Mutation bedingt in manchen Familien Brustkrebsrisiko bei männlichen, in anderen bei weiblichen Mitgliedern; und wiederum dieselbe Mutation bedingt bei manchen Familien ausschließlich Brustkrebs, bei anderen Familien treten aber auch andere Typen von Krebs auf. Da die sichere Bestimmung des Brustkrebsrisikos hohe Bedeutung besitzt, wird intensiv nach Modifikationsgenen gesucht. Zwei Möglichkeiten existieren: zum einen die genetische Kopplungsanalyse, die aber gerade bei Genen mit geringer oder variabler Penetranz problematisch ist. Zum anderen die zytogenetische Analyse, die zunächst auf den Nachweis zusätzlich konstitutioneller Chromosomenveränderungen abzielt. So gelang uns kürzlich in Zellen von Hochrisiko-Patienten mit BRCA2 Mutation erstmals der Nachweis der Koexistenz von distaler 9p Chromosomeninstabilität. Diese Patienten besitzen also bereits in ihren normalen Zellen sowohl die BRCA2 Mutation wie auch die 9p Instabilität. Sollte in distalen 9p einer der gesuchten Modifikationsfaktoren lokalisiert sein? Gerade für die Klärung solcher Fragen dürfte die etablierte Sequenz des Humangenoms als hervorragendes Werkzeug dienen. 3. Fragile sites Fragile sites sind nicht-zufällig verteilte instabile Chromosomenregionen, die durch unterschiedliche Noxen, z.b. Tabakrauch, induzierbar sind. Sie erscheinen bei mikroskopischer Betrachtung von Chromosomen als Brüche. Die Reparatur der entsprechenden DNA-Defekte ist gelegentlich unvollständig, und es können genetische Schäden in der Zelle entstehen. Über die molekulare Identität der entsprechenden DNA-Sequenzen an den etwa 120 fragile sites des humanen Genoms herrscht noch weitgehende Unklarheit. Es ist ein Ziel unserer Arbeiten, diese DNA-Sequenzen möglichst vollständig zu isolieren, zu charakterisieren, und ihre vermutete Rolle bei der Entstehung humaner Krebserkrankungen zu ermitteln. Wir haben hierzu ein genetisches Verfahren ausgearbeitet, welches die Markierung und Isolierung sämtlicher fragile site DNA-Sequenzen des humanen Genoms ermöglichen wird. Abteilung B030 Tumorgenetik Publikationen (* = externer Koautor) [1] Schwab, M., Claas, A., Savelyeva, L., BRCA2: A genetic risk factor for breast cancer. Cancer Letters (2002) [2] Schwab, M., Amplified MYCN in human neuroblastoma: A paradigm for the translation of molecular genetics to clinical oncology. Ann. N.Y. Acad. Sci. 963, 1-11 (2002) [3] *Godfried, M.B., *Veenstra, M., *v. Sluis, P., *Boon, K., *v. Asperen, R., *Hermus, M.C., *v. Schaik, B.D.C., *Voute, T.P.A., Schwab, M., *Versteeg, R., *Caron, H.N. The N-myc and c-myc downstream pathways include the cromosome 17q genes nm23- H1 and nm23-h2. Oncogene 21, (2002) [4] *Spitz, R., *Hero, B., Westermann, F., *Ernestus, K., Schwab, M., *Berthold, F. Fluorescence in situ hybridization analyses of chromosome band Ip36 in neuroblastoma detect two classes of alterations. Genes, Chromosomes & Cancer 34: (2002) [5] Westermann, F., Schwab, M. Genetic parameters of neuroblastomas. Cancer Letters 184, (2002) [6] Mädge, B., *Geisen, C., *Möröy, T., Schwab, M. Yaf2 inhibits Myc biological function. Cancer Letters 193, (2002) [7] Zitzmann, S., *Ehemann, V., Schwab, M. Arginine-Glycine- Aspartic Acid (RGD)-peptide binds to both tumor and tumor-endothelial cells in vivo. Cancer Research 62, (2002) [8] Zitzmann, S., Askoxylakis, V., *Mier, W. Phagen-Display Bibliotheken: mit viren auf der Suche nach neuen Targets. BIOforum 25, (2002) [9] *Berwanger, B., *Hartmann, O., *Bergmann, E., *Bernard, S., *Nielsen, D., *Krause, M., *Kartal, A., *Flynn, D., Wiedemeyer, R., Schwab, M., *Schäfer, H., *Christiansen, H., *Eilers, M., Loss of a FYN-regulated differentiation and growth arrest pathway in advanced stage neuroblastoma. Cancer Cell 2, 1-10 (2002) [10] Matzner, I., Savelyeva, L., Schwab, M. Preferential integration of transfected marker gene into spontaneously expressed fragile sites of a breast cancer cell line. Cancer Letters 189, (2003) [11] Wiedemeyer, R., Westermann, F., Wittke, I., *Nowock, J., Schwab, M. Ataxin-2 promotes apoptosis of human neuroblastoma cells. Oncogene 22, (2003) [12] Praml, C., Saveleva, L., Schwab, M., Aflatoxin B 1 Aldehyde Reductase (AFAR) genes cluster at 1p35-1p36.1 in a region frequently altered in human tumour cells. Oncogene 22, (2003) [13] Schwab, M., *Evans, A., Neuroblastoma developmental and molecular biology meet therapy design. Cancer Letters 197, 1 (2003) [14] Schwab, M., Westermann, F., *Hero, B., *Berthold, F., Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncology 4, (2003) [15] Wittke, I., Wiedemeyer, R., Pillmann, A., Savelyeva, L., Westermann, F., Schwab, M. Neuroblastoma-derived sulfhydryl oxidase/quiescin6 family, regulates sensitization to Interferon gamma-induced cell death in human neuroblastoma cell. Cancer Research 63, (2003) [16] *Sugihara, E., *Kanai, M., *Matsui, A., *Onodera, M., Schwab, M., *Miwa, M. Enhanced expression of MYCN leads to centrosome hyperamplification after DNA damage in neuroblastoma cells. Oncogene 23, (2004) [17] Schwab, M., MYCN in neuronal tumours. Cancer Letters 204, (2004)

113 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle Abteilung Biophysik der Makromoleküle (B040) Leiter: Prof. Dr. Jörg Langowski Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Katalin Tóth Dr. Waldemar Waldeck Dr. Malte Bussiek Dr. Konstantin Klenin (9/03 -) Dr. Malte Wachsmuth (- 9/02) Dr. Thomas Weidemann (9/02-6/03) Gastwissenschaftler Dr. Flavia Barone (1/03) Dr. Serena Bernacchi (9/02 -) Dr. Andrea Bodnár (12/03) Prof. Dr. Giuseppe Chirico (1/03) Dr. Gabriella Csík (1/02, 1/03) Prof. Dr. Judit Fidy (6/03) Dr. Konstantin Klenin (5/03) Dr. Filip Lankas (- 5/03) Dr. Filomena Mazzei (1/03) Dr. György Vámosi (7/02, 2/03, 12/ 03) Doktoranden/Diplomanden Frank Aumann (12/02 -) Nina Baudendistel Nicolas Dross (5/03 -) Marianna Egyeki (9/03 -) Alexander Gansen (2/03 -) Lutz Gehlen (3/03 -) Florian Hauger (12/02 -) Robert Kirmse (seit 10/02) Thomas Weidemann (- 8/02) Technische Assistenten Nathalie Brun Norbert Mücke Gabriele Müller Sekretariat Christine Drehsen (Teilzeit, 2/02 -) Das Hauptziel der Arbeit der Abteilung Biophysik der Makromoleküle ist es, die dreidimensionale Organisation des genetischen Materials und ihre Beziehung zu seiner Funktion an Hand einfacher theoretischer und experimenteller Modelle zu verstehen. Insbesondere interessieren uns der Einfluss lokaler Strukturänderungen auf die globale Konformation größerer DNA-Domänen, die Rolle der Struktur der DNA bei der Regulation der Transkription aus der Distanz, sowie die Dynamik des Chromatins im Interphasenkern. Wir untersuchen als Modell die Struktur von superhelikaler DNA, von Komplexen von DNA mit regulatorischen Proteinen und von Oligonukleosomen. Dazu bedienen wir uns verschiedener biophysikalischer Techniken wie Lichtstreuung, analytischer Ultrazentrifugation, Rasterkraftmikroskopie sowie Fluoreszenz- und Absorptionsspektroskopie. Aussagen der Modelle über den Effekt der DNA-Struktur auf die Transkriptionsregulation aus der Distanz werden auch durch in vitro- Transkriptionsexperimente quantitativ verifiziert. Die experimentellen Daten werden mit numerischen Modellen verglichen, die die Struktur und Dynamik von DNA, Chromatin und ganzen Chromosomen quantitativ beschreiben. Ein besonderer Schwerpunkt unserer Arbeit liegt in der Entwicklung und Anwendung von Einzelmolekültechniken wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS). In Verbindung mit anderen Fluoreszenztechniken wie Photobleaching können damit quantitative Aussagen über die Dynamik fluoreszenzmarkierter Proteine und Nukleinsäuren in lebenden Zellen erhalten werden. Die in unserer Abteilung etablierten biophysikalischen Verfahren sind auch für andere Gruppen des DKFZ von Interesse, die die Struktur größerer Biopolymere in vitro und in vivo untersuchen wollen. Allgemeine Informationen über die aktuellen Forschungsaktivitäten können auf unserer WWW-Seite eingesehen werden: Einführung: Genomorganisation in Raum und Zeit Eine der großen Herausforderungen der modernen Biologie ist es zu verstehen, wie das Genom in unterschiedlichen physiologischen Zuständen der Zelle organisiert ist und wie diese Organisation mit seiner Funktion zusammenhängt. Bei der Aktivierung vieler eukaryontischer Gene bildet sich z.b. eine DNA Schleife zwischen Enhancer und Promoter aus, deren Struktur die Wechselwirkung bestimmt. Auf höherer Strukturebene werden Gene durch Kompaktierung und Dekompaktierung der Chromatinfiber reguliert, die durch Modifikationen an Histonen und DNA kontrolliert werden. Schließlich ist die Chromatinfiber selbst in Interphase- und Metaphasechromosomen wie ein flexibler Faden gefaltet, und diese Faltung hängt ebenfalls mit der Genaktivität zusammen. Daher bestimmt die dreidimensionale Struktur des Genoms über die lineare Sequenzinformation hinaus in fundamentaler Weise seine Funktion. Unsere Abteilung besteht am DKFZ seit Juni 1994 und beschäftigt sich mit den physikalischen Grundlagen der Genomorganisation in vivo, sowie allgemein mit der Entwicklung und Anwendung experimenteller und theoretischer biophysikalischer Techniken zur Untersuchung der Struktur großer flexibler Biomoleküle. Die einzelnen Forschungsprojekte werden im Folgenden dargestellt. 113

114 114 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung DNA-Flexibilität auf multiplen Größenskalen F. Lankas, J. Langowski In Zusammenarbeit mit Jiri Sponer (Universität Brno) und Thomas A. Cheatham III (University of Utah) Die mechanische Verformbarkeit der DNA spielt eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie DNA-Protein- Wechselwirkung, Chromatinkompaktierung und der räumlichen Organisation des Genoms im Zellkern. Die Art der Deformation hängt von der Längenskala ab: beispielsweise ist die spezifische Bindung von Proteinen an DNA direkt mit den strukturellen und mechanischen Eigenschaften von konformationellen Unterzuständen der Nukleinsäure verknüpft. Auf größeren Längenskalen kann die gesamte DNA als flexible Kette durch Parameter wie die Biege- und Torsionsflexibilität beschrieben werden [3,9,15,29], und schließlich kann die Chromatinfiber selbst als flexibles Filament angenähert werden [28]. Bis zu einer Länge von Basenpaaren sind molekulardynamische Simulationen der DNA in atomarer Auflösung unter expliziter Einbeziehung von Gegenionen und Wasser möglich. Eine Reihe solcher Simulationen haben wir mit dem Programmsystem AMBER auf den Hochleistungsrechnern des DKFZ durchgeführt und Trajektorien von 5-10 ns Länge mit verschiedenen Methoden analysiert. Hierbei untersuchen wir einerseits mögliche konformationelle Unterzustände der DNA, sowie die Fluktuationen von Konformationsparametern für die Berechnung der sequenzabhängigen Flexibilität. Im allgemeinen finden wir eine erhöhte Flexibilität für Pyrimidin-Purin-Schritte. Eine Korrelationsanalyse der strukturellen Fluktuationen zeigte auch, dass die DNA-Flexibilität nicht nur von den direkten Nachbarn eines Basenpaars abhängt, sondern dass weiter reichende Effekte (bis zu 3-4 Basenpaaren) eine Rolle spielen [1,17,30]. Modellierung der 30nm-Chromatinfiber F. Aumann, F. Lankas, K. Klenin, J. Langowski In unserem Computermodell der Chromatinfiber wird die DNA durch eine Kette von zylinderförmigen Segmenten dargestellt, auf der die Nukleosomen in regelmäßigen Abständen als flache Zylinder repräsentiert sind. Die Nukleosomen wechselwirken miteinander über ein schwach anziehendes Potential; die elektrostatische Wechselwirkung der DNA-Segmente wird in der Debye-Hückel-Näherung dargestellt. Konfigurationen der Polynukleosomenkette im thermodynamischen Gleichgewicht werden dann durch einen Metropolis-Monte Carlo-Algorithmus erzeugt. Das Simulationsprogramm wurde in C++ optimiert für parallele Rechnersysteme entwickelt. Simulationen von 100 Nukleosomen langen Ketten bei physiologischer Ionenstärke führen zu Strukturen, die die experimentell bekannten Eigenschaften von Chromatinfibern wie Durchmesser, Massenbelegungsdichte und Neigungswinkel der Nukleosomen zur Fiberachse gut reproduzieren. Besonders bemerkenswert ist, dass die simulierte Chromatinfiber eine spiralförmige Struktur hat, d.h., der äußere Aspekt ist ähnlich dem Solenoidmodell, wobei aber anders als bei letzterem keine starke Krümmung der Linker-DNA zwischen Nukleosomen notwendig ist [2]. Simulationen zur Streckung der kondensierten Chromatinketten zeigen ein qualitativ ähnliches Verhalten im Vergleich mit experimentellen Daten [Bennink et al. 2001, Nat Struct Biol 8(7):606-10] und geben Aufschluss über eventuelle Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle geometrische Veränderungen der Chromatinkette bei der Streckung. Die aus den simulierten Streckexperimenten berechneten Elastizitätsparameter zeigen, dass die Chromatinfiber gegenüber Verbiegung deutlich flexibler ist als gegenüber Streckung. Flexibilität von Hefechromosomen L. Gehlen, J. Langowski In Zusammenarbeit mit Kerstin Bystricky und Susan Gasser, Universität Genf, Schweiz Hefe ist wegen des kleinen, gut charakterisierten Genoms ein ideales Modellsystem zur Untersuchung der Genomdynamik. In der Arbeitsgruppe von Prof. Susan Gasser (Uni Genf) ist die Dynamik von Chromosomen in Hefe unter Anwendung verschiedener Fluoreszenztechniken auf Zeitskalen von Zehntelsekunden bis hin zu Minuten untersucht worden. Im Rahmen dieser Zusammenarbeit wurde die Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, siehe unten) eingesetzt, um die Beweglichkeit von Hefechromosomen auf kurzen Zeitskalen zu untersuchen. Dies sind die ersten bisher beschriebenen FCS-Messungen in Hefezellen. Zunächst wurde anhand der Diffusion von freiem GFP die Anwendbarkeit der Messmethode auf Hefezellen und ihre Kerne untersucht. Die spezifische Bindung eines mit GFP fusionierten Repressorproteins an einen DNA-Abschnitt wurde ausgenutzt, um die Bewegung von Chromosomen zu beobachten. Nach Anpassung einer Modellfunktion mit zwei Spezies konnten signifikante Unterschiede zwischen Zellen mit markiertem Chromosom und solchen, die nur den freien Repressor enthalten, festgestellt werden. Die Unterschiede liegen in der Diffusionszeit und der Amplitude einer langsamen Komponente, die von der Bewegung der Chromosomenarme herrührt. Um die Daten theoretisch zu untermauern, wurde unser Brownsche-Dynamik-Simulationsprogramm auf die Modellierung der 30nm-Chromatinfiber umgestellt und um Funktionen zur Simulation von Chromatin im Zellkern und die Bindung des Zentromers an den spindle pole body erweitert. Erste Ergebnisse der Simulation von Hefechromosomen deuten darauf hin, dass sich durch den Vergleich mit experimentellen Resultaten zwischen verschiedenen diskutierten Parametersätzen für die mechanischen Eigenschaften von Chromatin unterscheiden lässt [Gehlen, Diplomarbeit, Fak. für Physik, Uni Heidelberg; Bystricky et al PNAS, eingereicht]. Geometrie der Linker-DNA in Mononukleosomen - Effekt der Histonacetylierung K. Tóth, N. Brun, J. Langowski Die Struktur des Grundbausteines von Chromatin, des Nukleosoms, ist seit einiger Zeit in atomarem Detail bekannt. In der Chromatinfiber ist die DNA in regelmäßigen Abständen um Histonoktamere gewunden; wie die so gebildeten Nukleosomen dreidimensional zu einer übergeordneten Struktur arrangiert sind, ist jedoch noch nicht geklärt. Wir versuchen hier, durch Untersuchungen der DNA-Struktur in der Nähe des Histonkerns Aussagen über solche Strukturen zu gewinnen. Dazu werden Nukleosomen auf DNA- Fragmenten von bp Länge rekonstituiert, die an den Enden mit jeweils einem Donor- und einem Akzeptor- Fluorophor markiert sind. Nach Bindung der DNA an den Histonkern wird durch FRET der mittlere Abstand zwischen den Fluorophoren als Funktion der DNA-Länge, der Salz-

115 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung konzentration und der Anwesenheit von Linker-Histon H1 bestimmt. Dieser Abstand nimmt mit der Länge der DNA monoton zu, was darauf hindeutet, dass sich die Arme der Linker-DNA im Mononukleosom nicht überkreuzen. Außerdem scheint die durch H1 induzierte, in EM-Aufnahmen festgestellte sog. Stem-Geometrie auch in freier Lösung zu existieren [Tóth et al. 2001, Biochemistry 40(23): ]. In Gegenwart von H1 und höheren Salzkonzentrationen bildet die Nukleosomenkette reguläre sog. Chromatin-fiber - Strukturen. Als einer der strukturbildenden Faktoren wird hier die Neutralisierung der elektrostatischen Abstoßung zwischen freien DNA-Bereichen durch das Linker-Histon vermutet. Wir finden in unseren FRET-Messungen an Mononukleosomen, dass Histon H1 den Abstand zwischen den Linker-DNA-Enden für alle untersuchten DNA-Längen um 5-10 Å verringert. Zunahme der NaCl-Konzentration von 5 auf 100 mm vermindert den Abstand nur sehr wenig (< 5Å), wogegen MgCl 2 -Zugabe von 0-2 mm bei NaCl- Konzentrationen von 5 mm den Abstand monoton um bis zu 10 Å verringert. Diese Salzeffekte zeigen sich in analoger Weise mit oder ohne Histon H1. Chemische Acetylierung der Histone durch Acetylphosphat führt zu Änderungen der Geometrie der Linker-DNA. Komplette Acetylierung aller Histone oder von H3 alleine führt zu einer globalen Vergrößerung des Öffnungswinkels der Linker-DNA, während Acetylierung von H4 alleine überraschenderweise eine Annäherung der Linkerarme induziert (Abb. 1) Abb. 1: Abstand der Linker-DNA-Enden in rekonstituierten Mononukleosomen als Funktion der Salzkonzentration und der DNA- Länge. Schwarz: nicht acetyliert, rot: alle Histone acetyliert, grün: H3 acetyliert, blau: H4 acetyliert Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle Rasterkraftmikroskopie von Nukleosomen und superhelikaler DNA M. Bussiek, J. Langowski Um den Einfluss der Nukleosomenbindung auf die globale Struktur von DNA zu untersuchen, haben wir einzelne auf superhelikaler DNA rekonstituierte Nukleosomen mit Rasterkraftmikroskopie (SFM) untersucht. Die Bedingungen für diese SFM-Experimente waren in einer früheren Arbeit ermittelt worden [18]. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass DNA-Krümmungen in den Endschleifen der Superhelix lokalisieren, und wir erwarteten bei der Bindung von Nukleosomen einen ähnlichen Effekt. Ein Vergleich von rekombinanten Histonen (nicht acetyliert) und teilweise acetylierten HeLa-Histonen zeigte klare Unterschiede zwischen den beiden Präparationen: die HeLa-Histone waren hauptsächlich in den Endschleifen lokalisiert, während die Nukleosomen aus rekombinanten Histonen zusätzlich oft an Kreuzungspunkten der Superhelix zu finden waren. Wir folgern daraus, dass Nukleosomen in bestimmten Fällen gleichzeitig an zwei DNA-Doppelstränge binden können, was insbesondere bei den stärker bindenden nichtacetylierten Histonen auftritt. In einer weiteren Arbeit haben wir systematisch die Bindung von DNA an Polylysin-behandelte Glimmeroberflächen für SFM-Beobachtungen in Lösung untersucht. Optimale Bedingungen für zweidimensionale Äquilibrierung auf der Oberfläche, sowie für Einfrieren der Konformation (trapping) bei verschiedenen Salz- und Polylysinkonzentrationen konnten definiert werden [20]. Untersuchung des makromolekularen Transports im Interphasezellkern mit Fluoreszenzfluktuationsmikroskopie N. Dross, J. Langowski, M. Wachsmuth, T. Weidemann Transport und Bindung von Molekülen zu spezifischen Sites sind essentiell für den Aufbau und die Funktion von organisierten supramolekularen Strukturen im Zellkern. Das un unserer Arbeitsgruppe entwickelte Fluoreszenzfluktuationsmikroskop (FFM) erlaubt die Beobachtung der Konzentration und Mobilität von fluoreszierenden Molekülen in vivo durch eine Kombination von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) und Photobleaching (CP). Das Diffusions- und Bindungsverhalten verschiedener fluoreszenzmarkierter Makromoleküle wurde mit FCS und CP analysiert und mit einer neuen Theorie beschrieben [14]. Damit konnte z.b. die mittlere Aufenthaltsdauer von Transkriptionsfaktoren an Bindungsstellen im Zellkern bestimmt werden und ein Verfahren entwikkelt werden, um die absolute Chromatindichte in Interphasezellkernen zu messen [19]. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass der Volumenanteil der Chromatinfiber z.b. in HeLa-Zellen nur etwa 10% ausmacht und dass alle Bereiche des Zellkerns für kleinere Proteinmoleküle zugänglich sind. Letzteres wurde auch durch neuere Messungen bestätigt, bei denen das Diffusionsverhalten eines rot fluoreszierenden Proteins mit der Chromatindichte korreliert wurde. Es zeigte sich keine Abhängigkeit der Mobilität von der Chromatindichte (Dross und Langowski, unveröffentlicht). In vivo-charakterisierung von Protein-Protein- Wechselwirkungen im AP-1-System mit Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie N. Baudendistel, G. Müller, W. Waldeck, J. Langowski In Zusammenarbeit mit Peter Angel (DKFZ) Das AP-1-System besteht aus einer Gruppe von TPA- (Tetradecanoylphorbolacetat) induzierbaren Transkriptionsaktivatoren. Die Hauptbestandteile sind c-jun und c-fos, beides Proteine mit einer für die Dimerisierung zuständigen Leucin-Zipper-Region. C-Jun bildet sowohl Heterodimere 115

116 116 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung mit anderen Mitgliedern der AP1-Familie als auch Homodimere, während c-fos nur Heterodimere bildet. Nur die Dimer binden an DNA und aktivieren die Transkription. Deregulation von AP1 kann zu onkogenen Transformationen führen. Bis jetzt wurde die Wechselwirkung zwischen Jun und Fos nicht in vivo beobachtet. Um sie sichtbar zu machen, wurden c-jun und c- Fos mit verschiedenen autofluoreszierenden Proteinen fusioniert und in HeLa-Zellen exprimiert. Die Wechselwirkung der beiden Proteine wurde dann durch Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) nachgewiesen (Abb. 2). Hierbei werden korrelierte Fluktuationen der Fluoreszenz in zwei Farbkanälen beobachtet, die nur dann auftreten, wenn die beiden Proteinen aneinander binden [4]. Außerdem wurde die Mobilität der Proteine wie oben beschrieben durch FCS charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass für eine Lokalisierung der Transkriptionsfaktoren im Zellkern sowohl die DNA-Bindungsals auch die Dimerisierungsdomäne notwendig sind. Bei der Kotransfektion von Zellen mit rot bzw. grün fluoreszierend markiertem c-jun und c-fos konnte eine eindeutige Zunahme der Kreuzkorrelationsamplitude beobachtet werden, die in Abwesenheit der DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomänen nicht auftrat. Die Fluktuationen, die dem Fos/ Jun-Dimer entsprechen, liegen in einem langsamen Zeitbereich, der der Bewegung der Chromatinkette entspricht. Dies deutet darauf hin, dass die Fos/Jun Dimerisierung erst bei Bindung an die DNA stattfindet. Abb. 2: Autokorrelation des roten und grünen Fluoreszenzkanals (rot, grün) und Kreuzkorrelation (blau) eines Fusionsproteins aus RFP und GFP in lebenden HeLa-Zellkernen. Untersuchungen viraler Eintrittsmechanismen in die Zelle mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie am Beispiel von SV40 S. Bernacchi, W. Waldeck, J. Langowski In Zusammenarbeit mit Jürgen Kleinschmidt (DKFZ) Das zur Polyoma-Familie gehörende SV40-Virus ist das einfachste bekannte doppelsträngige DNA-Virus. Onkogen in Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle verschiedenen Tiermodellen, dient es als Modellsystem für die Untersuchung von Funktionsmechanismen von Tumorviren. SV40 wird nach Endocytose zum endoplasmatischen Retikulum transportiert; der weitere Verlauf des Transports zum und im Zellkern ist noch unklar. Eine wichtige Fragestellung in diesem Zusammenhang ist, wo und wann das virale Capsid sich auflöst und in welcher Form das SV40-Genom im Zellkern transportiert wird. Wir untersuchen in diesem Zusammenhang mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) i) die Diffusion des Virus außerhalb der Zelle und die Bindung an den Rezeptor, ii) die Bildung des Endosoms im Zytoplasma, iii) den intrazellulären Transport des Endosoms und iv) den Transport in den und im Zellkern. Hierzu haben wir Capsidproteine chemisch mit Fluorophoren und das virale Genom, das als Minichromosom vorliegt, durch autofluoreszierende Histonkonstrukte [6] markiert. Erste Ergebnisse zeigen, dass die Diffusion intakter Viren und freier Capsidproteine in der Zelle deutlich unterschieden werden kann; auch die Diffusion des fluoreszenzmarkierten Genoms im Zellkern konnte beobachtet werden. Flexibilität und Assemblierung von Intermediärfilamenten N. Mücke, R. Kirmse, J. Langowski In Zusammenarbeit mit Tatjana Wedig and Harald Hermann (DKFZ) sowie Laurent Kreplak und Uli Aebi (Biozentrum Basel, Schweiz) Intermediärfilamente sind die Hauptkomponenten des Zytoskeletts von Metazoen. Im besonderen scheinen sie für die mechanische Stabilität der Zellen verantwortlich zu sein. Aus diesem Grund haben wir Intermediärfilamente mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht, um neue Informationen über ihre Struktur und die mechanischen Eigenschaften zu erhalten. Hierfür wurden Filamente aus rekombinantem humanen Vimentin in vitro gebildet, und dann auf Glimmer gebracht und in Luft sowie in Flüssigkeit vermessen. Für eine standard-elektronenmikroskopische Darstellung werden Filamente mit Glutaraldehyd fixiert und mit Uranylacetat kontrastiert. Solchermaßen drastische Behandlung kann in der Rasterkraftmikroskopie durch Messungen in Flüssigkeit vermieden werden, d.h. die Filamente können direkt in physiologischem Puffer vermessen werden. Nur wenn man die Präparate in Luft analysiert, muß noch fixiert werden, um ein Auflösen der Filamente beim Entfernen des Salzes zu verhindern. In unseren Experimenten wurde aus den zweidimensionalen Konturen der IFs die Persistenzlänge der Filamente als Maßzahl für ihre Flexibilität bestimmt (Abb. 3). Es wurde dazu ein neues Verfahren entwickelt, mit dem die Persistenzlänge aus dem mittleren quadratischen End-zu-End-Abstand und dem mittleren Biegewinkel der Filamente sehr genau ermittelt werden kann. Mit diesem Verfahren konnten auch die Bedingungen bestimmt werden, in denen die Konformation der Filamente auf der Oberfläche im Gleichgewicht ist, so dass die gemessenen Eigenschaften nicht durch schnelle Bindung an die Oberfläche ( trapping ) beeinflusst werden. Unter diesen Bedingungen fanden wir, dass Humanvimentin Filamente mit einer Persistenzlänge von 1 µm bildet [27]. Dies ist eine relativ starre Struktur, jedoch flexibel verglichen mit der Steifheit eines Vimentintetramers. Wir nehmen daher an, dass bei der Verformung von Vimentin die tetrameren Untereinheiten aneinander vorbei gleiten können. Die Konsequenzen aus diesem Befund für die Struktur

117 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung auf molekularer Ebene werden durch einen Vergleich mit den Röntgenstrukturdaten analysiert. Abb. 3: SFM-Aufnahme eines Filaments von menschlichem Vimentin in Puffer. Um die Assemblierung von Vimentin für Zeiten < 1s und die darauf folgende Elongation der Filamente kinetisch zu charakterisieren, wurden erste Messungen im Stopped- Flow-System unserer Abteilung durchgeführt (Abb. 4). Aus dem Zeitverlauf des Streulichtsignals, das dem Molekulargewicht in erster Näherung proportional ist, konnten die schnelle Bildung der Präassemblykomplexe im Sekundenbereich und die langsamere Elongation unterschieden werden. Die bisher durchgeführten Versuche im Stopped-Flow-Gerät zeigten, dass die Assemblierung zeitlich aufgelöst beobachtet werden kann. Einsatz verschiedener Konzentrationen zeigt eine klare Konzentrationsabhängigkeit der Assemblierungsgeschwindigkeit (blaue und rote Kurven), durch eine systematische Analyse der Kinetik in Abhängigkeit von der Konzentration und Pufferbedingungen, in Zusammenhang mit statischen Lichtstreuungsmessungen, soll ein detailliertes Model für den Assemblierungsmechanismus aufgestellt werden. Abb. 4: Stopped-Flow Messung von zwei verschiedenen Vimentin Konzentrationen. Der Kurvenverlauf zeigt, dass die Kinetik der Assemblierung mit der Stopped-Flow Technik aufgelöst werden kann; sie verläuft im Zeitbereich von Sekunden. Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle Selektive Strukturänderungen in Bacteriophagen durch Porphyrinderivate K. Tóth In Zusammenarbeit mit Gabriella Csík und Marianna Egyeki, Semmelweis-Universität, Budapest, Ungarn Porphyrinderivate finden weite Anwendung in der photodynamischen Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten, sowie bei der Desinfektion von Flüssigkeiten, allerdings sind weder der molekulare Wirkungsmechanismus noch die Zielmoleküle gut genug bekannt. Wir haben den Bakteriophagen T7 als Modellsystem verwendet, um die durch verschiedene Porphyrinderivate ausgelösten Strukturänderungen an einem Nukleoproteinkomplex bei der Photoreaktion und im Dunkeln zu untersuchen [21,22]. Die Bindung der Porphyrine an T7 und DNA wurde durch Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie (konventionell sowie zeitlich aufgelöst) verfolgt. Strukturänderungen im Nukleoproteinkomplex wurden durch thermische Denaturierung, DNA-Läsionen durch PCR charakterisiert. Die optischen Signale symmetrisch substituierter Tetraphenylporphyrine zeigten in Gegenwart von T7 oder DNA keine Änderung. Asymmetrisch substituierte Moleküle binden im Dunkeln an T7, aber nicht an freie DNA, wie die Fluoreszenzmessungen zeigen. Für die kationischen Derivate sind die spektralen Veränderungen in Gegenwart von T7 oder DNA ähnlich. Die Photoreaktion der drei untersuchten Meso-Tetraphenylporphyrine zeigt sich durch Schädigung des viralen Kapsids, ohne nachweisbare Veränderungen der DNA-Struktur. Andererseits destabilisieren die kationischen Porphyrine die DNA-Helix. Die Veränderungen in den verschiedenen Denaturierungsparametern korrelieren gut mit den Ergebnissen der PCR-Analyse und der Phageninaktivierungsrate. Die Dunkelreaktion mit neutralen Phenylporphyrinen hat keinen Effekt auf die thermische Stabilität der Phagen, und zeigt keine nachweisbaren DNA-Läsionen in der PCR-Analyse. Tetramethyl-4-pyridylporphyrin führt schon im Dunkeln zu Destabilisierung der DNA (Gábor et al. 2001, Photochemistry and Photobiology 73(3): ). Die Komplexbildung von Tetrakis(4-N-methylpyridyl)porphyrin (TMPyP) mit freier und capsidgebundener T7-Phagen-DNA wurde durch spektrale Dekomposition, Fluoreszenzlebensdauer und Zirkulardichroismusmessungen im Detail studiert. Externe und interkalative Bindung an die DNA konnten quantitativ unterschieden werden. Aus den Messungen konnte gefolgert werden, dass die Bindung von TMPyP die Struktur der Capsidproteine oder ihre Wechselwirkung mit DNA nicht beeinflusst (Zupán, Herényi, Tóth, Majer, Csík, in Vorbereitung). Publikationen ( * = externer Koautor) [1] F. Lankas, T. E. Cheatham III*, N. Spackova*, P. Hobza*, J. Langowski, J. Sponer*: Critical effect of the N2 amino group on structure, dynamics and elasticity of DNA polypurine tracts. (2002) Biophys. J. 82, [2] G. Wedemann, J. Langowski: Computer simulation of the 30- nm chromatin fiber. (2002) Biophys. J. 82(6), [3] K. Klenin, J. Langowski, A. Vologodskii*: Computational Analysis of the Chiral Action of Type II DNA Topoisomerases. (2002) J. Mol. Biol. 320(2), [4] T. Weidemann, M. Wachsmuth, M. Tewes*, K. Rippe, J. Langowski: Analysis of Ligand Binding by Two-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. (2002) Single Molecules 3, [5] M. Bussiek, K. Klenin, J. Langowski: Kinetics of site-site interaction in superhelical DNA. (2002) J. Mol. Biol. 322(4),

118 118 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [6] F. Bestvater, T.A. Knoch, J. Langowski, E. Spiess: GFP-Walking: Artificial construct conversions caused by simultaneous cotransfection. (2002) BioTechniques 32(4), [7] Dekker, J.*, Rippe, K., Dekker, M.* & Kleckner, N.* (2002). Capturing Chromosome Conformation. Science 295(5558), [8] I. Hofmann, H. Winter, N. Mücke, J. Langowski, J. Schweizer: The in vitro assembly of hair follicle keratins: Comparision of cortex and companion layer keratins. (2002) Biol. Chem. 383(9), [9] M. Gumbel, R. Grebe, M. Knapp-Mohammady, G. M. Ullmann*, J. Langowski: Modellierung biologischer Prozesse. In: Handbuch der Medizinischen Informatik (T. Lehmann & E. Meyer zu Bexten, eds.) Hanser, München [10] *Gil-Parrado, S., *Fernandez-Montalvan, A., *Assfalg- Machleidt, I., *Popp, O., Bestvater, F., *Holloschi, A., Knoch, T. A., *Auerswald, E. A., *Welsh, K., Reed, J. C., *Fritz, H., *Fuentes-Prior, P., Spiess, E., *Salvesen, G. S. & *Machleidt, W. (2002). Ionomycin-activated calpain triggers apoptosis: A probable role for Bcl- 2 family members. J Biol Chem 8, 8. [11] G. Westphal*, S. van den Berg-Stein*, K. Braun, T.A. Knoch, M. Dümmerling*, J. Langowski, J. Debus, E. Friedrich*: Detection of the NGF receptors TrkaA and p75ntr and effect of NGF on the growth characteristics of human tumor cell lines. (2002) J. Exp. Clin. Cancer Res., 21(2), [12] K. Braun, P. Peschke, R. Pipkorn, S. Lampel*, M. Wachsmuth, W. Waldeck, E. Friedrich*, J. Debus: A biological transporter for the delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclear compartment of living cells. (2002) J. Mol. Biol., 318(2): [13] Strunz AM, Peschke P, Waldeck W, *Ehemann V, Kissel M, Debus J.: Preferential radiosensitization in p53-mutated human tumour cell lines by pentoxifylline-mediated disruption of the G2/ M checkpoint control. (2002) Int J Radiat Biol. 78(8): [14] M. Wachsmuth, T. Weidemann, G. Müller, W. Waldeck, J. Langowski: Analyzing intracellular binding and diffusion with continuous fluorescence photobleaching. (2003) Biophys. J. 84, [15] T.P. O Brien*, C. Cremer*, M. Grunze*, B.B. Knowles*, J. Langowski, J. McNally*, T. Pederson*, J. Politz*, A. Pombo*, P. Schmidt*, R. van Driel*: Functional Architecture of the Nuclear Genome: Towards establishing the Genome Architecture Consortium. (2003) Genome Res. 13, [16] K. Módos*, R. Galántai*, I. Bardos-Nagy*, M. Wachsmuth, K. Tóth, J. Fidy*, J. Langowski: Maximum-entropy decomposition of fluorescence correlation spectroscopy data: application to liposome-human serum albumin association. (2003) Eur. Biophys. J., published online , DOI: /s [17] F. Lankaš, J. Šponer*, J. Langowski, T.E. Cheatham III*: DNA base-pair step deformability inferred from molecular dynamics simulations. (2003) Biophys. J., 85(5), [18] J. F. Kepert*, K. Fejes Tóth*, M. Caudron*, N. Mücke, J. Langowski, K. Rippe: Conformation of reconstituted mononucleosomes determined by scanning force microscopy in air and in aqueous solution. (2003) Biophys. J., 85(6), [19] T. Weidemann, M. Wachsmuth, T.A. Knoch, G. Müller, W. Waldeck, J. Langowski; Counting nucleosomes in living cells with a combination of fluorescence correlation spectroscopy and confocal imaging. (2003) J. Mol. Biol. 334(2), [20] M. Bussiek, N. Mücke, J. Langowski: Polylysine-coated mica can be used to observe systematic changes in the supercoiled DNA conformation by scanning force microscopy in solution. (2003) Nucl. Acids Res., 31(22), e137 [21] M. Egyeki, G. Turoczy*, Z. Majer*, K. Tóth, A. Fekete*, P. Maillard*, G. Csik*: Photosensitized inactivation of T7 phage as surrogate of non-enveloped DNA viruses: efficiency and mechanism of action. (2003) Biochim Biophys Acta 1624, Abteilung B040 Biophysik der Makromoleküle [22] M. Egyeki, G. Turoczy*, K. Tóth, A. Fekete*, P. Maillard*, G. Csik*: Photodynamic inactivation of porphyrin sensitized T7 phages: efficiency and mechanism of action. (2003) Acta Pharm Hung 73(2): [23] S. Heckl, R. Pipkorn, W. Waldeck, H. Spring, J. Jenne, C.- W. von der Lieth, H. Corban-Wilhelm, J. Debus, K. Braun. Intracellular Visualization of Prostate Cancer using Magnetic Resonance Imaging. (2003) Cancer Res. 63, [24] *Gil-Parrado, S., *Popp, O., Knoch, T. A., Zahler, S., Bestvater, F., Felgentrager, M., *Holloschi, A., *Fernandez- Montalvan, A., *Auerswald, E. A., *Fritz, H., *Fuentes-Prior, P., *Machleidt, W. & Spiess, E.: Subcellular localization and in vivo subunit interactions of ubiquitous mu-calpain (2003) J Biol Chem 278, [25] Braun, K., Wolber, G., Waldeck, W., Pipkorn, R., Jenne, J., Rastert, R., *Ehemann, V., Eisenmenger, A., Corban-Wilhelm, H., Braun, I., Heckl, S. & Debus, J.: The enhancement of neutron irradiation of HeLa-S cervix carcinoma cells by cell-nucleus-addressed deca-p-boronophenylalanine. (2003) Eur J Med Chem 38, [26] Perraud, A. L.*, Shen, B.*, Dunn, C. A.*, Rippe, K., Smith, M. K.*, Bessman, M. J.*, Stoddard, B. L.* & Scharenberg, A. M.*: NUDT9, a member of the Nudix hydrolase family, is an evolutionarily conserved mitochondrial ADP-ribose pyrophosphatase. (2003) J Biol Chem 278, [27] N. Mücke, L. Kreplak*, R. Kirmse, T. Wedig, H. Herrmann, U. Aebi*, J. Langowski: Assessing the Flexibility of Intermediate Filaments by Atomic Force Microscopy. (2004) J. Mol. Biol. 335(5), [28] J. Langowski, H. Schiessel*: Theory and computational modeling of the 30 nm chromatin fiber. In: Chromatin Structure: State of the Art, eds. S. Leuba & J. Zlatanova, 2004, Elsevier, Amsterdam. [29] J. Langowski: Melting Under Stress (New and Notable Comment on article Monte Carlo Simulations of Locally Melted Supercoiled DNAs in 20mM Ionic Strength by Sucato et al. in the same journal). (2004) Biophys. J., in press [30] F. Lankaš, J. Šponer*, J. Langowski, T.E. Cheatham III*: DNA deformability at the base-pair level. (2004) J. Am. Chem. Soc.,126(13) [31] N. Mücke, T. Wedig, A. Bürer*, L. N. Marekov*, P. M. Steinert*, J. Langowski, U. Aebi*, H. Herrmann: Molecular and Biophysical Properties of Assembly-Starter-Units of Human Vimentin. (2004) J. Mol. Biol., in press

119 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse Abteilung Molekulare Genomanalyse (B050) Leiterin: Prof. Dr. Annemarie Poustka Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Regina Albert Dr. Dorit Arlt Dr. Detlev Bannasch Dr. Stephanie Bechtel Dr. Lee Bergman (1/02 -) Dr. Gaby Bergmann Dr. Kim Beyer (- 8/03) PD Dr. Frank Breitling Dr. Claudia Büche (3/02-12/03) Andreas Buneß (5/02 -) Dr. Bärbel Felder (10/03 -) Simon Fernandez (5/02 -) Dr. Birgit Guilleaume Dr. Wolfgang Huber Dr. Sabine Klauck Dr. Fritz Klimek Dr. Thorsten Kohl Dr. Anja Kolb Dr. Ulrike Korf Dr. Inge Krebs Dr. Ruprecht Kuner (2/03 -) Dr. Vladimir Kuryshev Dr. Patricia McCabe (8/02 -) Dr. Alexander Mehrle Dr. habil. Jan Mollenhauer Dr. Petra Moosmayer Karl-Heinz Nolte Heiko Rosenfelder Markus Ruschhaupt (6/03 -) Dr. Ingo Schupp Dr. Volker Stadler PD Dr. Holger Sültmann Dr. Ruth Wellenreuther PD Dr. Stefan Wiemann Dr. Rainer Wittig Dr. Dorothea Zink (- 1/03) Gastwissenschaftler Floris Bikker (8-12/02) Doktoranden Mario Beyer (4/02 -) Stephanie Blaich (4/03 -) Laura Diedrichs Caroline End (1/03 -) Katharina Finis Olga Freidekind (9/03 -) Sabine Gronert (9/03 -) Stefan Lyer Meher Majety Marcus Renner Mamatha Sabbela Claudia Schuster (5/03 -) Jörg Schneider Markus Seiler Klaus Steiner Michael Stojanov (2/03 -) Rainer Will (1/02 -) Diplomanden: Seema Noor (3-11/03) Stefanie Rauskolb (-5/03) Tanja Schepua (3-12/03) Jochen Thomas (4/03 -) Technisches Personal Esther Backes Sabrina Balaguer (9/02 -) Hanna Bausbacher Christina Berg (9/02 -) Sara Burmester Nina Claudino Angelika Duda Ute Ernst Kerstin Feßler Claudia Grosser (4/03 -) Daniela Heiss Kerstin Hettler Gabriele Hoock Sabine Karolus Maren Kettner (9/02 -) Thorsten Kühlwein Ewald Münstermann Silvia Noack-Häfner (8/02 -) Rita Schatten Liane Schmitt Inaam Shatila (10/02 -) Markus Stauch Saskia Stegmüller (10/03 -) Stefanie Süß (- 4/02) Heike Wilhelm (8/02 -) Angelika Woerner Regina Zahn Ingenieure Simone Schleeger Christian Schmidt Sekretariat Daniela Fischer (7/02 -) Julia Carpinone (8/02 -) Das Ziel der Abteilung Molekulare Genomanalyse ist die systematische Untersuchung von molekularen Ursachen menschlicher Krankheiten - mit Schwerpunkt auf Krebserkrankungen. Unsere umfassende funktionelle Analyse menschlicher Gene und ihrer Genprodukte wird das Verständnis monogener und komplexer Krankheitsprozesse erweitern. Zum Nutzen der großen Datensätze, die in der Humangenomforschung generiert werden, haben wir gezielt Hochdurchsatztechnologien zur funktionellen Genomik und Proteomik einschließlich integrativer Bioinformatik entwickelt. Die in der Abteilung MGA erarbeiteten Daten und Technologien werden beständig optimiert und stehen der Wissenschaftsgemeinschaft unter anderem über das Nationale Genomforschungsnetz (NGFN) zur Verfügung. I. Gezielte Analyse relevanter Pathomechanismen I. 1 Dyskeratosis Congenita: funktionelle Charakterisierung von Dyskerin I. Krebs, R. Salowsky, N.S. Heiss, S. Gronert, T. Schepua, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: A. Benner (Biostatistik, DKFZ); P. Boukamp (Genetik der Hautcarcinogenese, DKFZ); F. von der Hoeven (Transgen-Service, DKFZ) Die systematische Analyse der genreichen chromosomalen Region Xq28 ermöglichte die Identifizierung krankheitsassoziierter sowie die Untersuchung putativ krankheitsrelevanter Gene [1,2]. Die Dyskeratosis Congenita (DKC) ist eine seltene, progressive Multisystemerkrankung, an der etwa 90% der Patienten in einem mittleren Alter von 16 Jahren aufgrund von Knochenmarkversagen sterben. Weitere Merkmale der Erkrankung sind Symptome vorzeitigen Alterns sowie ein erhöhtes Tumorrisiko. Kennzeichnend für die DKC ist, dass Gewebe und Zelltypen mit hoher Proliferationskapazität phänotypisch am stärksten betroffen sind. Übereinstimmend hiermit konnten Mutationen im DKC1-Gen als Ursache für die X-chromosomal rezessiv vererbte Form der DKC identifiziert werden [3,4]. Die von DKC1 codierte evolutionär hoch konservierte, nukleoläre Pseudoruridinsynthase Dyskerin ist mit ihrer Funktion bei der rrna-biosynthese essentiell für die Teilung sowie für die Lebensfähigkeit von Zellen. Eine Rolle bei der Erhaltung der Telomere, deren Integrität und Länge die Proliferationskapazität von Zellen bedingen, übt Dyskerin als Bestandteil des Telomerase-RNP-Komplexes offensichtlich durch die Stabilisierung der RNA Komponente der Telomerase htr aus. Diese Funktion von Dyskerin ist in DKC-Patienten beeinträchtigt, wie sich durch im Vergleich zu gesunden Personen signifikant verkürzte Telomere zeigt. Eine genaue Aufklärung der DKC-Pathomechanismen bedarf jedoch der Charakterisierung, in welchem Ausmaß beide Funktionen durch Mutationen im DKC1-Gen beeinflusst werden. Diese Charakterisierung ist Gegenstand unserer derzeitigen funktionellen in vitro und in vivo Untersuchungen. Erkenntnisse hieraus werden entscheidend zum Verständnis der zu Zellalterung und Krebs führenden Mechanismen beitragen. Eine reduzierte DKC1-Transkription hat in Hefe, in Drosophila und in der Maus eine Beeinträchtigung der Teilung 119

120 120 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung und der Lebensfähigkeit der Zellen zur Folge. Unsere Analysen zur transkriptionellen Regulation von DKC1 zeigen, dass wahrscheinlich auch quantitative Veränderungen der DKC1 mrna Expression zur Ausprägung der DKC führen können. So ergaben Reportergenuntersuchungen, dass die basale, durch den Transkriptionsfaktor Sp1 vermittelte, DKC1-Promotoraktivität durch den Transkriptionsfaktor Sp3 reprimiert werden kann [5,6]. Des weiteren konnten wir zeigen, dass die in einem DKC-Patienten identifizierte, sich in einer Sp1- Bindestelle befindende, Promotormutation G-141C in vitro die DKC1-Promotoraktivität vermindert [5,6]. Weiterführende Analysen zur transkriptionellen sowie posttranskriptionellen Regulation [7] zielen auf die Identifizierung gewebe- und/oder funktionsspezifischer regulatorischer Elemente, die auch eine funktionelle Zuordnung von Dyskerin zu spezifischen Signaltransduktionswegen ermöglichen sollten. Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse und CPA2 [10], TAC1 [11] und WNT16 untersucht, sowie neun Gene in der Region auf 2q, u.a. camp-gefii [12]. Ein größerer Einfluss der gefundenen Varianten im deutschen und im IMGSAC Geschwisterpaar-Patientenkollektiv auf die Symptomatik des Autismus konnte jedoch ausgeschlossen werden. Auch die Analyse von Kandidatengenen aus anderen genomischen Regionen (HOPA, Xq13 [13]; MECP2, Xq28 [14]; RAB3A, 19p13.2 [15]) ergab keinen Hinweis auf eine Beteiligung an der Ätiologie von frühkindlichem Autismus. Die Ergebnisse der Untersuchung des MECP2-Gens erlauben damit eine klare molekulargenetische Abgrenzung des Autismus vom Rett-Syndrom, einer Entwicklungsstörung mit zum Autismus überlappender Symptomatik und ursächlichen Defekten im MECP2-Gen, sowie einer von diesem Gen verursachten Form syndromaler geistiger Behinderung [16]. I. 2 Autismus S. Klauck, K. Beyer, S. Rauskolb, B. Felder, C. Schuster, M. Kettner, I. Shatila, S. Karolus, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: F. Poustka (Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Kindes-und Jugendalters, J.W. Goethe- Universität Frankfurt); The International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC) ( ~maestrin/iat.html); A. Benner (Biostatistik, DKFZ) Frühkindlicher Autismus ist eine tiefgreifende Entwicklungsstörung, die meist schon in den ersten drei Lebensjahren auftritt und durch eine starke Beeinträchtigung der sozialen Kontaktfähigkeit, verzögerte Sprachentwicklung sowie durch stereotype Verhaltensweisen gekennzeichnet ist. Die Prävalenz liegt bei 5-10 auf Geburten, wobei dreibis viermal mehr männliche als weibliche Patienten betroffen sind. Aus den bisherigen Erkenntnissen der Familien- und Zwillingsstudien geht hervor, dass die Entstehung der Erkrankung eine starke genetische Komponente beinhaltet und vermutlich polygen bedingt ist. Ziel dieses Projekts ist es, für Autismus ursächliche Krankheitsgene durch zwei Ansätze zu identifizieren. Im ersten werden in Kooperation mit dem International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC) genomweite Kopplungsstudien mit betroffenen Geschwisterpaaren ( affected sib-pair method ) durchgeführt. Die von IMGSAC 2001 [Am J Hum Genet 69, ] mit einem erweiterten Kollektiv von 152 Geschwisterpaaren als Folgestudie nach 1998 durchgeführte zweite genomweite Kopplungsanalyse zeigte die höchsten Kopplungswerte (MLS, multipoint maximum lod score) auf den Chromosomen 2q, 7q, 16p und 17q. Hierbei wurde die Region 7q21- q32 basierend auf der ersten Studie von 1998 mit einem MLS von 3,37 bei D7S477 bestätigt. Durch diese Kopplungsstudien wurden zahlreiche Kandidatengene identifiziert, die derzeit in dem zur Verfügung stehenden gut charakterisierten Patientenkollektiv mit Hilfe der DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)-methode systematisch auf Mutationen untersucht werden. Parallel werden im zweiten Ansatz familienbasierte Assoziationsstudien mit polymorphen Markern in definierten Genloci durchgeführt, um Hinweise auf eine Beteiligung bestimmter Gene am Autismus zu erhalten. Einerseits dient dies der Feinkartierung in identifizierten Kopplungsregionen und andererseits der Analyse gezielt ausgesuchter Kandidatengene in anderen Genomregionen. Innerhalb der Kandidatenregion auf 7q21-q32 wurden die Gene RELN [8], FOXP2 [9], PEG1/MEST, COPG2, CPA1 I. 3 Chemoresistenz-Mechanismen und funktionelle Analysen zu DMBT1 J. Mollenhauer, G. Kollender, R. Wittig, E. Münstermann, S. Lyer, M. Renner, S. Blaich, L. Schmitt, K. Fessler, C. Berg, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: Prof. A. v. Deimling (Institut für Neuropathologie, Charité der Humboldt Universität, Berlin); Prof. U. Holmskov (Immunology and Microbiology, Institute for Medical Biology, Odense University, Odense, Dänemark); Dr. T. Ligtenberg und F. Bikker (Dental Basic Sciences, ACTA, Amsterdam, Niederlande); Dr. B. Helmke, Dr. N. Gassler und Prof. H. F. Otto (Institut für Pathologie, Universität Heidelberg); Dr. M. Deichmann (Hautklinik, Universität Heidelberg); Prof. P. Lichter (Molekulare Genetik; DKFZ, Heidelberg); Prof. D. Schadendorf (Dermatoonkologie, DKFZ, Heidelberg); Dr. B. Korn (RZPD GmbH, Heidelberg); Prof. Y. Nakanuma (Department of Human Pathology, Kanazawa University, Kanazawa, Japan) Um der Komplexität der Erkrankung Krebs gerecht zu werden, untersuchen wir die Krebsentstehung anhand von Modellsystemen auf systematischer und auf systemischer Ebene. Mit Hilfe eines systematischen Ansatzes konnten über 200 Gene identifiziert werden, die im Zuge der Chemoresistenzentwicklung in vitro dereguliert sind. Im Rahmen dieses Projekts sind wir zu einer systematischen Klonierung der vollständigen offenen Leserahmen (ORF) und zu der Entwicklung neuer in vitro Systeme zur effizienten funktionellen Validierung möglicher therapeutischer Zielmoleküle fortgeschritten [17-20]. Der potentielle Tumorsuppressor Deleted in Malignant Brain Tumors 1 (DMBT1) dient uns als Modellmolekül, um systemische Aspekte der Krebsentstehung zu analysieren. Unserer Arbeitshypothese zufolge handelt es sich bei DMBT1 um ein multifunktionelles Protein, das eine Rolle in der Zelldifferenzierung, der Pathogenabwehr, dem generellen Gewebeschutz und der Wundheilung, aber auch in anderen Prozessen wie der Gallenstein-Bildung (Lithogenese) spielt. Die ersteren Funktionen lassen sich allgemein als Schutz vor und Regeneration nach Einwirkung von schädlichen Umwelteinflüssen zusammenfassen. Wir konnten demonstrieren, dass DMBT1 nicht die klassischen Merkmale konventioneller Tumorsuppressoren zeigt. So ist eine Inaktivierung durch biallelische Mutation für DMBT1 unwahrscheinlich. Als Antwort auf diverse pathogene Stimuli wird DMBT1 jedoch induziert bzw. hochreguliert, u. a. in entzündlichen Prozessen, an Wundrändern, nach Karzinogen- Einwirkung, in tumorflankierenden Geweben und Tumoren selber, aber auch im Zuge der Lithogenese. Während dies ein Indikator für mutmaßlich breite Schutzfunktionen ist,

121 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung findet eine Inaktivierung von DMBT1 auf der Expressionsebene offenbar in Abhängigkeit vom Zeitpunkt seiner Sekretion in die extrazelluläre Matrix statt. Wir folgern hieraus, dass die Schutzfunktionen von DMBT1 in Frühphasen der Tumorgenese von Bedeutung sind, dagegen eine Störung der DMBT1/galectin-3 vermittelten Differenzierung in der extrazellulären Matrix zu späteren Zeitpunkten den Tumorzellen Wachstumsvorteile verschaffen könnte [21-29]. Wir konnten des weiteren herausarbeiten, dass die DMBT1- Bindungsstelle für Bakterien, hierunter auch Helicobacter pylori, innerhalb jener Domänen lokalisiert ist, deren Anzahl durch genetische Polymorphismen innerhalb der menschlichen Bevölkerung stark variiert [24, 26, 29, 30]. Da DMBT1 an sämtlichen Umwelteinflüssen exponierten Oberflächen präsent ist, ist unsere Arbeitshypothese, dass genetischer Polymorphismus von DMBT1 zur Suszeptibilität des Menschen gegenüber Infektionen, Entzündungen und hieraus hervorgehenden Krebstypen beiträgt [31]. Dementsprechend haben wir unseren Fokus auf infektiöse und entzündliche Erkrankungen erweitert [30-33]. In laufenden Untersuchungen testen wir Vorhersagen der Arbeitshypothese anhand von genetischen Analysen, von Dmbt1 knockout Mäusen und von funktionellen Analysen in vitro [31, 34, 35]. II. Funktionelle Genomik und Proteomik II. 1 Expressionsprofil-Analyse zur Identifizierung tumorspezifischer Gene H. Sültmann, W. Huber, R. Kuner, A. Buneß, M. Steiner, J. Schneider, K. Finis, M. Stojanov, F. Haller, M. Ruschhaupt, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: A. v. Heydebreck, M. Vingron (MPI für Molekulare Genetik, Berlin); B. Gunawan, L. Füzesi (Universität Göttingen); K. Zatloukal, H. Samonigg (Universität Graz); H. Steiner, C. Herold-Mende (Kopfklinik Heidelberg); P. Kioschis, M. Hafner (Fachhochschule Mannheim); B. Korn (RZPD Heidelberg); J. Volz, (Klinikum Bielefeld); I. Berger, N. Gassler (Pathologie Heidelberg); B. Fink (Rheumaklinik Bad Bramstedt); P. Lichter, R. Eils, A. Benner (DKFZ Heidelberg); A. Becker (Universität Bonn); P. Schlag, W. Kemmner (Max-Delbrück-Zentrum Berlin); R. Schaefer (Charité Berlin); S. Schreiber, R. Häsler (Universität Kiel); M. Näbauer, S. Kääb (LMU München); H. Katus, D. Weichenhan (Universität Heidelberg); N. Santama, C. Lederer (Universität Nicosia, Zypern); W. Richter, E. Steck (Orthopädische Klinik Heidelberg); S. Mueller (Universität Heidelberg); G. Sawitzki (Universität Heidelberg); R. Gentleman (Dana Farber Cancer Institute, Harvard University); R. Irizarry (School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, USA); U. Mansmann (Inst. f. Medizinische Biometrie, Universität Heidelberg). Die Entstehung von Tumoren geht mit einer Fülle genetischer Veränderungen einher. Mit Hilfe der Array-Technologie ist es möglich, die Aktivität aller menschlichen Gene in sehr kurzer Zeit zu untersuchen. Besonders aufschlussreich ist es, Unterschiede zwischen einem Normalgewebe und den aus diesem hervorgegangenen Tumoren oder auch zwischen verschiedenen Tumorsubtypen festzustellen. Der Vergleich der Genexpressionsmuster mit klinischen Parametern wird zur molekularen Charakterisierung der Tumoren genutzt und kann so zur Verbesserung von Diagnose, Prognose und zu neuen therapeutischen Ansätzen führen. Zur Identifizierung derartiger Genaktivitätsmuster verfolgen wir zwei Strategien: Im ersten Ansatz wurde die Expression von ca Genen in menschlichen Tumoren (Niere, Brust, Gehirn, gastrointestinale Stromatumoren) verschiedener Stadien und den entsprechenden Normalgeweben Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse auf Filter-basierten cdna Arrays bestimmt [36]. Aus den gewonnenen Daten wurden tumorspezifische Genexpressionsprofile erstellt und Microarrays konstruiert, die nun zu Hochdurchsatz-Analysen größerer Patientenkollektive zur Verfügung stehen. In einem zweiten intensivierten Ansatz wurde parallel dazu die Herstellung von genomweiten Arrays mit dem größten, sequenzverifizierten Satz von cdna-klonen (RZPD Unigene 3.1) erreicht. Diese werden bereits in vielen wissenschaftlichen Kooperationen genutzt. Die Microarray-Technologie wird auch in Experimenten über reine Tumorerkrankungen hinaus eingesetzt. So werden (v.a. innerhalb des NGFN) Untersuchungen an rheumatoider Arthritis, an Herz-Kreislauf- und umweltbeeinflussten Erkrankungen, aber auch an in vitro Systemen mit humanen Zellen durchgeführt. In einem Projekt mit 112 Nierenproben wurden sowohl Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe als auch zwischen unterschiedlichen Tumorsubtypen gefunden. So wurden innerhalb der klarzelligen Nierenkarzinome 85 Gene identifiziert, mit deren Hilfe metastasierende von nicht-metastasierenden Tumoren unterschieden werden können. 45 weitere Gene waren mit der Überlebenszeit von Patienten assoziiert und dienen somit als frühe Indikatoren des Krankheitsverlaufes. Ähnliche Zusammenhänge mit der Überlebenszeit wurden auch für die Aktivität von 78 Genen an Hand von 60 Gehirntumoren erhalten. Weitere Experimente an 40 gastrointestinalen Stromatumoren ergaben 796 Gene, die zwischen Tumor- und Normalgewebe unterschiedlich aktiv waren [37]. Sehr gute Übereinstimmungen mit den Microarray-Ergebnissen ergab die Validierung der Gene mittels quantitativer RT-PCR. Viele der gefundenen Gene und Gengruppen eröffnen neue Ansatzpunkte für die Diagnose und Therapie von Tumoren. Insgesamt wurden bisher über Microarrays hergestellt. Die Methoden der Microarray-Technologie, die durch standardisierte Bedingungen und durch ständige Qualitätskontrollen als robuste Laborabläufe etabliert sind, werden dabei in fortlaufender paralleler Technologie-Entwicklung auf den Prüfstand gestellt und optimiert. Hierzu gehören etwa die PCR-Produkt-Aufreinigung, die Wahl der Oberflächen, das Spotting, die Nachbehandlung, die RNA-Isolierung und die Hybridisierungsbedingungen. Eine Herausforderung stellt die Durchführung von Microarrayexperimenten mit sehr geringen Mengen biologischer Proben dar. Hierzu etablierten wir ein Protokoll zur linearen Amplifikation von RNA und überprüften Effizienz und Vergleichbarkeit in zahlreichen Hybridisierungen [38]. II. 2 Systematische cdna-analyse im Deutschen cdna Konsortium S. Wiemann, R. Wellenreuther, R. Albert, P. Moosmayer, I. Schupp, D. Heiss, N. Claudino, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: Deutsches cdna Konsortium: W. Ansorge (EMBL Heidelberg); H. Blöcker (GBF Braunschweig); J. Lauber (QIAGEN Hilden); K. Köhrer (BMFZ Düsseldorf); W. Mewes (MIPS München); B. Ottenwälder (MediGenomix München); D. Heubner (AGOWA Berlin); Ressourcen Zentrum - RZPD (Berlin), A. Marmè (Universiätsklinik Heidelberg), S. Pääbo (MPI Leipzig), S. Haas (MPIMG Berlin), D. Zink (RZPD Heidelberg), L. Füzesi (Universitätsklinik Göttingen) Ein Hauptziel des Humanen Genomprojekts ist die Generierung umfassenden Wissens über die Gene des Menschen und ihre Assoziation mit humanen Krankheiten. Die Abteilung hat eine Funktionsanalyse- Pipeline etabliert, die, be- 121

122 122 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung ginnend mit der Herstellung von cdna-ressourcen, bis zur detaillierten funktionellen Charakterisierung der kodierten Proteine reicht [39,40]. Das Deutsche cdna Konsortium, das von der Abteilung Molekulare Genomanalyse (MGA) koordiniert wird, wurde 1996 im Rahmen des Deutschen Humangenomprojekts (DHGP) gegründet, als zweites Hochdurchsatz-cDNA-Projekt weltweit [Genome Res 11(2001) ]. Ziel des Konsortiums ist, neue Gene zu identifizieren und Volle-Länge cdna Klone für die Funktionsanalyse bereitzustellen. Im NGFN konnte dieses Projekt 2001 erweitert werden und ist damit eines von gegenwärtig drei großen derartigen Projekten (neben jeweils einem Projekt in Japan und den USA). Bis Ende 2003 hatte die Abteilung Molekulare Genomanalyse cdnas in dieser Kooperation sequenziert, was einer Länge von über 5,1 Mega Basen entspricht. Das gesamte Konsortium hatte zu diesem Zeitpunkt über cdnas mit zusammen 39,2 Mega Basen sequenziert. Die Annotation der cdnas wird an der GSF (München) durchgeführt, die Sequenzen werden in die EMBL/GenBank/DDBJ Datenbanken eingegeben. Die cdna-klone stehen über das RZPD (Deutsches Ressourcen Zentrum für Genomforschung GmbH) Wissenschaftlern in aller Welt zur Verfügung. II Automatisierte Lokalisation der von FLcDNA kodierten Proteine S. Bechtel, A. Duda, K. Hettler, S. Wiemann In Zusammenarbeit mit: R. Pepperkok, J. Simpson (EMBL, Heidelberg) Zu den wesentlichen Herausforderungen der großen Genomprojekte gehören die beträchtlichen Datenmengen, die weltweit generiert werden. Eine essentielle Aufgabe besteht darin, diese Daten mit krankheitsorientierten und funktionellen Informationen zu assoziieren. Entscheidend für die Funktionalität eines Genproduktes ist seine zelluläre Lokalisation. Um diese zu untersuchen nutzen wir die Ressource des Deutschen cdna Konsortiums an Volle-Länge-cDNA zunächst zur systematischen Klonierung der offenen Leserahmen (ORFs). In Folgeexperimenten verknüpfen wir die kodierten Proteine mit dem Lokalisationsmarker Green fluorescent protein (GFP), um ihre subzelluläre Position in lebenden Zellen zu detektieren [EMBO Rep 1 (2000) ]. Da wir das GFP einerseits am N-Terminus, andererseits aber in separaten Konstrukten auch am C-Terminus coexprimieren, können wir eindeutige Aussagen über die korrekte Lokalisation machen und des Weiteren die Konstrukte identifizieren, die diese korrekte Lokalisation erreichen. Diese Information ist wesentlich für die Planung und Analyse weiterführender funktioneller Untersuchungen der Expressionskonstrukte. Bisher wurden über 650 Proteine subzellulär lokalisiert, die Informationen, zusammen mit lichtmikroskopischen Aufnahmen sind in der LIFEdb Datenbank [41] öffentlich zugänglich ( Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse II. 3 Zell-basierte Hochdurchsatz-Assays zur Funktionsanalyse neuer Proteine D. Arlt, L. Bergman, M. Sabbela, M. Majety, R. Albert, R. Wellenreuther, C. Schmidt, H. Wilhelm, W. Huber, S. Wiemann, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: R. Pepperkok, U. Liebel (EMBL, Heidelberg); P. Bastiaens, H. Erfle (EMBL, Heidelberg) Während die Zahl der bekannten Gene insbesondere durch Hochdurchsatz-cDNA-Projekte in den vergangenen Jahren stark gestiegen ist, liegen Funktion und Krankheitsrelevanz für die Mehrheit der kodierten Proteine weiter im Dunkeln. Die Verfügbarkeit einer großen Zahl von Volle-Länge-cDNAs bietet die Möglichkeit, systematische Analysen durchzuführen. Ein hoher Automatisierungsgrad der Analyse ist erforderlich, um aus der großen Zahl neuer Gene und Proteine insbesondere die krankheitsrelevanten herauszufiltern. Wir haben daher verschiedene Hochdurchsatz-Assays etabliert, die die Funktion der Proteine im zellulären Umfeld beleuchten. Unser Focus liegt insbesondere auf krebsrelevanten Eigenschaften dieser Proteine, wie der Funktion in Zellproliferation, Apoptose, MAPKinase Signalwegen und Calcium Signalwegen. In den Assays wird die Funktion der Proteine sowohl durch Überexpression, mit Hilfe der ORF-GFP Expressionskonstrukte, als auch durch Unterexpression, mittels RNA- Interferenz (RNAi), untersucht. Demzufolge erhalten wir sich ergänzende Informationen, die ein umfassendes Bild entstehen lassen. Zur Analyse setzen wir ein automatisches Screening-Mikroskop ein, das von einem Kooperationspartner (R. Pepperkok, EMBL) in einem gemeinsamen Projekt entwickelt wird. Insbesondere verwenden wir FACS-Geräte, denen zwar die räumliche Auflösung eines Mikroskops fehlt, die aber einen höheren Durchsatz erreichen - und mit größeren analysierten Zellzahlen eine erhöhte statistische Absicherung der Resultate ermöglichen. Im Verlauf des Projekts wurden statistische Methoden etabliert, die sich als essentiell für eine gesicherte Analyse der Assays erwiesen haben (s.ii.5). Weitere Assays befinden sich im Aufbau. II. 4 Proteomik U. Korf, B. Guilleaume, F. Klimek, R. Will, S. Schleeger, R. Zahn, E. Backes, W. Huber, S. Wiemann, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer, B. Ueberle, S. Wandschneider (V250), G. Moldenhauer (D050), D. Bossemeyer (A060), (alle DKFZ); G. Tovar (Fraunhofer Institut Stuttgart); K. Büssow, A. Diehl (Proteinstrukturfabrik Berlin); R. Pepperkok, T. Sardon, I. Vernos (EMBL Heidelberg), P. Drückes (Proqinase, Freiburg) II Protein-Expression (E. coli und Baculovirus) Rekombinante Proteine stellen die Ausgangsbasis für eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen in der Proteinchemie dar, wie die Produktion von Antikörpern, die strukturelle Charakterisierung und die Herstellung von Protein-Arrays. Auf Basis der im Deutschen cdna Konsortium identifizierten und im Projekt zur subzellulären Lokalisation getesteten ORFs unbekannter Funktion werden mit Hilfe des Gateway- Systems (Invitrogen) Expressionsvektoren transferiert. Die in E. coli und Baculovirus exprimierten Proteine werden auf Expressionslevel und Löslichkeit geprüft und dann standardmäßig durch Massenspektrometrie bestätigt. Für die Proteinexpression in E. coli ist das Verfahren bereits weitgehend automatisiert worden. Für präparative Zwecke können Proteine auch im mg-maßstab hergestellt werden.

123 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung II Protein-Kinase-Assays im Mikroarray- Maßstab Für die funktionelle Charakterisierung von Proteinen wurden diverse Kinase-Assays an den Mikroarray-Maßstab adaptiert. Dabei wurden überwiegend Kinasen ausgewählt, die an der Regulation von Zelltod und Zell-Zyklus beteiligt sind. Eine Quantifizierung der enzymatischen Assays wird mit Hilfe von statistischen Auswertungsprogrammen durchgeführt. Diese Assays basieren auf der Inkorporation von radioaktivem Phosphat in die immobilisierten Proteine. Erstmalig identifizierte Phosphorylierungen werden mit Hilfe von Massenspektrometrie verifiziert. Anschließend wird die Interaktion zwischen einer Kinase und ihrem Substrat in zellulären Assays auf ihre in vivo-relevanz überprüft. II Peptid-Arrays V. Stadler, S. Fernandez, M. Beyer, T. Kühlwein, T. Seeberg, K. Leibe, A. Nesterov, K. König, T. Felgenhauer, R. Bischoff, F. Breitling Viele Krankheiten, wie z.b. die Borreliose, sind je nach Patient sehr unterschiedlich ausgeprägt. Ein Grund hierfür könnten unterschiedliche Immunantworten sein. Um etwa die gegen Borrelia burgdorferi gebildeten Antikörper möglichst umfassend nachweisen zu können, werden alle Proteine dieses Bakteriums benötigt. Da dies technisch schwierig ist, wollen wir in einem chemischen Ansatz beliebige Proteine als einander überlappende Peptide herstellen. Diese hochkomplexen Peptid-Arrays werden durch kombinatorische Synthese mit Hilfe eines abgewandelten Farblaserdruckers synthetisiert. Dabei werden die 20 verschiedenen Aminosäuren in einer Art festem Lösungsmittel immobilisiert und so 20 verschiedene Toner hergestellt. Ein modifizierter Farblaserdrucker verschickt diese Toner zu ihrem Bestimmungsort, an dem die Aminosäuren durch Erhitzen mobilisiert werden und hierdurch an den Träger koppeln. Die Wiederholung der Kopplungszyklen erzeugt ein Peptid Array (sehr ähnlich der Merrifield Synthese). Alternativ kann statt eines Laserdruckers ein Computerchip verwendet werden, um die Aminosäurenpartikel an definierten Orten auf einem Träger zu applizieren [42]. Diese Entwicklung sollte den Stand der Technik auf diesem Gebiet signifikant verbessern (Patentanmeldung EP A2; [43]). II Hybridom-Antikörper S. Lüttgau, G. Moldenhauer, T. Kühlwein, F. Breitling Monoklonale Antikörper sind für die Grundlagenforschung und die Diagnostik unverzichtbar. Gleiches gilt neuerdings auch für menschliche Antikörper als Therapeutika. Für die Suche nach neuen Antikörper-Spezifitäten eignen sich die auf bakteriellen Systemen beruhenden Rekombinanten Antikörper ausgezeichnet, diese Systeme besitzen aber Schwachpunkte insbesondere in der Antikörperproduktion und in der Stabilität der Antikörperfragmente. Deshalb wollen wir die Vorteile der Hybridomtechnologie (stabile, in großen Mengen produzierte Antikörper) und der Rekombinanten Antikörper (effiziente Suche nach neuen Spezifitäten durch Oberflächen-präsentierte Antikörper) miteinander verbinden. Hierauf zielt das Projekt zur Selektion von humanen Antikörpern mit Hilfe von Antikörper-Präsentation auf der Oberfläche von in vitro kultivierten Hybridomzellen. Hierfür werden die Gene für die variablen Antikörperregionen mittels homologer Rekombination mit loxp- und FRT-Stellen flankiert Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse und dann die Vielfalt der Antikörpergene durch sukzessive spezifische Rekombination integriert. Zur Selektion aus der Bibliothek von Hybridomzellen werden die auf der Zelloberfläche präsentierten Antikörper eingesetzt, wobei jede Zelle ihren spezifischen Antikörper präsentiert (Patentanmeldung EP A1). In einem alternativen Ansatz wurde eine Myelomzelllinie hergestellt, die sehr viele Protein-G-Moleküle auf der Oberfläche präsentiert. Auf der Oberfläche einer hiervon abstammenden Hybridomzelle werden Antikörper präsentiert, die (mit gebundenem Antigen) sehr effizient im FACS sortiert werden können. Dies erspart die arbeitsaufwändige Suche nach Antikörperspezifitäten und das Subklonieren, das in der konventionellen Hybridom Technologie unumgänglich ist. (Patentanmeldung EP A1, lizensiert an die Firma Abeome) II. 5 Bioinformatik II Bioinformatik- und Statistik-Methoden zur Daten-Erfassung und -Analyse W. Huber, A. Buneß, M. Ruschhaupt, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: A. v. Heydebreck, R. Spang, M. Vingron (MPI für Molekulare Genetik, Berlin); U. Mansmann (Universität Heidelberg); J. Rahnenführer, T. Lengauer (MPI Informatik, Saarbrücken); R. Gentleman (Harvard, USA); S. Dudoit (University of California Berkeley, USA); R. Irizarry (Johns Hopkins University, Baltimore, USA); S. Teichmann (MRC Cambridge, UK); L. Füzesi (Pathologie, Universität Heidelberg); D. Rocke (University of California Davis, USA); Febit (Mannheim); IBM Research (USA). In der Abteilung Molekulare Genomanalyse werden mittels Hochdurchsatz-Applikationen große Datenmengen generiert. Zu ihrer Auswertung setzen wir aktuelle Methoden des Daten- Mining und der computergestützten Datenanalyse ein, da es entscheidend ist, die Informationen statistisch abgesichert zu analysieren. Dies gilt besonders für krankheitsorientierte Fragestellungen. Die Verwendung von Technologien, die auf Microarrays basieren, ist eine wesentliche Komponente der funktionellen Genomanalyse, die von der Abteilung MGA durchgeführt wird. Systematische Microarraystudien generieren erhebliche Datenmengen. Informationen über die untersuchten Patienten, Gewebe, die histopathologische Tumorcharakterisierung, die verwendeten Arrays und die darauf repräsentierten cdna-klone sowie experimentelle Protokolle müssen erfasst, aktualisiert und ausgewertet werden. Qualitätskontrolle und Standardisierung dieser Daten sind grundlegende Voraussetzungen für die wissenschaftliche Publikation der Experimente. Die Unterscheidung zwischen signifikanten Expressionsmustern und stochastischen Fluktuationen wird durch eine integrierte statistische Datenanalyse gesichert [44-46]. In der nachfolgenden bioinformatischen Analyse werden die Ergebnisse an Hand von molekularen Datenbanken interpretiert, die Informationen über bereits bekannte Genexpressionsmuster, funktionelle Genannotationen, Krankheitsassoziationen oder Gen-Netzwerke enthalten [47,48]. Zu einem erheblichen Teil erhalten wir aber auch Informationen über Gene, deren Funktionen noch völlig unbekannt sind. Diese werden in der Abteilung auf ihre zellulären Funktionen untersucht, um ihren Nutzen als Zielgene für die klinische Diagnostik und neue Therapieansätze zu ermitteln. 123

124 124 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Die Technologien und Ressourcen für die Analyse (z.b. Kalibrierung, Datenvisualisierung, Qualitätskontrolle, statistische Tests, Multiplizitätskorrektur, ANOVA- und Überlebenszeit- Modellierung, Genannotation, Clustering, Mustererkennung und Machine Learning) werden in ein System erweiterbarer Softwaremodule integriert. Diese Module wurden als Komponenten der Analyseumgebung Bioconductor ( veröffentlicht, an deren Entwicklung und Management wir maßgeblich beteiligt sind. Dies ermöglicht einerseits eine schnelle Publikation unserer Methoden, andererseits aber auch die unmittelbare Prüfung ihrer Anwendbarkeit durch die Gemeinschaft der Wissenschaftler. Beispiele für international genutzte Module aus unserer Arbeitsgruppe sind vsn (Varianzstabilisierung und Kalibrierung von Microarraydaten, [44,49], arraymagic (Qualitätskontrolle und Prozessautomatisierung), matchprobes (Sequenzeigenschaften von Microarraysonden und Plattformintegration, [50] und makecdfenv (Präprozessierung). Einen weiteren Beitrag zur Verbreitung und Standardisierung qualitativ hochwertiger Analysemethoden leisten wir durch die Organisation der viermal jährlich in Heidelberg und Berlin stattfindenden, international besuchten Kurse Practical Microarray Analysis. Diese Kurse werden in Zusammenarbeit mit dem MPI für Molekulare Genetik (Berlin), dem MPI für Informatik (Saarbrücken) und dem Institut für Biometrie der Universität Heidelberg durchgeführt. II Datenbankentwicklung H. Rosenfelder, A. Mehrle, D. Bannasch, K.H. Nolte, M. Seiler, V. Kuryshev, S. Wiemann, A. Poustka In Zusammenarbeit mit: K.H. Glatting (Molekulare Biophysik, B020, DKFZ) Die Entwicklung von Datenbanken dient sowohl dem Ziel der Prozesssteuerung und Prozesskontrolle, als auch der Verknüpfung von internen mit externen Daten. Die verschiedenen Projekte der Abteilung MGA sind auf die Generierung und Analyse von Hochdurchsatz-Daten ausgerichtet. Dies erfordert die Verfügbarkeit von besonders leistungsfähigen LIMS-Datenbanken und -Systemen, mit denen die einzelnen Proben durch die komplexen Prozesse verfolgt werden können und von Projektdatenbanken zur Speicherung der diversen Datentypen. Beginnend mit einer MS-Access Datenbank zur Prozesskontrolle der Klonierung der ORFs im Functional Genomics Projekt [51] sind weitere Datenbanksysteme auf der Basis des MS-SQL Servers entwickelt worden, mittels derer die experimentellen Prozesse von DNA-Chips, Zellbiologie und Proteomics verfolgt werden. Die Dateneingabe in MS-SQL Server basierte Datenbanken kann entweder lokal über MS-Access User Interfaces, oder extern über Web-Interfaces erfolgen. Der Öffentlichkeit wird Zugang zu den meisten Daten über ein MS.NET basiertes Web-Interface ermöglicht. II Daten Mining W. Huber, H. Rosenfelder, K.H. Nolte, A. Mehrle, M. Seiler, V. Kuryshev, I. Schupp, S. Wiemann In Zusammenarbeit mit: A. Hotz-Wagenblatt, C. del Val, S. Suhai (Molekulare Biophysik, B020, DKFZ) Daten Mining dient der Funktionsbestimmung der untersuchten Proteine im gesunden, insbesondere aber auch im kranken Zustand von Zellen und Gewebeverbänden. Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse Die Beschränkung der Analyse auf intern generierte Daten wäre in Anbetracht der Fülle von verfügbaren externen Daten und Informationen unbefriedigend. Die Integration externer und interner Daten erreichen wir durch die Entwicklung geeigneter Hilfsmittel (Datenbanken, Web-Seiten). Ein Gen- und Protein-Annotationsprojekt wird mit dem Ziel entwickelt, Genstrukturen zu entschlüsseln und Proteine in Hinblick auf deren mögliche Funktion zu kategorisieren [51]. Ein weiteres Projekt ist die Entwicklung von Tools zum automatischen Durchsuchen externer Datenbanken, deren Output ebenso automatisch in eine interne Datenbank integriert wird und so über das web- Interface verfügbar ist [52]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Copley, L.M.*, Zhao, W.D.*, Kopacz, K.*, Herman, G.E.*, Kioschis, P., Poustka, A., Taudien, S.*, Platzer, M.* Exclusion of mutations in the MTMR1 gene as a frequent cause of X-linked myotubular myopathy. American Journal of Medical Genetics 107 (2002) [2] Aradhya, S.*, Woffendin, H.*, Bonnen, P.*, Heiss, N.S., Yamagata, T.*, Esposito, T.*, Bardaro, T.*, Poustka, A., D Urso, M.*, Kenwrick, S.*, Nelson, D.L.* Physical and genetic characterization reveals a pseudogene, an evolutionary junction and unstable loci in distal Xq28. Genomics 79 (2002) [3] Heiss, N.S., Poustka, A. Dyskeratosis Congenita. In: Hisama, F.M., Weissman, S.M., Martin, G.M. (Ed): Chromosomal Instability and Aging: Basic Science and Clinical Implication, Marcel Dekker Inc., New York (2003) [4] Heiss, N.S., Poustka, A. Dyskerin (DKC1 Gene). In: Creighton TE (Ed): Encyclopedia of Molecular Medicine, John Wiley & Sons Publishers, New York (2002) [5] Salowsky, R., Heiss, N.S., Benner, A., Wittig, R., Poustka, A. Basal transcription activity of the dyskeratosis congenita gene is mediated by Sp1 and Sp3 and a patient mutation in a Sp1 binding site is associated with decreased promoter activity. Gene 293 (1-2) (2002) 9-19 [6] Salowsky, R. Identifizierung und Charakterisierung des Dkc1- Gens der Maus und vergleichende Analysen zur Genregulation der orthologen DKC1/Dkc1-Gene. Dissertation, Universität Gießen (2002) [7] Schepua, T. Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von DKC1-Transkriptvarianten der Maus und des Menschen. Diplomarbeit, Universität Heidelberg (2003) [8] Bonora, E.*, Beyer, K.S., Lamb, J.A.*, Parr, J.R.*, Klauck, S.M., Benner, A., Paolucci, M.*, Abbott, A.*, Ragoussis, I.*, Poustka, A., Bailey, A.J.*, Monaco, A.P.*, the International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). Analysis of reelin as a candidate gene for autism. Molecular Psychiatry 8 (2003) [9] Newbury, D.F.*, Bonora, E.*, Lamb, J.A.*, Fisher, S.E.*, Lai, C.S.L.*, Baird, G.*, Jannoun, L.*, Slonims, V.*, Stott, C.M.*, Merricks, M.J.*, Bolton, P.F.*, Bailey, A.J.*, Monaco, A.P.*, International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (2002) FOXP2 is not a major susceptibility gene for autism or specific language impairment. Am. J. Hum. Genet. 70 (2002) [10] Bonora, E.*, Bacchelli, E.*, Levy, R.E.*, Blasi, F.*, Marlow, A.*, Monaco, A.P.*, Maestrini, E.*, IMGSAC. Mutation screening and imprinting analysis of four candidate genes for autism in the 7q32 region. Molecular Psychiatry 7 (2002) [11] Rauskolb, S. Tachykinin 1 Gen: Systematische Mutationsanalyse beim Autismus und Expressionsstudien. Diplomarbeit, Universität Heidelberg (2003) [12] Bacchelli, E.*, Blasi, F.*, Biondolillo, M.*, Lamb, J.A.*, Bonora, E.*, Barnby, G.*, Parr, J.*, Beyer, K.S., Klauck, S.M., Poustka, A., Bailey, A,J,*, Monaco, A.P.*, Maestrini, E.*, International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). Screening of nine candidate genes for autism on chromosome 2q reveals rare non-synonymous variants in the camp-gefii gene. Molecular Psychiatry 8 (2003)

125 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [13] Beyer, K.S., Klauck, S.M., Benner, A., Poustka, F.*, Poustka, A. Association studies of the HOPA dodecamer duplication variant in different subtypes of autism. Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatric Genet.) 114 (2002) [14] Beyer, K.S., Blasi, F.*, Bacchelli, E.*, Klauck, S.M., Maestrini, E.*, Poustka, A., International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). Mutation analysis of the coding sequence of the MECP2 gene in infantile autism. Human Genetics 111 (2002b) , Erratum: Human Genetics 112 (2003) 437 [15] D Adamo, P.*, Bacchelli, E.*, Blasi, F.*, Lipp, H.-P.*, Toniolo, D.*, Maestrini, E.*, International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). DNA variants in the human RAB3A are not associated with autism. Genes Brain Behavior 3(2) (2004) [16] Klauck, S.M., Lindsay, S*., Beyer, K.S., Splitt, M*., Burn, J*., Poustka, A. A mutation hot spot for nonspecific X-linked mental retardation in the MECP2 gene causes the PPM-X syndrome. American Journal of Human Genetics 70 (2002) [17] Wittig, R., Nessling, M., Will, R., Mollenhauer, J., Salowsky, R., Münstermann, E., Schick, M.*, Helmbach, H., Gschwendt, B., Korn, B.*, Kioschis, P., Lichter, P., Schadendorf, D., Poustka, A. Candidate genes for cross resistance against DNA-damaging drugs. Cancer Res., 62 (2002) [18] Wittig, R. Identifizierung von Kandidatengenen für die Kreuzresistenz gegen DNA-schädigende Substanzen. Doktorarbeit im Fach Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät der Universität Frankfurt (2002) [19] Wittig, R., Mollenhauer, J. Schadendorf, D., Poustka, A. Candidate genes for cancer therapy Submitted to the European Patent Office in June 2002 [20] Blaich, S. Klonierung von Chemoresistenz-Kandidatengenen und Evaluierung eines neuen Vektorsystems zur Herstellung von standardisierten stabilen Zell-Linien. Diplomarbeit im Fach Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät der Universität Heidelberg (2003) [21] Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Müller, H., Kollender, G., Krebs, I., Wiemann, S., Holmskov, U.*, Madsen, J.*, Otto, H. F.*, Poustka, A. An integrative model on the role of DMBT1 in epithelial cancer. Cancer Detect. Prevent., 26 (2002) [22] Deichmann, M.*, Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Thome, M.*, Hartschuh, W.*, Poustka, A., Näher, H.* Analysis of losses of heterozygosity of the candidate tumour suppressor gene DMBT1 in uncultured malignant melanomas. Oncology, 63 (2002) [23] Mueller, W.*, Mollenhauer, J., Stockhammer, F.*, Poustka, A., von Deimling, A.* Rare mutations of the DMBT1 gene in astrocytic gliomas. Oncogene, 21 (2002) [24] Mollenhauer, J., Müller, H., Kollender, G., Lyer, S., Diedrichs, L., Helmke, B.*, Holmskov, U.*, Ligtenberg, T.*, Herbertz, S., Krebs, I., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Schmitt, L., Wiemann, S., Scheurlen, W.*, Otto, H. F.*, von Deimling, A.*, Poustka, A. The SRCR/SID region of DMBT1 defines a complex multi-allele system representing the major basis for its variability in cancer. Genes Chrom. Cancer, 35 (2002) [25] Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Müller, H., Kollender, G., Lyer, S., Diedrichs, L., Holmskov, U.*, Ligtenberg, T.*, Herbertz, S., Krebs, I., Wiemann, S., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Schmitt, L., Otto, H. F.*, Poustka, A. Sequential changes of the DMBT1 expression and location in normal lung tissue and lung carcinomas. Genes Chrom. Cancer, 35 (2002) [26] Mollenhauer, J., Deichmann, M.*, Helmke, B.*, Müller, H., Kollender, G., Holmskov, U.*, Ligtenberg, T.*, Krebs, I., Wiemann, S., Bantel-Schaal, U., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Klauck, S. M., Otto, H. F.*, Moldenhauer, G., Poustka, A. Frequent downregulation of DMBT1 and Galectin-3 in epithelial skin cancer. Int. J. Cancer, 105 (2003) Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse [27] Sasaki, M.*, Huang, S. F.*, Chen, M. F.*, Jan, Y. Y.*, Yeh, T. S.*, Ishikawa, A.*, Mollenhauer, J., Poustka, A., Tsuneyama, K.*, Nimura, Y.*, Oda, K.*, Nakanuma, Y.* Expression of Deleted in Malignant Brain Tumours 1 (DMBT1) molecule in biliary epithelium is augmented in hepatolithiasis: possible participation in lithogenesis. Dig. Dis. Sci. 48 (2003) [28] Sasaki, M.*, Huang, S. F.*, Chen, M. F.*, Jan, Y. Y.*, Yeh, T. S.*, Ishikawa, A.*, Mollenhauer, J., Poustka, A., Tsuneyama, K.*, Nimura, Y.*, Oda, K.*, Nakanuma, Y.* Decrease of Deleted in Malignant Brain Tumours 1 (DMBT1) expression is a crucial late event in intrahepatic cholangiocarcinoma. Histopathology 43 (2003) [29] Mollenhauer, J., Helmke, B.*, Medina, D.*, Kollender, G., Müller, H., Lyer, S., Diedrichs, L., Renner, M., Wittig, R., Blaich, S., Madsen, J.*, Holmskov, U.*, Bikker, F.*, Ligtenberg, T.*, Carlen, A.*, Olsson, J.*, Otto, H. F.*, O Malley, B.*, Poustka, A. Carcinogen-inducibility in vivo and frequent down-regulation of DMBT1 during breast carcinogenesis. Genes Chrom. Cancer 39 (2004) [30] Bikker, F. J.*, Ligtenberg, A. J. M.*, Nazmi, K.*, Veerman, E. C. I.*, van t Hof, W.*, Bolscher, J. G. M.*, Poustka, A., Nieuw Amerongen, A. V.*, Mollenhauer, J. Identification of the bacteria-binding peptide domain on salivary agglutinin (gp-340/ DMBT1), a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily. J. Biol. Chem. 277 (2002) [31] Mollenhauer, J. Isolierung und Charakterisierung von DMBT1 - Ein putativer multifunktioneller Faktor mit Bedeutung für Infektion, Entzündung und Krebs. Habilitationsschrift im Fach Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät der Universität Heidelberg (2003) [32] Madsen, J.*, Tornoe, I.*, Nielsen, O.*, Krebs, I., Mollenhauer, J., Poustka, A., Skjodt, K., Holmskov, U. CRPductin, the mouse homologue of gp-340/dmbt1 binds specifically to lung surfactant protein D (SP-D). Eur. J. Immunol. 33 (2003) [33] Gassler, N.*, Kopitz, J.*, Tehrani, A.*, Ottenwälder, B.*, Schnölzer, M., Kartenbeck, J.*, Lyer, S., Autschbach, F.*, Poustka, A., Otto, H. F.*, Mollenhauer, J. Expression of Acyl- CoA synthetase 5 reflects the state of villus architecture in human small intestine. J. Pathol. 202(2) (2004) [34] Kollender, G. Untersuchungen zur biologischen Funktion von DMBT1. Doktorarbeit im Fach Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät der Universität Heidelberg (2002) [35] Renner, M. Expressionsanalysen in Wildtyp- und Dmbt1 Knockout-Mäusen. Diplomarbeit im Fach Biologie, Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät der Universität Heidelberg (2002) [36] Huber, W., Boer, J.M. *, v. Heydebreck, A. *, Gunawan, B. *, Vingron, M. *, Füzesi, L. *, A. Poustka, H. Sültmann. Transcription Profiling of Renal Cell Carcinoma. Proceedings of the German Society for Pathology 86 (2002) [37] Langer, C. *, Gunawan, B. *, Schuler, P. *, Huber, W., Füzesi, L. *, Becker, H. * Prognostic factors influencing surgical management and outcome of gastrointestinal stromal tumours. Br J Surg 90 (2003) [38] Schneider, J., Buneß, A., Huber, W., Volz, J. *, Kioschis, P. *, Hafner, M. *, Poustka, A, Sültmann, H. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics (2004) 5-29 [39] Wiemann, S., Bechtel, S., Bannasch, D., Pepperkok, R.*, Poustka, A., the German cdna Network. The German cdna Network: cdnas, functional genomics and proteomics. Journal of Structural and Functional Genomics 4 (2003) [40] Wiemann, S., Mehrle, A., Bechtel, S., Wellenreuther, R., Pepperkok, R.*, Poustka, A., the German cdna Consortium. cdnas in functional genomics and proteomics: The German cdna Consortium. CRBiologies 326 (2003)

126 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B050 Molekulare Genomanalyse 126 [41] Bannasch, D., Mehrle, A., Glatting, K.-H., Pepperkok, R.*, Poustka, A., Wiemann, S. LIFEdb: A database for functional genomics experiments integrating information from external sources, and serving as a sample tracking system. Nucleic Acids Res 32 (2004) D [42] Breitling, F., Breitling, F.A.*, Felgenhauer, T., Fernandez, S., Leibe, K.*, Beyer, M., Stadler, V., Bischoff, F.R., Poustka, A. Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips. Laborwelt 3 (2002) 4-6 [43] Breitling, F. Selektionssysteme für die Analyse von Bindungsereignissen. Habilitationsschrift, Universität Heidelberg (2002) [44] Huber, W., v. Heydebreck, A.*, Sültmann, H., Poustka, A., Vingron, M.*. Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression. Bioinformatics 18(S1) (2002) S96-S104 [45] Huber, W., v. Heydebreck, A.*, Sültmann, H., Poustka, A., Vingron, M.* Parameter estimation for the calibration and variance stabilization of microarray data. Stat Appl Genet Mol Biol 2 (2003) Article 3 [46] Huber, W., v. Heydebreck, A. *, Vingron, M. * Analysis of microarray gene expression data. In: (Bishop et al. eds.), Handbook of Statistical Genetics. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, UK (2003) [47] Apic, G. *, Huber, W., Teichmann, SA*. Multi-domain protein families and domain pairs: comparison with known structures and a random model of domain recombination. J Struct Funct Genomics 4 (2003) [48] Huber, W., Poustka, A., v. Heydebreck, A. *, Vingron, M*. Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression. Provisional patent application filed Mar 28 (EPO, 2002) [49] V. Heydebreck A. *, Huber W, Poustka A, Vingron M. *. Variance stabilization and robust normalization for microarray gene expression data. Proceedings in Computational Statistics (2002) [50] Huber, W., Gentleman, R*. Matchprobes: a Bioconductor package for the sequence-matching of microarray probe elements. Bioinformatics (2004) online erschienen [51] Bannasch, D., Mehrle, A., Glatting, K.-H., Pepperkok, R.*, Poustka, A., Wiemann, S. LIFEdb: A database for functional genomics experiments integrating information from external sources, and serving as a sample tracking system. Nucleic Acids Res 32 (2004) D [52] Del Val, C., Mehrle, A., Falkenhahn, M., Seiler, M., Glatting, K.-H., Poustka, A., Suhai, S., Wiemann, S. High-throughput protein analysis integrating bioinformatics and experimental assays. Nucleic Acids Res 32 (2004)

127 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B055 Molekulargenetik des Mammakarzinoms Molekulargenetik des Mammakarzinoms (B055) Priv.-Doz. Dr. Ute Hamann Gastwissenschaftler Prof. Rodney Scott (11/02-1/03) University of Newcastle, Newcastle, Australien Dr. Anna Jakubowska (7/03 -) Hereditary Cancer Center, Pomeranian University, Sczcecin, Polen Doktorand Usman Rashid (5/02 -) Technische Mitarbeiter Antje Seidel-Renkert Michaela Schleicher (- 9/02) Karin Schüssler (2/03 -) Michael Gilbert Christian Baisch (11/01-8/03) Brustkrebs (Mammakarzinom) ist die häufigste bösartige Tumorerkrankung der Frau. Ungefähr jede zehnte Frau erkrankt im Laufe ihres Lebens an einem Mammakarzinom. Die meisten Mammakarzinome treten sporadisch auf und entstehen durch zufällige, nicht vererbbare Veränderungen in Genen. Etwa 5-10% der Mammakarzinome beruhen auf einer genetischen Prädisposition, die in Familien vererbt werden kann. Das Ziel unserer Arbeit ist die Identifizierung von genetischen und nicht-genetischen Faktoren, die an der Pathogenese des familiären und sporadischen Mamma- und Ovarialkarzinoms beteiligt sind. Die Identifizierung dieser Faktoren und ihrer Veränderungen soll dazu beitragen, die Entstehung und Progression des Mammakarzinoms besser zu verstehen sowie die Früherkennung dieser Erkrankungen zu verbessern. In Zusammenarbeit mit: J. Mollenhauer, A. Poustka, A. Benner, DKFZ; H. Frenzel, H.U. Ulmer, Städtisches Klinikum Karlsruhe; G. Bastert, Universitätsfrauenklinik Heidelberg; H.-P. Sinn, Pathologisches Institut der Universität, Sektion Gynäkologische Pathologie, Heidelberg; H. M. Bolt, Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund; H. Brauch, C. Justenhoven, IKP, Stuttgart; T. Brüning, V. Harth, B. Pesch, BGFA, Bochum; Y. Ko, Med. Poliklinik, Bonn; H.-P. Fischer, Institut für Pathologie, Universität Bonn; H. E. Wichmann, GSF-Forschungszentrum, Neuherberg; K. Ickstadt, Fachbereich Statistik, Universität Dortmund; S. Narod, University of Toronto, Kanada; N. K. Burki, A. Amin, SKMCH, Lahore, Pakistan; J. Gronwald, J. Lubinski, Hereditary Cancer Center, Sczcecin, Polen, Breast Cancer Linkage Consortium 1 Molekulare Analysen des erblichen und earlyonset Mammakarzinoms Bis heute sind nur wenige Gene bekannt, deren Veränderungen für Mamma- und Ovarialkarzinome prädisponieren. Zu den wichtigsten Suszeptibilitätsgenen gehören BRCA1 (BReast CAncer gene 1) auf dem langen Arm von Chromosom 17 und BRCA2 (BReast CAncer gene 2) auf dem langen Arm von Chromosom 13. Die Art und Häufigkeit von BRCA1- und BRCA2-Keimbahnmutationen unterscheiden sich stark in ethnischen Gruppen und Bevölkerungen. Bei deutschen Mamma-/Ovarialkarzinomfamilien sind BRCA1- Mutationen bei 20% ursächlich für die Erkrankung. 1.1 Anteil von BRCA1/2 am erblichen und earlyonset Mammakarzinom in Deutschland Um den Beitrag von BRCA2 an der Entstehung des erblichen Mammakarzinoms zu bestimmen, wurden 68 deutsche Familien in Mutationsanalysen einbezogen. Bei allen Familien waren mindestens drei Familienmitglieder an einem Mamma- oder Ovarialkarzinom erkrankt, mindestens zwei davon vor dem sechzigsten Lebensjahr. Weiterhin waren alle Familien negativ für eine BRCA1-Mutation. Für die Untersuchung der gesamten kodierenden BRCA2-Gensequenz wurden PCR-gestützte genetische Tests (SSCP, PTT, HA, DHPLC, Primer Mismatch Tests, DNA-Sequenzierung) angewendet. Die Analysen wurden an der konstitutionellen DNA einer an einem Mammakarzinom erkrankten Patientin durchgeführt. BRCA2-Mutationen wurden bei 12% der Mamma- /Ovarialkarzinomfamilien festgestellt [1]. Bei 6% der Familien waren Mammakarzinome, bei 6% Mamma- und Ovarialkarzinome aufgetreten. Bei drei Mamma- und Ovarialkarzinomfamilien lag die Mutation in der zentralen Genregion in Exon 11, der sogenannten Ovarian Cancer Cluster Region (OCCR) und bei drei Mammakarzinomfamilien außerhalb der OCCR-Region. Es zeigte sich, dass BRCA2-Mutationen häufiger bei Familien mit bilateralen Mammakarzinomen zu beobachten waren als bei Familien mit unilateralen Mammakarzinomen. Somit sind BRCA1/2-Mutationen nur bei einem Drittel der deutschen Mamma-/Ovarialkarzinomfamilien für die Entstehung der Erkrankung verantwortlich, was auf die Existenz weiterer Suszeptibilitätsgene hinweist. Da über die Häufigkeit von BRCA1/2-Mutatinen außer bei Mamma-/Ovarialkarzinomfamilien wenig bekannt war, haben wir 91 Patientinnen mit einer Diagnose von Brustkrebs vor dem 41zigsten Lebensjahr (early-onset) einem Mutations- Screening unterzogen. Bei 3,3% dieser Patientinnen wurde eine BRCA1-Mutation und bei 2,2% eine BRCA2-Mutation festgestellt [2]. Diese Ergebnisse zeigen, dass BRCA1 und BRCA2 in gleichem Maße zur Entstehung des earlyonset Mammakarzinoms in Deutschland beitragen. Sie zeigen auch, dass aus gesundheitspolitischer Sicht ein Mutations-Screening bei Familien mit gehäuftem Auftreten von Mamma- und Ovarialkarzinomen am sinnvollsten ist. 1.2 BRCA1-Genotyp-Phänotyp-Korrelationen Vorherige Studien haben gezeigt, dass die Mamma- und Ovarialkarzinomerkrankungsrisiken in Abhängigkeit von der Lage der Mutation im BRCA1-Gen variieren. Mutationen in der 3 -Genregion waren mit einem niedrigeren Ovarialkarzinomrisiko assoziiert als Mutationen außerhalb dieser Region. Um die Evidenz für diese Genotyp-Phänotyp-Korrelationen zu erhärten, haben wir in einer großen multizentrischen 127

128 128 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B055 Molekulargenetik des Mammakarzinoms Studie mit dem Breast Cancer Linkage Consortium (BCLC) 356 Familien mit krankheits-assoziierten BRCA1-Mutationen analysiert. [3]. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten stellte sich heraus, dass in Familien mit BRCA1-Mutationen in der zentralen Genregion mehr Ovarialkarzinome auftraten als in Familien mit Mutationen außerhalb dieser Region. Mutationen in der zentralen Genregion waren mit einem niedrigeren Brustkrebsrisiko, Mutationen in der 3 -Genregion mit einem niedrigeren Ovarialkarzinomrisiko assoziiert als andere Mutationen. Die Bestimmung von Genotyp-Phänotyp- Korrelationen ist wichtig für die genetische Beratung und das klinische Management von BRCA1-Mutationsträgern. 1.3 Immunhistochemische und histopathologische Merkmale von BRCA1/2-assoziierten Mammaund Ovarialkarzinomen In Zusammenarbeit mit dem BCLC wurden mehrere internationale Studien zur Charakterisierung der histologischen Merkmale der BRCA1/2-assoziierten Mamma- und Ovarialkarzinome durchgeführt. Die Bestimmung der immunhistochemischen Profile von BRCA1/2-assoziierten Mammakarzinomen ergab, dass BRCA1-assoziierte Mammakarzinome häufiger Östrogen- und Progesteronrezeptor-negativ, HER-2-negativ und p53-positiv waren, wohingegen BRCA2- assoziierte Tumoren keine unterschiedliche Expression dieser Proteine im Vergleich zu Kontrolltumoren aufwiesen [4]. Diese Ergebnisse zeigen, dass BRCA1-assoziierte Tumoren neben einer besonderen Morphologie auch einen besonderen immunhistochemischen Phänotyp haben. Anhand dieser Daten ist es möglich, das Brustkrebsrisikos von BRCA1-Mutationsträgern zu schätzen. In einer weiteren Studie wurde beobachtet, dass BRCA1- assoziierte Ovarialkarzinome häufiger vom Subtyp des invasiven serösen Adenokarzinoms waren als vom Subtyp der Borderline-Tumoren oder muzinösen Tumoren. Darüber hinaus hatten sie häufiger einen höheren Differenzierungsgrad, eine geringere solide Komponente und zeigten häufiger eine starke p53-expression [5]. Die Verteilung der pathologischen Parameter bei den BRCA2-assoziierten Ovarialkarzinomen ähnelte der Verteilung bei den BRCA1-assoziierten Tumoren. 2 Bestimmung von Risikofaktoren für Brustkrebs und Therapie prädiktiven Faktoren Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die Identifizierung von genetischen Faktoren und Umweltfaktoren, die das Risiko einer Frau, an einem sporadischen Mammakarzinom zu erkranken, beeinflussen sowie die Identifizierung von Faktoren, die das individuelle Ansprechen-, Nicht- Ansprechen und die Toxizität einer Behandlung mit Chemotherapeutika vorhersagen [6]. Auf der klinischen Grundlage einer Fall-Kontroll und prospektiven Therapiestudie untersuchen wir durch Genotyp/ Phänotyp-Korrelationen bei gesunden Frauen und Mammakarzinompatientinnen sowie durch Expressionsstudien an Mammatumoren die Bedeutung einer Reihe von potentiell relevanten polymorphen Enzymen, die bei der Östrogenbiosynthese, dem Östrogen-, Fremdstoff- und Sauerstoffmetabolismus, der DNA-Reparatur eine Rolle spielen, aber auch Rezeptoren, Tumorsuppressoren, Signaltransduktoren, Transportermoleküle und Wachstumsfaktoren. Zu den klinischen und histo-pathologischen Daten der Patientinnen werden zusätzlich von allen Studienteilnehmerinnen potentielle Risikofaktoren wie z.b. Ernährungs- und Lebenstilfaktoren, Schwangerschaften, Hormoneinnahmen und Arbeitsplatzrisiken durch Befragung anhand eines standardisierten Fragebogens erfasst. Die epidemiologischen, molekularbiologischen, immunhistochemischen und klinischen Daten werden in univariater und multivariater Analyse auf ihre Aussagefähigkeit bezüglich eines Mammakarzinomrisikos und/oder der Tumoransprechbarkeit ausgewertet. Die Abschätzung der Risiken äußerer Einflüsse sowie die Abhängigkeit von den genetischen Polymorphismen soll einen Beitrag für die Entwicklung von wirksamen Ansätzen zur Prävention dieser Krankheit und zur Therapieprädiktion leisten. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Hamann, U., Liu, X., Lange, S., *Ulmer, H. U. and *Scott RJ (2002) Contribution of BRCA2 germline mutations to hereditary breast/ovarian cancer in Germany. J. Med. Genet. 39:e12. [2] Hamann, U., Liu, X., Bungardt, N., *Ulmer, H. U., *Bastert, G. and *Sinn, H.-P. (2003) Similar contributions of BRCA1 and BRCA2 germline mutations to early-onset breast cancer in Germany. Eur. J. Hum. Genet. 11(6): [3] *Thompson, D., *Easton, D. and the Breast Cancer Linkage Consortium (2002) Variation in BRCA1 cancer risks by mutation position. Cancer, Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 11:329. [4] *Lakhani, S. R., van de *Vijver M. J., *Jacquemier, J., *Anderson, T. J., *Osin, P.P., *McGuffog, L., *Easton, D. F. and The Breast Cancer Linkage Consortium (2002) The pathology of familial breast cancer: Predictive value of immunohistochemical markers estrogen receptor, progesterone receptor, HER-2, and p53 in patients with mutations in BRCA1 and BRCA2. J. Clin. Oncol. 20:2310. [5] *Lakhani, S.R., *Manek, S., *Penault-Llorca, F., +Flannagan, A., *Arnout, L., *Merrett, S., *McGuffog, L., *Steel, D., *Devilee, P., *Klijn, J.G.M., *Meijers-Heijboer, H., *Radice, P., *Pillotti, S., *Nevanlinna, H., *Sobol, H., *Jaquemier, J., *Stoppa Lyonnet,D., *Hoffman, M., *Weber, B., *Wagner, T., *Winquist, R., *Bignon, Y.-J., *Monti, F., *Soares, R., Hamann, U., *Pharoah, P., *Ponder, B., *Bishop, T., *Easton, D.F. (2004) Pathology of ovarian cancers in BRCA1 and BRCA2 carriers. Clin. Cancer Res. 10:2473. [6] *Brauch, H., *Brüning, T., *Fischer, H.-P., Hamann, U., *Harth, V., *Justenhoven, C., *Ko, Y. and *Pesch, B. for The GENICA NETWORK (2002) Breast cancer risk and predictive factors: Association with genetic polymorphisms and expression of human drug metabolising enzymes. DHGP Progress Report 2002, p. 148 [7] Mollenhauer, J., *Helmke, B., *Medina, D., Bergmann, G., *Gassler, N., Müller, H., Lyer, S., Diedrichs, L., Renner, M., Wittig, R., Blaich, S., Hamann, U., *Madsen, J., *Holmskov, U., *Bikker, F., *Ligtenberg, T., *Carlén, A., *Olsson, J., *Otto, H. F., *O Malley, B. and Poustka, A. (2004) Carcinogen inducibility in vivo and down-regulation of DMBT1 during breast carcinogenesis. Genes, Chromosomes & Cancer 39(3), [8] Hamann, U. (2003) Brustkrebs: Erbliche Formen sind selten. In: Was verraten unsere Gene? GSF mensch + umwelt, spezial. GSF, Hrsg., 16. Ausgabe, S. 51. [9] GENICA Study Group (2003) Krebs und Umwelt. In: Beispiele aus der Forschungspraxis, Umwelt Gesundheit. BMBF, Hrsg., S. 28. [10] GENICA Study Group (2002) Brustkrebsstudie: GENICA- Studie unerwähnt. Leserbrief. Deutsches Ärzteblatt 99, 41. Ausgabe vom

129 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B060 Molekulare Genetik Abteilung Molekulare Genetik (B060) Leiter: Prof. Dr. Peter Lichter Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Stefan Joos Dr. Antoaneta Mincheva Dr. Armin Pscherer Dr. Karsten Richter Dr. Claudia Schaffner Dr. Solinas-Toldo Dr.Stephan Wolf Dr. Michelle Neßling Dr. Meinhard Hahn (7/01-) Dr. Bernhard Radlwimmer (12/01-) Dr. Boris Zielinski (8/01) Dr. Kai Neben (6/01-) Dr. Daniel Mertens Dr. Carsten Schwänen ( - 6/02) Dr. Björn Fritz (1/00-) Gastwissenschaftler Prof. Donald Olins (3-5/02) Prof. Ada Olins (3-5/02) Dr. Peter Schraml (4-12/02) Prof. Dr.Andrey Korshunov (3-5/02 und 5-9/03)) Dr. Heiko Fensterer (10/02-3/03) Doktoranden Martyna Adamowicz (12/00-) Carsten Sticht(4/02-) Sabine Görisch (10/00 -) Felix Kokocinski (5/00-) Christian Korz (3/00-11/03) Ilka Prowatke ((5/01) Lars Hummerich (8/01-) Markus Scheuermann (5/00 -) Gunnar Wrobel (12/99-11/03) Jörg Schlingemann (11/01-) Cordula Tschuch (3/01-) Otto Mannherz (6/01-) Frank Mendrzyk (8/02-) Hendrik Reuter (8/02-) Ute Schmidt (1/02-) Björn Tews (6/02-) Grischa Tödt (9/02-) Olaf Thürigen (9/02-) Melanie Ruppel (7/03-) Leticia Serra Barrionuevo (1/03-) Julia Schliwka (3/03-) Katalin Fejes Toth (5/01-) Jacek Mazurkiewicz (4/03-) Technische Mitarbeiter Heidi Kramer Frauke Devens Sibylle Ohl Magdalena Schlotter Tajana Salvi Kathrin Wildenberger Andrea Wittmann Petra Schröter Elke Grünewald Stefanie Hofmann Andrea Nijakowski Daniela Bodemer Laura Puccio (1/03-) Diplomanden Julia Schliwka (8/02-2/03) Melanie Ruppel (10/02-6/03) Ingenieur Daniel Göttel (10/98-) Sekretariat Margit Michaeli-MacLeod (5/99-) Molekulargenetische und zytogenetische Analysen menschlicher Tumoren Die Ziele unserer molekularen und zytogenetischen Analyse humaner Tumoren sind: 1. die Klärung des Pathomechanismus einzelner Tumoren durch die Identifizierung der beteiligten Tumorsuppressorgene und Onkogene und der übergeordneten biochemischen Signal- oder Kontrollsysteme; 2. die Identifizierung genetischer Aberrationen bzw. molekularer Signaturen, welche von prognostischer Relevanz sind und zur Stratifizierung der Tumor-Patienten für geeignete Therapieschemata beitragen. Hämatologische Erkrankungen P. Lichter In Zusammenarbeit mit Hartmut Döhner, Martin Bentz, Stefan Stilgenbauer (Innnere Medizin III, Universität Ulm), Peter Möller, und Thomas Barth (Pathologisches Institut der Universität Ulm), Jörg Kalla and H.K. Müller-Hermelink (Pathologisches Institut der Universität Würzburg), Rainer Siebert (Humangenetisches Institut der Universität Kiel), Anna Jauch (Humangenetisches Institut der Universität Heidelberg) und Alfred Nordheim (Zellbiologisches Institut der Universität Tübingen). Ein Schwerpunkt unserer Arbeiten bezieht sich auf die Non- Hodgkin Lymphome chronisch lymphatische Leukämie vom B-Zell Typ (B-CLL) und Mantel-Zell Lymphom (MCL) (In Zusammenarbeit mit der Gruppe um Prof. H. Döhner, Ulm). Durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierungs (FISH)-Studien waren die bei B-CLL häufigsten chromosomalen Aberrationen (Deletion von 13q, 11q, 17p, 6q und Trisomie 12) identifiziert und deren Korrelation zur Überlebenszeit der betroffenen B-CLL Patienten gezeigt worden [1]. Hypermutierte V(H)-Regionen, die einen bestimmten Reifungsgrad von B-Zellen innerhalb des Keinzentrums von Lymphknoten markieren, sind ebenfalls eng assoziiert mit längeren Überlebenszeiten [2, 3]. Sogenannte genomische Hoch-Risiko Mutationen wie der Verlust von Chromosom 17p- oder 11q- zeigen sich vorwiegend in der V(H)-unmutierten Subgruppe, wohingegen günstige Mutationen wie 13q-Verlust in der V(H)-mutierten Subgruppe mehr oder weniger gleich verteilt sind. Die Analyse des V(H)-Mutationsstatus und der VDJ-Umlagerung im MCL ergab eine Korrelation zwischen dem Auftreten somatischer Mutationen und der Expression bestimmter variabler Regionen [4]. Schließlich konnte in MCL-Proben eine Assoziation von mutierten V(H)-Ketten und einer höheren Rate von Komplett-Remissionen beobachtet werden. Der Verlust von Chromosom 13q stellt die häufigste genomische Veränderung in beiden Tumorentitäten B-CLL und MCL dar (> 50%) und betrifft immer eine Region, die die Gene RFPZ, BCMS (B-cell neoplasia-associated gene with multiple splicing) und BCMSUN enthält. BCMS besitzt viele Splice-Varianten, welche mit Hilfe von Mutations- und Expressions-Analysen analysiert wurden [5]. Für die relevanten Gene konnten keine mutierten Gen-Transkripte, jedoch unterschiedliche Expressionsspiegel gefunden werden, die allerdings nicht durch epigenetische Phenomene wie einem veränderten DNA-Methylierungsmuster zustande kommen [6]. Unsere Genexpressions-Analysen innerhalb von B-CLL und MCL wurden mit Hilfe der quantitativen real-time PCR Technik auf tumor-assoziierte Kandidatengene und Proliferations- und Apoptose-assoziierte Gene ausgeweitet [7]. Von den signifikant unterschiedliche exprimierten Genen erlauben die Gene Cyclin D1, CDK4, und c-myc eine eindeutige Klassifizierung von B-CLL und MCL. Der verschiedenartige Pathomechnismus der beiden Lymphomentitäten wird auch durch das Gesamtergebnis der Expressionsanalyse von 17 Genen in 62 B-CLL- und 16 MCL-Proben belegt. Hier zeigte sich, dass das Expressionsgleichgewicht dieser Gene in B-CLL in Richtung Schutz vor Apoptose in den malignen Zellen verschoben ist, wohin- 129

130 130 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung gegen in MCL eine Stärkung in Richtung Proliferation aufgezeigt werden konnte. Bezogen auf die malignen Lymphome konzentrierten wir uns primär auf die mediastinalen B-Zell Lymphome (MBL) [9-10] und das Hodgkin-Lymphom (HD) [11-14]. Beim Hodgkin-Lymphom liegen die malignen Zellen (die sogenannten Hodgkin- und Reed Sternberg (HRS) Zellen nur in einer Häufigkeit von etwa 1-2 % der Gesamtzellpopulation vor. Aus diesem Grunde müssen HRS Zellen für Untersuchungen durch Mikromanipulation isoliert werden. Eine Serie von 40 Hodgkin-Lymphomen wurde nach Mikrodissektion von HRS-Zellen und anschließender universeller Amplifikation der genomischen DNA mittels der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) analysiert. Die Studie ergab, dass HRS-Zellen durch häufig auftretende Zugewinne des kurzen Arms von Chromosom 2 und 9 charakterisiert sind. Weitergehende Analysen deuteten darauf hin, dass das c-rel Onkogen und das für eine Thyrosinkinase kodierende Gen JAK-2 diejenigen Gene sind, die über diese numerischen Veränderungen zur Entwicklung des malignen Phänotyps beitragen. Interessanterweise wurden ähnliche chromosomale Veränderungen in MBL und HD nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass sich die Pathomechanismen für beide Tumorentitäten zumindest teilweise überlappen. Solide Tumoren In Zusammenarbeit mit Gabriele Schackert und Ramon Martinez (Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie, Universität Dresden), Martin Zörnig (Chemotherapeutisches Forschungsinstitut, Georg- Speyer-Haus, Frankfurt). Guido Sauter (Pathologisches Institut der Universität Basel, Schweiz), Andrey Korshunov (Burdenko Institut, Moskau, Russland) Abteilung B060 Molekulare Genetik Um weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen bei Weichteiltumoren zu erhalten, analysierten wir über 200 Leiomyosarkome, maligne periphere Nervenscheidentumoren, gastrointestinale Strumatumoren sowie verschiedene Subtypen von Liposarkomen auf zytogenetische Veränderungen hin (in Zusammenarbeit mit G. Mechtersheimer, Pathologisches Institut Heidelberg) [15]. Eine CGH Studie von 19 dedifferenzierten und pleomorphen Liposarkomen zeigte gemeinsame sowie Subtyp-spezifische chromosomale Veränderungen [16]. So wiesen pleomorphe Liposarkome vor allem Zugewinne der chromosomalen Regionen 5p13- p15, 1p21, 1q21-q22 und 7q22 auf, während dedifferenzierte Tumoren vor allem durch hochgradige Amplifikationen auf dem langen Arm von Chromosom 12 charakterisiert waren. Chromosomale Imbalancen in Liposarkomen wurden weiter durch die hochauflösende Matrix CGH (s.u.) untersucht. Eine Anzahl von Genen konnte identifiziert werden, die bisher nicht mit der Entwicklung dieser Tumoren in Verbindung gebracht wurden, wie zum Beispiel ISR1 und AIB1. Durch die erhaltenen Daten konnten beide Tumorsubtypen durch geeignete Clusteranalysen klar voneinander getrennt werden. Darüber hinaus wurden mehrere Klone, die zwischen den verschiedenen Subtypen unterscheiden können, durch das support vector machine Verfahren identifiziert [17]. Wir haben uns darüber hinaus auf genetische Veränderungen in Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region (HNSCCs) konzentriert. CGH Analysen von 20 Tumoren zeigten hochgradige Amplifikationen und Zugewinne des distalen Teils von Chromosom 3q. Um die kleinste überlappende Region dieser Amplifikationen zu bestimmen, wurden mehrere dieser HNSCCs mit der hochauflösenden Matrix CGH (s.u.) analysiert. Hierfür wurde ein Chromosom 3q26- q28 spezifischer DNA-Chip mit 20 BAC Klonen eingesetzt. Eine gemeinsam in allen untersuchten Fällen amplifizierte Region konnte auf 3 Megabasen eingegrenzt werden. Derzeit werden verschiedene Transkripte innerhalb dieser Region auf ihre pathogenetische Rolle in diesen Tumoren hin untersucht. HNSCCs wurden außerdem mittels des sogenannten Gewebearray (TMA)-Verfahrens analysiert (s.u.). Wir konstruierten ein TMA von etwa 600 HNSCCs und untersuchten die Frequenz hochgradiger Amplifikation von verschiedenen Onkogenen. Es wurden Korrelationen zwischen Genamplifikationen und der Lokalisation der Tumoren gefunden, was darauf hindeutet, dass diese Tumortypen durch unterschiedliche molekulare Aberrationsmuster charakterisiert sind. Hinsichtlich die Überlebensrate der Patienten erwies sich keines der getesteten Gene als signifikanter klinischer prognostischer Marker. [18-20]. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe bezieht sich auf molekular-zytogenetische Untersuchungen maligner Tumoren des zentralen Nevensystems. So wurden chromosomale Imbalancen in metachronen Glioblastomen sowie in Zusammenhang mit dem Ansprechen auf Chemotherapie und zytotoxischen Zytokinen in malignen Gliomen mittels CGH untersucht [21, 22]. In letzteren Fällen waren am häufigsten die Chromosomen 1, 7q, 19q und 20q von numerischen Zugewinnen betroffen, während die Chromosomen 4q, 11q, 13q, und 18q und oft unterrepräsentiert waren. In Zusammenarbeit mit Guido Reifenberger (Düsseldorf) und Ruthild Weber (Bonn) wurde darüber hinaus der Mutationsstatus von potentiellen Kandidatengenen analysiert, die innerhalb der deletierten Loci in Meningiomen lokalisiert sind. Bezüglich der Kandidatengene auf dem chromosomalen Arm 9p zeigten unsere Ergebnisse, dass das CDKN2C Gen selten in Meningiomen verändert ist. Die Mehrzahl der anaplastischen Meningiome zeigte jedoch entweder homozygote Deletionen von CDKN2A, p14 (ARF) und CDKN2B oder Mutationen bzw. einen Expressionsverlust in CDKN2A und p14 ARF. Das weist darauf hin, dass die Inaktivierung des G1/S Checkpoints im Zellzyklus anaplastischer Meningiomzellen eine wichtige pathogenetische Veränderung darstellt. Bezüglich der Kandidatengene auf Chromosom 18q (MADH2, MADH4, APM1 und DCC) fanden sich keine Hinweise auf Veränderungen in diesen Tumoren. Genomische Analysen solider Tumoren wurden außerdem bei Gliosarkomen [23], Mamakarzinomen [24], Melanomen [25] und Pankreaskarzinomen [26] durchgeführt. Weitere Gene (z.b. VPS7 und NF1), die in Zusammenhang mit der Entstehung verschiedener Tumoren stehen, wurden eingehend mittels FISH analysiert [27, 28]. Basierend auf eigenen veröffentlichten Daten wurde eine CGH Datenbank etabliert, welche molekular-zytogenetische Informationen über etwa 3000 unterschiedliche Tumoren enthält (etwa 700 hämatologische Erkrankungen, 500 Karzinome, 250 Weichteiltumoren und 350 ZNS Tumoren) [29]. Mit Hilfe dieser Datenbank zeigte sich, dass hochgradige Amplifikationen des distalen kurzen Arms von Chromosom 5 in 10% aller Tumoren auftraten. Da diese Veränderung besonders unter den Liposarkomen sehr häufig auftritt (18%), haben wir damit begonnen, die Amplifikationen in diesen Tumoren mittels der Matrix-CGH näher zu bestimmen.

131 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Profiling Chromosomaler Abberationen mittels Matrix-CGH Ein auf DNA-Mikroarrays basierender Ansatz der vergleichenden genomischen Hybridisierung (Matrix-CGH) wurde von unserem Labor zum ersten mal 1997 vorgestellt (Solinas- Toldo et al. 1997). Dabei werden die Metaphasen-Chromosomen durch geordnete, auf einer Glasoberfläche immobilisierte DANN-Fragmente ersetzt, sodass im Vergleich zur konventionellen CGH neben einer höheren Auflösung auch eine Grundlage für die automatisierte Analyse genomischer Imbalancen möglich ist. Mit einer vergleichenden genomischen Hybridisierung gegen eine solche Matrix aus DANN- Proben (wie z.b. Cosmide, PACs oder BACs) werden aus dem Verhältnis der Fluoreszenzsignale von Test- und Kontroll-DNA Zugewinne oder Verluste an genetischem Material mit einer Auflösung von bis zu ca. 50 kb nachgewiesen. Im Rahmen der methodischen Optimierung des Matrix-CGH Verfahrens wurde das experimentelle Protokoll weiter verbessert, neue Analyseprogramme entwickelt, und die Datenauswertung zentralisiert [30]. Anwendungen bei verschiedenen NHL zeigten, dass mit diesem Ansatz eine Vielzahl versteckter Amplifikationen gefunden wurden [31-33]. Darüber hinaus wurde ein neuer Matrix-CGH Chip entwickelt zur genomweiten Analyse von chromosomalen Abberationen entwickelt. Dieser Chip, bestehend aus ca genomischen Fragmenten, erlaubt Kopienzahl-Screening mit einer Auflösung von 1 Megabase oder besser, bei gleichzeitiger Analyse von etwa 1800 potentiell Tumorphatogeneserelevanten Genen. Im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) bestehen mit verschiedenen Kliniken und Forschungseinrichtungen Kooperationen, wobei das Verfahren der Matrix-CGH gezielt für die Bearbeitung definierter Fragestellungen eingesetzt wird [31-36]. Für die jeweilige fokussierte Anwendung wurden spezifische DNA-Mikroarrays von uns hergestellt und analysiert: Krankheitsspezifische DNA-Chips, die schnelle und parallele Analyse der prognostisch relevanten Veränderungen der B-CLL und M-CLL ermöglichen. Diese in Zusammenarbeit mit Prof. Döhner (Universität Ulm) entwickelten Chips wurden in Studien der respektiven Tumorentitäten eingesetzt. In einer Blindstudie von 106 Patienten zeigte der B-CLL Chip eine Sensitivität von 100% im Vergleich zu einer bereits vorliegenden FISH Daten [36]. In eine Analyse von MCL Patientenproben konnten mehrere rekurrent abberante chromosomale Regionen genauer eingegrenzt werden [32]. Zur Eingrenzung pathogenetisch relevanter Kandidatenregionen und Identifizierung der von Deletionen bzw. Amplifikationen betroffenen Gene werden Chips eingesetzt, die benachbarte, überlappende chromosomale Fragmente enthalten. Experimentelle Analysen zur Feinkartierung von Abberationen auf Chromosom 12 in B-CLL, Chromosom 1 (Retinoblastoma), Chromosom 4 (Ovarialkarzinom), und Chromosom 5 (Weichteilsarkome) wurden abgeschlossen. Der neuentwickelte Matrtix-CGH Chip zum genomweiten Screening wird zur Zeit zur Untersuchung von Medulloblastomen, Ependymomen, Invasiven Mammakarzinomen, Akuter Myeloischer Leukämie und Hodgkin Lymphomen eingesetzt. Abteilung B060 Molekulare Genetik Expression Profiling durch DNA-Microarrays In Zusammenarbeit mit Peter Angel, Jochen Hess, Oliver Pein, Regina Müller und Lore Florin (A100, DKFZ), Roland Eils (B080, DKFZ), Lutz Edler und Axel Benner (C060, DKFZ), Hartmut Goldschmidt und Friedrich Cremer (Innere Medizin V, Ruprecht- Karls-Universität Heidelberg), Christof Hofele und Kolja Freier (Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg), Andreas Schneeweiß, Christian Rudlowski und Gunther Bastert (Frauenklinik, Ruprecht- Karls-Universität Heidelberg), Martin Zeier und Christian Morath (Medizinische Universitätsklinik, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg), Alwin Krämer (Medizinische Poliklinik, Universität Heidelberg), Hartmut Döhner, Peter Liebisch, Martin Bentz, Stephan Stilgenbauer und Thomas Gress (Innere Medizin, Universität Ulm), Brigitte Schlegelberger (Zelluläre und Molekulare Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover), Bernd Groner, Roland Stauber, Sylvane Desrivieres und Edith Pfitzner (Georg- Speyer-Haus, Frankfurt/Main), Guido Reifenberger (Neuropathologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf), Andreas von Deimling und Christian Hartmann (Neuropathologie, Charité Berlin), Ramon Martinez (Universität Dresden), Claudia Schoch (Medizinische Klinik und Polyklinik III, Ludwig-Maximilians-Universität, München), Alfred Nordheim (Zellbiologie, Eberhard-Karls- Universität Tübingen), Stefan Bohlander und Christian Buske (GSF, München), Georg Zoidl und Cantas Alev (Ruhr-Universität Bochum), Ludger Fink, Jochen Wilhelm und Katja Becker- Brandenburg (Justus-Liebig-Universität Gießen), Lilly Deutschland GmbH (Bad Homburg), Carl Zeiss Jena GmbH (Jena), BioRad Laboratories GmbH (München), Andrey Korshunov und Andrey Golanov (Neuropathologie, Neurochirurgisches N.-N.-Burdenko- Institut, Moskau, Rußland), Ulf Landegren (Genetik und Pathologie, Rudbeck Laboratorium, Uppsala, Schweden), Ada & Don Olins (Scarborough, Maine, USA), Uta Lichter-Konecki (NIH, USA), Alan Harris (The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australien). In unserer Gruppe sind wir vorrangig daran interessiert, umfassende Genexpressionsprofile menschlicher Tumoren zu analysieren. Hierdurch sollen wichtige Erkenntnisse gewonnen werden, z.b. über die Aktion/Regulation von Genen unbekannter Funktion oder über krankheitsspezifische zelluläre Regulationswege ( pathways ). Für die Bearbeitung dieser Fragestellung setzen wir in unserem Labor die DNA- Microarray-Technik ein. Hierzu werden auf einer Glasoberfläche PCR-amplifizierte, genspezifische cdna-fragmente oder chemisch synthetisierte genspezifische 70mer Oligonukleotide immobilisiert, mit denen anschließend die aus der Tumorprobe isolierten Transkripte in Form Fluorophor markierter cdna analysiert werden [37]. So haben wir u.a. einen OncoChip mit ca verschiedenen genspezifischen Sonden entwickelt, welcher für 2600 Gene mit bekannter onkologisch / hämatologischer Bedeutung (u.a. involviert in Zellzyklus, Apoptose-Induktion, Erythropoese, Mitose) spezifisch ist. Hierüber können umfassende Expressionsprofile krebsrelevanter Gene erstellt werden. Dieser Microarray wird u.a. zur Profilierung von hämatologischen Neoplasien [38] und Liposarkomen [17, 39], insbesondere aber auch von Tumoren des zentralen Nervensystems (z.b. Ependymome [40], Meningiome, Medulloblastome [41], Oligodendrogliome) genutzt. So konnten an der promyeloischen Zelllinie HL-60, die sich bei Stimulus mit TPA oder Retinsäure unterschiedlich differenziert, wichtige Erkenntnisse zur Regulation dieses Differenzierungsgeschehens gewonnen werden [Wrobel, Dissertation 2004]. Diese Studien werden ergänzt und verifiziert durch quantitative real-time-pcr-versuchsreihen (siehe z.b. [40]). Im Berichtszeitraum wurden Sammlungen von genspezifischen Sonden für die Forschung zugänglich, die mehrere 131

132 132 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung zehntausend Gene und somit weite Bereiche der Gene des menschlichen und murinen Genoms umfassend repräsentieren. Um hiervon entsprechende DNA-Microarrays herstellen zu können, mussten die etablierten bisherigen Protokolle weiterentwickelt werden. Durch umfassende methodische Optimierungsarbeiten, die u.a. die Art der verwendeten Glasoberfläche, Spotting-Pufferrezeptur, Minimierung der Hintergrund-Fluoreszenz und erzielbare Spot- Dichte umfassten, konnte ein Protokoll entwickelt werden, welches die Aufbringung von bis zu genspezifischen Sonden auf einer Glasoberfläche ermöglicht [37]. Ein weiteres gravierendes Problem bei der Analyse von Tumortranskriptomen besteht in der oftmals limitierten Menge an RNA-Ausgangsmaterial, die die Analyse stark beeinträchtigt oder gar verhindert. Deshalb haben wir ein neuartiges in-vitro-mrna-amplifikationsprotokoll entwickelt, welches es gestattet, selbst von geringen Nanogramm- Mengen Gesamt-RNA ausgehend, ausreichend arna zu generieren, um hiermit zuverlässig und erfolgreich Expression-Profiling-Experimente auf Oligonukleotid-Microarrays durchführen zu können. Bisherige RNA-Amplifikationsprotokolle waren mit gespotteten Oligonukleotid- Microarrays, die üblicherweise sense-orientierte Oligonukleotid-Sonden tragen, nicht kompatibel, da diese Verfahren ebenfalls einen markierten sense-cdna-strang produzieren. Dies neuartige Protokoll ergibt Dye-markierte antisense-cdna, die mit den üblichen Typen gespotteter Oligonukleotid-Microarrays voll kompatibel ist, so dass diese Amplifikationstechnik einen wichtigen technologischen Fortschritt auf diesem Gebiet darstellt. Das Verfahren wurde seitdem in einer Vielzahl von Projekten sehr erfolgreich angewendet. Einen methodisch äußerst wichtigen Aspekt im Zusammenhang mit Microarray-Experimenten stellt die finale Analyse und Interpretation der gewonnen enormen Datenmengen dar. Die Datenanalyse erfolgt über komplexe Computerverfahren, die unterschiedliche Methoden der Bioinformatik, Biostatistik und des Data Mining vereinen. Benötigt werden des Weiteren spezifische Datenbanken, die alle grundlegenden Informationen zu den auf die Microarrays aufgebrachten genspezifischen Sonden (z.b. Klon- und Geninformationen) erfassen und speichern. Dies erfolgt in unserer selbst entwickelten clone database, die u.a. Links zu den bedeutenden biologischen Datenbanken, Informationen über Genlokalisation, funktionelle Annotation etc. umfasst und sich automatisch selbst aktualisiert. Alle relevanten Schritte der high-throughput-experimente sowie des Microarray-Produktionsprozesses werden zudem in unserem selbst entwickelten Laboratory Information and Management System QuickLIMS [42] erfasst und dokumentiert. Als Kernkomponente der Datenspeicherung und der statistischen Analyse der Microarray-Experimente, entsprechend der MIAME-Standards, wurde ferner das Programmpaket ChipYard framework entwickelt, welches es dem Microarray-Anwender ermöglichen soll, seine experimentellen Ergebnisse unter definierten Bedingungen auswerten zu können. Die beschriebenen methodischen Entwicklungen waren die Voraussetzung für die erfolgreiche Herstellung und Anwendung eines neuen Microarray-Typs, der für humane Gene spezifische 70mer Oligonukleotide jeweils als Replikat trägt (d.h. insgesamt Spots je Microarray). Dieser 70mer-Microarry wurde im Rahmen verschiedener Studien an epithelialen, hämatologischen und cranialen Tumorserien Abteilung B060 Molekulare Genetik sowie Zellkultur-Modellen von Apoptose bis Organabstoßung mit großem Erfolg eingesetzt, so u.a.: Basaliome: Expression-Profiling-Studien an einer Serie von Basaliomen und nachfolgende bioinformatische Analysen der identifizierten, im Vergleich zu normaler Haut differentiell exprimierten Gene zeigten, dass in diesen Tumoren insbesondere Gene des Zellzyklus, der Meiose und von DNA-Replikation/ Chromosomal Cycling hochreguliert sind. Durch Vergleich mit Daten aus Expression-Profiling-Studien am Tumorprogressionsmodell der murinen Haut nach DMBA/TPA-Behandlung wurden wichtige gemeinsame Kandidatengene und Pathways identifiziert, die für die humane epidermale Karzinogenese relevant sind und derzeit molekular eingehend weiter charakterisiert werden [43]. Studien zur molekularen Wirkung eines neuartigen Immunsuppressivums und Proliferationshemmers im Zellkulturversuch. Studien an primären Mammatumoren zur Identifizierung prognostisch relevanter Gensignaturen. Weiterhin wurden zwei umfassende DNA-Microarray-Typen für die Analyse muriner Expressionsprofile hergestellt, die (LION-Microarray) bzw (NIA-Microarray) verschiedene genspezifische Sequenzen der Maus repräsentieren. Hierdurch kann nun auch das für die Tumorforschung äußerst wichtige Tiermodell Maus mittels dieser Technik erschlossen werden. In einer in Zusammenarbeit mit der Abteilung von P. Angel durchgeführten Studie zur Tumorprogression konnten zahlreiche Gene identifiziert werden, die in der Maus an der mehrstufigen Entstehung von Hauttumoren unter Einfluss des Tumorpromoters TPA beteiligt sind. Diese Ergebnisse wurden durch quantitative real-time- PCR bestätigt. Erste auf diesen Ergebnissen basierende Folgestudien an humanen Tumoren belegen bereits, dass einige der so identifizierten Gene auch an der Entstehung menschlicher Hauttumoren beteiligt sind. Gewebe Mikroarrays In Zusammenarbeit mit Harald Stein (Benjamin-Franklin-Hospital, Berlin), Bernd Dörken (Charite, Berlin), Guido Sauter (Pathologisches Institut der Universität Basel), Andrey Korshunov (Burdenko Institut, Moskau), Hermann-Joseph Gröne (DKFZ) Gewebe Mikroarrays (DNAs) sind geeignet für Hochdurchsatzuntersuchungen immunhistochemischer und zytogenetischer Parameter von klinisch definiertem Tumormaterial. Kandidatengene und Proteine können mit Hilfe von TMAs schnell auf Zusammenhänge mit klinischen Parametern wie der Bildung von Metastasen oder dem Gesamtüberleben hin getestet werden. Wir haben TMAs aus mehr als 5500 verschiedenen Tumoren von 2700 unterschiedlichen Patienten hergestellt. Darin sind enthalten: Tumoren der Kopf- Hals-Region, Prostatakarzinome, Basaliome, Hodgkin Lymphome, niedrig und hochmaligne B-Zell Lymphome, T-Zell Lymphome, Meningiome, Medulloblastome, Thymome sowie adenoid-zystische Karzinome. Die Protokolle für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an TMAs wurden weiter optimiert, sodass Untersuchungen auf TMAs mit BAC und PAC Sonden jeder beliebigen genomischen Region durchgeführt werden können [19]. Darüber hinaus führten wir eine neue Strategie zur automatischen Daten-Aufnahme und Evaluation immunhistochemischer Analysen ein. Diese basiert auf der Erfassung digitaler Bilder mittels Laser Scanninng Verfahren [26]. Beide der genannten Applikationen sind von hohem praktischen Wert und wurden für eine Anzahl von

133 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Studien, die im besonderen Genom- und Expressionsprofilstudien ergänzten, eingesetzt [20, 39-41]. Funktionelle Architektur des Interphase-Zellkerns Interphase-Chromosomen sind territorial organisiert, wobei Gene vor allem in der Peripherie dieser Territorien liegen (Kurz et al. 1996) während die sog. nuclear bodies typischerweise außerhalb von Chromosomen-Territorien gefunden werden. Das sogenannte ICD-Modell (ICD: Interchromosomal Domain) postuliert darüber hinaus, dass zwischen den Chromosomen-Territorien ein funktionelles nukleares Kompartiment existiert, welches mit der Transkription zusammenhängt (Zirbel et al. 1993). Zur Charakterisierung der strukturellen und funktionellen Organisation des Interphase-Zellkerns (siehe auch [8]) untersuchen wir in diesem Zusammenhang die Lokalization genomischer Sequenzen relativ zur Ausdehnung des zugehörigen Chromosoms durch Fluorescence in-situ hybridiszation (FISH), die Verteilung und Dynamik endogener wie exogener Substanzen bzw. Partikel durch 3-dimensionale, zeitaufgelöste Laser-Scanning Mikroskopie, sowie die Diffusionswege exportkompetenter RNA. Neuere FISH-Untersuchungen mit Proben zu transkriptionell aktiven Regionen im Vergleich zu Regionen ohne bekannte Funktionalität zeigen, dass die inaktiven Regionen hauptsächlich an der Kernperipherie lokalisiert sind, während transkriptions-aktive Regionen eher zum Innern des Zellkerns hin lokalisiert sind. Mit der Vorstellung, dass das Chromatin durch seine Struktur diffusionsabhängige Prozesse hemmt, wäre es also denkbar, dass Chromosomenterritorien kernperipher dichter gepackt sind als im Kerninnern. Bezogen auf den ICD wäre dann zu erwarten, dass der interchromosomale Raum nahe der Kernperipherie enger und schärfer begrenzt ist, der ICD sich in Richtung Zentrum des Kerns dagegen lakunenartig aufweitet und sich der Übergang zu den angrenzenden Chromosomenterritorien zunehmend verwischt. Zur Darstellung dieses funktionell aktiven, diffusionskompetenten Raumes arbeiten wir aktuell an einer Methode, selektiv die exportaktive, endogene RNA zu markieren. Mikroinjizierte Dextrane verteilen sich sehr schnell im Zellkern. Injektion fluoreszenzmarkierter Dextrane unterschiedlicher molekularer Grösse hat gezeigt, dass die Verteilung mit zunehmender Größe inhomogener wird [44]. Für größere, partikuläre Molekülaggregate, z.b. die endogenen nuclear bodies, war schon in der Vergangenheit gezeigt worden, dass sie nicht in Chromosomenterritorien eingebettet liegen (Zirbel et al. 1993). Im Besonderen gilt das auch für exogen exprimiertes Xenopus vimentin (in collaboration with H. Herrmann, DKFZ). Vimentin gehört zu den zytoplasmatischen Intermediärfilamenten. Die Variante aus dem Krallenfrosch lässt sich temperaturabhängig reversibel polymerisieren: Temperaturen unter 30 C induzieren die Bildung von Vimentinbündeln im Kern von Zellen, die mit NLS-Vimentin transfiziert wurden. Diese Bündel folgen den Oberflächen von Chromosomenterritorien, sie dringen nicht in die Territorien ein Kolokalisation mit Markern für nuclear bodies wir z.b. speckles, PML-bodies oder Cajal bodies zeigen diese bodies häufig in unmittelbarer Nähe zu den Vimentin-Bündeln. Diese räumliche Nähe ist nicht durch eine Affinität der Vimentin-Filamente mit den Proteinbodies erklärbar, da einerseits Lebendbeobachtungen zeigen, dass sich beide Komponenten über die Zeit voneinander trennen können, anderseits zeigen elektronenmikroskopische Untersuchungen, dass sich die Abteilung B060 Molekulare Genetik Komponenten nicht miteinander verbinden. Vielmehr erklärt sich die räumliche Nähe besser durch die Begrenzung des zur Verfügung stehenden Raumes: Die partikulären Kernbestandteile, die nicht in die Chromosomenterritorien vordringen können, müssen sich zwischen den Territorien aufhalten und werden dort zusammengedrängt. Ihre Mobilität ist dann mitbestimmt durch die Dynamik der Formveränderungen der Territorien. Messungen zur Dynamik von PML-bodies, Cajal-bodies und ektopisch exprimierten, kleinen Protein-Kristallen (YFP-Mx1) legen nahe, dass die Beweglichkeit dieser Partikel durch zwei Diffusionskonstanten bestimmt ist, die sich in einem Modell für coralled diffusion als Zusammenspiel von der Eigendiffusion des Partikels im Nucleoplasma und der Diffusion des zeitlich veränderlichen Raumes zwischen den Chromosomenterritorien verstehen lassen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] * Döhner, H., *Stilgenbauer, S., Lichter, P. (2001) Chromosomal abnormalities in chronic lymphocytic leukemia. New Engl. J. 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134 134 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung [11] Küpper, M., Joos, S., von *Bonin F., *Daus, H., *Pfreundschuh*, M., Lichter, P., *Trümper, L. (2001) MDM2 gene amplification and lack of p53 point mutations in Hodgkin and Reed-Sternberg cells: Results from single cell polymerase chain reaction and molecular cytogenetic studies. Br. J. Haematol. 112, [12] Joos, S., *Menz, C.K., *Siebert, R., *Geske, S., Ohl, S., Wrobel, G., *Mechtersheimer, G., *Trümper, L., *Möller, P., Lichter, P., *Barth, T.F.E. (2002) Classical Hodgkin s lymphoma is characterized by recurrent copy number gains of the short arm of chromosome 2. Blood 99, [13] Joos, S., *Granzow, M., *Holtgreve-Grez, H., *Siebert, R., *Harder, L., Martín-*Subero, J.I., *Wolf, J., Adamowicz, M., *Barth, T.F.E., Lichter, P., *Jauch, A. (2003) Hodgkin s lymphoma cell lines are characterized by frequent aberrations on chromosome 2p and 9p including REL and JAK. Int. J. 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135 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B060 Molekulare Genetik [40] Korshunov, A., Neben, K., Wrobe,l G., Tews, B., Benner, A., Hahn, M., *Golanov, A., Lichter, P. (2003) Gene expression patterns in ependymomas are correlated to tumor location and patient age. Am. J. Patho.163, [41] Neben, K., Korshunov, A., Benner, A., Wrobel, G., Hahn, M., *Golanov, A., Joos, S., Lichter, P. (2004) Microarray-based screening for molecular markers in medulloblastoma revealed STK15 as independent predictor for survival. Cancer Res. 64 (in press) [42] Kokocinski, F., Wrobel, G., Hahn, M., Lichter, P (2003) QuickLIMS: facilitating the data management for DNA-microarray fabrication. Bioinformatics 19, [43] Schlingemann,J., Hess, J., Wrobel, G., Breitenbach, U., Gebhardt, C., Steinlein, P., Kramer, H., Fürstenberger, G., Hahn, M., Angel, P., Lichter, P. (2003) Profile of gene expression induced by the tumor promotor TPA in murine epithelial cells. In. J. Cancer 104, [44] Görisch, S.M., Richter, K., Scheuermann, M.O., Herrmann, H., Lichter, P. (2003) Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Exp. Cell Res. 289,

136 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse 136 Abteilung Funktionelle Genomanalyse (B070) Leiter: Dr. Jörg Hoheisel Wissenschaftler Dr. Verena Aign (4/02-) Dr. Tim Beißbarth (-6/02) Dr. Kurt Fellenberg (2/02-) Dr. Robert Fleischer Dr. Marcus Frohme Dr. Anette Jacob Dr. Zheng Li (10/03-) Dr. Timo Pulli (1/03-) Dr. Marcel Scheideler (3-8/02) Dr. Iana Syagailo Dr. Dimitrij Zubakov (-12/02) Gastwissenschaftler Dr. Nicole Hauser (Stuttgart; 6/01-) Dr. Sara Marsal Barill (Barcelona, Spanien; 6-7/03) Raphael Martinez (Mexico City, Mexiko; 2/03-) Janne Pullat (Tartu, Estland; 3-12/02) Prof. Josefa Salgado (Sevilla, Spanien; 11-12/02) Dr. Marc Valle (Madrid, Spanien; 7-8/02) Dr. Olaf Witt (Universität Göttingen; 11/02-12/03) Dr. Li Zheng (Schanghai, China; -9/03) Dr. Dimitrij Zubakov (Universität Heidelberg; 1/03-) Doktoranden Verena Aign (-3/02) Andrea Bauer Boris Beckmann Jürgen Beigel (-3/02) Anette Boerner (12/03-) Ole Brandt Stefanie Brems (3/03-) Christian Busold (1/02-) Kurt Fellenberg (-2/02) Yi-Ping Lin (11/03-) Susanne Grahlmann (-8/02) Volker Hollich (11/02-11/03) Tamara Korica Wladislaw Kusnezov Anja Petersohn (-6/02) Janne Pullat (1/03-11/03) Michaela Schanne (6/02-) Diana Stjepandic Simone Würtz (-6/03) Technisches Personal Melanie Bier Claudia Czink (-3/02) Tarik Hamid (2-4/02) Julia Klopp (1-5/03) Nina Kosmis (3/02-8/03) Sven Rüffer (2/03-) Marita Schrenk Sandra Schwarz Achim Stephan Jessica Werdermann (8/01-) Diplomanden Klára Drábková (10/03-) Julia Klopp (3-12/02) Chunguang Liang (9/03-) Jorge Soza Ried (5-12/03) Alexandra Walijew (-5/02) Studenten Meju Dominic (11/03-) Sonja Egolf (9/02-3/03) Anja Koschmieder (10/03-) Nicola Rath (6-10/03) Caren Raule (9/02-6/03) Jochen Rudolph (7-9/02) Christoph Schröder (11-12/03) Auszubildende Raphael Bleier (9/02-5/03) Jana Faut (4-11/03) Tarik Hamid (-1/02) Susannah Heck (9/02-5/03) Simone Jünger (5/03-) Jessica Kimmel (-7/02) Nadine Krenzer (10/03-) Jochen Kreth (10/02-9/03) Melanie Lehr (-9/02) Daniela Muth (10/03-) Sven Rüffer (5/02-1/03) Sekretariat Anke Mahler Fabian Unkrig (8/03-) Die Arbeiten der Abteilung Funktionelle Genomanalyse zielen auf die Entwicklung und unmittelbare Anwendung neuer Technologien zur Produktion und Prozessierung biologischer Information auf ganz-genomischer Ebene mit dem Ziel einer Beschreibung und Analyse der zellulären Umsetzung der genetischen Information und der Regulation dieser Vorgänge. Ein Schwerpunkt liegt dabei im Gebiet der DNA-, Protein- und Peptid-Microarrays. Dabei werden biophysikalische und chemischen Fazetten der Chipherstellung sowie Gesichtspunkte der Datenanalyse weiter entwickelt, um durch das grundlegende Verständnis methodischer Aspekte verbesserte Analyseverfahren zu etablieren. Aufbauend auf den rein technischen Entwicklungen werden die Methoden unmittelbar in biologisch und biomedizinisch motivierten Studien angewandt, die an zahlreichen Organismen durchgeführt werden. Hinsichtlich der Analyse von menschlichem Probenmaterial werden - mit dem Schwergewicht im Bereich bestimmter Tumore - Systeme zur Frühdiagnose, Krankheitsprognose und zur begleitenden Analyse des Behandlungserfolgs etabliert. Viele der Projekte werden im Rahmen nationaler oder internationaler Kooperationen und Programme durchgeführt. Neben anderen Anwendungen arbeiten wir im Bereich der molekularen Epidemiologie zum Beispiel an der Identifizierung und anwendungsbezogenen Umsetzung von krankheitsrelevanten Einzelbasenaustauschen ( single nucleotide polymorphisms ; SNPs). Gleichzeitig wird die Genotypisierung bestimmter pathogener Organismen und Viren verfolgt. Die Analyse epigenetischer Variationen ist ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten. Vergleichende Studien von Veränderungen in den Transkriptmengen aller Gene und der tatsächlichen Proteinexpression mit Blick auf die sich daraus ergebenden (phänotypischen) Konsequenzen sind ebenfalls im Gange und werden weiter vertieft. Dazu werden auch neuartige Prozesse wie Verfahren zur Selektion relevanter Sensormoleküle entwickelt, die beispielsweise die Bereitstellung von Bibliotheken hoch-affiner und spezifischer Antikörper erlauben. Die Abteilung ist im kleineren Maße auch noch in der Kartierung und Sequenzierung ganzer Genome aktiv. Diese Arbeiten stellen meist einen Vorlauf für weitergehende funktionelle Analysen dar. Ein weiteres Ziel ist die Etablierung neuartiger Methoden zur Untersuchungen der Korrelation von DNA-Struktur und Enzymaktivität, mit Perspektiven in der reinen Analytik und dem grundlegenden Verständnis von Protein-Nukleinsäure Wechselwirkungen.

137 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Funktionelle Genomanalyse J.D. Hoheisel, V. Aign, T. Beißbarth, K. Fellenberg, R. Fleischer, M. Frohme, A. Jacob, Z. Li, T. Pulli, M. Scheideler, Y. Syagailo, D. Zubakov, N. Hauser, S. Marsal Barill, R. Martinez, J. Pullat, J. Salgado, M. Valle, O. Witt, A. Bauer, B. Beckmann, J. Beigel, A. Boerner, O. Brandt, S. Brems, C. Busold, Y.-P. Lin, S. Grahlmann, V. Hollich, T. Korica, W. Kusnezov, A. Petersohn, M. Schanne, D. Stjepandic, E. Ullu, S. Würtz In Kooperation mit: H. Arlinghaus, Universität Münster; J. Arnold, University of Georgia, Athens, USA; M. Beier, Febit, Mannheim; N. Becker, DKFZ; K. Berlin, Epigenomics, Berlin; A. Brown, Universität Aberdeen, UK; S. E. Celniker, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, USA; C. Clayton, ZMBH, Universität Heidelberg; K. Dekker, MPI für Züchtungsfoschung, Köln; R. Frank, GBF, Braunschweig; H. Friess, Universität Heidelberg; E. Furlong, EMBL, Heidelberg; T. Gress, Universität Ulm; M. Harder, Merck, Darmstadt; M. Hecker, Universität Greifswald; M. Hrabé de Angelis, GSF, München; V. de Lorenzo, Centro Nacional de Biotecnologia, Madrid, Spanien; Frank Lyko, DKFZ; M. von Knebel-Döberitz, Universität Heidelberg; W. Mewes; GSF, München; A. Metspalu, Universität von Tartu, Estland; M. Nees, Universität Heidelberg; Karen Nelson, TIGR, Rockville, USA; S. Oliver, Universität Manchester, UK; R. Paro, ZMBH, Universität Heidelberg; A. Pühler, Universität Bielefeld; F. Sauer, ZMBH, Universität Heidelberg; M. N. Schlaich, RWTH Aachen; M. Schnölzer, DKFZ; U. Schulte, Universität Düsseldorf; A. Simpson, Ludwig Institut; Sao Paulo, Brasilien; B. Tümmler, Medizinische Hochschule Hannover; E. de Villiers, DKFZ; M. Vingron, MPIMG, Berlin; S. Volinia, Universität von Ferrara, Italien; und vielen anderen. Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse DNA-Microarray/DNA-Chip Technologie Mit der Entschlüsselung der vollständigen Sequenzinformation in einer Vielzahl von Organismen werden experimentelle Verfahren zur Analyse der zellulären Umsetzung der dort kodierten Information essentiell für weiterführende, funktionelle Studien. In den letzten Jahren hat sich die DNA- Chip Technologie zu einem wichtigen Werkzeug für solche Untersuchungen entwickelt. Über Modifikationen des grundlegenden Ansatzes sind viele, verschiedene Anwendungen möglich. Technische Entwicklungen zur Herstellung hochqualitativer Microarrays Für chip-basierende Analysen werden unterschiedliche Microarray-Systeme verwendet, die als Sensormoleküle entweder Oligonukleotide oder lange DNA-Fragmente tragen. In der Herstellung unterscheiden sie sich noch dadurch, ob Oligomere in situ synthetisiert werden oder DNA (Oligomer oder PCR-Produkt) als vorgefertigtes Fragment aufgebracht werden. Verschiedene Aspekte der Herstellung, die die Qualität der DNA-Microarrays maßgeblich beeinflussen, wurden untersucht und verbessert. Fotolithografische Produktion von Oligonukleotid- Chips (BMBF finanziert) Die Qualität der Oligonukleotide auf einem DNA-Chip hat immense Konsequenzen auf die Genauigkeit, Sensitivität und Messdynamik von Microarray Analysen. Die Qualität der fotolithografischen in situ Synthese hängt von der Effizienz der Fotoentschützung ab. Mittels eines neu entwickelten Prozesses konnte unter Ausnutzung von 5'-[2-(2-Nitrophenyl)-Propyloxycarbonyl]-2'-Deoxynucleoside Phosphoramiditen die schrittweise Syntheseausbeute im Vergleich zu bestehenden Verfahren wesentlich verbessert werden. Außerdem wurden fotolabile 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)-Propoxycarbonyl]-geschützte 5'-Phosphoramidite hergestellt. Aufgrund ihrer einzigartigen Charakteristik kann die lichtgesteuerte in situ Oligonukleotid-Synthese auf dem Chip in 5'-3' Richtung erfolgen. Dadurch sind die Oligonukleotide auf dem Chip invers ausgerichtet, wodurch ihre 3'-Enden als Substrat für nachfolgende Polymerasereaktionen dienen können. Produktion von DNA-Microarrays mit hoher Homogenität der Belegpunkte und geringem Hintergrundsignal aus unaufgereinigten PCR-Produkten (BMBF finanziert) In Analysen auf DNA-Microarrays, die durch das Aufbringen ( spotting ) vorgefertigter DNA-Fragmente entstehen, spielt die Qualität der Belegpunkte und die Stärke des Hintergrundsignals auf dem Glasträger eine wichtige Rolle. Durch den Zusatz von Betaine wurde die Bindungseffizienz und die Homogenität der Belegpunkte wesentlich verbessert. Zusätzlich konnte das unspezifische Hintergrundsignal stark verringert werden, indem die Blockierung der Aminogruppen auf der Chip-Oberfläche mit Succinylanhydrid durch die Gegenwart des unpolaren, nicht-wässrigen Lösungsmittels 1,2-Dichloroethan und des Katalysts N-Methylimidazol verbessert wurde. Mittels dieses Verfahrens konnte auch die aufwendige Aufreinigung der PCR-Produkte vor dem Aufbringen uaf die Microarray-Oberfläche vermieden werden, wodurch auch etwa doppelt so viele der teuren Microarrays produziert werden können. Herstellung und Nutzung komplexer Oligonukleotid Microarrays aus licht-kontrollierter in situ Synthese In Kooperation mit der Firma febit, nutzen wir als β-testpartner das Geniom-Gerät zur Herstellung komplexer Oligonukleotid-Microarrays. Durch die Kombination mit unseren Entwicklungen auf dem Gebiet licht-gesteuerter Oligomersynthese (s.o.), sind eine Vielzahl verschiedener Anwendungen möglich, wie etwa Untersuchungen von Transkriptmengen, Studien im Bereich molekulare Epidemiologie und Genotypisierung, Typisierung von HPV-Viren und die Durchführung enzymatischer Reaktionen direkt auf dem Chip. Markierungs- und amplifikationsfreier Nachweis von Hybridisierexperimenten auf Peptide Nucleic Acids (PNAs) (BMBF finanziert) Die Verwendung von PNA-Oligomeren als Chip-gebundene Sensor-Moleküle wurde in der Abteilung entwickelt. Die vollautomatische, parallele Synthese von mehreren Tausend PNA-Molekülen wurde im Labor etabliert. Des weiteren existieren Methoden zur Aufreinigung der Moleküle und Herstellung hoch-dichter PNA-Chips. Da PNA-Synthese chemisch betrachtet eine Peptid-Synthese darstellt, lassen sich diese Verfahren auch für die Herstellung komplexer Peptid-Chips nutzen. Im Vergleich zu DNA-Oligonukleotiden hat PNA wesentliche Vorteile. Vor allem lässt sich die Bindung von Nukleinsäuremolekülen direkt - markierungsfrei und ohne Amplifikation des Ausgangsmaterials - über die Phosphatgruppen massenspektrometrisch nachweisen, da PNA keine Phosphatgruppen besitzt. In einem Nachfolgeprojekt wird in Zusammenarbeit mit drei Firmen jetzt an der Entwicklung eines Prototypen gearbeitet 137

138 138 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abb.1: Nachweis der Bindung unmarkierter DNA. (a) PNA Oligomere wurden mit einer Mischung fluoreszenz-markierter DNA- Moleküle (rechts) oder der ensprechenden, unmarkierten DNA hybridisiert (links). Im zweiten Fall erfolgte der Nachweis über Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS). (b) Eine Verdünnungsreihe zweier PNA-Oligomere wurde mit einem unmarkierten Olignukleotid hybridisiert, das nur zur rechten Sonde komplementär war. Die Signalintensitäten repräsentieren eine Falschfarbendarstellung der Menge an Phosphat (PO 3- ) an der jeweiligen Stelle. Genotypisierung SNP Genotypisierung Die Typisierung von Einzelbasenaustauschen ( Single Nucleotide Polymorphisms ; SNPs) für Studien im Bereich molekulare Epidemiologiie werden in Zusammenarbeit mit der Abteilung Klinische Epidemiologie (Alexandra Nieters and Nikolaus Becker) durchgeführt. Es wurde ein Microarray für die Analyse von SNPs etabliert, die mit dem Auftreten von Lymphknotenkrebs assoziiert sind. In einer ersten Projektphase werden für etwa 600 Patienten und 600 Kontrollpersonen die epidemiologischen Daten mit der molekularen Information bei etwa 100 SNPs verglichen. Typisierung menschlicher Papillomaviren In Zusammenarbeit mit der Abteilung Charakterisierung von Tumourviren (Prof. Ethel de Villiers) wurde ein DNA-Chip entwickelt, mit dem alle bekannten Typen des menschlichen Papillomavirus charakterisiert werden können, von denen einige für die Ausbildung von Gebärmutterhals-Krebs verantwortlich sind. Damit läßt sich einfach feststellen, mit welchen Virentypen eine Frau infiziert ist. Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse Epigenetische Analysen (BMBF und DFG finanziert) In gemeinsamen Projekten mit der Firma Epigenomics, der GBF in Braunschweig und der neu etablierten Arbeitsgruppe Epigenetik (Dr. Frank Lyko) untersuchen wir den epigenetischen Zustand - sprich Änderungen im Methylierungszustand - bestimmter genomischer Bereiche. Veränderungen in den genomischen DNA-Methylierungsmustern stellen eines der frühesten und häufigsten Ereignisse in der Krebsentstehung dar. Die epigenetischen Daten werden zusammen mit verfügbaren klinischen Daten und den Ergebnissen genom-weiter Transkriptionsanalysen ausgewertet. Unsere Ergebnisse erlauben fundamentale Einblicke in die Rolle der DNA-Methylierung während der Tumorentstehung und bilden die Grundlage für eine epigenetische Tumorklassifikation. Ganz-genomische Untersuchungen von Transkriptionsänderungen Ziel der Studien ist der gleichzeitige Nachweis der Transkriptmengen aller Gene eines Organismus. Für alle Gene werden repräsentative PCR-Produkte in einem geordneten Raster auf Microarrays aufgebracht. Auf diese DNA-Chips wird mit Gesamt-RNA hybridisiert, und der Grad der Transkription der individuellen Gene durch eine Detektion der Signalintensitäten an jeder Position des Rasters bestimmt. Gleichzeitig zur experimentellen Durchführung wurden in Kollaboration mit der Abteilung Theoretische Bioinformatik von Martin Vingron Algorithmen und Datenbanken zur Auswertung solcher Datensätze entwickelt. Transkriptionelle Studien an Krebsgeweben (finanziert durch BMBF, EU, Deutsche Krebshilfe und Firmenkollaborationen) In verschiedenen Projekten wurden eine Reihe von krebsspezifischen wie auch ein globaler Microarray mit Fragmenten solcher Genen entwickelt und angewandt, die in verschiedenen Krebsformen ein differenzielles Transkriptionsverhalten anzeigen. In Zusammenarbeit mit den Firmen Merck, Hoffmann la Roche und einer Reihe von klinischen Partnern wurden transkriptionelle Unterschiede zwischen Normal- und Krebsgewebe untersucht. Ziel ist die Entwicklung von Systemen zur Frühdiagnose, Krankheitsprognose und zur begleitenden Analyse des Behandlungserfolgs. Dies wurde speziell für Formen des Bauchspeicheldrüsenkrebs erfolgreich durchgeführt und wird in preklinischen Studien bereits angewandt. Auch wurden potentielle Zielgene identifiziert, die von den Firmenpartner z.z. hinsichtlich möglicher Therapieansätze weiter untersucht werden. Abb.2: Bestimmung von Gemischen menschlicher Papillomaviren (HPV). Deutlich sind die Unterschiede in den Signalintensitäten zwischen solchen Molekülen zu sehen, die vorhandenen sind bzw. nicht im Gemisch vorliegen. Abb.3: Transkriptionelle Untersuchung von RNA aus Pankreastumor (rot markiert) und Gewebe mit chronischer Pankreatitis (grün markiert). Gene mit gleicher Aktivität zeigen die Mischfarbe Gelb.

139 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung MouseExpress : In silico Analyse der Expressionsprofile von Mausmutanten (BMBF-finanziert) In Zusammenarbeit mit der GSF in München wurden zwei Microarrays mit Genen der Maus etabliert. Einmal wurden cdna-klone amplifiziert, die in silico als nicht-redundant ausgewählt wurden. Parallel dazu wurde ein sequenzverifizierter Satz von Genfragmenten der Firma LION bioscience amplifiziert und auf Glas-Objektträger aufgebracht. Die molekulare Ähnlichkeit zwischen Mensch und Maus hinsichtlich Genomstruktur, Stoffwechsel, Physiologie und Entwicklungsmechanismen macht die Maus zum wichtigsten Modell für Studien von Vererbungskrankheiten im Menschen. Zur Integration der vorliegenden genomischen (Sequenz-) Information und biologischer und biomedizinischer Forschung wird ein systematischer Ansatz zur Identifizierung von Genfunktionen durchgeführt. Mausmutanten aus dem ENU Mutagenesis Screen der GSF werden innerhalb des Projekts auf Änderungen der Genexpression hin untersucht. Funktionelle Analysen in Drosophila melanogaster (BMBF-finanziert) Für das Modellsystem Drosophila wurden die molekularen Werkzeuge geschaffen, um in weiterführenden Arbeiten ganz-genomische Aspekte zu bearbeiten. Dazu wurde zusammen mit dem ZMBH ein Microarray für alle Gene der Fliege entwickelt, der den konkurrierenden amerikanischen Systemen in der Abdeckung überlegen ist nun von internationalen Konsortien als Grundlage für weitergehende Studien definiert wurde. Parallel dazu wurde in Zusammenarbeit mit der Harvard University ein globaler Satz an sirna Molekülen erstellt, so dass alle Gene von Drosophila gezielt inaktiviert werden können. In Zusammenarbeit mit der University of Berkeley wurde aus allen DNA-Fragmenten, die zur Sequenzierung des Genoms genutzt wurden, ein Minimalsatz gewonnen. Dieser wird zur Zeit in Kollaboration mit dem EMBL und der University of Oregon genutzt, um einen genomischen Microarray herzustellen. Mit diesen Werkzeugen wird in mehreren Kollaboration an der Analyse von Tumormodellen in Drosophila gearbeitet. Untersuchung komplexer Veränderungen des Expressionsmusters in Saccharomyces cerevisiae. (EU-finanziert) Mit den PCR-Produkten aller etwa Gene von S. cerevisiae wurden Untersuchungen zu transkriptionellen Änderungen in der Hefe angestellt. Ein Schwerpunkt dabei waren Untersuchungen auf Schädigungen der Zellwand. Transkriptionelle Studien an mikrobiellen Systemen. (finanziert durch BMBF und DFG) Neben unserer Teilnahme an der Kartierung und Sequenzierung ganzer Genome verschiedener Organismen wurden DNA-Microarrays für vier mikrobielle Organismen etabliert. Dabei wurden hauptsächlich genomische Fragmente genutzt, die aufgrund der hohen Gendichte gleichzeitig eine gute Repräsentation der Gene darstellen, doch gleichzeitig auch Untersuchungen anderer (regulativer) Sequenzbereiche erlauben. So wurde beispielsweise in Kollaboration mit dem ZMBH ein Microarray mit mehr als PCR- Produkten des Erregers der Schlafkrankheit Trypanosoma brucei erstellt. Durch transkriptionelle Untersuchungen werden beispielsweise verschiedene Infektionsschritte bzw. Entwicklungsstufen des Erregers analysiert. Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse Proteomics Obwohl mit der zweidimensionalen Gelelektrophorse seit Jahren eine wichtige Methode zur Analyse aller Proteine eines Organismus oder eines Gewebes existiert, besteht nichtsdestotrotz eine große Nachfrage nach Verfahren, die es erlauben, die Gesamtheit der Proteinmoleküle ( Proteom ) in ähnlich einfacher und gleichzeitg umfassender Weise zu untersuchen, wie dies mittlerweile für DNA und RNA der Fall ist. Antikörper-Microarrays sind eine der Möglichkeiten in diese Richtung. Antikörper Microarrays (BMBF-finanziert) Antikörper Microarrays haben ein großes Potential für funktionale Analysen der zellulären Aktivität und Regulation wie zum Nachweis von Veränderungen in der Protein Expression und Protein-Protein Interaktion. Zu diesem Zweck entwickelten wir Verfahren, die eine Anbindung der Antikörper an verschiedene Oberflächen erlauben, ohne ihre Aktivität zu beeinflussen. Gleichzeitig wird die Bindung der Epitope selbst bei der Analyse komplexer Proteingemische nicht durch die Oberfläche beeinflusst. Erstellung eines Expressionsprofils in Krebsgeweben (BMBF-finanziert) Aufbauend auf den transkriptionellen Untersuchungen wurden Antikörper gegen Proteine produziert, die auf RNA- Ebene signifikante Unterschiede zwischen Normal- und Krebsgewebe gezeigt hatten. Mittels dieser und weiterer Antikörper werden zur Zeit komplexe Proteingemische aus Tumorzellen verschiedener Gewebe auf ihre Proteinexpression hin untersucht. Identifizierung und Isolation hoch-affiner und selektiver Antikörper (finanziert durch BMBF und EU) Ziel dieser Projekte ist die Isolation von Antikörperbibliotheken - monoklonal wie polyklonal - die für ein von zwei Geweben oder Proteinextrakten spezifisch sind und damit zur Isolation der Unterschiede aus den komplexen Molekülpopulationen genutzt werden können. Genom Kartierung und Sequenzierung Für die Sequenzierung ganzer Genome ist das Vorhandensein von Genomkarten immer noch vorteilhaft, auch wenn der Großteil der tatsächlichen Sequenzinformation über Shotgun -Sequenzierung gewonnen wird. Zur Assemblierung in Sequenz- Contigs wie zur Überprüfung der Co- Linearität von Genom und Sequenz sind Klonkarten aber immer noch unverzichtbar, auch für Institute wie The Institute for Genome Research (TIGR). Dies wird durch die Zusammenarbeit mit TIGR zur Sequenzierung von Pseudomonas putida dokumentiert. Kartierung und Sequenzierung der Chromosomen 2 und 5 von Neurospora crassa (DFG-finanziert) In einem internationalen Projektverbund, dessen deutscher Teil durch die Universität Düsseldorf koordiniert wird, wurde das gesamte Genom von N. crassa sequenziert. Innerhalb dieser Analyse generieren wir eine vollständige Karte der Chromosomen 2 und 5 (zusammen etwa 16 Mb), die anschließend sequenziert wurden und führten DNA-Microarray Analysen durch. 139

140 140 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Kartierung, Sequenzierung und funktionelle Analyse des 6,1 Mb Genoms von Pseudomonas pudita (BMBF-finanziert) Innerhalb eines nationalen Netzwerks bestehend aus der Medizinischen Hochschule Hannover, der GBF in Braunschweig, QIAGEN in Hilden und uns sowie in Kollaboration mit TIGR (USA) wurde das gesamte Genom von P. pudita kartiert und sequenziert. Zusätzlich werden über DNA-Chip Analysen transkriptionelle Daten produzieren, die mit biologischen Informationen der anderen deutschen Teilnehmer in Korrelation gebracht werden. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Beier, M. & Hoheisel, J.D. (2002). Use of NPE/NPEOC-protected 5'-phosphoramidites for inverse in situ synthesis of oligonucleotides on DNA-microarrays. J. Biotechnol. 94, [2] Hoheisel, J.D. & *Cahill, D. (2002). Proteomics and genomics; catching function in action. Curr Opin. Chem. Biol. 6, [3] *Becerra, M., *Lombardía-Ferreira, L.J., Hauser, N.J., Hoheisel, J.D., *Tizon, B. & *Cerdán, M.E. (2002). The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions. Effects of HAP1 ROX1 ROX3 and SRB10 deletions. Mol. Microbiol. 43, [4] *Tauch, A., *Homann, I., *Mormann, S., *Rüberg, S., *Billaut, A., *Bathe, B., *Brand, S., *Brockmann-Gretza, O., *Rückert, C., *Schischka, N., *Wrenger, C., Hoheisel, J.D., *Mockel, B., *Huthmacher, K., *Pfefferle, W., *Pühler, A. & *Kalinowski, J. (2002). Strategy to sequence the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032: use of a cosmid and a bacterial artificial chromosome library. J. Biotechnol. 95, [5] Scheideler, M., *Schlaich, N.L., Fellenberg, K., Beißbarth, T., Hauser, N., Vingron, M., *Slusarenko, A.J. & Hoheisel, J.D. (2002). Monitoring the switch from housekeeping to pathogen defence metabolism in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 277, [6] Fellenberg, K., Hauser, N.C., Brors, B., Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2002). Microarray data warehouse allowing for the statistical analysis of experiment annotations. Bioinformatics 18, [7] Heber, S., Stoye, J., Frohme, M., Hoheisel, J.D. & Vingron, M. (2002). Resampling methods in physical mapping. Classification, Automation, and New Media; Studies in Classification, Data Analysis, and Knowledge Organization (Gaul, W. & Ritter, G., eds.), Springer Verlag, [8] Frohme, M., *Zolk, O., *Maurer, A., *Maurer, A., *Kluxen, F.-W., *Hentsch, B., Zubakov, D., Hoheisel, J.D., *Zucker, I.H., *Pepe, S. & *Eschenhagen, T. (2002). Cardiac ankyrin repeat protein, a negative regulator of cardiac gene expression, is augmented in human heart failure. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, [9] *Beckers, J., Hoheisel, J.D., *Mewes, W., Vingron, M. & *Hrabé de Angelis, M. (2002). Molecular phenotyping of mouse mutant resources by RNA expression profiling. Curr. Genet. 3, [10] *Hayes, A., *Zhang, N., *Wu, J., *Butler, P.R., Hauser, N.C., Hoheisel, J.D., *Lim, F.L., *Sharrocks, A.D., Oliver, S.G. (2002) Hybridisation array technology coupled with chemostat culture: tools to interrogate gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Methods 26, [11] Hoheisel, J.D. (ed.) (2002). DNA-Chip Technology. Adv. Biochem. Engineering/Biotechnol. 77. [12] *Brazma, A., *Sarkans, U., *Robinson, A., *Vilo, J., Vingron, M., Hoheisel, J.D. & Fellenberg, K. (2002). Microarray data representation, annotation and storage. DNA-Chip Technology; Adv. Biochem. Engineering/Biotechnol. 77, [13] Hauser, N.C., Fellenberg, K. & *Rupp, S. (2002). How to Discover Pathogenic Mechanisms - New Evaluation Tools Towards Drug Discovery. Screening 3/02, Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse [14] *Lombardía, L.J., *Becerra, M., *Rodríguez-Belmonte, E., Hauser, N.C. & Cerdán, M.E. (2002) Genome-wide analysis of yeast transcription upon calcium shortage. Cell Calcium 32, [15] Diehl, F., Beckmann, B., Kellner, N., Hauser, N.C., Diehl, S. & Hoheisel, J.D. (2002). Manufacturing DNA-microarrays from unpurified PCR-products. Nucleic Acids Res. 30, e79. [16] Scheideler, M. & Hoheisel, J.D. (2002). DNA-Microarray Analyses; benefits, promises and problems. Screening 5/02, [17] Diehl, S., Diehl, F., *El-Sayed, N.M., *Clayton, C. & Hoheisel, J.D. (2002). Analysis of stage-specific gene expression in the bloodstream and the procyclic form of Trypanosoma brucei using a genomic DNA-microarray. Mol. Biochem. Parasit. 123, [18] *Nelson, K.E., *Weinel, C., *Paulsen, I.T., *Dodson, R.J., *Hilbert, H., *Martins Dos Santos, V., *Fouts, D.E., *Gill, S.R., *Pop, M., *Holmes, M., *Brinkac, L., *Beanan, M., *DeBoys, R., *Daugherty, S., *Kolonay, J., *Madupu, R., *Nelson, W., *White, O., *Peterson, J., *Khouri, H., *Hance, I., *Chris Lee, P., *Holtzapple, E., *Scanlan, D., *Tran, K., *Moazzez, A., *Utterback, T., *Rizzo, M., *Lee, K., *Kosack, D., *Moestl, D., *Wedler, H., *Lauber, J., Stjepandic, D., Hoheisel, J.D., *Straetz, M., *Heim. S., *Kiewitz, C., *Eisen, J., *Timmis, K.N., *Düsterhoft, A., *Tümmler, B., & *Fraser, C.M. (2002). The complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ. Microbiol. 4, [19] Stjepandic, D., *Weinel, C., *Hilbert, H., *Koo, H.L., Diehl, F., *Nelson, K.E., *Tümmler, B. & Hoheisel, J.D. (2002). The genome structure of Pseudomonas putida; high-resolution mapping and microarray analysis. Environ. Microbiol. 4, [20] Kusnezow, W. & Hoheisel, J.D. (2002). Antibody Microarrays: Promises and Problems. BioTechniques 33 (suppl.), [21] Würtz, S., Hanke, J., Solinas-Toldo, S. & Hoheisel, J.D. (2003). Genomanalyse und Gendiagnostik. Grundlagen der Molekularen Medizin; 2. Auflage (Ganten, D. & Ruckpaul, K., Hrsg.), Springer Verlag, [22] Kusnezow, W., Jacob, A., Walijew, A., Diehl, F. & Hoheisel, J.D. (2003). Antibody microarrays: an evaluation of production parameters. Proteomics 3, [23] *Mannhaupt, G., *Montrone, C., *Haase, D., *Mewes, W., Aign, V., Hoheisel, J.D., *Fartmann, B., *Nyakatura, G., *Kempken, F., *Maier, J. and *Schulte, U. (2003). What s in the genome of a filamentous fungus? Analysis of the Neurospora genome sequence. Nucleic Acids Res. 31, [24] Scheideler, M. & Hoheisel, J.D. (2003). Analyses de microréseaux d ADN. Bioforum France 1/03, [25] Lagorce, A., Hauser, N.C., *Labourdette, D., *Rodriguez, C., *Jasson, S., *Arroyo, J., Hoheisel, J.D. & Francois, J.-M. (2003). Genome-wide analysis of the response to cell wall damage in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 278, [26] *Yin, Z., *Wilson, S., Hauser, N.C., *Tournu, H., Hoheisel, J.D. & *Brown, A.J.P. (2003). Differential effects of high and low glucose signals upon global expression patterns in yeast. Mol. Microbiol. 48, [27] Löhr, M. & Hoheisel, J.D. (2003). DNA-Chip Technologie beim Pankreaskarzinom. Z. Gastroenterol. 41, [28] Hoheisel, J.D. (2003). Humangenetik leicht gemacht. Forum DKG 2/03, 61. [29] Fellenberg, K., Vingron, M., Hauser, N.C. & Hoheisel, J.D. (2003). Correspondence analysis with microarray data. Perspectives in Gene Expression (Appasani, K., ed.), Eaton Publishing, Westborough, [30] Kusnezow, W. & Hoheisel, J.D. (2003). Solid Support for Microarray Immunoassays. J. Mol. Recognit. 16,

141 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B070 Funktionelle Genomanalyse [31] Zubakov, D., Hoheisel, J.D., *Kluxen, F.-W., *Brändle, M., *Ehring, T., *Hentsch, B. & Frohme, M. (2003). Late ischemic preconditioning of the myocardium alters the expression of genes involved in inflammatory response. FEBS Lett. 547, [32] *Becerra, M., *Lombardía, L.J., *González-Siso, M.I., *Rodriguez-Belmonte, E., Hauser, N.J., & *Cerdán, M.E. (2003). Genome-wide analysis of the yeast transcriptome upon heat and cold shock. Comp. Funct. Genom. 4, [33] Aign, V. & Hoheisel, J.D. (2003). Analysis of nutrient-dependent transcript variations in Neurospora crassa. Fungal Genet. Biol. 40, [34] Brandt, O., *Feldner, J., Stephan, A., *Schröder, M., Schnölzer, M. *Arlinghaus, H.F., Hoheisel, J.D. & Jacob, A. (2003). PNA-microarrays for hybridisation of unlabelled DNAsamples. Nucleic Acids Res. 31, e119. [35] Bauer, A., Beckmann, B., Busold, C., Brandt, O., Kusnezow, W., Pullat, J., Aign, V., Fellenberg, K., Fleischer, R., Jacob, A., Frohme, M. & Hoheisel, J.D. (2003). Use of complex DNA- and antibody-microarrays as tools in functional analyses. Comp. Funct. Genom. 4, [36] Hoheisel, J.D. (2003). DNA-Microarrays in der Routine. Forschung & Diagnostik 1, [37] Jacob, A., Brandt, O., Würtz, S., Stephan, A., Schnölzer, M. & Hoheisel, J.D. (2004). Production of PNA-arrays for nucleic acid detection. Peptide Nucleic Acids; Protocols and Applications (Nielsen, P.E., ed.), Horizon Bioscience, Wymondham, [38] *Hild, M., Beckmann, B., *Haas, S.A., *Koch, B., *Solovjev, V., Busold, C., Fellenberg, K, Boutros, M., *Vingron, M., *Sauer, F., Hoheisel, J.D. & *Paro, R. (2004). An integrated gene annotation and transcriptional profiling approach towards the full gene content of the Drosophila genome. Genome Biol. 5, R3. 141

142 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik Abteilung Theoretische Bioinformatik (B080) Leiter: Dr. Roland Eils 142 Wissenschaftler Dr. Benedikt Brors (- 12/05) Martin Bentele (IWR) (10/02-8/04) Alla Bulashevska (4/02-6/04) Svetlana Bulashevska (- 6/04) Christian Conrad (- 6/04) Jürgen Eils (10/02-6/04) Daniel Gerlich (- 6/02) Dr. Martin Granzow (- 6/02) Patrick Herde (11/02-6/03) Bernd Kalbfuß (7-10/03) Constantin Kappel (11/03-) Dr. Thomas Kochmann (- 9/02) Dr. Rainer König (- 6/05) Dr. Olga Krebs (- 6/03) Chris Lawerenz (4/03-6/04) Dr. Julian Mattes (- 8/03) Falk Schubert (- 10/04) Dr. Wolfgang Tvarusko (1/02-9/03) Dr. Dietmar Volz (- 4/03) Marco Weismüller (- 12/03) Dr. Jan Wiemer (1-9/02) Gastwissenschaftler Dr. Vijayraghavan Sundararajan (8/01-10/02) (Indien) David Camacho (4/03-3/04) (Doktorand aus Mexico) Doktoranden Chaitanya Athale (- 8/03) Christian Bacher (1/03-12/05) Gaëlle Dubios (- 12/03) Stefan Frank (5/03-11/05) Juntao Gao (- 10/04) Matthias Gebhard (- 12/03) Joshua Allen Moore (9/02-8/04) Markus Ulrich (8/03-6/04) Ming Xu (11/02-4/03) Diplomanden Martin Eigel (5/02-10/03) Armin Groll (- 7/02) Jasmin Müller (- 12/02) Patrick Warnat (3-11/03) Technische Assistenten Johannes Fieres (- 9/02; 7-12/03) Karlheinz Groß Rolf Kabbe (- 6/04) Praktikanten Bernd Kalbfuß (- 7/02) Eva Kowalinski (11/03-2/04) Sairam Manda (7-12/03) Janna Nawroth (2-6/03) Bernhard Tausch (11/02-8/03)Corinne Wacker (11/02-5/03) Wolfgang Weiss (- 10/02) Sven Wichert (9-11/02) Sekretariat Christina Grosch (- 6/04) Die Gruppe Theoretische Bioinformatik beschäftigt sich mit der Entwicklung und Anwendung von Methoden aus der Bioinformatik und der computergestützten Biologie sowie Onkologie. Die Forschungsgebiete von größtem Interesse schließen ein: a) Data Mining in der molekularen Genetik b) Datenbank und Datenmanagement c) Grid-Computing d) Modellierung und Simulation zellulärer Systeme e) Biomedizinische Bildverarbeitung unter Verwendung von geometrischen und dynamischen Modellen Die Entwicklung von computergestützten Methoden zur Analyse komplexer Daten in der molekularen Biologie als auch die Entwicklung von Modellen und computerbasierten Methoden in der Zellbiologie ist somit zentraler Gegenstand unserer Abteilung, die sich im Jahr 2000 am DKFZ etablierte. Die zentralen Ergebnisse der Gruppe enthalten auch mehrere patentierte Software-Systeme, z.b. zum wissensbasierten Data Mining im Life Science Bereich, zur voll automatisierten Diagnostik in der molekularen Zytogenetik und zum Studium von dynamischen Prozessen in lebenden Zellen. Die Gruppe kollaboriert aktiv mit verschiedenen Partnern, um die aufgebauten Systeme anzuwenden bzw. zu vermarkten. 1. Data Mining in der molekularen Genetik B. Brors, A. Bulashevska, S. Bulashevska, G. Dubois, M. Granzow, A. Groll, T. Kochmann, J. Müller, F. Schubert, B. Tausch, P. Warnat, J. Wiemer, R. Eils Kooperationen: Prof. Dr. T. Chakraborty, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universität Giessen; PD Dr. Torsten Haferlach, Leukämie-Diagnostiklabor, Universitätsklinikum Großhadern, München; Dr. Stefan Joos, Abt. Molekulare Genetik, DKFZ; Prof. Dr. Panthel, Institut für Tumorbiologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf; PD Dr. Gunhild Mechtersheimer, Pathologie, Universitätsklinikum Heidelberg; Dr. Christoph Klein, Institut für Immunologie, Ludwig-Maximilians-Universität München; Prof. Dr. G. Kovacs, Chirurgische Universitätsklinik Heidelberg; PD Dr. R. Kronenwett, Klinik für Hämatologie, Onkologie und Klinische Immunologie, Universität Düsseldorf; Prof. Dr. Lichter, Abt. Molekulare Genetik, DKFZ; Prof. Dr. Manfred Löhr, Innere Medizin, Universitätsklinikum Mannheim; Prof. Dr. Christoph Niehrs, Abt. Molekulare Embryologie, DKFZ; Prof. Walter Pyerin, Abt. Biochemische Zellphysiologie, DKFZ; Prof. Dr. Guido Sauter, Universität Basel, Schweiz; Prof. Dr. B. Schlegelberger, Mol. Pathologie, MH Hannover; Dr. Alexander Schramm, Pädiatrische Onkologie, Tumorzentrum, Universität Essen; Prof. Dr. F. Speleman, Mol. Cytogenetics, Universitair Ziekenhuis, Gent, Belgien; Dr. C. Thiede, Innere Medizin, Universitätsklinikum Dresden; Dr. F. Westermann, Abt. Cytogenetik, DKFZ; phase-it intelligent solutions AG, Heidelberg; Boehringer Ingelheim Österreich. Moderne molekulare Methoden in der Biologie und Medizin produzieren Daten, die allein durch ihren Umfang die Unterstützung aus der Informatik erfordern. Computerbasierte Methoden wurden bisher für Sequenzdaten entwickelt, während die Unterstützung der Auswertung von DNA- Chips, Proteomanalysen durch 2D-Gelelektrophorese oder Massenspektrometrie, vergleichender genomischer Hybridisierung (CGH), Mehrfarben-Fluoreszenz-In-Situ-Hybrisisierung (MFISH), Loss-Of-Heterozygosity Analysen (LOH) und Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNP) weiterhin eine große Herausforderung für die Bioinformatik darstellt. Ziel unseres Projektes ist es, Methoden aus der Statistik und dem Data Mining für diese Daten zu adaptieren bzw. weiterzuentwickeln. Insbesondere streben wir nach Methoden, die uns Verbindungen zwischen solchen molekulargenetischen Daten und klinischen Informationen wie Tumorgröße bzw. Tumorgrad, Krankheitsentwicklung und Ansprechbarkeit auf Chemotherapie aufzeigen. Data Mining steht in Beziehung zu Methoden, Techniken und Werkzeugen aus der Informatik und Statistik, wie z.b. Datenbanken, Modellierung, maschinellen Lernverfahren, Visualisierungen, statistischen Tests und wissensbasierten Systemen. Ziel des Data Mining Prozesses ist es, schrittweise neues Wissen in einem Anwendungsbereich zu generieren. Jeder Schritt des Data-Mining-Prozesses beinhaltet eine Teilaufgabe (z.b. Klassifizierung, Regression, zeitliche Modellierung oder Clustering), die durch eine adäquate Technik (z.b. neuronale Netzwerke, Entscheidungsbäume, k-nächster Nachbar Klassifikator, Netzwerke nach Bayes und klassische statistische Methoden) gelöst wird. Der typische Arbeitsablauf im Data Mining gestaltet sich dann wie folgt [15]: Datenvorverarbeitung Datenvisualisierung, Hypothesengenerierung Entwurf eines Klassifikators Training und Validierung eines Klassifikators

143 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung DNA-Mikroarrays stellen ein wichtiges Hilfsmittel auf dem Weg des Verstehens von Organismen auf der genomischen Ebene dar. Transkriptionsaktivitäten von tausenden Genen können gleichzeitig bestimmt werden, und sogar das gesamte Genom eines Organismus kann Gegenstand einer Untersuchung sein. Die Anwendung von Datawarehouse -Konzepten und Technologien aus dem Bereich kundenorientierter Geschäftsprozesse auf genomische Daten ermöglicht ein effizientes Data Mining [9]. Wir entwickeln deshalb ein integriertes Konzept, um Mikroarraydaten in einem zentralen Datawarehouse (spezielle Datenbank für das Data-Mining) zu speichern und diese Daten in analysierter Form zugänglich zu machen. Dies geschieht unter Berücksichtigung der Verschiedenartigkeit der experimentellen Techniken sowie der Beschreibung von Mikroarrayexperimenten. Darauf aufbauend entwickeln wir Techniken, um allgemeine Analyseprozesse zu etablieren, z.b. die Normalisierung von Genexpressionsdaten, Identifizierung von unterschiedlich transkribierten Genen oder das Clustering von Proben und Genen in der Datenbank [21]. Zusätzlich wenden wir Klassifikationsalgorithmen wie Entscheidungsbäume, neuronale Netzwerke und Support Vektor Maschinen an. Auf diese Weise können Klassifikationssysteme entwickelt und für diagnostische oder prognostische Aussagen nutzbar gemacht werden [16]. Einige wichtige Beispiele sind die Klassifizierung der Ergebnisse von Tumoruntersuchungen auf der Grundlage von bereits vorhandenen Gruppen (Tumorgrad, zytogenetische Daten) oder das Auffinden neuer Unterklassen in einer Menge von Tumoruntersuchungen basierend auf Genexpressionsprofilen. Insbesondere haben wir eine Methode entwickelt, die solche Klassifikationssysteme auf der Basis von Entscheidungsbäumen erstellt [5]. Entscheidungsbäume haben den Vorteil, dass die Entscheidungsregeln transparent sind und sofort abgelesen werden können; außerdem entfällt die bei anderen Verfahren z.t. notwendige Merkmalsauswahl, d.h. die Beschränkung auf eine kleine Zahl informativer Gene. In einem anderen Ansatz haben wir ein Merkmalsauswahlverfahren mit einem künstlichen neuronalen Netzwerk kombiniert, um Daten aus vergleichenden genomischen Hybridisierungen mit der Wahrscheinlichkeit des Vorliegens von Metastasen bei Brustkrebs zu assoziieren [17]. Darüber hinaus konnte durch Analyse der Daten eine neue Hypothese der Metastasierung bei Brustkrebs entwickelt und gestützt werden. In einem weiteren Projekt haben wir Bayes sche Netzwerke benutzt, um aus Daten über genetische Aberrationen von Urothelkarzinomen ein Modell zur Tumorprogression in diesen Tumoren aufzustellen [20]. Zur Unterscheidung von dedifferenzierten und pleiomorphen Liposarkomen haben wir neben Clusterverfahren Support Vektor Maschinen eingesetzt [4]. So konnten die relevanten Chromosomenorte für die Unterscheidung dieser Tumorformen identifiziert und Regeln zur Klassifikation aufgestellt werden. In einer Untersuchung der Auswirkungen des Verlustes (Deletion) verschiedener Untereinheiten der Casein-Kinase II auf den Zellzyklus von Hefe haben wir die Korrespondenzanalyse eingesetzt, um Gene mit veränderter Transkription zu identifizieren [13]. In einer weiteren Studie konnten wir zeigen, dass die beobachtete Häufung von differentiell exprimierten Genen an Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik bestimmten Chromosomenorten beim Vergleich zweier Subpopulationen von Thymus-Epithelzellen statistisch signifikant ist [18]. Aktuelle Untersuchungen betreffen vor allem verschiedene Formen myeloischer Leukämien (4 Kooperationen) und das Neuroblastom (3 Kooperationen). Weiterhin stellen wir Service- und Beratungsleistungen im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzwerks (NGFN) zur Verfügung und beteiligen uns mit Kursen und Wissenschaftleraustausch an der Weiterbildung biomedizinischer Forscher im Bereich der Analyse hochdimensionaler molekulargenetischer Daten. 2. Datenbanken und Datenmanagement J. Eils, K.H. Groß, P. Herde, R. Kabbe, O. Krebs, C. Lawerenz, R. Eils Kooperationen: Prof. Dr. Peter Lichter, Molekulare Genomanalyse, DKFZ; Prof. Dr. Annemarie Poustka, Abteilung Molekulare Genomanalyse, DKFZ; Prof. Dr. Sándor Suhai, Abteilung Molekulare Biophysik, DKFZ; Prof. Dr. Christof Niehrs, Abteilung Molekulare Embryologie, DKFZ; Prof. Dr. Werner Mewes, Institut für Bioinformatik/MIPS, GSF, Neuherberg; Dr. Alexander Schramm, Pädiatrische Onkologie, Universitätsklinik Essen; Prof. Dr. Chakraborty, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinik Giessen; PD Dr. Roland Stauber, Georg-Speyer-Haus Frankfurt; Prof. Dr. B. Schlegelberger, Institut für Zell- und Molekularpathologie, MH Hannover; Dr. Albert Becker, Institut für Neuropathologie, Universität Bonn; Dr. Thomas Häupl, Abteilung Rheumatologie, Charite Berlin; Prof. Dr. KH Jöckel, Institut für Medizinische Informatik, Universitätsklinik Essen. Forschungsgruppen am DKFZ und an anderen Partnerinstituten erzeugen eine große Menge an geno- und phänotypischen Daten im Bereich der Mikroarray-Technologie. Diese Daten müssen in standardisierter Form mit dem Ziel gespeichert und verwaltet werden, sie sowohl mit anspruchsvollen Auswertungsmethoden zu analysieren, als auch die wesentlichen Vorgänge, die zu den experimentellen Ergebnissen führen, eindeutig und nachvollziehbar zu dokumentieren. Dazu haben wir ein Informationssystem konzipiert und implementiert, das das Datenmanagement in die Datenanalyse integriert. RNA- Expressionsdaten werden mit anderen funktionellen genomischen Daten integriert. Die Funktionalität der Plattform reicht vom Speichern der Daten in relationalen Datenbankmanagementsystemen, etablierten Schnittstellen zu kommerziellen und frei erhältlichen Auswerteprogrammen bis zu Werkzeugen zur Präsentation und Pflege der Daten. Das MIAME-kompatible Oracle Datenbank-Schema ichip speichert Informationen zur detaillierten Beschreibung von biologischen Proben und Est-Klonen, Bilddaten, Hybridisierungsbedingungen, Daten zum Experiment, Genexpressionswerte (Rohdaten sowie prozessierte Daten), Qualitätsindikatoren und beschreibende Informationen. Basierend auf dem Datenbankschema haben wir in diesem Jahr eine benutzerfreundliche Bedieneroberfläche mit angebundenen Auswertewerkzeugen entwickelt. Diese Version von ichip ist aktuell in mehreren klinischen Laboren im Einsatz, wie z.b. im Krebsnetz und im Neuronetz. Die Erweiterung von ichip von cdna-mikroarrays hin zu anderen Datentypen (Proteinen, RNAi, Zellsysteme, Tissue- Microarray) sowie die Weiterentwicklung von ichip zum zentralen Speicher für umfangreiche Datensammlungen molekularbiologischer und phenotypischer Daten wird im Fokus der weiteren Entwicklung der Datenbankgruppe liegen. 143

144 144 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung 3. Grid-Computing für die Bioinformatik S. Frank, J. Moore, W. Tvarusko, M. Xu, R. Eils Das Projekt Grid-Computing für die Bioinformatik beschäftigt sich mit der Entwicklung und dem Betrieb von grid- und clusterbasierten Softwarelösungen für die Bioinformatik. Im Rahmen dieses Projektes wurde im letzten Jahr eine experimentelle Clusterlösung aufgebaut, bestehend aus 20 Doppel-Prozessor Rechnern (HP NetServers, 833Mhz, 1GB RAM), die der gesamten Abteilung zur Abwicklung rechenund ressourcenintensiver Rechenaufträge zur Verfügung stehen. In diesem ersten Schritt kamen vor allem lokale Programmablaufsteuerungsprogramme wie MPI und SGE zum Einsatz. Die nächsten Schritte befinden sich zur Zeit in der Entwicklung: Webservices erlauben unseren Kooperationspartnern eine enge, auch programmatische Verzahnung mit den innerhalb der Abteilung entwickelten Algorithmen und Diensten. Basierend auf diesen Diensten entsteht ein webbasiertes Portal, das den Zugang zu den Diensten auch für externe Kooperationspartner der Abteilung mittels eines Browsers ermöglicht. Basis dieser Plattform ist Globus ( das international am weitesten verbreitete Framework für Grid- Computing. Dadurch ist die Anbindung der Infrastruktur an die europaweiten Entwicklungen, vor allem an die im HealthGrid ( zusammengefassten Projekte, wie dem BioGrid (biogrid.icm.edu.pl) oder dem European Data Grid (eu-datagrid.web.cern.ch/eu-datagrid/) gewährleistet. Bereitgestellt werden Dienste für die Bereiche Data Mining, Simulation und Bildverarbeitung: In Planung befinden sich ein Projekt zur Abwicklung gridbasierter biologischer Workflows, die einen Data-Mining-Prozess inklusive Daten- Formatierung, Modell-Generierung und Fehler-Schätzung automatisch auf das Grid verteilt, sowie ein Projekt zum Aufbau einer gridbasierten Bilddatenbank, die der Abteilung und den Kooperationspartnern das Ablegen, Annotieren und Finden von biologischen Bilddaten erlaubt. Dies dient vor allem auch dazu, die entwickelten Algorithmen für die Objektdetektion, -registrierung, die Featureextraktion und die Klassifikation von 2D, 3D und 4D-Bilddaten einer größeren wissenschaftlichen Gemeinde zugänglich zu machen. Ziel dieser Projekte ist es, die enge Vernetzung, die die Abteilung mit ihren Kooperationspartner verbindet, auch mit einer gemeinsamen Softwareinfrastruktur zu erweitern. 4. Modellierung und Simulation zellulärer Systeme Am Anfang der Betrachtung zellulärer Systeme steht die Betrachtung der Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung. Mit der Weitergabe von Signalen reagieren Zellen auf äußere Stimuli und ihre Fehlfunktion ist verantwortlich für eine Reihe von bekannten Krankheiten. Experimentelle Studien können ergänzt werden durch die Modellierung und Simulation von Signalwegen basierend auf großen Transduktions-Datenbanken. Betreten wir den Zellkern, so müssen wir feststellen, dass unser Wissen über die örtliche Verteilung der Signale und ihre Verarbeitung gering ist. Das Verständnis von Designprinzipien, die die Architektur des Zellkerns bestimmen, ist deshalb von großem Interesse. Bildverarbeitungs- und Computergraphikwerkzeuge zur quantitativen Bewertung mikroskopischer Daten und die mathematische Modellierung werden uns helfen, die Dynamik des Zellkerns während Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik der Mitose zu verstehen. Werkzeuge zur mathematische Modellbildung und Simulation werden auch bei der Interpretation von FRAP-Experimenten eingesetzt, um auf diese Weise die Organisationsprinzipien des molekularen Transports im Interphasekern zu erforschen. Neueste Fortschritte in der DNA-Microarray Technologie erlauben es, den Expressionslevel vieler Gene im Kern synchron zu messen, der sich über die Zeit hinweg als Reaktion auf externe Stimuli ändert. Ausgehend von den genomischen Daten, können Bayes sche Netzwerke die Geninteraktion auf Transkriptionsebene rekonstruieren; sogar auf inverse und quantitative Weise. Ein weiterer Schritt hin auf eine systematische Beschreibung der Zelle ist die zelluläre Lokalisierung und Morphologie der Proteinsynthese bei unterschiedlichen Bedingungen. In Hochdurchsatzexperimenten wird unter Verwendung von Neuronalen Netzen zur Bildklassifikatoren bei tausenden von unbekannten Proteinen eine automatische Zuordnung versucht. Die identifizierten Proteinsysteme werden als Netzwerke modelliert und mit dem Verhalten und der Topologie von gut verstandenen metabolischen Netzwerken assoziiert. Infolge der Vielzahl an neu generierten biologischer Daten werden Modellierungs- und Simulationstechniken eine Schlüsselrolle beim Verständnis zellulärer Systeme und ihrer Interaktionen spielen Dynamik des Zellkerns C. Athale, C. Bacher, M. Eigel, D. Gerlich, B. Kalbfuss, C. Kappel, D. Volz, R. Eils Kooperationen: Jan Ellenberg, EMBL Heidelberg; Peter Lichter, Abteilung Molekulare Genomanalyse, DKFZ; Kevin Sullivan, Scripps Research Institut, San Diego, CA, USA; David Spector, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, USA; Tom Misteli, NCI, NIH, MD, USA. Dynamische Prozesse im Zellkern während der Interphase und der Zellteilung sind von besonderer Bedeutung. Die Organisationsprinzipien des molekularen Transports im Interphasekern sind der Fokus eines Projekts, während ein anderes sich mit dem Zusammenbruch [2] und der Rekonstruktion des Zellkerns während der Zellteilung beschäftigt. Transport-Phänomene im Interphasekern Beim Studium der Transportdynamik von fluoreszierenden Molekülen im Kern wurden die Prinzipien der nuklearen Architektur untersucht. Der letzte Modellierungsansatz konnte zeigen, dass Annahmen von durchmischten Kompartimenten mit entsprechenden quantitativen Daten gut übereinstimmen, im Widerspruch zu älteren Modellen. Um diese Widersprüche zu lösen, sind wir dabei, diese Modelle zu verbessern, indem wir auch anisotrope Effekte berücksichtigen. Dies erfordert allerdings Daten höherer Auflösung. Unserer Ansatz führt auf zweierlei Probleme, die wie folgt beschrieben werden: a) Das Vorwärts-Problem Ausgehend von biologischen Erkenntnissen der Chromatinverteilung im Interphasenkern werden verschiedene Szenarien der Ausgleichsdynamik nach FRAP-Einwirkung simuliert und mit experimentellen Daten verglichen. Approximativ lässt sich diese Dynamik mit dem mathematischen Modell einer Diffussionsgleichung ansetzen, die diese Dynamik beschreibt.

145 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Die Diffussionsgleichung kann mit einem Programm (UG- Tools), das im Interdisziplinären Zentrum für Wissenschaftliches Rechnen (IWR) in Heidelberg entwickelt wurde, gelöst werden. Mit Hilfe von Multigridtechniken und einer optionalen Parallelisierung löst das Programm die Transportgleichungen numerisch. b) Das Inverse-Problem Bei diesem Ansatz wurde die Diffusionsdynamik von Molekülen im Zellkern unter Verwendung von Daten aus Bleich- Experimenten hoher Auflösung untersucht. Das inverse Problem der Parameterbestimmung wurde unter Verwendung eines Programms gelöst, das die Fundamentallösung einer zeitabhängigen Diffusionsgleichung implementiert. Dynamik der Zellkern-Architektur während der Mitose Ein wesentlicher Schritt zur Interpretation von dynamischen Bilddaten war die Entwicklung von computerbasierten Methoden für eine automatische quantitative Analyse und raumzeitliche Visualisierung. Ein detailliertes Verständnis von komplexen, dynamischen Prozessen wie dem Zusammenbruch und der Rekonstruktion des Zellkerns während der Mitose kann nur erreicht werden, wenn die Mikroskopie in drei räumlichen Dimensionen über die Zeit (4D-Imaging) durchgeführt wird [14]. Im folgenden Projekt wurde eine neue Technik entwickelt, die eine vollautomatische quantitative Analyse und Visualisierung von Oberflächen dreidimensionaler, dynamischer Fluoreszenzstrukturen realisiert. Mit diesem Verfahren wurde die Dynamik der Zellkernarchitektur während der Zellkernteilung untersucht. Um die verrauschte Bildqualität in Videoaufnahmen von lebenden Zellen zu kompensieren, wird ein anisotroper Diffusionsfilter angewandt, der nur in Gebieten mit einer homogenen Bildinformation glättet ohne die gesamte Morphologie zu stören. Ein Morphing zwischen den 3D Oberflächen über die Zeit hinweg führt auf eine kontinuierliche Rekonstruktion der gesamten 4D-Daten. Globale Rotations- und Translationsbewegungen in einer Zeitserie werden durch einen rigiden Transformationsansatz automatisch korrigiert. Die animierte Oberflächenrekonstruktion ist eingebettet in einen mehrdimensionalen Ortsbetrachter (scene viewer), der Benutzerinteraktion in Echtzeit erlaubt. Binäre Objektrepräsentationen werden verwandt, um die Volumen- und Fluoreszenzintensität über die Zeit zu quantifizieren. Diese Bildverarbeitungs- und Computergraphikmodule wurden bei der Analyse der Dynamik in Interphase- und mitotischen Zellkernen verwandt. Insbesondere die Chromosomendynamik im Verlauf der Mitose und die Rekonstruktion der Zellkernhülle wurden detailliert untersucht [11, 12]. Weitere Anwendungen der entwickelten Technik analysierten den Zusammenbruch der nuklearen Hülle, die Bewegung von PML-Bodies [1], die Dynamik nuklearer Speckles, die Lokalisierung von Methyl-DNA-Bindungsproteinen, die Dynamik von sekretorischen Vesikeln und die Bewegung von markierten Zentromeren in lebenden Zellen Automatische Phänotypisierung in lebenden Zellen C. Conrad, V. Sundararajan, R. Eils Kooperationen: J. Ellenberg, N. Daigle, R. Pepperkok, H. Erfle, EMBL, Heidelberg; T. Lörch, MetaSystems, Neulussheim Die Markierung von Proteinen mit GFP (green fluorescent proteins) ermöglicht die Visualisierung und damit die Lokalisierung und zeitlich-räumliche Auflösung von Proteinen in Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik lebenden Zellen. Es gilt sowohl Überexpression von Genen als auch Gensuppression mittels Interferenz-RNA (RNAi) in genomweiten Ansätzen hinsichtlich dieser Phänotypisierung zu untersuchen. Für diese genomweiten, funktionellen Untersuchungen sind robuste miniaturisierte Zellkultursysteme und eine automatische, intelligente Mustererkennung der zu erwartenden Phänotypen unerlässlich, da eine manuelle Vorgehensweise sehr arbeitsintensiv ist, und abhängig von der subjektiven Bewertung des ausgebildeten Personals keine datenbank-konsistenten Werte liefert. Für diese Problemstellung wurden solid-transfizierte Zellarrays, ein motorisiertes Scanning-Zytometer und verschiedene Klassifikationsstrategien miteinander kombiniert. Nach erfolgter Bildvorverarbeitung und der automatischen Erkennung von Zellen werden die Proteinmuster durch Klassifikatoren erfasst. Zur Klassifikation werden neuronale Netzwerke und Support Vektor Maschinen verwendet. Die Software ordnet nach einer Trainingsphase automatisch mit großer Präzision nicht bekannte markierte Proteine 12 verschiedene funktionellen Klassen zu. Mögliche funktionelle Phänotypen sind z.b. funktionelle Einheiten wie Organellen, das Zytoplasma, Chromatin oder auch funktionelle Zellzustände (wie z.b. Zelltod). Im weiterem Verlauf sollen speziell die Veränderungen in 3D über die Zeit in diese automatischen Screeningsysteme einbezogen werden Biomedizinische Bildverarbeitung unter Verwendung von geometrischen und dynamischen Modellen J. Fieres, J. Gao, M. Gebhard, J. Mattes, R. Eils Kooperationen: I. Solvei, D. Köhler, A. Bolzer, T. Cremer, Institut of Human Genetics, LMU München; J. Beaudouin, D. Gerlich, Jan Ellenberg, EMBL, Heidelberg; Kevin Sullivan, Scripps Research Institute, CA, USA; P. Tracqui, S. Lavallée, J. Demongeot, TIMC- IMAG, IAB, PRAXIM Grenoble, Frankreich; W. Just, Biochemie- Zentrum, Universität Heidelberg; K. Richter, S. Görisch, Abteilung Molekulare Genomanalyse, DKFZ; J. Georgi, S. Heiland, Neurologische Klinik, Universität Heidelberg; David L. Spector, Watson School of Biological Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 11724, USA; Edith Heard, Marie Curie Institute, Paris, Frankreich Das Projekt konzentriert sich auf die Analyse von Bewegungen und Deformationen von räumlichen Datensequenzen. Einerseits untersuchen wir mit Methoden der Computer Vision die Quantifizierung, Visualisierung und Bewegungskorrektur von dynamischen Prozessen und bewerten mit statistischen Methoden die quantifizierten Daten. Wir arbeiten an mehreren anwendungsorientierten Projekten, die sowohl die Dynamik des Zellkerns und die Erhaltung seiner Architektur zum Gegenstand haben, als auch Zellmembranbewegungen untersuchen. Dabei steht die Quantifizierung dynamischer Prozesse im Vordergrund, um biologische Fragestellungen zu belegen bzw. zu widerlegen. Eine Softwareplattform wurde mit Hilfe von C++, Open Inventor, MFC und speziellen Bibliotheken für eine schnelle graphische Darstellung für das Windows Betriebssystem entwickelt. Diese integriert die unterschiedlichen Module der Bildvorverarbeitung, Segmentierung, Tracking, Registration, Quantifizierung, Bewegungskorrektur und Visualisierung. 145

146 146 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Die Methodenentwicklung umfasst die folgenden Gebiete: Objektsegmentierung durch deformierbare Modelle [6, 8] Objektverfolgung und Visualisierung von Trajektorien Schätzung und Analyse von Bewegung und Deformation durch Registrierung aufeinanderfolgender Bilddatenstapel Statistische Bildanalyse Vergleich der extrahierten Bewegungen mit gegebenen Bewegungsmodellen Diese Methoden wurden erfolgreich angewandt zur: Quantifizierung der Erhaltung von Chromosomenterritorien anhand von FISH Anfärbung zweier verschiedener Chromosomen [3] Untersuchung des Zusammenbruchs des Zellkerns und der Bildung von Porenkomplexe Charakterisierung und Quantifizierung von Zelldeformation und -migration Kompensierung von rigiden, affinen und nicht-affinen Deformationen während der Teilchenverfolgung 4.4. Modellierung Metabolischer und Signaltransduktionsnetzwerke M. Bentele, D. Camacho, R. König, M. Ulrich, M. Weismüller, R. Eils Kooperationen: Inna Lavrik, Peter Krammer, Abteilung Immungenetik, DKFZ; Sabine Westphal, Holger Kalthoff, Molekulare Onkologie, Universität Kiel; Biobase, Braunschweig Biologische Systeme werden auf der Ebene biochemischer Substrate in Metabolischen Netzwerken und Signalübertragungen in Signaltransduktionsnetzwerken modelliert. Die Signaltransduktion hat einen besonderen Stellenwert in der Krebsforschung, denn eine fehlerhafte Signalweitergabe ist wesentlich beteiligt an der Entstehung maligner Zellfunktionen. Wir modellieren Signaltransduktionsnetzwerke digital (in silico) und nutzen einen semiqualitativen sowie objektorientierten Ansatz. Als Basis dienen die Signaltransduktionsdatenbank Transpath ( und die Simulationsumgebung Swarm [7]. Das Hauptproblem der mathematischen Modellierung und Simulation großer Signaltransduktionsnetzwerke liegt einerseits in der Größe der Netzwerke, andererseits in der Menge noch nicht experimentell bestimmter biochemischer Parameter. Wir wenden hier wir einen Daten-basierten Ansatz an: Durch Sensitivitätsanalyse über einen größeren Bereich im hochdimensionalen Parameterraum werden zunächst die kritischen Parameter und unabhängige Netzwerkmodule identifiziert, die als Basis für eine effiziente, modularisierte und hierarchische Parameterschätzung dienen. Die experimentelle Grundlage bilden quantitative Zeitserien der wichtigen Proteinkonzentrationen. Als erstes Ergebnis konnte durch das Modell ein Schwellwert-Verhalten in der CD95- induzierten Apoptose vorhergesagt und erklärt werden. Ein weiteres Projekt umfasst die raumzeitliche Simulation von gekoppelten Diffusions-Reaktions-Mechanismen im Apoptose-Signaltransduktionsnetzwerk. Der Apoptosepfad wird über ein Gleichungssystem aus partiellen Differentialgleichungen (Diffusions-Reaktions-Gleichungen) beschrieben, die mittels finiter Differenzen und/oder finiter Volumen/ Elemente Methode integriert und simuliert werden. Die simulierten Daten werden durch in vivo Messungen, FCS (Fluoreszenz-Kreuzkorrekations-Spektroskopie) und FRET Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik (Fluoreszenz-Resonanz-Energie Transfer) am konfokalen Laserscanning-Mikroskop, verifiziert. Metabolische Netzwerke standen außerdem im Mittelpunkt unseres Interesses. Sie wurden der EcoCyc Datenbank entnommen sowie aufbereitet. Ein alternierender Graph wurde aus den Enzymen und Metaboliten erzeugt. Öffentlich zugängliche Genexpressiondaten, z.b. von der Stanford Datenbank, wurden benutzt, um Abstände zu bestimmen. Die Netzwerktopologie wurde mit einer Auswahl verschiedener Lernalgorithmen untersucht. Das Verhalten des Netzwerks wurde unter verschiedenen Einwirkungen, wie Hitze- oder Hungerstress, und Medikamenteinwirkungen beobachtet [19]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] M. Muratani*, D. Gerlich*, S. M. Janicki, M. Gebhard, R. Eils, D. L. Spector (2002) Energy-Dependent Movement of PML Bodies within the Mammalian Cell Nucleus. Nature Cell Biology 4, [2] J. Beaudouin, D. Gerlich, T. Klee, N. Daigle, R. Eils, J. Ellenberg (2002) Nuclear envelope breakdown results from microtubule induced tearing and leads to diffusion of inner nuclear membrane proteins into the ER. Cell 108, [3] J. Brown, Mays Jawad, S.R.F. Twigg, R. J. Jaju, K. Saracoglu, A. E. Thomas, R. Eils, J. Harbott and L. Kearney (2002) A cryptic t(5;11)(q35;p15.5) in two AML children with apparently normal karyotypes, identified by a multiplex FISH telomere assay (M-TEL). Blood 99, [4] B. Fritz, F. Schubert, G. Wrobel, C. Schwaenen, S. Wessendorf, M. Nessling, C. Korz, R. J. Rieker, K. Montgomery, G. Mechtersheimer, R. Eils, S. Joos, and P. Lichter (2002) Microarray-based copy number and expression profiling in dedifferentiated and pleomorphic liposarcoma. Cancer Research, 62: [5] C. Schoch, A. Kohlmann, S. Schnittger, B. Brors, M. Dugas, S. Mergenthaler, W. Kern, W. Hiddemann, R. Eils, T. Haferlach (2002) Acute myeloid leukemias with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expression profiles. PNAS 99: [6] M. Gebhard, R. Eils and J. Mattes (2002) Segmentation of 3D objects using NURBS surfaces for quantification of surface and volume dynamics. Proceedings of the ICDIA 02 conference, Shanghai, China. [7] M. Weismüller, R. König and R. Eils (2002) Modelling of information flow in cells. Proceedings of the 16th European Simulation Multiconference, Darmstadt, June 3-5, 2002, pp [8] J. Mattes, J. Fieres, R. Eils (2002). A shape adapted motion model for non-rigid registration. In: SPIE Medical Imaging 2002: Image Processing, San Diego, Feb. 2002, Proceedings of SPIE 4684, [9] K. Fellenberg, N.C. Hauser, B. Brors, J.D. Hoheisel, M. Vingron (2002) Microarray data warehouse allowing for inclusion of experiment annotations in statistical analysis. Bioinformatics 18: [10] Marhold, J., M. Zbylut, D.-H. Lankenau, M. Li, D. Gerlich, E. Ballestar, B.M. Mechler, and F. Lyko (2002). Stage-specific chromosomal association of Drosophila dmbd2/3 during genome activation. Chromosoma 111: [11] Gerlich, D., Kalbfuss, B., Beaudouin, J., Daigle, N., Eils, R.*, Ellenberg, J. (2003) Inheritance of chromosome topology throughout mitosis. Cell 112, [12] D. Gerlich, J. Mattes, R. Eils (2003). Quantitative motion analysis and visualization of cellular structures. Methods 29, [13] Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genome-wide expression screens indicate a global role for protein kinase CK2 in chromatin remodeling. J Cell Sci. 116: [14] R. Eils and C. Athale (2003) Computational imaging in cell biology. J Cell Biol 161,

147 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abteilung B080 Theoretische Bioinformatik [15] J. Wiemer, F. Schubert, M..Granzow, T. Ragg, J. Fieres, J. Mattes, R. Eils (2003) Informatics United: exemplary studies combining medical informatics, neuroinformatics and bioinformatics. Methods Inf Med. 42: [16] F. Schubert, J. Müller, B. Fritz, P. Lichter, R. Eils (2003) Understanding the Classication of Tumors with a Support Vector Machine: A Case-Based Explanation Scheme. Proceedings of the German Conference on Bioinformatics 2003, Garching, Oct 12-14, pp [17] O. Schmidt-Kittler, T. Ragg, A. Daskalakis, M. Granzow, A. Ahr, T.J.F. Blankenstein, M. Kaufmann, J. Diebold, H. Arnholdt, P. Müller, J. Bischoff, D. Harich, G. Schlimok, G. Riethmüller, R. Eils, and C.A. Klein (2003). From latent disseminated cells to overt metastasis: Genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100: [18] J. Gotter, B. Brors, M. Hergenhahn and B. Kyewski. Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters. J. Exp. Med. 199: [19] R. König and R. Eils (2004) Gene expression analysis on biochemical networks with the potts spin model. Bioinformatics, in press. [20] S. Bulashevska, O. Szakacs, B. Brors, R. Eils and G. Kovacs (2004) Pathways of urothelial cancer progression suggested by Bayesian network analysis of allelotyping data. Int. J. Cancer, in press. [21] R. König, D. Baldessari, N. Pollet, C. Niehrs and R. Eils (2004). Reliability of gene expression ratios for cdna microarrays in multi-conditional experiments with a reference design, Nucleic Acids Res., 32, e29. Patente [22] R. Eils, P. Lichter, T. Ragg et al. (2002) An Expert System for Clinical Outcome Prediction. European Patent pending. Europäische Patentanmeldung [23] B. Brors, N. Hauser, M. Vingron (2002) Method and system for determining absolute mrna quantities (WO ). Europäische Patentanmeldung EP Internationale Patentanmeldung WO 2003 EP [24] R. Eils, B. Brors, T. Haferlach, C. Schoch, S. Schnittger, S. Mergenthaler, A. Kohlmann, W. Kern, M. Dugas (2002) Novel Genetic Markers for Leukemias (WO ). Europäische Patentanmeldung Internationale Patentanmeldung WO 2002 EP Dissertationen: [25] D. Gerlich (2002) Dynamics of nuclear architecture investigated by live cell microscopy and quantitative 4D reconstruction. Dissertation, Universität Heidelberg. [26] C. Athale (2003) Modelling Nuclear Body Dynamics in Living Cell by 4-D Microscopy, Image Analysis and Simulation. Dissertation, Universität Heidelberg. 147

148 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B090 Zentrale Spektroskopie Zentrale Spektroskopie (B090) Leiter: Dr. William E. Hull, Spezialist für Kernspinresonanz (NMR) 148 Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. Wolf-Dieter Lehmann, Spezialist für Massenspektrometrie (MS) Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth, Spezialist für Modeling und Datenbankanwendungen Technisches Personal Gabriele Schwebel-Schilling, CL für NMR-Dienstleistung Gerhard Erben, CTA für Dienstleistung (IR, UV, MS) und Methodenentwicklung (MS, HPLC) Sekretariat Sabrina Zahner (½) waren folgende zusätzliche Personen über Hausoder Drittmittel-Zeitverträge (H oder D) oder ohne Vergütung (N) in der ZS an verschiedenen Forschungsprojekten tätig: Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Dieter Albert (H 1/01-8/03) Dr. Andreas Bohne-Lang (D 1/01-12/03) Dr. Martin Frank (D 6/01-12/03) Dr. Ralf Krüger (D 1/03-12/06) Gastwissenschaftler Dr. Marina Edelson-Averbukh, Technion, Haifa, Israel (Minerva Stiftung, 5/03-4/05) Prof. M. Remko, Department of Pharmaceutical Chemistry, Comenius University, Bratislava, Slowakei (H 1/03-4/03) Dr. Junhua Wei, Changchun Institute of Applied Chemistry, Changchun, P.R.China (H 10/02-9/04) Doktoranden Karin Bettinger (H 8/02-3/05) Chokri Hassayoun (D 1/02-6/03) Klaus Lohmann (D 5/01-12/04) Alexander Loß (D 1/01-1/03; 1/04-12/04) Thomas Lütteke (H 10/01-9/04) Mogjiborahman Salek (H 2/01-1/04) Andreas Schlosser (H - 3/02; mit Abt. A060) Mathias Wind (H 1/00-12/02) Diplomand Oliver Held (N 2-7/02) Studentische Hilfkräfte Franziska Becker (D 6/03-12/04) Michael Clark (D 9/01-6/02) Matthias Fleischer (D 9/01-12/04) Jan Kerschgen (D 2/03-12/04) Externe Verträge Peter Gutbrod (D 9/01-6/03) Neben der vielfältigen analytischen Dienstleistung (Auftragsmessungen zur Bestätigung bzw. Aufklärung von Molekülstrukturen mittels Kernspinresonanz (NMR) und Massenspektrometrie (MS) wird in der Zentralen Spektroskopie (ZS) an die Einführung bzw. Entwicklung neuer Meß- Analyse- und Modelierungsverfahren und ihre Anwendungen in der Krebsforschung intensiv gearbeitet. Diese Methoden werden bei eigenständigen bzw. kooperativen Forschungsaktivitäten in den Bereichen Biochemie, molekulare Struktur, Dynamik, und Wechselwirkung, funktionelle Proteomics und Glykomics, sowie Tumormetabolismus und Tumortherapie eingesetzt. Die Schwerpunkte der MS-Anwendungen liegen in Protein- und Peptidanalytik mit nano- bis picomol Mengen (präzises Molgewichtsbestimmung, Charakterisierung mittels eines enzymatischen Verdau, Sequenzierung, Bestimmung von Phosphorylierung und anderen posttranslationalen Modifikationen) sowie quantitative Bestimmung von zellulären Phospholipidenprofilen. Hochfeld-MR-Spektroskopie mit Magnetfeldstärken von 5,7-14 Tesla wird für die Entwicklung neuartiger Pharmaka, für die Identifikation von Naturstoffen mit krebspräventiver Wirkung, und zur Charakterisierung der strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Peptiden und Oligosacchariden so wie Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt. Mit der 31 P- bzw. 19 F-MR-Spektroskopie können metabolische Eigenschaften von Tumorzellen in Kultur sowie in vivo (Tiermodell) untersucht. Bei 7 Tesla ist es auch möglich die nichtinvasive Hochfeld- MR-Bildgebung einzusetzten, um z.b. das Wachstum von Tumoren und Metastasen in inneren Organen von tumortragenden Mäusen zu visualisieren und die Wirkung einer Therapie zu untersuchen. Im Internet-Zeitalter ist die Bereitstellung von spektroskopischen Daten und 3D Molekülstrukturen in Form von benutzerfreundlichen Datenbanken und Informationssystemen eine wichtige Dienstleistung. Schwerpunkte im Bereich molecular modeling sind die Oligosaccharide (Konformation und Dynamik), Glykoproteine, sowie Protein-Oligosaccharide-Wechselwirkungen (Lektine, Virusinfektion) und die Entwicklung neuer Pharmaka. Die Forschungsaktivitäten der ZS sind in vier thematischen Bereichen gegliedert (MS-Anwendungen, NMR-Applikationen, Datenbanken/Internet, und Molecular Modeling), die im Folgenden näher beschrieben werden. Unsere Internet-Addresse:

149 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Methodenentwicklung und Anwendung der Massenspektrometrie in der Krebsforschung (Ktr 12472) W.D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind, M. Salek, J. Wei, G. Erben In Zusammenarbeit mit: D. Bossemeyer, D. Kübler, V. Kinzel, A. Eisenmenger, H. Wesch, A. Alonso, M. Eisenhut, I. Grummt, R. Pipkorn (DKFZ). J. B. Helms, F. Wieland, Biochemiezentrum, Universität Heidelberg; D. Manstein, MPI f. Medizinische Forschung, Heidelberg; N. Jakubowski, Inst. f. Angewandte Spektroskopie (ISAS), Dortmund; E. Nigg, MPI für Biochemie, Martinsried; R. Kellner, Merck AG, Darmstadt. Zusatzfinanzierung: BMBF (W.D. Lehmann) Application of laserablation ICP-MS for the analysis of protein phosphorylation coupled with metabolome analysis of Corynebacterium glutamicum TP6, 1 postdoc und Geräte (6/02-5/05). Analytik von kovalenten Proteinmodifikationen mit Massenspektrometrie Die kovalente Modifikation von Proteinen und die darauf aufbauende nichtkovalente Wechselwirkung von Proteinen sind die zentralen Phänomene der physiologischen und pathophysiologischen zellulären Regulation. Die Massenspektrometrie, darunter besonders die hochauflösende Tandem- Massenspektrometrie hat sich zur zentralen Analysentechnologie für kovalente Proteinmodifikationen entwickelt. Dabei stehen zur Zeit die Bestimmung der Modifikationsart und die Identifizierung der Modifikationsstelle im Mittelpunkt der analytischen Möglichkeiten. Wir arbeiten an der methodischen Weiterentwicklung der Analytik von kovalenten Proteinmodifikationen mit dem Schwerpunkt Proteinphosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin. Fragmentierungsregeln, Proteinidentifizierung, Myristoylierung, Acetylierung Wir haben eine neue Fragmentierungsart von mehrfach geladenen Peptidionen beschrieben, die N- oder C-terminale Sequenzleitern erzeugt und damit auch die Erkennung von Peptid-Modifikationen unterstützt [1]. Mit Tandem Massenspektrometrie und Präzisionsmassenanalytik von Dipeptid- und Tripeptid-Fragmentionen haben wir eine neue Proteinidentifizierungsstrategie entwickelt, bei der die gemessene Präzisionsmasse direkt in eine minimale Sequenzinformationen umgesetzt wird. Aus mehreren solcher kurzen Sequenzen lässt sich das Ausgangsprotein in einer Datenbank identifizieren (Patchwork Sequencing) [2]. Wir haben an Proteinen eine N-terminale Myristoylierung [3] sowie eine N-terminale Acetylierung [4] beschrieben. Proteinphosphorylierung Es wurden zwei verbesserte Strategien für die Analyse der Proteinphosphorylierung eingeführt. Eine beruht auf dem Einsatz einer unspezifischen Protease (Elastase) zur Erzeugung von relativ kleinen Peptiden, bei denen sich die Phosphorylierung besser erfassen lässt als bei großen Peptiden [5], die andere beruht auf der gezielten Suche mit vorberechneten Phosphopeptid-Kandidaten Massen [6]. Durch beide Verfahren wird die Nachweisempfindlichkeit verbessert. Die Kombination Kapillar-Chromatographie/Element-Massenspektrometrie mit Phosphor-Detektion wurde zur Analytik der Proteinphosphorylierung weiter methodisch verbessert [7]. Dabei wurden durch Kombination von Element-Massenspektrometrie und Electrospray Tandem-Massenspektrometrie auch unbekannte Protein-Phosphorylierungsstellen charakterisiert [8-10]. Die Element-Massenspektrometrie wurde auch zum direkten Nachweis von Phosphoproteinen B090 Zentrale Spektroskopie von Blot-Membranen erprobt [11] sowie zur Proteinquantifizierung über Messung von Schwefel eingesetzt [12]. Aktuelle Anwendungen der Element-Massenspektrometrie in den Biowissenschaften wurden in einem Übersichtsartikel zusammenfassend beschrieben [13]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Salek M, Lehmann WD. Neutral loss of amino acid residues from protonated peptides in collision-induced dissociation generates N- or C-terminal sequence ladders. J Mass Spectrom 38 (2003) [2] Schlosser A, Lehmann WD. Patchwork peptide sequencing extraction of sequence information from accurate mass data of peptide tandem mass spectra recorded at high resolution. Proteomics 2 (2002) [3] *Eberle HB, *Serrano RL, *Füllekrug J, Schlosser A, Lehmann WD, *Lottspeich F, *Kaloyanova D, *Wieland FT, *Helms JB. Identification and characterization of a novel human plant pathogenesis-related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex. J Cell Sci 115 (2002) [4] Schlosser A, *Klockow B, *Manstein DJ, Lehmann WD. Analysis of posttranslational modification and characterization of the domain structure of dynamin A from Dictyostelium discoideum. J Mass Spectrom 115 (2003) [5] Schlosser A, Bodem J, Bossemeyer D, Grummt I, Lehmann WD. Identification of protein phosphorylation sites by a combination of elastase digestion, immobilized metal affinity chromatography, and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Proteomics 2 (2002) [6] Salek M, Alonso A, Pipkorn R, Lehmann WD. Analysis of protein tyrosine phosphorylation by nanoesi high -resolution tandem mass spectrometry and tyrosine-targeted product ion scanning. Anal Chem 75 (2003) [7] Wind M, Eisenmenger A, Lehmann WD. Modified direct-injection high-efficiency nebulizer with minimized dead volume for the analysis of biological samples by micro- and nano-lc-icp-ms. J Anal At Spectrom 17 (2002) [8] Wind M, Gosenca D, Kübler D, Lehmann WD. Stable isotope phospho-profiling of fibrinogen and fetuin subunits by element mass spectrometry coupled to capillary liquid chromatography. Anal Biochem 317 (2003) [9] Wind M, *Kelm O, *Nigg EA, Lehmann WD. Identification of phosphorylation sites in the polo-kinases Plx1 and Plk1 by a novel strategy based on element and electrospray high- resolution mass spectrometry. Proteomics 2 (2002) [10] *Kelm O, Wind M, Lehmann WD, *Nigg EA. Cell cycle-regulated phosphorylation of the Xenopus polo-like kinase Plx1. J Biol Chem 277 (2002) [11] Wind M, *Feldmann I, *Jakubowski N, Lehmann WD. Spotting and quantification of phosphoproteins purified by gel electrophoresis by laser ablation element mass spectrometry with phosphorus-31 detection. Electrophoresis 24 (2003) [12] Wind M, *Wegener A, Eisenmenger A, *Kellner R, Lehmann WD. Sulfur as the key element for quantitative protein analysis by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry. Angew Chem Int Ed Engl 115 (2003) [13] Wind M, Lehmann WD. Element and molecular mass spectrometry - an analytical dream team in the life sciences. J Anal At Spectrom 19 (2004) Methodische Entwicklung und Anwendung der Hochfeld-Kernmagnetischen-Resonanz-(MR)- Spektroskopie und Bildgebung (Ktr 12471) W.E. Hull, D. Albert, K. Bettinger In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, R. Owen, H. Bartsch, J. Debus, H. Walczak, R. Pipkorn (DKFZ); I. Walter-Sack, Innere Medizin VI, Klinische Pharmakologie und Pharmakoepidemiologie, Universitätsklinikum Heidelberg; Y.J.L. 149

150 150 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Kamm und A. Herschap, Univ. Medical Center, Nijmegen, Niederlande; H.-C. Siebert, Tierärtzliche Fakultät, LMU München In der ZS werden die MR-Forschungsaktivitäten mittels drei Großgeräten durchgeführt: ein 14-Tesla 4-Kanal Spektrometer (600 MHz 1 H-Frequenz), hauptsächlich für Strukturforschung im Bereich Proteomics und Glycomics; ein 11,7-Tesla Spektrometer (500 MHz 1 H-Frequenz) für die analytische in vitro NMR-Spektroskopie (MRS); ein multifunktionelles 7,0-Tesla System mit 15-cm Magnetbohrung für in vitro Analytik, z.b. an Bioflüssigkeiten, und in vivo MRS und MR- Bildgebung am Tiermodell. Für die routine MR-Analytik steht ein 5.8-Tesla (250 MHz) Gerät zur Verfügung. In vitro MRS wird für analytische Aufgaben und Molekül- Strukturforschung eingesetzt (reine Substanzen in Lösung, Chromatographie-Fraktionen oder Reaktionsgemischen, biologische Flüssigkeiten wie Urin und Plasma, Suspensionen intakter Zellen bzw. Zellextrakte). In vivo MRS wird hauptsächlich für nichtinvasive metabolische Untersuchungen an soliden Tumoren im Tiermodell eingesetzt. Mit MR-Bildgebung kann das Wachstum von Tumoren bzw. Metastasen im lebenden Tier visualisiert werden. Einige der aufwendigeren kooperativen Forschungsprojekte, die über die Routine-Analytik hinausgehen, werden im Folgenden beschrieben. Struktur-Analytik mittels MRS In verschiedenen Kooperationen, insbesondere mit der Abt. von M. Wiessler, wurden die Methoden der hochauflösenden MRS für die Strukturbestimmung und Charakterisierung einzelner synthetischer Moleküle eingesetzt: - ein Konjugat zwischen 3'-AMP und dem Farbstoff BODIPY, eines Indacen-Derivates, wurde mit 1 H, 13 C, 19 F, and 11 B MRS sowie mit semi-empirischem Modeling charakterisiert; - Glykokonjugate von Hydroxyharnstoff und Mesylglykol, potentielle prodrugs für targeted Antitumor-Therapie, wurden mit ein- und zwei-dimenionelle 1 H/ 13 C-MRS untersucht [1]; - Mono- und Diglukoside des Curcumins, ein antikrebswirkender Naturstoff, wurden charakterisiert. Tumor-selektive Farbstoffe. Für die intraoperative Visualisierung von Tumorgewebe und Metastasen wurden fluoreszierende Peptid-Farbstoff-Konjugate synthetisiert. Die Octapeptide Octreotat, Tyr 3 -Octreotat, und Tyr 3 -Octreotid wurden mit verschiedenen Rhodaminen gekoppelt und ihre Bindung an Somatostatin-Rezeptoren (SSTR) getestet. Bei Konjugaten mit Rhodamin-101 wurde einer unerwünschte Verlust der Fluoreszenz bei ph 7-8 festgestellt. Mit MRS konnte die reversible Bildung eines neutralen, nicht-fluoreszierenden Spirolaktam nachgewiesen werden [2]. Diät und Krebsprävention In einer langfristigen Kooperation mit R. Owen in der Abt. H. Bartsch (C010) wird eine Vielzahl von Naturstoffe aus diversen Nahrungsmittel auf ihre potentielle chemopräventive bzw. antitumoralle Wirkung untersucht. Extrakte von Ölen, Samen, Früchten oder Würzeln werden chromatografish aufgetrennt und die isolierten Komponenten mittels Massenspektrometrie und vor allem durch extensive MRS- Studien eindeutige identifiziert. Diverse einfache und komplexere Phenole (hydroxytyrosol, dihydrocaffeic acid, verschiedene cinnamic und coumaric acids) sowie das Glykokonjugat Acteosid und die Flavonoide Luteolin und Apigenin konnten in dem Fruchtfleisch der schwarzen Oliven nachgewiesen werden [3]. Diese Substanzen, die auch in anderen B090 Zentrale Spektroskopie Obst- und Gemüsesorten gefunden werden, wirken als starke Antioxidantien und schützen gegen die Wirkung von reaktive Sauerstoff (Radikalen) im Gewebe. Carob fiber wird aus der Carob-Bohne isoliert und als ergänzenden dietary fiber in der Nahrungsmittel-Industrie verwendet. In einem aufwendigen analytischen Verfahren wurde ein kommerzielles Carob-Präparat untersucht, um eine vollständigere Überblick über seine phenolischen Inhaltsstoffe zu gewinnen. Mittels MRS wurden diverse Bestandteile wie cinnamic and gallic acids, gallotannins, Flavone und ihre Glykoside sowie Cathechine nachgewiesen [4]. Weitere MRS-Untersuchungen sind im Gange bezüglich der Antioxidantien in Sesam-Öle und in diversen Früchten aus Thailand. Leinsamen enthalten Secoisolariciresinol Diglucosid, und diese Substanz wird durch Bakterien im Dickdarm zu Tamoxifen-ähnlichen Lignanen umgewandelt, die präventiv gegen Brustkrebs wirken können. Die Strukturen der verschiedenen Produkten konnten nur mit MRS aufgeklärt werden. 19 F-MR-Studien zur Fluorpyrimidin-Chemotherapie Fluorpyrimidin Chemotherapie (z.b. mit 5-Fluoruracil, 5-FU) ist eine der ältesten aber noch weitverbreiteten Behandlungsmethoden, insbesondere für Kolonkarzinom und Lebermetastasen. 19 F-MRS bietet die einmalige Möglichkeit die zahlreichen Metaboliten eines Medikamentes wie Fluoruracil z.b. in Blutplasma, Urin, oder Tumorgewebe nachzuweisen und zu quantifizieren. Mehrere Studien dieser Art wurden seit 1986 in der Abteilung erfolgreich durchgeführt. Nicht nur in der Forschung sondern auch im klinischen Alltag findet 19 F-MRS seine Anwendung, z.b. nach Fluoruracil-Behandlung für den Nachweis giftiger Kataboliten wie Fluorhydroxypropionsäure (FHPA) und das Neurotoxin Fluoracetat (FAC) in mikromolare Konzentrationen in Urin von Krebspatienten, die gleichzeitig an Niereninsuffienz leiden [5]. Diese Patienten zeigten auch entsprechend starke neurologische Nebenwirkungen. In einer Kooperation mit dem Medizinischen Zentrum Nijmegen [6] wurde am Mausmodell zwei Tumorarten mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber 5-FU Behandlung untersucht. Die sogenannte FU-empfindliche Tumoren bildeten größere Mengen der zytotoxischen Fluornukleotiden (FNuk, z.b. FUTP), die mittels in vivo 19 F-MRS im Tumorgewebe nachgewiesen werden konnten. Durch zwei Mechanismen wirken die FNuk zytotoxisch: (a) durch Einbau in RNA und (b) durch Inaktivierung das Enzym Thymidylat- Synthase (TS). Gegenüber der empfindlichen Tumorart zeigten die FU-unempfindlichen Tumoren eine schnellere Erholung der TS-Aktivität und ein schnelleres Entfernen der Fluoruracil-Einheiten aus der RNA. In einem Ratten-Modell Studie wurde intra-arterielle lokoregionale 5-FU Therapie mit systemischer i.v. Behandlung bei verschieden Dosen und Infusionszeiten verglichen. Gewebeproben (Tumor, Leber, Niere) wurden nach der Therapie entnommen und mittels 19 F-MRS bezüglich der Mengen an 5-FU Kataboliten und Anaboliten (FNuk) analysiert. Therapiewirkung korrelierte mit der Konzentration der FNuk in Tumorgewebe, und systemische Toxizität korrelierte mit der Erscheinung von FNuk in Leber und Niere. Niedrig dosierte Langzeit-Infusionen (25 mg/kg über 5 bzw. 24 Std) resultierten in den besten Verhältnissen für FNuk in Tumor gegenüber Leber und ergaben die besten Therapiewirkungen ohne Toxizität - mit einem kleinen Vorteil für i.a. gegenüber i.v. Therapie [7].

151 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung 19 F-MRS wurde auch erfolgreich eingesetzt, um metabolische Fragen zu einem Gentherapie-Modell zu beantworten (Cytosin-Deaminase/5-Fluorcytosin Therapie des Dunning Prostatakarzinoms der Ratte, Abt. Debus, E050) und das Fehlen eines sogenannten bystander Effektes zu erklären [8]. Die gewonnene Erfahrung und die etablierte Meßtechnik sollen jetzt für Untersuchungen an andere Zell-Linien und Gen-Transfektionsmodelle eingesetzt werden. B090 Zentrale Spektroskopie MR-Untersuchungen zur Protein-Ligand- Wechselwirkungen Mit der 1 H-MRS können die Wechselwirkungen von Liganden und Rezeptoren (Struktur und Dynamik) auf der molekularen Ebene detailliert untersucht werden. MR-Screening bietet die Möglichkeit, die Bindung von niedermolekularen, peptidischen oder nicht-peptidischen Liganden an Proteinen zu entdecken bzw. zu optimieren. Mögliche Vorteile der Methodik sind: die Erkennung auch schwach bindender Liganden; Bestimmung der 3D-Struktur des Liganden im gebundenen Zustand; Bestimmung der beteiligten Bindungsstellen am Rezeptor. Im Berichtszeitraum wurden eine Reihe meßmethodische Ansätze auf unserem 600 MHz NMR- Spektrometer erprobt und optimiert. Screening von Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor In einer Kooperation mit H. Walczak (D040) wurde versucht, Oligopeptide als Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor (TRAIL = TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) zu entwickeln. Mit Hilfe der vorliegenden Röntgenstruktur des TRAIL/TRAIL-R2 Komplexes wurden durch Molecular Modeling kurze Abschnitte (Teilsequenzen) im TRAIL Ligand gefunden, welche für die Affinität und Spezifizität von TRAIL verantwortlich sein könnten. Die entsprechende Oligopeptide, z.b. ein 19mer, durch eine Cystein Disulfidbrücke zyklisiert, wurden von R. Pipkorn synthetisiert und mittels 1 H-MRS vollständig charakterisiert. Ziel der Gruppe Walczak ist es, ein wasserlösliches Fusionsprotein, bestehend aus der extrazellulären Domäne von TRAIL-R2 und der Fc-Region des menschlichen IgG, als Modellsystem für den membrangebundenen TRAIL-R2 Rezeptor zu produzieren. Für die MRS-Untersuchungen werden etwa 0,1-1 µmol des Proteines benötigt. Bis jetzt war die Ausbeute an Protein zu niedrig für detailliert Bindungsstudien. Mit diesem Projekt sollen hochaffine und selektive Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor aufgebaut werden, wobei die Strukturen (Konformationen) der Liganden (frei und im Komplex mit dem Rezeptor) bezüglich der Bindungsaffinität, -spezifizität und biologischer Wirkung gezielt optimiert werden soll. Dadurch erhoffen wir niedermolekulare Substanzen liefern zu können, die die Apoptose in Krebszellen auslösen und von therapeutischem Interesse sind. Oligosaccharide und Galektine Als Teil einer Doktorarbeit werden die Struktur-Eigenschaften von Disacchariden und ihre Bindung an Proteine (Galektine) mittels 1 H-MRS bei 600 MHz untersucht. Um mehr Information über die konformationellen bzw. dynamischen Eigenschaften der Zucker-Moleküle zu erhalten, werden Messungen in DMSO/Wasser-Gemische durchgeführt. Dadurch werden die Signale der Hydroxyl-Protonen aufgelöst; im reinen Wasser sind diese Signale durch Austausch-Prozesse sehr breit oder nicht detektierbar. Die Bindung von galactose-haltigen Oligosacchariden an Galektinen in gemischten Lösungsmittel wird auch untersucht, mit dem Ziel die Konformation des gebundenen Zuckers zu bestimmen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Sorg BL, Hull WE, Kliem HC, Mier W, Wiessler M. Synthesis and NMR characterization of hydroxyurea and mesylglycol glycoconjugates as drug candidates for targeted cancer chemotherapy. Carbohydr Res, eingereicht. [2] *Mier W, *Beijer B, *Graham K, Hull WE. Fluorescent somatostatin receptor probes for the intraoperative detection of tumor tissue with long-wavelength visible light. Bioorg Med Chem 10 (2002), [3] Owen RW, Haubner R, Mier W, *Giacosa A, Hull WE, Spiegelhalder B, Bartsch H. The isolation, structure elucidation and antioxidant potential of the major phenolic and flavonoid compounds in brined olive drupes. Food Chem Toxicol 41 (2003) [4] Owen RW, Haubner R, Hull WE, Erben G, Spiegelhalder B, Bartsch H, *Haber B. Isolation and structure elucidation of the major individual polyphenols in carob fibre. Food Chem Toxicol 41 (2003) [5] *Rengelshausen J, Hull WE, *Schwenger V, *Göggelmann C, *Walter-Sack I, *Bommer J. Pharmacokinetics of 5-FU and its catabolites determined by 19 F nuclear magnetic resonance spectroscopy for a patient on chronic hemodialysis. Am J Kidney Dis 39 (2002) E10. [6] *Kamm YJL, *Peters GJ, Hull WE, *Punt CJA, *Heerschap A. Correlation between 5-fluorouracil metabolism and treatment response for two variants of C26 murine colon carcinoma. Br J Cancer 89 (2003) [7] Lutz NW, Naser-Hijazi B, Koroma S, Berger MR, Hull WE. Fluoropyrimidine chemotherapy in a rat model: comparison of fluorouracil metabolite profiles determined by high-field 19 F-NMR spectroscopy of tissues ex vivo with therapy response and toxicity for locoregional vs. systemic infusion protocols. NMR in Biomedicine, 17 (2004) [8] Corban-Wilhelm H, Hull WE, Becker G, Bauder-Wüst U, Greulich D, Debus J. Cytosine deaminase gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: characterisation of 5-fluorocytosine metabolism and the bystander effect with 19 F-NMR spectroscopy. Gene Therapy 9 (2002) Entwicklung von WWW-basierten Anwendungen und Datenbanken für strukturbiologische Fragestellungen (Schwerpunkt Glykobiologie) C.-W. von der Lieth, A. Bohne-Lang, K. Lohmann, A. Loß, T. Lütteke, T. Götz, M. Frank In Zusammenarbeit mit: P. Krieg, G. Fürstenberger, W.D. Lehmann (DKFZ); Prof. E. Schwarzer, Universität Hildesheim; Prof. Dr. E. Lang, Fachhochschule Darmstadt; Prof. Dr. R. Geyer, Universität Giessen; Prof. Dr. U. Zähringer, Forschungszentrum Borstel; Bioinformatik Core des Consortion for Functional Glycomics, MIT, Cambridge, MA, USA. Zusatzfinanzierung: DFG-Projekt (PD12483, C.-W. von der Lieth) Konzeption und Entwicklung einer Web-basierten Arbeitsumgebung von glykowissenschaftliche Fragestellungen und Bereitstellung von fachbasierten Informationsangeboten; 1 Postdoc (A. Bohne-Lang), 2 Doktoranden (A. Loß, K. Lohmann), DFN-Projekt: (C.-W. von der Lieth) Dynamische Moleküle: Darstellung und Analyse der Dynamik von biologischen Makromolekülen per Internet; 1 Postdoc (M.Frank), 1 Doktoranden (C. Hassayoun), 3 HiWis (P. Gutbrod, M. Clark, M. Fleischer), Die rasche Entwicklung der Möglichkeiten des Internet hat die Art und Weise wie Wissenschaftler weltweit miteinander kommunizieren und Information beschaffen entscheidend verändert. Über das WWW sind viele Datenbanken 151

152 152 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung mit strukturellen, biologischen und spektroskopischen Daten mittels standardisierter, graphischer Benutzerführungen verfügbar. Vorteile sind: a) der Zugriff auf die aktuellsten Daten zumeist ohne zusätzliche Kosten b) eine für viele Anwendungen sehr ähnliche, graphische und intuitiv bedienbare Benutzeroberfläche sowie c) eine weit gehende Unabhängigkeit von der jeweils vorhandenen Hardware-Konfigurationen, so dass die Anwendungen von praktisch jedem Arbeitsplatzrechner aus durchgeführt werden können. Aus diesen Gründen sondieren und testen wir kontinuierlich die über das WWW verfügbaren Angebote an spektroskopischen, strukturellen und biologischen Daten und machen sie in Form von Linksammlungen verfügbar [1-3]. Als Schwerpunkt betreiben wir eigenständige Entwicklungen von Datenbanken und Anwendungen im Bereich der Glykobiologie, in dem bisher nur wenige Angebote weltweit verfügbar sind [4]. In Tabelle 1 sind die bisher in der Arbeitsgruppe entwickelten Internet-Anwendungen und Datenbanken aufgelistet. Mit unseren WWW-Anwendungen im Bereich der Glykobiologie beteiligen wir uns an dem US amerikanischen Consortium for Functional Glycomics (web.mit.edu/glycomics/ consortium/). Ziel dieses Zusammenschlusses ist, die Funktion von kohlenhydratbindenden Proteinen bei der interund intrazellulären Kommunikation bzw. Signaltransduktion zu entschlüsseln. Intrazelluläre Kommunikation ist von entscheidender Bedeutung für verschiedene Aspekte der Immunologie, bei Entstehung von Tumoren sowie der Bildung von Metastasen. Eines der Ziele des Konsortiums ist die Entwicklung von Datenbanken für menschliche kohlenhydratbindende Proteine, kohlenhydrataufbauende Enzyme und den in Geweben vorkommenden Glykanen zu erstellen. Aufbauend auf unseren Methoden, verschiedene Datenbanken über eine eindeutige Strukturbeschreibung der Kohlenhydrate zu verknüpfen, sind wir intensiv an der konzeptionelle Arbeit für die neu zu schaffenden Datenbanken des Konsortiums beteiligt. Die aktuellen Nutzungsstatistiken unserer WWW-Datenbanken und Anwendungen (siehe spec/statistik/) belegen, dass die angebotenen Dienste von Wissenschaftlern weltweit intensiv genutzt werden. In den Jahren 2002/2003 wurden im Durchschnitt täglich mehr B090 Zentrale Spektroskopie als 800 Seiten aus allen Teilen der Welt aufgerufen. In den letzten 3 Jahren wurden mehr als räumliche Glykanstrukturen mit SWEET-II konstruiert und mehr als Animationen von Molekülen mittels PDB2Multigif erzeugt. Unsere Anwendungen sind in allen bekannten molekularbiologischen Linksammlungen aufgeführt. Mit der Realisierung des Projektes Dynamische Moleküle wurde das weltweit erste, komplett Internet basierte Portal geschaffen, mit dem die dynamischen Eigenschaften von biologischen Makromoleküle mittels Molekular-Dynamik Simulationen auf der atomaren Ebene untersucht werden können. Das Portal erlaubt es, Glykanmoleküle zu konstruieren und die gewünschten Simulationsbedingungen einzustellen. Die Simulation, die sehr lange (Stunden bis Tage) dauern können, werden auf einem Rechencluster der Abteilung durchgeführt. Danach hat der Benutzer die Möglichkeit, die ihn interessierenden Aspekte des dynamischen Verhaltens im Detail auf atomarer Ebene auszuwerten. Abb. 1: Web-Interface der Lipoxygenase Datenbank LOX-DB [12] Tabelle 1: Internet basierte Anwendungen und Datenbanken, die von der Zentralen Spektroskopie entwickelt wurden und unter der URL verfügbar sind. Service Funktion / Aufgabe Referenz SWEET-DB Zentrale Datenbank von Glykanstrukturen [5] PDB2LINUCS Auffinden von Glykanen in der Protein Daten Bank [10] Glycofragment Berechnung der Massen von Fragmentionen von Glykanen [9] GlycoSearchMS Vergleich von Fragmenten mit experimentellen MS-Spektren Nucl Acid Res (eingereicht) GlyPeps Erkennung von Glykanstrukturen in Glykoproteinen J Mass Spectrom 35 (2000) 1335 NMR-Search 1 H, 13 C-NMR Suche für Glykanen In Vorbereitung LINUCS Eindeutige Lineare Codierung von Glykanstrukturen Carbohydr Res 336 (2001) 1-11 LiGraph Konvertierung graphischer Darstellungen von Glykanen Carbohydr Res (eingereicht) SWEET-II Berechnung der 3D-Strukturen von Glykanen Bioinformatics 15 (1999) 767 GlycoMaps DB Konformationskarten für glykosidischen Bindungen Nucl Acid Res (eingereicht) GlyDict Generierung repräsentativer Ensembles von Glykankonformationen [7] PDB2Multigif Darstellung bewegender Molekülen in Web-Browsern J Mol Modeling 4 (1998) 344 Dynamic Molecules Web Portal: dynamisches Verhalten von Makromolekülen [11] Lox-DB Datenbank der Strukturen aller bekanten Lipoxygenasen [12]

153 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Publikationen ( * = externer Koautor) [1] *Ammenwerth E, *Haux R, *Kulikowski C, Bohne A, *Brandner R, *Brigl B, *Fischer G, *Garde S, *Knaup P, *Ruderich F, *Schubert R, *Singer R, *Wolff AC. Medical Informatics and the quality of health: new approaches to support patient care - findings from the IMIA Yearbook of Medical Informatics Methods of Information in Medicine 42 (2003) [2] Bohne A, *Schwiemann J. Entwurf und Realisierung einer Web-basierten Verknüpfung einer Literaturdatenbank mit einem Bestell- und Recherchesystem. Bibliothek 26 (2002) [3] Bohne-Lang A, Lohmann KK. Statistische Analyse der Eindeutigkeit einer Kombination von Jahrgang, Bandnummer und Anfangsseite von Publikationen anhand der PubMed-Einträge von Bibliotheksdienst 1 (2003) [4] von der Lieth CW. Expanding Proteomics to Glycobiology. In: Pacific Symposium on Biocomputing 2002, Vol. 7. R. B. Altman, A. K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale, T. E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp [5] Loß A, *Bunsmann P, Bohne A, Loß A, *Schwarzer E, *Lang E, von der Lieth CW. SWEET-DB: an attempt to create annotated data collections for carbohydrates. Nucl Acids Res 30 (2002) [6] von der Lieth CW, Bohne-Lang A, Lohmann KK. Datenbanken und Bioinformatik-Werkzeuge für die Glykobiologie. Biospektrum 9 (2003) [7] Bohne A, von der Lieth CW. Glycosylation of proteins: a computer-based method for the rapid exploration of the conformational space of N-Glycans. In: Pacific Symposium on Biocomputing 2002, Vol. 7. R. B. Altman, A. K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale, T. E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp [8] Frank M, Bohne-Lang A, *Wetter T, von der Lieth CW. Rapid generation of a representative ensemble of N-glycans conformations. In silico Biol 2 (2002) [9] Lohmann KK, von der Lieth CW. Glyco-Fragment: a Web tool to support the interpretation of mass spectra of complex carbohydrates. Proteomics 3 (2003) [10] Lütteke T, Frank M, von der Lieth CW. Data mining the protein data bank: automatic detection and assignment of carbohydrate structures. Carbohydr Res 339 (2004) [11] Frank M, Gutbrod P, Hassayoun C, von der Lieth CW. Dynamic molecules: molecular dynamics for everyone. An internetbased access to molecular dynamic simulations: basic concepts. J Mol Modeling 9 (2003) [12] Lütteke T, Krieg P, Furstenberger G, von der Lieth CW. LOX- DB - a database on lipoxygenases. Bioinformatics 19 (2003) Molecular Modeling (Ktr 12473) C.-W. von der Lieth, M. Frank, K. Bettinger, C. Hassayoun In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, H.-C. Kliem, E. Frei, J. Kleinschmidt, K. Braun, J. Debus, P. Krieg, G. Fürstenberger, V. Schirrmacher (DKFZ); J.F.G. Vliegenthart, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Universität Utrecht, Niederlande; H.-J. Gabius, H.-C. Siebert, Tierärtzliche Fakultät, LMU München, T.K. Lindhorst, Universität Kiel. Zusatzfinanzierung: DFN-Projekt (B919, C.-W. von der Lieth); Dynamische Moleküle: Darstellung und Analyse der Dynamik von biologischen Makromolekülen per Internet; 1 Postdoc (M. Frank), versch. HiWis; 1 Linux Rechner-Cluster (Teilfinanzierung); B090 Zentrale Spektroskopie Schlüssel zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirksamkeit. Mit multidimensionalen NMR-Techniken und effektiven Modellierungsprogrammen (Kraftfeldberechnung) ist es möglich, die räumliche Strukturen und Dynamik von Molekülen in Lösung zu untersuchen [1]. Die rasche Entwicklung der Computertechnologien erlaubt es, das dynamische Verhalten von zunehmend größeren molekularen Ensembles unter Berücksichtigung der jeweiligen physiologischen Bedingungen zu simulieren. Zur Auswertung werden effiziente Werkzeuge benötigt, die eine weitgehend automatische Analyse der anfallenden riesigen Datenmengen erlaubt. Das in der Arbeitsgruppe entwickelte Programm CAT (Conformational Analysis Tools) [2] ermöglicht eine detaillierte Analyse dynamischer Vorgänge innerhalb biologischer Markromoleküle und deren Wechselwirkungen untereinander. Intensive Studien zum Abtasten des konformationellen Raumes von flexiblen Molekülen wurden mittels Molekular-Dynamik Simulationen an Glykodendrimeren und N-Glykanen durchgeführt [2-4]. Um aussagekräftige Beschreibungen des dynamischen Verhaltens von sehr beweglichen Molekülen zu erhalten, erwies es sich als notwendig, neue Möglichkeiten zur Beschreibung der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten von funktionellen Gruppen zu entwickeln. Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen Die Untersuchung biologischer Kommunikationsprozesse stellt einen viel versprechenden Ansatz dar, um Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung in eine rationale Entwicklung von neuen Strategien zur Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen einzubringen. Zunehmend zeigt sich auch, dass Kohlenhydratstrukturen spezifische Träger biologischer Informationen sind. Sie werden mit membrangebundenen Proteinen oder Lipiden gekoppelt, die wesentliche Komponenten der Zelloberfläche darstellen. Die Glykoproteine und Glykolipide sind somit besonders exponiert und wirken bei Zell-Zell und Zell-Matrix Erkennungs- bzw. Signalprozessen mit (Entzündung, Virus-Infektion, Metastasierung). Die Bindung von Kohlenhydraten an Modell-Lektinen wurde mittels 1 H-NMR-Experimenten (Transfer-NOE) und verschiedenen Methoden des Molecular Modeling untersucht (Homologie-Modelierung, Berechnung der Wechselwirkungsenergien, systematische Konformationssuche, usw.) [5,6]. Experimentell wurde gefunden, dass allein der Austausch der Aminosäure Serin-200 der Hemagglutinin-Neuraminidase die funktionale Aktivität des Newcastle Disease Virus entscheidend beeinflusst [7]. Mittels intensiver molekulardynamischer Simulationen gelang es, die durch den Austausch einer Aminosäure veränderten dynamischen und sterischen Eigenschaften auf atomarer Ebene zu verstehen. Der Punkt-Mutation Serin Prolin bewirkte eine Umlagerung einer Schleife der Proteinrückgrats in der Nähe des enzymatisch aktiven Zentrums der Neuraminidase und erschwert dadurch der Zugang von Kohlenhydratstrukturen D Struktur in Lösung Die möglichst genaue Kenntnis der dreidimensionalen (3D) Struktur von biologisch aktiven Verbindungen und deren Flexibilität und Dynamik in Lösung ist oft der entscheidende

154 154 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung Abb. 2: Graphische Darstellung der Struktur des kompletten Kapsids des Adeno-assozierten Virus (AAV-2), die mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt wurde (links). Der gesamte Komplex besteht aus insgesamt 60 VP1 monomeren Einheiten. Die Vergrößerungen stellen jeweils drei VP1 Einheiten (dreifache Symmetrie) von der Seite (rechts oben) und von oben (rechts unten) mit einem gebundenen Oligosaccharid dar (negativ geladenem Heparin, blaue Kalotten, in Wechselwirkung mit positiv geladenen Arginin und Lysin, rot). Um die Bindungsstellen von Heparinen zu finden, wurde im Rechner ein virtuelles Abtasten der Proteinoberfläche mittels eines Docking Verfahrens durchgeführt. Das Heparin zeigte dabei eine besonders starke Wechselwirkung mit einer tiefen Einkerbung auf der Proteinoberfläche in der Nähe der dreifachen Symmetrieachse. Hier befinden sich in räumlicher Nähe die meisten der aus anderen Studien bekannten Aminosäuren, die für die Heparin-Bindung als besonders wichtig sind. Modellierung homologer makromolekularer Strukturen Die Zahl der experimentell bestimmten 3D Proteinstrukturen nimmt rapide zu, so dass auch für viele krebsrelevante Moleküle verlässliche Strukturen mit einem wissensbasierten Ansatz modelliert werden können. Zudem hat sich auch die Qualität der verwendeten Algorithmen kontinuierlich verbessert. Da alle notwendigen Daten und ein Großteil der Programme über das Internet abgerufen werden können, entwickelt sich eine ständig steigende Nachfrage, diese Möglichkeiten auch für Fragestellungen aus dem DKFZ zu nutzen. Aus diesem Grunde bieten wir einerseits Fortbildungskurse an, andererseits versuchen wir in Form von Linksammlungen den interessierten Kollegen einen einfachen Zugang zu den Datenbanken und Programmen zu eröffnen. Werden neben den Standardanwendungen zusätzliche, komplexe Modellierungsschritte [9-12] erforderlich, so führen wir diese in Kooperation durch. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Siebert HC, Frank M, von der Lieth CW, *Jiménez-Barbero J, *Gabius HJ. Detection of hydroxyl protons. In: NMR Spectroscopy of Glycoconjugates. J. Jiménez-Barbero, T. Peters (Eds.). Wiley -VCH, Weinheim (2002) pp [2] Frank M, Bohne-Lang A, *Wetter T, von der Lieth CW. Rapid generation of a representative ensemble of N-glycans conformations. In silico Biol 2 (2002) B090 Zentrale Spektroskopie [3] von der Lieth CW, Frank M, *Lindhorst TK. Molecular dynamics simulations of glycoclusters and glycodendrimers. Rev Mol Biotech 90 (2002) [4] *Andre S, *Unverzagt C, *Kojima S, Frank M, *Seifert J, *Fink C, *Kayser K, von der Lieth CW, Gabius HJ. Determination of modulation of ligand properties of synthetic complex-type biantennary N-glycans by introduction of bisecting GlcNAc in silico, in vitro and in vivo. Eur J Biochem 271 (2004) [5] *Siebert HC, *Lu SY, Frank M, *Kramer J, *Wechselberger R, *Joosten J, *Andre S, *Rittenhouse-Olson K, *Roy R, von der Lieth CW, *Kaptein R, *Vliegenthart JFG, *Heck AJ, *Gabius HJ. Analysis of protein-carbohydrate interaction at the lower size limit of the protein part (15-mer peptide) by NMR spectroscopy, electrospray ionization mass spectrometry, and molecular modeling. Biochemistry 41 (2002) [6] *Siebert HC, *Andre S, *Lu SY, Frank M, *Kaltner H, *van Kuik JA, *Korchagina EY, *Bovin N, *Tajkhorshid E, *Kaptein R, *Vliegenthart JFG, von der Lieth CW, *Jimenez-Barbero J, *Kopitz J, *Gabius HJ. Unique conformer selection of human growth-regulatory lectin Galectin-1 for ganglioside GM(1) versus bacterial toxins. Biochemistry 42 (2003) [7] Fournier F, Zeng J, von der Lieth CW, *Waschburn B, *Ahler T, Schirrmacher V. Importance of serine 200 for functional activities of the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of Newcastle Disease Virus. Int J Oncology, (2004) im Druck. [8] Kern A, Schmidt K, Leder C, Müller OJ, *Wobus CE, Bettinger K, von der Lieth CW, King JA, Kleinschmidt JA. Indentification of a heparin-binding motif on adeno-associated virus type 2 capsids. J Virology 77 (2003) [9] Heckl S, Debus J, Jenne J, Pipkorn R, Waldeck W, Spring H, Rastert R, von der Lieth CW, Braun K. CNN-Gd(3+) enables cell nucleus molecular imaging of prostate cancer cells: the last 600 nm. Cancer Res 62 (2002) [10] Heckl S, Pipkorn R, Waldeck W, Spring H, Jenne J, von der Lieth CW, Corban-Wilhelm H, Debus J, Braun K. Intracellular visualization of prostate cancer using magnetic resonance imaging. Cancer Res 63 (2003) [11] *Kipriyanov SM, Moldenhauer G, *Braunagel M, *Reusch U, Cochlovius B, Le Gall F, Kouprianova OA, von der Lieth CW, Little M. Effect of domain order on the activity of bacterially produced bispecific single-chain Fv antibodies. J Mol Biol 330 (2003) [12] *Lahm H, *Andre S, *Hoeflich A, *Kaltner H, *Siebert HC, *Sordat B, von der Lieth CW, *Wolf E, *Gabius HJ. Tumor galectinology: Insights into the complex network of families of endogenous lectins. Glycoconjugate J 20 (2004) 1-12.

155 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B100 Zentrale Proteinanalytik Zentrale Proteinanalytik (B100) Leiterin: Dr. Martina Schnölzer Wissenschaftl. Mitarbeiter Dr. Tore Kempf Dr. Barbara Überle (1/02-4/03 seit 05/03 - Mutterschaftsurlaub) Dr. Silke Wandschneider (1/03 - ) Dr. Uwe Warnken (8/03 - ) Dr. Bela Paizs (6/03 - ) Gastwissenschaftler Dr. Andrea Urbani, Rom, Italien ( - 12/02) Marialuisa Casella (4-7/02) Doktoranden Wilma Dormeyer (11/00 - ) Claudio Diema (8/03 - ) Technische Mitarbeiter Sabine Fiedler ( - 2/02 4Std./Woche, 3/02-19 Std./Woche) Gerda Baumann ( - 7/03) Bettina Helfert (7/02-12/03) Sebastian Sobiesiak(3/02 -) 1998 wurde die Einheit Zentrale Proteinanalytik am DKFZ eingerichtet. Diese Maßnahme hatte sich als notwendig erwiesenen, um der wachsenden Nachfrage nach zuverlässigen und sensitiven Analysen mithilfe moderner analytischer Methoden gerecht zu werden. Den Forschungsgruppen des DKFZ wird die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und ihrer posttranslationalen Modifikationen angeboten. Ausgangsmaterial für die Analysen sind üblicherweise SDS-PAGE-getrennt Proteine, die im Gel mit Trypsin verdaut werden. Die generierten Peptidfragmente werden am MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)- Massenspektrometer analysiert und mit Hilfe des Peptidmassenfingerprints per Datenbanksuche identifiziert. Zusätzliche Analysemöglichkeiten erhält man durch LC-ESI MS/MS (liquid chromatography-electrospray-ionization MS/MS und MALDI PSD (post source decay) Experimente. Die gewonnenen Informationen dienen als Grundlage für die Synthese von Peptiden und Oligonukleotiden, welche als Werkzeuge für weitere Studien eingesetzt werden können. Analyse von Peptiden und Proteinen W. Dormeyer, T. Kempf, M. Schnölzer, B. Ueberle Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und ihren posttranslationalen Modifikationen Für die Analytik stehen der Einheit folgende Geräte zur Verfügung: Zwei MALDI-TOF-Massenspektrometer (Reflex II, Bruker Daltonik und M@LDI, Micromass), ein nano-hplcgekoppeltes (Ultimate, Dionex) ESI-Iontrap-Massenspektrometer (LCQ, ThermoFinnigan) und ein ESI-Q-TOF Massenspektrometer (Q-TOF Ultima, Micromass) und ein Edman- Sequenzer (Procise clc, Applied Biosystems). Die meisten Analysen werden derzeit mit Hilfe der MALDI Technik durchgeführt. Aufgrund der hohen Sensitivität und Massengenauigkeit können 80% der Proteine durch Massenfingerprints oder in Kombination mit MALDI PSD identifiziert werden. Für Kunden innerhalb des DKFZ und für externe Gruppen werden jedes Jahr etwa 400 Analysen durchgeführt. Als Teil des Nationalen Genomforschungsnetzwerks (NGFN) im Kernbereich 4 (Protein-Protein Interaktionen) werden rekombinante Proteine und Proteininteraktionen mit Hilfe der Massenspektrometrie untersucht. Weitere Analysen werden für NGFN-Partner innerhalb der krankheitsorientierten Netzwerke Krebs und Erkrankungen des Nervensystems durchgeführt. Für Partner innerhalb des NGFN Netzwerks wurden in 2 Jahren etwa 700 Proben erfolgreich analysiert. Daneben bestehen Kooperationen mit verschiedenen Forschungsgruppen des Hauses und zahlreichen externen Forschungsgruppen. Neben der Identifizierung und Charakterisierung einzelner Proteine konnten Proteinmodifikationen lokalisiert werden und im Rahmen weiterer Arbeiten konnten Proteininteraktionen, funktionelle Bestandteile von Proteinkomplexen und Proteome analysiert werden. Identifizierung und Interaktion von Proteinen In Kooperation mit: I. Hofmann, DKFZ Plakophilin 2 kommt sowohl in den cytoplasmatischen Plaques von Desmosomen als auch in extrahierbarer Form im Nukleoplasma vor. Es konnte gezeigt werden, dass zwei nukleäre Partikel existieren, die Plakophilin2 und die größte Untereinheit von RNA Polymerase III (RPC155) enthalten. [3] In Kooperation mit M. Drobny, Technische Universität Darmstadt Anhand der Modellpflanze Nicotiana tabacum L. wurde auf Proteinebene die Zusammensetzung der Untereinheiten der V- ase untersucht. V-ATPase wurde mit Hilfe Triton X-100 aus Tonoplasten solubilisiert und anschließend immunpräzipitiert. In der gereinigten Fraktion konnten 12 Proteine nachgewiesen werden. Davon konnten 11 Proteine durch MALDI Analyse als die Untereinheiten A, B, C, D, F, G, c d und drei Isoformen der Untereinheit E identifiziert werden. [1] Nachweis der H(+) transportierenden V-ATPase Untereinheit D und von zwei verschieden E-Untereinheiten in Blättern von Kalanchoe daigremontiana. [16] 155

156 156 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung In Kooperation mit K. Zatloukal, Karl Franzens Universität, Graz, Österreich Stress, besonders oxidativer Stress führt bei Zellen zu Fehlern bei der Proteinfaltung, und bei ausbleibender Neufaltung oder ausbleibendem Abbau zur Ausbildung von cytoplasmatischen Aggregaten. Proteinaggregate sind charakteristisch für verschiedene chronisch toxische und degenerative Erkrankungen wie Mallory bodies bei alkoholischer und nicht-alkoholischer Steatohepatitis, neurofibrilläre Ablagerungen bei Alzheimer und Lewy bodies bei Parkinson. Durch 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie konnte p62, neben HSP70, HSP25 und ubiquitinylierten Cytokeratinen, als neue Komponente in Mallory bodies identifiziert werden. [7] Modifikation von Proteinen In Kooperation mit C. Mandal, Indian Institute of Chemical Biology, Kolkata, Indien Humanes C-reaktives Protein (CRP) besitzt klinische Relevanz bei der Diagnose. Verschiedene krankheitsspezifische CRPs zeigen unterschiedliche Molekulargewichte in der Gelelektrophorese. Es konnte gezeigt werden, dass CRP unter bestimmten pathologischen Bedingungen glykosyliert wird. [10] B100 Zentrale Proteinanalytik In Kooperation mit J. Kuhn, Herz- und Diabeteszentrum Nordrhein-Westfalen, Bad Oeynhausen Humane Xylosyltransferase transferiert Xylose von UDP-Xylose auf Proteoglykan Proteine. Rekombinante His-getaggte Xylosyltransferase konnte in löslicher Form in hoher Ausbeute in Insektenzellen exprimiert werden. Das gereinigte, biologisch aktive Protein konnte zur Homogenität gereinigt werden. Der Peptidmassenfingerprint zeigte das erwartete Spektrum. Durch N-terminale Sequenzierung konnte gezeigt werden, dass die Signalsequenz des exprimierten Proteins quantitativ abgespalten wird. [15] In Kooperation mit M. Ott, University of California, San Francisco, USA Das HIV-1 Transaktivatorprotein Tat reguliert die transkriptionelle Aktivität des integrierten HIV-1 Provirus. Dazu bindet Tat an eine charakteristische RNA Struktur am 5 Ende aller HIV-1 Transkripte und erhöht die Elongationseffizienz der RNA Polymerase II durch Rekrutierung des essentiellen ptefb-elongationskomplexes zum Promotor. Zusätzlich interagiert Tat mit zellulären Cofaktoren, darunter die Acetyltransferasen p300/cbp und pcaf, und wird selbst durch p300/cbp an Lysin 50 acetyliert. Die K50- Acetylierung ist notwendig für die transaktivierende Wirkung von Tat auf die HIV-1 Transkription. Mit Hilfe von MALDI TOF MS, proteolytischer Spaltung und Edman Sequenzanalyse wurde auf Peptid- und erstmals auch auf Proteinebene bestätigt, dass K50 die einzige Acetylierungsstelle von p300/cbp in Tat ist. Durch Analyse von Tat Mutantenpeptiden in Kombination mit transienten Transfektionsstudien von 1G5 Zellen und statistischer Auswertung von p300/cbp Substratproteinsequenzen konnten die für die Lysinacetylierung durch p300/cbp kritischen Aminosäurereste charakterisiert und zu potentiellen Substratsequenzen kombiniert werden. Datenbanksuchen mit diesen Sequenzen führten zur Identifizierung neuer Substrate von p300/cbp. Zusätzlich wurde gezeigt, dass K50 in Tat auch von pcaf acetyliert wird, und dass Cysteinreste unabhängig von der umgebenden Peptidsequenz als enzymunabhängige Acetylgruppenakzeptoren fungieren können. Die Vernachlässigung der nichtenzymatischen Cysteinacetylierung kann zur fehlerhaften Interpretation von Acetylierungsstudien führen [11]. Abbildung: MALDI TOF MS Spektrum eines HIV-1 Tat Peptids (MW 1326 Da) nach in vitro Acetylierung. Die einfache Lysinacetylierung bewirkt eine Massenverschiebung von + 42 Da.

157 Proteomanalyse Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung In Kooperation mit F. Schütt, Universität Heidelberg Übermäßige Akkumulation von Lipofuscin in postmitotischen retinalen Pigmentepithelzellen führt zu verschiedenen Formen der Erblindung einschließlich der altersabhängigen Degeneration der Makula (ARMD), welche derzeit die häufigste Ursache für Erblindung bei Patienten jenseits der 50 in den Industrieländern ist. Um die Rolle der Lipofuscin Akkumulation besser verstehen zu lernen, wurden Lipofuscin Granula aus humanen retinalen Pigmentepithelzellen analysiert. Die isolierten Proteine wurden durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit MALDI-TOF Massenspektrometrie und nanolc-esi Massenspektrometrie analysiert. Die gefundenen Proteine umfassen Cytoskelettproteine, Proteine der Phototransduktion, Stoffwechselenzyme, mitochondriale Enzyme, Ionenkanalproteine und Chaperone. [6] In Kooperation mit: D.Schadendorf, DKFZ, P.Sinha, LKH Klagenfurt, Österreich Chemoresistente Zelllinien von Magencarcinom, Pankreascarcinom, Fibrosarkom und Melanom wurden zusammen mit ihren thermoresistenten Entsprechungen etabliert. Mit Hilfe der Proteomanalyse wurden auf der Basis von 2D- Gelelektrophorese und Bildanalyse resistente Melanomzellen untersucht. Um Unterschiede zu finden, wurde das Proteinmuster parentaler Melanomzelllinien mit dem der resistenten Sub-Zelllinien verglichen. Es konnten eine Anzahl von Proteinen identifiziert werden, welche in chemoresistenten Melanomzelllinien überexprimiert waren. [4, 17] Der Gebrauch dreidimensionaler Zellkultur Modelle, sogenannter multizellulärer Tumorsphäroide, ist ein besonderer Ansatz in der experimentellen Krebsforschung, da Sphäroide sowohl strukurell als auch funktional in vivo Tumoren ähnlich sind. Zellen die in Sphäroiden wachsen zeigen Veränderungen im Zellzyklus, der Induktion von Apoptose und Differenzierung und können Multidrogenresistenz ausbilden. Die Proteinexpression humaner colorektaler Krebszellen sowohl als Monolayerkultur als auch als Sphäroidkultur wurde mit Hilfe der Proteomanalyse untersucht. Eine Bildanalyse ergab die Überexpression von 3 Cytokeratin18-Fragmenten. Cytokeratin18 ist als Zielmolekül einer Caspase-vermittelten Spaltung während der Apoptose beschrieben worden. Andere hochregulierte Proteine in Sphäroiden beinhalten Calretikulin Precursor, eine Rho-GDP-Dissoziierungsinhibitor Variante, einige Cytokeratine und Peroxyredoxin 4. Einige dieser Proteine wurden schon bisher mit Chemoresistenz und apoptotischen Phänomenen in Verbindung gebracht. [5] Publikationen (* = externer Koautor) [1] Drobny M*, Schnölzer M, Fiedler S, Lüttge U*, Fischer- Schliebs E*, Christian AL*, Ratajczak R* (2002) Phenotypic subunit composition of the tobacco (Nicotiana tabacum L.) vacuolartype H(+)-translocating ATPase. Biochim Biophys Acta ;1564(1): [2] Gassler N*, Schnölzer M, Rohr C*, Helmke B*, Kartenbeck J, Grünewald S*, Laage R*, Schneider A*, Kränzlin B*, Bach A*, Otto HF*, Autschbach F*. (2002) Expression of calnexin reflects Paneth cell differentiation and function. Lab Invest 82(12), [3] Hofmann I, Schnölzer M, Kaufmann I, Franke WW (2002) Symplekin, a constitutive protein of karyo- and cytoplasmic particles involved in mrna biogenesis in Xenopus laevis oocytes. Mol Biol Cell 13(5), B100 Zentrale Proteinanalytik [4] Poland J*, Schadendorf D, Lage H*, Schnölzer M, Celis JE*, Sinha P* (2002) Study of therapy resistance in cancer cells with functional proteome analysis. Clin Chem Lab Med 40(3), [5] Poland J*, Sinha P*, Siegert A*, Schnölzer M, Korf U, Hauptmann S* (2002) Comparison of protein expression profiles between monolayer and spheroid cell culture of HT-29 cells revealed fragmentation of CK18 in three-dimensional cell culture. Electrophoresis 23(7-8), [6] Schütt F*. Ueberle B, Schnölzer M, Holz F*, Kopitz J* (2002) Proteome analysis of lipofuscin in human retinal pigment epithelial cells. FEBS Lett. 25, 528(1-3), [7] Zatloukal K*, Stumptner C*, Fuchsbichler A*, Heid H, Schnölzer M, Kenner L*, Kleinert R*, Prinz M*, Aguzzi A*, Denk H* (2002) p62 is a common component of cytoplasmic inclusions in protein aggregation diseases. Am J Pathol 160(1), [8] Bauer H*, Gromer S*, Urbani A, Schnölzer M, Schirmer RH*, Müller HM* (2003) Thioredoxin reductase from the malaria mosquito Anopheles gambiae. Eur J Biochem. 270(21), [9] Brandt O, Feldner J, Stephan A, Schröder M, Schnölzer M, Arlinghaus HF, Hoheisel J, Jacob J (2003) PNA microarrays for hybridisation of unlabelled DNA samples. Nucleic Acids Res. 31(19):e119. [10] Das T*,. Sen A*, Kempf T,. Pramanik SR*, Mandal C*, Mandal C* (2003) Induction of glycosylation in human C-reactive protein under different pathological conditions. Biochem.J. 373(2), [11] Dormeyer W, Dorr A, Ott M, Schnölzer M (2003) Acetylation of the HIV-1 Tat protein: an in vitro study. Anal Bioanal Chem 376, [12] Gassler N*, Schneider A*, Kopitz J*, Schnölzer M, Obermüller N*, Kartenbeck J, Otto HF*, Autschbach F* (2003) Impaired expression of acyl-coa-synthetase 5 in epithelial tumors of the small intestine. Hum Pathol. 34(10), [13] Gassler N*, Bohn J*, Schnölzer M, Scheuerer J*, Obermüller N*, Otto HF*, Autschbach F*. (2003) Distinct expression of calnexin in major human salivary glands. Histol Histopathol 18(1), [14] Kaehlcke K, Dorr A, Hetzer-Egger C, Kiermer V, Henklein P, Schnölzer M, Loret E, Cole PA, Verdin E, Ott M (2003) Acetylation of Tat defines a CyclinT1-independent step in HIV transactivation. Mol Cell 12, [15] Kuhn J*, Müller S*, Schnölzer M. Kempf T, Schön S*, Brinkmann T*, Schottler M*, Götting, C*, Kleesiek K* (2003) High-level expression and purification of human xylosyltransferase I in High Five insect cells as biochemically active form. Biochem Biophys Res Commun. 19; 312(3): [16] Ratajczak R*, Pfeifer T*, Drobny M*, Schnölzer M, Lüttge U* (2003) Molecular evidence for the occurrence of H(+)-transporting V-ATPase subunit D and two different forms of subunit E in leaves of the obligate CAM species Kalanchoe daigremontiana. Biologia Plantarum 46(1), [17] Sinha P*, Poland J*, Kohl S*, Schnölzer M, Helmbach H, Hütter G*, Lage H*, Schadendorf D (2003) Study of the development of chemoresistance in melanoma cell lines using proteome analysis. Electrophoresis 24, [18] Straub BK, Boda J, Kuhn C, Schnölzer M, Korf U, Kempf T, Spring H, Hatzfeld M*, Franke WW (2003) A novel cell-cell junction system: The cortex adhaerens mosaic of lens fiber cells. J Cell Sci 116,

158 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B120 Chipbasierte Peptidbibliotheken Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (B120) Leiter: Dr. Volker Stadler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dipl.-Chem. Mario Beyer Dr. Simon Fernandez Dipl.-Phys. Kai König Doktoranden Thorsten Kühlwein Tim Seeberg 158 Herstellung hochkomplexer Peptidarrays V. Stadler, F. Breitling, R. Bischoff Die Arbeiten finden in enger Kooperation mit PD Dr. Frank Breitling (Mitarbeiter: Dr. Thomas Felgenhauser, Dipl.-Biol. Sandra Lüttgau) aus der Abteilung Molekulare Genomanalyse sowie mit PD Dr. Ralf Bischoff (Mitarbeiter: Dipl.-Phys. Alexander Nesterov, Dipl.-Ing. Klaus Leibe) aus der Abteilung Molekulare Biologie der Mitose statt. In einer Zusammenarbeit mit PD Dr. Michael Himmelhaus und PD Dr. Reiner Dahint von der Angewandten Physikalischen Chemie der Universität Heidelberg wird zudem an der Entwicklung eines markierungsfreien Nachweisverfahrens von biospezifischen Bindungsereignissen gearbeitet. Im Unterschied zu Oligonukleotidarrays, die für die Untersuchung des DNA- und RNA-Status eingesetzt werden und damit Rückschlüsse auf unterschiedlich starke Genexpression von Zellen erlauben, zielen Peptidarrays auf den Nachweis von Proteinen und Antikörpern und somit auf die Abbildung des Ist-Zustands eines Organismus ab. Da der Ist-Zustand jedoch nicht ausschließlich durch die Genexpression bestimmt wird, sollten Peptidarrays einen wesentlich direkteren Zugriff auf charakteristische Signalmuster bieten, die z.b. mit einem pathogenen Status einhergehen. Mit den verfügbaren Methoden für die kombinatorische Synthese von Arrays konnten jedoch aufgrund konzeptioneller Nachteile wie die Diffusion von Monomeren bei elektrolytischen Verfahren [Southern et al., US Patent , 1997; Heller et al., US Patent , 1999], eine zu hohe Anzahl der notwendigen Kopplungszyklen in der lithographische Synthese [Fodor et al., Science, 251 (1991), ; Pellois et al., Nat. Biotech., 20 (2002), ] oder die sehr problematische Handhabung von Flüssigkeiten im Nano- bis Picoliterbereich beim Tintenstrahldruck und der SPOT-Synthese [Frank, Tetrahedron, 48 (1992), ; Frank, J. Biotechnol., 41 (1995), ; Kramer et al., Methods, 6 (1994), ] bislang keine Peptidarrays mit mehr als 150 Peptidspots pro cm 2 hergestellt werden. In der Arbeitsgruppe soll ein Verfahren entwickelt werden, das die oben beschriebenen Nachteile umgeht und die Herstellung von Peptidarrays mit Komplexitäten von > 375 cm -2 mit Hilfe eines speziellen Laserdruckers bzw. von > cm -2 mit Hilfe eines CMOS Chips ermöglichen soll. Den Kernpunkt des Verfahrens stellen elektrostatisch aufladbare Monomerpartikel dar, die die Bausteine für die kombinatorische Peptidsynthese in Form von aktivierten Fmoc-Aminosäuren enthalten [1]. Die Partikel bestehen im Wesentlichen aus einem Matrixmaterial (z.b. Diphenylsulfoxid), das bei Raumtemperatur fest ist und bei Temperaturen von C schmilzt, wobei es dann die Monomere freisetzt und als Lösungsmittel für die kombinatorischen Synthese dient (Abb. 1). Weitere Additive sind so genannte CCAs (charge control agents), CS (charge stabilizer) und Abb. 1: Prinzip der Monomerpartikel Antibackmittel (z.b. Silicapartikel, Aerosile), die eine kontrollierte, triboelektrische Aufladung gewährleisten bzw. eine Agglomeration der mikrometergroßen Monomerpartikel verhindern [2]. Die Partikelherstellung erfolgt durch Mahlen einer glasartigen Schmelze mit einer Luftstrahlmühle bzw. mit Hilfe des RESS-Verfahrens (rapid expansion of supercritical solutions [Matson et al., Ind. Eng. Chem. Res.,26 {1987}, ]) durch Abscheidung aus überkritischem CO 2. Mit beiden Methoden konnten bereits Monomerpartikel mit einer engen Größenverteilung unterhalb von 10 µm hergestellt werden. Grundsätzlich erlaubt die Trennung von Partikelherstellung, Adressierung und chemischer Kopplung eine einfachere Handhabung und Reaktionskontrolle im Vergleich zu den oben aufgeführten alternativen Methoden. Die Adressierung der Monomerpartikel auf einen Träger erfolgt durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den elektrisch geladenen Partikeln und einem Ladungsmuster auf einem Träger. Das Ladungsmuster wird entweder durch die LED-Zeilen eines Laserdruckers und die daraus folgende strukturierte Belichtung einer vorgeladenen Photowalze oder aber durch ein Array von Pixelelektroden auf einem CMOS Chip [3] generiert. Entsprechend erfolgt die Aufladung der Partikel in einer Tonerkartusche (Laserdrucker) oder in einem Partikelaerosol (CMOS Chips). Mit dem Laserdrucker konnten bereits Aminosäurespots in einer Auflösung von bis zu 736 cm -2 gedruckt werden (Abb. 2), während beim CMOS Chip zunächst Simulationen der elektrostatischen Felder Aufschluss über das zu wählende Chipdesign geben sollen. Die Herstellung von Peptidarrays soll letztendlich dadurch ermöglicht werden, dass zunächst eine erste Schicht aller verschiedenen Monomerpartikel nacheinander auf dem Träger ortsaufgelöst abgelegt wird. Die Kopplungsreaktion wird nun gleichzeitig durch definiertes Schmelzen der Partikel ermöglicht, wobei nach routinemäßigen Syntheseschritten nach Merrifield eine erste Schicht aller verschiedenen Aminosäuren an den Träger angebunden wird. Darauf kann wiederum ortsaufgelöst eine zweite, dritte usw. Schicht aller verschiedenen Monomerpartikel adressiert werden, bis schließlich die vollständige Peptidbibliothek z.b. in Form von

159 Forschungsschwerpunkt B Funktionelle und Strukturelle Genomforschung B120 Chipbasierte Peptidbibliotheken [4] V. Stadler, Hochdurchsatzverfahren zur bioanorganischen Katalyse, Nachwuchswettbewerb Nanotechnologie, Bundesministerium für Bildung und Forschung, [5] R. Bischoff, F. Breitling, R. Wallich*, A. Poustka, V. Stadler, F. Breitling, Borrelien Peptidomarrays, Förderung der Medizintechnik Innovationswettbewerb, Bundesministerium für Bildung und Forschung, Abb. 2: Aminosäurespots nach Laserdruck der Monomerpartikel und Kopplung einander überlappender Bruchstücke von Proteinen aufgebaut ist. Die Anzahl der notwendigen Kopplungszyklen entspricht bei dieser Methode der Länge der synthetisch herzustellenden Peptide. Zunächst werden 15-20mere Einheiten angestrebt, da gezeigt wurde, dass in vielen Fällen die Strukturinformation zur Wechselwirkung mit Bindungspartnern auch in den entsprechenden Oligomeren erhalten bleibt. Mit den Peptidarrays sollen verschiedene Anwendungsbereiche abgedeckt werden: Es soll mit Hilfe der Peptidarrays ein Verfahren zur Hochdurchsatzsuche nach bioanorganischen Katalysatoren entwickelt werden, indem potenziell katalytische Metallzentren durch Komplexbildung in die Peptide integriert werden sollen [4]. Sowohl die Synthese der bioanorganischen Katalysatoreinheiten als auch die Auslese von katalytischen Ereignissen sollen auf dem CMOS Chip vereinigt werden. Eine Nutzung der Peptidarray-Technologie für die biomedizinische Forschung (Suche nach Diagnostika und Therapeutika) soll in Kooperation mit den Arbeitsgruppen von PD. Dr. Frank Breitling und PD. Dr. Ralf Bischoff erfolgen. Es gilt hier, die Gestaltung der Arrays an die Bedürfnisse des jeweiligen Anwenders anzupassen, der z.b. das Proteom von Malaria- oder Borreliose-Erregern [5] hinsichtlich biospezifischer Wechselwirkungspartner untersuchen möchte. Ferner wird in Zusammenarbeit mit der Angewandten Physikalischen Chemie an der Entwicklung eines markierungsfreien Nachweisverfahrens von biospezifischen Bindungsereignissen mit Hilfe von core-shell-goldnanopartikelschichten sowie an der Entwicklung von proteinresistenten Oberflächen zur Vermeidung von unspezifischer Proteinadsorption gearbeitet. Publikation (* = externer Koautor) [1] A. Poustka, F. Breitling, K.H. Gross, S. Dübel*, R. Saffrich*, Verfahren und Vorrichtungen zum Aufbringen von Substanzen auf einem Träger, insbesondere von Monomeren für die kombinatorische Synthese von Molekülbibliotheken, WO Patent /A2 (1999). [2] F.R. Bischoff, V. Stadler, F. Breitling: Hochkomplexe Peptidarrays Techniken, Anwendungen und Perspektiven. BIOspektrum, 5 (2002), [3] F. Breitling, Verfahren und Anordnung zum Anbringen von in Transportmittel immobilisierten Substanzen sowie Monomerpartikel, DE Patent /A1 (2001).

160 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Übersicht Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Sprecher: Prof. Dr. Kari Hemminki 160 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C010) Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch Tel.: , FAX h.bartsch@dkfz.de Klinische Epidemiologie (C020) Prof. Dr. Nikolaus Becker (kommissarisch) Tel.: , FAX n.becker@dkfz.de Umweltepidemiologie (C030) Prof. Dr. sc. math. Jürgen Wahrendorf Tel.: , FAX j.wahrendorf@dkfz.de Genetische Veränderungen in der Karzinogenese (C040) Dr. Monica Hollstein PhD Tel.: , FAX m.hollstein@dkfz.de Molekular-Genetische Epidemiologie (C050) Prof. Kari Hemminki, MD, PhD Tel.: , FAX k.hemminki@dkfz.de Biostatistik (C060) Dr. Lutz Edler Tel.: , FAX edler@dkfz.de Die einmalige Rolle des DKFZ in der Krebsursachen und -präventionsforschung in den letzten 20 Jahren ist in der Wissenschaftsgemeinschaft und den öffentlichen Gesundheitsorganisationen Deutschlands anerkannt. Ausgewählte, besonders relevante Krebsrisiko- und Abwehrfaktoren, zusammen mit Gen-Umweltfaktoren wurden mit Hilfe epidemiologischer, pathologischer und molekular-toxikologischer Methoden untersucht. Diese Methoden bilden, zusammen mit den deskriptiven Daten der Krebssterblichkeitsrate bei Krebs in Deutschland (Deutscher Krebsatlas) eine Basis für einen rationalen Ansatz in der Krebsprävention. Das DKFZ hat eine führende Position errungen bezüglich großer (EUfinanzierter) Multi-Center-Studien, z. B: European Prospective Study into Cancer and Nutrition (EPIC) in Epidemiologie, sowie auf dem Gebiet der Ernährungswissenschaft, Biostatistik und Anwendung von Biomarkern. Es bestehen Kooperationen zur Grundlagenforschung im DKFZ und zu Einrichtungen außerhalb des DKFZ. Außerdem wurde eine neue Abteilung, die Molekular-Genetische Epidemiologie, gegründet. In Deutschland werden jährlich ca Krebserkrankungen festgestellt und ca Patienten sterben pro Jahr. Die derzeitigen Forschungsergebnisse der Molekularbiologie versprechen große Fortschritte in der Krebsprävention, Diagnose und Therapie. Das Forschungsprogramm Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ist gerichtet auf die Identifizierung der Risikofaktoren (Primärprävention), die Frühdiagnose (Screening) und die Faktoren, die den Krankheitsfortschritt aufhalten (Chemoprävention). Diese wurden durch die Erforschung der Mechanismen der Krebsentwicklung unterstützt. Unter realistischen Gesichtspunkten könnten bis zu 30% neuer Krebsfälle innerhalb einer Zeitspanne von 20 bis 30 Jahren verhindert werden. Um dieses Ziel zu erreichen sind die Hauptanstrengungen auf folgende Punkte gerichtet: Zusammenführung von Laborforschung, Epidemiologie und klinischer Studien unter Nutzung breit angelegter molekularer, genetischer und epidemiologischer Methoden; Aufbau und Ausweitung von biologischen Probensammlungen und Datenbanken; Verbesserung der bereits bestehenden Aktivitäten in europäischen und internationalen kollaborativen Studien. Zu diesem Zweck wurden im Forschungsschwerpunkt drei neue Abteilungen gegründet: Molekular-Genetische Epidemiologie (seit 2002), Klinische Epidemiologie (seit 1999) und Genetische Veränderungen in der Karzinogenese und international reputierte Wissenschaftler als Abteilungsleiter eingesetzt. Die neuen Prioritäten und Richtungen des Forschungsschwerpunktes C beinhalten: volle Integration der proteomics/genomics und der sensitiven Biomarker der Krebsforschung in die epidemiologischen und klinischen Studien über Krebsursachen und Prävention; Studien zur Etablierung kausaler Beziehungen und zur Aufklärung, wie Diätfaktoren die zellulären/molekularen Aspekte des Prozesses der Karzinogenese beim Menschen modifizieren (unentbehrlich für die Umsetzung rationaler Studien zu Diätregeln in der Bevölkerung);

161 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Übersicht Forschung und Qualitätskontrolle neuer Screening-Tests und Krebs-Screening Programme; Charakterisierung neuer sicherer chemopräventiver Medikamente und ihrer Wirkungsart, umgesetzt durch ein intensives interdisziplinäres Forschungsnetzwerk in der Krebsprävention zur Sicherstellung der Wirksamkeit und Sicherheit neuer prophylaktischer Kräfte; Forschung auf dem Gebiet der Biostatistik und des methodischen Consulting, Bereitstellung von Prärequisiten zur Aktualisierung der experimentellen/klinischen Studien und Analysen, die breit angelegte, komplexe genomische und proteomische Datenreihen beinhalten. Die Forschungsaktivitäten in der Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren umfassen die Aufklärung von umweltbezogenen Risikofaktoren und Studien über Wechselwirkungen von kanzerogenen Stoffen mit erworbenen oder geerbten Wirtsfaktoren (genetische Disposition) beim Menschen. Insbesondere werden molekulare Mechanismen untersucht, wie chronische Infektionen bzw. entzündliche Prozesse zu Krebs führen oder die Krebsentstehung beschleunigen. Die Hauptziele der Abteilung sind daher: (a) Identifizierung von exogenen und endogenen Krebsrisikofaktoren und Aufklärung ihrer Wirkmechanismen, (b) Charakterisierung krebsvorbeugender Stoffe und Nachweis ihrer Effizienz in vorklinischen und klinischen Studien, (c) Entwicklung und Validierung neuer Methoden und Biomarker für molekularepidemiologische Studien zur Krebsätiologie und -prävention auf der Basis der gewonnenen mechanistischen Erkenntnisse, (d) Initiierung und Beteiligung an solchen Studien mit klinischen Kooperationspartnern durch Beiträge zur Planung und Vermessung von human Gewebs- und Blutproben. Damit sollen die Voraussetzungen für eine effiziente Prävention von Krebserkrankungen durch Eliminierung der Risikofaktoren, Unterbrechung der Krankheitsentwicklung (Chemoprävention) oder Auffinden von Risikogruppen mit erhöhter Krebsdisposition geschaffen werden. Die Abteilung Klinische Epidemiologie untersucht in der Hauptsache ernährungsbedingte, hormonelle, lebensstilbezogene und umweltbedingte Krebsrisikofaktoren und deren Zusammenspiel mit genetischer Veranlagung. Auch andere ätiologische Faktoren, wie z.b. soziale, ökonomische und medizinische Faktoren werden in die Projekte miteinbezogen. Insbesondere wird in der Abteilung die EPIC-Studie betreut, eine groß angelegte prospektive Studie zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Krebs. Abgesehen von der Erforschung von Risikofaktoren umfasst die Bandbreite der Aktivitäten innerhalb der Abteilung auch deskriptive epidemiologische Arbeiten, wie z.b. den Krebsatlas, und die Evaluation neuer statistischer Ansätze in Bezug auf epidemiologische Beobachtungsstudien. Weitere Studien zielen auf methodologische Entwicklungen in der Prävention ab wie z.b. Screening und auf Fortschritte im Hinblick auf epidemiologische Beiträge zur klinischen Forschung. Die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie hat es sich zur Aufgabe gemacht, die Bedeutung verschiedener Umweltfaktoren, wie z. B. elektromagnetische Felder, körperliche Aktivitäten und berufsbedingte Noxen, in Zusammenhang mit der Entstehung unterschiedlicher Krebserkrankungen zu untersuchen. Ein Schwerpunkt der inhaltlichen Forschungstätigkeiten ist zur Zeit die Untersuchung ätiologischer Risikofaktoren für Hirntumoren. In diesem Zusammenhang wird der Einfluss von elektromagnetischen Feldimmissionen, die u.a. durch die Nutzung von mobilen Kommunikationseinrichtungen (wie z.b. Handys ) auftreten, von beruflichen Risikofaktoren und von Viren auf die Entstehung von Gliomen, Meningeomen und Akustikusneurinomen untersucht. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt auf der Untersuchung des Einflußfaktors körperliche Aktivität, der für verschiedene Krebsarten als protektiver Faktor diskutiert wird. Hierbei stehen derzeit Studien zur Entstehung von Brustkrebs und Kolorektalkarzinomen sowie methodische Studien zur Verbesserung und Validierung der Erfassung von körperlicher Aktivität im Vordergrund. Des weiteren wird in einer virologisch-epidemiologischen Studie in Zusammenarbeit mit der Abt. Tumorvirologie des DKFZ die Bedeutung einer Infektion mit adeno-assoziierten Viren auf den Schwangerschaftsverlauf und die Entwicklung des Embryos untersucht, da diese Viren u.a. als Vektoren im Rahmen der Tumortherapie diskutiert werden. In Kooperation mit der Universität Mainz werden Daten des Mainzer Kindergeburten-Registers im Hinblick auf angeborene Fehlbildungen und mögliche ätiologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus soll die Prävalenz onkologischer Erkrankungen bei Kindern mit Fehlbildungen ermittelt werden. Methodisches Interesse besteht zudem in der Fortentwicklung statistischer Verfahren in der Epidemiologie sowie in der Durchführung von Quantitativen Risikoabschätzungen. Deren Ziel ist es, aus den Ergebnissen von epidemiologischen Studien konkrete Aussagen zu dem Gefährdungspotential verschiedener Risikofaktoren in einer bestimmten Bevölkerung abzuleiten. Derartige Untersuchungen stellen eine wichtige Basis für Entscheidungen im Öffentlichen Gesundheitswesen dar. Ziel der Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese ist es, Veränderungen der DNA-Sequenz und von Genexpressionsmustern, die mit der Entstehung von Krebs assoziiert sind, bei Karzinomen, frühen neoplastischen Läsionen, und Tumorzellinien zu charakterisieren. Expressionsprofile von Tumoren geben Informationen über die Signaltransduktionswege und die Teile des biologischen Netzwerks, die Zellwachstum, -differenzierung, und -tod kontrollieren, und öffnen Wege für neuartige Diagnosemethoden, Chemopräventionsmethoden und therapeutische Strategien. Ein weiteres Ziel dieser Abteilung ist es, genetisch hergestellte Mäusestämme mit einer vorgegebenen molekularen Veränderung (z.b. inaktivierende Punktmutation im p53 Tumorsuppressorgen), die typisch für Krebszellen sind und zum malignen Wachstum beitragen, zu entwickeln. Diese Mäuse-Modelle sollen die Entwicklung und die vorklinische Evaluierung in vivo von maßgeschneiderten Pharmazeutika gegen spezifische molekulare Veränderungen in menschlichen Krebszellen vorantreiben. Verwandte Mausstämme, die menschliche Gene beherbergen, werden eingesetzt, um einerseits Hypothesen über den Ursprung spezifischer genetischer Defekte in menschlichen Krebszellen, andererseits endogene und umweltbedingte Krebsrisikofaktoren und Mechanismen, die schädliche Änderungen in der DNA-Sequenz hervorrufen, zu untersuchen. Ziel der Abteilung Molekular-Genetische Epidemiologie ist die Erforschung der vererbbaren und umweltbedingten Ursachen des Krebses. Dies wird auf zwei unterschiedliche Weisen erreicht: 1) Charakterisierung des Familienrisikos in einer großen Datenbank mit Hilfe genetisch-epidemiologischer Methoden; 2) Analyse biologischer Proben von Krebspatienten durch molekular-genetische Methoden. Die genetisch-epidemiologische Analyse liefert Daten über Krebs- 161

162 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Übersicht 162 risiken, genetisch bedingte und Umweltkomponenten, Art und Weise der Vererbung und letztlich den Wegweiser für die Identifikation von Personen für molekulare Krebsstudien. Familiäre Effekte auf individuelle Krebsarten beinhalten Brust-, Prostata- und Melanoma. Ebenso wurden Veränderungen im Krebsrisiko auf die Immigration aufgedeckt. Das Hauptaugenmerk der molekularen Epidemiologie ist auf die Analyse von Polymorphismen (SNPs) in krebsverwandten Genen bei Patienten und Kontrollpersonen gerichtet. Zusätzlich zu den Studien der in Frage kommenden Gene entwickeln wir neue Methoden für die populationsgerichtete Genidentifikation. In Melanoma weisen die Kontrollregulatoren des G1/S Zellzyklusses häufig Abweichungen auf, weshalb wir den Lokus des p16 Gens untersuchen und die Rolle von BRAF und N-RAS klären wollen. Die Zentrale Einheit Biostatistik ist eine Zentrale Einrichtung des Zentrums und wurde im Berichtszeitraum mit ihrem Forschungsprogramm dem Forschungsschwerpunkt C zugeordnet. Die Aufgaben liegen in der Beratung und der Forschung auf dem Gebiet biostatistischer Methoden und ihrer Anwendung in der Krebsforschung mit dem Ziel, durch Einsatz und Weiterentwicklung biometrischer und statistisch quantifizierender Verfahren in der experimentellen und klinischen Krebsforschung einen Beitrag zur Verhütung, Entdeckung und Behandlung von Krebskrankheiten zu leisten. Als Bindeglied zwischen den methodischen Fächern auf der einen und in der Krebsforschung arbeitenden biomedizinischen Fächern auf der anderen Seite ist die Biostatistik mit computergestützter Beratung, projektbegleitender Mitarbeit und statistischer Methodenforschung befasst. Schwerpunkte der Forschungs-und Entwicklungsarbeiten liegen auf den Gebieten der Entwicklung effizienter und unverfälschter Verfahren für die Analyse von Genom- und Proteomdaten, der statistischen Modellbildung Beschreibung und Erklärung von Mechanismen der Krebsentstehung, der Methoden der quantitativen Risikobewertung, Entwicklung moderner Methoden der rechnergestützten Datenanalyse und -präsentation und der Optimierung der biometrischen Versuchsplanung in der experimentellen und in der klinischen Onkologie.

163 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C010) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Matthias Bartelmann (- 6/02) Dr. Barbara Bertram Dr. Heike Dally Dr. Norbert Frank Dr. Clarissa Gerhäuser Dr. Ragna Hussong (10/03 -) Dr. Reinhold Klein (- 10/03) Dr. Jagadeesan Nair Dr. Claudia Mayer Dr. Urmila Nair Prof. Dr. Hans Osswald Dr. Robert W. Owen Dr. Beate Pfundstein (9/03 -) PD Dr. Odilia Popanda Dr. Angela Risch Dr. Margarita Rojas (- 8/02) Dr. Hans-Rudolf Scherf (- 4/02) Dr. Peter Schmezer Dr. Bertold Spiegelhalder Dr. Gisela Werle-Schneider Gastwissenschaftler Dr. Dorota Butkiewicz (10/02-4/03) Amira Gamal Eldeen (- 2/02) Dr. Nikolai Hadjiolov (3-5/03) Hui Huang (3/03-) Emma Humphreys (6-7/02) Dr. Roger Godschalk (- 11/02) Kyoung-Ho Lee (6-8/03) Dr. Xin Sun Somkid Sitthimonchai (- 9/02) Dr. Maria Teresa Salles Trevisan (7/02 -) Yuttana Sudjaroen (12/02-9/03) Doktoranden Elisabeth Bertl Katrin Frerk (7/03 -) Kai Gassner (- 7/02) Claudia Haas (2/03-8/03) Jörg Hümmerich Jens Marquardt (2/03 -) Lydia Pan (8/02 -) Gerlinde Pappa (10/03 -) Chi Tai Phong Torsten Schattenberg Inge Schönffeldt Patrick Schweizer Sabine Stöckigt (3/03 -) Andreas Wölfelschneider (12/03 -) Changping Xie (- 6/03) Beate Breitschopf Diplomanden Anja Stroloke (10/02 -) Praktikanten Maike Lichtenberg (5-6/03) Stephanie Flipo (7-9/03) Assistenz/technisches Personal Ursula Bollow Christel Ditrich (- 8/03) Reinhard Gliniorz Roswitha Haubner Birgit Jäger Karin Klimo Jutta Knauft Regina Merkel (- 2/02) Barbara Mostermann (9/02-6/03) Regina Peichl (7/02 -) Ulrike von Seydlitz-Kurzbach Peter Waas Gerd Würtele Otto Zelezny Auszubildende Karin Schüßler (- 2/02) Kai Doberstein (- 11/02) Sekretariat Susanna Fuladdjusch Die Hauptziele der Abteilung sind: (a) Identifizierung von exogenen und endogenen Krebsrisikofaktoren und Aufklärung ihrer Wirkmechanismen, (b) Charakterisierung krebsvorbeugender Stoffe und Nachweis ihrer Effizienz in vorklinischen und klinischen Studien, (c) Entwicklung und Validierung neuer Methoden und Biomarker für molekularepidemiologische Studien zur Krebsätiologie und -prävention auf der Basis der gewonnenen mechanistischen Erkenntnisse, (d) Initiierung und Beteiligung an solchen Studien durch Beiträge zur Methodik und Planung. Damit sollen die Voraussetzungen für eine effiziente Prävention von Krebserkrankungen durch Eliminierung der Risikofaktoren, Unterbrechung der Krankheitsentwicklung (Chemoprävention) oder durch Auffinden von Risikogruppen mit erhöhter Krebsdisposition geschaffen werden. Viele der Forschungsaktivitäten in der Abteilung fallen unter Biomarkerentwicklung, Validierung und deren Anwendung in Humanstudien (Abb. 1). Dadurch sollen (a) neue Quellen der Karzinogenexposition identifiziert werden, insbesondere solche, die durch endogene (entzündliche) Prozesse entstehen, (b) die Exposition der Bevölkerung mit Hilfe von Markern der Schadstoffexposition und genetischen Disposition abgeschätzt werden um damit Hochrisikogruppen zu identifizieren und schließlich (c) die Wirksamkeit präventiver Maßnahmen z.b. durch Intervention mit chemopräventiven Substanzen verifiziert werden. Mitte 1996 wurden die Aktivitäten zur sekundären Krebsprävention in der Abteilung intensiviert. Da chemopräventive Substanzen strukturell heterogen sind und unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen, werden neue vielversprechende Naturstoffe und synthetische Analoga identifiziert und bewertet. Letztendlich soll der Nachweis ihrer präventiven Wirksamkeit beim Menschen, zuerst z.b. bei Patienten mit Dysplasien und später in der Allgemeinbevölkerung erbracht werden. Somit sind die Fernziele Charakterisierung und Erprobung neuer, wirksamer chemopräventiver Substanzen mit geringer Langzeittoxizität und verstärkte interdisziplinäre Forschungsaktivitäten: 1. Durchführung klinischer Versuche an zugänglichen Dysplasien mit wiederholter, direkter Kontrolle nach Behandlung mit bekannten und neuen antidysplastischen Arzneimitteln, 2. Entwicklung und Validierung krebsprädiktiver Biomarker für schwer zugängliche Dysplasien, 3. Entwicklung neuer antidysplastischer Substanzen von hoher präventiver Wirksamkeit bei mehreren unterschiedlichen Organdysplasien. Zur Intensivierung der Zusammenarbeit zwischen Grundlagenforschern, Klinikern und Epidemiologen auf dem Gebiet der Krebsursachen- und Krebspräventionsforschung wurden 2002/2003 folgende multidisziplinären Veranstaltungen abgehalten: Internationaler Workshop Biological Basis of Sensitivity to Ionizing Radiation, P. Schmezer, O. Popanda, G. Werle-Schneider, H. Bartsch in Zusammenarbeit mit: J. Chang-Claude, Klinische Epidemiologie, DKFZ und J. Debus, Strahlentherapeutische Onkologie, DKFZ; gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter (Mai 2003). Symposium: Prevention of degenerative diseases; clues from studies investigating oxidative stress [2], Brussels, J. Nair, gefördert von der Helmholtz Gemeinschaft, Bonn als Teil einer Konferenz der Europäischen Kommission zum Start des 6. EU-Rahmenprogramms (FP-6) (November 2002). Symposium: Exocyclic DNA adducts: formation, repair and biological effects [3], Warschau, H. Bartsch und B. Tudek, als Teil der 32. Tagung der EMS, DNAdamage and repair - fundamental aspects and contribution to human disorders (September 2002). 163

164 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 164 Abb. 1 Biomarker in der Humankarzinogenese zur Anwendung in der molekularen Epidemiologie und in klinischen Studien [1]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Bartsch, H.: Studies on biomarkers in cancer etiology and prevention: a summary and challenge of interdisciplinary research. Mutation Research 462 (2000) [2] Nair, U., Bartsch, H., Nair, J.: Meeting Report: Prevention of degenerative diseases; clues from studies understanding oxidative stress. Mutagenesis 18 (2003) [3] *Tudek, B., *Boiteux, S., *Bebenek, K., *Shinagawa, H., *Ciesla, Z., Bartsch, H., *Janion, C., *Laval, J., *van Zeeland, A.A., *Mullenders, L.F.H., *Szyfter, K., *Collins, A., *Kruszewski, M.: Meeting Report 32 nd Annual Meeting of European Environmental Mutagen Society DNA Damage and Repair Fundamental - Aspects and Contribution to Human Disorders. DNA Repair 2 (2003) Chemoprävention (C010-2) C. Gerhäuser, N. Frank, R. Hussong, C. Xie, E. Bertl, L. Pan, G. Pappa, S. Sittimonchai, K. Klimo, J. Knauft, R. Peichl, B. Mosterman, M. Lichtenberg, S. Flipo Zusatzfinanzierung: Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauereiwirtschaft e.v.: Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken); Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken); Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken)/Prof. W. Back (TU München); BMBF Nutrition-Net: Dr. C. Gerhäuser/Dr. N. Frank; EU Seahealth: Dr. C. Gerhäuser/ Dr. N. Frank; DFG Flavo-Net: Dr. C. Gerhäuser/Dr. N. Frank 1. Identifizierung und Entwicklung neuer chemopräventiver Verbindungen: Programmüberblick Die Krebsentstehung, die grob in die Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase unterteilt wird, kann als kontinuierliche Anhäufung von genetischen oder biochemischen Zellschäden angesehen werden. Zur Identifizierung und Beurteilung neuer krebs-chemopräventiver Naturstoffe und synthetischer Verbindungen wurden in den Schwerpunktbereichen Metabolismus, Antioxidantien, Hemmung der Tumorpromotion, der Zellproliferation und von Entzündungsprozessen verschiedene Testmodelle als Markersysteme für chemopräventive Aktivität im Labor etabliert [1]. Diese Modelle, die meist im 96-Lochplatten-Format mit Enzympräparationen oder in Zellkultur mit photometrischer, fluorimetrischer oder radioaktiver Endpunktbestimmung durchgeführt werden, ermöglichen die Untersuchung einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit (1-3 Tage), ohne dass wie im High-Throughput-Screening die Kontrolle über substanzspezifische Charakteristika (z.b. Löslichkeit, toxische Effekte) verloren geht. Vorteile sind ein geringer Substanzbedarf, einfache Durchführung, vergleichbar geringe Kosten, und die Generation von Daten in computerisierter Form, die eine schnelle, halbautomatische Auswertung der Ergebnisse ermöglichen. Als Link zwischen Kurzzeit in vitro und Langzeit in vivo Modellen wurde ein Maus Brustdrüsen Organkulturmodell (Mouse Mammary Gland Organ Culture Model, MMOC) eingesetzt. Diese Kombination ermöglicht die Auswahl der erfolgversprechendsten Substanzen für in vivo Untersuchungen [2]. 2. Identifizierung neuer Leitstrukturen In Zusammenarbeit mit R. W. Owen (DKFZ), C. Zidorn, R. Spitaler, H. Stuppner, E.-P. Ellmerer-Müller (Institut für Pharmazie und Organische Chemie, Universität Innsbruck), und N.B. Perry (Department of Chemistry, University of Otago, Dunedin, New Zealand), E. Wollenweber (Technische Universität, Darmstadt), und F. Stevens (Oregon State University, Corvallis, OR, USA), H. Becker (Universität des Saarlandes, Saarbrücken), und H. Dietrich ( Institut für Ökologie und Getränkeforschung, Forschungsanstalt Geisenheim), F. D. Horgen (Hawaii Pacific University, Honolulu, Hawaii), K. Dittmann und M. Hamburger (Institut für Pharmazie, Friedrich-Schiller-Universität Jena). In den oben beschriebenen Testsystemen wurden Naturstoffe und synthetische Analoge, Extrakte und Subfraktionen von Nahrungsbestandteilen (z.b. Apfelsaft, Johannisbaumbrot-Extrakt Caromax, Schwarzwurzel Scorzonera hispanica L., Bier), Heilpflanzen (z.b. Iris germanica L., Humulus lupulus L., Salvia militiorrhiza Bunge), Algen (z.b. Gracilaria salicornica, Dictyota, Fucus vesiculosus), Schwämmen (z.b. Spirastrella vagabunda, Cacospongia), Pilzen und Lebermoosen getestet. Apfelsaft ist reich an Phenolkarbonsäuren (z.b. Chlorogensäure). Darüber hinaus finden sich im Apfelsaft Catechine, spezifische Chalcone (Phloretin Glycoside), und Flavonoide (Quercetin Glycoside). Wir konnten zeigen, dass Apfelsaft- Extrakte und Fraktionen in einem Konzentrationsbereich unter 10 µg/ml ein starkes antioxidatives Potential gegenüber Peroxyl- und Superoxid Anion-Radikalen besitzt, die in der Krebsentstehung von Bedeutung sind. Außerdem konnte durch die Hemmung des Phase I Enzyms Cyp1A1 ein Einfluss auf die Aktivierung von Karzinogenen sowie über die Inhibition der Aromatase (Cyp 19) eine anti-östrogene Wirkung nachgewiesen werden. In höheren Konzentrationen hemmten einige Fraktionen auch die Cyclooxygenase 1 (Cox-1), hatten jedoch nur wenig Einfluss auf die Proliferation verschiedener Kolonkarzinomzelllinien. Weitere Untersuchungen der Wirkmechanismen und der chemopräventiven Wirksamkeit in einem genetischen Darmkrebsmodell in Min Mäusen sind geplant (finanziert durch das BMBF Netzwerk-Projekt Nutrition-Net). Ein ähnliches Wirkprofil wie beim Apfelsaft konnten wir bei Fraktionen des Johannisbrotbaums (Caromax ) beobachten, für die als Inhaltsstoffe Gallussäure und Gallotannine, einfache Phenolkarbonsäuren wie Zimtsäure, sowie Flavonoide (Myricetin und Quercetin Glykoside) beschrieben wurden [3]. Bei der anti-oxidativen Wirkung bzw. der Hemmung von Cyp1A und der Aromatase dominierten die Gallussäure, die 42% (1.6g/kg) der extrahierbaren Polyphenole ausmachte, und die Flavonoide (26%), während die übrigen Inhaltsstoffe weniger aktiv waren. Tyrolobibenzyle aus der Schwarzwurzel stellen eine neue Klasse von Naturstoffen dar, erwiesen sich im Screening

165 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention auf chemopräventive Aktivität jedoch als wenig interessant [4]. Seit Jahrhunderten wird der Wurzelstock verschiedener Irisarten aufgrund seiner emetischen, kathartischen, diuretischen, stimulierenden, expektorierenden und Niesreiz auslösenden Eigenschaften in der Volksheilkunde eingesetzt. Aus Iris germanica Rhizomen wurden die sechs Isoflavonoide Irisolidone, Irisolidone-7-O-α-D-glucosid, Irigenin, Irilone, Iriflogenin und Iriskashmirianin isoliert und auf chemopräventive Wirkung hin untersucht. Die interessanteste Aktivität war die Hemmung von Cyp1A1 mit IC 50 Werten um 1µM [5]. Das Rhizom von Salbei (Salvia militiorrhiza Bunge) wird in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung koronarer Herzerkrankungen verwendet. Wir untersuchten den Einfluss eines Salbeiextraktes und daraus isolierter Diterpenen von Abietan Typ (Tanshinon I, Tanshinon II, Dihydrotanshinon, Cryptotanshimon) auf anti-inflammatorische Wirkung (Hemmung der Induktion der induzierbaren Stickoxid Synthase inos). Alle Verbindungen außer Tanshinon II waren mit IC 50 Werten von 2.1 bis 13.5µM aktiv. Darüber hinaus wurden die Substanzen als sehr potente Hemmstoffe von Cyp1A1 mit IC 50 Werten von 0.02 bis 0.17 µm identifiziert (Dittmann Doktorarbeit Universität Jena, Publikation in Vorbereitung). Marine Algen und Schwämme stellen eine interessante Quelle für neue Leitstrukturen dar. Bei der aktivitätsgeleiteten Fraktionierung der essbaren Rotalge Gracilaria salicornica konzentrieren wir uns auf die Induktion der NAD(P)H:Chinon Reduktase (QR) sowie die Hemmung der Cyp1A1 und der Cyclooxygenase 1 Aktivität, weil der Rohextrakt in diesen Systemen die besten Wirkungen zeigte. Die Isolierung der aktiven Wirkprinzipien ist noch nicht abgeschlossen (Horgen et al., in Vorbereitung). 3. Potentielle chemopräventive Wirkung von polyphenolischen Bierinhaltsstoffen In Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken. Finanziert von der Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft Bier enthält eine Vielzahl von phenolischen Verbindungen. Während des Brauvorgangs werden einige dieser Verbindungen durch Behandlung des Biers mit Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) entfernt, um Trübungen während der Lagerung zu vermeiden. Wir untersuchten die phytochemische Zusammensetzung des PVPP Retentats sowie von unstabilisiertem Bier und isolierten insgesamt 51 Verbindungen verschiedener struktureller Klassen, u.a. Benzoe- und Zimtsäure Derivate, Acetophenone, Flavonoide (Chalcone, Flavanone, Flavone, Flavan-3-ole, und Proanthocyanidine). Acht Strukturen stellen neue Naturstoffe dar: 2-(4 -Hydroxyphenyl)-3,5-Dihydroxybenzoesäure, 2 -(4 -Hydroxyphenyl)isoferulasäureester, 1,2,5,7-Tetrahydroxyanthrachinon und 4,7-Dihydroxy-5-(2,4,6 -Trihydroxyphenyl)-Indan-1,2-Dion aus dem PVPP Retentat, und Catechin-7-O-β-(6 -O-Nicotinoyl)-β-D-Glucopyranosid, ent-epigallocatechin-(4α- 8, 2α- O- 7)Catechin, ent-epigallocatechin (4α- 6, 2α- O- 7)Catechin and 2,3-cis-3,4-trans-2-[2,3-trans- 3,3,4,5,7-Pentahydroxyflavan-8-yl]-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)3,5,7-Trihydroxybenzopyran aus dem unstabilisierten Bier. Die meisten der Verbindungen wurden auf Modulation des Fremdstoffmetabolismus (Hemmung der Cyp1A1 Aktivität, Induktion der QR Aktivität) und auf anti-inflammatorische Mechanismen (Hemmung der LPS-vermittelten Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren inos Induktion, Hemmung der Cox-1 Aktivität) untersucht [6]. 1,2,5,7-Tetrahydroxyanthrachinon 1,2,5,7-Tetrahydroxyanthrachinon (THA) wurde als eine der interessantesten Verbindungen identifiziert. Es hemmt die Cyp1A Aktivität mit einem IC 50 von 0.07µM und verdoppelt die spezifische QR Aktivität in einer Konzentration von 10.3µM. In Bezug auf anti-inflammatorische Mechanismen reduzierte es die inos Induktion (IC µM) und hemmte die Cox-1 Aktivität mit einem IC 50 von 7.2µM. Wir konnten darüber hinaus nachweisen, dass THA die Bildung prä-neoplastische Läsionen im MMOC Modell effektiv vorbeugt (IC µM) (Gerhäuser et al., in Vorbereitung). Unsere Ergebnisse zeigen dass Bier reich an potentiellen chemopräventiven Verbindungen ist und in dieser Hinsicht weiter untersucht werden sollte. 4. Krebs-chemopräventive Wirkung von Xanthohumol, ein prenyliertes Chalcon aus Hopfen (Humulus lupulus L.) In Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken. Finanziert von der Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft und der DFG Hopfen ist eine reiche Quelle an phenolischen Verbindungen im Bier. Der Anteil an Polyphenolen im Hopfenharz, bestehend aus Phenolkarbonsäuren, prenylierten Chalconen und Flavonoiden, Catechinen und Proanthocyanidinen, liegt bei 4-14%. In früheren Untersuchungen konnte bereits gezeigt werden, dass prenylierte Flavonoide aus Hopfen den Fremdstoffmetabolismus in vitro beeinflussen. Daneben wurden antioxidative, anti-proliferative und cytotoxische Effekte beschrieben. Hopfen wurde immer wieder mit einer phytoöstrogenen Wirkung in Verbindung gebracht; in dieser Hinsicht konnte 8-Prenylnaringenin als aktives Prinzip identifiziert werden. Basierend auf diesen Informationen wurde im Rahmen eines von der Wissenschaftsförderung der Dt. Brauwirtschaft e.v. unterstützten Projektes ein Hopfenextrakt in den oben beschriebenen Testsystemen analysiert. Eine anschließende Aktivitäts-geleitete Fraktionierung führte zur Identifizierung von Xanthohumol als aktivster Verbindung und einer Reihe von strukturverwandten Substanzen. Xanthohumol Wir konnten zeigen, dass Xanthohumol in der Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase in die Krebsentstehung eingreifen kann. Zunächst wurde Xanthohumol als Radikalfänger untersucht und konnte Hydroxyl-, Peroxylund Superoxidanion-Radikale besser als Trolox inaktivieren. Eine Hemmung der Tumor-Initiation durch Modulation der Aktivität von Enzymen des Phase 1 und 2 Fremdstoffmeta- 165

166 166 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention bolismus konnte bestätigt werden. Erstmalig konnte eine entzündungshemmende Wirkung von Xanthohumol nachgewiesen werden. Xanthohumol hemmte die Aktivität der konstitutiv exprimierten Cox 1, aber auch der induzierbaren Cox 2, und verhinderte in LPS-stimulierten Raw Makrophagen die Induktion der inos und Produktion von NO. Zellwachstumshemmende Wirkung konnte anti-östrogenen Eigenschaften, der Hemmung der DNA Polymerase a und einer Induktion von Apoptose und Zell-Differenzierung zugeschrieben werden. Als erster Nachweis einer chemopräventive Wirksamkeit wurde Xanthohumol im MMOC Modell untersucht und verhinderte das Auftreten DMBAinduzierte Läsionen im nanomolaren Bereich [7,8]. In in vivo Untersuchungen an Ratten konnten wir zeigen, dass XN in Konzentrationen bis 1000 mg/kg Körpergewicht p.o. gut verträglich ist. In kinetischen Studien zur Bioverfügbarkeit wurde bei einer Dosis von 1000 mg/kg Körpergewicht p.o. vier Stunden nach Applikation im Plasma eine Maximalkonzentration von 0.34 µm gemessen. Als Hauptmetabolit wurde Xanthohumol-4 -O-Glucuronid identifiziert, das eine Maximalkonzentration von 3.1 µm erreichte. Im Urin wurden Konzentrationen von 81.9µM (0-24 h) und 35 µm (24-48h) gemessen (Frank et al., in Vorbereitung). Aus dem Kot konnten 22 Metabolite von XN isoliert und strukturell analysiert werden, von denen 20 modifizierte Chalcone darstellten und nur zwei Verbindungen ein Flavonoid-Gerüst zeigten [9]. Erste Untersuchung zum Nachweis chemopräventiver Mechanismen in vivo zeigen, dass XN im Unterschied zu Tamoxifen ein reines Anti-Östrogen darstellt. In einem Uterotrophie Test an präpubertären Ratten konnten durch XN (100 mg/ kg Körpergewicht) sowohl das durch 1µg/kg Ethinylestradiol stimulierte Wachstum der Gebärmutter um 33% reduziert werden wie auch das nicht induzierte Wachstum um 26 %. 5. Apoptose-Induktion durch Brassica Inhaltsstoffe In Zusammenarbeit mit R. Iori (Research Institute for Industrial Crops, Italian Ministry of Agriculture, Bologna, Italien) Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Gemüse der Familie der Kreuzblütler (Brassicaceae) wie Rotkohl, Weißkohl, Grünkohl oder Broccoli haben aufgrund ihres hohen Gehaltes an Glucosinolaten (Thioglucoside) chemopräventive Eigenschaften. Bei Zerstörung des Pflanzengewebes durch Schneiden oder Kauen kommt es zur Spaltung der Glucosinolate durch das pflanzeneigene Enzym Myrosinase, was zur Freisetzung reaktiver Isothiocyanate und Indolderivate führt. Diese Verbindungen erwiesen sich als potente Modulatoren des Phase 1 und Phase 2 Fremdstoffmetabolismus und zeigten antiproliferative und Apoptose-induzierende Eigenschaften in vitro und in vivo. Ziel der vorliegenden Studie war, Mechanismen der Induktion von Apoptose in Kolonkarzinom-Zelllinien durch die Isothiocyanate Sulforaphan (SFN) und Phenethyl-Isothiocyanat (PEITC), sowie durch die Indolderivate Indol-3-Carbinol (I3C) und dessen Kondensationsprodukt 3,3 -Diindoylmethan (DIM) zu untersuchen. Dafür wurden die von der kolorektalen Zelllinie HCT116 abgeleiteten Zelllinien (Klon vom Wildtyp), (p53 -/-) und 8054 (p21 -/-) eingesetzt, die uns freundlicherweise von B. Vogelstein, Johns Hopkins University Baltimore, USA, zur Verfügung gestellt wurden. Wir konnten zeigen, dass alle vier untersuchten Substanzen mit IC 50 -Werten von 4-9 µm starke wachstumshemmende Eigenschaften auf die Zell-Linien hatten. Dabei wirkten die Isothiocyanate SFN und PEITC, sowie deren Vorläufer-Glucosinolate Glucoraphanin und Gluconasturtiin (nur in Kombination mit exogener Myrosinase) stark cytotoxisch, wogegen der antiproliferative Effekt der Indole I3C und DIM eher cytostatischer Natur war. Die Cytotoxizität war zum Großteil bereits nach 24 h irreversibel. Um zu ermitteln, ob die beobachteten Effekte auf die Induktion von Apoptose (programmierter Zelltod) zurückgeführt werden können, wurde die DNA von mit SFN behandelten Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI angefärbt. Es konnten sowohl in p53 (+/+), als auch in p53 (-/-) Kolonkarzinom- Zellen die für Apoptose charakteristische Chromatinkondensation und -fragmentierung beobachtet werden. Ein weiteres Kennzeichen von Apoptose ist die Spaltung des DNA-Reparaturenzyms PARP [Poly (ADP-Ribose) Polymerase] durch die Effektor-Caspasen 3 und 7, welche über den externen Signalweg via Todesrezeptoren (z.b. CD95) und über interne Signal und den Ausstrom proapoptotischer Faktoren (z.b. Cytochrom c) aus Mitochondrien aktiviert werden können. Die Behandlung mit allen vier Substanzen führte zur PARP-Spaltung in der p53 (+/+) und in der p53 (-/-) Zelllinie, was auf einen von p53 unabhängigen Mechanismus hindeutete. In den Wildtyp-Zellen konnte die Spaltung der Initiator- Caspase 9, die Abnahme der Effektor-Caspase-7 und eine Herunterregulation des antiapoptotischen Proteins Bcl-x L nachgewiesen werden. Demnach ist hier wahrscheinlich der mitochondriale Signalweg beteiligt. Insgesamt deuten diese Resultate darauf hin, dass die Induktion von Apoptose einen chemopräventiven Mechanismus von Inhaltsstoffen aus Kohlgemüse darstellt. 6. Identifizierung neuer anti-angiogener Verbindungen In Kooperation mit F. M. Klenke (Abteilung Allgemein-, Viszeralund Unfallchirurgie, Chirurgische Universitätsklinik Heidelberg) sowie H. Becker und Th. Eicher (Universität des Saarlandes, Saarbrücken) Die Hemmung der Angiogenese, d.h. der Bildung neuer Blutgefäße zur Tumorversorgung aus dem bestehenden Gefäßsystem, bietet neue Angriffsmöglichkeiten im Bereich der Krebstherapie. In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass chemopräventive Agenzien wie Epigallocatechingallat, Resveratrol oder Curcumin auch anti-angiogene Wirkung zeigen und das Kapillarwachstum reduzieren (Cao et al., 2002; Brakenhielm et al., 2001; Gururaj et al., 2002). Diese Angioprävention beruht auf dem Zusammenspiel einiger Faktoren, die auch Angriffspunkte in der klassischen Krebs-Chemoprävention darstellen, wie z.b. Stickstoffmonooxid als Produkt der induzierbaren NO-Synthase oder Prostaglandine, die durch Cyclooxygenasen gebildet werden (Chiarugi et al., 1998). Unter Verwendung von Gefäßen aus humanen Plazenten haben wir ein in vitro Anti-Angiogenese Testmodell etabliert (nach Brown et al., 1996) und damit das angiopräventive Potential verschiedener potentieller chemopräventiver Substanzen untersucht, die in unserem Naturstoffscreening als Leitstrukturen identifiziert werden konnten [10]. Einige dieser Stoffe zeigten besonders gute Hemmaktivität, z.b. EC 1021, ein bibenzylisches Derivat der Lunularsäure aus Lebermoosen, das das Kapillarwachstum in einer Konzentration von 10µM um 92% reduzierte. Das Isothiocyanat Sulforaphan (SFN) hemmte die Neubildung der Mikrokapillaren dosisabhängig, wobei ein IC 50 von 0.08µM

167 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ermittelt wurde, während wir für Xanthohumol (XN) einen IC 50 Wert von 2.2 µm bestimmten. Zur Untersuchung von mechanistischer Fragen setzten wir humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) ein, die von Dr. Candal vom Center of Disease Control (CDC) in Atlanta, USA, zur Verfügung gestellt wurden. Wir untersuchten die Wirkung der chemopräventiven Teststoffe auf die Proliferation, Migration und Differenzierung der Endothelzellen. EC 1021 zeigte keinen toxischen Einfluss auf die Zellen, beeinflusste aber wesentlich die Migration (IC µM) sowie die Formation des Kapillarnetzwerkes. Bei der Behandlung mit XN und SFN konnte im µm Bereich Zelltoxizität beobachtet werden. Auch die Migration der Endothelzellen wurde gehemmt (IC 50 Werte: XN 0.2µM; SFN 0.7µM). Eine vollständige Hemmung der Differenzierung konnte durch XN bei Konzentrationen von 1 und 10 µm beobachtet werden. Des weiteren wurde unter Benutzung eines in vitro Modells für inflammatorischen Prozesse, der Stimulierung von murinen Raw Makrophagen mit Lipopolysacchriden (LPS), der Einfluss von XN und SFN auf die mrna Expression verschiedener Angiogenese-stimulierender Faktoren bzw. der damit verbundenen Enzyme analysiert. Wir konnten mittels RT-PCR zeigen, dass XN und SFN zeit- und dosisabhängig die LPS-induzierte mrna Expression des Vaskulären Endothelzellen Wachstumsfaktor (VEGF) sowie des Hypoxie-induzierten Faktors 1α (HIF-1α) unterdrückten. Ferner wurde die mrna Induktion der pro-angiogenen Enzyme inos, Cox- 2 und ODC sowie des Transkriptionsfaktors c-myc gehemmt, der eine essentielle Rolle in der Auslösung der Angiogenese spielt [11, 12]. Vor kurzem konnten wir über die Hemmung der Expression der Matrixmetalloproteinasen 2 und 9 auch einen möglichen Einfluss der Substanzen auf den Abbau der Basalmembran nachweisen. Zur Zeit wird in einem Rückenhautkammermodell in SCID Mäusen der in vivo Effekt von XN auf die Gefäßversorgung eines humanen Brusttumors mit Hilfe der Intravitalmikroskopie untersucht. 7. Induktion von HL-60 Zelldifferenzierung durch das Sesquiterpen Lactone In Zusammenarbeit mit C.A. Klaas und I. Merfort (Institut für Pharmazeutische Biologie, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Ein Mechanismus in der Chemoprävention ist die Induktion der terminalen Zell-Differenzierung von Krebszellen in einen normalen, nicht krebsartigen Zustand [13]. Sesquiterpen-Lactone (SLs), die in der Natur in Asteraceen wie Arnica montana vorkommen, besitzen anti-inflammatorische und tumorhemmende Wirkung. Wir konnten SLs als potente Induktoren von Zell-Differenzierungsprozessen in HL- 60 Zellen identifizieren. Die Expression der nichtspezifischen Säure-Esterase zeigte eine Differenzierung in Richtung Monozyten/Makrophagen an (Gerhäuser et al., 2001). Für weiterführende Untersuchungen des Wirkmechanismus wurden DNA Makroarrays (SuperArray@) eingesetzt und Dihydrohelenalin Acetat (DHAc) als Modellsubstanz untersucht. Die Behandlung von HL-60 Zellen mit DHAc für 12 h führte zu einer Verringerung der mrna Expression von Faktoren, die eine Bedeutung für die Zellzyklusprogression haben, z.b. die Cyklin-abhängige Kinasen 1 und 4 und der universelle Transkriptionsfaktor E2F, während mrna Spiegel von Zellzyklus-Inhibitoren wie p21 und p57 induziert wurden. Die Ergebnisse der Array Analysen konnten durch Western Blot Experimente bestätigt werden. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Induktion von Differenzierungsprozessen durch SLs eng mit ihrem Einfluss auf zellzyklusregulierende Gene verbunden ist [11] (Xie et al. Publikation in Vorbereitung). 8. Einfluss von Curcumin auf die Tumor Entstehung im Long Evans Cinnamon (LEC) Rattenmodell In Zusammenarbeit mit F. Amelung (Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie, DKFZ) und Horst Wesch (Abteilung Medizinische Physik in der Radiologie, DKFZ) Der Long-Evans Cinnamon (LEC) Inzucht Rattenstamm akkumuliert durch ein verändertes ATPase Gen Kupfer und entwickelt bedingt durch Kupfer-induzierten oxidativen Stress, Lipidperoxidation und DNA Schäden akute Hepatitis, chronische Leberschäden und Lebertumoren. Curcumin, ein Bestandteil aus Curry, hat anti-oxidative, antiinflammatorische und chemopräventive Eigenschaften. Wir untersuchten den Einfluss von Curcumin auf die Entstehung von Nieren- und Leber Tumoren im LEC Ratten Modell. Zwei Gruppen von vier Wochen alten Ratten (n=60) wurden mit einer Standard Diät (Kontrolle) bzw. mit Curcumin (0.5% im Futter) gefüttert. Unbehandelte Ratten zeigten in 32% akutes Leberversagen und entwickelten in 100% Leber bzw. in 10% Nierentumoren. Diese Ergebnisse wurde durch Curcumin nicht beeinflusst. Curcumin reduzierte jedoch die Tumor Inzidenz in anderen Organen (15% vs 0%; p = 0.025) und unterdrückte die Entstehung von Metastasen (18% vs 0%; p = 0.01). Die mittlere Überlebenszeit sank bei den Curcumin-behandelten Ratten von 88.7 auf 78.1 Wochen (p = 0.002). Die fehlende chemopräventive Wirksamkeit könnte auf erhöhte Toxizität und gesteigerten oxidativen Stress durch die Kupfer Akkumulation zurückzuführen sein. Aufgrund unserer Ergebnisse sollte Curcumin für Patienten mit angeborenen oder erworbenen Metallspeicher-Krankheiten einschließlich Individuen mit Hepatitis C Infektionen kontraindiziert sein [15, 17]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Gerhäuser, C., Klimo, K., Heiss, E., Neumann, I., Gamal Eldeen, A., Knauft, J., Liu, G., Sitthimonchai, S., Frank, N. Mechanism-based in vitro Screening of Potential Cancer Chemopreventive Agents. Mutation Research (2003) [2] Gerhäuser, C. and Frank, N. New Promising Chemopreventive Agents and Mechanisms. In: Handbook of Experimental Pharmacology. Harri Vainio: Springer Verlag, Heidelberg, 2003, pp [3] Owen, R.W., Haubner, R., *Hull, W.E., *Erben, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H., *Haber, B.: Isolation and structure elucidation of the major individual polyphenols in carob fibre. Food an Chemical Toxicology 41 (2003) [4] *Zidorn, C., *Spitaler, R., *Ellmerer-Müller, E.P., *Perry, N.B., Gerhäuser, C., *Stuppner, H.: Structure of Tyrolobibenzyl D and biological activity of tyrolobibenzyls from Scorzonera humilis. Zeitschrift für Naturforscher 57 (2002) [5] *Wollenweber, E., *Stevens, J.F., Klimo, K., Knauft, J., Frank, F. and Gerhäuser, C.: Cancer Chemopreventive in vitro Activities of Isoflavones Isolated from Iris germanica. Planta Medica 69 (2003) [6] Gerhäuser, C., *Alt, A.P. Klimo, K., Knauft, Frank, N., *Becker, H.: Isolation and potential cancer chemopreventive activities of phenolic compounds of beer. Phytochemistry Reviews 1 (2002) [7] Gerhäuser, C., *Alt, A., Heiss, E., Gamal-Eldeen, A., Klimo, K., Knauft, J., Neumann, I., Scherf, H.-R., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Cancer chemopreventive activity of Xanthohumol, a natural product derived from hop. Molecular Cancer Therapeutics 1 (2002)

168 168 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [8] Gerhäuser, C., *Alt, A., Heiss, E., Gamal-Eldeen, A., Klimo, K., Knauft, J., Neumann, I., *Nookandeh, A., Scherf, H., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Identification and cancer chemopreventive potential of Xanthohumol, a prenylated chalcone from hop (Humulus lupulus L.). Hopfenrundschau International (2002/ 2003) [9] *Nookandeh, A., Frank, N., *Steiner, F., *Ellinger, R., *Schneider, B., Gerhäuser, C., *Becker, H.: Xanthohumol metabolites in faeces of rats. Phytochemistry (2004) [10] Bertl, E., Klimo, K., Heiss, E., *Klenke, F., *Peschke, P., *Becker, H., *Eicher, T., Herhaus, C., *Kapadia, G., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Identification of novel inhibitors of angiogenesis using a human in vitro anti-angiogenesis assay. Intern. J. Cancer Prev. 1, (2004) [11] Bertl, E., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Anti-angiogenic properties of sulforaphane, an isothiocyanate derived from broccoli. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention (Suppl.) 12 (2003). [12] Bertl, E., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Xanthohumol, a novel anti-angiogenic agent derived from hop. Presentation at the Third Interdisciplinary Euroconference on Angiogenesis held in Dublin, Ireland, Oct (2003). [13] Xie, C.P., Scherf, H.R., Bartsch, H., and Gerhäuser, C., Differential effects of sodium butyrate and trichostatin A on differentiation induction in HCT 116 colonic cancer cell. Cancer Epid. Biomarker Prev. 11 (10 Part 2), 1229s (2002). [14] Xie, C.P., Scherf, H.R., *Merfort, I., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Modulation of cell cycle related gene expression during HL-60 cell differentiation induced by dihydrohelenalin acetate (DHAc). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology Suppl. 129 (2003). [15] Frank, N., Nair, J., Knauft, J., Amelung, F., Bartsch, H., Curcumin does not protect LEC-rats against hepatic DNA damage and liver carcinogenesis but prevents other tumors and metastases. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 43, #4294 (2002). [16] Nair, J., Frank, N., Bartsch, H., Comparisons of hepatic etheno-adduct levels in nuclear and mitochondrial DNA of LEC rats treated with or without curcumin. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 43, #4259 (2002). [17] Frank, N., Knauft, J., *Amelung, F., Nair, J., *Wesch, H., Bartsch, H.: No prevention of liver and kidney tumors in Long- Evans Cinnamon rats by dietary curcumin, but inhibition at other sites and of metastases. Mutation Research (2003) Genetische Toxikologie und DNA Reparatur (C010-3) P. Schmezer, O. Popanda Die DNA ist in der Zelle fortwährend Schädigungen ausgesetzt, die sowohl endogen durch reaktive Zwischenstufen des eigenen Stoffwechsels als auch exogen durch Umweltschadstoffe verursacht werden. Derzeit sind beim Menschen mehr als 130 Reparatur- bzw. Reparatur-assoziierte Enzyme bekannt, die kontinuierlich schadhafte Stellen der DNA aufspüren und reparieren, um daraus resultierende toxische oder mutagene Konsequenzen so weit wie möglich zu minimieren. Defekte in der DNA-Reparatur können zur Krebsentstehung beitragen. Es ist deshalb unser Ziel, sensitive Methoden zu entwickeln und einzusetzen, um Chemikalienoder Strahlen-induzierte DNA-Schäden und deren Reparatur zu untersuchen. Dabei konzentrieren wir uns auf die Identifizierung von sog. Hochrisiko-Personen, indem wir in Kooperation mit epidemiologischen und klinischen Partnern Populations-basierte Studien durchführen. Ein optimiertes Einzelzell-Mikrogel-Elektrophorese Verfahren (alkalischer Comet Assay) wird eingesetzt, um an Blutlymphozyten von Probanden die individuelle Mutagensensitivität sowie die Fähigkeit zur DNA-Reparatur (zelluläre DNA-Reparaturkapazität) zu Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren ermitteln. Auch werden verschiedene PCR Techniken angewendet, um Personen mit spezifischen Genvarianten (Polymorphismen) bei DNA-Reparaturenzymen zu erkennen. Weiterhin führen wir mittels cdna-array-technologie und quantitativer RT-PCR Untersuchungen zur Genexpression von DNA-Reparaturenzymen durch. Mit den genannten Methoden wollen wir Biomarker entwickeln und validieren, um Personen mit erhöhter Mutagensensitivität und verminderter DNA-Reparaturkapazität identifizieren zu können, die dadurch (i) ein hohes Krebsrisiko tragen oder (ii) ein erhöhtes Risiko besitzen, unter Radiotherapie starke Strahlen-bedingte Nebenwirkungen im Normalgewebe zu entwickeln. Die frühzeitige Erkennung solcher Hochrisiko-Personen ist von großer praktischer Bedeutung, z.b. für die Entwicklung und Ergreifung präventiver Maßnahmen. Identifizierte Hochrisiko-Personen könnten so z.b. von einem engmaschigen Vorsorgeprogramm oder der Teilnahme an einer Chemopräventionsstudie profitieren. Schließlich besteht eine weitere Aktivität der Arbeitsgruppe in der Suche und Bewertung von Stoffen, die in der Lage sind, zelluläre DNA Reparatursysteme zu induzieren. 1. Untersuchungen zur Induktion und Reparatur Strahlen-induzierter DNA Schäden in Lymphozyten von Tumorpatienten: Korrelation der zellulären Strahlenempfindlichkeit mit den klinischen Nebenwirkungen einer Strahlentherapie im Normalgewebe O. Popanda, R. Ebbeler, O. Zelezny, P. Waas, R. Gliniorz, P. Schmezer In Zusammenarbeit mit J. Chang-Claude, D. Twardella, I. Helmbold, Klinische Epidemiologie; J. Debus, Strahlentherapeutische Onkologie; H.W. Thielmann, Wechselwirkungen von Karzinogenen mit Biologischen Makromolekülen, alle DKFZ; D. von Fournier, Gynäkologische Radiologie, Universitätsklinikum Heidelberg; W. Haase, Klinik für Strahlentherapie und Radiologische Onkologie, St. Vicentius-Kliniken, Karlsruhe; M.L. Sautter-Bihl, Klinik für Strahlentherapie, Städtisches Klinikum, Karlsruhe; F. Wenz, Klinische Radiologie, Universitätsklinikum Mannheim. Gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter. Bei einer strahlentherapeutischen Behandlung reagiert die überwiegende Mehrheit der Patienten mit keinen oder nur geringen Nebenwirkungen. Bei ca. 10 % der Patienten führt die Bestrahlung jedoch zu schweren Akut- und Spätreaktionen. Daher spielt das Wissen um die individuelle Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung zur Abschätzung von Risiken in der Strahlentherapie eine besondere Rolle. Es gibt jedoch bisher keine überzeugende Möglichkeit einer präventiven Bestimmung von Strahlenüberempfindlichkeit. Ziel dieser Forschungsaktivität ist es, hierfür geeignete Biomarker zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern aus den Kliniken und der Epidemiologie zwei prospektive molekularepidemiologische Studien mit strahlentherapierten Krebspatienten aufgebaut, in deren Rahmen eine Probenbank (mit peripheren Blutlymphozyten, RNA, DNA, Blutplasma) sowie eine Datenbank mit für die Strahlensensitivität relevanten klinischen (z. B.: Einstufung der Nebenwirkungen nach den Common Toxicity Criteria des NIH, USA) und epidemiologischen Daten erstellt wurden. Im Rahmen der beiden Studien werden Patientinnen mit Brusttumoren sowie Patienten mit Prostatakarzinom erfasst, die aufgrund ihrer Tumorerkrankung therapeutisch bestrahlt werden müssen. Als Hauptereignis der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung treten in den Zellen DNA-Schäden und Reparatur-

169 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren prozesse zu deren Beseitigung auf. Deshalb wurde die Fähigkeit bestrahlter Zellen zur DNA-Reparatur und die Expression der daran beteiligten Gene untersucht. Als mögliche zelluläre Biomarker für Strahlensensitivität wurden im Comet Assay DNA-Hintergrundschaden, induzierter DNA-Schaden nach in vitro γ-bestrahlung mit 5 Gy sowie die anschließende DNA-Reparaturkapazität nach 15 und 60 min evaluiert. Zusätzlich wurden zur Identifizierung potentieller Marker-Gene Expressionsanalysen für ausgewählte Patienten durchgeführt, d. h. mittels cdna-arrays, die ca. 130 an der DNA- Reparatur beteiligte Gene umfassten, und quantitativer RT- PCR wurden sog. Expressionsprofile erstellt (siehe Punkt 2). In die Studie mit Brustkrebspatientinnen wurden solche Patientinnen aufgenommen, die nach einer brusterhaltenden Operation eine therapeutische Strahlenbehandlung erhielten [5, 12]. Als Anzeichen klinischer Strahlensensitivität wurde das Auftreten unerwünschter Nebenreaktionen der Haut im Bestrahlungsfeld erfasst. Zur Bestimmung der DNA- Reparaturkapazität in vitro wurden periphere Lymphozyten von 113 Patientinnen mit einer Dosis von 5 Gy γ-strahlen behandelt und mit dem alkalischen Comet-Assay untersucht. Die Reproduzierbarkeit des Assays wurde durch die wiederholte Bestimmung (n=26) der Reparaturaktivität von Lymphozyten eines gesunden Referenzspenders bestimmt, wobei ein Variationskoeffizient von 0.3 errechnet wurde. Die ermittelten Reparaturparameter (s.o.) zeigten für die Zellen der Patientinnen deutlich größere Schwankungen als für die der Referenzperson. Im einzelnen wurden 11 Patientinnen mit einer deutlich erhöhten DNA-Schädigung nach γ-bestrahlung sowie 7 Patientinnen mit stark erniedrigter Reparaturkapazität nach 15 und 30 min gefunden. In der Klinik wurden sechs Patientinnen als besonders strahlenempfindlich eingestuft, da sie nach einer Gesamtdosis von 50 Gy eine feuchte Desquamation der Haut im Bestrahlungsfeld aufwiesen. Der Vergleich der beiden Gruppen von Patientinnen, die im Experiment oder in der Klinik strahlenüberempfindlich waren, zeigte allerdings nur eine geringe Übereinstimmung. Dies gilt auch dann, wenn für den Vergleich diejenigen Nebenwirkungen erfasst werden, die bei den Patientinnen über den gesamten Therapie- und Beobachtungszeitraum auftraten. Zusammenfassend kann daher gesagt werden, dass mit Hilfe des alkalischen Comet Assays Patientinnen identifiziert werden können, die eine gestörte Fähigkeit zur Reparatur strahleninduzierter DNA-Schäden aufweisen. Diese Reparatur-Störungen spiegeln allerdings nur in sehr geringem Umfang die klinische Strahlenempfindlichkeit der Haut der Patientinnen wieder. Mögliche Ursachen dafür könnten zum einen darin bestehen, dass der Comet Assay nicht die für die erfassten Nebenwirkungen repräsentativen Reparaturparameter misst, zum anderen aber auch darin, dass die bei den Brustkrebspatientinnen beobachteten akuten Nebenwirkungen durch andere Mechanismen, wie Entzündungsreaktionen der Haut, bedingt sind. Daher werden zur Zeit klinische Spätfolgen der Therapie sowie zusätzliche experimentelle Reparaturparameter, wie die Expression bestimmter Reparaturgene, für die Patientinnen erfasst. In einer weiteren Studie mit Prostatakarzinom-Patienten wird eine weiter entwickelte Version des Comet Assays eingesetzt. Unter anderem konnte die experimentelle Variabilität durch Einbeziehen eines Standards bei jedem Experiment besser kontrolliert werden. Zusätzlich findet man bei den Prostatakarzinom-Patienten ein sehr viel breiteres Spektrum an Nebenwirkungen (u. a. sind durch die Bestrahlung benachbarte Organe wie Blase und Darm betroffen), so dass eine differenziertere Einstufung der Nebenwirkungen möglich ist. Die Comet Assay-Untersuchungen wurden bisher für 195 Patientenproben abgeschlossen. Dabei wurden wiederum Proben mit Störungen in den DNA-Reparaturparametern identifiziert; einige Proben zeigten ihre erhöhte zelluläre Strahlensensitivität bei mehr als einem der Comet Assay-Parameter. In einem Subkollektiv von Patienten, die auf die Therapie entweder unauffällig oder aber mit schweren Nebenwirkungen reagiert haben, wurde eine erste Datenanalyse durchgeführt. Die klinischen und epidemiologischen Patientendaten ergaben für 40 Patienten (67.8%) des Subkollektivs keine erhöhte Strahlensensitivität während 19 Patienten (32.2%) klinisch deutlich strahlensensitiv waren. Der Vergleich der Comet Assay-Daten mit diesen klinischen Befunden zeigte, dass eine Korrelation der Empfindlichkeitswerte erkennbar ist: z. B. hatten nur 12.5 % der nicht klinisch empfindlichen aber 26.3 % der empfindlichen Patienten eine Auffälligkeit im Comet Assay. Die bisherige Auswertung der Daten hat gezeigt, dass der Comet Assay geeignete biologische Endpunkte charakterisiert, die als potentielle Biomarker für klinische Strahlensensitivität genutzt werden können. 2. Expressionsprofile von DNA-Reparaturgenen P. Schmezer, C. Mayer, J. Hümmerich, G. Werle- Schneider, K. Frerk, O. Zelezny, P. Waas, O. Popanda In Zusammenarbeit mit W. Rittgen, A. Benner, L. Edler, Biostatistik, DKFZ; A. Bach, M.C. von Brevern, Axaron Bioscience AG, Heidelberg. Gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter. Es ist ein wichtiges Ziel der Arbeitsgruppe, solche DNA- Reparaturgene zu identifizieren und zu charakterisieren, die für Störungen der zellulären DNA-Reparaturfähigkeit (z.b. ermittelt durch Comet Assay) verantwortlich sein können. Dazu untersuchen wir die Expression verschiedener menschlicher Reparaturgene auf der mrna-ebene. Wir entwickelten cdna-arrays, mit deren Hilfe die Expression von ca. 130 Genen, die bei der Reparatur von DNA-Schäden eine Rolle spielen, gleichzeitig gemessen werden kann. Aus IMAGE cdna-klonen isolierten wir für jedes dieser Gene repräsentative PCR-Fragmente. Nach Verifizierung der Identität der PCR-Fragmente durch Sequenzanalyse wurden diese Fragmente auf Membranen gespottet und fixiert. Mit Hilfe dieser Arrays wurde zunächst untersucht, ob sich das Expressionsmuster von DNA-Reparaturgenen in ruhenden peripheren menschlichen Blutlymphozyten von dem in Mitogen-stimulierten (mit PHA behandelten) Zellen unterscheidet [1]. Es gibt Hinweise, dass die Fähigkeit der Zellen, DNA-Schäden zu reparieren, mit ihrer Proliferationsaktivität zusammenhängen könnte. Es ist deshalb eine wichtige Frage für molekular-epidemiologische Studien, ob stimulierte oder ruhende Lymphozyten zur Messung der DNA-Reparaturkapazität eingesetzt werden sollen. Es wurden Hybridisierungsexperimente sowohl mit ruhenden als auch mit bis zu 72 Stunden mit PHA- stimulierten Lymphozyten durchgeführt. Wir haben 12 Gene identifiziert, die 72 Stunden nach PHA-Behandlung mit einem mehr als zweifachen Anstieg der Transkriptmenge reagierten, wobei der maximale Anstieg mehr als das Achtzehnfache betrug. Für die meisten der hochregulierten Reparaturgene ist bekannt, dass sie außer bei der DNA-Reparatur auch eine Rolle bei der DNA-Replikation spielen. Im Gegensatz hierzu beobachteten wir bei 74% der Reparaturgene keinen Anstieg des Expressionsniveaus, d.h. die Messwerte lagen innerhalb eines 169

170 170 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Bereichs, der das Zweifache des Vergleichswertes bei Zellen ohne PHA Behandlung nicht überschritt. Die Expressionswerte wurden unabhängig von den cdna-arrays verifiziert, und zwar unter Verwendung eines LightCyclers mittels quantitativer PCR im Echtzeit-Verfahren nach Reverser Transkription (real time RT-PCR). Aus unseren Ergebnissen können wir schließen, dass es in humanen peripheren Blutlymphozyten nach PHA-Stimulierung nicht zu einem generellen Anstieg der Genexpression von DNA-Reparaturgenen kommt. Dieses Resultat steht im Einklang mit eigenen Comet Assay Untersuchungen an ruhenden und PHA-stimulierten Lymphozyten [1]: Die Reparaturkapazität PHA-behandelter und nicht behandelter Zellen wurde nach γ-bestrahlung gemessen. Wir konnten keine Unterschiede feststellen, weder in der Menge der durch die Bestrahlung induzierten DNA-Schäden noch in der DNA-Reparaturkapazität. Allerdings war die Hintergrundschädigung (=Menge an DNA Schäden ohne γ-bestrahlung) in den PHA-stimulierten Lymphozyten höher als in den ruhenden Zellen. Im Rahmen einer Untersuchung von Lymphozyten radiotherapierter Prostatakarzinom-patienten (siehe Punkt 1.) wurden für 59 ausgewählte Patienten und 12 Referenzproben Genexpressionsprofile zur Bestimmung der zellulären Strahlensensitivität erstellt (> Einzelmesswerte). Die biostatistische Auswertung dieser großen Datenmenge ist derzeit noch nicht abgeschlossen und eine endgültige Bewertung der Expressionsprofile kann noch nicht vorgenommen werden. Es gibt jedoch erste Hinweise aus sog. Cluster-Analysen, die zeigen, dass es informative Unterschiede zwischen den Expressionswerten für die einzelnen Patientenproben gibt: Patienten mit hoher Expression für bestimmte DNA-Reparaturgene scheinen klinisch nicht strahlensensitiv zu sein, während sich in der Gruppe der Patienten mit geringer Expression für diese Gene mehr Patienten mit klinisch erhöhter Strahlensensitivität befinden. 3. Expressionsprofile von DNA-Reparaturgenen an strahlenüberempfindlichen humanen Kulturzellen mit bekanntem genetischem Defekt im ATM-Gen P. Schmezer, J. Hümmerich, C. Mayer, O. Popanda In Zusammenarbeit mit A. Bach, M.C. von Brevern, Axaron Bioscience AG, Heidelberg. Gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter. Mittels der unter Punkt 2. beschriebenen cdna-array-technik wurden Expressionsunterschiede von DNA-Reparaturgenen an strahlenüberempfindlichen Zelllinien mit bekanntem genetischem Defekt im ATM-Gen und normalsensitiven Zellen eines nicht erkrankten Familienmitglieds untersucht. Profile wurden hierzu sowohl im unbelasteten Zustand als auch 4 bis 72 Stunden nach Bestrahlung mit 1.2 Gy erstellt. Die gemessenen relativen Expressionswerte wurden für zahlreiche Gene (GAPDH, ACTB, PCNA, CDKN1A, LIG1, MPG) durch quantitative RT-PCR in Echtzeit auf dem Light- Cycler überprüft. Die deutlichsten Unterschiede ergaben sich, übereinstimmend mit beiden Methoden, bei der Induktion des CDKN1A (waf1)-gens nach Bestrahlung. Dieses Gen spielt bei der Regulation des Zellzyklus eine wesentliche Rolle. Während die Zellen des gesunden Familienmitgliedes in drei unabhängig untersuchten Familien bereits 4 Stunden nach Bestrahlung mit einer deutlichen Induktion der CDKN1A-mRNA reagieren, findet diese Antwort bei den strahlenüberempfindlichen Zellen der AT-Patienten stark verzögert und abgeschwächt statt. Für PCNA ergaben die LightCycler Analysen Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren ebenfalls deutliche Expressionsunterschiede zwischen Zellen von überempfindlichen und normalempfindlichen Probanden. Auch bei diesem Gen reagieren die Zellen des AT- Patienten verglichen mit den Kontroll-Zellen des gesunden Familienmitglieds mit einer verzögerten Induktion. Der beobachtete Effekt in potentiellen Markergenen für Strahlensensitivität wurde in unabhängigen Experimenten bestätigt. Hierbei wurden die Zellen mit Defekt im ATM- Gen sowie die zugehörigen Kontroll-Zellen mit ansteigenden Dosen (1.2 bis 9.6 Gy) bestrahlt und die Expression der oben genannten Gene mit dem LightCycler (quantitative RT-PCR) in der unbehandelten Kontrolle sowie 4 bis 24 Stunden nach der Bestrahlung bestimmt. Die Induktion von PCNA ist dosisabhängig und in den Zellen des Patienten wie schon in den vorangegangenen Experimenten deutlich verzögert. Die starke Induktion von CDKN1A in den Kontrollzellen 4 Stunden nach Bestrahlung bleibt in den Zellen des Patienten bei den Dosen bis 4.8 Gy nahezu aus. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen mit menschlichen Kulturzellen unterschiedlicher Strahlenempfindlichkeit, dass die relative Induktion der mrna-expression für bestimmte Gene nach γ-bestrahlung als Biomarker für Strahlensensitivität geeignet sein können. 4. Die biologischen Grundlagen der Strahlenempfindlichkeit - Internationaler Workshop Biological Basis of Sensitivity to Ionizing Radiation P. Schmezer, O. Popanda, G. Werle-Schneider, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit: J. Chang-Claude, Klinische Epidemiologie und J. Debus, Strahlentherapeutische Onkologie, DKFZ. Gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter. Um den Anteil strahlenüberempfindlicher Personen in der Bevölkerung abzuschätzen und das erhöhte Strahlenrisiko dieser Bevölkerungsgruppe zu ermitteln, müssen die biochemischen und genetischen Komponenten, die zur Strahlenempfindlichkeit beitragen, besser bekannt sein. Wichtige Fragestellungen sind dabei immer wieder, an welcher Patientengruppe Strahlenempfindlichkeit exemplarisch untersucht werden kann, welche klinischen Kriterien für die Einstufung von Strahlenempfindlichkeit herangezogen werden können, und mit welchen experimentellen Markern Strahlenempfindlichkeit im Voraus getestet werden kann. Im Mai 2003 veranstalteten wir mit Unterstützung des DKFZ und des Bundesamtes für Strahlenschutz einen Internationalen Workshop ( zu diesem Thema mit dem Ziel, neuste Forschungsergebnisse zu diesem Gebiet zusammenzutragen, wissenschaftliche Hypothesen zur individuellen Strahlenempfindlichkeit im Zusammenhang mit der Krebsentwicklung zu bewerten und weiteren Forschungsbedarf aufzudecken. Im wesentlichen wurden drei Schwerpunktthemen diskutiert, (a) Grundlegende molekulare und genetische Mechanismen der DNA-Reparatur, Apoptose und Zellzykluskontrolle nach Bestrahlung, (b) Identifizierung von geeigneten Biomarkern und methodischen Ansätzen zur präventiven Erkennung von Strahlenüberempfindlichkeit und (c) klinische Merkmale der Strahlenempfindlichkeit, und verschiedene laufende klinische Studien vorgestellt. Der Workshop hat gezeigt, dass sich das Verständnis der klinischen Strahlenüberempfindlichkeit zwar stetig verbessert, es jedoch derzeit keine Biomarker gibt, die klinische Strahlenempfindlichkeit umfassend charakterisieren und die derzeit in der klinischen Routine eingesetzt werden können. Allerdings

171 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention gibt es eine Reihe neuer zellulärer oder enzymatischer Endpunkte, die für die Entwicklung von Biomarkern für Strahlenempfindlichkeit genutzt werden können, z.b. genetische Polymorphismen (relativ häufige Mutationen mit niedriger Penetranz) und Expressionsanalysen. Die Etablierung solcher Marker zur Vorhersage von Strahlenempfindlichkeit wird prospektive Studien mit großen Patientenzahlen erfordern, bei denen die enge Zusammenarbeit von Klinik, Epidemiologie und experimentellen Labors besonders wichtig ist. 5. Einfluss von Polymorphismen in DNA-Reparaturgenen auf Reparaturfunktion und individuelles Tumorrisiko O. Popanda, T. Schattenberg, C.T. Phong, D. Butkiewicz, J. Marquardt, P. Waas, A. Risch, P. Schmezer In Zusammenarbeit mit L. Edler, Biostatistik, DKFZ; P. Drings, H. Dienemann, K.W. Kayser, V. Schulz, Thoraxklinik Heidelberg- Rohrbach. Obwohl heute zahlreiche genetische Varianten von DNA- Reparaturgenen (DNA-Polymorphismen) bekannt sind, fehlen doch detaillierte Daten über die funktionellen Auswirkungen dieser Punktmutationen. Es ist allerdings wahrscheinlich, dass einige dieser Polymorphismen zu Störungen in der DNA-Reparatur beitragen, welche wiederum zu einer erhöhten Mutationsrate, genetischer Instabilität und erhöhtem Krebsrisiko führen können. Da wir im Rahmen einer laufenden Studie zum Lungenkarzinom [2,6] zeigen konnten, dass eine reduzierte DNA-Reparaturkapazität das Risiko, an Lungentumoren zu erkranken, erhöht (Schmezer et al. Mutagenesis 16, 2001 ; Rajaee et al. Int J Cancer 95, 2001), wird in dieser Forschungsaktivität der Einfluss von Polymorphismen in DNA-Reparaturgenen auf die DNA-Reparaturkapazität und das Risiko für Lungentumoren untersucht. Aufgrund bisheriger Literaturdaten sind die folgenden Genvarianten, die einen Aminosäureaustausch bewirken, besonders interessante Kandidaten: XPA (-4G/A), XPD (Lys751Gln and Asp312Asn), XRCC1 (Arg399Gln), APE1 (Asp148Glu), and XRCC3 (Thr241Met). Die von diesen Genen kodierten Proteine gehören verschiedenen DNA-Reparaturmechanismen an, und zwar der Nukleotidexzisions- Reparatur, der Basenexzisions-Reparatur und der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur. Die genannten Polymorphismen wurden in der genomischen DNA von 463 Lungenkarzinompatienten (darunter 204 Patienten mit Adenocarcinoma und 212 Patienten mit Plattenepithelkarzinom) und 460 Kontrollpatienten untersucht. Dazu wurden die zu untersuchenden DNA-Bereiche mittels PCR amplifiziert und die Mutationen mit Hilfe sequenzspezifischer Sonden im LightCycler (Roche) detektiert. Die Korrelation der Polymorphismen mit dem Lungenkrebsrisiko ergab für homozygote Träger des Glu-Allels im APE1-Gen einen protektiven Effekt (OR=0.77, P=0.25), während homozygote Träger der A-Variante im XPA-Gen, der Gln-Variante im XPD-Gen sowie der Met-Varianten im XRCC3-Gen ein erhöhtes Risiko (Odds Ratios 1.53, 1.39 bzw. 1.29) trugen, an Krebs zu erkranken. Allerdings war nur das Ergebnis für die XPA-Variante statistisch signifikant (p<0.05). Aus der Literatur ist bekannt, dass die verschiedenen Genvarianten jeweils in wechselnder Zusammensetzung auftreten können. Daher sollte nicht nur der Beitrag einzelner Polymorphismen auf das Lungenkrebsrisiko evaluiert werden, sondern auch der Einfluss von bestimmten Allelkombinationen. Ein erster Schritt zu einer solchen Analyse ist, jeweils die Patienten und Kontrollen zu erfassen, die homozygote Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Träger von den varianten Allelen der Gene waren, die zu einer Risikoerhöhung beitrugen (i.e. XPA-AA, XPD-751Gln und XRCC3-241Met, s.o.). Hierbei handelt es sich um Gene, deren Proteine an verschiedenen DNA-Reparaturmechanismen mitwirken. Das untersuchte Kollektiv enthielt 54 Patienten und Kontrollen, die homozygot zwei oder drei der varianten Allele trugen. Das relative Risiko verglichen mit Individuen ohne diese Allele war signifikant erhöht (Odds Ratio=2.37; CL= ), auch bei den einzelnen histologischen Untergruppen (Plattenepithelkarzinom: Odds Ratio =2.83; CL= ; Adenokarzinom: Odds Ratio =3.05; CL= ). Wurden homozygote Träger von Genvarianten untersucht, die in Genen desselben Reparaturmechanismus lagen (z. B Varianten des XPA- und des XPD-Gens der Nukleotidexzisionsreparatur), war das Risiko an Lungenkrebs zu erkranken, nicht betroffen. Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten, dass bestimmte Kombinationen von Genvarianten das Tumorrisiko bis zu dreifach erhöhen, während der Beitrag einzelner Sequenzvarianten eher geringfügig ist. Solche kritischen Allelkombinationen sollen in weiteren Untersuchungen identifiziert werden, was allerdings eine genügend hohe Anzahl an Studienteilnehmern erfordert. Zusätzlich soll der Einfluss von Expositionen (wie Rauchen oder berufliche Karzinogenbelastung) und anderen Störfaktoren auf das Risiko berücksichtigt werden. In weiteren Assoziationsstudien wird die Wirkung von Genpolymorphismen auf die DNA-Reparaturfunktion (z. B.: die DNA-Reparaturkapazität) und weitere klinische Endpunkte (wie Strahlensensitivität) untersucht. 6. Quantitative Erfassung der Poly(ADP-ribosyl)ierung P. Schmezer, N. Rajaee-Behbahani, C. Mayer, O. Zelezny, R. Gliniorz, P. Waas, U. Bollow, B. Bertram In Zusammenarbeit mit A. Bürkle, Abtl. Molekulare Toxikologie, Universität Konstanz; H. Becher, Abteilung Tropenhygiene und öffentl. Gesundheitswesen, Universität Heidelberg; H. Ramroth, Abteilung Klinische Epidemiologie, DKFZ; A. Dietz, Abteilung Otolaryngologie, Kopf-Hals-Chirurgie, Universität Heidelberg. Die Poly(ADP-Ribose)polymerase (PARP) ist ein nukleares Enzym das durch bestimmte DNA-Schäden (Strangbrüche) aktiviert wird. Sie katalysiert unter Verwendung von NAD + die kovalente Modifikation von Proteinen durch ADP-Ribose- Polymere. Da bekannt ist, dass Defekte in der DNA-Reparatur mit einem erhöhten Tumorrisiko beim Menschen einhergehen können, haben wir untersucht, ob erworbene oder vererbte Änderungen in der PARP-Aktivität einen Einfluss auf das Tumorrisiko haben. Wir haben nach Induktion von DNA-Schäden die Polymerbildung mittels eines Immunfluoreszenz-Verfahrens in intakten peripheren Blutlymphozyten des Menschen analysiert. Hierzu wurde die Reaktion der Lymphozyten auf Bleomycin untersucht, eine Verbindung, die bekanntermaßen DNA Einzel- und Doppelstrangbrüche induziert. Es wurde ein Verfahren eingesetzt, mit dessen Hilfe die Immunfärbung durch PC-gestützte Bildverarbeitung quantitativ erfasst werden konnte. Im Rahmen einer klinischen Fall-Kontroll-Studie zu genetischen sowie berufs- und Lebensstil-bedingten Risikofaktoren für Larynxkrebs [3,7] wurde mittels quantitativer Immunfluoreszenz-Analyse die PARP-Aktivität durch Messung der Poly(ADP-Ribose)-Bildung in peripheren Blutlymphozyten erfasst. Die Polymerbildung wurde nach Behandlung der Lymphozyten von 69 Larynxkrebspatienten und 125 gesunden populationsbasierten Kontrollpersonen mit Bleomycin bestimmt. Das Ausmaß der Bleomycin-induzierten Polymer- 171

172 172 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention bildung, gemessen als durchschnittliche Pixel-Intensität, war in Larynxkrebspatienten (74.6; SE=3.7) signifikant niedriger als in Kontrollpersonen (94.5; SE=3.5) und wurde durch Faktoren wie Alter, Geschlecht oder Rauchverhalten nicht beeinflusst [3]. Es war jedoch kein Unterschied bei den Basalwerten der Polymerbildung (ohne Bleomycin-Behandlung) zu beobachten (Fälle: 59.1; SE=5.2 / Kontrollen: 50.5; SE=3.7). Wenn man das höchste Tertil der Polymerbildung als Referenzwert heranzieht, ist das Risiko (odds ratio) für das niedrigste Tertil um den Faktor 3.79 (95% CI , p=0.01) erhöht. Dies bedeutet, dass periphere Blutlymphozyten von Patienten mit Larynxkrebs eine signifikant niedrigere Bleomycin-induzierte Poly(ADP-Ribose)-Bildung aufweisen als Zellen von gesunden Kontrollpersonen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine verminderte Fähigkeit zur zellulären Poly(ADP-Ribose)-Bildung mit einem erhöhten Risiko für Larynxkrebs einhergehen könnte. Der diesem Befund zugrundeliegende Wirkmechanismus muss weiter aufgeklärt werden. 7. Einfluss des Tee-Inhaltsstoffes (-)-Epigallocatechingallat auf DNA-Reparaturprozesse in der Zelle B. Bertram, U. Bollow, G. Werle-Schneider, P. Schmezer In Zusammenarbeit mit A. Bürkle, Abtl. Molekulare Toxikologie, Universität Konstanz Im Hinblick auf einen möglichen Einsatz von Stoffen mit chemopräventiven Eigenschaften bei Personen mit erhöhtem Krebsrisiko wurden Versuche mit (-)-Epigallocatechingallat (EGCG), dem Hauptinhaltsstoff von grünem Tee, durchgeführt. Tee gehört nicht zur großen Gruppe von pflanzlichen Arzneimitteln mit mutagenen oder kanzerogenen Eigenschaften [4, 8-11], sondern hat, im Gegenteil, einen bemerkenswerten Schutz vor der Entstehung von Tumoren und Herz-Kreislauferkrankungen gezeigt [zusammengefasst in 5]. Versuche zum Einfluss von EGCG auf die Bildung von Poly(ADP-ribose) (PAR), welche bei Reparaturprozessen in der Zelle eine entscheidende Rolle spielt (siehe Punkt 6.), wurden in Lymphozyten und in einer Leukämiezelllinie des Menschen durchgeführt. Diese Versuche zeigten einen Dosis-Zeitabhängigen Anstieg der PAR nach EGCG Behandlung [4]. Da die Induktion der PAR auf DNA-Schäden zurückgeführt wird, untersuchten wir auch die Effekte von EGCG auf die DNA in den genannten Zellen. Dabei stellte sich heraus, dass EGCG DNA-Schäden und PAR-Bildung in nennenswerter Weise nur in Konzentrationen über 20µM auslöste, jedoch nicht unter 20µM. Da die Plasmakonzentration von EGCG nach Tee-Genuss zwischen 0.4-4µM liegt, ist dies ein wichtiger Befund. Brustkrebszellen (MCF7), die mit dem DNA Strangbruchauslösenden Bleomycin behandelt wurden, konnten durch Vorbehandlung mit EGCG geschützt werden (50% weniger DNA-Schäden gemessen im Comet Assay). Sind die DNA-Schäden durch γ-strahlen ausgelöst, zeigte EGCG keine Schutzwirkung in diesem Versuchsansatz. In einem Pilotexperiment zum Einfluss von EGCG auf reparaturrelevante Gene beobachteten wir in einer AT-Zelllinie einen Anstieg der mrna- Expression von ABCC2, MPR2, XPC und ERCC5 um einen Faktor von Die chemopräventiven Eigenschaften des wichtigsten Tee-Inhaltsstoffs EGCG scheinen also, zumindest teilweise, auf einer Induktion der PAR zu beruhen, ohne dass DNA-Schäden ausgelöst werden. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 8. Transkriptionsanalyse in der prädiktiven Toxikologie G. Werle-Schneider, H. Bartsch, M. Bartelmann In Zusammenarbeit mit C.K. Behrens, M.C. v. Brevern, J. Scheel, T. Storck, A. Bach, AXARON Bioscience AG, Heidelberg; D. Müller, R. Glöckner, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Schiller-Universität, Jena; J. Hengstler, M. Ringel, Institute of Toxicology; Johannes Gutenberg-University, Mainz; zum Teil unterstützt durch das Bio-Regio-Projekt Klassische toxikologische Testsysteme zur frühen Erkennung des karzinogenen Potentials chemischer Substanzen sind aufgrund der Durchführung von Tierversuchen sehr zeitund kostenintensiv. Der Entwicklung neuartiger Testsysteme, die bereits in der Frühphase der Wirkstoffentwicklung eine schnelle Evaluierung des karzinogenen Potentials erlauben, kommt daher eine große Bedeutung zu. Basierend auf der Annahme, dass die karzinogene Wirkung einer Substanz mit einer Veränderung der Transkription und somit Expression bestimmter Gene einhergehen kann, wurden neue Testverfahren entwickelt, die auf der Analyse von Transkriptionsprofilen beruhen. Dieser neue Zweig der Toxikologie, auch toxicogenomics genannt, gründet sich darauf, dass für eine bestimmte Substanzklasse charakteristische Genexpressionsprofile erzielt werden können. Durch eine hierarchische Cluster-Analyse ausgewählter Markergene wird überprüft, ob Substanzen abhängig von ihrem Wirkmechanismus anhand ihrer spezifischen Genexpressionsprofile klassifiziert werden können. Zur Entwicklung der Transkriptionsprofilierung wurden in unserer Arbeitsgruppe Tumorpromotoren oder nicht-gentoxische Kanzerogene verwendet, da diese keine DNA- Schäden verursachen, aber in die intrazelluläre Signaltransduktion eingreifen und bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Kanzerogenese die Expression von Genen verändern. Die Transkriptionsprofile von bekannten Tumorpromotoren aus unterschiedlichen toxikologisch relevanten Klassen wurden mit Hilfe von TOXaminer TM microarrays (Storck et al., Curr Opin Drug Discov Devel 5 (2002) 90) erstellt, die 1500 ausgewählte Gene des Rattengenoms enthalten. Neben den Enzyminduktoren Phenobarbital (PB), α-hexachlorozyklohexan (HCH) und dem auch als Hormon wirksamen Cyproteronacetat (CPA), wurden die Peroxisomenproliferatoren WY14,643 (WY) und Ciprofibrat (CF) oder Nafenopin (NF), das Hormon Ethinyloestradiol (EE) sowie Dehydroepiandrosteron (DHEA), das neben hormonaler vor allem eine peroxisomenproliferierende Wirkung besitzt, verwendet. Anhand der für jede Substanz spezifischen Transkriptionsprofile wurden Markergene identifiziert, die für die Wirkung von Tumorpromotoren charakteristisch sind und als prädiktiv eingeschätzt werden können. Untersuchungen in einem in vivo Modell (Rattenleber) und ein hierarchisches Clustering der resultierenden Transkriptionsprofile für ausgewählte Markergene zeigten, dass Substanzen entsprechend ihrer Wirkmechanismen klassifiziert werden können (Scheel et. al., CRC Press, 2003). Für ein highthroughput screening sogenannter Leitsubstanzen in der Frühphase der Wirkstoffentwicklung ist jedoch die Entwicklung eines geeigneten in vitro -Testsystems erforderlich. 8.1 Entwicklung eines in vitro-testsystems zur Identifizierung prädiktiver Genexpressionsmuster nicht-gentoxischer Kanzerogene Zur Entwicklung eines in vitro-testsystems zur Erkennung von nicht-gentoxischen karzinogenen Substanzen wurden mit Hilfe der Modellsubstanz PB verschiedene von der Ratten-

173 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention leber abgeleitete Testsysteme untersucht: Eine aus der Rattenleber etablierte Zelllinie, C2I, (Mayer D and Schäfer B. Exp Cell Res 138, 1982), Leberschnitte (Kuhn et al., Exp Toxicol Pathol 50 (1998) und primäre kultivierte Hepatozyten (Hengstler et al., Drug Metab Rev 32, 2000). PB verändert die Expression einer Vielzahl von Enzymen, die unter anderem bei der Metabolisierung von Fremdstoffen eine Rolle spielen. Durch die Analyse bekannter Veränderungen in der Genexpression wurde das in vitro-system etabliert und validiert. Etablierte Zelllinien wären aufgrund ihrer einfachen Handhabung für Routinetests besonders geeignet. Eine schnelle Zellteilung und die damit verbundene Dedifferenzierung bedingen jedoch das Fehlen der für PB spezifischen Veränderung der Genexpression. Testsysteme mit etablierten Zelllinien erwiesen sich daher als ungeeignet. In primären kultivierten Hepatozyten können durch bestimmte Kultivierungsbedingungen, z.b. durch die Verwendung von Matrigel (extrazelluläre Matrix) oder des Hormons Dexamethason, für PB spezifische Veränderungen der Genexpression ähnlich in vivo erhalten werden. Primäre Hepatozyten der Ratte wurden daher in verschiedenen Kultivierungssystemen und -medien untersucht. Zusammenfassend wurde bei Kultivierung primärer Hepatozyten in Monokultur auf collagenbeschichteten Zellkulturschalen hinsichtlich der Gesamtzahl der exprimierten Gene als auch der regulierten Gene die größte Übereinstimmung mit der in vivo behandelten Rattenleber beobachtet. Als drittes in vitro-testsystem, das in toxikologischen Untersuchungen zunehmend Anwendung findet, wurden Leberschnitte eingesetzt. Im Unterschied zu primären Hepatozyten bleibt bei Leberschnitten der Gewebeverband erhalten. Nach Behandlung mit Phenobarbital wurde eine ausgeprägte Übereinstimmung zwischen den in vitro und den in vivo in der Rattenleber induzierten Transkriptionsprofilen beobachtet. Kryokonservierte Leberschnitte zeigten hingegen nur eine geringe Übereinstimmung. In zwei ausgewählten in vitro-testsystemen wurde untersucht, ob ähnlich in vivo in der Rattenleber, unterschiedliche Testsubstanzen mit Hilfe der spezifischen Transkriptionsprofile entsprechend ihrer Wirkmechanismen klassifiziert werden können. Die hierfür durchgeführten Clusteranalysen der Transkriptionsprofile ausgewählter Markergene für die Substanzen PB, HCH, CPA, CF, WY, EE und DHEA zeigten, dass ähnlich den in vivo Studien auch in beiden in vitro- Testsystemen eine Klassifizierung entsprechend den Wirkmechanismen erzielt werden konnte. So riefen die Enzyminduktoren PB, HCH und in geringerem Ausmaß CPA ähnliche Transkriptionsänderungen hervor. Auch die durch die Peroxisomenproliferatoren CF, WY14,643 und DHEA erhaltenen Transkriptionsprofile wiesen Ähnlichkeiten auf, während das Hormon EE keiner Substanzklasse zugeordnet werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass mit Hilfe beider in vitro-testsysteme und der Erstellung von Transkriptionsmustern prädiktive Testsysteme erhalten werden könnten, mit denen auch bisher unbekannte Substanzen durch eine Analyse auf Zugehörigkeit zu einer dieser Wirkgruppen getestet werden könnten. Um allerdings die Aussagekraft dieser neuen toxikologischen Ansätze für ein Screening neuer Wirkstoffe zu untermauern, müssen Datenbanken mit Transkriptionsprofilen einer größeren Anzahl von Testsubstanzen mit verschiedenen Wirkmechanismen erweitert werden. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren - CPA Abb. 2: Beispiel einer Genexpressionsanalyse mit Hilfe von cdna- Arrays. Die aus mit Tumorpromotoren behandelten und unbehandelten Leberschnitte isolierte RNA wird in 32 P-markierte cdna umgeschrieben. Bei der Hybridisierung der cdna-arrays erfolgt eine spezifische Bindung der 32 P-markierten Sondenmoleküle an die trägergebundenen DNA-Sensormoleküle mit passender Sequenz. Nach Detektion und Bildanalyse können mit Hilfe spezieller Software-Programme über die Bestimmung der relativen RNA-Menge für die einzelnen Tumorpromotoren spezifische Transkriptionsprofile erstellt werden. Vergleichende Bewertungen (hierarchische Clusteranalyse) der einzelnen Transkriptionsprofile zeigen den Grad der Übereinstimmung der Expression aller auf einem DNA- Array enthalten Gene: Gene, die durch Tumorpromotoren in ihrer Expression erhöht wurden sind grün dargestellt und Gene deren Expression vermindert wurde rot [13]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Mayer, C., Popanda, O., Zelezny, O., *von Brevern, M.-C., *Bach, A., Bartsch, H., Schmezer, P.: DNA repair capacity after gamma-irradiation and expression profiles of DNA repair genes in resting and proliferating human peripheral blood lymphocytes. DNA Repair 1 (2002) [2] Dally, H., Gassner, K., Jäger, B., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., Edler, L., *Drings, P., *Dienemann, H., *Schulz, V., *Kayser, K., Bartsch, H., Risch, A.: Myeloperoxidase (MPO) genotype and lung cancer histologic types: The MPO -463 A allele is associated with reduced risk for small cell lung cancer in smokers. International Journal of Cancer 102 (2002) [3] Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Ramroth, H., *Bürkle, A., Bartsch, H., *Dietz, A., *Becher, H.: Reduced poly(adpribosyl)ation in lymphocytes of laryngeal cancer patients: results of a case-control study. International Journal of Cancer 98 (2002) [4] Bertram, B., Bartsch, H.: Krebsprävention durch grünen Tee: Wirklichkeit und Wunschdenken. Green tea - a cancer preventive agent: facts and fiction. Wiener Medizinische Wochenschrift 5 (2002) [5] Twardella, D., Popanda, O., Helmbold, I., Ebbeler, R., Benner, A., *von Fournier, D., *Haase, W., *Sautter-Bihl, M.L., *Wenz, F., Schmezer, P., Chang-Claude, J.: Personal characteristics, therapy modalities and individual DNA repair capacity as predictive factors of acute skin toxicity in an unselected cohort of breast cancer patients receiving radiotherapy. Radiotherapy and Oncology 69 (2003) [6] Dally, H., Edler, L., Jäger, B., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Drings, P., Schulz, V., Kayser, K., Bartsch, H., Risch, A.: The CYP3A4*1B allele increases risk for small cell lung cancer: effect of gender and smoking dose. Pharmacogenetics 13 (2003) [7] Risch, A., Ramroth, H., Raedts, V., Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Bartsch, H., *Becher, H., *Dietz, A.: Laryngeal cancer risk in Caucasians is associated with alcohol and tobacco consumption but not modified by genetic polymorphisms in class I alcohol dehydrogenases ADH1B and ADH1C, and glutathione-stransferases GSTM1 and GSTT1. Pharmacogenetics 13 (2003)

174 174 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [8] Bertram, B., Bollow, U., Rajaee-Behbahani, N., *Bürkle, A., Schmezer, P.: Induction of poly(adp-ribosyl)ation and DNA damage in human peripheral lymphocytes after treatment with (-)- epigallocatechin-gallate. Mutation Research 534 (2003) [9] *Tang, W., *Hemm, I., Bertram, B.: Recent Development of antitumor agents from Chinese Herbal Medicines. Part I. Low molecular compounds. Planta Medica 69 (2003) [10] *Tang, W., *Hemm, I., Bertram, B.: Recent Development of antitumor agents from Chinese Herbal Medicines. Part II. High molecular compounds. Planta Medica 69 (2003) [11] Bertram, B., Bartsch, H.: DNA-Schäden durch oxidativen Streß - Auslöser genomischer Instabilität. Forum DKG S1 (2003) [12] Popanda, P., Ebbeler, R., Twardella, D., Helmbold, I., Gotzes, F., Schmezer, P., Thielmann, H.W., *von Fournier, D., *Haase, W., *Sautter-Bihl, M.L., *Wenz, F., Bartsch, H., Chang- Claude, J.: Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes from breast cancer patients and their correlation with acute skin reactions to radiotherapy. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 55 (2003) [13] Bartsch, H., Risch, A., Werle-Schneider, G., Schmezer, P.: Molekulare Frühwarnsysteme. Spektrum der Wissenschaften, Spezial Krebsmedizin II 3 (2003) Neue Biomarker in der Krebsätiologie- und Präventionsforschung (C010-4) J. Nair Erhöhter oxidativer Stress und Lipidperoxidation (LPO) gelten als auslösende Faktoren von Krebs und anderen chronisch degenerativen Erkrankungen. LPO wird eine Rolle bei der Tumorpromotion und -progression zugeschrieben und erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass Etheno(ε)- DNA-Addukte aus LPO-Produkten gebildet werden. Die Bildung von exozyklischen DNA-Addukten ist eine der frühesten Stufen von messbaren genetischen Schäden der Zelle (Abb. 3). Werden diese nicht repariert, so führen sie nach Zellteilung zu Mutationen, die sich anhäufen und zu genomischer Instabilität und Krebswachstum führen können. Die Entwicklung und Validierung von Analysemethoden für DNA-Addukte soll deshalb zum Verständnis der Bildung von exogenen und endogenen DNA-reaktiven Metaboliten beitragen. Weiterhin können diese Adduktmarker bereits in Biomonitoring- und Chemopräventionsstudien angewandt werden. 1. Untersuchungen zu endogen gebildeten DNA- Addukten Bisher wurde die Bildung von DNA-Addukten untersucht, die über Lipidperoxidation (LPO) aus 4-Hydroxynonenal (HNE) entstehen. HNE wird auch durch Lipoxygenasen aus Linolsäure gebildet. Malondialdehyd (MDA) wird außer durch LPO auch enzymatisch durch die Thromboxan-Synthase generiert oder nicht enzymatisch durch Zerfall von Prostagladin H 2, das durch Cyclooxygenasen entsteht. Um das MDA-Desoxyguanosin-DNA-Addukt (M 1 dg) zu bestimmen (Struktur und Bildung siehe Abb. 3), wurde eine neue nachweisempfindliche Methode entwickelt und validiert. 1.1 Etheno-DNA-Addukte 1,N 6 -Ethenodesoxyadenosin (εda) und N 3,4-Ethenodesoxycytidin (εdc) werden durch Immunaffinitäts- 32 P- Postmarkierung analysiert (Nair et al. Carcinogenesis, 1995). εda in Gewebeschnitten wird immunhistochemisch bestimmt (Yang et al. Carcinogenesis, 2000). εda im Harn wird durch Immunanreicherung / HPLC-Fluoreszenzdetektierung vermessen (Nair, IARC, 1999). Bisherige Untersuchungen bestätigten die Nachweisempfindlichkeit und Spezifität unserer entwickelten Methoden Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Abb. 3: Bildung von exozyklischen (Etheno)-DNA-Addukten aus 4-Hydroxynonenal (HNE) und M 1 dg aus Malondialdehyd (MDA), die durch oxidativen Stress in der Säugetierzelle aus Linolsäure und Arachidonsäure gebildet werden und auch beim Menschen nachgewiesen wurden. Anhäufung solcher promutagenen DNA- Läsionen führt zu genetischer Instabilität, die den Übergang von gutartigen in bösartige Zellen vorantreibt [1, 2]. εda = 1,N 6 - Ethenodesoxyadenosin, εdc = 1,N 3,4-Ethenodesoxycytidin, M 1 dg = Malondialdehyd-Desoxyguanosin (3-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-pyrimido[1,2-α]purin-10(3H)-on). zur Messung von Etheno-DNA-Addukten, die durch oxidativen Stress und LPO entstehen. So konnte eine verstärkte DNA-Schädigung durch chronisch entzündliche Prozesse und Aufnahme von ω-6 PUFA-reicher Nahrung mit einer erhöhten Etheno-Addukt-Bildung assoziiert werden (Bartsch et al. Carcinogenesis, 1999). Etheno-Addukte waren in FAP- und Morbus Crohn (CD) Patienten erhöht, während bei Colitis ulcerosa (UC) Patienten nur εdc im Vergleich zur normalen Kolon-DNA angereichert war. Die Bildung von Etheno-DNA-Addukten in FAP-Patienten ist einem erhöhten Arachidonsäure-Metabolismus zuzuschreiben, dies in Folge einer Überexprimierung der Phospholipase A2 und Cyclooxygenase-2 im Darmepithel. Im Falle der entzündlichen Darmerkrankungen CD und UC wird die Adduktbildung auf erhöhten oxidativen Stress und Lipidperoxidation zurückgeführt, die als Folge chronisch entzündlicher Prozesse und einer Überproduktion von NO in den Zielzellen einhergehen. Die bisher meist benutzte Messmethode für oxidative DNA- Schäden ist die Bestimmung der oxidierten DNA-Base 8- Oxo-Desoxyguanosin. Jedoch bestehen wegen der Artefaktbildung Unsicherheiten über die Verlässlichkeit dieses Biomarkers. Die Messung stabilerer, sekundärer Marker für DNA-Schäden, wie den Etheno-DNA-Addukten, erwies sich als besserer Indikator, um durch erhöhten oxidativen Stress und Lipidperoxidation bedingte DNA-Schäden zu erfassen, was durch die nachfolgenden Untersuchungen weiter bestätigt wurde. 1.2 Experimentelles Atherosklerose-Modell Das Karzinogen Benzpyren (BP) beschleunigt die Bildung von atherosklerotischen Plaques, wahrscheinlich durch Induktion von oxidativem Stress und nachfolgender Lipidperoxidation (LPO). Da LPO eine wichtige Rolle bei der Atherosklerose-Auslösung spielt, sind DNA-Veränderungen, die von Lipidperoxidationsprodukten gebildet werden, wie z.b. εda und εdc potentielle Marker um oxidativen Stress in vivo nachzuweisen. In einer Studie wurde das Benzpyrendiolepoxid (BPDE)-DNA-Addukt, εda und εdc durch 32 P-Postmarkierung bestimmt und zwar in Apolipoprotein E Knockout (ApoE-KO) Mäusen, die vorher mit 5 mg/kg (BP)

175 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention durch Gavage behandelt wurden. Nach 4 Tagen wurden die BPDE-DNA-Addukte bestimmt und die Spiegel in der Aorta signifikant höher als in der Lunge gefunden. Das letztere ist ein Zielorgan für Benzpyren. Die Adduktspiegel von εda waren ebenfalls höher in der Aorta von BP-behandelten Tieren als in Kontrollen. Im Gegensatz waren εdc-spiegel nicht durch BP-Behandlung beeinflusst. Im Serum von BPbehandelten Mäusen wurde ein dreifach erhöhtes LDL/ HDL Verhältnis beobachtet. εda-spiegel waren positiv mit der Plasma HDL-Konzentration korreliert. Dies lässt vermuten, dass der vom HDL vermittelte Schutz der Gefäßwände gegen reaktive Lipidperoxide in Benzpyren belasteten ApoE-KO-Mäusen reduziert war. Unsere Ergebnisse zeigen, dass DNA-Schäden, die direkt von Benzpyren ausgelöst und über Lipidperoxidation entstehen in der Aorta von ApoE-KO-Mäusen nachzuweisen sind, die ihrerseits bei der Entstehung von atherosklerotischen Plaques eine Rolle spielen. Die Studie bestätigt ferner, dass Etheno-DNA-Addukte nützliche Biomarker für die Messung von in vivo oxidativen Stress bei der Atherosklerose-Auslösung darstellen [3]. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 1.3 LEC-Rattenmodell In Zusammenarbeit mit N. Frank, DKFZ; S. Strand, Medizinische Klinik und Poliklinik, Universität Mainz. Long-Evans Cinnamon (LEC) Ratten tragen einen Gendefekt und häufen dadurch Kupfer in der Leber an, was zur chronischen Hepatitis und nachfolgender Entwicklung von hepatozellulären Karzinomen führt. In der abgeschlossenen Langzeitstudie konnten wir keinen protektiven Effekt durch 0,5 % Curcumin in der Nahrung gegen Leber- und Nierentumore in diesen Ratten finden, obwohl Curcumin bereits in vielen Tiermodellen eine starke krebspräventive Wirkung gezeigt hat [4]. Um das Ausbleiben einer Schutzwirkung zu verstehen, wurde untersucht, ob Curcumin und Kupfer oxidativen Stress in LEC-Ratten erzeugen. Dazu wurden in der Leber LPO-assoziierte DNA-Addukten im Zellkern und in Mitochondrien gemessen, der Gluthation-Status bestimmt und Apoptose-Raten gemessen. Kupfer- und Eisengehalt wurden in der Leber, Gehirn und Plasma bestimmt. Alle diese Parameter wurden in Gruppen von Tieren gemessen, die in einem Zeitrahmen von 6-32 Wochen mit Curcumin behandelt wurden. In unbehandelten LEC- Ratten stiegen die Etheno-DNA-Addukt-Spiegel in der Leber altersabhängig an, mit Höchstwerten nach 8 Wochen im Zellkern und 12 Wochen in den Mitochondrien. Nach 2- wöchiger Curcuminbehandlung stiegen die Etheno-DNA- Addukte 9-25fach im Zellkern und 3-4fach in der Mitochondrien-DNA an und blieben dann konstant erhöht. Die CD95-Expression und die Zahl der apoptotischen Zellen (Tunel Färbung) war höher in der Leber von Curcuminbehandelten Tieren als in Kontrollen. In unbehandelten Tieren stimmten zeitlich die höchsten DNA-Adduktspiegel im Zellkern mit einer Reduzierung der Apoptose überein, vermutlich weil mehr geschädigte Hepatozyten durch Apoptose eliminiert werden konnten. In den Mitochondrien koinzidierten die höchsten Adduktspiegel mit der höchsten Apoptose-Rate, was eine Rolle von DNA-Addukten bei der Auslösung des programmierten Zelltods vermuten lässt. Unsere Ergebnisse haben zum ersten Mal gezeigt, dass ε-dna-addukte in der mitonchondrialen DNA gebildet werden und damit zur Hepatokarzinogenese in der LEC- Ratte beitragen. Diese DNA-Schäden waren deutlich durch die Curcuminbehandlung erhöht. Damit wurde gezeigt, dass Curcumin in der Nahrung oxidativen Stress in LEC-Ratten auslöst und damit das Fehlen einer krebspräventiven Wirkung in der Leber und den Nieren erklärt. Aus diesen Beobachtungen vermuten wir, dass bei Patienten mit ererbten oder erworbenen Metallspeicherkrankheiten die Einnahme von Curcumin kontraindiziert ist. 1.4 Alkohol-assoziierte Lebererkrankungen J. Nair, A. Frank, C. Haas In Zusammenarbeit mit H.K. Seitz, Salem Krankenhaus, Heidelberg. Neben Hepatitis B Virusinfektionen steht Alkoholabusus als Hauptursache von Leberkrebs an zweiter Stelle, der über Fettleber und Fibrose als Vorstufen verläuft. In humanen Leberproben, die von Patienten mit der Diagnose einer alkoholbedingten Fettleber und Fibrose erhalten wurden, wurden εda-spiegel in der DNA bestimmt. Die Werte wurden dann mit Proben von Kontrollen und Patienten mit primärer Haemochromatose und Morbus Wilson verglichen. Mit einer von uns entwickelten immunhistochemischen Methode wurden mean pixel intensity -Werte im Zellkern gemessen und damit die Prävalenz von εda positiv gefärbten Zellkernen (in Prozent) bestimmt. Diese betrog in normalen Lebern 3,1 % und war signifikant höher in Leberproben, die aus einer alkoholbedingten Fettleber (15 %) und Patienten mit Fibrose (50 %) stammten. Die Leberwerte waren nicht erhöht in Patienten mit Hepatitis (6,2 %). Die Werte für Morbus Wilson waren 50 % und für Haemochromatose 33 % [5]. Mit einer Immunaffinitäts-HPLC-Fluoreszenz-Methode wurden εda-spiegel im Harn von Patienten gemessen, die an chronischen alkoholbedingten Erkrankungen litten und mit asymptomatischen Kontrollen verglichen. 6 von 14 Patienten hatten zum Teil stark erhöhte εda-spiegel im Harn. Damit haben wir zum ersten Mal nachgewiesen, dass in der Leber durch Alkoholmissbrauch Etheno-DNA-Addukte gebildet werden. Diese stark miskodierenden DNA-Läsionen, wie sie im Zellkern der Leber und im Urin nachgewiesen wurden, sind wahrscheinlich bei der Entwicklung von Leberkrebs aus Fettleber-, Zirrhose- und Fibrosevorstufen beteiligt. 1.5 Hepatitis B Virus infizierte Patienten In Zusammenarbeit mit P. Srivatanakul, National Cancer Institute, Bangkok, Thailand; H.K. Seitz, Salem Krankenhaus, Heidelberg. Harnproben wurden von Hepatitis B Virus (HBV) infizierten männlichen thailändischen Patienten gesammelt, bei denen eine chronische Hepatitis, Zirrhose und ein hepatozelluläres Karzinom diagnostiziert worden war und mit asymptomatischen HBV-Trägern verglichen. Die Harnproben wurden durch eine HPLC-Fluoreszenzmethode analysiert. Die Mittelwerte für εda-spiegel (fmol/µmol Kreatin) in Kontrollpersonen waren 6,4, in Patienten mit chronischer Hepatitis 127 und in solchen mit Zirrhose 468; Tumorpatienten hatten einen Wert von 247. Damit lagen im Vergleich zu Kontrollen in diesen Patienten die εda-konzentrationen im Harn 20-90fach höher. Interessanterweise waren auch die εda- Konzentrationen von Kontrollpersonen aus Europa 2,5fach höher als die aus Thailand, was möglicherweise auf unterschiedliche Ernährung zurückzuführen ist. Damit konnte gezeigt werden, das die εda-ausscheidung im Harn bei HBVassoziierten Lebererkrankungen stark erhöht ist. HBV-induzierte Entzündungsprozesse lassen erhöht Sauerstoff- und Stickstoffradikale entstehen, die ihrerseits Lipidperoxidation und DNA-Schäden auslösen. Ähnliche Untersuchungen werden derzeitig an Patienten in Heidelberg durchgeführt. 175

176 176 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 1.6 Interventionsstudie in japanischen Frauen In Zusammenarbeit mit T. Hanaoka, National Cancer Research Institute, Tokio, Japan. In einer Interventionsstudie in Japan wurde die Ausscheidung von εda im Urin in nichtrauchenden postmenopausalen Frauen in Nordjapan untersucht [6]. Dabei wurde der Erfolg einer diätetischen Beratung, die Salzeinnahme zu reduzieren und höhere Vitamin C- und Karotin-Mengen zu sich zu nehmen durch Fragebögen und biochemischen Analysen bestimmt. Aus einer großen Kohorte wurden 30 postmenopausale Frauen (60-69 Jahre alt) in der Interventionsgruppe und 30 Frauen in der Kontrollgruppe untersucht. Vor der Intervention war der εda-spiegel im Harn positiv mit der ausgeschiedenen Kochsalz-Konzentration korreliert; ebenso korrelierte εda mit der Einnahme von ω- 6 vielfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA). Die Ergebnisse dieser Pilotstudie stützen die Annahme, dass das ausgeschiedene εda im Harn von DNA-Schäden herstammt, die durch Kochsalz und Helicobacter pylori über chronisch entzündliche Prozesse im Magen ausgelöst werden. Ein bereits nachgewiesener Zusammenhang zwischen der Aufnahme von ω-6 PUFA-reicher Nahrung und erhöhter Etheno-Addukt-Bildung in Lymphozyten weiblicher Probanden wurde in dieser Studie weiter bestätigt. Die biologische Relevanz von εda und εdc als Biomarker in Biomonitoring- und klinischen Studien wird derzeitig in prämenopausalen Frauen (Leukozyten-DNA) in Abhängigkeit vom Östradiol-Metabolismus und Fettsäureaufnahme untersucht. 1.7 Erhöhte Etheno-DNA-Addukt-Spiegel und Mutationsrate in transgenen Mäusen mit verminderter G6PD-Enzymaktivität. In Zusammenarbeit mit K. Felix und S. Janz, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA. Das von G6PD-generierte NADPH spielt eine wichtige Rolle beim Schutz der Zelle gegenüber oxidativem Stress. Ein möglicher Zusammenhang mit der Auslösung von somatischen Mutationen und einer G6PD-Defizienz wurde in einem transgenen Mäusestamm untersucht, der ein low efficiency Allel der G6PD und einen Shuttle-Vektor pur288 zum Nachweis von Mutationen trägt. Das Hirn männlicher Tiere zeigte wegen der auf 13 % erniedrigten G6PD-Aktivität deutliche Störungen des Redox-Gleichgewichtes, d.h. eine dreifache Verminderung des Verhältnisses von reduzierten zu oxidierten Glutathion. Eine Anhäufung promutagener Etheno-Addukte (13-fach für εda und 5-fach für εdc) wurde nachgewiesen, die mit einer dreifach erhöhten somatischen Mutationsrate einherging. Die Ergebnisse belegen die wichtige Schutzfunktion der G6PD in der Säugetierzelle [7]. 1.8 DNA-Addukte in OXYS-Ratten In Zusammenarbeit mit G. Nevinsky, Novosibirsk Institute of Biochemistry, Russland Dieser Inzucht Wistar-Rattenstamm wurde mit Hilfe eines galaktosereichen Futters auf erhöhte Kataraktbildung selektioniert und zeigt eine vererbbare Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Damit ist dieses Tiermodell für Untersuchungen human chronisch degenerativer Krankheiten, wie Kataraktbildung, Skoliose und Tumorentstehung geeignet. In einer Pilotstudie wurde die DNA aus der Leber von 3 bis 15 Monate alten OXYS- und Wistar-Ratten untersucht und εda und εdc mit Hilfe von 32 P-Postmarkierung bestimmt. Die Adduktspiegel zeigten keine Unterschiede, wenn 3 Monate alte OXYS- und Wistar-Ratten verglichen wurden. In 15 Monate OXYS-Ratten verglichen mit gleichaltrigen Wistar-Ratten oder 3 Monate alten OXYS-Ratten Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren waren die Adduktspiegel signifikant höher. Weiterhin wurden LPO-induzierte DNA-Schäden im Gehirn untersucht und dazu Gefrierschnitte von OXYS- und Wistar-Ratten von Hirngewebe auf εda immunhistochemisch untersucht. Die Ergebnisse zeigten deutlich erhöhte Werte im Gehirn von 15 Monate alten OXYS-Ratten und sogar in einigen der 3 Monate alten Tiere. Unsere Ergebnisse zeigen deutliche, dass in der Leber und im Gehirn dieses OXYS-Ratten-Stammes ein oxidativer Stress und Lipidperoxidation vorherrschen, die die Bildung dieser promutagenen DNA-Läsionen verursachen. Weiterhin wurde ein altersabhängiger Anstieg der Adduktspiegel demonstriert. 1.9 Messmethode für das Malondialdehyd modifizierte DNA-Addukt M 1 dg M 1 dg wurde bereits früher in menschlichen Geweben entdeckt und gilt damit als ein weiterer viel versprechender Marker zur Bestimmung von LPO-induzierten DNA-Schäden. Mit dem Ziel M 1 dg in kleinen DNA-Proben (weniger als 10 µg) zu bestimmen und die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, wurde von uns eine Nachweismethode entwikkelt, die auf Immunanreicherung, 32 P-Postmarkierung und HPLC beruht. Die folgenden Schritte erhöhten deutlich die Reproduzierbarkeit und Nachweisempfindlichkeit: 1. Eine Optimierung zur Immunanreicherung mit einem monoklonalen Antikörper (MAb D 10A1). 2. Eine einzige Markierungsreaktion des vorgereinigten M 1 dg 3'-Monophosphats zum 5'-Monophosphat bei ph 6,8. 3. Der Zusatz von O 4 -Äthylthymidin als interner Standard und 4. Vorreinigung des markierten Addukts an eine Polyäthylenimin-Minisäule vor der HPLC-Analyse. Mit diesem verbesserten Analysenprotokoll kann eine Nachweisgrenze von 6 Addukte pro 10 9 Nukleotide in 10 µg DNA erreicht werden. Mit unserer Methode mit hoher Nachweisempfindlichkeit und Spezifität konnten Hintergrundspiegel von M 1 dg humanen Brust- und Leberproben reproduzierbar nachgewiesen werden. Die Methode eignet sich deshalb bestens für Anwendungen im Bereich des humanen Biomonitoring und für Studien der Molekularepidemiologie [8] Nachweismethode für O 4 -Äthyl-Desoxythymidin (O 4 -etdt) und seine Bildung in Rauchern J. Nair, R. Godschalk, A. Risch In Zusammenarbeit mit M. Wießler und C. Kliem, DKFZ; F.J. van Schooten, Universität Maastricht, Niederlande; P. Drings, K. Kayser, H. Dienemann, Thoraxklinik, Heidelberg Neben dem Nachweis von Etheno-DNA-Addukten wurde auch eine verbesserte Methode zur quantitativen Bestimmung von O 4 -etdt entwickelt. Unter den Dutzend verschiedener Alkylierungsprodukte in der DNA, die z.b. durch karzinogene N-Nitrosoverbindungen gebildet werden, zählt O 4 - etdt zu den wichtigen promutagenen DNA-Läsionen, die hauptsächlich AT GC Punktmutationen hervorrufen. Obwohl O 4 -etdt anfänglich in relativ niedriger Ausbeute gebildet wird, reichert es sich wegen der unvollständigen DNA-Reparatur in der Zelle an und spielt deshalb in der Karzinogenese eine wichtige Rolle. Eine erhöhte Ausscheidung von äthylierten DNA-Basen wurde im Harn von Zigarettenraucher nachgewiesen. Um die Äthylierung der DNA in Zielorganen von Rauchern nachzuweisen, wurde eine 32 P-Postlabelling-Immunanreicherungs-Methode für O 4 - Äthyl-Thymidin (O 4 -ett) entwickelt. O 4 -ett-3'-monophosphat wurde synthetisiert, aufgereinigt und durch LC, MS, ESI-MS und NMR charakterisiert. Zur Validierung der Metho-

177 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention de wurden O 4 -ett-spiegel in DNA bestimmt, die zuvor mit N-Äthyl-N-Nitroso-Harnstoff in vitro behandelt wurde. Dabei wurde eine konzentrationsabhängige Bildung von O 4 - ett nachgewiesen. Da O 4 -ett in der DNA schlecht repariert wird, ist unsere Methode zum Biomonitoring von Tabakrauch-assoziierte DNA-Schäden geeignet. Wie gezeigt, besitzt unsere neu entwickelte Methode eine genügend hohe Nachweisempfindlichkeit und Spezifität, um O 4 -ett in Surrogatzellen von Zigarettenrauchern nachzuweisen [9]. Zigarettenraucher inhalieren eine Vielzahl von Karzinogenen, die entweder aus dem Tabak selbst stammen oder durch Pyrolyse im Rauch entstehen. Dabei werden auch freie Radikale gebildet, die oxidativen Stress und LPO induzieren. Es ist bekannt, dass mehrere miskodierende Karzinogen- DNA-Addukte durch Zigarettenrauch gebildet werden und damit den Karzinogeneseprozess in der Lunge in Gang setzen. Wir haben deshalb verschiedene Arten von DNA- Addukten untersucht, die im nicht malignen Lungengewebe gebildet werden. Es wurde Operationsmaterial von 13 Rauchern und 11 Nichtrauchern - alle operierte Lungenkrebspatienten - analysiert. O 4 -ett-, εda- und εdc -Spiegel wurden analysiert. Addukte von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) wurden durch 32 P-Postmarkierung nach Nuklease P1 Anreicherung als diagonale radioaktive Zonen bestimmt. Mittelwerte für O 4 -ett- und PAH-DNA-Addukt-Spiegel waren in Rauchern signifikant höher. Dagegen waren die Etheno-DNA-Adduktspiegel bei Rauchern und Nichtrauchern gleich hoch, zeigten aber große interindividuelle Schwankungen (80-250fach). Da alle Raucher zumindest 1 Woche von der Operation das Rauchen eingestellt hatten, belegen unsere Ergebnisse die Persistenz von O 4 -ett- und PAH-DNA-Addukten in der menschlichen Lunge. Da beide Adduktspiegel positiv korreliert waren, müssen beide DNA-Läsionen hauptsächlich von Schadstoffen im Zigarettenrauch herstammen. Unsere Ergebnisse belegen, dass zusätzlich zu den von PAH und tabakspezifischen Nitrosaminen verursachten DNA-Schäden bei Rauchern auch miskodierende O 4 -ett- Addukte entstehen und damit zu einer erhöhten genomische Instabilität und Lungenkrebsrisiko bei Rauchern beitragen [10]. Der Bildungsmechanismus des äthylierenden Agenz im Tabakrauch ist bisher ungeklärt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Bartsch, H., Nair, J., Owen, R.W.: Exocyclic DNA adducts as oxidative stress markers in colon carcinogenesis: potential role of lipid peroxidation, dietary fat and antioxidants. Biol Chem. 383 (2002) [2] Bartsch, H., NAir, J.: potential role of lipid peroxidation derived DNA damage in human colon carcinogenesis: studies on exocyclic base adducts as stable oxidative stress markers. Cancer Detect Prev. 26 (2002) [3] Godschalk, R., *Curfs, D., Bartsch, H., *van Schooten, F.-J., Nair, J.: Benzo[a]pyrene enhances oxidative stress and lipid peroxidation induced DNA damage in aorta of apoliproprotein E knockout mice. Free Radical Research 37 (2003) [4] Frank, N., Knauft, J., Amelung, F., Nair, J., Wesch, H., Bartsch, H.: No prevention of liver and kidney tumors in Long- Evans Cinnamon rats by dietary curcumin, but inhibition at other sites and of metastases. Mutation Research (2003) [5] Frank, A., *Seitz, H.K., Bartsch, H., Frank, N., Nair, J.: Immunohistochemical detection of 1,N 6 -ethenodeoxadenosine in nuclei of human liver affected by diseases predisposing to hepato-carcinogenesis. Carcinogenesis (2004), im Druck. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren [6] *Hanaoka, T., Nair, J., *Takahashi, Y., *Sasaki, S., Bartsch, H., *Tsugane, S.: Urinary excretion of 1, N 6 -ethenodeoxyadenosine, a marker of oxidative DNA damage in postmenopousal Japanese women participating in a dietary intervention trial in Northern Japan. International Journal of Cancer 100 (2002) [7] *Felix, K., *Rockwood, L.D., *Pretsch, W., Nair, J., Bartsch, H., *Bornkamm, G.-W., *Janz, S.: Moderate g6pd deficiency increases mutation rates in the brain of mice. Free Radical Biology & Medicine 32 (2002) [8] Sun X, Jagadeesan N, Bartsch H. A modified immuno-enriched 32 P-postlabeling method for analyzing the malondialdehyde-deoxyguanosine adduct, 3-(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)pyrimido[1,2-α]purin-10(3H)-one in human tissue samples. Chemical Research in Toxicology,17 (2004) [9] Godschalk, R.W.L., Nair, J., Kliem, C., Wiessler, M., *Bouvier, G., Bartsch, H.: Modified immuno-enriched 32 P-HPLC assay for the detection of O 4 -ethylthymidine in human biomonitoring studies. Chemical Research in Toxicology 15 (2002) [10] Godschalk, R., Nair, J., *van Schooten, F.J., Risch, A., *Drings, P., *Kayser K., *Dienemann, H., Bartsch, H.: Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis 23 (2002) Zusatzfinanzierung: Marie Curie Fellowship Program from EU; EU Contract MCFI EU-Contract QLRT Oxidative Stress and Chronic Diseases: Exocyclic DNA Adducts as Markers for Disrupted Genomic Integrity and Risk. WCRF (London) Grant. Biomonitoring, molekulare Dosimetrie und Analytik (C010-5) B. Spiegelhalder Angesichts ihrer Bedeutung als Expositionsmarker und initiierende Läsionen bei der Krebsentstehung werden die folgenden karzinogenen DNA-Addukte genauer untersucht: oxidative Basenschäden, Benzo(a)pyren-Diolepoxid-DNA- Addukte sowie einige Addukte aus tabakspezifischen und anderen umweltrelevanten Nitrosaminen. Um die Expositionen und Quellen für DNA-schädigende Substanzen exogenen und endogenen Ursprungs in exponierten Bevölkerungs- und Hochrisikogruppen zu identifizieren, werden hochsensible und spezifische Methoden zum Nachweis von DNA- bzw. Proteinaddukten entwickelt, die auf die menschliche Situation anwendbar sind. Hierzu gehören GC-MS, HPLC-MS und MALDI-TOF-MS in Kombination mit Immunaffinitätsreinigung. Mit einem neu entwickeltem Verfahren zur Bestimmung von Ozon verursachten DNA-Schäden wird durch Immunoaffinitätschromatographie isoliertes 8-oxo-dG mit MALDI-TOFMassenspektrometrie und HPLC mit Elektrochem.-Detektor analysiert. Als Biomarker zur Messung von oxidativem Stress dient ein neues Verfahren zur Bestimmung von Nitrotyrosin. Weiterhin wird die Entwicklung und Validierung nichtinvasiver Methoden für molekulare epidemiologische Ansätze vorangetrieben, wobei z. B. Zellexfoliate aus Kolon, Harnblase oder Lymphozyten und Erythrozyten in die Untersuchungen mit einbezogen werden. Entscheidend für die Erfolgsaussichten chemopräventiver Vorhaben sind die klinisch und genetisch fundierte Bestimmung von Hochrisikogruppen und die Etablierung geeigneter klinisch messbarer Biomarker zum Monitoring von Patientengruppen bei Interventionsstudien. Der Einfluss verschiedener fremstoffmetabolisierender Enzyme auf das Risiko, an verschiedenen Krebsarten zu erkranken, soll im 177

178 178 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Rahmen von molekulargenetischen Fall-Kontrollstudien untersucht werden. Gesamtziel ist es, genetisch bedingte Krebsrisiken möglichst frühzeitig zu erkennen, um damit betroffene Personen einer präventiven Behandlung zuführen zu können. Im Rahmen dieses Projektes soll dazu in enger Kooperation zwischen Kliniken und Forschungszentrum die Relevanz verschiedener Enzympolymorphismen für das Erkrankungsrisiko und die Prognose von schadstoffbelasteten Krebspatienten bestimmt werden. Längerfristig soll untersucht werden, welchen prädiktiven Nutzen diese Marker in der klinischen Anwendung, d.h. in Interventionsstudien zur Chemoprävention von Tumoren haben können. 1. Biomonitoring und Kolorektalkrebs R.W. Owen, B. Spiegelhalder Interventionsstudien: Es wird angenommen, dass Kalzium in der Nahrung eine Schutzfunktion gegen Kolorektalkrebs hat. Deshalb wurde eine Reihe von Kalziuminterventionsstudien an Adenompatienten begonnen. Die oben erwähnte DKFZ-Studie ist abgeschlossen und wurde publiziert. Eine weitere, etwas größere Studie in Zusammenarbeit mit dem Medical Department des National Hospital of Norway, Oslo wurde ausgewertet und publiziert. Schließlich wird in Zusammenarbeit mit der European Agency for Cancer Prevention (ECP) eine gesamteuropäische (10 Länder), Langzeit-(3 Jahre)-Kalzium-Ballaststoff-Interventionsstudie mit Placebokontrollen durchgeführt. Insgesamt nehmen 650 Patienten an der Studie teil; bei 800 ist die Intervention bereits abgeschlossen. Das Verhältnis zwischen Zellproliferation, Adenomrezidiv und intestinalen Lipid- und Mineralstoffwerten und dem Antioxidantienstatus im Blut soll in den nächsten Jahren untersucht werden. Einfluss von Phenolen und Lipiden in Speiseöl sowie Antioxidantien in Rotwein auf die Krebsentstehung: Eine erhöhte Aufnahme von polyphenolischen Antioxidantien ist mit einer Verringerung von oxidative stress verbunden und damit auch mit einer geringeren Krebsinzidenz. Um diese Zusammenhänge zu klären, wurde ein Spektrum neuer Analysenmethoden entwickelt zur Bestimmung des Antioxidantiengehalts in Speiseöl und Rotwein. Untersuchungen auf Phytinsäure in biologischen Proben: Phytinsäure (PA) ist ein wichtiges Antioxidans, das in bestimmten Nahrungsmitteln mit hohem Ballaststoffgehalt, wie z. B. Getreide und Hülsenfrüchten, vorkommt. Phytinsäure wirkt antioxidativ, indem sie elementares Eisen bindet, so dass eine Fenton-Reaktion verhindert wird und keine reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) entstehen. Im vergangenen Jahr wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung des PA-Gehalts in Lebensmitteln und anderen biologischen Proben (insbesondere Stuhlproben) entwickelt, um ihren möglichen Einsatz zur Prävention von Kolorektalkrebs zu prüfen. Die Methode basiert auf der lonenpaar-chromatographie und wurde im Vergleich mit publizierten Arbeiten validiert. Bisher wurde PA in Stuhlproben aus einer Kalziuminterventionsstudie mit Placebokontrolle an Adenompatienten bestimmt (in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Umweltepidemiologie; J. Wahrendorf). Bei diesen Patienten zeigte sich eine starke Assoziation zwischen PA und dem Eisengehalt im Stuhl. Dies stützt die Vermutung, dass die Chelatbildung Eisen bei der ROS-Produktion behindert. [Owen R.W. In: Carcinogenic and anticarcinogenic factors in food (G. Eisenbrand, A.D. Dayan, P.S. Elias, W. Grunow, J. Schlatter Eds), DFG, Wiley-VCH, 43-75, 2000] Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Untersuchungen auf reaktive Sauerstoffradikale in biologischem Material: Es wurde eine zuverlässige HPLC-Methode entwickelt und optimiert, bei der ROS über die Bildung von hydroxilierten Salizylsäurederivaten bestimmt werden. Die Methode wird derzeit auf die Analyse der ROS-Produktion in der Stuhlmatrix angewandt, was bisher nicht möglich war, und hat gezeigt, dass ROS in höherem Maße als bisher angenommen gebildet werden. Mit dieser neuen empfindlichen Methode sollen umfangreiche Korrelationsanalysen zwischen PA- und ROS-Werten, Zellproliferation und intestinaler Biochemie (Stuhllipide und Mineralstoffgehalt) durchgeführt werden [Owen R.W. In: Biomarkers in cancer chemoprevention (A.B. Miller, H. Bartsch, L. Dragsted, H. Vainio Eds.). IARC Scientific Publications No 154, 101, 2001] 1.1 Interventionsstudien und Kolorektalkrebs R.W. Owen, G. Würtele, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit Jürgen Wahrendorf, Abt. Umweltepidemiologie, DKFZ, Björn Hofstad, Morton H. Vatn, Rikshospitalet, Oslo, Norwegen, Claire Bonithon-Kopp, Jean Faivre, ECP Colon Cancer Working Group, Faculté de Medicine, Dijon, Frankreich. Einem hoher Gehalt an Kalzium und/oder einem hohen Ballaststoffgehalt in der Nahrung wird ein protektiver Effekt in bezug auf Kolorektalkrebs zugeschrieben. Die Wirkung kann durch eine Chelatbildung (durch Kalzium) und durch eine Verdünnung (durch Ballaststoffe) von möglicherweise co-karzinogenen intestinalen Lipiden erklärt werden. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden verschiedene Interventionsstudien bei Adenompatienten durchgeführt. Weiterhin wurde gemeinsam mit der European Cancer Prevention Organisation (ECP) dreijährige Interventionsstudie in 10 europäischen Ländern an Patienten durchgeführt. Insgesamt 665 Patienten beteiligten sich an dieser Studie und die Intervention wurde im Juli 1997 abgeschlossen. Das Verhältnis zwischen Zellproliferation, Adenomrezidiv, intestinalen Lipid- und Mineralstoffwerten, Blut-DNA und Antioxidansstatus und dem Effekt der Intervention auf diese Parameter wird zur Zeit ausgewertet und sollte in den folgenden 2 Jahren beendet sein. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass die Einnahme von Calcium protektiv ist und Ballaststoffe als Risiko anzusehen sind. [Kopp, C. et al. Lancet 356, 1300, 2000]. 1.2 Einfluss von Phenolen und Lipiden in Speiseöl sowie deren Vorläufer auf die Entstehung von Brust- und Dickdarmkrebs R.W. Owen, R. Haubner, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit William E. Hull, Zentrale Spektroskopie, DKFZ; Attilio Giacosa, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, Italien und Petcharin Srivatanakul, National Cancer Institute, Bangkok, Thailand a) Oliven und Olivenöl Die Mittelmeerdiät wird mit einem verringerten Vorkommen einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht, insbesondere von Darm- und Brustkrebs. Ein Hauptgrund dafür ist der hohe Verbrauch von Olivenöl, das über 70% seiner Lipide als Ölsäure (einfach ungesättigte Fettsäure) enthält und zusätzlich verschiedene Phenole. Da in neuesten Veröffentlichungen der Konsum von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit der Ätiologie von Brustkrebs in Zusammenhang gebracht wurde und um feststellen, warum Olivenöl im Vergleich zu anderen Ölen bezüglich eines möglichen protektiven Effekt überlegen zu sein scheint, wird der Phenolgehalt (Antioxidantien) und der Gehalt an Lipiden in einer Serie von Olivenölen und Saatölen (n = 30) des italie-

179 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention nischen Marktes bestimmt. Extraktions-, GLC- und HPLC- Methoden wurden zur Bestimmung und Trennung von Lipiden und Phenolen entwickelt. Die wichtigsten Antioxidantien wurden durch Massenspektrometrie und Kernspinresonanz identifiziert (Squalen, einfache Phenole, Secoiridoide, Lignane und Flavonoide). Der Nachweis und die Charakterisierung von Lignanen und von Flavonoiden in Olivenöl ist bisher nicht publiziert. Außerdem ist der Gehalt an Phenolen und Squalen in extra virgin Olivenölen (nativen Olivenölen extra) erheblich höher als in raffinierten virgin Ölen (raffinierten Olivenölen), während Saatöle geringe Mengen an Squalen, aber keine phenolischen Antioxidantien enthalten. Alle Phenole, die aus Olivenölen extrahiert und isoliert wurden, haben typische antioxidative Eigenschaften und sind mit dem klassischen Antioxidans, Vitamin E vergleichbar. Diese Daten sind nicht nur für chemopräventive Strategien, sondern auch für zukünftige epidemiologische Studien von Bedeutung. Hierfür wird empfohlen, nicht nur die Art und die Qualität des Öls in Betracht zu ziehen, sondern auch die Herkunft der Öle zu berücksichtigen. Es ist geplant, diese Studien auch auf Olivenöle anderer Herkunftsländer auszudehnen. [Owen, R.W. et al. VTT Symposium 213, 85-88, Owen, R.W. et al. Lancet Oncology 1, , 2000; Owen, R.W. et al. Eur J Cancer 36, , 2000; Owen, R.W. et al. Clin Chem 46, , 2000; Owen, R.W. et al. Food Chem Toxicol 38, , 2000][3] b) Palm-, Sesam- und Sojaöl aus Thailand Lebensmittel aus asiatischen Ländern enthalten antioxidativ wirksame Verbindungen, die üblicherweise nicht Bestandteil der Western diet sind. Wegen der besonders niedrigen Brust- und Magenkrebsrate in Thailand wurden eine Reihe von Speiseölen in Zusammenarbeit mit dem National Cancer Institute Bangkok mit den gleichen Methoden wie bei der Olivenölstudie untersucht. Unverarbeitetes Palmöl enthielt beträchtliche Mengen an Antioxidantien, wie 3,4- Dihydroxybenzoesäure, Vanillinsäure und Cumarinsäure. Raffinierte Öle enthielten nur butyliertes Dihydroxyanisole, vermutlich aus synthetischen Zusätzen gebildet. Weiterhin wurden Sesamin und Sesamolin neben weiteren komplexen Antioxidantien in Sesamöl festgestellt. Soja-, Sonnenblumen und Erdnussöl enthielten keine entsprechenden Antioxidantien. Für weitere biologische Untersuchungen werden derzeit größere Mengen dieser neu identifizierten Verbindungen isoliert. c) Leinsamen und Leinöl und Lignane Lignane werden im Dickdarm von Säugetieren durch mikrobielle Umwandlung von Vorläufern aus Nahrungsmitteln gebildet und gelten wegen ihrer Ähnlichkeit zu Tamoxifen als Schutzfaktoren für Brustkrebs. Als eigentlicher Vorläufer der gebildeten Lignane Enterodiol (ENND) und Enterolacton (ENNL) wird Secoisolariciresinoldiglukosid (SDG) als ein Bestandteil eines komplexen phenolischen Polymers (CPP) angesehen. Wegen der geringen Löslichkeit enthält Leinöl nur wenig SDG. Eine erhöhte Aufnahme von Leinsamen mit der Nahrung stellt nicht nur eine ergiebige Quelle für Lignane dar, sondern erhöht auch die Freisetzung von phenolischen Antioxidantien. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 1.3 Bildung von Phenolen im Darm R.W. Owen, B. Spiegelhalder Viele phenolische Verbindungen in Ölfrüchten und Speiseölen liegen in Glycosid-gebundener Form vor. Die Freisetzung der Phenole für, z.b. Strukturbestimmungen, kann mithilfe von käuflichen Glykosidasen nur unzureichend erfolgen. Sehr effektiv erwies sich der Einsatz von in menschlichen Stuhlproben enthaltenen Glykosidasen in Phosphatpuffersystemen. So konnte in Ansätzen mit SDG eine vollständige Spaltung nach 3 h Inkubation erreicht werden. Bei diesen Studien zeigte sich auch, dass Stuhlproben bereits eine Reihe von phenolischen Antioxidantien enthalten. In einer Pilotstudie mit Proben aus drei Ländern der ECP-Interventionsstudie konnte eine inverse Korrelation phenolischer Antioxidantien mit dem Brust- und Darmkrebsrisiko festgestellt werden. [Owen, R.W. et al. VTT Symposium 213, (2001)] 1.4 Phytinsäure, reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) und Kolorektalkrebs (CRC) R.W. Owen und B. Spiegelhalder Für die zuverlässige Bestimmung von Phytinsäure (PA) und reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) in menschlichen Stuhlproben wurden HPLC-Methoden entwickelt. Der PA- Gehalt in Stuhlproben zeigt eine starke Korrelation mit der Ausscheidung an Eisen, Kalzium und Magnesium. Um den Einfluss von PA in der Kolorektal-Karzinogenese völlig zu klären, müssen ähnliche Untersuchungen in einer Fall-Kontrollstudie durchgeführt werden. In zukünftigen epidemiologischen Studien sollte darüber hinaus die Aufnahme von PA bestimmt werden, um die experimentellen Arbeiten zur Phytinsäure/ROS-Hypothese zu ergänzen. HPLC erlaubt die simultane Bestimmung des Hypoxanthin/ Xanthinoxydasesystems und der ROS-Bildung. Die Methode wurde erfolgreich zur Bestimmung der ROS-Produktion durch die Stuhlmatrix eingesetzt. Diese Untersuchungen haben klar gezeigt, dass die ROS-Bildung nicht von der bakteriellen Besiedlung abhängig ist. Die ROS-Bildung wird vermutlich durch einen bis jetzt nicht identifizierten löslichen Faktor innerhalb der Stuhlmatrix gefördert. Laufende Studien zur Identifizierung dieses löslichen Faktors und die Untersuchung von zusätzlichen Patienten- und Bevölkerungsgruppen sollen zeigen, inwieweit PA, Eisen und ROS- Bildung Einfluss auf die Ätiologie von CRC haben. (Haines, A. et al. Eur J Cancer Prev 9, 317, 2000; Owen, R. W. et al. Gut 46, 225, 2000; [4,5,6]) 1.5 Interventionsstudie bei Frauen mit erhöhtem familiärem Brustkrebsrisiko U. Knust, K.H. Adzerson* 1), R.W. Owen, R. Haubner, B. Spiegelhalder 1) Frauenklinik der Universität Heidelberg Ziel dieser Studie ist die Bestimmung von Lignan- und Östrogengehalten in Serum und Urin durch Intervention mit Leinsamen. Die Teilnehmerinnen sind Frauen in der Prämenopause oder Perimenopause mit Schwestern oder Müttern mit Brustkrebserkrankung. Korrelationen von Ernährungsgewohnheiten (EPIC-Fragebogen), Enterolignan-Gehalte im Blut sowie Urin-Östrogenprofile werden mit Parametern für das Brustkrebsrisiko in Beziehung gesetzt. 1.6 Phenolische Antioxidantien in Südfrüchten R.W. Owen, R. Haubner, B. Spiegelhalder, W.E. Hull 1), Y. Sudjoereen* 2), S. Chambumrung* 2), M.T.S. Trevisan* 3), F. Khallouki* 4) 1) Zentrale Spektroskopie DKFZ, 2) Mahidol University, Bangkok, Thailand, 3) Departemento de Quimica Organica e Inorganica, Universidade Federal do Ceara, Fortaleza, Brasilien, 4) Université de Metz, Frankreich. 179

180 180 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Profile phenolischer Antioxidantien in einer Reihe von thailändischen und brasilianischen Früchten, brasilianischen Heilpflanzen und Gewürzen sowie marokkanischem Arganöl wurden in verschiedenen Kooperationen erstellt. Zahlreiche Antioxidantien konnten bestimmt werden, neue Strukturen konnten identifiziert werden und werden auf ihre Eignung als chemopräventiv wirksame Substanzen geprüft [2]. 1.7 Ungesättigte Fettsäuren und Östrogenmetabolismus J. Nair, R.W. Owen, K.H. Adzerson* 1), F. Beldmann* 1), G. Bastert* 1) 1) Frauenklinik der Universität Heidelberg Epidemiologische und experimentelle Daten zeigen einen Zusammenhang zwischen erhöhtem Brustkrebsrisiko und Aufnahme von langkettigen Fettsäuren (LCFA), wobei mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) der Omega-6- Familie eher schädlich sind und PUFA der Omega-3-Familie und einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFA) eher protektiv wirken. Der Einfluss von unterschiedlichen LCFA auf das Brustkrebsrisiko durch Lipidperoxidbildung und oxidativen Stress soll in einer Fall-Kontrollstudie in Kooperation mit der Frauenklinik Heidelberg untersucht werden. Diese Studie wird durch World Cancer Research Fund gefördert. [Bartsch, H., Nair, J. and Owen, R. W. Carcinogenesis 20, , 1999]. 1.8 Phenolische Antioxidantien in Caromax H. Hwang, R.W. Owen, R. Haubner, G. Würtele, B. Spiegelhalder, B. Haber* 1), D. Cremer* 1), G.-W. von Rymon Lipinski* 1) 1) Nutrinova, Höchst-Frankfurt Kooperationen: J. Wahrendorf, DKFZ; J. Faivre, ECP, Dijon, Frankreich; A. Giacosa, Genoa, Italien; M.H. Vatn, Oslo, Norwegen; I. Segal, Johannesburg, Südafrika; S.B. Naeder, Accra, Ghana. Zusatzfinanzierung: Verein zur Förderung der Krebsforschung, Deutsche Krebshilfe, World Cancer Research Fund Im Rahmen einer Industriekooperation mit der Firma Nutrinova konnten in einem Spezialprodukt, dem functional food pflanzlicher Herkunft Caromax, über 20 verschiedene Antioxidantien qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Um die Eignung als chemopräventiv wirksames Nahrungsergänzungsmittel zu prüfen, wird Caromax in weiteren spezifischen Testsystemen untersucht [1]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Owen, R.W., Haubner, R., Hull, W.E., Erben, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H., *Haber, B.: Isolation and structure elucidation of the major individual polyphenols in carob fibre. Food and Chemical Toxicology 41 (2003) [2] *Khallouki, F., *Younos, C., *Oster, T., *Charrouf Z., Spiegelhalder, B., Bartsch, H. Owen R.W.: Consumption of argan oil (Morocco) with its unique profile of fatty acids, tocopherols, squalene, sterols and phenolic compounds should confer valuable cancer chemopreventive effects. European Journal of Cancer Prevention 12 (2003) [3] Owen, R.W., Haubner, R., *Mier, W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: The isolation, structural elucidation and antioxidant potential of the major phenolic compounds in brined olive drupes. Food and Chemical Toxicology 41 (2003) [4] Bartsch, H., Nair, J., Owen, R.W.: Exocylic DNA adducts as oxidative stress markers in colon carcinogenesis: Role of lipid peroxidation, dietary fats and antioxidants. Journal of Biological Chemistry 383 (2002) Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren [5] *Little, J.L., Owen, R.W., *Fernandez, F., *Hawtin, P.G., *Hill, M.J., *Logan, R.F.A., *Thompson, M.H., *Hardcastle, J.D.: Asymptomatic colorectal neoplasia and fecal characteristics: a case control study of subjects participating in the Nottingham fecal occult blood screening trial. Dis. Colon Rectum 45 (2002) [6] Owen, R.W., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Possible molecular targets for exogenous factors. In. Exogenous Factors in Colonic Carcinogenesis - Falk Symposium 128 (W. Scheppach, M. Scheulen Eds), Kluwer Academic publishers, Lancaster, UK. (2003) Genetische Suszeptibilitätsmarker B. Spiegelhalder, A. Risch Genetische Enzympolymorphismen, aus denen sich ein veränderter Phänotyp ergibt, können ein erhöhtes Risiko für bestimmte schadstoffbedingte Krebsarten zur Folge haben (Bartsch et al. Cancer Epidemiol. Biomarkers and Prevention 2000). 2.1 Die Bedeutung genetischer Polymorphismen in Phase I- und Phase II-Enzymen bei der Entstehung von Lungenkrebs A. Risch, H. Dally, K. Gassner, D. Butkiewicz, S. Stöckigt, P. Schmezer, B. Spiegelhalder, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit: P. Drings, H. Dienemann, K. Kayser, V. Schulz, J.R. Fischer, S. Tuengerthal, Thoraxklinik, Heidelberg; L. Edler, DKFZ. Zusatzfinanzierung: Projekt- und Personalmittel: Deutsche Krebshilfe, Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland Dies wird im Rahmen einer Fall-Kontrollstudie untersucht. Blutproben und Angaben zur Schadstoffexposition von über 1800 Personen (Patienten mit primärem Bronchialkarzinom bzw. Krankenhauskontrollen ohne Malignom) konnten bisher archiviert werden. Gewebeproben zur späteren Korrelation der Ergebnisse mit weiteren Biomarkern wie z.b. Adduktspiegel [3] wurden ebenfalls archiviert. Ein Polymorphismus im Myeloperoxidase-Gen (MPO-463), der mit einer verringerten Expression des Enzyms und infolgedessen mit einer geringeren Aktivierung von Tabakkarzinogenen assoziiert ist, führt bei Trägern dieser Variante zu einem verringerten Bronchialkarzinomrisiko [2]. Der stärkste protektive Effekt ergibt sich für variante Allelträger in Bezug auf die Entwicklung eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms [2]. Der unterschiedliche Anteil verschiedener Histologien (Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Karzinom) innerhalb verschiedener Studien zum Einfluss von MPO- 463 auf das Lungenkrebsrisiko könnte ein Grund für die unterschiedlich stark ausgeprägten protektive Effekte sein [5]. Aktuelle Ergebnisse zeigen, dass rauchende Träger einer Genvariante im Cytochrom P450 3A4 Gen (CYP3A4* 1B) ein gegenüber Nichtträgern dieses Allels mehr als doppelt erhöhtes Risiko haben, am kleinzelligen Bronchialkarzinom zu erkranken [7]. Zudem scheint beim varianten CYP3A4 Allel auch das Geschlecht, besonders in Verbindung mit der konsumierten Menge an Tabak, eine Rolle hinsichtlich der Suszeptibilität für Lungenkrebs zu spielen [7]. Zwischen Allelvarianten verschiedener Mitglieder der CYP3A Familie besteht jeweils ein hohes Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium), aber keine komplette Kopplung [11]. Es konnte gezeigt werden, dass der für CYP3A4*1B in Lungenkrebspatienten gefundene Effekt nicht, wie ursprünglich angenommen, auf das CYP3A5*1 Allel zurückzuführen ist, sondern tatsächlich auf der CYP3A4*1B Variante beruht [7]. Genotypisierungsdaten für weitere schadstoffmetabolisierende Enzyme, die im Zu-

181 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention sammenhang mit Zigarettenrauch-induziertem Lungenkrebs von Interesse sind, werden derzeit ausgewertet (u.a. CYP1B1) und verschiedene genetische Polymorphismen werden noch untersucht. Ein Projektziel ist die Erstellung eines Markerprofils, welches die Identifikation von Individuen mit erhöhtem Lungenkrebsrisiko erlaubt. Ferner werden zur Bestimmung der möglichen Relevanz genetischer Polymorphismen bei der Chemotherapiesensitivität und für die Prognose von Bronchialkarzinompatienten derzeit weiterhin Probanden rekrutiert und klinische Daten erfasst und ausgewertet. 2.2 EU-Projekt: Molekulare Biomarker zur Lungenkrebsfrüherkennung A. Risch, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit: P. Drings, H. Becker, Thoraxklinik, Heidelberg; J. K. Field, Univ. of Liverpool, UK and the EU-Early Lung Cancer Detection Group ( Zusatzfinanzierung: Projekt und Personalmittel: 5. EU- Rahmenprogramm Im Rahmen einer EU-weiten Kooperation wurde in 11 Zentren mit der Patientenrekrutierung begonnen. Ziel ist die Evaluierung potentieller Marker zur Früherkennung von Lungentumoren. Dazu werden Patienten identifiziert, die ein hohes Risiko haben an einem zweiten Primärtumor zu erkranken und kontinuierlich über 3 Jahre klinisch beobachtet (Spiral CT, Fluoreszenz-Bronchoskopie) werden. Archivierte Blut- und Gewebeproben (Primärtumor, Sputum/ Bronchoalveoläre Lavage) werden mit modernen molekularen/pathologischen Methoden zur Identifizierung geeigneter Marker (LOH, Methylierung, Protein Expression, Genotypisierung) untersucht. 2.3 Die Entwicklung neuer Genotypisierungsmethoden und Identifikation neuer Allele A. Risch, H. Dally, B. Spiegelhalder, H. Bartsch Zusatzfinanzierung: Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.v.) Zur Durchführung großer Fall-Kontrollstudien sind neue Genotypisierungsmethoden notwendig, die einen höheren Probendurchsatz als herkömmliche PCR/RFLP-basierte Methoden erlauben. Genotypisierungsmethoden auf der Basis von Fluoreszenz-basierter Schmelzkurvenanalyse wurden für verschiedene bekannte Polymorphismen wie z.b. in N-Acetyltransferasen, Glutathiontransferasen, CYP3A4 und CYP3A5 [7] und Myeloperoxidase [2] entwickelt. Weiterhin werden Methoden zur Identifizierung bisher nicht bekannter genetischer Polymorphismen etabliert. 2.4 Identifikation bisher unbekannter MRP3 (ABCC3) Polymorphismen A. Risch, B. Jäger In Zusammenarbeit mit D. Keppler, A. Nies, J. König, DKFZ. Zusatzfinanzierung: Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.v.) Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Multidrug resistance protein 3 ist ein ATP abhängiges Membranprotein dass Gallensäuren und verschiedene mit Glukuronsäure, Sulfat oder Glutathion konjugierte organische Anionen aus Zellen exportiert. Überexpression von MRP3 kann zur Resistenz gegenüber Zytostatika wie Etoposid, Teniposid und Vincristin führen. Mittels single strand conformation polymorphism (SSCP)-Analyse wurden neue, bisher unbekannte genetische Polymorphismen im Multidrug Resistance Protein 3 Gen (MRP3/ABCC3) identifiziert, und Ihre Allelfrequenz in der Europäischen Bevölkerung bestimmt. Eine ausgewählte Allelvariante wird nun im Rahmen der Kooperation funktionell charakterisiert. 2.5 Zigarettenrauch und genetische Polymorphismen als Risikomarker für Brustkrebs A. Risch, B. Spiegelhalder, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit J. Chang-Claude, S. Kropp, M. Rohrbacher, DKFZ, Abtl. Klin. Epidemiologie. Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe, Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.v.) Der langsame NAT2-Acetyliererstatus ist bei Raucherinnen als ein Risikofaktor für die Brustkrebsentstehung identifiziert worden [Ambrosone et al, JAMA 1996). Allerdings ist Rauchen als ätiologischer Faktor bei der Brustkrebsentstehung umstritten. Aus Blasenkrebsstudien ergibt sich, dass der Genotyp bei niedriger Schadstoffdosis besonders wichtig für das individuelle Risiko sein kann. Im Rahmen dieser Kooperation wird diese Hypothese für Brustkrebspatientinnen getestet. Beim separaten Vergleich von Aktiv- und Passivraucherinnen mit nicht Tabakrauch-exponierten Frauen waren die Brustkrebsrisiken unterschiedlich bezüglich des NAT2 Status. Ein signifikant erhöhtes Risiko ergab sich bei langsam Acetylierenden für das Rauchen von mehr als 10 Packyears, OR 1.8 (1-3.2), jedoch nicht für schnell Acetylierende. Andererseits war der Zusammenhang zwischen Passivrauchen und erhöhtem Brustkrebsrisiko stärker bei schnell als bei langsam Acetylierenden (OR 1.9 ( ) bzw. OR 1.2 ( )). Es wird deutlich, dass bei Studien zu Gen-Umweltinteraktion zwischen Aktiv-, Passiv- und Nichtrauchern unterschieden werden muss. Neben der unterschiedlichen Gesamtschadstoffdosis beim Aktiv- und Passivrauchen könnten auch Unterschiede in der Zusammensetzung des mainstream und side-stream Tabakrauchs das Gen-Umweltinteraktions-bedingte Krebsrisiko beeinflussen [1]. Analysen zu weiteren genetischen Polymorphismen sind im Gange. 2.6 Relevanz von Enzympolymorphismen bei der Entstehung des Larynxkarzinoms A. Risch, V. Raedts, P. Schmezer, N. Rajaee-Behbahani, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit H. Ramroth, DKFZ; H. Becher, Institut für Tropen-Hygiene, Univ. Heidelberg; A. Dietz, Kopfklinik Heidelberg. Zusatzfinanzierung: Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie; Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.v.) Im Rahmen einer populationsbasierten Fall-Kontroll-Studie zur Ätiologie von Larynxkarzinomen werden mögliche Gen- Umweltinteraktionen untersucht. Beim Vergleich von je rund 250 Fällen und gemachten Kontrollen wurden Alkohol- und Tabakkonsum als signifikante Risikofaktoren identifiziert. Statistische Auswertung der Genotypanalysen für Alkoholdehydrogenasen ADH 2 und 3 und Glutathiontransferasen GSTM1 und GSTT1 ergaben jedoch keine Hinweise auf eine signifikante Beeinflussung dieses Risikos durch die untersuchten ADH oder GST Genotypen [4]. Alle Projekte sollen zu einem besseren Verständnis der Ätiologie der verschiedenen Krankheiten beitragen und Hinweise auf einen möglichen Mechanismus der Aktivierung von Karzinogenen durch den menschlichen Stoffwechsel geben [6]. Anonymisierte Genotypisierungsdaten werden zur Beantwortung von Fragestellungen, für die sehr viel größere Fallzahlen notwendig sind, zusätzlich in internatio- 181

182 182 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention naler Zusammenarbeit ausgewertet [8]. Die Identifikation von Hochrisikogruppen ist von Bedeutung für verschiedene präventive Ansätze z.b. im Rahmen der Grenzwertfestsetzung, gesundheitlicher Aufklärungskampagnen [10] oder der Chemoprävention. Die Etablierung genetischer Polymorphismen als prädiktive Marker für Chemotherapiesensitivität würde eine Stratifizierung der Tumorbehandlung ermöglichen und sich damit zukünftig für die Patienten während einer Chemotherapie lebensqualitätssteigernd sowie insgesamt lebensverlängernd auswirken. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Chang-Claude, J., Kropp, S., Jäger, B., Bartsch, H., Risch, A.: Differential effect of NAT2 on the association between active and passive smoke exposure and breast cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomarkers and Prevention 11 (2002) [2] Dally, H., Gassner, K., Jäger, B., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., Edler, L., *Drings, P., *Dienemann, H., *Schulz, V., *Kayser, K., Bartsch, H., Risch A.: The Myeloperoxidase -463 G>A variant allele is associated with reduced risk for Small Cell Lung Cancer in smokers. International Journal of Cancer 102 (2002) [3] Godschalk, R.W.L., Nair, J., Risch, A., *Van Schooten, F.-J., *Drings, P., *Kayser, K., *Dienemann, H. Bartsch, H.: Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis 23 (2002) [4] Risch, A., *Ramroth, H., Raedts, V., Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Bartsch, H., *Becher, H., * Dietz A. Genetic Polymorphisms in class I alcohol dehydrogenases ADH1B and ADH1C, and glutathione-s-transferases GSTM1 and GSTT1 do not significantly modify the alcohol- and tobacco smoke-associated laryngeal cancer risk. Pharmacogenetics 13 (2003) [5] Dally, H. Bartsch, H. Risch, A.: Correspondence re: Feyler et al., Point: Myeloperoxidase (-463)G à A Polymorphism and Lung Cancer Risk. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev., 11: , 2002, and Xu et al., Counterpoint: The Myeloperoxidase (-463)G à A Polymorphism Does Not Decrease Lung Cancer Susceptibility in Caucasians. 11: , Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 12 (2003) 683. [6] Bartsch, H., Risch, A., Werle-Schneider, G., Schmezer, P.: Krebs - Molekulare Frühwarnsysteme. In Krebsmedizin II, Spektrum der Wissenschaft Spezial 3 (2003) [7] Dally, H., Edler, L., Jäger, B., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Drings, P., *Schulz, V., *Kayser, K., Bartsch, H., Risch A.: The CYP3A4*1B allele increases risk for small cell lung cancer: effect of gender and smoking dose. Pharmacogenetics 13 (2003) [8] *Smits, K.M., *Benhamou, S., *Gaspari, L., *Weijenberg, M.P., *Alamanos, Y., *Ambrosone, C., *Autrup, H., *Autrup, J.L., *Baranova, H., *Bathum, L., Boffetta, P., *Brockmoller, J., *Butkiewicz, D., *Cascorbi, I., *Clapper, M.L., *Coutelle, C., *Daly, A., *Muzi, G., *Dolzan, V., *Duzhak, T.G., *Farker, K., *Garte, S., *Golka, K., *Haugen, A., *Hein, D.W., *Hildesheim, A., *Hirvonen, A., *Hsieh, L., *Ingelman-Sundberg, M., *Kalina, I., *Kang, D., *Katoh, T., *Kihara, M., *Kihara, M., *Kim, H., *Kiyohara, C., *Kremers, P., *Lazarus, P., *Le Marchand, L., *Lechner, M.C., *London, S., *Manni, J.J., *Maugard, C.M., *Morgan, G.J., *Morita, S., *Nazar-Stewart, V., *Nedelcheva Kristensen, V., *Oda, Y., *Parl, F.F., *Peters, W.H.M., *Rannug, A., *Rebbeck, T., *Ribeiro, *Pinto, L.F., Risch, A., *Romkes, M., *Šalagovic, J., *Schoket, B., *Seidegard, J., *Shields, P.G., *Sim, E., *Sinnett, D., *Strange, R.C., * Stucker, I., *Sugimura, H., *To- Figueras, J., *Vineis, P., *Yu, M.C., *Zheng, W., *Taioli, E.: Association of metabolic gene polymorphisms with tobacco consumption in healthy controls. International Journal of Cancer 110 (2004) [9] Bartsch, H., *Haugen, A., Risch, A., *Shields, P., *Vineis, P. Section 10108: Genetic Polymorphisms. In Chapter 1, Tumours of the lung, In: WHO Classification of tumours of the lung, thymus and heart, in press. Abteilung C010 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren [10] Bartsch, H., Risch, A.: Einfluss genetischer Polymorphismen auf das Erkrankungsrisiko bei Tabakrauch-assoziierten Tumoren. Bericht der 6. Deutsche Nikotinkonferenz, Erfurt Mai (2003),Hrsg. K.-O. Haustein, Organon-Verlag, Weinheim (2004), S [11] Dally, H., Bartsch, H., Jäger, B., Edler, L., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Drings, P., *Kayser, K., *Schulz, V., Risch, A. Genotype relationships in the CYP3A locus in Caucasians. Cancer Letters 207 (2004) Multizentren-Fall-Kontrollstudie zur molekularen Epidemiologie von Mundhöhlenund Rachenkrebs U. Nair, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit S. Francheschi, R. Herrero, N. Muñoz, IARC, Lyon, Frankreich. Eine frühere Studie zeigte, dass der Nullgenotyp von GSTM1 und GSTT1 allein oder in Kombination das Risiko für Leukoplakien bei Indern erhöht (Nair U.J., et. al., Carcinogenesis 20, 1999, 643). Beide Enzyme GSTM1 sowie GSTT1 katalysieren bekanntlich die Detoxifizierung von reaktiven Sauerstoffradikalen, LPO-Produkten und Tabak-assoziierten Karzinogenen, die im Speichel von Betelnuss/Tabakrauchern gefunden wurden. In einer multizentrischen Kooperationsstudie mir der IARC wurde ein Risikomarkerprofil erstellt, um Personen mit einem hohen Mundhöhlenkrebsrisiko identifizieren zu können. So können ethnische Unterscheide aufgeklärt und mit klassischen epidemiologischen Faktoren sowie anderen molekulargenetischen Markern korreliert werden. Die Studie umfasst 2000 Fälle in 8 Ländern auf 4 Kontinenten. DNA-Extraktion und Genotypanalysen von ca. 400 Proben ethnischer indischer Probanden wurden am DKFZ durchgeführt. Dabei zeigten sich geschlechtsspezifische Unterschiede bezüglich verschiedener Genotypen und dem Mundhöhlenkrebsrisiko: GSTT1 Wildtyp erhöhte das Risiko bei Männern, während das GSTP1 Allel mit erniedrigter Enzymaktivität und das CYP1B1*3 Allel bei Frauen, die Betelnuss/Tabak kauten, das Risiko signifikant erhöht (Manuskript in Vorbereitung).

183 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C020 Klinische Epidemiologie Abteilung Klinische Epidemiologie (C020) Leiter: Prof. Dr. Anthony B. Miller (kommissarisch, -3/03) Prof. Dr. Paolo Boffetta (9/03-3/04) Prof. Dr. Nikolaus Becker (kommissarisch) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Hans-Peter Altenburg Prof. Dr. Nikolaus Becker Prof. Dr. Jenny Chang-Claude Marie-Luise Groß (½, -10/03) Irmgard Helmbold Dr. Silke Hermann ( -12/03) Jutta Kneisel (½) Dr. Silke Kropp Dr. Gabriele Nagel Dr. Alexandra Nieters Dr. Irene Reinisch ( -6/03) Dr. Tilla Ruf Simon Roether (10/0 - ) Dr. Tracy Slanger (7/02- ) Dorothee Zoller ( -3/03) Doktoranden Lars Beckmann Maren Rohrbacher Sabine Rohrmann ( -1/02) Technische Mitarbeiter Anette Albrecht-Schmitt (½, 2/03- ) Karin Becker Renate Birr Evelin Deeg Ursula Eilber Erika Fisch Hiltrud Förster (½, 4/02-4/03) Ulla Gromer (¾) Belinda Su Kaspereit Martina Keith (½, -4/02) Margarete Klingenberg (-4/03) Ina Kögel Waltraud Kröner (¾) Ilona Krüger-Friedemann (½, 5/01- ) Yvonne Küster (½) Paula Nowak ( - 4/03) Michaela Rauchholz (9/02-1/03) Jutta Schmitt Kati Smit Margot Villhauer-Lehr Ulla Gromer (¾) Belinda Su Kaspereit Sonstige Mitarbeiter Ronak Amanat (8/03- ) Helga Buchmüller Severin ElAlamy Benjamin Heinzerling (Zivi) Paula Novak Marcel Reinhardt ( -8/02) Jochen Rudolph ( -9/02) Julia Schliwka ( -6/02) Marcel Reinhardt ( -8/02) Sekretariat Petra Rössler Heike Weis Gegenstand der Abteilung Klinische Epidemiologie sind die Identifizierung von Faktoren, die zur Entstehung von Krebs führen, und gegebenenfalls die Quantifizierung der mit einer Exposition verbundenen Risiken. Ein weiterer Schwerpunkt der Forschung sind die Untersuchung von Möglichkeiten zur Vorbeugung und Früherkennung von Krebserkrankungen sowie die Evaluation der Effektivität bereits implementierter Maßnahmen. Neu in das Forschungsprogramm aufgenommen ist der Bereich der Prüfung der Effektivität neuer Diagnose- und Behandlungsverfahren. Schließlich gehört zu den Aufgaben der Abteilung auch die Verbreitung von Informationen über wirksame Maßnahmen zur Krebsprävention. Krebsprävention N. Becker, D. Bayaz, E. Deeg, B. Heinzerling, I. Krüger-Friedemann, A. Nieters, M. Reinhardt, S. Rohrmann, J. Rudolph, J. Schliwka, T. Ruf Kooperationen: BIPS, Bremen (Dr. Wolfgang Ahrens, Dr. Klaus Giersiepen, Prof. Dr. Eberhard Greiser); IARC Lyon, Frankreich (Dr. Paolo Boffetta, Dr. Paul Brennan, Dr. Elio Riboli, Dr. Rengsawami Sankaranarayanan); Süddeutsche Metall BG Mainz; Universität Heidelberg (Prof. Dr. med. Stefan Meuer); Universität München, München (Dr. Leonhard Knorr-Held, Prof. Dr. Ludwig Fahrmeier); Universität Bielefeld (Prof. Dr. Maria Blettner); Universität Würzburg (Prof. H.K. Müller-Hermelink); Zentralinstitut für die Kassenärztliche Versorgung in der BRD; Krankenhäuser in den Studienregionen Modellprojekt Mammograpie-Screening Wiesbaden Epidemiologische Studien belegen, daß Mammographie- Screening bei 50-69jährigen Frauen die Brustkrebsmortalität um bis zu 30% senken kann. Voraussetzung ist die Einhaltung bestimmter, auf der Grundlage dieser Studien quantifizierbarer hoher Qualitätsstandards. Ziel des in der Region Wiesbaden/ Rheingau-Taunus-Kreis von niedergelassenen Ärzten und der Planungsstelle Mammographie- Screening in Zusammenarbeit mit dem DKFZ im Jahr 2001 begonnenen Vorhabens ist es, die erforderlichen Erfahrungen für die Durchführung eines organisierten, qualitätsgesicherten Mammographie-Screenings zu sammeln und im Hinblick auf eine bundesweite flächendeckende Einführung wissenschaftlich zu evaluieren. Zwischenauswertungen haben gezeigt, dass dieses Modellprojekt ebenso wie die beiden anderen in Bremen und Weser-Ems von Beginn an die in Europäischen Richtlinien zu qualitätsgesichertem Mammographie-Screening empfohlenen Qualitätsstandards erreichen bzw. übertreffen konnte. Lungenkrebs-Screening Von den etwa in jedem Jahr neu diagnostizierten Erkrankungsfällen an Lungenkrebs sterben 85-90% an der Krankheit. Mit Todesfällen in jedem Jahr ist Lungenkrebs damit nach wie vor die häufigste Krebstodesursache in Deutschland. Theoretisch könnte eine frühzeitige Erkennung der Tumoren die Überlebenschancen nachhaltig verbessern, doch verliefen in der Vergangenheit Prüfungen von eventuellen Früherkennungsverfahren stets enttäuschend. Neueste Ergebnisse deuten nun allerdings darauf hin, daß spezielle Verfahren der Computertomographie möglicherweise frühe Stadien der Lungenkrebsentwicklung entdecken und zur Senkung der Sterblichkeit beitragen können. In Zusammenarbeit mit Radiologen des DKFZ wird derzeit eine randomisierte Studie zur Überprüfung dieses neuen Verfahrens vorbereitet. Das Vorhaben wird eingebettet sein in eine breite internationale Zusammenarbeit unter Einschluß europäischer und nordamerikanischer Gruppen. Kolorektales Screening Mit etwa Todesfällen im Jahr ist Darmkrebs die zweithäufigste Krebstodesursache und etwa Neuerkrankungsfällen im Jahr die häufigste Krebskrankheit in Deutschland. In den letzten Jahren veröffentlichte Ergebnisse randomisierter Studien haben gezeigt, daß mit dem Test auf okkultes Blut im Stuhl (FOBT) eine bis zu 30%ige Senkung der Sterblichkeit an kolorektalen Tumoren erreicht werden kann. Eine bevölkerungsweite Einführung dieses 183

184 184 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C020 Klinische Epidemiologie Tests wird daher empfohlen. In Deutschland ist er bereits seit 1977 Bestandteil des gesetzlichen Früherkennungsprogramms. Eine weitaus stärkere Senkung der Krebssterblichkeit ist allerdings von einer breiten Anwendung der vollständigen Koloskopie ( Darmspiegelung ) zu erwarten, die im Jahr 2002 ebenfalls in das Früherkennungsprogramm aufgenommen wurde. Empfohlen wird eine Darmspiegelung im Alter von 55 Jahren und eine weitere 10 Jahre später. Derzeit wird ein Studienprotokoll für eine quasi-experimentelle prospektive Studie ausgearbeitet, die die in der Routineanwendung tatsächlich erreichbare Senkung der Sterblichkeit an kolorektalen Tumoren und andere wichtige, die Effektivität des Verfahren charakterisierende Parameter sowie mit dem Screening verbundene Risiken quantifizieren soll. Gebärmutterhalskrebs-Screening Gebärmutterhalskrebs ist weltweit eine der häufigsten Krebsarten (etwa Neuerkrankungsfälle jährlich, 10 % aller Krebsfälle bei Frauen). Aufgrund einer wirksamen Früherkennung ist in Deutschland diese Krebsart mit etwa 7000 Neuerkrankungsfällen jährlich (4 %) weitaus seltener. Gleichwohl besteht nach wie vor Unsicherheit hinsichtlich der Screeninghäufigkeit und geeigneter Kriterien für eventuell erforderliche chirurgische Eingriffe. Viele der bei der Früherkennung entdeckten Läsionen hängen mit Infektionen mit Papillomviren (HPV) zusammen, die vorübergehend sind, so daß sich die Veränderungen von selbst wieder zurückbilden. Allerdings entwickelt sich ein kleiner Teil dieser Veränderungen zu Gebärmutterhalskrebs weiter. Da die HPV-Infektion notwendige Voraussetzung für die Entstehung dieser Krebsart ist, versucht man neuerdings, durch einen spezifischen Test auf Papillomviren die Bekämpfung des Gebärmutterhalskrebses effizienter zu machen. Allerdings kann dieser Test nicht zwischen vorübergehenden und persistenten Infektionen unterscheiden. Nur letztere entwickeln sich zu Krebs. Das Risiko unnötiger chirurgischer Eingriffe nimmt durch diesen Test daher eher noch zu. Ein im DKFZ entwickelter neuartiger Test (p16 INK4a ) ist in der Lage, spezifisch die persistenten, d.h. mit hohem Risiko zu Gebärmutterhalskrebs führenden Veränderungen zu identifizieren. Gegenwärtig wird eine randomisierte epidemiologische Studie vorbereitet, mit der dessen Eignung für einen Einsatz beim Screening überprüft wird. Eine nicht-randomisierte Vorstudie zur Bestimmung von Sensitivität und Spezifität des Tests wurde bereits begonnen. Fall-Kontrollstudie zur Ätiologie von Lymphomen Lymphome gehören zu den wenigen Krebsarten, für die die Inzidenz in Deutschland weiterhin ansteigt. Im internationalen Schrifttum veröffentlichte Studien deuten daraufhin, daß das Antwortverhalten des Immunsystems sowie infektiöse Erreger an der Ätiologie von Lymphomen beteiligt sind. Diese beiden Bereiche sind Schwerpunkte einer Fall- Kontrollstudie, die im Jahr 1999 begonnen wurde, und deren Patientenrekrutierung Ende 2002 abgeschlossen wurde. Weitere zu berücksichtigende Faktoren sind eine Exposition gegenüber Pestiziden sowie berufliche Expositionen, beispielsweise gegenüber chemischen Agentien oder Asbest sein. Ein weiterer Hintergrund der Studie ist die Tatsache, daß in den letzten Jahren eine moderne molekularbiologisch begründete Diagnostik und Klassifikation entwickelt wurde, die sich nun auch international durchgesetzt hat. Auf dieser Grundlage durchgeführte epidemiologische Untersuchungen lassen erwarten, daß Zusammenhänge zwischen spezifischen Expositionen und spezifischen Entitäten von Lymphomen eher gefunden werden können. Die Studie wurde in sechs Regionen Deutschlands durchgeführt (Heidelberg/Rhein-Neckar-Kreis, Ludwigshafen/Vorderpfalz, Würzburg, Bielefeld, Hamburg und München). Die Kontrollgruppe wurde im Verhältnis 1 : 1 alters- und geschlechtsgleich aus der Allgemeinbevölkerung gezogen. Im Hinblick auf die Durchführung von Virusnachweisen und Untersuchungen zu genetischen Polymorphismen, bzw. Gen-Umwelt-Interaktionen wurden von Fällen und Kontrollen jeweils Blutproben genommen und eingefroren. Die Studie ist an dem deutschen Kompetenznetz Maligne Lymphome, dem europäischen kooperativen Projekt EPILYMPH sowie dem internationalen Kooperationsvorhaben INTER- LYMPH beteiligt. [68] Immungenetische Determinanten von Allergien Bestimmte Faktoren, die an der Entstehung von Allergien beteiligt sind, spielen möglicherweise auch bei der Entstehung bestimmter Krebsarten, darunter auch Lymphome und Leukämien, eine Rolle. Darauf deuten epidemiologische Studien hin, die teilweise ein verändertes Krebsrisiko unter Allergikern festgestellt haben. Da sowohl Allergien als auch Lymphome einen immunologischen Hintergrund haben, kann die Untersuchung gemeinsamer immunologischer Faktoren auch mit der Charakterisierung immungenetischer Voraussetzungen für die Entwicklung von Allergien begonnen werden. Entsprechende Untersuchungen wurden im Berichtszeitraum im Rahmen von EPIC fortgeführt und im Rahmen von Kooperationsprojekten auch in umfangreicheren Studien eingesetzt. Analoge Auswertungen wurden inzwischen auch im oben genannten Lymphomprojekt begonnen. [82] Immungenetische Determinanten von Gebärmutterhalskrebs Infektion mit Human-Papillomviren (HPV) im Genitalbereich sind häufig und in aller Regel vorübergehend und harmlos. Nur in einem sehr kleinen Teil der Fälle wird das Virus durch die Immunabwehr nicht eliminiert und führt zu einer persistenten Infektion. Eine persistente Infektion ist Voraussetzung für die Entstehung von Gebärmutterhalskrebs. Mit dem vorliegenden Projekt sollen immungenetische Determinanten identifiziert werden, die das Risiko für eine persistente Infektion erhöhen. Diese können dann eventuell bei der Früherkennung von Gebärmutterhalskrebs behilflich sein. Molekulargenetische Determinanten zu Wachstum und Ausbreitung von Brustkrebs Sowohl bei klinisch diagnostizierten als auch bei im Screening entdeckten Karzinomen der Brust ist zu beobachten, dass selbst kleine Tumoren bereits lymphknotenpositiv, d.h. in einem fortgeschrittenen Stadium sind und daher eine ungünstigere Prognose haben. Die Tumoren wurden in diesen Fällen trotz Screening nicht früh genug erkannt. Es ist bekannt, dass die für die Entwicklung von Tumoren erforderliche Angiogenese auch bei der Metastasierung eine bedeutende Rolle spielt. In den für die Angiogenesefaktoren kodierenden Genen wird eine zunehmende Zahl von z.t. auch funktionell relevanten Polymorphismen gefunden. Fragestellung des Vorhabens ist es festzustellen, ob durch Polymorphismen definierte genetische Variation Einfluss auf die frühe Lymphknotenmetastasierung hat. Für diese Untersuchung sollen von den im Rahmen der Modellprojekte Mammographie-Screening identifizierten Brustkrebspatientinnen Blutproben gesammelt und die diagnostischen Daten

185 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention zusammengetragen werden. Anhand der Blutproben wird hinsichtlich der relevanten Gene eine Genotypisierung vorgenommen. Lymphknotenstatus und Genotyp werden im Sinne von Assoziationsstudien auf eine mögliche Beziehung ausgewertet. Wenn auf diesem Weg Marker einer genetischen Disposition für eine frühe Metastasierung gefunden werden, können diese zur Identifizierung von Hochrisikogruppen verwendet und Screeningmodalitäten entsprechend angepasst werden. [66] Statistische Methoden zur Evaluation von Assoziationsstudien mit Einzel-Nukleotid- Polymorphismen (SNPs) Es wird davon ausgegangen, dass der überwiegende Teil der interindividuellen Variation des menschlichen Genoms verursacht ist von Veränderungen in einzelnen Nukleotiden, den sog. single nucleotid polymorphisms (SNPs). Man schätzt, dass im Durchschnitt sechs solcher SNPs in einem Gen anzutreffen sind. Viele davon befinden sich in nicht-kodierenden Bereichen. Eine zunehmende Zahl wird jedoch auch in kodierenden Genbereichen gefunden und erweisen sich als funktionell relevant. Ein Teil davon kann wiederum krankheitsrelevant sein oder eine Rolle bei der Wirksamkeit von Medikamenten spielen. Die Suche nach derartigen krankheitsrelevanten SNPs hat daher in den letzten Jahren eine wachsende Bedeutung erlangt. Allerdings kommt es sehr häufig vor, dass eine zunächst gefundene Assoziation zwischen einem SNP und einer Krankheit in Folgeuntersuchungen nicht reproduzierbar ist. Zum Teil kann dies damit zusammenhängen, dass die Untersuchungen mit epidemiologisch nicht gut charakterisierten Patientenkollektiven durchgeführt wurden, zum Teil aber auch damit, dass es sich um nicht reproduzierbare Zufallsbefunde handelt. Um das Risiko von Zufallsbefunden zu verringern, wurde in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagen, die Auswertungen mit einem zweistufigen Verfahren vorzunehmen. Außerdem wurden epidemiologische Kriterien angegeben, die bei der Auswahl des Patientengutes zu beachten sind, mit dem solche Studien durchgeführt werden. Das vorgeschlagene Verfahren hat den Vorteil, dass im Durchschnitt weniger biologische Proben, die im allgemeinen aufwendig zu sammeln und daher wertvoll sind, benötigt werden und durch die faktisch durchgeführte studieninterne Prüfung der Reproduzierbarkeit von Befunden deren Glaubwürdigkeit erhöht wird. [67] Krebsatlas für Deutschland In Fortschreibung des im Jahr 1997 erschienen Atlas der Krebsmortalität in Deutschland werden jährlich die Daten und Grafiken zur säkularen Entwicklung der Sterblichkeit an Krebs insgesamt und den im Atlas aufgeführten Einzellokalisationen auf das Internet übertragen und ermöglichen einen raschen Zugriff auf den jeweils aktuellen Stand der Krebssterblichkeit in Deutschland. Die Daten bilden die Grundlage für Beiträge in Zeitschriften, in denen über den Stand des Wissens zu bestimmten Krebskrankheiten berichtet wird, für weitergehende statistische Untersuchungen und auch für Auswertungen epidemiologischer Studien der Abteilung. [34,35,38,64,69] Internet: Der deutsche Krebsatlas. Anwendung Bayesianischer Modellierung auf kartographische Darstellungen der stadienspezifischen Krebsinzidenz Effektive Krebsfrüherkennung führt zu einer Stadienverschiebung der in der betreffenden Bevölkerung diagnostizierten Krebsfälle in Richtung früherer, besser behandelbarer Stadien. Auch wenn für ein Früherkennungsverfahren die Abteilung C020 Klinische Epidemiologie prinzipielle Effektivität wissenschaftlich nachgewiesen wurde, kann in der Praxis die Effektivität gering sein, wenn die Flächendeckung des Angebotes unzureichend, die Qualität der Durchführung nicht optimal oder die Teilnahmebereitschaft gering ist. Die beobachtete Stadienverschiebung ist dann auch geringer als theoretisch zu erwarten wäre. Insbesondere können sich regionale Unterschiede in den genannten Faktoren durch regionale Unterschiede in der beobachteten Stadienverteilung bemerkbar machen. Die Analyse derartiger Unterschiede kann folglich Hinweise auf mögliche Versorgungslücken, Qualitätsprobleme oder eine mangelnde Teilnahmebereitschaft liefern und Hilfestellung für entsprechende gesundheitspolitische Maßnahmen bieten. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Statistik der Universität München wurde auf der Grundlage von in der letzten Zeit entwickelten Modellen zur räumlichen Statistik anhand der stadienspezifischen Inzidenzdaten für Gebärmutterhalskrebs aus dem Krebsregister der ehemaligen DDR exemplarisch derartige Analysen durchgeführt und überprüft, ob die Methoden geeignet sind, regionale Unterschiede in der Stadienverteilung zu detektieren und statistisch zu sichern. [12] Schätzung der durch Screening vermeidbaren Krebstodesfälle in Deutschland In Deutschland ist ein Anspruch auf jährliche Krebsfrüherkennungsuntersuchungen seit 1971 gesetzlich festgelegt. Das Programm ist allerdings als sog. opportunistisches Screening, d.h. nicht als organisiertes Screening, strukturiert, so dass die Teilnahmebereitschaft in der Vergangenheit recht gering war. Eine Qualitätssicherung findet nicht statt. Eine Abschätzung des Nutzens ergab, dass von einer durch das Programm bedingten Senkung der Krebsmortalität um etwa 2-6.5% auszugehen ist, wobei der überwiegende Teil der Früherkennung von Gebärmutterhalskrebs zuzuschreiben ist. Durch Steigerung von Effizienz und Qualität könnte eine weitere Senkung um etwa % erreicht werden. Diese Werte liegen in Größenordnungen, wie sie von Abschätzungen auch aus anderen Ländern bekannt sind [65,70]. Ernährungsepidemiologie P. Boffetta, A.B. Miller, A. Albrecht-Schmitt, H.-P. Altenburg, K. Becker, N. Becker, E. Fisch, H. Förster, U. Gromer, M.-L. Groß, M. Klingenberg, J. Kneisel, W. Kröner, I. Krüger-Friedemann, Y. Küster, G. Nagel, A. Nieters, P. Novak, M. Rauchholz, S. Roether, T. Ruf, J. Schmitt, M. Villhauer-Lehr, J. Wahrendorf, D. Zoller Kooperationen: Prof. Dr. Helmut Bartsch, DKFZ, Abt. Toxikologie und Krebsrisikofaktoren; Dr. Heiner Boeing, DIfE, Potsdam-Rehbrücke; Dr. Elio Riboli, International Agency for Research on Cancer, Lyon, Frankreich; Prof. Dr. A. Trichopoulo, Athens School of Public Health, Athen, Griechenland; Dr. Domenico Palli CSPO, Florenz, Italien; Dr. Anne Tjønneland Danish Cancer Society, Copenhagen, Dänemark; Dr. Paolo Vineis, Department of Cancer Epidemiology, Turin, Italien; Dr. Francoise Clavel, INSERM U. 287, IGR, Villejuif, Frankreich; Dr. Franco Berrino Instituto Nazionale dei Tumori, Mailand, Italien; Dr. Carlos Gonzáles ICO Barcelona, Spanien; Dr. Gunnar Berglund Malmö Diet & Cancer Study, Schweden; Dr. Nick Day MRC Biostatistics Unit, Cambridge, UK; Dr. Rosario Tumino Registro dei Tumori, Ragusa, Italien RIVM,; Dr. Bas Bueno de Mesquita Bilthoven, Netherlands; Dr. Kim Overvad University of Aarhus, Dänemark; Dr. Timothy J. Key University of Oxford, UK; Dr. Göran Hallmans University of Umea, Dept. of Epidemiology, Schweden; Dr. Eiliv Lund, University of Tromsø, Norwegen; Dr. Petra Peeters University of 185

186 186 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Utrecht, Niederlande; Dr. Rashmi Sinha National Cancer Institute, Bethesda, USA; Dr. Gunnar Steineck, Karolinska Institute, Stockholm, Schweden Die Vermutung, dass die Ernährung ein wichtiger Faktor für die Entstehung von Krebs darstellt, existiert seit langem. Doll and Peto (1981) rechneten etwa 35% der Todesfälle an Krebs einer ungünstigen Ernährung zu. Die grundsätzliche Bedeutung der Ernährung bei der Entstehung von Krebs gilt als unbestritten, wobei der Einfluss einzelner Lebensmittelgruppen, Nährstoffe und anderer Inhaltsstoffe für die Krebsentstehung nur für wenige Zusammenhänge so überzeugend bewiesen ist, dass daraus öffentliche Ernährungsempfehlungen abgeleitet werden können. Vom World Cancer Research Fund (WCRF) und dem American Institute for Cancer Research (AICR) wurden die Ergebnisse biomedizinischer und epidemiologischer Studien zur Erforschung des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Krebs in einem 1997 herausgegebenen Bericht zusammengefasst. Die vorhandenen biomedizinischen und epidemiologischen Forschungsergebnisse wurden zusammengestellt und hinsichtlich der Zusammenhänge zwischen Ernährung und Krebsrisiko als überzeugend, wahrscheinlich oder möglich bewertet. Als überzeugend wissenschaftlich bewiesen gelten demnach vor allem die protektive Wirkung von Gemüse und Obst für verschiedene Krebsarten (Mundhöhle, Rachen, Speiseröhre, Lunge, Magen). Auf der Seite der krebsfördernden Faktoren hat Alkohol eine übergreifende Bedeutung. Dabei wirkt Alkohol in Bezug auf die Karzinome des oberen Verdauungstraktes synergetisch mit dem Tabakrauchen, d.h. die Anwesenheit beider Faktoren verstärkt deren Einzelwirkungen. Das Ziel der Arbeitsgruppe ist es, zu einer weiteren Klärung des Zusammenhanges Ernährung und Krebs sowie anderen chronischen Erkrankungen beizutragen, um genauere Empfehlungen für eine gesundheitsfördernde Ernährung zu ermöglichen. Kohortenstudie Gesundheit, Ernährung, Krebs als Teilstudie von EPIC (European Prospective Investigation into cancer and Nutrition) Die Studie Gesundheit, Ernährung, Krebs wird seit 1994 von der Abteilung Epidemiologie des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) in Heidelberg als Teil der europäischen Langzeitstudie EPIC (European Prospective Investigation into cancer and Nutrition) durchgeführt. Mittlerweile sind 10 europäische Länder mit über Studienteilnehmern und -teilnehmerinnen beteiligt. In Deutschland befindet sich neben Heidelberg auch noch ein EPIC Zentrum am Deutschen Institut für Ernährungsforschung (DIFE) in Potsdam. EPIC zielt auf eine weitere Klärung des Zusammenhangs von Ernährung und Krebs. Die Durchführung einer prospektiven Kohortenstudie in mehreren europäischen Ländern mit unterschiedlichen Ernährungsweisen und deutlichen Unterschieden der Neuerkrankungsraten für verschiedene Krebsarten erhöht das Auswertungspotential erheblich. Das Projekt wird von der Abteilung Ernährung und Krebs der International Agency for Research on Cancer (IARC) in Lyon koordiniert. Mit EPIC wird versucht, die Beschränkungen früherer epidemiologischer Studien hinsichtlich der Präzision und Validität traditioneller Ernährungsfragebögen sowie der Anwendung biologischer Marker zu überwinden. Im Rahmen der Befragung wurden biologische Proben gewonnen, welche auf Grund der Größe eine einzigartige biologische Daten- Abteilung C020 Klinische Epidemiologie bank bilden. Molekularbiologische Untersuchungen sind Bestandteil des wissenschaftlichen Programms. Stand der Datenerhebung EPIC Heidelberg Rekrutierung Die Erstbefragung der Studienteilnehmer/-innen wurde in Heidelberg im Oktober 1998 abgeschlossen. Außer einer umfangreichen Erhebung der Ernährungsgewohnheiten wurden die Teilnehmer auch zu Rauchgewohnheiten, körperlicher Aktivität, subjektivem Befinden, Krankheitsgeschichte und Medikamenteneinnahme befragt. Begleitet wurde die Befragung von Blutentnahmen, Blutdruck- und Körpermessungen. Insgesamt haben über Personen aus Heidelberg und Umlandgemeinden an der Ersterhebung teilgenommen. Davon sind 53% Frauen und 47% Männer; 57% der Teilnehmer kommen aus dem Stadtbereich und 43% aus den Umlandgemeinden Heidelbergs. Von Teilnehmern (95,7%) konnten Blutproben gewonnen werden, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Nachbeobachtung Die Auswertung der EPIC-Studie beruht vor allem auf der möglichst lückenlosen Erfassung der Krebsneuerkrankungen und der Sterbefälle mit den jeweiligen Todesursachen. Deshalb kommt der Nachbeobachtung der gesamten Studienbevölkerung eine entscheidende Bedeutung zu. Die erste Nachbefragungsrunde hat in Heidelberg Anfang 1998 begonnen und wurde Anfang 2000 abgeschlossen. Es konnte eine Teilnahmerate über 93% erreicht werden. Die zweite Nachbefragungsrunde, bei der auch wieder die Ernährungsgewohnheiten erfragt werden, wurde Anfang 2001 begonnen. Alle Teilnehmer konnten bis Ende 2003 angeschrieben werden. Außer zu ihrem Ernährungsverhalten wurden die Studienteilnehmer erneut zu Krankheitsgeschichte, Teilnahme an Krebsvorsorgeuntersuchungen, Rauchverhalten, körperlicher Aktivität, Einnahme von Medikamenten, Hormonpräparaten und Nahrungsergänzungsstoffen befragt. Ein Fragebogen für die dritte Nachbefragungsrunde wurde erarbeitet und in einer Pilotphase getestet. Verifizierung Alle Selbstangaben der Studienteilnehmer/-innen zu Krebsneuerkrankungen werden durch den Vergleich mit pathologischen Befunden oder Arztberichten überprüft und gemäß des von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) vorgegebenen internationalen Schlüssels zur Klassifikation der Krankheiten (ICD-O2) kodiert. Um in fernerer Zukunft auch Informationen zu Krebsneuerkrankungen über das im Aufbau befindliche Epidemiologische Krebsregister Baden-Württemberg zu bekommen, wurde ein Verfahren entwickelt, das in anonymisierter Form einen routinemäßigen Abgleich der EPIC-Daten mit den Daten des Krebsregisters erlaubt. Gleichzeitig melden wir alle von uns innerhalb der Heidelberger Studienbevölkerung erfassten Krebsfälle an das Krebsregister und leisten auf diese Weise einen Beitrag zur Vervollständigung des Krebsregisters. Dieser Datenaustausch wird kontinuierlich durchgeführt. Auswertung Abschätzungen des Krebsrisikos für verschiedene Expositionsfaktoren werden dann möglich sein, wenn eine ausreichende Zahl von Neuerkrankungen für die entsprechende Krebslokalisation erfaßt wurde. Dies wird in Zusammenarbeit mit dem DIFE (Deutsches Institut für Ernährungsfor-

187 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention schung) in Potsdam für Deutschland voraussichtlich im Jahr 2004 möglich sein. Hingegen haben Auswertungen auf europäischer Ebene mit den Daten aller EPIC beteiligten Zentren für die häufigen Krebserkrankungen (Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Prostatakrebs) bereits begonnen. Die Arbeit verschiedener Arbeitsgruppen führte zu Publikationen. Die Ergebnisse zur Ballaststoffzufuhr und Kolonkarzinom [71], Rauchverhalten und Magenkarzinom [76] sowie Obst- und Gemüsezufuhr und Prostatakarzinom (Key, 2003) sind veröffentlicht. EPIC Heidelberg hat die Leitung der EPIC-Arbeitsgruppe Lungenkarzinom zur Quantifizierung der Erkrankungsrisiken für Ernährungs- und andere Lebensstilfaktoren. Untersuchungen zur Obst - und Gemüsezufuhr sowie der Fleischzufuhr und Lungenkarzinom wurden durchgeführt und die Ergebnisse publiziert [40, 42]. In diesem Kontext wurde anhand der Heidelberger Daten der Zusammenhang zwischen Lebensmittel- und Nährstoffzufuhr, Körperbau und Rauchverhalten bezogen auf den Alkoholkonsum untersucht [87]. Für einige Tumorentitäten (Magenkrebs, Lungenkrebs, Kolonkarzinom, Brustkrebs, Prostatakarzinom) wurden in Kooperationen auf europäischer Ebene weitere vertiefende Projekte initiiert. Zur Charakterisierung der EPIC-Kohorte hinsichtlich des Ernährungsverhaltens und Anthropometrie, wurden die Verzehrsmengen einzelner Lebensmittelgruppen sowie deren Zubereitungsmethoden zwischen den teilnehmenden Studienregionen verglichen. Wissenschaftler der Heidelberger EPIC-Gruppe haben bei der Auswertung folgender Ernährungsmuster auf europäischer Ebene mitgewirkt: Zufuhr von Ölen und Fetten, Fleischzufuhr, Zufuhr von Fleisch und Fleischprodukten klassifiziert nach ätiologischen Hypothesen der Krebsentstehung, Zubereitungsmethoden von Fisch und Fleisch. Zusammengefasst wurden die wesentlichen Ergebnisse in einem Supplementband von Public Health Nutrition (Dezember 2002) veröffentlich [47-61]. Als Teilprojekt von EPIC Heidelberg wurden Untersuchungen zur Bedeutung von Zubereitungsmethoden, wie Braten und Grillen, für die Krebsentstehung durchgeführt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Ernährungsfragebogen der zweiten Nachbefragung um einen Fragekomplex bezüglich der Nahrungsmittelzubereitung ergänzt. Das Ziel ist es, die alimentäre Aufnahme der durch die Zubereitung entstehenden heterozyklischen aromatischen Amine (HAA) bestimmen zu können [25]. Die Bestimmung von Biomarkern der Nahrungsmittelaufnahme in den Blutproben stellt eine weitere Auswertungsebene dar. Zur Exploration dieser Fragestellungen wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: Bedeutung von Cholesterol und Cholesteroloxidationsprodukten für die Entstehung von Lungenkrebsrisiko, Lipidoxidation und Brustkrebsrisiko sowie Plasmakonzentrationen von Flavonoiden als Biomarker für deren Zufuhr (Radtke, 2002). Die fraktionierten Blutproben enthalten auch DNA-Material, um molekulargenetische Untersuchungen durchzuführen. Gen-Umwelt-Interaktionen werden zur Beschreibung von Risikogruppen untersucht. Disbezüglich wurden Untersuchungen zur Risikoabschätzung genetischer Varianz in Kombination mit Ernährungsfaktoren für das Auftreten von Adipositas und,,assoziationen zwischen Genpolymorphismen der Immunreaktion und Heuschnupfen durchgeführt. [21, 82]. Abteilung C020 Klinische Epidemiologie Der Einfluss der Fettsäuren- und Antioxidantienzufuhr auf immunologische Faktoren wurde am Beispiel Heuschnupfen untersucht [80]. Im Zusammenarbeit mit dem koordinierenden Zentrum des IARC in Lyon wird an der Entwicklung einer standardisierten europäischen Lebensmitteltabelle gearbeitet. Förderung: Deutsche Krebshilfe e.v. (seit Mai 2000); European Commission Sanco ( ) Genetische Epidemiologie J. Chang-Claude, L. Beckmann, K. Becker, R. Birr, U. Eilber, I. Helmbold, S. Hermann, B Kaspereit, M. Keith, S. Kropp, C. Lilla, I. Reinisch, T. Slanger, K. Smit, E. Tebit Kooperationen: DKFZ (Prof. Dr. H. Bartsch, Dr. A. Risch, Dr. P Schmezer, Prof. Dr. H. Thielmann); Institut für Tropenmedizin, Heidelberg (Prof. Dr. H. Becher); Universitäts-Frauenklinik Heidelberg (Prof. Dr. G. Bastert, Prof. Dr. D. von Fournier); Universitäts-Frauenklinik Ulm (Prof. Dr. R. Kreienberg, Dr. Shan Wang- Gohrke); Technische Universität München (Dr. J. Linseisen); Institut für Humangenetik, Heidelberg (Dr. C. Fischer); Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Lübeck (Dr. A. Ziegler); Imperial Cancer Research Fund, Leeds, England, UK (Prof. T. Bishop); Medical Research Council, Cambridge, England UK (Prof. Douglas Easton, Dr. Alison Dunning ); IARC, Lyon, Frankreich (Dr. P. Boffetta, Dr. David Goldgar); Institute of Cancer Research, Sutton, England, UK (Prof. M. Stratton); Instituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori, Mailand, Italien (Prof. F. Berrino); Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA (Prof. Dr. Christine Ambrosone); University of Southern California, Los Angeles, USA (Prof. Dr. Duncan Thomas); University of Oxford Oxford, UK (Prof. Valerie Beral, Dr. Timothy Key); Sämtliche Kliniken der Studienregionen Rhein-Neckar-Odenwald und Freiburg ; Breast Cancer Linkage Consortium Genetisch-epidemiologische Studien zur Ätiologie des prämenopausalen Brustkrebses Das Projekt hat zum Ziel, Suszeptibilitätsgene für Brustkrebs und Ovarialkrebs zu lokalisieren, die Bedeutung und Heterogenität der disponierenden Gene zu klären und die Gen-Umwelt Interaktion zu untersuchen. Die Studien wurden von der Deutschen Krebshilfe gefördert. Deutsche Familien mit mindestens drei Brustkrebs- oder Ovarialkrebspatientinnen innerhalb von zwei oder drei Generationen wurden in Linkage- und Assoziationsstudien zur Genkartierung einbezogen. In internationaler Zusammenarbeit wurde ein CHEK2 Genvariant als disponierendes Allel in Familien, die keine Mutationen in BRCA1 und BRCA2 tragen, festgestellt. - In einer bevölkerungs basierten Fall-Kontroll-Studie in zwei Studienregionen Rhein-Neckar-Odenwald und Freiburg-Breisgau-Emmendingen-Ortenau in Baden-Württemberg wurden neu erkrankte Brustkrebspatientinnen ( 50 Jahre) und zwei Gruppen von Kontrollpersonen (Schwester Kontrolle, Bevölkerungskontrollen aus der gleichen Studienregion) einbezogen. Risikoreduktionen mit Dauer des Stillens, Anzahl der Geburten, höherem Gemüsekonsum und regelmäßiger körperlicher Aktivität wurden nachgewiesen. Ein hoher Alkoholkonsum ging mit erhöhtem Brustkrebsrisiko einher. Aufbauend auf der Studie wurden zusätzlich detailliertere Angaben zur Schadstoffbelastung durch Aktiv- und Passivrauchen erhoben, um die Wechselwirkung der genetischen Polymorphismen in verschiedenen relevanten Fremdstoffwechselenzymen, z. B. N-Acetyltransferase 1 und 2 (NAT1, NAT2), Glutathiontransferase GSTT1, GSTM1, und Cytochrom-P450-Monooxygenerase CYP1A1, CYP1B1, CYP2A6 187

188 188 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention auf das Brustkrebsrisiko in Bezug auf das Aktiv- und Passivrauchen in Zusammenarbeit mit der Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren zu untersuchen. Verglichen mit weder aktiv noch passiv exponierten Frauen, ergab sich ein um 31% erhöhtes Brustkrebsrisiko für Aktivrauchende. Bei den Nichtraucherinnen war das Passivrauchen mit einer eindeutigen Risikoerhöhung um 50% verbunden. Verglichen mit weder aktiv noch passiv exponierten Frauen waren die Brustkrebsrisiken unterschiedlich bezüglich NAT2 Status. Frauen mit einer langsamen acetylierenden Fähigkeit hatten ein erhöhtes Brustkrebsrisiko für Aktivrauchen, während schnell Acetylierende ein erhöhtes Risiko bei passiver Exposition hatten. Weitere Assoziationsanalysen werden durchgeführt, um risikomodifizierende Gene (z.b. im Stoffwechsel von Hormonen, DNA Reparatur, und Zellzyklenkontrolle) beim Brustkrebs zu identifizieren. [4, 5, 13, 16, 30, 32, 63, 66, 73, 74, 77, 78] Förderung: Deutsche Krebshilfe e.v. ( ) Hormonsubstitution und Risiko für postmenopausalen Brustkrebs MARIE-Studie (Mammakarzinom-Risikofaktoren-Erhebung) Hormonsubstitution wird häufiger über die Linderung klimakterischer Beschwerden hinaus zur Steigerung der Lebensqualität und Prävention von Herzkreislaufkrankheiten und Osteoporose verschrieben. Die Klärung der Frage des möglichen Einflusses hormoneller Substitutionsbehandlung auf das postmenopausale Brustkrebsrisiko in Deutschland ist daher von außerordentlich hoher Bedeutung. Ziele der Studie sind, die Bedeutung der Lebensstilfaktoren wie Schwangerschaften, Rauchen, Alkoholkonsum, körperliche Aktivität und die Hormonersatztherapie für die Entstehung von Brustkrebs zu bestimmen, den Einfluss postmenopausaler Hormonsubstitution differenziert nach Art und Anwendungsdauer der verwendeten Substanzen, nach histologischen Typen unter Berücksichtigung modifizierender Faktoren zu untersuchen, und den Einfluss genetisch bedingter Unterschiede in der Regulation des Stoffwechsels von Hormonen zu bestimmen. Die Erhebungsphase dieser Studie begann am in der Studienregion Rhein-Neckar/Karlsruhe/Heilbronn. In Zusammenarbeit mit regionalen Krankenhäusern und Kliniken werden Frauen mit primärem Brustkrebs im Alter von Jahren über alle Kliniken in der Studienregion erfasst. Aus dem gleichen Studiengebiet werden Vergleichspersonen (ohne Brustkrebs) einbezogen. Epidemiologische Angaben werden mittels eines standardisierten Fragebogens von Interviewerinnen sowie einen selbstauszufüllenden Ernährungsfragebogen erhoben. Eine Blutprobe wird gesammelt. Parallel wird diese Studie auch in Hamburg durchgeführt. Förderung: Deutsche Krebshilfe e.v. ( ) Abteilung C020 Klinische Epidemiologie Genetik von komplexen Krankheiten: Genetische Kartierung von Brustkrebsgenen und Darmkrebs- Suszeptiblilitätsgenen durch haplotype sharing analysis in Isolatpopulationen Die bisher identifizierten Krankheitsgene (BRCA-Gene, HNPCC-Gene), die zu einem stark erhöhten Risiko für das Mammakarzinom und das kolorektale Karzinom disponieren, können das gehäufte Auftreten nur in 30% bis 60% der entsprechenden Familien erklären. Zur Genkartierung weiterer zum Brustkrebs und Kolonkrebs disponierender Gene nehmen wir die haplotype-sharing Methode in einer Isolatpopulation als eine aussichtsreiche Alternative zu den traditionellen Ansätzen. Als geeignete Isolatpopulation wurde die sorbische Population der Oberlausitz ausgewählt, die ethnisch, konfessionell, geographisch, demographisch und historisch einzigartig dokumentiert ist. Es wurden 530 Brustkrebspatientinnen und 406 Patienten mit Kolorektakarzinom sowie Eltern bzw. Kernfamilie rekrutiert. In Zusammenarbeit mit dem Gene Mapping Center in Berlin wird zunächst die genetische Homogenität und Verwandtheit der Sorben, Oberlausitzer und Schlesier untersucht, um Populationsstratifikation in der weitern Assoziationsanalyse zu berücksichtigen. Förderung: HGF Strategie Fonds ( ) Genetik komplexer Krankheiten: Statistische Methoden der Haplotypenanalyse Haplotyp-basierte Methoden kommen zunehmend in Assoziationsstudien zur Anwendung. Wir untersuchten eine effiziente haplotype sharing Methode HSS, eine neue Methode zur statistischen Auswertung einer genomweiten Analyse bei komplexen Krankheiten. Die nichtparametrische HSS Methode beruht auf dem Prinzip des Identity by descent (IBD). In einer geeigneten Isolatpopulation erwarten wir, daß ein Teil der Patienten von einem oder wenigen mutationstragenden Vorfahren (foundern) abstammen. Daher teilen sie sich ein Chromosomensegment um die Mutation und sind an dieser Stelle IBD im Gegensatz zu Nicht- Mutationsträgern. Anhand von simulierten Daten wurden die Eigenschaften von HSS untersucht. HSS hat im Vergleich zu Methoden, die nur einzelne genetische Marker betrachten, eine größere statistische Power zur weiteren Einengung in genomweiten Analysen in Isolatpopulationen. Insbesondere eignet sich die Methode zur weiteren Einengung von Kandidatenregionen. Im Gegensatz zu Mendelschen Krankheiten sind für viele komplexe Krankheiten mehrere genetische und nicht-genetische Faktoren verantwortlich. Zur Verbesserung der statistischen Power wurde eine neue Methode entwickelt, die auf Mantel s statistics zur Analyse der räumlichen und zeitlichen Verteilung von epidemischen Krankheiten basiert. Ziel ist eine Assoziationsmethode zur Korrelierung von Haplotypen zu Phänotypen und Expositionen. Die Phänotypen/ Expositionen können sowohl binär wie beispielsweise der Krankheitsstatus, als auch quantitativ sein. Die Methode soll erweitert werden zur Adjustierung mit Covariaten. Die Haplotypen eines Individuums müssen aus den Genotypen mittels statistischer Verfahren rekonstruiert werden. Eine neue Methode Minimum Recombination Haplotype Configuration (MRHC) für Familendaten wurde in Kooperation mit Dr. Dajun Qian (Department of Biostatistics, City of Hope National Medical Center, Duarte, USA) entwickelt. Diese sehr schnelle Methode ist anwendbar auf beliebige Familienstrukturen mit und ohne Verwandtenehen. Im Vergleich mit anderen etablierten Methoden konnte die Effektivität von MRHC gezeigt anhand simulierter und echter Daten werden. [22, 75] Förderung: HGF Strategie Fonds ( ), DFG ( ) Genetische Faktoren für das Risiko des kolorektalen Karzinoms DACHS-Studie (Darmkrebs: Chancen der Verhütung durch Screening) In Zusammenarbeit mit dem Deutschen Zentrum für Alternsforschung wird eine bevölkerungsbasierte Fall-Kontroll- Studie in der Rhein-Neckar-Odenwald Studienregion durchgeführt zur näheren Abklärung der Risikoreduktion kolorektaler Karzinome in Abhängigkeit von der Zeit nach endosko-

189 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention pischem Screening (mit Entfernung präkanzeröser Veränderungen) unter besonderer Berücksichtigung des individuellen Erkrankungsrisikos. Im Rahmen dieser Studie werden andere Gen-Umwelt-Wechselwirkungen untersucht, wie z. B. zwischen Polymorphismen in metabolisierenden Enzymen in Relation zur Exposition gegenüber aktivem oder passivem Tabakrauch. Förderung: DFG ( ) The International BRCA1/2 Carrier Cohort Study Angesichts der vermuteten Natur der BRCA1- und BRCA2- Gene (Tumorsuppressorgene) können exogene Risikofaktoren die Wahrscheinlichkeit einer somatischen Mutation des verbliebenen normalen Allels und damit den Zeitpunkt, wann die Krankheit ausbricht, auch Penetranz genannt, beeinflussen. Tatsächlich werden in Familien mit BRCA-Mutationen auch Frauen beschrieben, die erst im hohen Alter Brustkrebs entwickelten oder bis zum hohen Alter gesund bleiben. Es wird Gegenstand der Untersuchung bei Mutationsträgerinnen aus zahlreichen europäischen Ländern und aus Kanada sein, den Einfluss exogener Risikofaktoren weiter zu charakterisieren und die Bedeutung prophylaktischer Chirurgie für das Erkrankungsrisiko prospektiv zu ermitteln. Förderung: Europäische Union/ Europe Against Cancer ( ). Genetische Einflüsse auf dem klinischen Verlauf bei Brustkrebspatientinnen nach Strahlentherapie und ihre Bedeutung für die individuelle Strahlenempfindlichkeit Individuelle Strahlenempfindlichkeit kann zum Auftreten von Nebenwirkungen infolge von Strahlentherapie aber auch zur Prognose des Krankheitsverlaufes und eventuell zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Es fehlen Kenntnisse darüber, welche Gene bei der Strahlenempfindlichkeit eine wesentliche Rolle spielen. Die Identifizierung solcher Gene soll durch die Suche nach Kandidaten-Genen mit abweichender Genexpression oder nach verantwortlichen Genvarianten (Polymorphismen) in einer definierten Patientenkohorte von Brustkrebspatientinnen mit stringenter Erhebung von Daten zu Therapiefolgen sowie anderen Einflussfaktoren für Strahlenempfindlichkeit erfolgen. [31, 83, 89] Förderung: Bundesamt für Strahlenschutz ( ), Department of Defense ( ) Europäische multizentrische Studie: Assoziationen zwischen Ernährungs- und Lebensstilfaktoren und genetischer Prädisposition im Auftreten von Brustkrebs bei jungen Frauen Diese multizentrische Studie in 7 Ländern untersucht die Frage, ob sich bekannte Lebensstil- und Umweltfaktoren, die als Risikofaktoren für Brustkrebs gelten, gleichermaßen auf Patientinnen mit und ohne genetische Disposition auswirken. Brustkrebspatientinnen in der Rhein-Neckar- und Ortenau-Region sowie im gesamten Bundesland Rheinland- Pfalz, die bei der Diagnose (zwischen 1998 und 2002) jünger als 40 Jahre alt waren, wurden in die Studie einbezogen. Daten über Ernährungsfaktoren, verschiedene Lebensstilfaktoren, Reproduktivitätsfaktoren, und hormonelle Faktoren werden mit selbstauszufüllenden Fragebogen gewonnen. Das Risiko einer genetischen Disposition wird zunächst anhand der familiären Krebserkrankungen geschätzt. Das gewählte Case-Only Studiendesign ermöglicht Gen-Umwelt-Interaktionen mit größerer statistischer Power festzustellen, erlaubt jedoch keine Aussage über die Effekte der einzelnen Risikofaktoren. Förderung: Europäische Union Fifth Framework Programme Abteilung C020 Klinische Epidemiologie ( ). Andere Projekte der Arbeitsgruppe: Verlängertes Follow-up und eingebettete Fall- Kontrollstudie in der Kohortenstudie zur Exposition gegenüber künstlichen Mineralfasern Im Rahmen der internationalen Kohortenstudie unter Beschäftigten in der Herstellung künstlicher Mineralfasern (KMF) wurde eine eingebettete Fall-Kontrollstudie mit den Lungenkrebsfällen und geeigneten Kontrollpersonen innerhalb der Kohorte durchgeführt, um das Lungenkrebsrisiko in Bezug auf die berufliche Exposition gegenüber KMF unter Berücksichtigung von Störfaktoren wie Rauchen, Alkoholkonsum und andere berufliche Expositionen, zu ermitteln. Expositionsbewertungen erfolgen basierend auf Angaben eines Expertpanels von Betriebsleitern und Vorarbeitern sowie auf Angaben von Hinterbliebenen. Es wurden keine eindeutigen Hinweise auf karzinogene Effekte von Steinund Schlackenwolle auf die Lunge gefunden. [11, 72] Kohortenstudie bei Vegetariern (20 Jahre- Mortalitäts-Follow-up) Lebensstilfaktoren von 1904 deutschen Vegetariern werden in Bezug auf ihre Mortalität seit 1978 untersucht. Regelmäßige körperliche Aktivität, die Dauer des Vegetarismus und der Vegetarier-Status (streng oder moderat) wurden als Determinanten der Gesamt-Mortalität, der Krebsmortalität und/oder der Mortalität an kardiovaskulären Erkrankungen gefunden. Eine gemeinsame Analyse von amerikanischen und europäischen prospektiven Kohortenstudien ergab eine erniedrigte Mortalität von Vegetariern verglichen mit Nicht-Vegetariern vorwiegend für ischämische Herzkrankheiten. Der Follow-up dieser Kohorte wurde bis Ende 1999 weitergeführt für weitere Analysen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Auvinen A.*, Alexander F.*, de Koning H.J.*, Miller AB. Editorial: Should we start population screening for prostate cancer? Randomised trials are still needed. Int J Cancer (2002) 97: [2] Becher H.*, Chang-Claude J. 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190 190 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [9] Hoffmann W.* Latza U.*, Ahrens W.*, Greiser K.H.*, Kroke A.*, Nieters A., Schulze M.B.*, Steiner M.*, Terschuren C.*, Wjst M.* Biological markers in epidemiology: concepts, applications, perspectives (parti). Gesundheitswesen (2002) 64(2): [10] Hoffmann W.* Latza U.*, Ahrens W.*, Greiser K.H.*, Kroke A.*, Nieters A., Schulze M.B.*, Steiner M.*, Terschuren C.*, Wjst M.* Biological markers in epidemiology: concepts, applications, perspectives (partii). Gesundheitswesen (2002) 64(3): [11] Kjaerheim K.*, Boffetta P., Hansen J.*, Cherrie J.*, Chang- Claude J, Eilber U., Ferro G.*, Guldner K.*, Olsen JH.*, Plato N.*, Proud L.*, Saracci R.*, Westerholm P.*, Andersen A. Lung Cancer Among Rock and Slag Wool Production Workers Epidemiology (2002) 13(4): [12] Knorr-Held L.*, Rasser G.*, Becker N. Disease mapping of stage-specific cancer incidence data. Biometrics (2002) 58: [13] Kropp S., Chang-Claude J. 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Consumption of vegetable, fruit and other plantfoods in the epic cohorts from ten european countries. Suppl, Public Health Nutr. 2002; 5(6b): [48] Ferrari P.*, Slimani N.*, Ciampi A.*, Trichopoulou A.*, Naska A.*, Lauria C.*, Veglia F.*, Bueno-de-Mesquita HB.*, Ocké MC.*, Brustad M.*, Braaten T.*, Tormo MJ.*, Amiano P.*, Mattisson I.*, Johanssom G.*, Welch A.*, Davey G.*, Overvad K.*, Tjonneland A.*, Clavel-Chapelon F.*, Thiebaut A.*, Linseisen J., Boeing H.*, Hemon B.* and Riboli E.* Evaluation of under- and overreporting of energy intake in the 24-hour diet recalls in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC). 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Suppl, Public Health Nutr 2002; 5(6b): [50] Haftenberger M.*, Schuit A.J.*, Tormo M.J.*, Boeing H.*, Wareham N.*, Bueno-de-Mesquita H.B.*, Kumle M.*, Hjartåker A.*, Chirlaque M.D.*, Ardanaz E.*, Andren C.*, Lindahl B.*, Peeters P.H.M.*, Allen N.E.*, Overvad K.*, Tjønneland A.*, Clavel-Chapelon F.*, Linseisen J., Bergmann M.*M.*, Trichopoulou A.*, Lagiou P.*, Salvini S.*, Panico S.*, Riboli E.*, Slimani N.*: Physical activity of subjects aged 50 to 64 years involved in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC). Suppl, Public Health Nutr 2002; 5(6b): [51] Hjartåker A.*, Lagiou A.*, Slimani N.*, Lund E.*, Chirlaque M.D.*, Vasilopoulou E.*, Zavitsanos X.*, Berrino F.*, Sacerdote C.*, Ocké M.C.*, Peeters P.H.M.*, Engeset D.*, Skeie G.*, Allen A.*, Amiano P.*, Berglund G.*, Westman V.*, McTaggart A.*, Spencer E.*, Overvad K.*, Tjønneland A.*, Clavel F.*, Linseisen J., Schulz, Hemon B., Riboli E.* Consumption of dairy products in the epic cohort. Data from 35, hour dietary recalls in 10 European countries. Suppl, Public Health Nutr 2002; 5(6B): Abteilung C020 Klinische Epidemiologie [52] Keinan-Boker K.L.*, Peeters P.H.M.*, Mulligan A.A.*, Navarro C.*, Slimani N.*, Mattisson I.*, Lundin E*, McTaggart A.*, Allen N.E.*, Overvad K.*, Tjønneland A.*, Clavel-Chapelon F.*, Linseisen J, Haftenberger M.*, Lagiou P.*, Kalapothaki V.*, Evangelista A.*, Frasca G.*, Bueno-de-Mesquita H.B.*, van der Schouw Y.T.*, Engeset D.*, Skeie G.*, Tormo M.J., Ardanaz P.*, Charrondière U.R.*, Riboli E.*: Soy products consumption in 10 European countries - the EPIC study. Suppl, Public Health Nutr 2002; 5(6b): [53] Klipstein-Grobusch K*, Slimani N*, Krogh V.*, Keil U.*, Boeing H.*, Overvad K.*, Tjønneland A.*, Clavel-Chapelon F.*, Thiebaut A.*, Linseisen J., Schulze M.*, Lagious P.*, Papadimitrou A.*, Saieva A.*, Veglia F.*, Bueno-de-Mesquita H.B.*, Peeters P.H.M.*, Kumle M.*, Brustad M.*, Martinez C.*, Barricarte A.*, Berglund G.*, Weinehall L.*, Mulligan A.*, Allen N.*, Ferrari P.*, Riboli E.*: Trends in self-reported past alcoholic beverage consumption and ethanol intake from observee in eight European countries participating to the European Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) project. Suppl, Public Health Nutr. 2002; 5(6B): [54] Linseisen J., Bergström E.*, Gafá L.*, Gonzalez C.A.*, Thiebaut A.*, Trichopoulou A*, Tumino R.*, Navarro C.*, Martinez C.*, Mattisson I.*, Molin S.*, Welch A.*, Spencer E.*, Overvad K.*, et al. Consumption of added fats & oils in EPIC centres across 10 European countries as assessed by 24-hour recalls. Suppl. 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Patterns of alcohol consumption in 10 European countries participating in the EPIC project Suppl, Public Health Nutr. 2002; 5(6B): [58] Slimani N.*, Fahey M*, Welch AA.*, Wirfält E.*, Stripp C.*, Bergström E.*, Linseisen J, Schulze MB.* Bamia C.*, Chloptsios Y.*, Veglia F.*, Panico S.*, et al. Diversity of dietary patterns observed in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) project. Suppl, Public Health Nutr. 2002; 5(6B): [59] Slimani N.*, Kaaks R.*, Ferrari P.*, Casagrande C.*, Clavel- Chapelon F.*, Lotze G.*, Kroke A.*, et al. EPIC Calibration study: Rationale, design and population characteristics. Suppl, Public Health Nutr 2002; 5(6B): [60] Welch AA.*, Lund E.*, Amiano P.*, Dorronsoro M.*, Brustad M.*, Kumle M.*, Rodriguez M.*, Lasheras C.*, Janzon L.*, Jansson J.*, Luben R.*, Spencer E.A.*, Overvad K.*, Tjønneland A.*, Clavel-Chapelon F.*, Linseisen J., Klipstein- Grobusch K.*, et al. 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Allergy (2004): 34(3): [83] Popanda O., Ebbeler R.*, Twardella D.*, Helmbold I., Gotzes F.*, Schmezer P., Thielmann H.W., von Fournier D.*, Haase W.*, Sautter-Bihl M.L.*, Wenz F.*, Bartsch H.*, Chang-Claude J. Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes from breast cancer patients and their correlation with acute skin reactions to radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys (2003) 55(5): [84] Rohrmann S. and Klein G.*: Validation of a short questionnaire to qualitatively assess the intake of total fat, saturated, monounsaturated, polyunsaturated fatty acids, and cholesterol J Hum Nutr Diet. 2003; 16: [85] Rohrmann S., Becker N., Kroke A.*, Boeing H.* Trends in cigarette smoking in the German centers of the European prospective investigation into cancer and nutrition (EPIC): the influence of the educational level. Preventive Medicine (2003) 36: [86] Rohrmann S., Kroke A.*, Boeing H.*, Becker N. 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193 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention C030 Umwelt-Epidemiologie Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie (C030) Leiter: Prof. Dr. sc. math. Jürgen Wahrendorf Wissenschaftliche Mitarbeiter Iris Hettinger (¾) Klaus Schlaefer Dr. Brigitte Schlehofer (½) Martina Schmidt (geb. Deseyve) (½) Dr. Karen Steindorf (½) Awi Wiesel (½: 7/02-12/02; 4/03 - ) Doktoranden/Diplomanden Sabine Poltermann (10/02 - ) Technische Mitarbeiter Stephanie Estel (¾; 3/02-8/03; 100% 9/03 -) Zivildienstleistende Frank Seifried (8/01-5/02) Konrad Duden (8/02-5/03) Andreas Hartel (9/03 -) Sekretariat Angelika Lampe (¼: - 8/02; ½: 09/02 - ) Die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie hat es sich zur Aufgabe gemacht, die Bedeutung verschiedener Umweltfaktoren, wie z. B. elektromagnetische Felder, körperliche Aktivitäten und berufsbedingte Noxen, in Zusammenhang mit der Entstehung unterschiedlicher Krebserkrankungen zu untersuchen. Ein Schwerpunkt der inhaltlichen Forschungstätigkeiten ist zur Zeit die Untersuchung ätiologischer Risikofaktoren für Hirntumoren. In diesem Zusammenhang wird der Einfluss von elektromagnetischen Feldimmissionen, die u.a. durch die Nutzung von mobilen Kommunikationseinrichtungen (wie z.b. Handys ) auftreten, von beruflichen Risikofaktoren und von Viren auf die Entstehung von Gliomen, Meningeomen und Akustikusneurinomen untersucht. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt auf der Untersuchung des Einflußfaktors körperliche Aktivität, der für verschiedene Krebsarten als protektiver Faktor diskutiert wird. Hierbei stehen derzeit Studien zur Entstehung von Brustkrebs und Kolorektalkarzinomen sowie methodische Studien zur Verbesserung und Validierung der Erfassung von körperlicher Aktivität im Vordergrund. Des weiteren wird in einer virologisch-epidemiologischen Studie in Zusammenarbeit mit der Abt. Tumorvirologie des DKFZ die Bedeutung einer Infektion mit adeno-assoziierten Viren auf den Schwangerschaftsverlauf und die Entwicklung des Embryos untersucht, da diese Viren u.a. als Vektoren im Rahmen der Tumortherapie diskutiert werden. In Kooperation mit der Universität Mainz werden Daten des Mainzer Kindergeburten-Registers im Hinblick auf angeborene Fehlbildungen und mögliche ätiologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus soll die Prävalenz onkologischer Erkrankungen bei Kindern mit Fehlbildungen ermittelt werden. Methodisches Interesse besteht zudem in der Fortentwicklung statistischer Verfahren in der Epidemiologie sowie in der Durchführung von Quantitativen Risikoabschätzungen. Deren Ziel ist es, aus den Ergebnissen von epidemiologischen Studien konkrete Aussagen zu dem Gefährdungspotential verschiedener Risikofaktoren in einer bestimmten Bevölkerung abzuleiten. Derartige Untersuchungen stellen eine wichtige Basis für Entscheidungen im Öffentlichen Gesundheitswesen dar. Hochfrequente elektromagnetische Felder B. Schlehofer, K. Schlaefer, I. Hettinger, S. Estel, J. Wahrendorf In Zusammenrbeit mit: Prof. Dr. Maria Blettner ( - 8/03) und Dr. Gabriele Berg, Epidemiologie und Medizinische Statistik, Universität Bielefeld; Prof. Dr. Maria Blettner (8/03 - ) und Dr. Joachim Schüz, Institut für Medizinische Biometrie, Epidemiologie und Informatik, Universität Mainz; Prof. Dr. Stefan Kunze ( - 3/03); Prof. Dr. A. Unterberg (4/03 - ), Neurochirurgische Klinik, Universität Heidelberg; Prof, Dr. Marika Kissling, Pathologisches Institut, Universität Heidelberg; Prof. Dr. Klaus Sartor, Abteilung Neuroradiologie, Universität Heidelberg; Prof. Dr. Jürgen Debus, Radiologische Universitätsklinik, Heidelberg; Prof. Dr. Peter Schmiedek, Neurochirurgische Klinik, Klinikum Mannheim; Prof. Dr. Uwe Bleyl, Pathologisches Institut, Klinikum Mannheim; Prof Dr. Christoph Groden, Institut für Klinische Radiologie, Klinikum Mannheim. Interphone Study Group: Dr. Elisabeth Cardis, IARC, Lyon, Frankreich; Prof. Dr. Bruce Armstrong, NSW Cancer Council, Kings Cross, Australien; Dr. Martine Hours, Université Claude Bernard Lyon, Frankreich; Dr. Anssi Auvinen, University of Tampere, Finnland; Dr. Liz Findlay, NHS Scotland, Edinburgh, UK; Dr. Christoffer Johansen, Danish Cancer Society, Kopenhagen, Dänemark; Dr. Simon Mann, National Radiological Protection Board, Chilton, UK; Prof. Dr. Baruch Modan, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer, Israel (deceased); Prof. Dr. Daniel Krewski, University of Ottawa, Ottawa, Kanada; Dr. Stefan Lönn, Karolinska Institute, Stockholm, Schweden; Dr. Toru Takebayashi, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan; Dr. Paolo Vecchia, Istituto Superiore di Sanità, Rom, Italien; Dr. Tore Tynes, Norwegian Radiation Protection Authority, Østerås, Norwegen, Dr. Alistair Woodward, University of Otago, Wellington, Neuseeland. Gesundheitsschädigende Wirkungen hochfrequenter elektromagnetischer Felder, wie sie z. B. durch die Nutzung des Mobilfunks auftreten, wurden in den letzten Jahren äußerst kontrovers diskutiert. Expositionen mit hochfrequenten elektromagnetischen Feldern sind neben dem Gebrauch durch eine Vielzahl mobiler Kommunikationseinrichtungen (z. B. Handys, Funk- oder schnurlose Telefone) auch durch spezifische berufliche Tätigkeiten gegeben. Ein Handlungsbedarf für die Erforschung dieses Feldes mit verbesserter Methodik und auf den Ergebnissen vorangegangener Untersuchungen ergab sich, einerseits auf Grund der öffentlichen Besorgnis, aber auch aus der starken Zunahme der Exposition v.a. durch mobile Kommunikationseinrichtungen. Studien zur validen Quantifizierung gesundheitlicher Risiken durch Hochfrequenzstrahlung sind somit gerade zum heutigen Zeitpunkt zwingend geboten. Auf dieser Basis führt die International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, 2000 eine international-multizentrische, populationsbezogene Fall-Kontroll-Studie zu Tumoren des Kopf- und Halsbereiches (Gliome, Meningeome, Akustikusneurinome; fakultativ auch einige Länder, aber nicht Deutschland: Parotistumoren und Leukämien) durch, an der Forschergruppen aus Australien, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Israel, Italien, Japan, Kanada, Neusee- 193

194 194 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention land, und den skandinavischen Ländern beteiligt sind. Hierbei wird untersucht, in wie weit ein Risiko bezüglich der oben genannten Tumoren durch die Mobilfunknutzung und durch sonstige Expositionen gegenüber hochfrequenten elektromagnetischen Feldern im privaten und beruflichen Bereich besteht. In diese internationale Studie sollen insgesamt ca Hirntumorpatienten und eine gleich große Anzahl von Bevölkerungskontrollen einbezogen werden. Das Befragungsinstrument, ein computergestütztes persönliches Interview (CAPI), ist für alle Studienzentren der internationalen Studie einheitlich. Schwerpunkt ist die detaillierte Erfassung der Telefoniergewohnheiten und der Hochfrequenzexposition der Studienteilnehmer durch ein direktes Interview. Die AG Umwelt-Epidemiologie beteiligt sich zusammen mit dem Institut für Medizinische Biometrie, Epidemiologie und Informatik der Universität Mainz und der AG Epidemiologie und Medizinische Statistik der Universität Bielefeld als gemeinsame Deutsche Studiengruppe an diesem Projekt. Das einheitliche Studiendesign erlaubt eine Auswertung der gepoolten Studiendaten sowohl für Deutschland als auch im internationalen Rahmen, was aufgrund der Seltenheit der zu untersuchenden Tumoren und der noch nicht sehr lange bestehenden Nutzung mobiler Telefone sinnvoll ist, da nur bei großer Fallzahl mit aussagekräftigen Ergebnissen zu rechnen ist. Die Vorarbeiten zu dieser Studie wurden bereits 1999 durchgeführt. Mit der Rekrutierung von Fällen und Kontrollen konnte im Oktober 2000, nach Fertigstellung der Erhebungsinstrumente und aller Begleitunterlagen begonnen werden. Die Datenerhebung für die Fälle wurde am in Deutschland abgeschlossen. Ziel war es, in den drei definierten Studienregionen Heidelberg, Bielefeld und Mainz in einer 3-jährigen Erhebungsphase alle inzidenten Patienten, die im Alter von 30 bis 69 Jahren an primären Hirntumoren erkrankt sind, aus den jeweiligen regionalen Neurochirurgischen Kliniken zu erfassen und zu befragen. Es konnten insgesamt 1000 Patienten einbezogen werden, davon beteiligten sich 86 % an der Befragung. Unsere Studiengruppe konnte dazu aus der Studienregion Heidelberg 499 Patienten beitragen (Teilnahmerate 83 %). Parallel wird eine doppelt so große Anzahl von Kontrollpersonen (gematcht nach Alter und Geschlecht zu den Fällen) aus der Bevölkerung der drei Studienregionen (Gesamteinwohnerzahl ca. 5,5 Millionen) befragt. Diese Befragung wird bis März 2004 fortgesetzt. Bisher wurden in der Heidelberger Studienregion (Rhein-Neckar, Neckar-Odenwald, Rheinland-Pfalz, Südhessen) über 1000 Personen angesprochen. Davon haben sich 66 % am Interview beteiligt. Für das gesamte deutsche Studienzentrum wurden bisher nahezu 1500 Kontrollpersonen interviewt (Teilnehmerrate 62 %). Nach Vorgaben aus dem internationalen Studienkoordinationszentrum Lyon werden in allen Studienzentren verschiedene Validierungsuntersuchungen durchgeführt: Parallel zur Datenerhebung wurden 2002 die Angaben zum Telefonierverhalten im Studienzentrum Bielefeld (stellvertretend für alle deutschen Studienzentren) mittels spezieller Handies, die sowohl den Eingang als auch den Ausgang von Telefonaten erfassen, durchgeführt. Für die Validierung der histologischen Diagnose wird anhand einer randomisierten Stichprobe der Studienteilnehmer eine Referenzpathologie in der IARC, Lyon, vorgenommen werden. Die Lokalisation der Tumoren wird für alle eingeschlossenen Fälle mit Hilfe der Dokumentation aus Arztbrief, Operationsbericht bzw. C030 Umwelt-Epidemiologie Pathologiereport und anhand der vorliegenden bildgebenden Diagnostik-Verfahren (MRT, CT) vorgenommen. In ein elektronisches Grid-Raster werden die in den bildgebenden Verfahren abgebildeten Tumoren mit Unterstützung der jeweiligen Neuroradiologischen Kliniken eingescannt. Unter Zuhilfenahme der Informationen zu den Telefoniergewohnheiten (aus der Befragung) können aus diesen Angaben die jeweils spezifische Absorptionsrate (SAR) jedes Studienteilnehmers berechnet werden. Nach der Datenaufbereitung soll im Frühsommer 2004 mit der gemeinsamen Datenanalyse für das deutsche Studienzentrum begonnen werden. Mit ersten Ergebnissen ist Ende 2004 zu rechnen. Finanzierung: 5. Rahmenprogramm der Europäischen Union (2/ 00-1/04), UICC (10/01-9/05) (anteilig alle Europäischen Studienzentren); nur DKFZ: Ministerium für Umwelt und Verkehr, Baden- Württemberg, 1. Förderphase: 00-01; 2. Förderphase: Berufliche Risikofaktoren für Hirntumoren I. Hettinger, B. Schlehofer, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Anders Ahlbom, Institute for Environmental Medicine, Stockholm, Schweden; Annie Arslan, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, Frankreich; Prof. Dr. Maria Blettner, Universität Bielefeld; Prof. Dr. Won N. Choi ( ), Manitoba Cancer Treatment & Research Foundation, Winnipeg, Kanada; Prof. Dr. Graham G. Giles, Anti Cancer Council of Victoria, Victoria, Australien; Prof. Dr. Geoffrey Howe, Columbia University School of Public Health, New York, USA; Prof. Dr. Julian Little, University of Aberdeen Medical School, Aberdeen, UK; Dr. Francois Menegoz, Registre du Cancer du Department de l Isère, Frankreich; Prof. Dr. Susan Preston-Martin, University of Southern California School of Medicine, Los Angeles, USA; Dr. Philip Ryan, University of Adelaide, Adelaide, Australien. Im Rahmen einer Internationalen populationsbezogenen Studie zur Ätiologie von Hirntumoren im Erwachsenenalter wurden Daten zu verschiedenen potentiellen Risikofaktoren aus den Bereichen Ernährung, Lebensstil (z.b. Rauchen und Alkohol), berufliche Tätigkeit und zur medizinischen Vorgeschichte erhoben. Die von der International Agency for Research on Cancer, Lyon (France) koordinierte Studie wurde Ende der 80er Jahre nach gleichem Protokoll in acht Studienzentren in Australien (Adelaide, Melbourne), Kanada (Toronto, Winnipeg), Europa (Frankreich, Deutschland, Schweden) und den USA (Los Angeles) durchgeführt. Insgesamt konnten 331 Meningiom- und 1178 Gliomfälle, sowie 2493 Kontrollen (gematcht nach Alter, Geschlecht und Region) rekrutiert werden. Ergebnisse über medizinische Faktoren (Schlehofer et al. Int. J. Cancer 82 (1999) ), Kopfverletzungen (Preston-Martin et al. Int. J. Epidemiol. 27 (1998) ), und Kontakt mit Tieren [1] im Hinblick auf das Risiko für Gliome und Meningiome sind bereits publiziert worden. Aktuell werden die Informationen zu beruflichen Risikofaktoren und deren Einfluss auf die Hirntumorentstehung bzw. Entwicklung untersucht. Die Analyse des gepoolten Datensatzes der Internationalen Fall-Kontroll-Studie bietet außerdem die Möglichkeit, Analysen für Männer und Frauen, sowie für niedriggradige und hochgradige Gliome getrennt durchzuführen. Ein Mnuskript mit dem Titel Berufliche Risikofaktoren für niedriggradige und hochgradige Gliome wurde vor kurzem zur Publikation angenommen. Risikofaktoren für Hirntumoren werden für verschiedene berufliche Tätigkeiten und Expositionen kontrovers diskutiert. Von allen Studienteilnehmern wurden Daten zu beruf-

195 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention lichen Tätigkeiten über das gesamte Berufsleben erhoben, gemäß der ISCO (International Standard Classification of Occupation) kodiert und in 16 Berufsgruppen kategorisiert. Zusätzlich wurden anhand einer Liste Informationen zu spezifischen Substanzexpositionen erhalten. Aufgrund von Informationen aus der Literatur standen à priori sechs Berufsgruppen im Mittelpunkt der Analysen: Chemie, Metall, Elektro, Bau, Transport und Landwirtschaft. Als Hauptresultate liegen vor: Für Gliome als ganze Gruppe konnten bezüglich der sechs wichtigsten Kategorien (s.o.) keine beruflichen Risikofaktoren identifiziert werden, weder für Frauen noch für Männer. Bei der getrennten Analyse von niedriggradigen und hochgradigen Gliomen zeigte sich für Männer ein erhöhtes Risiko für niedriggradige Gliome bei beruflicher Tätigkeit in der Kategorie Metall. Für Frauen weist die Tätigkeit in der Berufsgruppe Lebensmittelproduktion und -verarbeitung ein signifikant zweifach erhöhtes Risiko für Gliome auf, welches bei der Subgruppenanalyse nur bei den niedriggradigen Gliomen, nicht jedoch bei den hochgradigen Gliomen bestehen bleibt. Berufliche Exposition gegenüber Substanzen waren für Männer und Frauen in keiner der 20 Substanzgruppen positiv mit Gliomen assoziiert. Für Meningeome und Männer zeigte sich ein signifikant dreifach erhöhtes Risiko für berufliche Tätigkeit in der Kategorie Bau und ein zweifach erhöhtes Risiko für berufliche Exposition mit der Substanzgruppe Isoliermaterial. Für Meningeome und Frauen zeigten sich zweifach erhöhte Risiken in den Berufskategorien Transport und Lebensmittelproduktion und -verarbeitung (nicht signifikant); bezüglich Substanzexpositionen weisen die Substanzgruppen Kosmetische Produkte, Ölprodukte und Metalle und Metallverbindungen erhöhte Risiken auf, die jedoch überwiegend auf kleinen Fallzahlen beruhen. Da ätiologische Faktoren von Hirntumoren noch immer nicht hinreichend geklärt sind und bisher nicht alle Daten der Internationalen Hirntumorstudie ausgewertet werden konnten, hat sich die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie und die AG Epidemiologie und medizinische Statistik der Universität Bielefeld entschlossen, weitere Bereiche der Studie (z.b. ionisierende Strahlung) zu untersuchen. Ergebnisse aus dieser Hirntumorstudie können wertvolle Hinweise für die Analyse der Interphone Studie liefern. Körperliche Aktivität und Krebs K. Steindorf, M. Schmidt In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Wieslaw Jedrychowski, Universität Krakau, Polen; PD Dr. Jenny Chang-Claude, Abteilung Klinische Epidemiologie, DKFZ C030 Umwelt-Epidemiologie Ein Zusammenhang zwischen körperlicher Aktivität und der Entstehung von Tumoren wird für verschiedene Krebsarten diskutiert, so z.b. für Darm- und Brustkrebs, aber auch für Gebärmutter- und Prostatakrebs. Körperliche Aktivität stellt einen Faktor dar, der auf Individual- und auf Bevölkerungsebene in seiner Häufigkeit und Intensität veränderbar ist. Daher besitzt er ein hohes Potential für die Gesundheitserziehung und die primäre Prävention von Tumoren. Aus wissenschaftlicher Sicht handelt es sich bei der Größe körperliche Aktivität um eine komplexe Variable. So müssen z.b. Arbeits- und Freizeitverhalten, Verhaltensweisen in verschiedenen Lebensaltersstufen, jahreszeitliche Einflüße und Wechselwirkungen zu anderen Lebensstilfaktoren wie z.b. der Ernährung berücksichtigt werden. In der Literatur finden sich verschiedene Ansätze zur Erhebung und Auswertung von körperlicher Aktivität, von sehr einfachen Abfragen bis hin zu sehr detaillierten und aufwendigen Befragungen. Die Fortentwicklung und Validierung von standardisierten Erhebungs- und Auswertungsmethoden für verschiedene Arten von körperlicher Aktivität stellen daher wichtige Aufgaben dar [IARC Handbooks on Cancer Prevention, Vol. 6: Weight Control and Physical Activity, 2002, S. 245]. Daher führten wir im Jahr 2003, im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie zu den Risikofaktoren von postmenopausalem Brustkrebs unter Leitung von Frau Dr. Chang-Claude, Abteilung Klinische Epidemiologie, eine vergleichende Untersuchung zweier Erhebungsinstrumente durch. Neben dem ausführlichen, von uns mitentwickelten Fragebogen für körperliche Aktivität wurden 215 Frauen (114 Fälle, 101 Kontrollen) in einem Abstand von mindestens zwei Monaten mit einem deutlich kürzeren Fragebogen telefonisch interviewt. Ziel dieses Vergleichs ist es zu untersuchen, ob beide Fragebögen vergleichbare Informationen liefern und ob der kürzere Fragebogen in der Praxis zu relevanten Zeitersparnissen führen kann. Derzeit erfolgt die Auswertung dieser relativen Validierungsstudie. Die Auswertungen zu dem Zusammenhang zwischen postmenopausalem Brustkrebs und körperlicher Aktivität kann erst nach Abschluß der Hauptstudie erfolgen. Da auch die Wiederholbarkeit einer Datenerhebung ein sehr wichtiges Kriterium bei retrospektiven Erfassungen darstellt, untersuchen wir in einem eigenständigen Kollektiv von 30 Frauen die Reliabilität des kürzeren Fragebogens. In dieser Studie werden die Frauen zwei Monate nach der ersten telefonischen Befragung mittels des kürzeren Fragebogens erneut in analoger Weise befragt. Die erste Befragungswelle ist abgeschlossen, die zweite Welle und die Auswertungen werden Anfang 2004 fertiggestellt. Neben diesem eher methodischen Schwerpunkt besteht ein weiteres wichtiges Ziel dieses Themenschwerpunkts darin, die Erkenntnislage für verschiedene Tumoren zu verbessern und somit die Erstellung von konkreten Empfehlungen für das Gesundheitsverhalten zu unterstützen. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie zur Entstehung von Kolorektalkarzinomen an der Universität Krakau in Polen wurden 180 neu an einem derartigen Tumor erkrankte Patienten und 180 Krankenhauskontrollen untersucht. Der Schwerpunkt der Kooperation lag auf der gemeinsamen Betrachtung von körperlicher Aktivität im Beruf und in der Freizeit, als auch auf der ausführlichen Analyse möglicher Wechselwirkungen zu anderen Lebensstilfaktoren wie z.b. der Ernährung [2,3]. In einer bevölkerungsbezogenen Fall-Kontroll-Studie untersuchten wir den Zusammenhang zwischen körperlicher Aktivität durch Beruf, Sport, Haushalt, Zu-Fuß-Gehen und Fahrradfahren in der Jugend und im jungen Erwachsenenalter bei 360 prämenopausalen Brustkrebsfällen und bei 886 Kontrollen [4]. Wir fanden keine Assoziation zwischen der gesamten körperlichen Aktivität und prämenopausalem Brustkrebs, wenn beide Altersperioden getrennt betrachtet wurden. Wurden beide Altersperioden zusammengefasst, so zeigte sich keine eindeutige montone inverse Beziehung zwischen dem Grad der körperlichen Gesamtaktivität und Brustkrebs. Lediglich der protektive Effekt von moderat hoher körperlicher Aktivität war statistisch signifikant. Analysen nach der Art der körperlichen Aktivität zeigte signifikante protektive Effekte für Frauen, die die höchste Fahrradfahr-Aktivität aufwiesen. Das häufige Auftreten von 195

196 196 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Fahrradfahren und Zu-Fuß-Gehen in unserer Studie zeigt deutlich, wie wichtig es ist, bei Expositionserfassungen nationale Gegebenheit zu berücksichtigen. Statistische Methoden in der Epidemiologie und Quantitative Risikoabschätzungen K. Steindorf In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Maria Blettner, Universität Mainz; Prof. Dr. Heiko Becher, Universität Heidelberg, Dipl.-Stat. Dirk Taeger, Berufsgenossenschaftliches Forschungsinstitut für Arbeitsmedizin, Bochum Eine kontinuierliche statistische Betreuung epidemiologischer Projekte in der Plannungs-, Durchführungs- und Auswertungsphase ist unerläßlich für valide epidemiologische Forschung. Es werden verschiedene Projekte der Arbeitsgruppe Umweltepidemiologie sowie der Abteilung Klinische Epidemiologie statistisch betreut [5]. In einigen Fällen können Standardverfahren angewendet werden, in anderen müssen neue statistische und epidemiologische Methoden entwickelt werden. Im Berichtszeitraum wurden zwei wissenschaftliche Workshops (Themen: Statistische Methoden des Verbraucherschutzes; Neue statistische Verfahren in der Epidemiologie) organisiert, um neue Verfahren auf nationaler und internationaler Ebene zu diskutieren und bekannt zu machen. Eine Hauptaufgabe der Krebsepidemiologie und der Umwelt-Epidemiologie besteht darin, Faktoren zu identifizieren, die das Krebsrisiko erhöhen oder verringern können. Dabei ist meist nicht nur von Interesse, ob ein Faktor karzinogen ist, sondern auch das Risiko quantitativ und für verschiedene Expositionskonstellationen zu beschreiben. Insbesondere die zweite Fragestellung ist die Aufgabe von sogenannten Quantitativen Risikoabschätzungen. Seit Jahren beschäftigt sich die Arbeitsgruppe mit derartigen Fragestellungen. Derartige Bewertungen stellen eine wichtige Grundlage für Entscheidungen im Öffentlichen Gesundheitswesen dar. So können Empfehlungen für Präventionsstrategien, Grenzwertfestlegungen im Schadstoffbereich oder Prognosen für die Entwicklung von Krebsinzidenzen mittels der Verfahren von Quantitativen Risikoabschätzungen erstellt werden. Auch die Berücksichtigung von individuellen Suszeptibilitäten und Hoch-Risikogruppen gerät zunehmend in den Vordergrund von Quantitativen Risikoabschätzungen. Auch die politische Neuorganisation des Verbraucherschutzes in Deutschland führt zu einem verstärkten Interesse an Quantitativen Risikoabschätzungen. Angeborene morphologische Defekte bei Neugeborenen K. Schlaefer, J. Wahrendorf, A. Wiesel In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Annette Queisser-Luft, Geburtenregister Mainzer Modell, Kinderklinik der Universität Mainz In der Bundesrepublik Deutschland sind angeborene Fehlbildungen die häufigste Ursache der Kindersterblichkeit (ca. ein Viertel aller kindlichen Todesfälle). Die Prävention angeborener Fehlbildungen ist daher eine wichtige Aufgabe der Pädiatrie. Eine systematische Registrierung von angeborenen Fehlbildungen stellt die Grundlage zur Bearbeitung wissenschaftlicher Fragestellungen und damit auch zur Ursachenforschung dar. Epidemiologische Daten und Analysen können Ansatzpunkte zur Prävention von Fehlbildungen liefern und C030 Umwelt-Epidemiologie sind daher wesentliche Grundlagen für gesundheitspolitische Maßnahmen. Die intrauterine Entwicklung des Kindes kann durch äußere Störfaktoren (z.b. chemische und physikalische Noxen, Medikamenteneinnahme in der Schwangerschaft, Fehlernährung, ökosoziale Faktoren, berufliche Expositionen) beeinflusst und sehr empfindlich gestört werden. Fehlbildungen können dann die Folge solcher schädigenden Einflüsse sein. Aber noch immer sind in ca. 60% der Fälle die Ursachen angeborener Fehlbildungen nicht bekannt. Seit 1990 besteht das Mainzer Geburtenregister zur Erfassung angeborener Fehlbildungen bei Neugeborenen. Ziele dieses Registers sind die Erfassung von bevölkerungsbezogenen Fehlbildungshäufigkeiten, zeitlichen und regionalen Trends sowie die Ermittlung von Ansatzpunkten zur Ursachenforschung angeborener Fehlbildungen (Queißer-Luft et al. Monatsschrift Kinderheilkunde 149 (2001) ); [6]. Dazu werden alle in Mainz geborenen Kinder (Lebendgeborene, Totgeborene, spontane und induzierte Aborte) nach einem standardisierten Schema klinisch und sonographisch (Hüften und Nieren; bei spezieller Indikation Schädel und Herz) untersucht. Eine Zusammenarbeit mit der AG Umwelt-Epidemiologie des DKFZ besteht bezüglich der Auswertung der epidemiologischen Fragestellungen. Seit 1990 wurden mehr als Neugeborene untersucht davon entfallen auf die Region Rheinhessen, dies sind ca. 90 % der in dieser Region geborenen Kinder, d.h. alle Auswertungen sind somit populationsbezogen und deren Ergebnisse sind repräsentativ. Wurden in den Anfangsjahren Kinder pro Jahr in der Region Rheinhessen erfasst, so sank diese Zahl auf Grund des allgemeinen Geburtenrückgangs in den letzten Jahren auf / Jahr. Die Rate der großen Fehlbildungen lag in allen Jahren zwischen 6% und 8%. Einen zeitlichen Trend gab es hierbei nicht. Bisherige spezielle Auswertungen widmeten sich u.a. den Themenbereichen: Pränatale Diagnose von Fehlbildungen: Sensitivität pränataler Ultraschalluntersuchungen, Mütterliche Medikamenteneinnahme und Fehlbildungen beim Feten, Mütterliche Adipositas als Risikofaktor für kindliche Fehlbildungen und Überprüfung der mütterlichen perikonzeptionellen Folsäureeinahme zur Prävention von Neuralrohrdefekten. Derzeitige Schwerpunkte bei den Auswertungen liegen in der Ermittlung möglicher Risikofaktoren (z.b. von reproduktionsmedizinischen Methoden) für die Entstehung angeborener Fehlbildungen. Bei der derzeit invasivsten Methode, der intra-cytoplasmatischen Spermieninjektion, wurde ein um das 2,7-fach erhöhtes Risiko beobachtet mit einer großen Fehlbildungen geboren zu werden. Nach nun mehr als zehn Jahren Laufzeit steht die Prävalenzermittlung onkologischer Erkrankungen bei den Kindern mit Fehlbildungen der Mainzer Geburtenkohorte im Vordergrund (Kalla et al. Journal of Human Ecology 12 (2001) ). In Zusammenarbeit mit dem Deutschen Kinderkrebsregister und der onkologischen Station der Kinderklinik (beide ebenfalls Universität Mainz) konnten für den Zeitraum Kindern mit Neubildungen ermittelt werden. Von diesen hatten 9 eine angeborene große Fehlbildung. Dies bedeutet ein um das 3-fach erhöhtes Risiko für Kinder mit einer angeborenen großen Fehlbildung noch in der Kindheit einen Tumor zu entwickeln.

197 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Studie zum Einfluß von Adeno-assoziierten Viren auf die Schwangerschaft (AAVIS). B. Schlehofer, I. Hettinger, S. Estel, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. med. Jörg Schlehofer, Christine Wenig, Bettina Kohlhoff, Julie Aldinger, Abteilung Tumorvirologie, DKFZ; Dr. Paul Schnitzler, Hygiene Institut, Abteilung für Virologie, Universität Heidelberg; Dr. Karsten Geletneky, Neurochirurgische Klinik, Universität Heidelberg; Dr. Gernot K. Beisler, Ärztehaus, Bad-Wildbad C030 Umwelt-Epidemiologie Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind helferabhängige Parvoviren (kleine, einzelsträngige, DNA-Viren), mit denen sich die meisten Menschen schon in der Kindheit infizieren. Sie gelten als nicht humanpathogen, sind tumorprotektiv und werden, aufgrund ihrer Eigenschaft sich unter bestimmten Bedingungen ins zelluläre Genom integrieren zu können, als mögliche Vektoren in der Gentherapie diskutiert. Systematische Untersuchungen zur möglichen Rolle von AAV bei chronischen Störungen oder Erkrankungen liegen zur Zeit noch nicht vor. In den vergangenen Jahren wurde AAV in einigen virologischen Studien im menschlichem Genitalgewebe (z.b. Uterus- und Hodengewebe, Zervixabstriche, Sperma) nachgewiesen. In Tierexperimenten zeigte sich ein Zusammenhang zwischen AAV und perinatalen Komplikationen. (Botquin et al. J. Gen. Virol. 75 (1994) ). Es gibt Hinweise auf vorzeitige Wehen und vorzeitigen Blasensprung sowie ein vermindertes Geburtsgewicht bei Kindern von Müttern mit AAV-infizierter Amnionflüssigkeit (Burguete et al. Hum. Reprod. 14 (1999) ) Im Rahmen einer prospektiven virologisch-epidemiologischen Studie wird untersucht, wie sich die Antikörperprävalenz der Viren während der Schwangerschaft und beim Neugeborenen entwickelt, ob virale DNA im Fruchtwasser nachweisbar ist und ob Infektionen mit AAV und/oder seinen Helfern, Papillom- und Herpes-Viren (HCMV), den Verlauf der Schwangerschaft, die Entwicklung des Kindes oder den Geburtsvorgang beeinflussen. Hierzu wurden alle 403 schwangere Frauen, die zwischen Februar 1999 und April 2000 in einer Schwerpunktspraxis für Amniozentese im Raum Pforzheim behandelt wurden zum Zeitpunkt der Amniozentese (T1) in die Studie aufgenommen. Bei n=391 Müttern wurde sowohl zu (T1) als auch direkt nach der Geburt (T2) (n=270) und deren Kindern (n=261) Serum entnommen und auf IgG und IgM Antikörper (AK) gegen AAV mittels ELISA getestet; zusätzlich wurde bei 396 Frauen das Fruchtwasser auf AAV-DNA mittels PCR untersucht. Für 246 Studienteilnehmerinnen (61%) sind alle 3 Serumproben (zwei mütterliche und ein kindliches) und die Fruchtwasserprobe vorhanden. Parallel dazu wurden sowohl zu T1 wie auch zu T2 verschiedene, die Schwangerschaft möglicherweise beeinflussende medizinische und lebensstilbedingte Risikofaktoren per Fragebogen erhoben, ebenso relevante Daten bezüglich früherer und der aktuellen Schwangerschaft, der Entbindung und des Kindes. 91% der Fragebogen (n=369) wurden sowohl von den jeweils betreuenden Gynäkologen als auch von den Geburtsstationen der Entbindungskliniken ausgefüllt. Die Testung der Seren auf AAV-AK und der Fruchtwasserproben auf virale DNA werden z.zt. abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigen, dass in 38% der Fruchtwasserproben AAV-DNA nachweisbar ist. Bei 41% dieser Frauen wurden perinatale Komplikationen beobachtet (vorzeitiger Blasensprung, Gestosen, Plazentadysfunktion), während solche Komplikationen nur bei 26% der Schwangeren mit DNAnegativem Fruchtwasser auftraten. Ebenso wurde von Frauen mit DNA-positivem Fruchtwasser Frühgeburten (<=259 Tage) doppelt so häufig berichtet. Es zeigte sich jedoch kein Zusammenhang von Schwangerschafts-assoziierten Infektionen (mit Clamydien-, Bakterien-, anderen Virusinfektionen und Toxoplasmose), vorzeitigen Wehen, Blutungen oder Missbildungen der Kinder und der Anwesenheit von DNA im Fruchtwasser. Auffallend war, dass bei AAV-DNApositivem Fruchtwasser nicht immer Serumantikörper gegen AAV nachweisbar waren. In 18 von 262 Neugeborenenseren konnten IgM-Antikörper gegen AAV nachgewiesen werden, was für eine in-utero- Infektion der Feten mit AAV spricht. Ob hiermit ein klinisches Krankheitsbild verbunden ist, ließ sich im Rahmen dieser Studie nicht zeigen. Die gleichen Serum- und Fruchtwasserproben der 403 Schwangeren wurden auch auf HCMV (Herpervirus) untersucht. 3% der Fruchtwasserproben waren DNA positiv, wobei zum gleichen Zeitpunkt bei 46,6% der Schwangeren IgG-Antikörper im Serum aufwiesen. Zum Zeitpunkt der Entbindung hatten 40,3% der Mütter und 41,1% der Kinder IgG-Antiköper gegen HCMV, keines der Kinder hatte IgM-Antikörper. Papillomvirus-DNA war im Fruchtwasser nicht nach weisbar (Aldinger et al. Prenatal and Neonatal Medicine 6, suppl. 1 (2001) 62). Die Rolle von Herpesvirus-Infektionen in der Ätiologie von Hirntumoren B. Schlehofer, S. Poltermann, K. Steindorf, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Jörg R. Schlehofer, Abteilung Tumorvirologie, DKFZ; Prof. Dr. Andreas Unterberg und Dr. Karsten Geletneky, Neurochirurgische Klinik, Universität Heidelberg, im Rahmen des Graduiertenkollegs Epidemiology of communicable and non-communicable diseases. Für maligne Gliome, die häufigsten primären Hirntumoren des Erwachsenenalters, ist die Ätiologie noch immer unklar. In verschiedenen Studien wurde ein möglicher Zusammenhang dieser Tumoren mit Virusinfektionen (SV40, JC-Virus, Herpes Viren) untersucht. Die Assoziation mit SV40 und Polyomaviren wird kontrovers diskutiert, jedoch machen neuere Untersuchungen diesen Zusammenhang eher unwahrscheinlich. Einige Humane Herpes Viren (HHV), die zu einer lebenslangen latenten Infektion führen, spielen eine Rolle bei der Pathogenese verschiedener menschlicher Krebserkrankungen. Es wird angenommen, dass die Reaktivierung der Viren, auch nach langer Latenzzeit, zur Krebsentstehung führen kann. Auf der anderen Seite zeigte eine epidemiologische Studie (Wrensch et al. Am. J. Epidemiol. 154 (2001) ), eine inverse Korrelation zu Serum Antikörper gegenüber Varizella Zoster Viren bei Gliom-Patienten. Des weiteren konnten wir bereits in früheren Studien eine Reduzierung des Risikos für Hirntumoren bei Personen mit gehäuftem Erkranken an Infektionen beobachten (Schlehofer et al. Cancer 69 (1992) ; Schlehofer et al. Int. J. Cancer 82 (1999) ), was erst kürzlich wieder bestätigt wurde. Es wird vermutet, dass hierbei evtl. die Stimulation des Immunsystems durch die Infektion eine Rolle spielt (Brenner et al. Int. J. Cancer 99 (2002) ). Kürzlich stellte Cobbs et al. (Cancer Res. 62 (2002) ) die Hypothese auf, dass Infektionen mit dem Humanen Cytomegalie Virus (HCMV), einem Herpesvirus, eine aktive Rolle in der Pathogenese von Gliomen, nicht aber von ande- 197

198 198 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ren Hirntumoren spielen könnte, am ehesten im Sinne eines Tumorpromotors. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, dass trophisch ist für gliale Zellen (Fritschy et al. J. Neurosci. 16 (1996) ) und das in % der Bevölkerung prävalent ist (Britt et al. In: Fields et al. (eds.), Fields Virology, Ed. 3 (1996), pp , New York: Raven Press). Infektion von Feten kann zu schweren Enzephalitiden führen und ebenso - auf Grund seiner Fähigkeit reaktiviert zu werden - bei immunsupprimierten Erwachsenen. HCMV-Gentranskription kann durch Entzündungsstimmuli aktiviert werden und transkriptorisch aktiviertes HCMV kann eine maligne Transformation von Zellen induzieren. HCVM-Genprodukte können auch andere onkogene Viren, die im Zusammenhang mit Gliomen diskutiert werden, wie z.b. das JC-Virus, transaktivieren (Winklhofer et al. Virology 275 (2000) , Del Valle et al. Cancer Res. 61 (2001) ) und mit einem solchen Virus synergieren und so zu einer Tumorpromotion führen. Die Infektion durch Reaktivierung von HCMV ist bei immunsupprimierten Patienten (z.b. Transplantationspatienten, HIV-Infizierte, bei Chemotherapie) eine der gefürchtetsten Komplikationen, wobei gerade bei diesen Patienten auch ein besonders hohes Risiko für Hirntumoren und Leukämie besteht. Im Rahmen einer Studie in Zusammenarbeit mit der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg und der Abteilung Tumorvirologie des DKFZ werden Tumorbiopsien von jeweils 80 Patienten mit Gliomen und Meningeomen auf HCMV- DNA, -RNA mittels PCR, RT-PCR und in-situ Hybridisierung sowie Immunfluoreszenz auf HCMV-Proteine untersucht. Zusätzlich werden deren Serum auf HCMV-Antikörpern getestet. Weiterhin wird das Serum dieser Patienten auf Antikörper gegen verschiedene Herpesviren (Herpes simplex virus [HSV], Epstein-Barr Virus [EBV], VZV) getestet, um die Rolle vorausgegangener Infektionserkrankungen bei der Entstehung von Hirntumoren zu untersuchen, wie das im Rahmen der serologischen Studien von Wrensch et al. (Am. J. Epidemiol. 154 (2001) 161-5) empfohlen wurde. In einem Telefoninterview werden Zusatzinformationen erfasst bezüglich sonstiger Einflussfaktoren, wie z.b. anamnestische Angaben zu Infektionserkrankungen und Impfungen, zu immunsupprimierenden Medikamenten, dem Kontakt zu Tieren und der familiären Krankengeschichte. Die Auswertung der Daten erfolgt im Rahmen einer multivariaten logistischen Regressionsanalyse. Die Studie soll voraussichtlich Ende 2004 abgeschlossen sein. Finanzierung: DFG i. R. des Graduiertenkollegs Epidemiologiy of communicable and non-communicable diseases Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Menegoz, R.F., *Little, J., *Colonna, M., *Arslan, A., *Preston-Martin, S., Schlehofer, B., *Blettner, M., *Howe, G.R., *Ryan, P., *Giles, G.G.; *Rodvall, Y., *Choi, N.W. (2002) Contacts with animals and humans as risk factors of brain tumor in adult. An international case-control study. European Journal of Cancer 38, [2] *Jedrychowski W., *Tobiasz-Adamczyk B., Steindorf K., *Popiela T., *Penar A., *Matyja A., Wahrendorf J. (2002): Protective effects of physical activity in the occurrence of colon cancer. Przeglad Lekarski, 59, [3] *Jedrychowski W., Steindorf K., *Popiela T., Wahrendorf J., *Tobiasz-Adamczyk B., *Kulig J., *Penar A. (2002): Alcohol consumption and the risk of colorectal cancer at low levels of micronutrient intake. Medical Science Monitor, 8, CR C030 Umwelt-Epidemiologie [4] Steindorf K., Schmidt M., Kropp S., Chang-Claude J. (2003): Case-control study of physical activity and breast cancer risk among premenopausal women in Germany. American Journal of Epidemiology, 157, [5] *Adzersen K.-H., Becker N., Steindorf K., *Frentzel-Beyme R. (2003): Cancer mortality in a cohort of male german iron foundry workers. American Journal of Industrial Medicine, 43, [6] *Queißer-Luft, A., *Stolz, G., Wiesel, A., Schlaefer, K., *Spranger, J. (2002) Malformations in newborns: Results based on 30,940 infants and fetuses from the Mainz congenital birth defect monitoring system ( ). Archives of Gynecology and Obstetrics, 266,

199 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C040 Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese (C040) Leiterin: Dr. Monica Hollstein Wissenschaftler Dr. Manfred Hergenhahn (! ) Dr. Keijan Pan (10/02-10/03) Doktoranden Djeda Belharazem (8/02-) Sebastian Günkel (-12/02) Amanda Hong (8/03-) Zhipei Liu (12/01-) Technische Angestellte Karl-Rudolf Muehlbauer Annette Weninger Die Abteilung untersucht Tumoren, frühe neoplastische Läsionen und Tumorzell-Linien auf Veränderungen in der DNA-Sequenz und auf Veränderungen in der Genexpression, die zur Entwicklung der Tumoren in Verbindung stehen. Das Molecular Profiling von Tumoren liefert Erkenntnisse über biologische Abläufe und Vernetzung, welche das Leben und Sterben der Zelle bestimmen und öffnet so neue Wege für moderne diagnostische chemopräventive und therapeutische Strategien. In diesem Zusammenhang werden genetisch veränderte Mausstämme mit genau definierten molekularen Veränderungen erzeugt (zum Beispiel mit einer inaktivierenden Punktmodation im p53-tumor Suppressorgen), wie sie für Krebszellen typisch sind und zum malignen Wachstum beitragen. Die Mausmodelle sollen die Entwicklung und die in vivo präklinische Evaluation maßgeschneiderter Arzneimittel beschleunigen, welche ganz spezifisch molekulare Veränderungen in menschlichen Tumoren ansteuern können. Verwandte Mäusestämme, welche menschliche DNA-Sequenzen tragen, sollen ebenfalls verwendet werden, um Hypothesen über den Ursprung spezifischer genetischer Defekte bewerten zu können, welche menschlichen Krankheiten zu Grunde liegen, einschließlich endogener und exogener Krebsrisikofaktoren und Mechanismen, die für die Schäden in der DNA-Sequenz verantwortlich sind. 1. Genexpression und Mutationsanalyse in Tumoren, primären Säugerzellen und Zelllinien: neue Marker für Krebsdiagnose und Chemoprävention M. Hergenhahn und M. Hollstein In Zusammenarbeit mit H.-J. Gröne, M. Kenzelmann, G. Schütz, B. Kyewski, P. Boukamp (alle DKFZ); A. Germann, R. Kösters, M. von Knebel Doeberitz, Chirurgie Universität Heidelberg; F.X. Bosch, HNO Kopfklinik, A. Grau, S. Wagner, C. Grond-Ginsbach, Neurologie Kopfklinik Universität Heidelberg; K. Beyreuther, T. Hartmann, ZMBH Heidelberg; Yang Xu, UCSD, San Diego, USA. Genexpressionsprofile und Mutationsuntersuchungen in kritischen Genen von Tumoren können dazu dienen, neue Marker für die Tumordiagnostik und neue Targets für Tumorbehandlung und Chemoprävention zu ermitteln. Wir haben daher mit dem Affymetrix-System der Abteilung die Expression von Genen aus 10 phänotypisch normalen Prostatabereichen mit denen von 18 nicht-metastasierenden Tumoren verglichen und Boten-RNAs für mögliche neue Marker und Therapieangriffsorte beschrieben [1]. Durch die Verbindung von Tumormikrodissektion, RNA- Amplifikation und - markierung mit einer von uns verbesserten Methode der Expressionsprofilierung [1,2,3] gelang es weiter, die Zusammenarbeit von Tumorepithel- und -stromazellen in Prostatatumoren quantitativ zu beschreiben. Diese Arbeiten werden mit methodischen Entwicklungen zur Analyse von Prostata-Tumorvorstufen (PINs) und frühen Tumoren fortgesetzt. Ergänzend wurden Prostatatumoren auf Mutationen in zwei Tumorsuppressor-Genen ( p53 und dem erst kürzlich als häufig mutiert beschriebenen KLF6 ) untersucht; beide sind in den von uns untersuchten Prostatatumoren selten mutiert [4]. In einer umfangreichen Studie wurden Tumoren im Hals-Rachenbereich auf p53-mutationen hin untersucht, die zunächst mit Affymetrix-p53 Chips ermittelt und dann mit konventioneller Sequenzierung bestätigt wurden (F.X.Bosch, M.Hergenhahn). Erstmals hat Prof. B. Kyewski (DKFZ) in Zusammenarbeit mit C040 in aufwendig angereicherten Zellpopulationen aus menschlichem Thymus einen wichtigen Aspekt des Immunsystems beschrieben - die sog. promiskuitive Genexpression. Diese sorgt dafür, dass körpereigene Zellen nicht vom eigenen Immunsystem attackiert werden [5]. Zur Untersuchung beteiligter Mechanismen werden diese Arbeiten in Mausmodellen fortgesetzt, die Defekte in verschiedenen Mechanismen der Immunantwort aufweisen. In zwei Ansätzen wurden mögliche Angriffsorte für die Chemoprävention von Tumoren untersucht: mit dem Ziel einer Chemoprävention von Epstein-Barr Virus-induzierten Tumoren und Erkrankungen konnten wir erstmals zeigen, dass Curcumin (die gelbe Substanz im Curry) die Induktion von EBV aus der Latenz in B-lymphoiden Zellen auf der Transkriptionsebene verhindert [6]. In einem Rattenmodell für Colonkrebs beim Menschen (R. Koesters, DKFZ) haben wir die Kinetik der Genexpression unter dem Einfluss der chemopräventiven Substanzen Aspirin und Butyrat beschrieben [7]. In einem Mausmodell von Y. Xu (UCSD, USA) haben wir erstmals belegt, dass eine spezifische knock-in Mutation im p53-gen bei der Maus Veränderungen des Thymusphänotyps, der strahlungsinduzierten Apoptose und Genex- 199

200 200 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention pression (im Thymus) bestimmter, aber nicht aller p53-abhängigen Gene hervorruft. Dies ist eine der ersten in-vivo- Arbeiten zur Bedeutung spezifischer p53-modifikationen (hier: Phosphorylierung von Ser18) für die Transkription spezifischer Gene [8]. Diese Arbeiten werden in Mausstämmen mit verschiedenem p53-status fortgesetzt. - Die Bedeutung einer Spliceform eines Transkriptionsfaktors (Crem tau) für die Spermienentwicklung wurde in einem Maus-KO-Modell untersucht (G.Schütz). Diese Spliceform des Transkriptionsfaktors erwies sich als entscheidend für die Entwicklung runder Spermatiden zu Spermien: die entsprechende Expression von Genen fehlte, die Mausmännchen waren wegen des Fehlens dieses notwendigen Entwicklungsschritts steril [9]. - In weiteren Zusammenarbeiten werden zur Zeit Genexpressionsuntersuchungen zu beteiligten Mechanismen beim Schlaganfall und beim Altern des Menschen durchgeführt. Unsere Erfahrungen zur Methodik und Analyse der Genexpression im experimentellen und klinischen Kontext haben wir zusammen mit Vorstellungen zu notwendigen methodischen Weiterentwicklungen in einem Übersichtsartikel publiziert [10]. 2. Entwicklung von Mausmodellen, die die DNA- Bindungsdomäne des humanen p53-gens tragen, für molekularepidemiologische Studien und präklinische Untersuchungen von anti-p53 Therapeutika. M. Hollstein, K. Pan, M. Hergenhahn In Zusammenarbeit mit M. Murphy, Fox Chase Cancer Center, USA, M. Tommasino, IARC, Lyon, Frankreich; C.C. Harris and P. Hussain, National Cancer Institute, USA; H. Schmeiser (DKFZ); G. Wogan, Massachussetts Institute of Technology, USA. Mutationen in der DNA-Bindungsdomäne (DBD) des p53- Gens werden häufig in Tumoren des Menschen beobachtet, und sind mit einer schlechteren Prognose verknüpft [11, 12]. Um die Ursachen und Konsequenzen von p53-mutationen beim Menschen besser verstehen zu können, haben wir erstmals eine Maus hergestellt, bei der mit Knock-in Technik die DBD der Maus, die sich in der Basensequenz von der des Menschen unterscheidet, in beiden Allelen durch Basensequenz des Menschen ersetzt wurde (Hupki- Maus, [13]]. Damit wird es möglich, in Tierversuchen die exogenen Carcinogene und endogenen mutagenen Mechanismen (z.b. chronische Entzündungen) zu untersuchen, die zu p53-mutationen in Tumoren von Patienten führten. In Zellkulturen embryonaler Fibroblasten aus diesen Mäusen erzeugen wir Mutationsmuster, die denen aus menschlichen Tumoren entsprechen [14]. In weiteren Ansätzen führen wir solche Mutationen konditional bei Mäusen ein, um einerseits die Konsequenzen auf die Genexpression p53-abhängiger Gene und biologischer Prozesse im genetischen Netzwerk, andererseits präklinisch die Neutralisierung der p53- Mutation durch Therapeutika zu untersuchen, die gegen mutiertes p53-protein gerichtet sind. Abteilung C040 Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Ernst, T.; Hergenhahn, M.; Kenzelmann, M.; *Cohen, C. D.; Bonrouhi, M.; Weninger, A.; Klären, R.; Gröne, E. F.; *Wiesel, M.; *Gudemann, C.; *Kuster, J.; *Schott, W.; *Staehler, G.; *Kretzler, M.; Hollstein, M.; Gröne, H. J.: Decrease and gain of gene expression are equally discriminatory markers for prostate carcinoma: a gene expression analysis on total and microdissected prostate tissue. American Journal of Pathology 160 (2002) [2] Kenzelmann, M.; Klären, R,; Hergenhahn, M.; Bonrouhi, M.; Grone, H. J.; Schmid, W.; Schütz, G.: High accuracy amplification of nanogram total RNA amounts for gene profiling. Genomics, in press. [3] Hergenhahn, M.; Kenzelmann, M.; and Gröne, H. J.: Lasercontrolled microdissection of tissues opens a window of new opportunities. Pathology Research and Practice 199 (2003) [4] Mühlbauer, K. R.; Gröne, H. J.; Ernst, T.; Gröne, E.; Tschada, R.; Hergenhahn, M.; Hollstein, M.: Analysis of human prostate cancers and cell lines for mutations in the TP53 and KLF6 tumour suppressor genes. British Journal of Cancer 89 (2003) [5] Gotter, J.; Brors, B.; Hergenhahn, M., Kyewski, B.: Medullary epithelial calls of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes co-localized in chromosomal clusters. Journal of Experimental Medicine, 199 (2004) [6] Hergenhahn, M.; *Soto, U.; Weninger, A.; *Polack, A.; *Hsu, C. H.; *Cheng, A. L.; *Rösl, F.: The chemopreventive compound curcumin is an efficient inhibitor of Epstein-Barr virus BZLF1 transcription in Raji DR-LUC cells. Molecular Carcinogenesis 33 (2002) [7] Germann, A.; Dihlmann, S.; Hergenhahn, M.; Doeberitz, M. K.; and Koesters, R.: Expression profiling of CC531 colon carcinoma cells reveals similar regulation of beta-catenin target genes by both butyrate and aspirin. International Journal of Cancer 106 (2003) [8] *Chao, C.; Hergenhahn, M.; *Kaeser, M.D.; *Wu, Z.; *Saito, S.; *Iggo, R.; Hollstein, M.; *Appella, E.; *Xu, Y.: Cell type- and promoter-specific roles of Ser18 phosphorylation in regulating p53 responses. The Journal of Biological Chemistry 278 (2003) [9] Beißbarth, T.; Borisevich, I.; Hörlein, A.; Kenzelmann, M.; Hergenhahn, M., Klewe-Nebenius, A.; Klären, R.; Korn, B.; Schmid, W.; Vingron, M.; Schütz, G.: Analysis of CREM-dependent gene expression during mouse spermatogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology 212 (2003) [10] Hergenhahn, M.; *Mühlemann, K.; Hollstein, M.; Kenzelmann, M.: DNA microarrays: Perspectives for hypothesisdriven transcriptome research and for clinical applications Current Genomics 4 (2003) [11] *Olivier, M.; *Eeles, R.; Hollstein, M.; *Khan, M.A; *Harris, C.C; *Hainaut, P.: The IARC TP53 database: new online mutation analysis and recommendations to users. Human Mutation 19 (2002) [12] *Lord, G.M.; Hollstein, M.; *Arlt, V.A.; *Roufosse, C.; *Pusey, C.D.; *Cook, T.; Schmeiser, H.H.: Formation of DNA adducts and p53 mutations in a patient with aristolochic acid related nephoropathy. Am. J. Kidney Diseases,43 (2004) e11-e17. [13] *Clarke, A.R; Hollstein, M.: Mouse models with modified p53 sequences to study cancer and ageing. Cell Death and Differentiation 10 (2003) [14] Liu, Z. Hergenhahn, M., Schmeiser, H., *Wogan, G., Hong, A, Hollstein, M.Human tumor p53 mutations are selected for in mouse embryonic fibroblasts harboring a humanized p53 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2004)

201 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C050 Molekular-Genetische Epidemiologie Abteilung Molekular-Genetische Epidemiologie (C050) Leiter: Prof. Kari Hemminki MD PhD (10/02 - ) WissenschaftlicheMitarbeiter Dr. RajivKumar(1/03-) Dr. Justo Lorenzo (1/03-) Dr. Andreas Gast (1/03-) Dr. Bowang Chen (2/03-) Dr. Barbara Burwinkel (5/03-) Dr. Asta Försti (9/03-) Gastwissenschaftler Frederike Büchner (Nijmegen, Niederlande) (4-7/03) Doktoranden Rajesh Rawal (1/03-) Sandra Blöthner (7/03-) Michael Wirtenberger (7/03-) Kerstin Wagner (10/03-) Sekretariat Marion Gangel-Drechsel (1/03-) Die Arbeit der neu gegründeten Abteilung gliedert sich in zwei sich überschneidende Gebiete: Genetische Epidemiologie und Molekulare Epidemiologie. 1) Genetische Epidemiologie: Gegenstand unserer Arbeit ist es, die Familienkrebs-Datenbank von über 10 Millionen Personen und über 1 Million Krebserkrankungen zu aktualisieren und sie für eine verlässliche Schätzung des Familienkrebsrisikos bei speziellen Krebserkrankungen, für die Beurteilung der genetischen und Umweltkomponenten, die Art und Weise der Vererbung und zur Identifizierung der Individuen in Familien für molekulare Studien des Krebses zu nutzen. Die Familienkrebs-Datenbank wird darüber hinaus genutzt, um die familiären Effekte auf alle allgemeinen und Subtypen von Krebs, wie Brust-, Prostata-, Eierstock- und Hautkrebs zu charakterisieren und die Umwelteffekte durch Vergleich von Krebsrisiken zwischen Ehepartnern abzuschätzen. Es werden verschiedene Modellstudien durchgeführt, um rezessive und polygenetische Effekte bei Krebserkrankungen zu testen. Außerdem werten wir die Prävalenz des vererbbaren Krebses unter allen Krebserkrankungen aus. 2) Das Hauptaugenmerk der molekularbiologischen Mutationsuntersuchungen ist darauf gerichtet, Polymorphismen (SNPs) in krebsverwandten Genen bei verschiedenen Krebserkrankungen, einschließlich des familiär auftretenden Krebses und des nicht selektierten Brust-, Blut-, Speiseröhren- und Hautkrebses zu analysieren. Wir entwickeln neue Methoden für die populationsgerichtete Genidentifikation. Putative rezessive Krebserkrankungen werden durch genetische epidemiologische Studien identifiziert (unter [1] beschrieben) und Methoden für die Suche in Frage kommender Gene entwickelt. SNPs in DNA Reparaturmechanismus-Genen, die z. B. für chromosomale Aberrationen und die DNA Reparaturkapazität in Lymphozyten verantwortlich sind, werden aufgedeckt. In Melanoma weisen die Kontrollregulatoren des G1/S Zellzyklusses häufig Abweichungen auf. Außerdem untersuchen wir den Lokus des p16 Gens und klären die Rolle von BRAF und N- RAS im Melanoma und in anderen Neoplasmen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Hemminki, K; Granström, C*. Risk for familial breast cancer increases with age. Nature Genet (2002) 32:233. (Supplementary information at Nature Genet website). [2] Hemminki, K; Jiang, Y*; Steineck, G*. Skin cancer and non- Hodgkin s lymphoma as second malignancies: markers of impaired immune function. Eur J Cancer (2003) 39: [3] Hemminki, K; Li, X*. 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Int J Cancer (2003) 103: [11] Hemminki, K; Granström, C*. Re: Risk of subsequent cancer following breast cancer in men. J Natl Cancer Inst (2002) 94:1892. [12] Hemminki, K; Czene, K*. Attributable risks of familial cancer from the Family-Cancer Database. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev (2002) 11: [13] Berggren, P*; Kumar, R; Sakano, S*; Hemminki, L*; Wada, T*; Steineck, G*; Adolfsson, J*; Larsson, P*; Norming, U*; Wijkström, H*; Hemminki, K. Detecting homozygous deletions in the CDKN24(p16 INK4a )/ARF(p14 ARF ) gene in urinary bladder cancer using real-time quantitative PCR. Clin Cancer Res (2003) 9: [14] Kumar, R; Höglund, L*; Zhao, C*; Försti, A; Snellman, E*; Hemminki, K. Single nucleotide polymorphisms in the XPG gene: determination of role in DNA repair and breast cancer risk. Int J Cancer (2003) 103: [15] Kumar, R; Hemminki, K. Re: Zhang et al. 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202 202 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [21] Snellman, E*; Strozyk, M*; Segerbäck, D*; Klimenko, T*; Hemminki, K. Effect of the spectral range of a UV lamp on the production of cyclobutane pyrimidine dimers in human skin in situ. Photodermatol Photoimmunol Photomed (2003) 19: [22] Kumar, R; Angelini, S*; Hemminki, K. Activating BRAF and N- ras mutations in sporadic primary melanoma: an inverse association with allelic loss on chromosome 9. Oncogene (2003) 22: [23] Kumar, R; Angelini, S*; Czene, K*; Sauroja, I*; Hahka- Kempinen, M*; Pyrhonen, S*; Hemminki, K. BRAF mutations in metastatic melanomas: association with clinical outcome. Clinical Cancer Res (2003) 9: [24] Shao, YH*; Försti, A; Egevad, L*; Anderson, LM*; Lindblad, P*; Hemminki, K. VHL down-regulation and differential localization as mechanisms in tumorigenesis. Kidney Internat (2003) 64: [25] Sallmen, M*; Liesivuori, J*; Taskinen, H*; Lindbohm, ML*; Anttila, A*; Aalto, L*; Hemminki, K. Time to pregnancy among the wives of Finnish greenhouse workers. Scand J Work Environ Health (2003) 29: [26] Li, X*; Hemminki, K. Familial and second lung cancers: nation-wide epidemiological study from Sweden. Lung Cancer (2003) 39: [27] Hemminki, K; Jiang, Y*; Steineck, G*. Skin cancer and non- Hodgkin s lymphoma as second malignancies: markers of impaired immune function? Eur J Cancer (2003) 39: [28] Hemminki, K; Li, X*. Time trends and occupational risk factors for peritoneal mesothelioma in Sweden. J Occup Environ Med (2003) 45: [29] Hemminki, K; Li, X*. Time trends and occupational risk factors for pleural mesothelioma in Sweden. J Occup Environ Med (2003) 45: [30] Hemminki, K; Li, X*. Mesothelioma is a killer of urban men in Sweden. Int J Cancer (2003) 105: [31] Hemminki, K; Zhang, H*; Czene, K*. Familial and attributable risks in cutaneous melanoma: effects of proband and age. J Invest Dermatol (2003) 120: [32] Hemminki, K; Li, X*. 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203 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C050 Molekular-Genetische Epidemiologie [66] Vodica, P*; Kumar, R; Sanyal, S*; Soucek, P*; Haufroid, V*; Stetina, R*; Dusinska, M*; Kuricova, M*; Zamecnikova, M*; Musak, L*; Buchancova, J*; Norppa, H*; Hirvonen, A*; Vodickova, L*; Naccarati, A*; Matousu, Z*; Hemminki, K. Genetic polymorphisms in DNA repair genes and possible links with DNA repair rates, chromosomal aberrations and single-strand breaks in DNA. Carcinogenesis (2004) 25: [67] Försti, A; Angelini, S*; Festa, F*; Sanyal, S*; Grzybowska, E*; Pamula, J*; Pekala, W*; Zientek, H*; Zhang, Z*; Hemminki, K; Kumar, R. Single nucleotide polymoprhisms in breast cancer. Oncol Reports (2004) 11: [68] Sanyal, S*; Festa, F*; Sakano, S*; Zhang, Z*; Steineck, G*; Normig, U*; Wijkström, H*; Larsson, P*; Kumar, R; Hemminki, K. Polymorphisms in DNA repair and metabolic genes in bladder cancer. Carcinogenesis (2004) 25: [69] Jin, Q*; Hemminki, K; Grzybowska, E*; Klaes, R*; Söderberg, M*; Zienek, H*; Rogozinska-Szczepka, J*; Utracka- Hutka, B*; Pamula, J*; Pekala, W*; Försti, A. Polymorphisms and haplotype structures in genes for transforming growth factor B1 (TGFB1) and its receptors in familial and unselected breast cancer. Int J Cancer (2004) 112: [70] Jin, Q*; Hemminki, K; Grzybowska, E*; Klaes, R*; Söderberg, M*; Försti, A. Re: Integrin B3, Leu33Pro homozygosity and risk of breast cancer. J Natl Cancer Inst (2004) 96:

204 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention C060 Biostatistik 204 Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) (C060) Leiter: Dr. rer. nat. Lutz Edler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dipl. Stat. Axel Benner Dr. rer. nat. Iris Burkholder Dipl. Math. Jutta Groos Dr. rer. nat. Carina Ittrich PD Dr. rer. nat. Annette Kopp-Schneider Dipl. med. inf. Timm Pauli Dipl. Math. Lothar Pilz Dr. rer. nat. Werner Rittgen Gastwissenschaftler Prof. Andrej Yakovlev, University of Rochester, NY, USA, (6-9/03) Prof. Byung-Soo Kim, Yonsei University, Seoul, Korea, (6-10/03) Shree Whitaker PhD, Natl. Inst. Environ Health Sciences, RTP, USA, (5-7/03) Sekretariat Regina Grunert Dokumentation und Datenbearbeitung Anna Hellmann Dagmar Metz Datenbearbeitung und -auswertung Renate Rausch Wissenschaftliche Hilfskräfte Sabrina Carpentier, INSA, Lyon Dirk Hoffmann, cand. med. Inf., Universität Heidelberg Axel Karst, cand. med. Inf., Universität Heidelberg Joanna Politis, cand. med. Inf., Universität Heidelberg Christina Winkler, FH Ulm Praktikanten Daniela Beister, BFW Heidelberg Kathrin Huber, FH Ulm Barbara Mathes, Schule Med. Dok. Ulm Gudrun Spilger, TÜV Mannheim Informationsquellen edler@dkfz.de bzw. benner@dkfz.de Tel.: , Fax: Die Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) des DKFZ ist eine Zentrale Einrichtung des Zentrums und wurde im Berichtszeitraum mit ihrem Forschungsprogramm dem Forschungsschwerpunkt C: Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention zugeordnet. Die Aufgaben der ZEB liegen in der Beratung und der Forschung auf dem Gebiet biostatistischer Methoden und ihrer Anwendung in der Krebsforschung mit dem Ziel, durch Einsatz und Weiterentwicklung biometrischer und statistisch Verfahren in der experimentellen und klinischen Krebsforschung einen Beitrag zur Verhütung, Entdeckung und Behandlung von Krebskrankheiten zu leisten. Als Bindeglied zwischen den methodischen Fächern auf der einen und in der Krebsforschung arbeitenden biomedizinischen Fächern auf der anderen Seite ist die Biostatistik mit computergestützter Beratung, projektbegleitender Mitarbeit und statistischer Methodenforschung befasst. Schwerpunkte der Forschungs- und Entwicklungsarbeiten liegen auf den Gebieten der Entwicklung effizienter und unverzerrter Verfahren für die Analyse von Genom- und Proteomdaten, der statisti- schen Modellbildung, Beschreibung und Erklärung von Mechanismen der Krebsentstehung, der Methoden der quantitativen Risikobeurteilung, Entwicklung moderner Methoden der rechnergestützten Datenanalyse und - präsentation und der Optimierung der biometrischen Versuchsplanung in der experimentellen und klinischen Onkologie, siehe Tabelle 1. Tabelle 1: Forschungs- und Entwicklungsprogramm der Zentralen Einheit Biostatistik FORSCHUNG 1. Biostatistische Auswertung von Genom- und Proteom-Daten Statistische Methoden in der Genetik: Planung und Auswertung Molekulargenetischer Experimente Transcriptomics und Proteomics Pharmacogenomics Bestimmung Prognostischer Faktoren auf Markerbasis 2. Angewandte Karzinogenesemodelle Modellbildung für die Krebsentstehung - Entwicklung von Karzinogenesemodellen - Modellanpassung und experimentelle Daten - Entwicklung von Versuchsplänen Pharmakokinetische and pharmakodynamische Modelle Quantitative Methoden der Risikobewertung Screening Modelle 3. Biometrie in der Klinischen Onkologie Biometrie der Planung und Auswertung klinischer Studien - Biometrisches Zentrum für Phase I/II/III Studien - onkologische Therapieoptimierungsstudien Projekt kolorektale Tumoren Projekt Lymphome/Myelome Projekt Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom Statistische Verfahren zur Bestimmung prognostischer Faktoren Überlebenszeitanalysen Verbesserte Auswertung von Toxizität und Lebensqualität SERVICE Fortbildungsprogramm in Biometrie, Versuchsplanung und Datenanalyse Biometrische Versuchsplanung für Tierexperimente Biometrische Auswertung Datenmanagement und Qualitätssicherung Vergleich und Bewertung statistischer Software

205 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 1. Biostatistische Auswertung von Genom- und Proteom-Daten (C060-01) A. Benner, C. Ittrich, A. Kopp-Schneider, W. Rittgen, L. Edler In Zusammenarbeit mit: P. Lichter, S. Joos, A. Poustka, S. M. Klauck, W. Huber, F. Lyko, M. Deichmann, U. Hamann, P. Schmezer, O. Popanda, S. Suhai, H.-W. Thielmann, H. Bartsch, A. Risch, H. Dally, W. Schmid, M. Kenzelmann, DKFZ. G. Sawitzki, Univ. Heidelberg; B. Lausen, T. Hothorn, Univ. Erlangen; M.Vingron, MPI, Berlin; M. Schwarz, Univ. Tübingen; U. Gundert- Remy, H.-B. Richter-Reichhelm, A. Oberemm, Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin; P.J. Kramer, M. Kröger, Merck KGaA, Darmstadt; H.-J. Ahr, G.Scholz, H. Ellinger-Ziegelbauer, Bayer Health Care AG; H. Döhner, Univ. Ulm; B. S. Kim, Yonsei University, Seoul, Korea. Genom- und Proteom-Daten unterscheiden sich von traditionellen Daten der experimentellen Krebsforschung in entscheidenden Punkten. Einer davon betrifft das Verhältnis zwischen dem Aufwand an Experimentierzeit und dem Umfang der erhaltenen Datenmenge. Während man für herkömmliche biomedizinische Daten eine relativ lange Zeit zur Produktion weniger aussagekräftiger Daten benötigte, erlauben die neuen Verfahren der Microarraytechnik und der 2D-Gelelektrophorese die Erzeugung riesiger Datenmengen in der Größenordnung von Einträgen in sehr kurzer Zeit, wenn die Systeme einmal etabliert sind. Diese grundsätzliche Veränderung in der Beziehung zwischen biomedizinischem Experiment und der Produktion quantitativer Daten rückt die Bedeutung der Versuchsplanung weiter in den Vordergrund und stellt neue Herausforderungen an die biostatistische Forschung. Demzufolge befasst sich die Einheit jetzt intensivst mit der Entwicklung statistischer Methoden zur Identifikation differentiell exprimierter Gene unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Tumor- und Normalgewebe), mit der Bestimmung einer minimalen Kombination von Genen, die zwischen solchen Bedingungen diskriminiert, mit der Identifikation von Gen-Clustern, deren Expressionsniveaus korreliert sind, und mit neuen Cluster-Verfahren, die erlauben, neue Subgruppen C060 Biostatistik auf der Grundlage der Genexpression zu finden. Insbesondere wurden Methoden zur Fallzahlschätzung für Genexpressions- und Proteomanalysen entwickelt und ROC-Modelle als Verfahren zur Adjustierung bezüglich möglicher Confounder etabliert. Tabelle 2 gibt einen Überblick zur Zusammenarbeit mit experimentellen Gruppen und der Anwendung statistischer Verfahren im Berichtszeitraum. Beispielhaft werden fünf Teilprojekte herausgehoben, die aufzeigen, wie die biometrische Methodik nutzbringend für die Lösung von Klassifikations- und Vorhersageproblemen der molekularen Medizin angewendet werden kann, wenn hochdimensionale Daten vorliegen. Genomweites Screening für die Untersuchung genomischer Veränderungen (Deletion, Trisomie etc.). Ig-VH-Mutation und genomische Imbalancen wurden in einer Kohorte von 300 Patienten bestimmt auf das Vorliegen prognostischer genomischer Faktoren. Überlebensbäume und Ensemble Methoden angewandt auf dieselben erlaubten die Bestimmung derartiger Faktoren [69,75]. Identifizierung und Prävalidierung von hepatozellulären Biomarkern zur Erfassung und Prädiktion toxischer und kanzerogener Wirkungen von chemischen Stoffen. Ein herkömmlicher Bioassay der chemisch induzierten Hepatokanzerogenese in der Ratte wurde verwendet, um durch den vergleichenden Einsatz ausgewählter Methoden der molekularen Toxikologie die Möglichkeit der Identifizierung von frühen Biomarkern zu demonstrieren, die eine Prädiktion klassischer toxikologischer Endpunkte einschließlich der Kanzerogenität erlauben. Die Etablierung in einem Kurzzeit- Kanzerogenitätstests würde einen Beitrag zur Reduzierung von belastenden Langzeit-Kanzerogenitätsstudien an Labornagern leisten. Die Erfassung der transkriptionellen Veränderungen erfolgte mit Affymetrix-Chips, Veränderungen in der Proteinexpression wurden mit 2D Gelelektrophorese und SELDI-TOF Analysen aufgezeigt. Wir erarbeiteten die methodische Grundlagen und Algorithmen zur Qualitätskontrolle und biometrischen Auswertung der bei den Projektpartnern Bayer AG, BfR und Merck KGaA erhobenen Genexpressions- und Proteinintensitätsdaten. Schwerpunktmäßig 205 Tabelle 2: Statistische Methoden für Molekulargenetische Studien Thema Statistisches Verfahren Zitat Dodecamer Verdopplung des HOPA A-Gens und Fall-Kontroll Studie, [1] Autismus, mentaler Retardierung und Schizophrenie; Allelhäufigkeitsanalyse [2] MPO-463 G3A Polymorphism als Risiko/Schutzfaktor Fall-Kontroll Studie, [14] beim Bronchialkarzinom multiple logistische Regression Prognostische Marker beim resezierbaren Bronchialkarzinom multivariate Regression [72] zur Stratfikation in Studien zur Wirkung von Lektinen für Überlebenszeiten PTEN/MMAC1-Expression beim Melanom Häufigkeitsanalyse [15] CYP3A4*1B Allel als Risikofaktor für NSCLC logistische Regression [13] Microarrays für die Prävalenz einer Onkogenamplifikation statistische Genomanalysen [37] bei Kopf-Hals Tumoren BRCA2 Keimbahnmutationen in erblichen gynäkologischen Tumoren Korrelationsanalyse [45] Korrelation genomischer Veränderungen mit klinischen Ergebnissen beim Korrelationsanalyse [55] Mantelzell-Lymphom: VH-Mutationsstatus und VDJ Strukturveränderung Überlebenszeit-Analyse [56] Genexpression im Ependymom in Beziehung zu klinischen Faktoren Statistische Genexpressionsanalyse [67,86] Expression von Zellzyklus- und Apoptosegenen Statistische Genexpressionsanalyse [68] Genomische Targets der Knochenmarksrepopulation Häufigkeitsanalyse [74] Prognostische Marker beim Medulloblastom Überlebenszeitanalyse [85] Basale Gentranskription in Relation zu Promoteraktivität Brier Score, Genselektion [92] CYP1A1 Genexpressionregulation durch TCDD Statistische Genexpressionsanalyse [96] Kapillarelektrophorese genomischer DNA beschreibende Statistik [98] Identifikation von RCT-Genen für Mikrosatellite Mutationen statistisches Modell, Metaanalyse [103]

206 206 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention wurden lineare und lineare gemischte Modelle eingesetzt [88]. Diese konnten auch auf die Analyse der Proteinintensitäten aus 2DE-Gelen von Leber- und Thymusproben TCDD belasteter Marmoräffchen angewandt werden [87]. Statistische Klassifikation von Proteomdaten. Für das Verständnis der Funktion von Proteinen ist die Kenntnis ihrer 3-dimensionalen Struktur entscheidend. Da für die meisten Proteine diese unbekannt ist, kommt einer Strukturvorhersage auf der Grundlage der Aminosäuresequenz eine besondere Bedeutung zu. Für diese Vorhersage steht ein breitgefächertes Arsenal statistischer Verfahren bereit: logistische Regression, additive Modelle, Projection Pursuit Regression, lineare, quadratische und flexible Diskriminanzanalyse und K-nearest-neighbour (KNN) Klassifikation. In Fortsetzung früherer Arbeiten wurden diese Verfahren mit Methoden des Machine Learning verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Support Vector Machines die bisher benutzten Verfahren an Prädiktionsgenauigkeit übertreffen [22,82]. Molekulare Marker. Für ein groß angelegtes Projekt der Bestimmung des Risikopotentials (Suszeptibilität) und prognostischen Wertigkeit von Polymorphismen der Glutathion-S- Transferase und ihrer Modifikation der Entgiftung von polyzyklischen Aromaten des Zigarettenrauchs der Abt. Toxikologie und Krebsrisikofaktoren werden Daten einer Fall-Kontrollstudie biometrisch ausgewertet, wobei der logistischen Regression in einer multivariaten Analyse besondere Bedeutung zukommt. Die Ergebnisse wurden durch die Berechnung von odds ratios quantifiziert. Polymorphismen der P450 Klasse wurden entsprechend ausgewertet, wobei der Multiplizität der Vergleiche besondere Beachtung geschenkt wurden [13,14]. Comet Assay. Der Comet Assay findet breite Anwendung in der genetischen Toxikologie, im Monitoring der Umwelt, in der molekularen Epidemiologie und in der klinischen Forschung. Allerdings gibt es immer noch sehr unterschiedliche Vorstellungen zu der Frage des optimalen Designs des Assays und der besten Auswerteverfahren. Wir entwickelten eine neue Maßzahl (2D), welche die gesamte Dosis-Zeit Wirkungsfläche eines Comet Assay repräsentiert und somit eine umfassende Quantifizierung der DNA-Reparaturkapazität erlaubt [61,62]. Ein entsprechendes Auswerteprogramm in SAS/AF wurde von unserem Partner in Seoul, Korea, entwickelt und ist im Internet frei verfügbar. Das Verfahren wurde an einem Datensatz von 25 Brustkrebspatienten getestet und wir konnten dort zeigen, dass tail moment und tail DNA hoch korreliert sind, während tail inertia zu einem größeren Anteil davon unabhängige Information trägt. In einer großen klinischen Untersuchung bei Brustkrebspatientinnen wurden weitere Comet Assay Daten zur Vorhersage akuter Toxizität nach Bestrahlung herangezogen [102]. Bei einer Reduktion des Comet Assay- Designs auf 1-Punkt Auswertungen konnte kein deutlicher Zusammenhang gefunden werden. Zusätzliche Finanzierung durch: DFG-KOFEG Projekt 446KOR- 113/139/0-1, Partner: Yonsei University, Seoul; BMF BEO Angewandte Karzinogenesemodelle und Modelbasierte Risikobewertung (C060-02) A. Kopp-Schneider, I. Burkholder, J. Groos, C. Ittrich, T. Pauli, W. Rittgen, L. Edler In Zusammenarbeit mit: P. Bannasch, N. Becker, G. Fürstenberger, S. Heeger, H. Wesch, DKFZ; C. Portier, S. Whitaker, F. Parham, NIEHS, RTP, N.C., USA; G. Luebeck, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA; A. Yakovlev, University of C060 Biostatistik Rochester, NY, USA; L. Hanin, University of Idaho, Pocatello, USA; L. Pavlova, Universität Petersburg, Russische Förderation; A. Muttray, Universität Mainz; M. Schwarz, Institut für Toxikologie, Universität Tübingen; W. Lutz, Universität Würzburg; W. Urfer, Universität Dortmund; H. Heinzl, Universität Wien, Österreich; C.P. Kitsos, TEI Athen, Griechenland. In diesem Teilbereich werden biologisch begründete Karzinogenesemodelle entwickelt, die biologische Hypothesen widerspiegeln. Durch Anwendung der Modelle auf entsprechende Daten können mit statistischen Tests Hypothesen geprüft werden, welche sowohl Mechanismen der Krebsentstehung und Dosis-Wirkungsbeziehungen für karzinogene Substanzen betreffen als auch für gesundheitspolitische Fragen der quantitativen Risikoabschätzung von Bedeutung sind. Ein Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Beschreibung der Entstehung und des Wachstums von präneoplastischen Leberläsionen. Leberherde werden in der experimentellen Leberkarzinogenese beobachtet unabhängig davon, ob die Karzinogenese durch chemische Substanzen, durch radioaktive Strahlung oder viral ausgelöst wird. Das stochastische Color-Shift-Modell der Entstehung von Leberherden und ihrer Phänotypänderungen wurde auf einen Datensatz aus einem Rattenhepatokarzinogeneseversuch angewandt. Mit dem Modell konnte die zeitliche Reihenfolge des Auftretens von drei Phänotypen von Herden gefunden werden. Mit einer Monte-Carlo-Simulationsstudie wurde mit der Methode der Maximalen Likelihood zuverlässig das richtige Modell gefunden. Als alternative Hypothese für die Entstehung und den Phänotypwechsel von präneoplastischen Leberherden wird diskutiert, dass einzelne Zellen durch Mutation in den nächsten Phänotyp übergehen und dann durch klonale Expansion Herde des fortgeschritteneren Phänotyps entstehen (Vierstufenmodell). Es zeigte sich, dass die Anpassung der Größenverteilung der Herde mit diesem Modell unzureichend ist und dass die Parameterschätzer für die Teilungsraten von präneoplastischen Zellen biologisch unrealistische Werte annehmen [65,66]. Dosis-Wirkungsmodellierung. Es wird häufig postuliert, dass Dosis-Wirkungskurven in experimentellen Kanzerogenitätsstudien Schwellenwerte zeigen, insbesondere bei nichtgenotoxischen Substanzen, die in hoher Dosierung die Zellproliferationsrate erhöhen. Basierend auf dem Zweistufenmodell mit klonaler Expansion intermediärer Zellen konnten wir zeigen, dass auch genotoxische Karzinogene einen Dosis- Wirkungsverlauf mit Schwellenwert haben können, wenn die Zellteilungsrate eine j-förmige Dosis-Wirkungsbeziehung für die Zellteilungsrate aufweist. Ausgangspunkt der Analysen war hier die experimentelle Beobachtung einer j-förmigen Dosis-Wirkungsbeziehung für den labeling index im Vormagen der Ratte bei Behandlung mit Kaffeesäure. Mit zum beobachteten labeling index proportionaler Zellteilungsrate für intermediäre Zellen konnten Mutationsraten gefunden werden, derart dass die vom Modell vorhergesagten Tumorinzidenzen innerhalb der beobachteten 95%- Konfidenzintervalle für die Tumorinzidenz lagen. Wenn allerdings historische Kontrolldaten über die spontane Tumorinzidenz im Vormagen der Ratte hinzugenommen wurden und die Konfidenzintervalle dadurch schmaler wurden, musste das Modell modifiziert werden. Hierfür wurde die Mutationsraten als Produkt von DNA-Schädigungsrate und Zellteilungsrate aufgefasst und beide Faktoren dosisabhängig modelliert. Diese Modellmodifikation führte zu biologisch sinnvollen Parameterschätzern für die Anpassung der Daten. Es zeigte sich hiermit der Nutzen des Modells für die Beschreibung hormetischer Effekte [78].

207 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Low dose risk models. Ziel des Gesamtprojekts war die Abschätzung des humanen Krebsrisikos unter Exposition gegenüber niedriger Strahlendosis. Es wurden morphometrische Daten über hepatozelluläre Präneoplasien aus einer von Drs. Wesch und Heeger (E020) durchgeführten tierexperimentellen Studie untersucht. Das Experiment umfasste 4 Gruppen: Kontrolle, Thorotrast sowie niedrige und hohe Dosis eines 213 Bi-markierten Antikörpers. 6, 12 und 17 Monate nach Behandlungsbeginn identifizierten und morphometrierten Dr. T. Härtel und Prof. Dr. P. Bannasch auf Hämatoxilin/Eosin-gefärbten Leberschnitten von je 5 Tieren aus jeder Gruppe Herde veränderter Leberzellen. In den beiden späten Untersuchungszeitpunkten konnten in allen Behandlungsgruppen Leberherde gefunden werden. Fragestellung war, ob das Wachstum von Leberherden von der α-strahlendosis abhängt. Diese Fragestellung lässt sich aufgrund der stereologischen Probleme bei der Auswertung von Schnitten durch das dreidimensionale Organ der Leber nicht direkt statistisch beantworten, sondern erfordert eine modellbasierte Auswertung [10]. Daher wurde ein Einstufenmodell für die Modellierung der Entstehung und des Wachstums der Leberherde eingesetzt. Dieses Modell postuliert, dass Leberherde gemäß einem räumlich homogenen Poisson-Prozess erzeugt werden und als linearer Geburtsund Todesprozess wachsen, wobei das Herdwachstum nicht nur Folge der Zellteilung der Herdzellen sein kann, sondern auch auf die Rekrutierung von Nachbarzellen zurückzuführen sein kann. Es wurden verschiedene Dosis-Wirkungs-Zusammenhänge für die Abhängigkeit der Modellparameter von der α-strahlendosis mit Maximum-Likelihood-Methoden an die Daten angepasst. Ausgewählte Modelle können als hierarchisch geschachtelte statistische Modelle verstanden werden. Daher kann die Anpassungsgüte der Modelle mit Likelihood-Ratio-Test verglichen werden. Die Untersuchungen zeigten, dass sowohl der für die Herdentstehung verantwortliche Modellparameter wie auch der Wachstumsparameter der Herde eine hochsignifikante Abhängigkeit von der Strahlendosis zeigte. Es konnte daher die ursprüngliche Frage - ob die Strahlendosis einen Einfluss auf das Herdwachstum zeigt - eindeutig positiv beantwortet werden [42]. Leberherde zur Prädiktion der Karzinomentstehung. Der chronische Kanzerogenitätstest an Ratten und Mäusen ist hinsichtlich Kosten und Zeitbedarf das aufwendigste Prüfverfahren in der Toxikologie. Die Relevanz und Zuverlässigkeit eines Protokolls für die Durchführung eines Rat Liver Foci Bioassay (RLFB) als Kurzzeittestsystem in vivo zur Bewertung des kanzerogenen Potentials von Chemikalien wurde in einer vom BMBF geförderten zweijährigen Prävalidierungsstudie mit vier Modellhepatokarzinogenen (N-Nitrosomorpholin, 2-Acetylaminofluoren, Phenobarbital, Clofibrat) untersucht. An dieser Ringstudie waren 5 Laboratorien beteiligt. Der RLFB beruht auf dem Nachweis und der morphometrischen Quantifizierung von Herden präneoplastischer Hepatozyten (foci of altered hepatocytes, FAH) in der Rattenleber, die auf Grund veränderter Enzymfunktionen und Strukturmerkmale histochemisch und morphologisch identifiziert werden können. Die intra- und interlaboratorielle Variabilität wurde mit klassischen varianzanalytischen Methoden und simultanen Konfidenzintervallen für die many-to-one-by center- interaction contrasts bewertet. Die Beurteilung des kanzerogenen Potentials der vier Chemikalien durch die verschiedenen Laboratorien war ähnlich und die Dosis-Wirkungs-Kurven unterschieden sich nur marginal [54]. Die Ergebnisse wurden verwendet, um ein C060 Biostatistik Abb. 1: Dosis-Wirkungskurven des Flächenanteils GSTP-positiver Herde präneoplastischer Hepatozyten (FAH) nach 2-Acetylaminofluoren-Exposition in weiblichen Ratten, die mittels N-Nitrosodiethtylamin initiiert wurden, getrennt nach fünf Labors. biostatistisch basiertes Prädiktionsmodell für das kanzerogene Potential von Testchemikalien zu entwickeln. Hautmodell. Die wesentlichen Funktionen der menschlichen Haut wurden als ein stochastisch-mathematisches Modell in kontinuierlicher Zeit und mit diskreten Zuständen beschrieben und in einer dazugehörigen Computer-Simulation numerisch analysiert. Das dynamische Verhalten des Hautgewebes ist bestimmt durch die Regulation der Zellwanderung durch definierte Kolumnen aufgeteilt in verschiedene Hautschichten, wobei wiederum die Dicke jeder Schicht durch Kontrollmechanismen gesteuert wird. Die Einführung einer Zelltypmodifikation kann zur Entstehung und Entwicklung von spezifischen Subpopulation (Tumoren) innerhalb des Modells führen. Die Regulationsmechanismen wurden systematisch dahingehend untersucht und variiert, um Mechanismusbedingungen zu finden, die Grundlage von Karzinogeseprozessen sein können. Als besonderes Ergebnis ist hervorzuheben, dass alleine die Migrationsrate in der Basalschicht darüber entscheidet, ob sich ein superfiziell spreitendes oder noduläres Melanom entwickelt. (Timm Pauli, Diplomarbeit, Universität Heidelberg 2002 [90]). Krebsvorsorgemaßnahmen. In dem vom NATO Science Programme unterstützten Collaborative Linkage Grant wurden mechanistische Modelle des Prozesses der Entdeckung eines Tumors untersucht, wenn dieser im zeitlichen Verlauf ausgemessen werden kann und diese Beobachtungen zur Tumorlatenzzeit in Beziehung gesetzt werden. Mittels quantitativer Response Variabler konnte so die Entdeckungswahrscheinlichkeit zur Tumorgröße in Bezug gesetzt werden. Hinreichende Bedingungen der Parameteridentifizierbarkeit der Verteilung der Zeit bis zum Tumor wurden aufgestellt und die gemeinsame Verteilung der Tumorgröße und des Alters bei Entdeckung konnte unter relativ einfachen Annahmen an die Wachstumskinetik charakterisiert werden. Mittels eines numerischen Verfahrens erhält man Maximum Likelihood Schätzer der Parameter dieser gemeinsamen Verteilung bei deterministischem exponentiellen Wachstum. Das Projekt lieferte wertvolle Informationen für die Erstellung eines optimalen Screening Programms und dessen Validierung in Simulationsstudien [27]. Dioxin Risikobeurteilung. Die Erstellung einer Kausalbeziehung zwischen der Exposition xenobiotischer Substanzen 207

208 208 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention und dem Auftreten von Krankheiten stellt eine extrem wichtige Aufgabe im Streben nach verbesserten Bedingungen für die Gesundheit und für die Verhütung von Krankheiten dar. In Fortsetzung früherer Arbeiten untersuchten wir das Auftreten von neurotoxischen Wirkungen nach Exposition gegenüber Dioxinen und Furanen in Bezug zu Störungen des autonomen Nervensystems beim Menschen. Im Vordergrund standen die Untersuchung von Dosis-Wirkungsbeziehungen zwischen TCDD bestimmt als Expositionslast im Körper und sich daraus ergebende Unsicherheiten für die Risikobeurteilung dieser Substanzklasse [29,47,48]. In einer deutschen beruflich exponierten Kohorte konnte nach Adjustierung für Alter, Übergewicht, Rauchen und Alkoholkonsum gezeigt werden, dass neben einigen Symptomen unklarer Korrelation vor allem die Fähigkeit des Farbsehens mit der Expositionshöhe (negativ) korreliert war [28]. Nahrungsmittelsicherheit in Europa. In einem von der EU geförderten und von ILSI (International Life Science Institute) Europe koordiniertem Projekt wurden federführend innerhalb eines international besetzten Expertengremiums quantitative Methoden für die Risikobeurteilung von Chemikalien in Nahrungsmitteln entwickelt und für die Regulation auf europäischer Ebene zusammengestellt [34]. Nach der Erstellung einer Übersicht über die Verfahren der mathematischen Modellbildung und der quantitativen Auswerteverfahren wurden diese zusammen mit den anderen Komponenten dieser EU Concerted Action im 5. Rahmenprogramm in ein umfassendes Dokument der Risikocharakterisierung integriert, welche als Grundlage des Risikomanagements und der Risikobeurteilung auf dem Nahrungsmittelsektor der EU dienen kann [91]. Zusätzliche Finanzierung durch: BEO 031/11834; FIGH-CT ; Theme Group in FOSIE, Concerted Action in 5 th Framework, EU, QLK ; NATO CLG Collaborative Linkage Grant No , F823; CCMS-NATO Project Pilot Study Biometrie in der Klinischen Onkologie (C060-03) L. Pilz, A. Benner, A. Kopp-Schneider, L. Edler In Zusammenarbeit mit: R. Breitkreuz, W. Hildebrandt, P. Lichter, F. Lyko, D. Schadendorf, W. Dröge, DKFZ; Ch. Manegold, Thoraxklinik, Heidelberg; CESAR - Central European Society for Anticancer Drug Research; C. Dittrich, Boltzmann Institut für angewandte Krebsforschung, Wien, Österreich; M. Scheulen, Universität Essen; H. H. Fiebig, Universität Freiburg; W. Queißer, Onkologisches Zentrum, Klinikum Mannheim; G. Hartung, Universität Rostock; H. Goldschmidt, M. Görner, E. Leo, A. Krämer, S. Frühauf, T. Möhler, K. Neben, Universität Heidelberg; F. Cremer, M. Bakkus, Universität Brüssel, Belgien; H. Döhner, S. Stilgenbauer, R. Schlenk, A. Körber, D. Dienle, E. Leupold, P. Liebisch, C060 Biostatistik Universität Ulm; E. Laack, D. Hossfeld, UKE Hamburg; N. Victor, U. Abel, IMBI, Universität Heidelberg; A. Koch, BfArM, Berlin; E. Graf, W. Sauerbrei, M. Schumacher, Inst. f. Medizinische Biometrie, Universität Freiburg; C. Quintero, Departamento de Matematicas y Estadistica, Universidad Nacional Santa Fe de Bogota, Kolumbien. Abkürzungen: MM = multiples Myelom, NHL = non-hodgkin Lymphom; FL = folliculares Lymphom, CLL = chronische lymphatische Leukämie; ALL = akute lymphatische Leukämie; RKS = randomisierte klinische Studie, RS = retrospektive Beobachtungsstudie Die Betreuung klinischer Studien, soweit sie am DKFZ in Kooperation mit klinischen Einrichtungen durchgeführt wird, ist diesem Teilbereich ebenso zugeordnet wie unsere Kooperationen mit klinischen Forschergruppen und nationalen Studiengruppen. Die Einheit erfüllt für aktuelle onkologische Therapiestudien die Funktion eines Biometrischen Zentrums für die Planung, Durchführung und Auswertung klinischer Studien der Phase I-III bei klinischen Kooperationen des DKFZ. Unsere Arbeiten beinhalten die Beratung bei der Erstellung von Studienprotokollen für klinische Studien gemäß GCP (Good Clinical Practice), Randomisation und Statistisches Patientenmonitoring, Zwischenauswertungen, Dokumentation, Dateneingabe und deren Kontrolle und die biometrische Auswertung. Als biometrisches Zentrum für klinische Studien am DKFZ trug die Einheit zur erfolgreichen Planung und Auswertung von klinischen Projekten und klinischen Studien des DKFZ und seiner Partner bei (vgl. Tabelle 3). Biostatistische Methodik für die Planung, Durchführung und Auswertung von klinischen Studien und die biostatistische Bewertung von Therapieergebnissen wurden in einflussreichen Publikationen der klinischen Onkologie dargestellt [20,21,31-33]. Einen besonderen Schwerpunkt bildete im Berichtszeitraum die Methodik der klinischen Phase III Studien. Für die Entwicklung biometrischer Methodik für Studien der Phase I, II und III wurde die Mitarbeit in der Central European Society for Anticancer Drug Research (CESAR) [17] fortgesetzt. Ein wesentlicher Teil der Arbeit lag in der Erstellung von Standardarbeitsanweisungen zur Durchführung klinischer Studien. Eine umfangreiche Broschüre wurde erstellt [41]. Dazu wurde auch ein spezieller Satz klinischer Dokumentationsbögen in der Einheit entworfen, dem Werk beigefügt und elektronisch der Studiengruppe zur Verfügung gestellt. Kausalität in klinischen Studien. Publikation und wiederholtes Zitieren einer retrospektiven klinischen Studie zur Wirksamkeit der Misteltherapie bei Krebspatienten waren Anlass einer Prüfung auf methodische Gültigkeit von Design und Auswertung. Geringe externe Validität, Mängel der biome- Tabelle 3: Onkologische klinische Studien unter Teilnahme der ZE Biostatistik als Biometrisches Zentrum Klinisches Thema Fragestellung und Hypothesen Planung und Auswertung Zitat A: Hämatologische Tumoren (insbesondere MM, AML, B-CLL) Stammzellen im peripheren Blut Vergleich zweier Induktionstherapien: vergleichende Statistik, Tests [4,6] bei initialer Chemotherapie (i) VAD vs VID, (ii) TAD versus VAD [5,43] HOVON-50/GMMG-HD3 DVT Thalidomid als Teil einer adverse event Auswertung [3] Hochdosistherapie Prognostische Wertigkeit der Bestimmung eines Schwellenwerts multivariate Überlebenszeitanalyse [12] Resttumormasse im Knochenmark der Hochdosistherapie maximal selektierter Logrank Test nach Transplantation GVHD nach Stammzelltransplantation CD3+ Zellen zugefügt zu CD34 Überlebenszeitanalyse [44,83] angereicherten Allografts Nicht-myeloablative Transplantation Vergleich verwandter und Überlebenszeitanalyse [52,53] Allogene Stammzelltransplantation nicht-verwandter Spender

209 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention C060 Biostatistik Fortsetzung Tabelle 3 Klinisches Thema Fragestellung und Hypothesen Planung und Auswertung Zitat (Trisomie-)Chromosomen 1q, 9q, 11q Verteilungsunterschiede in der Häufigkeitsanalyse [76,77] 13q, t14q Aberrationshäufigkeit Clusteranalyse Prognose bei früher AML, Therapie- Aktivierung von FLT3 Mutationen, Überlebenszeitanalyse [39,40] resistenz bei jungen Patienten Aktivierung von CEBPA Mutationen [18,38,101] Prognose bei B-CLL klonale Evolution und klonale Response- und [75] FISH-Analyse Fluktuation, IgVH Homology Überlebenszeitanalyse B-CLL Bendamustin induzierte Apoptose vergleichende Statistik [97] Molekulargenetic der CLL risikoadaptierte Therapie Inzidenzanalyse [99] Prognose bei CLL autologe Stammzelltransplantation risikogematchte Auswertung [19] VH Genmutation multivariate Überlebenszeiten AML HD93 risikoadaptierte Behandlung nach Überlebenszeitanalyse [93] Remission AML in älteren Patienten Wirksamkeit von all-trans Retinoidsäure Überlebenszeitanalyse [94] B: Bronchialkarzinom Verlängerung der Überlebenszeit Machbarkeit dosisintensivierter ICE vergleichende Phase II Auswertung [7] beim SCLC Sequentielle Reinfusion Überlebenszeiten [8,9] hämatopoetischer Vorläuferzellen Präoperative Induktionstherapie Wirkung auf Resezierbarkeit Überlebenszeitanalyse [84] beim NSCLC stage IIIA-B Response und Überleben Behandlung des NSCLC Kombinationschemotherapie Phase II, Überlebenszeiten [71] Inoperables NSCLC Gemcitabin in Kombination Phase II Gesamtauswertung [89] mit Vindesin Prognose des Adenokarzinoms Lektinhistochemie, HPA Lektine Prognosestudie [73] C: Kolorektale Tumoren Adjuvante Chemotherapie beim Vergleich der Wirksamkeit von 5-FU/LEV Randomisierte Phase III Studie [16] Stadium III Kolon Karzinom mit vs 5-FU/FA 6 bzw. 12 Monate GCP Auswertung Second-line Therapie des Wirksamkeit und Toxizität von Phase II-Studie [49] Kolorektalen Karzinoms Irinotecan und Hochdosis 5-FU Rektumkarzinom Capecitabin vs 5-FU RKS, Studienplanung [50] adjuvante Radiochemotherapie Staging des Oesophagus und Vergleich von Endoskopie, Kategoriale Datenanalyse [57] Magenkarzinoms Endosonographie und CT Neo-adjuvante Behandlung molekulare Surrogatmarker logistische Regression [58] Kolorektomie und ileonaler Pouch Wirksamkeit der Ileostomy exakte logistische Regression [59] Analsphinkterinsuffizienz Elektrostimulation vergleichende Statistik [60] Kurative Laparaskopie der Leber bzw. Helium/Pneumoperitoneum, vergleichende Statistik [70,95] Kolon im Tierversuch Laparaskopie D: Melanom Gesundheitsökonomie des Kosten-Nutzen Analyse bildge- Häufigkeitsanalysen [51] Stagings beim Melanom bender Verfahren in der Routine Orale DNA Vakzine gegen Salmonella/pCMV-hpg100 im Datenanalyse [11] GP 100 Antigen Maus Model E: Cervix-, Ovarial- und Uterus-Karzinom Intraepitheliale Neoplasie (CIN) p16 Expression Kappastatistik [64] Polymorphismen als Risikofaktor Assoziation HPV16E6 Variant mit exakte Tests [104] Leukozyten Antigen Klasse I Prädiktion des klinischen Verlaufs L1 expression Cox Regression [36] Überlebenszeitanalyse F: Tumoren allgemein antioxidative Behandlung zur NAC bei Tumorkachexie RKS [46] Verbesserung der Muskelfunktion REDST bei Hyperlipidämie Cholesterol in Beziehung zu Plasmathiol Korrelationsanalysen [63] Vaskuläre Dichte im Differentialdiagnose vergleichende Statistik [100] atypischen Keratoacanthom Abkürzungen: VAD Vincristin, Doxorubicin, Dexamethasan VID Vincristin, Ifosfamid, Dexamethasan TAD Thalidomid, Doxorubicin, Dexamethasan ICE Ifosfamid, Carboplatin, Etoposid GVC Gemcitabin, Vinorelbin, Cisplatin DVT deep vein thrombosis GVHD graft versus host disease 5-FU/LEV 5-fluorouracil, Levamisol 5-FU/FA 5-fluorouracil, Leucovorin REDST Thiol/Disulfid Redoxstatus NAC N-acetylcystein 209

210 210 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention trischen Auswertung, Informationsmängel und Möglichkeiten der Verfälschung der Studienergebnisse infolge der nur teilweise prospektiven matched pairs -Bildung und die Möglichkeit einer deutlichen Auswahlverzerrung ließen diese Studienergebnisse als sehr fragwürdig erscheinen [23,26]. Vor dem Hintergrund von negativen randomisierten Studien zur Wirksamkeit der Misteltherapie sind die bisher in qualitativ geringer einzustufenden retrospektiven Studien erhaltenen positiven Ergebnisse nicht ausreichend für den Nachweis der Wirksamkeit. In einer weiteren Arbeit beschäftigten wir uns mit der Frage, inwieweit mit neueren Studien die Wirksamkeit der Misteltherapie durch die sog. epidemiologische Kohortenstudie als Spezialfall einer retrospektiven klinischen Studie über eine ausreichende Methodik für den Wirksamkeitsnachweis verfügt. Diese Studienform wurde in ihren Grundzügen beschrieben und es wurden ihre grundsätzlichen Schwächen im Nachweis kausaler Beziehungen offen gelegt. Es wurde festgestellt, dass auf der Grundlage der vorliegenden Studiendaten und einer kritischen Beurteilung der biometrischen Methodik auch die neuen Studien eine Wirksamkeit der Misteltherapie nicht objektiv belegen, die Methodik der epidemiologischen Kohortenstudie die grundsätzlichen Schwachstellen retrospektiver Studien nicht überwindet und in einzelnen Studien Selektionsund Informationsverzerrungen zugunsten der Mistelbehandlung und zuungunsten der Kontrollgruppe nicht ausgeschlossen werden können [25]. Die Einheit war in zunehmendem Umfang in tumorspezifische Projekte zur Therapieoptimierung eingebunden, die einen weiten Bereich von Tumorerkrankungen umfasst; u. a. hämatologische Tumoren, kolorektale Tumoren, das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom. Hämatologische Tumoren. Das Lymphom/Myelom Projekt. Bei der Suche nach neuen Behandlungsstrategien für Patienten mit hämatologischen Tumoren wurden im Rahmen verschiedener Kooperationen geeignete biometrische Studienpläne erstellt und sowohl in Zwischen- wie auch in Endauswertungen die Ergebnisse dieser Vorhaben zusammen mit dem klinischen Kooperationspartner erarbeitet. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Bestimmung prognostischer Faktoren gelegt und es wurden Meta- Analysen durchgeführt, um so diese Behandlungsstrategien weiter zu verbessern. MM-Studien RKS Sequentielle Hochdosistherapie (GMMG-HD2), N=384 RKS Thalidomid (GMMG-HD3), N=450(offen) KS Dosiseffekt des Thalidomid, N=83 KS Fremdspender bei allogener Transplantation, N=51 KS gpcr im Tumor, N=68 NHL-Studien RKS Phase II Studie zur Primärtherapie mit Rituximab, N=105(offen) Meta-Analyse zur Wirksamkeit von Fludarabin (22 Studien) RKS Rituximab beim diffusen klein-zelligen B-cell NHL, N=174(offen) CLL-Studien KS Hochdosistherapie, N=88 KS Prognostischer Wert einer Stratifikation nach Vorliegen somatischer Mutationen in variablen Regionen des B-lymphozyten Antikörperrezeptors, N=300 KS Genexpression, N=101 AML-Studien FLT3 Mutationen, N=224 HD93 Risikoadaptierte Therapie, N=223 C060 Biostatistik Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom. Der Abschlussbericht zu einer randomisierten crossover Phase II Studie mit den Einzelsubstanzen Gemcitabine (G) und Docetaxel (D) und einer Phase III Studie zum Vergleich einer Zweierkombination (Gemcitabine, Vinorelbine) gegen eine Dreierkombination (Gemcitabine, Vinorelbine, Cisplatin) für Patienten mit fortgeschrittenen, nicht-klein-zelligen Bronchialkarzinomen (NSCLC), deren Krankheit sich im Stadium IIIb (Pleuraerguss) oder Stadium IV (metastasiert) befand, wurde vorgelegt. Primäre Endpunkte waren ein günstigeres Toxizitätsprofil bzw. Gesamtüberleben. In dem Crossover -Projekt wurden G und D in der Dosierung Arm A [q3w; G: Tag 1, 8; 1250 mg/m²] und Arm B [q3w; D: Tag 1; 100 mg/m²] zunächst bis zu 6 Zyklen verabreicht und im Falle der Progression wurde der Behandlungsplan des jeweils anderen Arm angewandt. Von 330 aufgenommenen Patienten waren 321 auswertbar und zeigten keinen statistisch signifikanten Unterschied im Gesamtüberleben (in Monaten): A/B 6.3/8.6 (p=0.21). Die 1-Jahres-Gesamtüberlebensrate war A/B 28%/31%. Bei der Beurteilung der Lebensqualität unter Benutzung des Fragebogens EORTC-QLQ-C30 mit LC13 konnte nur ein statistisch signifikanter Unterschied im Teil LC13 mit Vorteil für die Patienten aus Arm A gesehen werden; sie fühlten sich zu Beginn der Behandlung genauso gut, wie nach Ende des zweiten Zyklus (Wilcoxon Rangsummentest, p-wert < 0,0001). In der first-line Therapie zeigte Arm B ein signifikant besseres Therapieansprechen als Arm A (p=0.01). Beide sequentiellen Therapiearme können als praktikabel, effektiv und gut verträglich eingestuft werden [79-81]. In einer neuen offenen, randomisierten, multi-zentrischen vierstufigen Phase II-Studie, die schlussendlich in eine Phase III-Studie münden soll, wird die relevante hämatologische Toxizität und das Gesamtüberleben in Patienten untersucht, die bei gleicher Indikation wie oben G und D in zwei Therapiearmen (A und B) entweder in Kombination oder sequentiell erhalten (G/D mit Dosen von 1000 mg/m² /75 mg/m²/q3w; Arm A (G Tage 1,8 + D Tag 8 für 6 Zyklen) und Arm B (G: Tage 1,8 für 3 Zyklen gefolgt von D: Tag 1 für 3 Zyklen). In der ersten Phase II-Stufe konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede gesehen werden; die Studie wird somit in der zweiten Stufe fortgeführt. Kolorektale Tumoren. In einer randomisierten klinischen Studie wurde geprüft, ob sich eine 12monatige Behandlung mit 5-FU/Leucovorin (LV) von einer nur 6-monatigen Behandlung beim lokal fortgeschrittenen bzw. nodal positiven Rektum Karzinom des Stadiums II-III unterscheidet. Für N=263 auswertbare Patienten zeigten die 3-Jahresüberlebensraten und die 3-Jahresrückfallraten eine sehr hohe Übereinstimmung (ein Test auf Äquivalenz war statistisch signifikant p=0.03). Ein ähnliches Ergebnis wurde beim Vergleich von 3 Therapien (5FU/LEV wöchentlich 12 Monate/ 5FU/FA, Tag 1-5, alle 4 Wochen, 12 Monate oder 6 Monate) erhalten. Nach einem medianen follow-up von 36.2 Monaten sah man keinen signifikanten Unterschied im krankheitsfreien Überleben und im Gesamtüberleben [16]. Eine weitere prospektive randomisierte Studie zur adjuvanten Behandlung des Kolonkarzinoms 17A-1 Stadium II mit dem Antikörper 17A-1 wurde ausgewertet. Zusätzliche Finanzierung durch: Kolon-Rektum-Studiengruppe, Onkologisches Zentrum, Prof. Queisser, Klinikum Mannheim; GemTax Studiengruppe, Prof. Manegold, Thorax-Klinik Heidelberg; Studiengruppe, Prof. Ho, Dr. Goldschmidt, Poliklinik Heidelberg; Studiengruppe, Prof. Hossfeld. Dr. Laack, UKE Hamburg; Studiengruppe, Dr. Oehm, Treuenbrietzen.

211 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention SERVICE: Biometrische Beratung und Versuchsplanung (C060-04) W. Rittgen, A. Benner, C. Ittrich, A. Kopp-Schneider, L. Edler In Zusammenarbeit mit: Tierschutzbeauftragte des DKFZ; AG Statistische Methodik in der klinischen Forschung, AG Statistische Auswertungssysteme, GMDS / AG Computational Statistics, Deutsche Region der Intern. Biometrischen Gesellschaft; C. Ortseifen, URZ Universität Heidelberg; L. Hothorn, LG Bioinformatik, Universität Hannover; N. Victor, Institut für Med. Biometrie und Informatik, Universität Heidelberg; Akademie für Weiterbildung, Universität Heidelberg. Die Einheit bietet im Rahmen ihres Serviceprogramms Dienstleistungen zur Unterstützung der experimentellen Abteilungen des DKFZ bei Planung, Durchführung und Auswertung von Experimenten. Dies umfasst die Beratung bei Versuchsanträgen unter Berücksichtigung formaler Kriterien der Versuchsplanung und eines optimalen Informationsgewinns und die Übernahme der biometrischen Planung bei Tierversuchen einschließlich der Ausarbeitung einer schriftlichen Anlage zur biometrischen Begründung der Tierzahlen und des Versuchsplans. So wurden in biometrische Versuchspläne und in biometrische Versuchspläne ausgearbeitet. Die angebotenen Dienstleistungen schließen die Beratung von zahlreichen DKFZ-Doktoranden/Innen ein. Das Labor für Computational Statistik und Datenanalyse hat die Funktion, die erforderliche Infrastruktur sowie Hardund Software bereitzustellen. Darin werden auch die Informationen für Beratungsaufgaben gesammelt und Forscher des DKFZ zur selbständigen Auswertung ihrer Versuchsergebnisse angeleitet. Die Themenschwerpunkte waren Softwareevaluierung, Datenbank-Management und Ausbildung. Software-Entwicklung und -Evaluierung: Das Statistiksystem ADAM wurde auf der Grundlage von Benutzeranforderungen in seinem Funktionsumfang erweitert und der Bedienungskomfort der Dateneingabe und der grafischen Darstellungen weiter verbessert. Darüber hinaus wurden für den Benutzer nicht direkt sichtbar Verbesserungen beim Rechenaufwand vorgenommen. Die so erhöhte Benutzerfreundlichkeit hat wesentlich zu einer breiteren Nutzung im DKFZ geführt. Datenbank-Management: Für die vermehrt durch die ZE Biostatistik betreuten klinischen Studien ist eine adäquate Datenhaltung unerlässlich. Ein Bereich des statistischen Labors beschäftigte sich daher mit der Qualitätssicherung statistischer Daten bei Dateneingabe und Datenbankverwaltung. Die Programmierumgebung von ACCES und EXCEL wurde verwendet, um schnell und effizient problemgerechte Prozeduren zu entwickeln. Damit liegt eine wichtige kostengünstige Alternative zum Statistischen Programmpaket SAS, das aus finanziellen Gründen nur in einzelnen Modulen zentral am DKFZ verfügbar ist, vor. Ausbildung: Kurse zu Grundlagen der Statistik, zu statistischen Methoden und zur Anwendung statistischer Software hat Forschern und Doktoranden ermöglicht, selbständig statistische Auswertungen durchzuführen. Fortbildungsveranstaltungen zu statistischen Methoden werden regelmäßig angeboten. Daneben wird eine intensive persönliche Beratung und Hilfestellung bei der Auswahl statistischer Software und deren Anwendung geboten. Die in der Serviceeinheit entwickelten Verfahren konnten in einzelnen experimentellen Projekten direkt angewendet werden wie z. B. bei der 3-D Auswertung der Lebersegmentierung [35]. C060 Biostatistik Wir beteiligten uns an einem Projekt der Validierung alternativer Verfahren zur Prüfung der Toxizität von Substanzen, die nicht auf Tierversuchen basierten, unter Federführung von Prof. L. Hothorn (Universität Hannover). Dieses von der EVCAM initiierte und finanzierte Projekt leistet einen wesentlichen Beitrag zum Ersatz von Tierversuchen. Dazu wurden biometrische Verfahren entwickelt, die es gestatten, für die Ersatzmethoden ein vergleichbares Niveau von Genauigkeit nachzuweisen und die den unverfälschten Vergleich der Ergebnisse der Ersatzmethoden mit den Ergebnissen der herkömmlichen Tierversuche erlauben. Dies wird ermöglicht durch die Bestimmung von Sensitivität und Spezifität sowie der Anwendung von Regressionsverfahren. Insbesondere wurde die ROC-Technik bei Vorliegen eines Kontinuums quantitativer Daten benutzt, wenn cut-off Werte zu bestimmen waren. Model Selektion und Model Validierung bildeten einen weiteren Schwerpunkt unseres Arbeitspakets und schließlich wurden Empfehlungen in der Form eines 4-Stufenprogramms gegeben [30]. Zur statistischen Auswertung toxikologischer Daten wurden die Rollen des proof of hazard und des proof of safety herausgestellt [24]. Die in Zusammenarbeit mit der Stabsstelle Krebsprävention durchgeführten Studien zur Kindergesundheit und zum Rauchverhalten von Kindern der Jahre 1996 bis 2000 wurden einer ausführlichen Nachbetreuung und Analyse hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der erhobenen Variablen und der Wirkung der einmalig vorgenommenen Intervention (Aufklärungsunterricht über die Schädlichkeit des Rauchens) an einer Teilpopulation untersucht. Ein intern zugänglicher Bericht wurde dazu vorgelegt. Zusätzliche Finanzierung durch: ECVAM- EU-Projekt shared cost action, Partner: Universität Hannover Publikationen (Autoren der Biostatistik hervorgehoben) [1] Beyer K.S., Klauck S.M., Benner A., Poustka F., Poustka A.: Association studies of the HOPA dodecamer duplication variant in different subtypes of autism. Am.J.Med.Genet. 114 (1) , [2] Bonora E., Beyer K.S., Lamb J.A., Parr J.R., Klauck S.M., Benner A., Paolucci M., Abbott A., Ragoussis I., Poustka A., Bailey A.J., Monaco A.P.: Analysis of reelin as a candidate gene for autism. Mol.Psychiat. 8 (10) , [3] Breitkreutz I., Benner A., Möhler T., Glasmacher A., Martin H., Hölzer M., Salwender H., Ho A.D., Goldschmidt H.: Initial therapy with thalidomide in multiple myeloma: no increase of adverse events compared to standard therapy. Onkol. 26(S5), p.127 (P705), [4] Breitkreutz I., Cremer F.W., Benner A., Raab M.S., Moehler T., Christensen O., Herrmann D., Ho A.D., Goldschmidt H.: Peripheral blood stem cell collection (PBSC) after CAD plus G- CSF in multiple myeloma: no influence of previous thalidomide (THAL) administration. Onkol. 25(S4), pp (748), [5] Breitkreutz I., Cremer F.W., Benner A., Raab M.S., Möhler T., Christensen O., Herrmann D., Ho A.D., Goldschmidt H.: Peripheral blood stem cell collection after CAD plus G-CSF in multiple myeloma: no influence of previous thalidomide administration. Onkol. 26(S5), p.131 (P718), [6] Breitkreutz I., Glasmacher A., Cremer F.W., Benner A., Imbach U., Herrmann D., Ho A.D., Goldschmidt H.: Peripheral blood stem cell (PBSC) collection in the treatment of multiple myeloma (MM): influence of VAD and VID. Onkol. 25(S4), p.211 (747), [7] Buchholz E., Drings P., Braun L., Meurer S., Pilz L., Manegold C.: Standard (SCT) versus dose-intensified chemotherapy (ICT) with sequential re-infusion of peripheral blood cells (PBC) in SCLC. J.Cancer Res.Clin.Oncol. 128(Suppl.1), p.76 (P386),

212 212 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [8] Buchholz E., Drings P., Pilz L., Manegold C.: A single, center, controlled study of standard versus dose intensified chemotherapy with sequential reinfusion of hematopoetic progenitor cells in small cell lung cancer, final results. Onkol. 26(S5), p.26 (V305), [9] Buchholz E., Drings P., Pilz L., Manegold C.: Final results from a single center, controlled study of standard versus dose intensified chemotherapy with sequential reinfusion of haematopoetic progenitor cells in small cell lung cancer. Proc.ASCO, p.no.2572, [10] Burkholder I., Kopp-Schneider A.: Incorporating phenotype-dependent growth rates into the color-shift model for preneoplastic hepatocellular lesions. Math.Biosci. 179 (2) , [11] Cochlovius B., Stassar M.J.J.G., Schreurs M.W., Benner A., Adema G.J.: Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol.Lett. 80 (2) 89-96, [12] Cremer F.W., Bouko Y., Everaert T., Lipinski E., Samson D., Apperely J.F., Thielemans K., Van Camp B., Benner A., Goldschmidt H., Moos M., Bakkus M.H.C.: Quantitation of the post-transplantation tumor load in the bone marrow by PCR with allele-specific oligonucleotide primers is a prognostic parameter in multiple myeloma. Onkol. 25(S4), p.120 (419), [13] Dally H., Edler L., Jäger B., Schmezer P., Spiegelhalder B., Dienemann H., Drings P., Schulz V., Kayser K., Bartsch H., Risch A.: The CYP3A4*1B allele increases risk for small cell lung cancer: effect of gender and smoking dose. Pharmacogen. 13 (10) , [14] Dally H., Gassner K., Jäger B., Schmezer P., Spiegelhalder B., Edler L., Drings P., Dienemann H., Schulz V., Kayser K., Bartsch H., Risch A.: Myeloperoxidase (MPO) genotype and lung cancer histologic types: the MPO-463 A allele is associated with reduced risk for small cell lung cancer in smokers. Int.J.Cancer 102 (5) , [15] Deichmann M., Thome M., Benner A., Egner U., Hartschuh W., Näher H.: PTEN/MMAC1 expression in melanoma resection specimens. Brit.J.Cancer 87 (12) , [16] Dencausse Y., Hartung G., Sturm J., Kopp-Schneider A., Hagmüller E., Wojatschek C., Lindemann H., Fritze D., Queisser W.: Adjuvant chemotherapy in stage III colon cancer with 5-fluorouracil and levamisole versus 5-fluorouracil and leucovorin. Onkol. 25 (5) , [17] Dittrich C., Arndt D., Beck J., Behringer D., Berdel W., Bokemeyer C., Borner M., DeSantis M., Edler L., Eisenbrand G., Fichtner I., Fiebig H.H., Fricker G., Gastl G., Hartung G., Hofheinz R., Hossfeld D.K., Illiger H.J., Jaehde U., Keppler B.K., Morant R., Mross K.B., Müller H.J., Oberhoff C., Queisser W., Reichert D., Reszka R., Scheulen M.E., Schüller J., Strumberg D., Pawel J.v., Wiessler M.: CESAR-EWIV: A platform for developing new anticancer agents. J.Cancer Res.Clin.Oncol. 128(Suppl.1), p.39 (I199), [18] Döhner K., Tobis K., Ulrich R., Fröhling S., Benner A., Schlenk R.F., Döhner H.: Prognostic significance of partial tandem duplications of the MLL gene in adult patients 16 to 60 years old with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study of the AML group Ulm. J.Clin.Oncol. 20 (15) , [19] Dreger P., Stilgenbauer S., Benner A., Ritgen M., Kröber A., Kneba M., Schmitz N., Döhner H.: The prognostic impact of autologous stem cell transplantation in patients with chronic lymphocytic leukemia: a risk-matched analysis based on on the VH gene mutational status. Onkol. 26(S5), p.8 (V182), [20] Edler L.: Anforderungen an die klinische Therapieforschung in der Phase I, II und III. Onkol. 25 (Suppl.1) 78-83, [21] Edler L.: Biometrische Bewertung palliativer Massnahmen. In: D.Fritze (Ed.), Palliative Krebsbehandlung. Beiträge zur interdisziplinären Krebsbehandlung. 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213 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [40] Fröhling S., Schlenk R.F., Breitruck J., Benner A., Kreitmeier S., Tobis K., Döhner H., Döhner K.: Prognostic significance of activating FLT3 mutations in younger adults (16 to 60 years) with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study of the AML study group Ulm. Onkol. 25(S4), p.218 (769), [41] Gastl G., Berdel W., Edler L., Jaehde U., Port R.E., Mross K.B., Scheulen M.E., Sindermann H., Dittrich C.: Standard operating procedures for clinical trials of the CESAR - Central European Society for Anticancer Drug Research - EWIV. Onkol. 26 (Suppl.6), [42] Geisler I., Kopp-Schneider A.: Modeling the formation and growth of radiation induced liver focal lesions. pp.68-69, Freiburg, Germany, Int.Biometr.Soc. 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214 214 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [68] Korz C., Pscherer A., Benner A., Mertens D., Schaffner C., Leupolt E., Döhner H., Stilgenbauer S., Lichter P.: Evidence for distinct pathomechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma by quantitative expression analysis of cell cycle and apoptosis-associated genes. Blood 99 (12) , [69] Kröber A., Seiler T., Benner A., Bullinger L., Brückle E., Lichter P., Döhner H., Stilgenbauer S.: V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 100 (4) , [70] Kuntz C., Kienle P., Schmeding M., Benner A., Autschbach F., Schwalbach P.: Comparison of laparoscopic versus conventional technique in colonic and liver resection in a tumor-bearing small animal model. 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215 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention C060 Biostatistik [95] Schmeding M., Schwalbach P., Reinshagen S., Autschbach F., Benner A., Kuntz C.: Helium pneumoperitoneum reduces tumor recurrence after curative laparoscopic liver resection in rats in a tumor-bearing small animal model. Surg.Endosc. 17 (6) , [96] Schmiechen A., Buckler F., Schmohl S., Ittrich C., Münzel P., Schwarz M.: Regulation of cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) gene expression by TCDD. Naunyn-Schmiedeb.Arch.Pharmacol. 367(Suppl.1), p.r125 (486), [97] Schwänen C., Hecker T., Hübinger G., Wölfle M., Rittgen W., Bergmann L., Karakas T.: In vitro evaluation of bendamustine induced apoptosis in B-chronic lymphocytic leukemia. Leukem , [98] Stach D., Schmitz O.J., Stilgenbauer S., Benner A., Dohner H., Wiessler M., Lyko F.: Capillary electrophoretic analysis of genomic DNA methylation levels. Nucl.Acids Res. 31 (2) E2, [99] Stilgenbauer S., Benner A., Kröber A., Winkler D., Kienle D., Lichter P., Döhner H.: Molecular genetics of CLL: role for future treatment strategies. Onkol. 25(S4), p.273 (978), [100] Strieth S., Hartschuh W., Pilz L., Fusenig N.E.: Carcinomalike vascular density in atypic keratoacanthoma suggests malignant progression. Brit.J.Cancer 87 (11) , [101] Tobis K., Fröhling S., Hein S., Benner A., Schlenk R.F., Döhner H., Döhner K.: Partial tandem duplication of the MLL gene as an important prognostic factor for remission duration in adult patients (16 to 60 years) with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study within the multicenter treatment trials AML HD93 and HD98-A of the AML study group Ulm (AMLSG ULM). Onkol. 25(S4), p.222 (785), [102] Twardella D., Popanda O., Helmbold I., Ebbeler R., Benner A., v.fournier D., Haase W., Sautter-Bihl M.L., Wenz F., Schmezer P., Chang-Claude J.: Personal characteristics, therapy modalities and individual DNA repair capacity as predictive factors of acute skin toxicity in an unselected cohort of breast cancer patients receiving radiotherapy. Radiother.Oncol. 69 (2) , [103] Wörner S.M., Benner A., Sutter C., Schiller M., Yuan Y.P., Keller G., Bork P.: Pathogenesis of DNA repair-deficient cancers: a statistical meta-analysis of putative real common target genes. Oncogene 22 (15) , [104] Zehbe I., Mytilineos J., Wikström I., Henriksen R., Edler L., Tommasino M.: Association between human papillomavirus 16 E6 variants and human leukocyte antigen class I polymorphisms in cervical cancer of Swedish women. Hum.Immunol. 64 (5) ,

216 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention M019 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (M019) Leiter: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Heinz Walter Thielmann 216 Tätigkeit in der Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft H. W. Thielmann ist Mitglied der Senatskommission der DFG zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe. Laut Mandat erarbeitet die Kommission die wissenschaftlichen Grundlagen des Schutzes der Gesundheit vor toxischen Stoffen am Arbeitsplatz. Ergebnisse der Kommissionsarbeit sind wissenschaftliche Empfehlungen zur Aufstellungen von MAK-Werten ( Maximale Arbeitsplatzkonzentration ), zur Einstufung krebserzeugender Arbeitsstoffe, zur Bewertung fruchtschädigender und erbgutschädigender sowie weiterer Wirkungen. Darüber hinaus greift die Kommission weitere aktuelle Probleme der Gesundheitsgefährdung durch Arbeitsstoffe auf und schlägt Lösungsmöglichkeiten vor. Die Arbeitsergebnisse der Senatskommission werden in Form ausführlicher wissenschaftlicher Begründungen durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft veröffentlicht. Keine der Publikationen trägt die Namen der beteiligten Autoren, damit diese nicht seitens wirtschaftlicher, politischer oder sonstiger Interessengruppen angegriffen werden können. Die Publikationen werden als Empfehlungen dem Bundesminister für Arbeit und Sozialordnung übergeben. Dieser kann den Empfehlungen - unverändert oder geändert - in geeigneter Form Rechtsverbindlichkeit als Grundlage des Arbeitschutzes verleihen. Die Kommission arbeitet in wissenschaftlicher Freiheit und Unabhängigkeit. Sie ist in der Auswahl und in der Prioritätensetzung der Prüfung von Arbeitsstoffen und weiterer zu untersuchender Probleme an Weisungen nicht gebunden. Im Hinblick auf diese Aufgabe sind die Kommissionsmitglieder ad personam in ihrer Eigenschaft als sachkundige Experten berufen, nicht als Vertreter der Institutionen, in denen sie tätig sind. Ziel der Kommissionsarbeit ist allein der nach dem jeweiligen Stand der Wissenschaft mögliche und gebotene Schutz der Gesundheit der Beschäftigten und deren Nachkommen. Es versteht sich von selbst, dass die Kommissionsarbeit ein Ganzes darstellt. Folglich lässt sich der von einem einzelnen Mitglied geleistete Anteil nicht herauslösen und gesondert beschreiben. In ca. 25 Sitzungen der Kommission bzw. ihrer Ad-hoc- Arbeitsgruppen wurden Bewertungskonzeptionen entwikkelt, Stoffe beurteilt und die Ergebnisse in den Kommissionsmitteilungen MAK- und BAT-Werte-Liste der Jahre 2002 und jeweils in deutschen als auch englischen Fassungen - veröffentlicht [1,2]. In den Broschüren sind mehr als 160 Änderungen und Neuaufnahmen pro Arbeitsjahr dokumentiert. Für jede Neuaufnahme und Änderung wurden detaillierte wissenschaftliche Begründungen erarbeitet. Deren Veröffentlichung erfolgte in der Monographiensammlung Gesundheitsschädliche Arbeitsstoffe - Toxikologisch-arbeitsmedizinische Begründungen von MAK-Werten (Herausgeber: H. Greim) der Jahre 2002 und 2003 (Lieferungen 34 bis 37) mit jeweils Druckseiten pro Lieferung [3]. In den MAK- und BAT-Werte-Liste(n) 2002 und sind die jeweils auf den neuesten Stand gebrachten Leitlinien dargelegt, wie die Kommission bei ihren Bewertungen, insbesondere der Ableitung von MAK- Werten vorgeht. In den einschlägigen Kapiteln sind die Kriterien für die Einstufung von Stoffen in folgende Wirkkategorien festgeschrieben: Kanzerogenität,Keimzellmutagenität, Fruchtschädigung, Sensibilisierung, Hautresorption, zulässige Kurzzeit-Überschreitung. Erwähnenswert ist die Neufassung des Kapitels Aerosole hinsichtlich der wirkungsbestimmenden Eigenschaften der Aerosole, ihrer Deposition und Clearance in den Atmungsorganen, ihrer wirkungsbezogenen Messung sowie der Festlegung von Fraktionen für die Messtechnik [2]. Bei der Überprüfung von Arbeitsstoffen auf krebserzeugende Wirkung wurden folgende Stoffe als Kanzerogene erkannt oder neu bewertet und aufgrund ihres Wirkmodus und ihrer Wirkungsstärke in eine der fünf Kanzerogen-Kategorien eingestuft [1-5]: Kategorie 1, d. h. erwiesenermaßen krebserzeugend bei Menschen: Arsen und seine anorganischen Verbindungen; Beryllium, Benzol (Jahresproduktion in Deutschland: 2.3 Mio t; s. a.[7]), Vinylchlorid. Kategorie 2, d. h. eindeutig krebserzeugend beim Versuchstier, daher beim Menschen als krebserzeugend anzusehen: 2-Nitrotoluol, Ochratoxin A, 1-Chlor-2,3-epoxypropan; Kategorie 3A. Diese Kategorie ist Stoffen vorbehalten, deren krebserzeugender Wirkmechanismus zwar bekannt ist, für die jedoch Daten zur Ableitung eines MAK-Wertes fehlen. Eingestuft wurde Vinylacetat (Jahresproduktion: ca. 4 Mio t). Kategorie 3B. Stoffe, die im Verdacht stehen, Krebs zu erzeugen: Stickstoffdioxid (der bisherige MAK-Wert wurde ausgesetzt); Bromchlormethan, Glutardialdehyd: empfohlener Momentanwert, der nicht überschritten werden darf: 0.8 mg/m 3 ; Rhodium; chlorierte Biphenyle; Chlorparaffine, N,N,N -Triethylhexahydro- 1,3,5-triazin. Kategorie 4. Kanzerogene, bei denen gentoxische Effekte keine oder nur eine untergeordnete Rolle spielen: Di(2- ethylhexyl)phthalat (Zusatz für Kunststoffe; Jahresproduktion ca. 3 Mio t; ubiquitäres Vorkommen): MAK-Wert: 10 mg/m 3 ; Tetrahydrofuran: MAK-Wert: 150 mg/m 3. Beispiele für Stoffe, für die nach intensiver Prüfung keine MAK-Werte aufgestellt werden konnten: chlorierte Diphenyloxide; Ethylhexansäure; Dicyandiamid; Resorcin; Nikotin; Osmiumtetroxid; Wolfram und seine Verbindungen; Tellur. Bewertung von Kontrolldaten bei Kanzerogenitätsexperimenten. Es wurden Grundsätze erarbeitet, nach denen die MAK- Kommission Kontrolldaten von Kanzerogenitätsversuchen, insbesondere sog. historische Kontrollen bei Tierversuchen bewertet. Grund für diese Klarstellung ist die steigende Tendenz, ein aktuelles Tierversuchsergebnis im Licht älterer Kontrolldaten zu interpretieren. So haben namhafte Industrieunternehmen (aber auch das NATIONAL CANCER INSTITUTE) Datenbanken z. B. über Häufigkeiten von Spontantumoren bei Kontrolltieren angelegt. Da diese Kontrolldaten oft nach Gutdünken zur Evaluierung expositionsbedingter kanzerogener Effekte herangezogen werden, hat die MAK-Kommission nunmehr Leitlinien publiziert, wann überhaupt historische Kontrolldaten in Betracht gezogen werden können und welche Bedingungen erfüllt sein müssen (z. B. Zeitfenster,

217 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Identität des Prüflabors etc.), damit ein Vergleich wissenschaftlich akzeptabel ist [8]. MAK-Werte Für zahlreiche Stoffe änderten sich die MAK-Werte bzw. wurden erstmals ermittelt [1-6]. Für insgesamt 18 Stoffe konnten aufgrund fehlender Daten keine MAK-Werte festgelegt werden. Auf besondere Gefährdung in der Schwangerschaft wurden ca. 30 Stoffe überprüft und entsprechend klassifiziert. Publikationen (* = externer Koautor) [1] MAK- und BAT-Werte-Liste Deutsche und englische Versionen, Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Mitteilung 38 (2002), VCH Verlagsgesellschaft mbh, Weinheim. [2] MAK- und BAT-Werte-Liste Deutsche und englische Versionen, Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Mitteilung 39 (2003), VCH Verlagsgesellschaft mbh, Weinheim. [3] Autoren der MAK-Kommission, u. a. H. W. Thielmann: Di(2- ethylhexyl)phthalat, Tetrahydrofuran, Stickstoffdioxid, Glutardialdehyd, Ethylhexansäure und weitere Stoffe In Greim, H. (Hrsg.): Gesundheitsschädliche Arbeitsstoffe. Toxikologisch-arbeitsmedizinische Begründungen von MAK- Werten (Maximale Arbeitsplatzkonzentrationen). 34., 35., 36. u. 37. Lieferung, Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2002 und [4] Occupational Toxicants, Critical Data Evaluation for MAK Values and Classification of Carcinogens. Vol. 17; Autoren der MAK- Kommission, u. a. Thielmann, H. W.; Herausgeber: H. Greim, Commission for the Investigation of Health Hazard of Chemical Compounds in the Work Area. Wiley-VCH, Weinheim, [5] Occupational Toxicants, Critical Data Evaluation for MAK Values and Classification of Carcinogens. Vol. 19; Autoren der MAK- Kommission, u. a. Thielmann, H. W.; Herausgeber: H. Greim, Commission for the Investigation of Health Hazard of Chemical Compounds in the Work Area. Wiley-VCH, Weinheim, [6] Occupational Toxicants, Critical Data Evaluation for MAK Values and Classification of Carcinogens. Vol. 20; Autoren der MAK- Kommission, u. a. Thielmann, H. W.; Herausgeber: H. Greim, Commission for the Investigation of Health Hazard of Chemical Compounds in the Work Area. Wiley-VCH, Weinheim, [7] *Woitowitz, H.-J., Thielmann, H. W., *Norpoth, K., *Henschler, D., *Hallier, E. Benzol als Ausnahmekanzerogen in der Prävention und seine gentoxischen Folgen: Toxikologische, arbeitsmedizinische und sozialmedizinische Aspekte. Zentralblatt für Arbeitsmedizin, Arbeitsschutz und Ergonomie, 3, Jahrgang 53, (2003). [8] *Greim, H., *Gelbke, H.-P., *Reuter, U., Thielmann, H. W., Edler, L. Evaluation of historical control data in carcinogenicity studies. Hum. Exp. Toxicol. 22, (2003). Forschungsvorhaben StSch 4116 des Bundesamtes für Strahlenschutz: Bedeutung der individuellen Strahlenempfindlichkeit für die Abschätzung des individuellen Strahlenrisikos beruflich strahlenexponierter Personen ; Teilaktivität: Entwicklung eines In-vitro- Testsystems zur Erfassung der Strahlenempfindlichkeit. H.W. Thielmann, F. Gotzes, J.J. Park, L. Edler 1) ; B.-S. Kim* 2), D. von Fournier* 3), W. Haase* 4), M.-L. Sautter-Bihl * 5), E. Hagmüller* 6) 1) Biostatistik des DKFZ, 2) Yonsei-Universität Seoul, Süd-Korea, 3) Radiologische Klinik der Universität Heidelberg, 4) Klinik für Radiotherapie und radiologische Onkologie der St. Vincentius Krankenhäuser, Karlsruhe, 5) Klinik für Radiotherapie des Städt. Klinikums Karlsruhe, 6) Klinikum Heilbronn M019 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Zur Abschätzung der individuellen Strahlenempfindlichkeit wurden Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen herangezogen und zwei zellphysiologische Parameter bestimmt: 1) die Anzahl der Basenfehlpaarungsstellen, die - nach Bestrahlung der Zellen mit 137 Cs (γ-quelle) in vitro - im Zuge der replikativen DNA-Synthese auftreten; 2) die Anzahl von strahleninduzierten DNA-Brüchen sowie deren Beseitigung durch Reparatur. Zu 1). Testprinzip. Nach γ-bestrahlung enthält die DNA- Matrize der Lymphozyten veränderte (d. h. teilzerstörte) Basen, u. a. 8-Oxoguanin, das bei der stimulierten DNA- Replikation mit dem falschen Nukleotid Adenin anstelle des korrekten Cytosins paart und folglich Cytosin in den Tochterstrang dirigiert. Die Reparatur dieser Fehlpaarung erfolgt durch selektive enzymatische Abspaltung des Adenins aus dem 8-Oxoguanin : Adenin-Paar. Die Abspaltung wird durch eine spezifische Glykosylase-Endonuklease der Lymphozyten katalysiert, kann jedoch, nach Zell-Lyse, auch von einem zugesetzten Enzym z. B. aus E. coli ausgeführt werden. Der durch das Enzym bewirkte - unvermeidliche - DNA- Einzelstrangbruch wird anschließend mit der Methode der alkalischen Elektrophorese ermittelt [9]. Die Häufigkeit der DNA-Strangbrüche ist somit ein Maß für die Anzahl an Basenfehlpaarungen, und diese Basenfehlpaarungen können zu Mutationen werden, falls die Zelle sie nicht rechtzeitig eliminiert. Die Hypothese (die zu verifizieren oder zu widerlegen ist) unterstellt, dass Basenfehlpaarungen und deren Reparatur bestimmende Variable der Strahlenempfindlichkeit sind [9]. Zu 2). Bei 25 Patientinnen wurde die Einzelzell-Gelelektrophorese zur Abschätzung der Strahlenempfindlichkeit benutzt. Im einzelnen wurden die Lymphozyten jeder Patientin in vitro mit γ-strahlen einer 137 Cs-Quelle bestrahlt, Dosis- Wirkungskurven erstellt sowie die zeitabhängige Eliminierung von DNA-Schäden (DNA-Strangbrüchen) für mehrere Bestrahlungsdosen bestimmt. Das Abklingen der Strahlenschäden gibt Auskunft über das DNA-Reparaturvermögen der Zelle. Vereint man die Dosis-Wirkungs- und Dosis-Zeit-Kurven, die für die Lymphozyten jeder Patientin gewonnen wurden, so erhält man eine Dosis-Zeit-Wirkungsfläche. Für den geplanten Vergleich dieser Schädigungs- und Reparaturcharakteristik mit den klinischen Zeichen der Strahlenempfindlichkeit stellte sich das Problem, wie die in der Dosis- Zeit-Wirkungsfläche steckenden Informationen zu einer einzigen quantifizierenden Messgröße vereinigt werden konnten. Derzeit existiert für die Datenfülle der Einzelzell-Gelelektrophorese kein validiertes und bindendes Auswertungsverfahren. Das ist einer der Gründe, weshalb die regulatorische Toxikologie diese Elektrophorese bislang nicht als verlässlichen Test anerkennt. Die OECD urteilt ebenfalls zurückhaltend. Um das Defizit zu kompensieren, entwickelten wir folgende Auswertungsmethode und stellten sie in das Internet [10,11] ( Die Dosis-Zeit-Wirkungsfläche - gebildet jeweils für DNA-Wanderungsverzögerung im elektrischen Feld ( Olive tail moment ) sowie weiteren Messparametern ( tail DNA, tail inertia ) - wird mittels der doppelten Ableitung dieser Wirkungsfläche nach Zeit und Dosis zu einer einzigen Größe (genannt: 2D) komprimiert [9-11]. Die rechnerische Darstellung lautet: d 2 F/dt,dx [F bedeutet die von Dosis und Zeit bestimmte Wirkungsfläche; (F = f(t,x)]. Aus diesem Rechenverfahren resultierten für jede Patientin mindestens zwei quantitative integrale Messgrößen, die, jede für sich genommen, die weit über tausend Einzeldaten 217

218 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention M019 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe eines Dosis-Zeit-Wirkungsexperiments wiederspiegelt und den klinischen Zeichen der Strahlenempfindlichkeit gegenübergestellt werden kann [9,10]. Publikationen (* = externer Koautor) [9] Thielmann et al., Die Bedeutung der individuellen Strahlenempfindlichkeit für die Abschätzung des individuellen Strahlenrisikos. In: Bundesamt für Strahlenschutz, Fachbereich Strahlenhygiene, Programmreport Herausgeber: W. Donhäri, R. Gödde, A. Schmitt-Hannig, M. Williams. Wirtschaftsverlag NW/ Verlag für neue Wissenschaft GmbH. [10] *Kim, B.-S., Park, J. J., Edler, L., *von Fournier, D., *Haase, W., *Sautter-Bihl, M.-L., Gotzes, F., Thielmann, H. W. New Measure of DNA repair in the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. Environ. Molec. Mutagen. 40, (2002). [11] *Kim, B.-S., Park, J. J., Edler, L., *von Fournier, D., *Haase, W., *Sautter-Bihl, M.-L., Gotzes, F., Thielmann, H. W. The second derivative of the dose-time-response surface as a measure of DNA repair kinetics in the comet assay. Environmetrics 14, (2003). 218

219 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention M050 Krebsprävention Stabsstelle Krebsprävention (M050) Leiterin: Dr. med. Martina Pötschke-Langer TEL ; FAX M.Poetschke-Langer@DKFZ.de Wissenschaftliche Mitarbeiter Dipl.-Psych. Dr. P. H. Annette Bornhäuser Dr. rer. nat. Reinhold Klein (10/03-6/04) Dipl.-Psych. Peter Lindinger Projektkoordinationen Susanne Schunk Susanne Schmitt Technische Mitarbeiter mit Werkvertrag Christa Leiber (1/02-12/03) Sevin Cetinkaya (1-6/02) Patricia Strand (1/02-12/03) Gabi Meier (1-12/02) Elfun Spohr (1/02-12/03) Alessandra Moschetti (1/02-12/03) Doris Erbe (7-12/03) Daniela Knödler (6-12/03) Freie Mitarbeiter des Rauchertelefones vom Gesundheitsamt Mannheim und der AOK Rhein-Neckar Praktikanten Lemi Reskovac (1-8/02) Alexander Schulze (9/02-12/03) Carmen Schletterer (1-6/02) Fabian Möhres (9-10/03) Sandra Seeman (10-12/03) Auszubildende Kauffrauen für Bürokommunikation Jennifer Hoffmann (1-6/02) Jessica Bopp (6-9/02) Sandra Zeisberger (10-12/02) Judith Hiller (1-4/03) Nicole Zimmermann (5-8/03) Laura Lockstaedt (9-12/03) Kooperationen (ausgewählt): International: Dr. Derek Yach und Prof. Dr. Pekka Puska, World Health Organization, Genf, Schweiz; Dr. Haik Nikogosian, World Health Organization, Kopenhagen, Dänemark; Mike Pertschuk, Advocacy Institute, Washington, USA; Dr. Scott Leischow, National Cancer Institute, USA; Sibylle Fleitmann European Network for Smoking Prevention, Brüssel, Belgien; Dr. Liisa Elovainio, Cancer Society of Finnland, Helsinki, Finnland; Margaretha Haglund, International Women Against Tobacco, Stockholm, Schweden; Patti White, Health Development Agency, Smoking or Health (AHS), London, UK; Andrew Hayes, UICC, Brüssel, Belgien National: PD Dr. Anil Batra, Universitätsklinik für Psychiatrie und Psychotherapie Tübingen; Dr. Pal Laszlo Bölcskei, Medizinische Klinik des Klinikum Nürnberg Nord, Nürnberg; Dr. Christoph Kröger, IFT, München; Dr. Reiner Hanewinkel, ITF Nord, Kiel; Dr. Wilfried Kunstmann und Dr. Justina Engelbrecht, Bundesärztekammer Köln; Prof. Dr. Karl Mann, Lehrstuhl für Suchtforschung der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg und Klinik für Abhängigkeitsverhalten, Zentralinstitut für seelische Gesundheit, Mannheim; Prof. Dr. Peter Drings, Thorax Klinik, Heidelberg; Dr. Volker Beck, Deutsche Krebsgesellschaft, Frankfurt; Prof. Dr. Friedrich Wiebel, Ärztlicher Arbeitskreis Rauchen und Gesundheit, Eching; Dr. Uwe Prümel-Philippsen, Bundesvereinigung für Gesundheit, Bonn; Rolf Hüllinghorst und Dr. Raphael Gassmann, Deutsche Hauptstelle gegen die Suchtgefahren, Hamm; Dr. Eva Kalbheim, Deutsche Krebshilfe, Bonn; Prof. Dr. Gerhardt Simon, Deutsche Lungenstiftung, Donaustauf; Martin Vestweber und Christine Raap, Deutsche Herzstiftung, Frankfurt; Gisela Marsen-Storz und Peter Lang, Bundeszentrale für gesundheitliche Aufklärung, Köln Die Stabsstelle Krebsprävention hat 2002/2003 den Arbeitsschwerpunkt Tabakprävention und Tabakkontrolle weiter ausgebaut. Dabei wurden folgende Projekte durchgeführt: 1. Rauchertelefon als zentrale Hotline zur Tabakentwöhnung und eine spezielle Hotline für rauchende Krebspatienten (gemeinsam mit der Deutschen Krebshilfe) Die Bereitstellung evidenzbasierter Entwöhnungsangebote für eine große Zahl von Rauchern bei möglichst geringen Kosten erfüllt nur die telefonische Raucherberatung. In Deutschland bestehen unterschiedliche Arten der Informationsvermittlung und Beratungen an Telefonen. Ein strukturiertes Beratungsprotokoll sowie Daten zur in Anspruchnahme und Effektivität liegen lediglich beim Rauchertelefon des DKFZ vor. Beide Telefondienste werden kontinuierlich evaluiert und in ihrer Wirksamkeit überprüft. Das Rauchertelefon hat sich nicht nur für ratsuchende Raucherinnen und Raucher sowie deren Angehörigen, sondern auch für Journalisten zu einem bundesweiten Informationsdienst entwickelt. 2. Massenmediale Nichtraucherkampagne Rauchfrei im 2-Jahres-Rhythmus nach den internationalen Quit and Win Konzepten Die Stabsstelle Krebsprävention führte in den Jahren 2000 und 2002 die ersten großen nationalen Nichtraucherkampagnen durch, an denen sich im Jahr und im Jahr 2002 über Raucherinnen und Raucher beteiligten und versuchten, wenigstens einen Monat lang, im Mai, nicht zu rauchen. Der langfristige Erfolg der Kampagne liegt in der dauerhaften Beibehaltung des Nichtrauchens. Die Evaluationen beider Kampagnen zwölf Monate später ergaben, dass 30 % bzw. 22 % dauerhaft abstinent geworden sind und weitere 6 % bzw. 7 % bezeichneten sich als abstinent, jedoch mit zwischenzeitlichen Rückfällen, während der vergangenen Monate. [1] Massenkampagnen dieser Art haben noch einen weiteren Effekt: Durch die Nutzung sämtlicher Medien wie Rundfunk, Fernsehen, Internet und Print-Medien wird die Motivation von Raucherinnen und Rauchern zum Rauchstopp gesteigert und gleichzeitig die Akzeptanz des Nichtrauchens erhöht. Dieser Medieneffekt trägt auch dazu bei, dass stabile Raucher zunehmend erwägen, den Rauchstopp vorzunehmen. Deshalb sind Kampagnen, die sich an Raucher richten, von besonderer Bedeutung. Bemerkenswert ist das hohe Interesse der Medien: Die Kampagne 2002 wurde in über 100 Millionen Printmedien in Deutschland kommuniziert sowie in einer Vielzahl von Hörfunk- und Fernsehprogrammen und im Internet. 3. Curriculum für Gesundheitsberufe zur Tabakabhängigkeit und Raucherentwöhnung Gemeinsam mit dem Fortbildungsdezernat der Bundesärztekammer wurde ein Curriculum für Gesundheitsberufe zur Tabakabhängigkeit und Tabakentwöhnung entwickelt. Dieses Curriculum wird im DKFZ, aber auch im Rahmen von Fortbildungsveranstaltungen für Ärzte, Suchttherapeuten und andere Gesundheitsberufe seit 2001 kontinuierlich durchgeführt. [2] 219

220 220 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 4. Die Rauchersprechstunde - Beratungskonzept für Gesundheitsberufe Ein in Zusammenarbeit mit führenden deutschen Suchtmedizinern und Therapeuten von der Stabsstelle Krebsprävention entwickeltes Beratungskonzept findet hohe Akzeptanz bei den Gesundheitsberufen, so dass inzwischen bereits eine dritte Auflage möglich wurde. [3] 5. Handlungsempfehlungen für eine wirksame Tabakkontrollpolitik in Deutschland Verhältnisorientierte Tabakkontrollmaßnahmen stellen die Basis für eine erfolgreiche Absenkung des Rauchverhaltens in allen Bevölkerungsgruppen, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen dar. Hierzu gehören unter anderem deutliche Tabaksteuererhöhungen, die Bekämpfung des Zigarettenschmuggels, ein umfassendes Tabakwerbeverbot, der Abbau der Zigarettenautomaten, die Durchsetzung des Nichtraucherschutzes und Schaffung rauchfreier Zonen sowie Produktregulation von Tabakwaren, umfassende Verbraucherinformation und große Warnhinweise auf Zigarettenpackungen. In enger Zusammenarbeit mit über 30 deutschen Wissenschaftlern und in Berücksichtigung der Ergebnisse des Sachverständigenrates für die Konzertierte Aktion im Gesundheitswesen entwickelte die Stabstelle Krebsprävention Handlungsempfehlungen für die deutsche Tabakkontrollpolitik. [4] Die Autorin der Publikation, Dr. Annette Bornhäuser, erhielt für diese Arbeit den deutschen Forschungspreis Rauchen und Gesundheit im Jahr Framework Convention on Tobacco Control (FCTC) Nach sechs Verhandlungsrunden der Mitgliedstaaten der WHO, an der auch Mitarbeiter der Stabsstelle als Beobachter teilnahmen, wurde im Mai 2003 von der Weltgesundheitskonferenz die Rahmenkonvention zur Tabakkontrolle angenommen. Deutschland unterzeichnete das Rahmenabkommen im Oktober 2003 und wird voraussichtlich in 2004 die Ratifizierung vornehmen. Viele Einzelaspekte der Implementierung des Rahmenabkommens in Deutschland bedürfen der sorgfältigen Vorbereitung und Transparenz. Die Stabsstelle Krebsprävention leistet dabei durch gezielte Informationsvermittlung ihren Beitrag. So bearbeitet die Stabsstelle die deutsche Herausgabe des Weltbankberichtes Der Tabakepidemie Einhalt gebieten - Regierungen und wirtschaftliche Aspekte der Tabakkontrolle [5] und führte die Konferenz Wirtschaftliche und gesundheitliche Aspekte des Tabakrauchens in Deutschland am 31. März und 01. April 2003 für politische Entscheidungsträger in Regierung und Opposition sowie den Ländern durch. Beide Projekte wurden in enger Zusammenarbeit mit dem Bundesministerium für Gesundheit und Soziale Sicherung durchgeführt. Auch gab die Stabsstelle ein Fact Sheet zur aktuellen Diskussion um Tabaksteuererhöhungen heraus. [6] 7. Passivrauchende Kinder in Deutschland In Deutschland lebt jedes zweite Kind in einem Haushalt, indem mindestens eine Person raucht. Jedes fünfte Kind ist bereits im Mutterleib durch Tabakrauch gefährdet. Die Stabsstelle hat eine Publikation herausgegeben, welche Gesundheitsberufe, Politiker und Journalisten die Bedeutung des Problems nahe bringen will und ihnen Handlungsempfehlungen nahe legt. Die Empfehlungen werden in den gesundheitspolitischen Diskussionsprozess um ein nationales Tabakkontrollprogramm eingebracht. [7] M050 Krebsprävention 8. Anerkennung der Stabstelle als WHO- Kollaborationszentrum für Tabakkontrolle Die Weltgesundheitsorganisation hat der Stabsstelle Krebsprävention die Anerkennung als WHO-Kollaborationszentrum für Tabakkontrolle im August 2002 ausgesprochen. Das Bundesministerium für Gesundheit und Soziale Sicherung fördert das WHO-Kollaborationszentrum mit der Schwerpunktausrichtung einer kontinuierlichen Informationsvermittlung im Bereich Tabakkontrolle, den nationalen und internationalen Austausch von Wissen und Erfahrung bezüglich wirksamer Maßnahmen in der Tabakkontrolle und der Unterstützung einer Implementierung der Framework Convention on Tobacco Control in Deutschland. Publikationen [1] Pötschke-Langer M: Rauchfrei -Kampagne als erfolgreichste Nichtraucher-Kampagne. Forum DKG 5/03 [2] Deutsches Krebsforschungszentrum, Bundesvereinigung für Gesundheit, Barmer (Hrsg): Tabakabhängigkeit und Raucherentwöhnung. Zweite überarbeitete Auflage Heidelberg, Bonn, Wuppertal, 2002 [3] Deutsches Krebsforschungszentrum (Hrsg): Die Rauchersprechstunde Beratungskonzept für Gesundheitsberufe. Dritte überarbeitete Auflage Heidelberg 2003 [4] Deutsches Krebsforschungszentrum (Hrsg): Handlungsempfehlungen für eine wirksame Tabakkontrollpolitik in Deutschland Heidelberg 2002 [5] Weltbank: Der Tabakepidemie Einhalt gebieten - Regierungen und wirtschaftliche Aspekte der Tabakkontrolle. Herausgabe der deutschen Ausgabe des Weltbankberichtes durch das Deutsche Krebsforschungszentrum, Heidelberg 2003 [6]Deutsches Krebsforschungszentrum (Hrsg): Tabaksteuererhöhungen - Fakten und Argumente. Heidelberg 2003 [7] Deutsches Krebsforschungszentrum (Hrsg): Passivrauchende Kinder - Frühe Schädigungen für ein ganzes Leben. Heidelberg 2003

221 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Übersicht Forschungsschwerpunkt Tumorimmunologie Sprecher: Prof. Dr. med. Peter Krammer Zelluläre Immunologie (D010) Prof. Dr. rer. nat. Volker Schirrmacher! , FAX V.Schirrmacher@DKFZ.de Immunchemie (D020) Prof. Dr. rer. nat. Wulf Dröge! , FAX W.Droege@DKFZ.de Immungenetik (D030) Prof. Dr. med. Peter Krammer! , FAX P.Krammer@DKFZ.de Apoptose Regulation (D040) Dr. rer. nat. Henning Walczak! , FAX H.Walczak@DKFZ.de Molekulare Immunologie (D050) Prof. Dr. rer. nat. Günter Hämmerling! , FAX G.Hammerling@DKFZ.de Tumorprogression und Tumorabwehr (D060) Prof. Dr. med. Margot Zöller! , FAX M.Zoeller@DKFZ.de Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D070) Prof. Dr. med. Dirk Schadendorf! , FAX D.Schadendorf@DKFZ.de Angeborene Immunität (D080) Dr. Adelheid Cerwenka! A.Cerwenka@DKFZ.de Der Forschungsschwerpunkt Tumorimmunologie erforscht Wachstum, Aktivierung und Regulation von Zellen des Immunsystems, um ihre Beteiligung bei Krebs, AIDS und Autoimmunkrankheiten besser zu verstehen. Immunologische, zellbiologische und molekularbiologische Methoden werden benutzt, um Diagnostik und Therapie von Tumoren des Immunsystems und anderer Krebserkrankungen verbessern zu helfen. Es ist das Ziel, die aus der engen Zusammenarbeit innerhalb des Forschungsschwerpunktes und aus nationalen und internationalen Kooperationen gewonnen Erkenntnisse der immunologischen Grundlagenforschung für den Einsatz in der Klinik zugänglich zu machen. Der derzeitige und künftige Schwerpunkt der Abteilung Zelluläre Immunologie ist die experimentelle Metastasenforschung und Immuntherapieforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Ziel der Abteilung ist die molekulare Grundlage der Tumor-Wirts-Interaktion auf verschiedenen Ebenen des Mikroenvironments (Organ- Stromazellen, Blutgefäß-Endothelzellen etc.) zu erarbeiten, um so ein besseres Verständnis für die Bedeutung bestimmter Zelladhäsionsmoleküle sowie deren Zuckerstrukturen zu erhalten. Durch Einbringen des bakteriellen lac-z-genes in Tumoreinzelzellen konnten diese anschließend im Gewebsverband durch Blaufärbung nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die Reisolierung und quantitative und qualitative FACS-Analyse sowie das Studium von Immun- Kontrollmechanismen bei Tumor-Dormancy und Tumor- Mikrometastasen Zuständen. Im Vordergrund stehen zwei Therapieverfahren, nämlich ASI (aktiv-spezifische Immuntherapie mit modifizierten Tumorvakzinen) und ADI (adoptive zelluläre Therapie mit Immunzellen). Neue Aspekte aus der Immuntherapieforschung werden in klinisch-angewandtete Forschung überführt. Die Abteilung Immunchemie erforscht regulatorische Mediatoren des Immunsystems, die Mechanismen von immunpathologischen Prozessen sowie neue therapeutische Strategien. Zu den wichtigsten klinisch-orientierten Schwerpunkten gehört die Immunpathologie der Immunschwäche AIDS und der körperliche Verfall (Skelettmuskelkatabolismus) bei Krebserkrankungen, AIDS und im Alterungsprozeß. Diese Projekte werden in Kooperation mit zahlreichen Kliniken und anderen wissenschaftlichen Institutionen unter Einsatz moderner immunologischer, biochemischer und molekular-biologischer Methoden bearbeitet. Es wird erwartet, daß die detailliertere Kenntnis der zu Grunde liegenden Mechanismen zu neuen therapeutischen Ansätzen führt. Darüber hinaus beschäftigt sich die Abteilung mit grundlegenden Untersuchungen zur Redoxregulation des Immunsystems. Schwerpunkt dieser Untersuchungen ist die Rolle des Glutathions, des Glutathion- Disulfids und des Thioredoxins in der Regulation von Transkriptionsfaktoren und Komponenten der Signalkaskade. Die Abteilung Immungenetik erforscht das Wachstum normaler und bösartig entarteter Lymphozyten. Hierbei stehen Untersuchungen über den molekularen Mechanismus der Regulation der von Lymphozyten sezernierten Wachstumsfaktoren sowie Untersuchungen über die molekularen Mechanismen des programmierten Zelltodes (Apoptose) im Mittelpunkt. Es ist das Ziel der Abteilung, die extrazellu- 221

222 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Übersicht 222 lären und intrazellulären Signale für Apoptose zu verstehen, um Apoptose dann therapeutisch gezielt in Tumorzellen einzusetzen. Der Einsatz modernster immunologischer, zellbiologischer und gentechnischer Methoden und die Kooperation zwischen Grundlagenforschung und Klinik sind nötig, um herauszufinden, warum Tumore resistent gegenüber der Induktion von Apoptose sind. Die Gruppe Apoptose Regulation konzentriert sich darauf die biochemischen Wege zu verstehen, aus denen der Zelltod durch Apoptose resultiert. Unter physiologischen Bedingungen haben Zellwachstum und Zelltod gleiche Raten. Aus diesem Gleichgewicht resultiert der Erhalt der Gewebe. Fehlregulation der Apoptose ist ursächlich für viele behandlungsbedürftige Krankheiten wie Krebs, Autoimmunerkrankungen, Schlaganfall, AIDS, Alzheimer und Parkinson. Für viele dieser Krankheiten stehen bis heute keine oder nur unzureichende Therapien zur Verfügung. Die Gruppe untersuchr das therapeutische Potential von Apoptose Induktion oder Hemmung insbesondere bei Krebsund Autoimmunerkrankungen. Die Arbeiten der Abteilung Molekulare Immunologie konzentrieren sich auf die Prozessierung und Präsentation von Antigenen. Nach neuen Erkenntnissen sind Tumorantigene in der Regel nicht auf der Zelloberfläche zu finden, sondern nur intrazellulär vorhanden, weshalb sie nicht von Antikörpern erkannt werden können. Intrazelluläre Proteine werden jedoch im Zytosol und in den Endosomen in Peptide zerlegt, die an Haupthistokompatibilitätsmoleküle (MHC) der Klassen I und II binden und an der Zelloberfläche T-Lymphozyten präsentiert werden. Die Erkennung derartiger MHC-Peptidkomplexe kann nicht nur zur Aktivierung von T-Lymphozyten führen, sondern auch zu deren Inaktivierung (Toleranz). Dieses könnte erklären, warum Tumoren häufig nicht vom Immunsystem abgestoßen werden, obwohl sie tumorspezifische Antigene besitzen. Deshalb sind weiterhin die Fragen der Toleranzinduktion und die Brechung der Toleranz für Tumoren zentrale Aspekte unserer Arbeit. Hierzu werden transgene Maussysteme eingesetzt. In einem weiteren Ansatz zur immunologischen Tumorabwehr stellen wir bispezifische Antikörper her, die in vivo körpereigene Killerzellen direkt zu den Tumoren lenken und so deren Zerstörung bewirken können. Im Focus der Forschung der Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D060) steht die Suche nach Molekülen, die für die Tumorprogression verantwortlich sind, sowie die Klärung der dem Phänomen der Metastasierung zugrunde liegenden Mechanismen. Eine therapeutische Nutzung der erzielten Ergebnisse wird vornehmlich über die Etablierung neuer Vakzinierungsverfahren angestrebt. Die klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D070) untersucht schwerpunktmäßig Fragen der Chemoresistenz und erarbeitet neue Vakzinierungsstrategien beim malignen Melanom. Daneben werden Möglichkeiten eines in vivo Gentransfers untersucht. Das angeborene Immunsystem hat das Potential Tumorzellen als fremd zu erkennen und abzuwehren. Ziel der Forschung der neu etablierten Arbeitsgruppe Angeborene Immunität (D080) ist es, die molekularen Signalketten in Immunzellen des angeborenen Immunsystems und deren Erkennungsstrukturen auf Tumorzellen zu erforschen. Diese Projekte haben das Ziel, neue Strategien zur Tumorbekämpfung durch das Immunsystem zu entwickeln.

223 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D010 Zelluläre Immunologie Abteilung Zelluläre Immunologie (D010) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Volker Schirrmacher Wissenschaftler Dr. Yvonne Adams Prof. Dr. Peter Altevogt Dr. Philipp Beckhove Dr. Yi Cao Dr. rer. nat. Jens Derbinski Dr. Philippe Fournier Dr. rer. nat. Jörn Gotter Dr. Paul Gutwein Dr. rer. nat. Mirja Hommel Prof. Dr. med. Bruno Kyewski PD Dr. Reinhard Schwartz-Albiez Dr. Rosemarie Steubing Dr. Agnes Szmolenszky Dr. Sabine Schlich Gastwissenschaftler Dr. Huije Bian (Shaanxi, China, 9/03-8/04) Doktoranden Safwan Joumaà Svenja Riedle Matthias Dolenc Richard Taubert Jana Gäbler Markus Janke Michael Erdmann Carmen Choi Maria Lulei Christoph Fiola Jochen Schwendemann Nora Sommerfeldt Alexander Stoeck Yvonne Ziouta Katrin Ehlert Daniela Gast Heidi Schabath Jana Gäbler Janna Arnold Maximilian Aigner Daniel Nummer Technische Assistenten Verena Gschwend Mariana Bucur Annette Arnold Andreas Griesbach Anette Merling Stefanie Rösch Kai Doberstein Esmail Rezavandy Auszubildende Kerstin Spirohn Caroline Muth Caroline Math Alexander Strecker Daniel Strauss Simone Jünger Die Abteilung betreibt Tumor-immunologische und Zellulär-immunologische Grundlagenforschung sowie Klinischanwendungsorientierte Forschung vor allem zu Fragen der Tumor-Immuntherapie. Es sollen molekulare Grundlagen für Interaktionen von Lymphozyten mit nicht lymphoiden Zellen des Mikroenvironments (Organ-Stromazellen und Blutgefäß-Endothelzellen) erarbeitet werden, um ein besseres Verständnis für die Bedeutung bestimmter Zelladhäsionsmoleküle und deren Zuckerstruktur bei wichtigen Zell-Zellinteraktionen während der Lymphozytenreifung und Aktivierung sowie bei ihrem Wanderungsverhalten und Homing im Organismus zu erhalten. Diese molekularen Grundlagen der Zelladhäsion und Zell- Zell-Interaktion dienen gleichzeitig einem besseren Verständnis des entarteten Verhaltens maligner Lymphozyten bei der Tumorentstehung und besonders bei der Metastasenbildung. Ein besonderer Schwerpunkt der Abteilungsarbeit ist seit jeher ein besseres Verständnis der Metastasenbildung sowie deren Verhinderung durch immunologische Abwehr. Aus dieser Zielsetzung ergibt sich eine intensive Befassung mit der Immunbiologie und Immuntherapie von Tumormetastasen, die schließlich in eine klinisch orientierte Forschung mündet. Dieses Forschungsprogramm wird in 4 Projektgruppen betrieben, die vom Abteilungsleiter und drei wissenschaftlichen Projektleitern geleitet wird. Es existiert ein ausgewogenes Verhältnis zwischen reiner Grundlagenforschung (Projekte D0102, D0103, D0104), Tumorforschung (insbesondere Metastasierung und Immuntherapie, Projekte D0101, D0102, D0104) und klinisch orientierter Forschung mit humanen Zellen und am Patienten (Projekte D0101 bis D0104). 223

224 Knochenmark und T-Zell-Immunität V. Schirrmacher Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Es gelang erstmalig der Nachweis, dass primäre T-Zell-Immunantworten autonom im Knochenmark generiert werden können [1]. Dieses passiert insbesondere gegen im Blut zirkulierende Antigene, die durch im Knochenmark residente Dendritische Zellen prozessiert werden. Die Induktion der T-Zell-Immunantworten erfordert kein Adjuvans und erfolgt auch in Abwesenheit sekundärer lymphatischer Organe, wie Lymphknoten und Milz [1]. Damit ist die klassische Lehrbuch-Aufteilung in primäre und sekundäre lymphatische Organe hinfällig, denn wir haben bewiesen, dass das Knochenmark beide Funktionen ausüben kann. Dieser Befund ist auch wichtig, weil aus den geprimten T-Zellen Gedächtnis-T-Zellen werden. T-Zell-Priming im Knochenmark hat eine besondere Bedeutung für Immunantworten gegen im Blut zirkulierende Tumorzellen und deren Tumorassoziierte Antigene (TAA) [2]. Priming von T-Zellen gegen TAA im Knochenmark führt zur Generierung von Effektor- und Memory T-Zellen, die Tumorzellen entweder zerstören oder sie in einem Stadium von Tumor-Dormancy kontrollieren können. Damit entsteht im Knochenmark ein Potential für lang anhaltende protektive Antitumor-Immunität [3-5]. Während diese Erkenntnisse zunächst an Tiertumormodellen erhoben wurden, zeigte unsere klinisch-angewandte Forschung, dass ähnliche Zusammenhänge sehr wahrscheinlich auch bei Krebspatienten im Knochenmark stattfinden. Bei einer Vielzahl unterschiedlicher Krebserkrankungen und Patienten, ließ sich die Anwesenheit antitumoraler immunologischer Gedächtniszellen in deren Knochenmark nachweisen. Adjuvante Hormon- oder Chemotherapie hatte zwar einen negativen Einfluß auf das Immunsystem [6], zerstörte aber nicht die anti-tumoralen Gedächtnis-T-Zellen im Knochenmark. Feinspezifitätsanalysen ergaben, dass die Gedächtniszellen Tumorlysate von Normalzell-Lysaten unterscheiden können, wenn diese durch dendritische Zellen präsentiert werden. Darüber hinaus reagierten die Gedächtniszellen auf definierte bekannte Tumorantigene (TAA) wie Her2/neu und MUC-1 [2], aber auch auf endogene Invasionsenzyme wie zum Beispiel Heparanase [7]. Es konnte gezeigt werden, dass die Zelloberflächenexpression und Sekretion von Heparanase Tumorangiogenese und Metastasenbildung fördert [8]. Diese Zielstruktur wurde nach unseren Analysen besonders häufig von patienteneigenen Gedächtniszellen aus dem Knochenmark erkannt [7]. Abteilung D010 Zelluläre Immunologie 2. Gedächtsniszellen und Zelltherapie-Studien V. Schirrmacher Auch zu diesem Thema wurden zunächst tierexperimentelle Studien durchgeführt. Mit Hilfe von Peptid-MHC-Tetramer-Analysen konnte die Anwesenheit von Gedächtniszellen gegen Modell-TAA wie β-galactosidase oder Ovalbumin im Knochenmark nachgewiesen werden [1]. In einem adoptiven Zelltransfer-Modell in Nacktmäusen konnte deren antitumorale Protektivität gezeigt werden [9]. Zelluläre adoptive Immuntherapie (ADI)- Versuche wurden nicht nur in autologen Tiertumormodellen sondern auch in einem allogenen Modell durchgeführt, in dem wir Graft versus Leukämie (GvL)-Effekte gegen Makrometastasen studieren. Eine ADI Therapie mit immunen T Zellen aus dem Knochenmark vorimmunisierter Donor-Tiere führte zu hervorragenden GvL Effekten. Neben immunologischen Gedächtniszellen waren daran auch vβ6 T-Zellen beteiligt, die das virale Superantigen vsag-7 erkennen und daraufhin eine durch Perforin und Granzyme B-vermittelte Apoptose in Tumorzellen einleiten [10]. Auf klinisch- angewandtem Sektor wurden wichtige neue Erkenntnisse über Gedächtniszellen im Knochenmark und über deren Reaktivierbarkeit und therapeutische Kapazität erhalten. Bei der Mehrzahl von inzwischen vielen hundert analysierter Krebspatienten (Brustkrebs, Multiples Myelom, Melanom, Pankreaskarzinom, Glioblastom) konnten antitumorale Gedächtnis-T-Zellen im Knochenmark nachgewiesen werden. Aus dem Knochenmark konnten nicht nur Gedächtniszellen sondern auch durch ein von uns neu entwickeltes Verfahren sehr effizient dendritische Zellen angezüchtet werden [11]. Diese werden für die Stimulation der Gedächtniszellen benötigt. Für die Untersuchung immuntherapeutischer Effekte in vivo mit Patienten-eigenen Zellen wurde ein neues NOD/SCID-Testmodell etabliert, das es erlaubt, frisch explantiertes Tumorgewebe mit hoher Effizienz zu transplantieren, wobei die Tumorcharakteristika des Originaltumors erhalten bleiben [12]. Es zeigte sich, dass nach Transfer von Patienten-eigenen Gedächtnis-T- Zellen, die in vitro zunächst kultiviert und expandiert wurden und anschließend mit Hilfe von Antigen- gepulsten dendritischen Zellen aktiviert wurden, diese transferierten Zellen von der Bauchhöhle an den Tumor gelangten, dort infiltrierten und im Tumor Apoptose und Nekrose-Phänomene erzeugten, so dass es zu einer Komplettremission der Tumore kam [2, 13]. Kognitive Interaktionen zwischen Gedächtniszellen und TAA-präsentierenden dendritischen Zellen aus dem Knochenmark bei Brustkrebspatientinnen zeigten eine bi-direktionale Zellstimulation, ein verbessertes Überleben und gesteigerte antitumorale Aktivität in vivo [13]. 3. Tumorvakzineforschung V. Schirrmacher Tumorzell-Dendritenzell Fusions Vakzine Während unsere bisherigen tierexperimentellen Untersuchungen vor allem an lymphoiden Tumoren durchgeführt worden waren, wurden in jüngster Zeit auch murine Mamma-Karzinome in Vakzinierungsexperimenten untersucht. Hierzu wurde eine niedrig-immunogene Ausgangslinie zunächst mit lac-z transfiziert und entweder als solche oder nach Fusion mit dendritischen Zellen (DZ) als prophylaktische Tumorvakzine getestet. Es stellte sich heraus, dass die Injektionsstelle der Ohrmuschel allen anderen Injektionsstellen in Bezug auf Induktion einer Immunantwort überlegen war. Die Fusion mit dendritischen Zellen wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt und vergleichend validiert. Elektro-Fusion wie auch PEG-vermittelte Fusion führten zu ähnlichen Resultaten. Die Immunogenität der Ausgangsvakzine konnte mit beiden Methoden der DZ-Fusion entscheidend verbessert werden [14]. Virus-modifizierte Tumorvakzine ATV-NDV und Wirkmechanismus von NDV Auf dem Gebiet der humanen Tumorvakzine-Forschung konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus unserer Zwei-Komponenten Vakzine ATV-NDV. Diese besteht aus frisch isolierten, intakten, autologen Tumorzellen, die durch γ-bestrahlung inaktiviert werden (ATV) und die durch Infektion mit dem

225 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie apathogenen Newcastle Disease Virus (NDV, Stamm Ulster) infiziert werden. Nach Klonierung der beiden viralen Spike-Proteine HN und F und Herstellung von c-dna Transfekanten gelang uns vor kurzem der Nachweis, dass das HN nicht aber das F-Molekül in mononukleären Zellen von humanem Blut eine starke Interferon-α Antwort erzeugt [15] und das Molekül TRAIL hochreguliert [16]. Durch Mutagenisierungsexperimente gelang weiterhin eine Aufklärung der Domänen innerhalb des HN-Moleküls, die für die Induktion der Interferon-α Antwort wichtig sind. Es stellte sich heraus, dass die Lektin-Bindungsdomäne [17] und in dieser insbesondere die Position Serin 200 [18] von Bedeutung für die Interferon-Antwort ist. Murine wie auch humane Monozyten konnten durch NDV über Interferon und TRAIL zu antitumoraler Zytotoxizität aktiviert werden [16]. NDV zeigte auch im Zusammenhang mit einer Dendritenvakzine einen potenzierenden Effekt [19]. Interferonα konnte sowohl durch das virale HN Molekül, wie auch nach Virus-Infektion von Tumorzellen, durch dsrna induziert werden [20]. Die Daten legen nahe, dass die Infektion von Tumorzellen durch NDV vom Immunsystem als ein Gefahrensignal wahrgenommen wird und dass es daraufhin zu einer verbesserten Interaktion zwischen Zellen der natürlichen und der spezifischen Immunabwehr kommt. Aus diesen, unser Konzept unterstützenden Gründen, wird die autologe Virus-modifizierte Tumorvakzine ATV-NDV in der klinischen Anwendung weiter evaluiert. Nicht nur bei Brustkrebs, sondern auch beim Glioblastom wurden inzwischen vielversprechende Resultate infolge Anwendung dieser Vakzine erhalten [21]. Bispezifische Antikörper Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden gelang es uns, in dem Berichtszeitraum bispezifische Bindungsmoleküle herzustellen, die mit einem Arm an das HN Molekül der Virusmodifizierte Tumorvakzine binden und mit dem anderen Arm Komponenten des Immunsystems aktivieren. Zur Zeit werden 4 Produkte in größeren Mengen hergestellt, Reinigungsverfahren evaluiert und die funktionelle Aktivität in vitro untersucht. Die neuen Konzepte der Anti-Tumor-Vakzinierung wurden in verschiedenen Buchbeiträgen vorgestellt [22-25]. 4. Klinische Studien V. Schirrmacher In zwei Reviews wurden unsere bisherigen Erfahrungen klinischer Studien mit der Tumorvakzine ATV-NDV zusammengefasst. In 9 Phase II-Studien zeigte sich ein positiver Effekt auf das Gesamtüberleben [24, 25]. Die Effekte der Vakzine auf das antitumorale immunologische Gedächtnis wurden ebenfalls zusammengefasst und deren Aktivierung als Erklärung für die Immunkontrolle residualer Tumorzellen herangeführt [24]. Die Auswertung einer neuen Antitumor- Vakzinierungsstudie von 24 Patienten mit Glioblastoma-Multiforme zeigte deutliche Vakzine-induzierte Antitumor-Immunantworten und eine signifikante Verbesserung der Prognose der so behandelten Patienten [21]. Desweiteren wurde eine weltweit neuartige adoptive Zelltherapie-Studie iniziiert mit Patienten-eigenen reaktivierten immunologischen Gedächtniszellen aus dem Knochenmark. Diese Phase I Studie wird an vorher typisierten austherapierten Brustkrebspatientinnen als Pilotstudie evaluiert. Die Studie gilt als logische Fortsetzung, nachdem bereits gezeigt worden ist, dass derartige Zellen in vivo therapeutische Aktivität in einem NOD/SCID autologen Tumor-Xenotransplantat Modell aufweisen [2]. Abteilung D010 Zelluläre Immunologie 5. DNA Vakzinierungen in einem Infektionsmodell V. Schirrmacher Die vorher mit einem Modell-Antigen erhobenen Befunde der DNA-Vakzinizerung wurden kürzlich in einem Infektionsmodell einer Wurmerkrankung mit Schistosomen erprobt. Von Schistosomen konnten drei Verdauungsenzyme, nämlich Asparaginyl-Endopeptidase [26], Aspartic-Proteinase [27] und Elastate [28] erfolgreich kloniert werden. Nach DNA-Vakzination in der Ohrmuschel wurden in Mäusen jeweils hoch spezifische Antikörper generiert. Diese gegen definierte Wurm-Proteine hergestellten Antikörper waren für diagnostische Zwecke besser geeignet als herkömmlichen Reagentien. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Feuerer M., Beckhove, P., Mahnke Y., Schwendemann, J., Hommel M., Bai L., Kyewski, B., Umansky V. and Schirrmacher V.: Bone marrow as a priming site for T cell responses to blood-borne antigen. Nature Medicine, 9: (2003). [2] Feuerer, M., Beckhove, P., Bai, L., *Solomayer, E.F., *Bastert, G., Diel, I.J., *Heep, J., *Oberniedermayr, M., Schirrmacher V., Umansky, V.: Therapy of human tumors in NOD/SCID mice with patient derived re-activated memory T cells from bone marrow. Nature Medicine 7 (4): (2001). [3] Mahnke Y.D., Schirrmacher V.: T cell memory to cell-bound antigen. Proceedings of the second international conference on tumor microenvironment, progression, therapy and prevention. S (2002). [4] Schirrmacher, V. Feuerer, M., Beckhove, P., *Ahlert, T., Umansky, V.: T cell memory, anergy and immunotherapy in breast cancer. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, Apr. 7 (2): (2002). [5] V. Schirrmacher: Immuntherapie von Karzinomen? Editorial Dtsch. Ärztebl. 99: A (2002) [6] *Solomayer, E.-F., Feuerer M., Bai, L., Umansky, V., *Meyberg, G.C., *Bastert G., Schirrmacher V., *Diel I.J.: Influence of adjuvant hormone therapy and chemotherapy on the immune system analysed in the bone marrow of patients with breast cancer. Clin. Cancer Res., 9: (2003). [7] Schirrmacher V., Sommerfeldt, N.: Specific memory T-lymphocytes in cancer patients recognizing peptides from Heparanase expressed by metastatic cancer cells.(in preparation) [8] *Goldshmidt, O, *Zcharia, E., *Abramovitch R, *Metzger, S., *Aingorn, H., *Friedmann, Y., Schirrmacher, V., *Mitrani, E., *Vlodavsky I.: Cell surface expression and secretion of heparanase markedly promote tumor angiogenesis and metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci., 99: (2002). [9] Mahnke Y. and Schirrmacher V.: A novel tumor model system for the study of long term protective Immunity and immune T cell memory. Cellular Immunol., 221: (2003) [10] Müerköster, S., Weigand M.A., Walczak H., Schirrmacher V., Umansky V.: Superantigen reactive Vβ6+ T cells induce perforin/ granzyme B mediated caspaseindependent apoptosis in tumor cells. Brit. J. Cancer 86: (2002) [11] Bai L., Feuerer M., Beckhove P., Umansky V. and Schirrmacher V.: Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to perhipheral blood monocyte derived cells. Int. J. Oncol. 20: (2002). [12] Beckhove P., Schütz F., *Diel I.J., *Solomayer E.-F., *Bastert G., *Förster J. *Oberniedermayr M., Feuerer M., Bai L., Umansky V., and Schirrmacher V.: Efficient engraftment of human primary breast cancer transplants in NOD/SCID mice. Int. J. Cancer, 105: (2003) 225

226 226 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie [13] Bai, L., Beckhove, P., Feuerer, M., Umansky, V., *Solomayer, E.F., *Diel, I.J. and Schirrmacher V.: Cognate interactions between memory T cells and tumor antigen presenting dendritic cells from bone marrow of breast cancer patients: bi-directional cell stimulation survival and anti-tumor activity in vivo. Int. J. Cancer, 103: (2003) [14] M. Lindner and V. Schirrmacher: Tumor cell dendritic cell fusion for cancer immunotherapy: comparison of therapeutic efficiency of polyethylen-glycol versus electro-fusion protocols. Eur. J. Clin. Invest. 32: (2002) [15] Zeng J., Fournier, P. and Schirrmacher, V. Induction of interferon a and TRAIL in human blood mononuclear cells by HN but not F protein of Newcastle Disease Virus. Virology, 297:19-30, [16] Washburn, B., Weigand, M.A., Grosse-Wilde A., Sprick, M.R., Schirrmacher V. and Walczak H.: TNF-related apoptosisinducing ligand mediates tumoricidal activity of human monocytes stimulated by Newcastle Disease Virus. J. Immun., Feb. 15; 170 (4): (2003). [17] Zeng, J., Fournier, P., Schirrmacher, V.: stimulation of human natural interferon-α response via paramyxo-virus hemagglutinin lectin-cell interaction. J. Molec. Med., 80: (2002). [18] Fournier, P., Zeng, J., *Von der Lieth, C.W., Washburn, B., Ahlert, T. and Schirrmacher V. Importance of serine 200 for functional activities of the hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle Disease Virus. Int. J. Oncol., in press. [19] Bai, L., *Koopmann, J., Fiola, C., Fournier, P., Schirrmacher V.: Dendritic cells pulsed with viral oncolysates potently stimulate autologous T cells from cancer patients. Int. J. Oncol. Oct. 21: (2002). [20] Fournier P., J.Y. Zeng and V. Schirrmacher: Two ways to induce innate immune responses in human PBMCs: Paracrine stimulation of IFN-a responses by viral protein or dsrna. Int. J. Oncol. 23: (2003) [21] *Steiner, H.H., *Bonsanto, M.M., Beckhove, P., Brysch, M., *Schuele-Freyer, R., *Geletneky, K., *Kremer, P., *Golamrheza, R., *Bauer H., *Kunze S., Schirrmacher, V., *Herold-Mende C.: Anti-tumor vaccination of patients with glioblastoma multiforme in a case-control study: Feasibility, safety and clinical benefit. Submitted. [22] Washburn, B. and Schirrmacher V.: Human tumor cell infection by Newcastle Disease Virus leads up to upregulation of HLA and cell adhesion molecules and to induction of interferons, chemokines and finally apoptosis. Int. J. Oncol. 21: 85-93, [23] Schirrmacher, V. Feuerer, M., Beckhove, P., *Ahlert, T., Umansky, V.: T cell memory, anergy and immunotherapy in breast cancer. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, Apr. 7 (2): (2002). [24] Schirrmacher V.: Anti-tumor immune memory and its activation for control of residual tumor cells and improvement of patient survival. In: Virus therapy of human cancers. (Sinkovics J., Horvath J. eds., Marcel Decker Monograph in press.) [25] Schirrmacher V.: Improvements of survival in nine phase II clinical studies with different types of cancer upon anti-tumor vaccination with an autologous tumor cell vaccine modified by virus infection to introduce danger signals. In: New trends in Cancer for the 21st Century. (Editors A. Llombart-Bosch and Vincente Felipo) Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 532, pp , Publishers Kluwer Academic (Plenum Publishers. (2003). [26] Chlichlia K., *Bahgat M., *Ruppel, A., Schirrmacher V.: DNA vaccination with asparaginyl endopeptidase (Sm32) from the parasite Schistosoma mansoni: anti-fecundity induced in mice. Vaccine, 20: (2002). [27] Chlichlia, K., *Bahgat, M., Schirrmacher, V., *Ruppel A.: Species-restricted antibody response against a DNA-construct coding for aspartic proteinase from Schistosoma japonicum. Parasitol. Res., 88: (2002). Abteilung D010 Zelluläre Immunologie [28] *Bahgat, M., Chlichlia, K., Schirrmacher, V., *Ruppel A.: Antibodies induced in mice by a DNA-construct coding for the elastase of Schistosoma mansoni recognize the enzyme in secretions and preacetabular glands of cercariae. Parasitol. 124: , [29] Schirrmacher, V., Umansky V., Lindner, M., Müerköster, S. and Rocha M.: Models for immunotherapy and cancer vaccines. (In: The Cancer Handbook) Macmillan Publ. Ltd., M. Alison and G. Nicolson, ed. Vol. 2 p 1055 (2002). [30] Chlichlia, K., Los M., *Schulze-Osthoff, K., *Gazzolo, L., Schirrmacher V. and *Khazaie, K.: Redox Events in HTLV-1 Taxinduced apoptotic T cell death. Forum Review Article. Antioxidants & Redox Signalling Vol. 4, 3: (2002). [31] Schirrmacher V.:, Tumorimmunologie In: Grundlagen der Komplementär-Onkologie. J. Beuth, Hrsg. Hippokrates, (2002). [32] Schirrmacher V.: Tumorvakzinierung und antikörpervermittelte Immuntherapien. In: Grundlagen der Komplementär-Onkologie. J. Beuth, Hrsg. Hippokrates, (2002). [33] Schirrmacher V.: Möglichkeiten einer T-Zell-vermittelten Immuntherapie bei Hirntumoren. Brainstorm (9), Die Rolle von Zelladhäsion und Migration bei Lymphozyten-Homing und Tumor- Metastasierung. P. Altevogt, S. Schlich, P. Gutwein In Kollaboration mit Mina Fogel, Kaplan Hospital Rehovot, Israel; Vance Lemmon, Universität Miami, Florida, USA; Glen Kristansen Charité, Berlin.; Jörg Reichrath, Dermatologische Klinik Universität des Saarlandes, Homburg; Brigitte Schmitz, Universität Bonn; Martin Deichmann, Dermatologische Klinik Universität Heidelberg; Hanswalter Zentgraf, DKFZ; Lutz Edler, DKFZ. Tumorzellen benutzen für Tumormetastasierung und Invasion ähnliche molekulare Mechanismen der Migration und Proteolyse wie Immunzellen bei der Immunüberwachung des Körpers. Wir untersuchen die Funktion des humanes L1 Adhäsionsmoleküls und des CD24, eines Liganden für P- Selektin, bei der Zellmigration und Adhäsion von Karzinomzellen. Unser Hauptaugenmerk gilt der Funktion von L1 und seiner proteolytischen Spaltung durch die Metalloproteinase ADAM10 bei Karzinomen der Eierstöcke und der Gebärmutter. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Barth,T.F.E., *Rinaldi, N., *Brüderlein, S., *Mechtersheimer, G., *Sträter,J., Altevogt, P., *Möller, P.: Mesothelial cells in suspension expose an enriched integrin repertoire capable of capturing soluble fibronectin and laminin. Cell Commun. Adhes. 9: 1-14 (2002) [2] Gutwein, P., Mechtersheimer,S., Riedle,S., Stoeck,A., Gast,D., Joumaa,S., *Zentgraf,H., Fogel,M. and Altevogt,P.: ADAM10-mediated cleavage of L1 adhesion molecule at the cell surface and in released membrane vesicles. FASEB J.17:292-4 (2003). [3] *Fogel, M., Mechtersheimer, S., *Smirnov, A.,*Husar, M., *Abu-Dahi, A., *Tilgen, W., *Reichrath, J., *Georg, T., Altevogt,P. and Gutwein, P.: L1 adhesion molecule (CD 171) in development and progression of human malignant melanoma. Cancer Lett.189: (2003) [4] *Phong,M.-C., Gutwein,P., *Kadel,S. Hexel,K., Altevogt,P., *Linderkamp,O., and *Brenner,B.: Molecular mechanisms of L- selectin-induced colocalization: rafts and shedding. BBRC, 300: (2003) [5] *Ohl, C., *Albach, C., Altevogt, P. and *Schmitz, B.: N- Glycosylation patterns of HSA/CD24 from different cell lines and brain homogenates: A comparison. Biochimie, 85: (2003)

227 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie [6] *Fogel, M., Gutwein, P., Mechtersheimer, S., Riedle, S., Stoeck, A., *Smirnov, A., *Edler, L., *Ben-Arie, A., *Huszar, M. and Altevogt, P.: L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas The Lancet, 362: (2003) [7] *Deichmann, M., *Kurzen, H., *Egner, U., Altevogt,P., and *Hartschuh, W.: Adhesion molecules CD171 (L1CAM) and CD24 are expressed by primary neuroendocrine carcinomas of the skin (Merkel cell carcinomas). J Cutan Pathol. 30: (2003) [8] *Kristiansen, G, *Winzer, K.-J., *Mayordomo, E., *Bellach, J., *Schlüns, K., *Denkert, C., *Dahl, E., *Pilarsky, C., Altevogt, P., *Guski, H., and *Dietel, M.: CD24 Expression is a New Prognostic Marker in Breast Cancer. Clin. Cancer Res. 9: (2003) T-Zell Differenzierung / T-Zell Toleranz / T-Zell Aktivierung B. Kyewski Kooperationspartner: T. Boon, Ludwig Institute for Cancer Research, Brüssel, Belgien; L. Klein, Institute for Molecular Pathology (IMP), Wien, Österreich; E. Peltonen, Dep. of Human Genetics, University of Helsinki, Finnland; J. Walter, Institut für Genetik, Universität des Saarlandes, Saarbrücken Gefördert durch die DFG (SFB 405, Teilprojekt A8) und die Mildred Scheel Stiftung. Intrathymische Selbsttoleranz gegenüber ektopisch exprimierten, Gewebe-spezifischen Selbstantigenen: Regulation und Spezieskonservierung J. Arnold, J. Derbinski, J. Gäbler, J. Gotter, R. Taubert Die Unterscheidung zwischen Selbst und Fremd (Selbsttoleranz) ist eine grundlegende Eigenschaft des Immunsystems. Die Induktion von Selbsttoleranz wird durch verschiedene Mechanismen, die sowohl im Thymus (zentrale Toleranz) als auch in peripheren lymphoiden und nicht-lymphoiden Organen (periphere Toleranz) wirksam sind. Während im Thymus Toleranz gegen übiquitäre Selbstantigene stattfindet, wurde bislang angenommen, dass periphere Toleranzmechanismen für Toleranz gegenüber Organ-spezifischen Selbstantigenen verantwortlich sind. Aufgrund unserer Beobachtung, dass bestimmte Gewebe-spezifische Antigene im Thymus exprimiert werden, muss die gängige Vorstellung revidiert werden, dass intrathymische Toleranz sich nur auf eine Gruppe von prävalenten Selbstantigenen beschränkt. Im Laufe dieser Studien haben wir sowohl im Maus als auch im Humanthymus medulläre Epithelzellen als einen speziellen Zelltyp identifiziert, der ein weites Spektrum an Gewebe-spezifischen Antigenen exprimiert. Dieses als promiskuöse Genexpression (promiscuous gene expression) bezeichnetes Phänomen ist eine autonome Eigenschaft der Epithelzellen. Diese Genexpression ist ausgehend von der pränatalen Periode im adulten Thymus voll erhalten, solange der Thymus reife T-Zellen exportiert. Die Expression bestimmter Gene ist jeweils auf wenige medulläre Epithelzellen (< 3%) beschränkt, die in situ vorwiegend in Clustern lokalisiert sind. Interessanterweise sind Gene von Organen ganz unterschiedlicher Größe in ähnlicher Frequenz im Thymus repräsentiert [1, 2]. Diese Befunde sind zwischen Mensch und Maus hoch konserviert [5]. Diese Ergebnisse legen nahe, daß ektopische Expression im Thymus ein biologischer Mechanismus ist, um zentrale T-Zell Toleranz gegenüber bestimmten Gewebe-spezifischen Selbstantigenen zu gewährleisten. Auf diese Weise könnte Selbsttoleranz gegen Antigene erreicht werden, die räumlich oder zeitlich vom Immunsystem getrennt Abteilung D010 Zelluläre Immunologie sind. Die Analyse von globaler Genexpression mittels Gen- Chips zeigt jedoch, daß die Auswahl der ektopisch exprimierten Gene sich nicht auf solche Selbstantigene beschränkt, für die eine solche immunologische Notwendigkeit nahe läge. Sie schließt auch Selbstantigene ein, die erst in der Pubertät oder Schwangerschaft auftreten. Damit ist ein bislang unverstandenes Phänomen, nämlich Selbsttoleranz gegenüber späten, postnatalen Selbstantigenen erklärbar. Die Abbildung des immunologischen Selbst ist somit umfassender als bisher angenommen. Interessanterweise sind auch sog. cancer germline genes ektopisch im menschlichen Thymus exprimiert. Von dieser Gengruppe wurde bisher angenommen, dass sie nur in männlichen Keimzellen und diversen Tumoren, insbesondere Melanomen exprimiert werden. Dieses eingeschränkte Expressionsmuster hat u.a. dazu geführt, dass diese Tumorantigene bevorzugt in derzeitigen klinischen Studien zur aktiven Tumor-spezifischen Immunisierung eingesetzt werden. Aufgrund der Expression im Thymusepithel ist jedoch davon auszugehen, dass partielle Toleranz gegenüber diesen Antigenen besteht, was ihre Eignung als Zielstrukturen für Tumor-spezifische Immunintervention möglicherweise einschränkt. Die molekularen Mechanismen, die dieses ektopische Expressionsmuster determinieren, sind derzeit noch weit gehend unverstanden. Verschiedene Befunde deuten darauf hin, dass es sich wahrscheinlich um eine random de-repression von Genexpression handelt. Ektopisch exprimierte Gene zeigen keine erkennbaren strukturellen, oder funktionellen Gemeinsamkeiten. Das Genexpressionsmuster ist entkoppelt von Entwicklungs-, Gewebe- und Geschlechts-spezifischen Kontrollmechanismen. Interessanterweise sind die Gene jedoch im Genom in zusammenhängenden Clustern von 10 und mehr Genen angeordnet. Diese und andere Befunde legen nahe, dass epi-genetische Steuerung an der Selektion diese Genpools beteiligt ist. Ektopische Expression Gewebe-spezifischer Gene ermöglicht somit umfassende Repräsentanz und damit Selbsttoleranz von Selbststrukturen im Thymus, die für das Überleben der Spezies notwendig war. Bei der Konzeption von Tumor-spezifischen Immuntherapien sollten diese neuen Einsichten aus der Grundlagenforschung nicht unberücksichtigt bleiben. Antigen-spezifische T-Zell Aktivierung in situ M. Hommel T-Zell Erkennung erfolgt über die Bindung des Antigenspezifischen T-Zell-Rezeptors an einen spezifischen Peptid/ MHC Komplex auf Antigen-präsentierenden Zellen. Die zeitliche und räumliche Verfügbarkeit dieser spezifischen Komplexe in situ reguliert T-Zell Erkennung und damit T-Zell Biologie in vivo. Die Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort (sog. adaptive Immunantwort) setzt voraus, daß antigen-spezifische T-Zellen Peptide fremder Antigene, präsentiert von dendritischen Zellen in den T-Zell Arealen sekundärer lymphoider Organe, erkennen und daraufhin aktiviert werden. Die genaue in situ Charakterisierung dieser interzellulären Erkennung steht noch aus. Mittels adoptiven Transfers konnten wir anhand verschiedener Modellantigene zeigen, daß klonale Expansion Antigenspezifischer T-Zellen im Kontakt mit Antigen-präsentierenden Zellen initiiert wird. Diese Analysen basieren auf der ex vivo Isolation von multizellulären Clustern von T-Zellen und dendritischen Zellen, die die funktionelle in situ Einheit der Antigen-spezifischen 227

228 228 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie T-Zell Aktivierung darstellen [3]. Diese zunächst in peripheren Lymphknoten erhobenen Befunde konnten jüngst auch auf das Knochenmark, einem primären lymphoiden Organ ausgedehnt werden [4]. Die Isolation solcher multizellulärer Funktionseinheiten wird die eingehende molekulare Charakterisierung der frühen T-Zell Aktivierung ermöglichen und neue methodische Ansätze wie Intravital-Mikroskopie ergänzen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Derbinski, J.; Schulte, A.; Kyewski, B.; Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nature Immunology 2 (2001) [2] Kyewski, B.; Derbinski, J.; Gotter, J.; Klein, L. Promiscuous gene expression and central tolerance: more than meets the eye. Trends in Immunology 23 (2002) [3] Hommel, M.; Kyewski, B. Dynamic changes during the antigen-specific immune response in T cell-apc clusters isolated ex vivo from lymph nodes. Journal of Experimental Medicine 197 (2003) [4] Feuerer, M.; Beckhove, P.; Garbi, N.; Mahnke, Y.; Limmer, A.; Hommel, M.; Hämmerling, G.J.; Kyewski, B.; Hamann, A.; Umansky, V.; Schirrmacher, V. Bone marrow as a priming site for T cell responses to blood-borne antigen. Nature Medicine 9 (2003) [5] Gotter, J.; Brors, B.; Hergenhahn, M.; Kyewski, B. Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes co-localized in chromosomal clusters. Journal of Experimental Medicine 199 (2004) Struktur und Funktion von Adhäsions- und Differenzierungsmolekülen auf normalen und malignen Lymphozyten und hämatopoetischen Vorläuferzellen (D0104) R. Schwartz-Albiez, R. Steubing, Y. Cao, A. Merling In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr.W.Bergler (HNO Klinik, Klinikum Mannheim/St.Josephs Klinikum, Bremen), Prof.Dr.P.Crocker (University of Dundee, UK), Prof. Dr.H.-J.Groß (Universitätsklinikum Ulm), Prof.Dr.Dr.Keller (TU Aachen), Prof.Dr.A.D.Ho, Dr.T.Möhler (Poliklinik, Universitätsklinikum Heidelberg), Dr.M.Punzel (Universitätsklinikum Düsseldorf), Prof.Dr.F.Sanchez-Madrid Universität Madrid, Spanien), PD Dr. U.Karsten, Max-Delbrück Zentrum, Berlin, Dr. Chitra Mandal, Dr.M.Chatterjee, (Department of Biological Sciences, Indian Institute of Chemical Biology, Calcutta, Indien). DKFZ intern: Dr.W. von der Lieth, Zentrale Spektroskopie, Dr.T.Kempf, Dr.M.Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik, Dr.H.Spring, Strukturelle Genanalyse, Dr.R.Pipkorn, Peptidsyntheseeinheit Zusatzfinanzierung: Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim, BMBF Projekt Glykotechnologie, SFB 544 (Kontrolle tropischer Infektionskrankheiten) Abteilung D010 Zelluläre Immunologie Aufgabe dieser Arbeitsgruppe ist es, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion hochglykosylierter Oberflächenmoleküle auf humanen normalen und malignen Lymphozyten sowie auf hämatopoetischen Vorläuferzellen zu klären. Diese Makromoleküle stellen Kontakte zu anderen Zellen und zu Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) her und sind an der Regulation der Zellreifung und des Wachstums in spezifischen Geweben beteiligt. Wir untersuchen die Wechselbeziehungen zwischen oberflächenständigen Oligosaccharidstrukturen und kohlenhydratbindenen Proteinen (Lektinen). Solche Kohlenhydrat-Proteininteraktionen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei Infektionen mit Leishmanien und Plasmodien, den Erregern der Leishmaniose (Kalaazar) und Malaria. In diesem Teilprojekt sollen die jeweiligen Zielstrukturen genau charakterisiert und strukturanaloge Mimetika entwickelt werden, die langfristig prophylaktisch und therapeutisch einsetzbar sind. Oberflächenständige Sialoglykane (neuraminsäurehaltige Oligosaccharidstrukturen) auf hämatopoetischen Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Apoptose von Lymphozyten und können als Tumormarker eingesetzt werden. Sie werden in unterschiedlicher Weise während der Lymphozytendifferenzierung exprimiert, wobei ihre Regulation von mehreren Enzymsystemen bestimmt wird. Ein definiertes B-Lymphozyten-spezifisches Lektin (CD22), welches an der Regulation der B-Zellaktivierung beteiligt ist und eine bestimmte Gruppe von Sialoglykanen erkennt, wurde auf seine Funktion unter physiologischen Bedingungen untersucht. Wir fanden mehrere molekulare Mechanismen, die die Bindungsfähigkeit von CD22 beeinflussen: zum einen wird durch die Eigensialylierung von CD22 die Lektinfunktion herunterreguliert, zum anderen kann ein bestimmtes Arrangement der Sialoglycanliganden die Bindung auf der Zielzelle verändern. Sialylierte Serumglykoproteine verhindern, daß CD22-vermittelte Adhäsionsprozesse im peripheren Blut stattfinden [1]. Die Sialylierungsreaktionen werden zum Teil über eine von uns charakterisierte zelloberflächenständige Sialyltransferase reguliert [2]. Diese Sialyltransferase wird unterschiedlich in normalem Lebergewebe und Lebertumorzellen exprimiert, und von uns entwickelte monoklonale Antikörper gegen dieses Enzym können histologisch als Marker eingesetzt werden [2]. Humane hämatopoetische Stammzellen existieren in sogenannten Stammzellnischen im Knochenmark. Die enge Wechselwirkungen zwischen der extrazellulären Matrix, Stromazellen anderen hämatopoetischen Zellen und löslichen Faktoren (Zytokinen) regulieren sowohl den Erhalt des Stammzellpools als auch gleichzeitig die kontrollierte Proliferation und Differenzierung bis hin zu den reifen Blutzellen. Diese Interaktionen werden über membranständige Adhäsionsrezeptoren vermittelt, die differentiell während verschiedener Reifungsstadien der Stammzellen exprimiert werden. Auch bei diesen Adhäsionsmolekülen sind Lektine beteiligt. Hochpolymere Kohlenhydratstrukturen, wie Heparansulfate mit spezifischen Seitengruppen sind an der Regulation der Proliferation und Differenzierung humaner hämatopoetischer Stammzellen beteiligt. Mit Hilfe regioselektiv modifizierter Polysaccharide können diese Effekte simuliert werden und für die ex vivo Expansion humaner pluripotenter Stammzellen ausgenutzt werden [Deutsche Patentanmeldung]. Hochglycosylierte, neuraminsäurehaltige (sialylierte) Glycoproteine und Glycolipide auf der Zelloberfläche können das Adhäsionsverhalten sowohl negativ auf Grund ihrer hohen negativen Ladung als auch postiv über spezifische Reaktionen mit Lektinen beeinflussen. Wir haben das CD60 Antigen in zwei Varianten definiert: als CD60b wurde die 9-O-acetylierte Form einer Disialo-Oligosaccharidsequenz auf der Basis des Gangliosids GD3 bestimmt, als CD60c die entsprechende 7-O-acetylierte Variante. Beide Oligosaccharide haben Funktionen bei der Adhäsion von Lymphozyten an ECM Komponenten und sind gleichzeitig in unterschiedlicher Weise an der Regulation der Aktivierung bzw Apoptose von Lymphozyten beteiligt [3,4]. Auf hämatopoetischen Stammzellen wurde mehrere neue Marker charakterisiert, bei denen es sich um definierte Oligo-

229 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie saccharidteile bestimmter Oberflächen-Glykoproteine handelt. Die Oligosaccharidsequenzen waren bisher als Histo- Blutgruppen bekannt, wie die Blutgruppe H Typ 2 (CD173), Lewis Y (CD174), das Thomsen-Friedenreich Antigen (CD176) und das T-Nouvelle Antigen (Tn, CD175). Diese Marker sind auf hämatopoetischen Vorläuferzellen verschiedener Linien und z.t. auf leukämischen Vorläuferzellen exprimiert [5,-9]. Adhäsionsprozesse werden zum einen über die oberflächenständigen Adhäsionsmoleküle vermitteln, zum anderen im Zellinneren über Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine weitergeleitet, die außerdem die Morphologie der adhärierenden Zellen mitverändern. Ein Schlüsselmolekül des Zytoskeletts für Adhäsionen von T-Lymphozyten und myeloische Zellen ist das Phosphoprotein MOESIN, welches bei der Ausbildung sogenannter Uropoden auf aktivierten T Lymphozyten beteiligt ist [10]. Der Erreger der visceralen Leishmaniose Leishmania donovani ist in der Lage, bestimmte sialylierte Strukturen seines Wirtes auf seiner Oberfläche zu adsorbieren [11]. Dieser Prozeß könnte dem Erreger den Eintritt in die Wirtszellen erleichtern und gleichzeitig vor einer Immunabwehr schützen. Entsprechende funktionelle Untersuchungen werden zur Zeit durchgeführt. Erythrozyten, die mit dem Malariaerreger Plasmodium falciparum infiziert sind, können sich an Gefäßendothel oder an Plazentagewebe anlagern. Dort können sie zu den schweren Erkrankungen der cerebralen bzw maternalen Malaria beitragen, in dem die angehefteten infizierten Erythrozyten den Stofftransport durch Blutgefäße bzw Plazenta erschweren. Rezeptoren auf der Erythrozytenmembran heften sich spezifisch an negativ geladene Polysaccharide der Wirtszelle. Mit Hilfe löslicher Strukturanaloga ist es uns bereits gelungen, diese Interaktionen der Malariaerreger zu unterbinden. Weitere Arbeiten sollen einerseits zur genauen Charakterisierung der Bindungsmodalitäten zum anderen zur Entwicklung eines Medikamentes führen, welches zur Verhinderung der maternalen Malaria beitragen soll. Publikationen (* = externer Koautor) [1] H.J.Groß*, A.Merling, H.Klein*, O.T.Keppler*, R.Schwartz- Albiez. Binding of sialylated CD22 to cell surface sialoglycans on human lymphocytes. Zur Publikation eingereicht. [2] Y.Cao, A.Merling, P.R.Crocker*, R.Keller*, R.Schwartz- Albiez. Differential expression of beta-galactoside alpha2,6 sialyltransferase (ST6GalI) and sialoglycans in normal and cirrhotic liver and hepatocellular carcinoma, Lab Invest 82, , [3] C.Claus*, A.Gocht*, R.Schwartz-Albiez, H.Lünsdorf*, B.Kniep*. CD60:Specificity of the antibodies, distribution of the antigens, and the functional aspects. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz-Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, [4] Erdmann, M., Vlasak, R*., Kniep, B.*, Bergler, W.*, Schwartz-Albiez, R., Different roles of CD60b and CD60c as activation mediators on human tonsillar lymphocytes, Zur Publikation eingereicht. [5] R.Schwartz-Albiez. Carbohydrate and Lectin: Section Report. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz-Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, [6] Y.Cao, A.Merling, U.Karsten*, R.Schwartz-Albiez. The fucosylated histo-blood group antigens Lewis Y and H type 2 (blood group O) are expressed on CD34+ haematopoietic progenitors. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz- Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, Abteilung D010 Zelluläre Immunologie [7] Y.Cao, U.Karsten*, R.Schwartz-Albiez. Expression of Thomsen-Friedenreich-related carbohydrate antigens on human leukemia cells. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz-Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, [8] B.Kniep*, K.Schäkel*, R.Schwartz-Albiez, M.Nimtz*. Different binding characteristics of the alpha2-6sialoglycan specific antibodies. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz- Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, 2002 [9] B.Kniep*, R.Schwartz-Albiez. Antibodies detecting type 2 chain glycolipids. In: Leucocyte Typing VII (eds. D.Mason, R.Schwartz-Albiez et al.), Oxford University Press, Oxford, [10] J.M.Serrador*, M.Vicente-Manzanres*, J.Calvo*, O.Barreiro*, M.C.Montoya,* R.Schwartz-Albiez, H.Furthmayr*, F.Lozano*, F.Sanchez-Madrid*. A novel serinerich motif in the intercellular adhesion molecule 3 is critical for its ERM-directed subcellular targeting. J. Biol. Chem. 277, , [11] Chatterjee, M*, Chava, A.K.*, Kohla, G., Pal, S*., Merling, A., Hinderlich, S*., Unger, U.*, Strasser, P*., Gerwig, G.J*., Kamerling, J.P*., Vlasak, R.*, Crocker, P.*, Schauer, R.*, Schwartz-Albiez, R., Mandal, C*. Identification and characerization of adsorbed serum sialoglycans on Leishmania donovani promastigotes, Glycobiology 13, ,

230 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D020 Immunchemie 230 Abteilung Immunchemie (D020) Leiter: Prof. Dr. Wulf Dröge Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Heiner Fritze (ohne Vergütung) Dr. Wulf Hildebrandt Dr. Holger Krakowski-Roosen Dr. Volker Lehmann Dr. Thomas Schmitt Gastwissenschaftler Dr. Alexander Skorokhod (Ukraine, -10/04) Doktoranden Oliver Dienz (-10/2002) Annette Künkele Sabrina Lacher Andreas Möller (-12/2002) Nuria Nöbel Roland Sauer Technische Mitarbeiter Natalie Erbe Helge Lips Angelika Ott-Hartmann Ute Winter Sekretärin Ingrid Fryson Spüldienst Magdalena Pröll Die Abteilung Immunchemie erforscht mit einer Kombination von klinischen Untersuchungen und komplementären Laborexperimenten die biochemischen Mechanismen und immunologischen Implikationen der Krebskachexie, des körperlichen Verfalls im Alter, des nicht-insulin-abhängigen Diabetes mellitus, der HIV-Infektion und anderer mechanistisch verwandter Krankheitszustände. Neue therapeutische Ansätze, die sich aus diesen Untersuchungen ergeben, werden in klinischen Studien in Zusammenarbeit mit verschiedenen klinischen Partnern untersucht. Die Aktivitäten der Abteilung konzentrieren sich schwerpunktmässig auf die physiologische und pathophysiologische Rolle von Redoxprozessen in Signalkaskaden und regulatorischen Regelkreisen. Redoxregulation von immunologischen und anderen physiologischen Funktionen (D0201) W. Dröge In Zusammenarbeit mit A. Hotz-Wagenblatt (DKFZ), J. Braunstein, C. Herfarth und S. Meuer (Universität Heidelberg) Eine Kombination verschiedener regulatorischer Mechanismen ermöglicht es, dass selbst kleinste Mengen von pathogenen Keimen hochaggressive Abwehrmechanismen aktivieren, ohne gleichzeitig das Wirtsgewebe substantiell zu schädigen. Solche Immunreaktionen werden typischerweise von Lymphozyten mit Hilfe ihrer Antigen-Rezeptoren und Rezeptoren für kostimulatorische Signale in Verbindung mit verschiedenen Zytokinen in Gang gesetzt. Arbeiten aus dieser Abteilung haben darüber hinaus gezeigt, dass an der Regulation dieser Reaktionen auch Redoxprozesse beteiligt sind. Schon früher ist in dieser Abteilung gezeigt worden, dass die funktionelle Aktivierung von T-Lymphozyten durch Superoxydanion-Redikale und andere reaktivie Sauerstoffspezies oder durch eine Verschiebung des intrazellulären Glutathion-Redoxstatus deutlich verstärkt wird. Neuere Arbeiten haben inzwischen gezeigt, dass die Einwirkung von physiologisch relevanten Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies oder anderen Formen von mildem oxidativen Stress bei T-Lymphozyten nicht die Stimulation der T-Zell-Rezeptoren obsolet macht, aber die Signalkaskaden bei relativ schwacher Antigen-Stimulation verstärkt [1]. So wird z.b. die Transkription vom Interleukin- 2-Promotor in T-Zellen durch Einwirkung von 50µM Wasserstoffperoxyd in Kombination mit, aber nicht ohne CD28 Liganden verstärkt, d.h. der Redoxeffekt kann das stimulatorische Signal des Antigen-Rezeptors verstärken, aber nicht das Signal vom CD28 kostimulatorischen Rezeptor ersetzen. Offenbar kann Bildung von Wasserstoff durch Makrophagen und Granulozyten im entzündlichen Gewebe dazu dienen, die Aktivierungsschwellen der Antigenrezeptor-abhängigen Signalkaskaden zu senken. Es kann für einen infizierten Wirt lebenswichtig sein, dass die spezifische Immunreaktion induziert wird bevor optimale Antigendosen, d.h. hohe Pathogenkonzentrationen, im Gewebe vorhanden sind [1-3]. Nicht zuletzt wird auch die vom Insulin-Rezeptor-abhängige Signaltransduktionskaskade durch Redoxprozesse moduliert. Während einerseits Hinweise auf eine Redoxregulation durch redox-empfindliche Phosphatasen beschrieben wurden, gibt es andererseits inzwischen experimentelle Befunde, dass auch die Insulin-Rezeptor-Kinase-Domäne als Zielstruktur einer Redoxregulation durch reaktive Sauerstoffspezies dienen kann [4]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dröge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82: (2002). [2] Dröge, W. and Hildebrandt, W. Role of free radicals and cellular redox status in signal transduction and gene expression. In: Redox Genome Interactions in Health and Disease (J. Fuchs, M. Podda, L. Packer, eds.), Marcel Dekker Inc. New York, (2003). [3] *Sido, B., Breitkreutz, R., *Seel, C., *Herfarth, C., and *Meuer, S. Redox processes regulate intestinal lamina propria T lymphocytes. Redox Cell Biol. and Gent. Part A 352: (2002).

231 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie [4] Hotz-Wagenblatt, A. and Dröge, W. Redox-mediated functional and structural changes in the insulin receptor kinase. Methods Enzymol. 348: (2002). Signaltransduktion und Genaktivierung in T-Lymphozyten (D0202) O. Dienz, A. Möller, M.L. Schmitz, W. Dröge In Zusammenarbeit mit P. Krammer und V. Schirrmacher (DKFZ) sowie W. Fiers (Universität Gent, Belgien), M. Heinrich (University London, UK), B. und C. Kaltschmidt (Universität Freiburg), N. Lassam (Universität Toronto, Kanada), M. Ueffing (GSF, München) und C. Scheidereit (MDC Berlin). Die gleichzeitige Stimulation des T-Zell Rezeptor-CD3-z-Komplexes (TZR) und des kostimulatorischen CD28 Rezeptors führt zur Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten. Diese rezeptorvermittelten Signale induzieren eine Vielzahl von unterschiedlichen Signalübertragungskaskaden, die letztlich zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise NF-κB sowie der induzierten Genexpression führen. Schwerpunktmäßig wurden 4 Aspekte untersucht, nämlich a) die Regulation von frühen Signaltransduktionsereignissen nach T-Zell Kostimulation, b) die Aktivierungswege und physiologischen Funktionen von NF-κB, c) neuartige Mechanismen der Regulation von Proteinkinasen und d) die Regulation des Tumor-Suppressors p53 [1-9]. Ein weiterer Fokus lag schließlich auch auf der Regulation des p53-proteins in der Kontrolle des Zellzyklus. In diesem Zusammenhang haben wir HIPK2 (human homeodomain interacting protein kinase 2) als einen Interaktor und Modulator der p53 Aktivität identifiziert [10,11]. Die humane HIPK2 interagiert und kolokalisiert mit p53 und dem Koaktiviator-Protein CBP in den PML nuclear bodies, d.h. Strukturen innerhalb des Zellkerns, die in der akuten promyolozytischen Leukämie und anderen Erkrankungen gestört sind. HIPK2 wird durch UV-Bestrahlung aktiviert und phyosphoryliert p53 am Serin 46 und erlaubt dadurch die Acetylierung von p53 an den Lysinresten 373 und 382 durch den CBP-Koaktivator. Durch diese Modifikationen wird die p53-abhängige Genexpression stimuliert. Im Einklang damit konnte gezeigt werden, daß die Kinase-Funktion von HIPK2 eine verstärkte Expression von p53-zielgenen, wie z.b. p21 waf1 und damit einen Wachstumsstop der Zellen vermittelt. Die Expression einer Kinase-inaktiven Variante von HIPK2 führt zur Bildung von Zellen mit mehreren Zellkernen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dienz, O., Grohmann, A., Bacher, S., Dröge, W., and Schmitz, L.M. Activation and function of NF-κB in T lymphocytes. Recent Res. Devel. Mol. Cell. Biol. 3:59-74 (2002). [2] Dienz, O., Möller, A., *Strecker, A., *Stephan, N., *Krammer, P.H., Dröge, W., and Schmitz, L. Src homology 2 domain-containing leukocyte phosphoprotein of 76 kda and phospholipase Cγ1 are required for NFκ-B activation and lipid raft recruitment of PKCT induced by T cell costimulation. J. Immunol. 170: (2003). [3] Hofmann, T.G., Möller, A., *Sirma, H., *Zentgraf, H., *Taya, Y., Dröge, W., *Will, H. and M.L. Schmitz Regulation of p53 activity by its interaction with homeodomain interacting protein kinase 2. Nature Cell Biol. 4:1-10 (2002). [4] *Schlueter, D., *Meyer, T., *Kwok, L.Y., *Montesinos- Rongen, M., *Lutjen, S., *Strack, A., Schmitz, M.L., *Deckert, M. Phenotype and regulation of persistent intracerebral T cells in murine Toxoplasma encephalitis. J. Immunol. 169: (2002). Abteilung D020 Immunchemie [5] *Spitkovsky, D., Hehner, S.P., Hofmann, T.G., Möller, A., and Schmitz, M.L. The human papillomavirus oncoprotein E7 attenuates NFκB activation by targeting the IκB kinase complex. J. Biol. Chem. 277: (2002). [6] *You, L.T., *Kruse, F.E., Bacher, S., and Schmitz, M.L. Lipoteichoic acid slectively induces the ERK signaling pathway in the cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science 43: (2002). [7] Schmitz, L.M., Bacher, S., Dröge, W. Molecular analysis of mitogen-activated protein kinase signaling pathways induced by reactive oxygen intermediates. Methods Enzymol. 352:53-61 (2002). [8] Dröge, W., Hofmann, T.G., *Sirma, H., *Will, H., Schmitz, L.M., and Möller, A. HIPK-Kinasen und deren Verwendung zur Beeinflussung der Zellteilung und Zellproliferation. WO 02/ (2002). [9] Dienz, O., Bacher, S., and Schmitz, M.L. NF-kB in T lymphocyte biology. In: Nuclear Factor kb, R. Beyaert, ed., Kluwer Academic Publishers, 2003, pp [10] Möller, A., *Sirma, H., Hofmann, T., *Rueffer, S., *Klimczak, E., Dröge, W., *Will, H., and Schmitz, L. PML is required for HIPK2-mediated p53 phosphorylation and cell cycle arrest but dispensable for the formation of HIPK domains. Cancer Res. 63: (2003). [11] Möller, A., *Sirma, H., Hofmann, T., *Staege, H., *Gresko, E., *Schmid Lüdi, K., *Klimczak, E., Dröge, W., *Will, H., and Schmitz, L. Sp100 is important for the stimulatory effect of homeodomain-interacting protein kinase-2 on p53-dependent gene expression. Oncogene 22: (2003). Die Rolle von Carboxyl-Methylierungen in Signalprozessen und im TNF-vermittelten Zelltod (D0204) V. Lehmann, H. Fritze Die zytotoxischen und Zell-stimulierenden Wirkungen von TNF auf Tumorzellen werden entscheidend durch Proteine beeinflußt, die am Carboxyl-terminalen Ende prenylierte Cysteingruppen tragen. Solche Proteine einschließlich Ras Proteine, werden von Carboxyl-Methyltransferasen erkannt und am Carboxyl-terminalen Ende methyliert. Inhibitoren der Carboxyl-Methyltransferase, wie z.b. N-Acetyl-S-Farnesyl- L-Cystein oder eine Kombination von Adenosin und Homocystein, verhindern die Carboxyl-Methylierung von Ras und Ras-verwandten Proteinen, verstärken die zytotoxische Wirkung von TNF auf TNF-empfindliche Tumorzellen und verwandeln TNF-resistente Tumorzellen in TNF-empfindliche Zellen. In Fibrosarcomzellen induziert TNF einen nekrotischen Zelltod. Dabei aktiviert es Bax und stimuliert die Produktion von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS), die wiederum das mitochondriale Membranpotential zerstören. Die Methylierungshemmer Adenosin und Homocystein verstärken die TNF-vermittelte Aktivierung von Bax, die Produktion von ROS und die Zerstörung des mitochondrialen Membranpotentials. Aus Lysosomen werden Proteasen, wie z.b. Cathepsin B ins Cytosol freigesetzt und aktiviert. Darüber hinaus induziert die Kombination von Adenosin, Homocystein und TNF Prozesse, die für einen apoptotischen Zelltod typisch sind, wie z.b. die Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien [1], die Aktivierung der Caspasen 3, 6 und 9 und die Expression von Phosphatidylserin an der Tumoroberfläche und schließlich die Bildung von apoptotischen Bläschen. Außerdem induzieren die Methylierungshemmer und TNF die Serinphosphorylierung eines 36 KD Proteins, das mittels Nano-Elektrospray-Massenspektroskopie als das ribosomale El6 Protein identifiziert wurde. Mit Hilfe von 231

232 232 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Tumorzell-Varianten, die eine defekte Atmungskette besitzen, haben wir gezeigt, dass die Serinphosphorylierung von El6, die Expression von Phosphatidylserin und die Bläschenbildung unabhängig von den mitochondrialen Prozessen ablaufen. In MCF-7 Zellen beschleunigen und verstärken Methylierungs-Inhibitoren den TNF-vermittelten Zelltod, indem sie u.a. die Aktivierung des antiapoptotischen PI3-Kinase/AKT/ BAD-Reaktionswegs verhindern. Als Konsequenz wird die Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien verstärkt. Ferner wurde gezeigt, dass die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber Adenosin, Homocystein und TNF auch darüber entscheidet, ob entsprechende Tumore in nackten Mäusen, d.h. in vivo, durch die Kombination dieser drei Agenzien unterdrückt werden. Die durch Adenosin, Homocystein und TNF-induzierten Veränderungen der Tumorzellen führen in vivo außerdem dazu, dass Zellen der körpereigenen Abwehr ins Tumorgewebe einwandern und dort ihre tumorzerstörende Wirkung entfalten. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Lehmann V. and Shatrov V. Lipid metabolism and release of cytochrom c from mitochondria. In: Phospholipid metabolism in apoptosis, Quinn P.J. and Kagan V.E. (eds.): Subcell. Biochem., 36: 1-17 (2002). Die Rolle des Redoxstatus im Alterungsprozeß und beim körperlichen Verfall von Krebspatienten. - Untersuchungen zur therapeutischen Anwendung von N-Acetyl-Cystein und anderen Cystein-Derivaten (D0207) W. Dröge, W. Hildebrandt Das Verhältnis der Cystin-Konzentration zur säurelöslichen Thiol-Konzentration im Blutplasma ist ein relativ einfach zu ermittelnder Indikator des Redoxstatus. Mit zunehmendem Alter steigt dies Verhältnis stark an, da insbesondere der Plasma-Cystin-Spiegel zwischen der dritten und zehnten Lebensdekade fast um den Faktor 2 ansteigt [1-4]. Verschiedene Untersuchungen aus den letzten Jahren deuten darauf hin, dass die oxidative Verschiebung im Plasma-Thiol/Disulfid Redoxstatus eine Rolle in verschiedenen im Alter gehäuft auftretenden Erkrankungen spielen und letztlich für wichtige Aspekte des Alterungsprozesses verantwortlich sind [2,3]. Methoden, um den Plasma-Redoxstatus in älteren Menschen und bei Krebspatienten zu korrigieren, werden z.zt. schwerpunktmäßig in dieser Abteilung untersucht, um 1.) die oben genannte Hypothese zu testen, und 2.) um zu ermitteln, ob solche Ansätze geeignet sind, die Lebensqualität älterer Menschen zu verbessern [2-8]. Albumin ist eine der quantitativ wichtigsten Redoxpuffer im Plasma und seine Konzentration ist signifikant mit dem Plasma-Redoxstatus korreliert [2,3]. Während verschiedene frühere Versuche, durch Ernährungstherapie den Albuminspiegel zu heben, nicht erfolgreich waren, haben wir in verschiedenen Studien gefunden, dass durch Behandlung mit N-Acetylcystein, d.h. einer Redox-orientierten therapeutischen Intervention, der Albuminspiegel signifikant erhöht werden kann. Da der Sauerstoffpartialdruck im Blut durch Chemorezeptoren erfasst wird, welche zur Regulation der Atmungsaktivität und der Blutbildung beitragen, haben wir u.a. auch Abteilung D020 Immunchemie die Hypothese untersucht, dass der hypoxische ventilatorische Response und die Produktion von Erythropoietin durch Veränderungen des Plasma Thiolspiegels beeinflusst werden. In der Tat haben wir zeigen können, dass beide physiologische Reaktionen durch eine orale Behandlung mit N-Acetylcystein signifikant verstärkt werden und dass der hypoxische ventilatorische Response mit dem Plasma-Thiol/ Disulfid-Redoxstatus korreliert ist [9-11]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Hildebrandt, W., Kinscherf, R., Hauer, K., Holm, E., and Dröge, W. Plasma cystine concentration and redox state in aging and physical exercise. Mechanisms of Ageing and Development 123: (2002). [2] Dröge, W. The plasma redox state and aging. Aging Research Reviews 1: (2002). [3] Dröge, W. Aging-related changes in the thiol/disulfide redox state: implications for the use of thiol antioxidants. Exp. Gerontol. 37: (2002). [4] Dröge, W. Oxidative stress and aging. In: Hypoxia: Through the lifecycle (R.C. Roach, P.D. Wagner, and P.H. Hackett, eds.) Kluwer/Plenum Academic pp (2003). [5] *Hauer, K., Hildebrandt, W., Sehl, Y., *Edler, L., *Oster, P., and Dröge, W. Improvement in muscular performance and decrease in tumor necrosis factor level in old age after antioxidant treatment. J. Mol. Med. 81: (2003). [6] Kinscherf, R., *Cafaltzis, K., *Röder, F., Hildebrandt, W., *Edler, L., *Deigner, H.-P., Breitkreutz, R., *Feussner, G., *Kreuzer, J., *Werle, E., *Michel, G., *Metz, J., and Dröge, W. Cholesterol levels linked to abnormal plasma thiol concentrations and thiol/disulfide redox status in hyperlipidemic subjects. Free Radical Biol. & Med. 35: (2003). [7] Hildebrandt, W. *Hamann, A., Krakowski-Roosen, H., Kinscherf, R., Dugi, K., Sauer, R., Lacher, S., Nöbel, N., *Bodens, A., *Bellou, V., *Edler, L., *Nawroth, P., and Dröge, W. Effect of thiol antioxidant on body fat and insulin reactivity. J. Mol. Med., i82: (2004). [8] *Weiss, C., *Bierhaus, A., Kinscherf, R., Hack, V., *Luther, T., *Nawroth, P.P., *Bärtsch, P. Tissue factor-dependent pathway is not involved in exercise-induced formation of thrombin and fibrin. J. Appl. Physiol. 92: (2002). [9] Hildebrandt, W., *Alexander, S., *Bärtsch, P., Dröge, W.: Effect of N-acetylcysteine on the hypoxic ventilatory response and erythropoietin productoin: linkage between plasma thiol redox state and O 2 -chemosensitivity. Blood 99: (2002). [10] Hildebrandt, W. and Dröge, W. Thiol-mediated redox regulation. Forum of Nutrition (Elmadfa, I., Anklam, E., König. J.S. (Eds.), Basel, Karger) 56: (2003). [11] Dröge, W. Autophagy and aging. - Importance of amino acid levels. Mech. Ageing Dev., 125: (2004).

233 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D030 Immungenetik Abteilung Immungenetik (D030) Leiter: Prof. Dr. med. Peter H. Krammer Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Rüdiger Arnold Dr. Sven Baumann Dr. Karsten Gülow Dr. Inna Lavrik Dr. Frederik Igney Dr. Andreas Krüger Dr. Min Li-Weber Dr. Diana Macasev Dr. Ana Martin-Villalba Dr. Henning Schulze-Bergkamen Dr Elisabeth Suri-Payer Doktoranden Konstantina Bourkoula Dirk Brenner Lucie Dörner Nadine Eberhardt Stefanie Fas Christian Frey Cornelius Fritsch Alexander Golks Susanne Kleber Stefan Klussmann Dagmar Riess Heiko Weyd Cecilia Zuliani Diplomanden Katalin Darvas Binje Fleischer Technische Angestellte Marco Giaisi Sibylle Klevenz Kathrin Kapppes Ursula Matiba Corinna Metzger Wolfgang Müller Marlene Pach Simone Parg Simone Stösser Nadja Stephan Christine Stumpf Dorothee Süss Monika Walker Sekretariat Heidi Sauter Elektronik-Techniker Hanspeter Götz Spülküche Christa Kremer Gabi Puttner Die Abteilung Immungenetik erforscht das Wachstum normaler und bösartig entarteter Lymphozyten. Modellhaft stehen hierbei zwei Themengebiete im Vordergrund: 1. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Regulation der von Lymphozyten sezernierten Wachstumsfaktoren, der Zytokine, wie dem Interleukin 4, und 2. Untersuchungen mit Hilfe von programmiertem Zelltod, Apoptose, Zellwachstum zu stoppen. Das Zytokin Interleukin 4 ist unter anderem wichtig für das Wachstum von T-Lymphozyten. Die Expression des Interleukin 4 Gens unterliegt komplizierten, negativen und positiven Kontrollmechanismen. Die Aufklärung der Vorgänge bei der Regulation der Expression des Interleukin 4 Gens wird Aufschlüsse über Regulationsmechanismen der Expression anderer wichtiger Zellwachstumsgene liefern. Darüber hinaus sind diese Untersuchungen die Grundlage für ausgedehnte Studien zur Biologie von Interleukin 4. Apoptose ist die häufigste Form von natürlichem Zelltod im Organismus. Es ist das Ziel der Abteilung, die extrazellulären und intrazellulären Signale für Apoptose zu verstehen um Apoptose dann therapeutische gezielt in Tumorzellen einzusetzen. Der Einsatz modernster immunologischer, zellbiologischer und gentechnologischer Methoden und die Kooperation zwischen Grund-lagenforschung und Klinik ist nötig, um herauszufinden, warum Tumoren resistent gegenüber der Induktion von Apoptose und damit möglicherweise therapierefraktär sind. 233

234 234 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Die physiologische Bedeutung der Apoptose Apoptose spielt eine fundamentale Rolle im Organismus. Sie ist verantwortlich für die Homöostase von Geweben und für die Beseitigung von alten, verletzten, mutierten oder gefährlichen Zellen. Im Immunsystem ist sie der Hauptmechanismus, über den potentiell autoreaktive oder nutzlose Immunzellen beseitigt werden. T-Zellen durchlaufen im Thymus die Prozesse der positiven und negativen Selektion. Durch negative Selektion findet die Eliminierung von T-Zellen statt, deren T-Zell-Rezeptoren (TCR) mit Komplexen aus körpereigenen Peptiden und MHC reagieren und die damit potentiell autoreaktiv sind. Auf ähnliche Weise werden im Knochenmark B-Zellen mit einem nichtfunktionellen B-Zell-Rezeptor durch Apoptose beseitigt. Auch werden nach dem Gipfel einer Immunantwort aktivierte T-Zellen, die nicht mehr benötigt werden, durch Apoptose eliminiert. Dies bezeichnet man als aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD). Beim Menschen wurden Mutationen des CD95-Systems beschrieben. Sie führen zur Ausbildung eines Autoimmun-Lymphoproliferativen Syndroms (ALPS) oder Canale Smith Syndrome, das eine massive Lymphadenopathie, die Akkumulation von nicht-malignen T-Zellen und Anzeichen von Autoimmunität zeigt. Diese Krankheitsbilder und der Sterbedefekt der T-Lymphozyten verdeutlichen, dass das CD95-System maßgeblich an der Apoptose im Immunsystem beteiligt ist. Folgerungen für Pathomechanismen von Erkrankungen Die Aufklärung der Funktion des CD95-Systems hat Konsequenzen für das Verständnis der Entstehung von Krankheiten, die durch zuviel oder durch zuwenig Apoptose gekennzeichnet sind. Außer bei genetischen Defekten des CD95-Systems bei Maus und Mensch und den daraus resultierenden Autoimmunphänomenen gibt es bisher noch keine direkten Hinweise auf seine Störungen bei Autoimmunerkrankungen. Da jedoch das CD95-System an Immunregulation und peripherer Selbsttoleranz beteiligt ist, könnten sich bestimmte pathologische Konstellationen durch zu wenig Apoptose auszeichnen. Die Störungen könnten sich auch im Bereich der Regulatormoleküle finden und eine defekte Signalgebung verursachen. Die Entstehung von Autoimmunkrankheiten könnte man sich schließlich folgendermaßen vorstellen. Ständig präsente Autoantigene bewirken eine permanente Stimulation von autoreaktiven T-Zellen. Aufgrund der permanenten Stimulation schalten die T-Zellen den Apoptosesignalweg auf resistent, können nicht mehr absterben und schädigen den Organismus durch Sekretion inflammatorischer Zytokine. Auch die Massenzunahme von Tumoren ist erklärbar als die Summe von ungesteuertem Wachstum und reduziertem Zellsterben durch eine verminderte Apoptoserate. Hier könnten intrazelluläre anti-apoptotische Programme, die durch genetische Veränderungen aktiviert sind, die Apoptosesensitivität negativ beeinflussen und bei der Tumorentstehung und bei der Resistenzentwicklung von Tumoren, z.b. im Verlauf einer Chemotherapie mitwirken. Zuviel Apoptose findet sich z.b. bei manchen Erkrankungen der Leber. Es gibt Hinweise, daß bei der Hepatitis, spezifische anti-virale T-Zellen die Virus-befallenen CD95positiven Leberzellen angreifen und durch CD95L abtöten. Bei der Leberschädigung durch Alkohol findet sich sogar CD95L -Produktion in CD95positiven Leberzellen selbst. So läßt sich spekulieren, daß toxische Alkoholabbauprodukte ein CD95-abhängiges Apoptoseprogramm, das zur Selbstzerstörung der Leberzellen führt, anschalten. Abteilung D030 Immungenetik Auch bei AIDS findet sich mit Progression der Erkrankung eine gesteigerte Apoptose der Lymphozyten. Hier ist die Frage, ob eine gesteigerte Apoptose neben direktem Virusbefall eine der Ursachen für die T-Helferzelldepletion ist. Es gibt Hinweise darauf, daß bei HIV-infizierten Personen die durch das CD95/CD95L-System vermittelte Apoptose krankhaft gesteigert ist. Allerdings wurden auch CD95-unabhängige Mechanismen beschrieben, die zur verstärkten Apoptose von Lymphozyten bei AIDS beitragen können. Die Steigerung der CD95-vermittelten Apoptose findet sich auch in nicht-virus-infizierten Zellen. Generell ist in HIVinfizierten Personen sowohl die Expression von CD95 auf T-Lymphozyten als auch die Produktion von CD95L stark erhöht. In Modellsystemen mit virusinfizierten T- Lymphozyten in der Zellkultur konnte gezeigt werden, daß die Steigerung der CD95-vermittelten Apoptose u.a. durch eine durch virale Genprodukte erhöhte CD95L-Produktion zustandekommt. Entscheidend hierfür ist das in virusinfizierten Zellen produzierte Molekül Tat. Tat kann von virusinfizierten T-Lymphozyten ausgeschieden und von nichtinfizierten T-Zellen aufgenommen werden. Auch in diesen T-Zellen sensibilisiert Tat die CD95- vermittelte Apoptose und könnte so zum Tod und zur Depletion auch nichtinfizierter aktivierter T-Zellen beitragen. Ebenfalls verstärkend auf diesen Vorgang wirkt sich der Effekt eines Proteins der Virushülle, gp120, aus. Gp120 bindet an den CD4 Rezeptor von T-Helferzellen und sensibilisiert die CD95-vermittelte Apoptose besonders in diesen Zellen. Das molekulare Verständnis dieser Zusammenhänge läßt die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze erhoffen. Noch ist keine direkte, ausreichend erfolgreiche Therapie zur Eliminierung der infizierenden Viren in Sicht. Deshalb zielen solche Ansätze darauf, durch Neutralisierung der Tat- oder gp120-effekte die CD95-vermittelte Apoptose auf Normalmaß zu reduzieren. Schließlich scheint das CD95 System auch bei der Entwicklung von Leberschäden und neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose beteiligt zu sein. Transkriptionelle Regulation der IL-4 Genexpression in T-Zellen M. Li-Weber, P.H. Krammer T-Helfer-Zellen (Th-Tellen) spielen durch die Synthese und Sekretion von Zytokinen eine Schlüsselrolle in der Immunantwort. Aufgrund ihres Zytokinprofils und ihrer funktionellen Eigenschaften unterscheidet man zwei Klassen von Th-Zellen: Die Th1-Zellen synthetisieren Interleukin-2 (IL- 2), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor (TNF) und ermöglichen damit die zellvermittelte Immunantwort. Th2- Zellen produzieren IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 sowie IL-13 und unterstützen die humorale Immunantwort. Der Charakter der Immunantwort wird grundlegend durch das interschiedliche Zytokinprofil der T-Helfer-Zell-Klassen beeinflußt. Da die jeweiligen Zytokine, welche während einer Immunantwort produziert werden, die Rekrutierung und Aktivierung anderer Immunzellen bestimmen, wurden entscheidende Fortschritte im Verständnis der Zytokine und Transkriptionsfaktoern gemacht, welche die Differenzierung von Th-Vorläuferzellen (Thp) zu reifen Th1 und Th2 Zellen kontrollieren. Es wurde gezeigt, daß IFN-γ Th1-Differenzierung über Induktion der IL-12 Produktion aktivierter Makrophagen und der Expression des IL-12-Rezeptors auf Thp- Zellen fördert. Jedoch wurden keine Regulations-

235 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie mechanismen von Th1-Zellen beschrieben, welche direkt Th2-Zellen negativ regulieren. Kürzlich haben wir gezeigt, daß IFN-γ, das wichtigste Th1-Zytokin, in primären humanen T-Zellen direkt die IL-4-Produktion herunterregulieren kann. Der IFN-γ-Effekt wird durch die Induktion von IRF-1 und IRF-2 in humanen T-Lymphozyten vermittelt, welche an drei IRF-Bindestellen im IL-4-Promotor binden. Wir zeigen, daß IRF-2 sowie auch IRF-1 (bekannt als Transaktivator von IFN und IFN-induzierbaren Genen) als Repressorgen der IL-4-Promotor-Aktivität und damit als Antagonist der IL-4-Transkription wirken. IL-4, das wichtigste Th2-Zytokin, spielt auch eine entscheidende Rolle in der Entwicklung allergischer Entzündungen durch Induktion von IgE isotype switching und verstärkte IgE-Rezeptor-Expression. Kürzlich haben wir zwei wichtige IL-4-Promotor-Elemente identifiziert, welche nach T- Zell-Stimulation mit den Proteinen der AP-1- und NF-κB- Familie interagieren. Wir haben gezeigt, daß Vitamin E, ein natürlich vorkommendes effektives, fettlösliches Anti-Oxidans, IL-4-Expression auf der Ebene von mrna und Protein unterdrückt, indem es die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die zwei wichtigen NF-κB- und AP-1-Bindestellen im IL-4-Promoter verhindert. Unsere Studien zeigen einen molekularen Mechanismus, der die weitreichende Rolle von Vitamin E in der Vermeidung von IL-4-vermittelten allergischen Erkrankungen unterstützt. Zusätzlich zeigen wir, daß das entzündungshemmende Sesquiterpen-Lactone Parthenolid aus Mutterkraut (Tanacetum parthenium) und vielen mexikanischen Heilpflanzen die IL-4-Expression durch Blockierung der NF-κB-Aktivität unterdrückt. Desweiteren demonstriert unsere Studie die wichtige Rolle von NF-κB in der IL-4-Gen-Aktivierung und zeigt das Potential zur Behandlung von IL-4-vermittelten allergischen Entzündungen durch die Modulation der NF-κB-Aktivität. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] Elser, B., Lohoff, M., Kock, S., Giaisi, M., Kirchhoff, S., Krammer, P.H. and Li-Weber, M. (2002) IFN γ Represses IL-4 Expression via IRF-1 and IRF-2. Immunity, 17: [2] Li-Weber, M., Giaisi, M., Treiber, M. K., and Krammer, P.H. (2002) Vitamin E Inhibits Interleukin-4 Gene Expression in Peripheral Blood T Cells. European Journal of Immunology, 32: [3] Li-Weber, M., Giaisi, M., and Krammer, P.H. (2002) The Anti-inflammatory Sesquiterpene Lactone Parthenolide Suppresses Interleukin-4 Gene Expression in Peripheral Blood T Cells. European Journal of Immunology, 32: [4] Li-Weber, M., Krammer, P.H. (2003) Regulation of IL-4 Gene Expression by T Cells and Therapeutic Perspectives. Nature Reviews Immunology, 3: Apoptose und CD95-Signalwege I. Lavrik, A. Golks, A. Krueger, S. Baumann, S. Fas, P.H. Krammer. Mit CD95 wurde 1989 zum ersten Mal ein Zelloberflächenrezeptor beschrieben, der in der Lage ist, Apoptose auszulösen. CD95 ist ein differentiell glykosyliertes Typ I- Transmembranprotein mit einer molekularen Masse von kda, das in den meisten Säugetiergeweben exprimiert wird [Trauth, B.C., et al. (1989). Science 245: ]. CD95 gehört zur NGF-/TNF-Rezeptorfamilie. Charakteristisch für diese Familie sind zwei bis sechs extrazelluläre cysteinreiche Domänen. Die biologischen Effekte, die von den Rezeptoren dieser Familie vermittelt werden, sind sehr Abteilung D030 Immungenetik unterschiedlich: Sie umfassen so verschiedene Prozesse wie Differenzierung, Proliferation, Aktivierung oder Apoptose. Eine Subfamilie der NGF-/TNF Superfamilie bilden die sogenannten Todesrezeptoren. Diese zeichnen sich dadurch aus, daß sie Apoptose auslösen. Strukturell wichtig für die Auslösung von Apoptose ist eine ungefähr 80 Aminosäuren lange intrazelluläre Domäne, die als Todesdomäne (engl.: death domain, DD) bezeichnet wird. Diese Domäne zeigt eine hohe Homologie bei allen Todesrezeptoren. Die Aggregation der Todesdomänen von CD95 ist für die Übermittlung des apoptotischen Signals essentiell. Da der intrazelluläre Teil von CD95 selbst keinerlei enzymatische Funktion aufweist, muss das Signal durch rezeptorassoziierte Moleküle übertragen werden. Die Identifizierung von Proteinen, die stimulationsabhängig nur an kreuzvernetztes CD95 binden, hat dieses Konzept bestätigt. So konnte gezeigt werden, daß verschiedene Proteine nur an stimulierte CD95 Rezeptoren binden. Der Komplex zwischen aktivierten CD95 Rezeptoren und den assoziierten Signalmolekülen wurde Tod-induzierender Signalkomplex genannt (death-inducing signaling complex, DISC). Die Bildung des DISC ist wie die Signaltransduktion von intakten Todesdomänen abhängig. Damit war eine erste Korrelation zwischen der Bildung des DISC und der Übertragung des apoptotischen Signals gegeben. Zunächst werden die Adapter FADD/MORT-1 in den DISC rekrutiert. Dies passiert durch homologe Interaktion der Todesdomäne (death domain, DD) von FADD mit den DD von trimerisierten CD95-Rezeptoren. FADD hat aber auch noch eine sogenannte Todeseffektordomäne (death effector domain, DED). Damit attrahiert es Procaspase 8 (ein Eiweiß spaltendes Enzym; vide infra) in den DISC. Dies geschieht wieder durch homologe Interaktion mit der DED von Procaspase 8. Dieses Proenzym (Zymogen) wird nun autokatalytisch gespalten und am DISC in aktives Enzym, die Caspase 8, überführt. Aktive Caspase 8 spaltet und aktiviert dann weitere Caspasen (Effektorcaspasen), die schließlich zelluläre Substrate spalten. Die Spaltung dieser zellulären Substrate bestimmt das morphologische und biochemische Bild der Apoptose. Zusammenfassend gibt es also mehrere Apoptosesignalwege mit folgenden Signalschritten: 1. Einen Signalweg mit Todesrezeptoraktivierung, DISC Bildung, Caspasenkaskade und Spaltung zellulärer Substrate (in Typ I Zellen), 2. einen Signalweg mit wenig DISC Bildung, einer Signalamplifikation über BID (gespalten) aktivierte Mitochondrien, der Bildung eines Apoptosoms und folgender Effektorcaspasenaktivierung (in Typ II Zellen) und 3. einen bisher noch nicht geklärten Signalweg, bei dem AIF aus den Mitochondrien freigesetzt wird, das Caspasen unabhängig wirkt. Die Aufklärung der Signalwege und die Charakterisierung der bei ihnen wichtigen molekularen Interaktionsmechanismen hat Konsequenzen für die Erklärung der Pathogenese vieler Erkrankungen. Darüber hinaus stehen uns nun Moleküle aus den Signalwegen zur Verfügung, die das Ziel therapeutischer Interaktionen sein können. Die mathematiche Modellierung der CD95-Signalübertragung erlaubt die Signalwege weiter zu charakterisieren und den Apoptose-Schwellen Mechanismus zu erklären. Die Existenz von zwei verschiedenen CD95-Signalwegen, ist vermutlich auf die Bildung eines alternativen DISC komplex in Typ II-Zellen zurückzuführen. Mit 2D-Gelelektrophorese haben wir unterschiedliche Proteine im DISC 235

236 236 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie von Typ I- und Typ II-Zellen gefunden. Weiter versuchen wir diese neuen DISC-Proteine durch Massen-Spektrometrie zu identifizieren. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] Baumann S, Krueger A, Kirchhoff S, Krammer PH. (2002). Regulation of T cell apoptosis during the immune response. Curr. Mol.Med. 2, Bentele, M., Lavrik, I., Ulrich, M., Stosser, S., Kalthoff, H., Krammer, P.H., Eils, R. (2004). Mathematical Modeling reveals threshold behavior of CD95-induced Apoptosis. Submitted [2] Krueger, A., Fas, S.C., Baumann, S., Krammer, P.H. (2003). The role of CD95 in the regulation of peripheral T-cell apoptosis. Immunol. Rev. 193, [3] Lavrik, I., Krueger, A., Shmitz, I., Baumann, S., Weyd, H., Kirchhoff, S. Krammer, P.H. et al. (2003). The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC. Cell Death Differ 10(1): [4] Schmitz I, Krueger A, Baumann S, Schulze-Bergkamen H, Krammer PH, Kirchhoff S. (2003). An IL-2-dependent switch between CD95 signaling pathways sensitizes primary human T cells toward CD95-mediated activation-induced cell death. J.Immunol. 171, [5] Peter, M. E. and P. H. Krammer (2003). The CD95(APO-1/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ 10 (1): Oxidative Signale und molekulare Mechanismen der T-Zellrezeptor vermittelten Apoptose K. Gülow, M. Kaminski, K. Darvas, P.H. Krammer In der Immunantwort werden T-Zellen über ihren T-Zellrezeptor aktiviert. Es folgt eine Phase der klonalen Expansion, in der die T-Zellen resistent gegenüber diversen apoptotischen Stimuli sind. Mit dem Erreichen des Höhepunktes der spezifischen Immunantwort treten die Zellen in eine neue Phase ein, die sogenannte Deletionsphase, in der sie Apoptose sensitiv werden. Kommt es jetzt zu einer erneuten Stimulation des T-Zellrezeptors, wird die Expression des CD95(Apo-1/Fas)-Liganden (L) induziert. Da T-Zellen auch den CD95-Rezeptor exprimieren, kommt es zur T-Zell Apoptose durch Fratrizid oder auch zu autokrinem Suizid. Calcium-Signale und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-AT spielen ebenso wie oxidative Signale eine entscheidende Rolle in der Regulation der CD95L-Expression. Die Stimulation des T-Zellrezeptors führt zu einer Calcium-Freisetzung aus dem Endoplasmatischen Retikulum. Dadurch wird die Phosphatase Calcineurin aktiviert, die den Transkriptionsfaktor NF-AT dephosphoriliert. Dieser bindet danach an den CD95L-Promotor. Dieser Calcium abhängige Signalweg ist jedoch nicht ausreichend, um Apoptose einzuleiten. Dazu wird noch ein oxidatives Signal benötigt. Quelle dieses oxidativen Signals ist die mitochondriale Atmungskette. Die reaktiven Sauerstoffverbindungen aktivieren ihrerseits Transkriptionsfaktoren wie NF-κB und AP-1, die ebenfalls an den CD95L Promotor binden. Blockiert man diese Signale durch Antioxidantien, hemmt man zugleich auch die Apoptose. Calcium und reaktive Sauerstoffverbindungen werden gleichermaßen für die CD95L-Expression benötigt. Ein Signal alleine ist nicht ausreichend. In vielen Tumoren zeigt sich eine Verschiebung der Verhältnisse von reduziertem zu oxidiertem Glutathion, oder es liegen sogar Veränderungen in der Gesamtmenge an Glutathion vor. Glutathion ist ein zelluläres Antioxidans. Veränderungen in dem Verhältnis reduziert zu oxidiert zeigen eine Veränderung im Redox-Status der Zelle an. Sinkt die Gesamtmenge an Glutathion, bilden sich reaktive Sauerstoffverbindungen. Diese Veränderungen, die in vielen Tumoren Abteilung D030 Immungenetik beobachtet wurden, deuten auf eine Störung der oxidativen Signalweiterleitung hin. Auch bei AIDS spielen oxidative Signale eine Rolle. Zellen, die mit dem HIV-1 Transkriptionstransaktivator (Tat) behandelt wurden, weisen eine verminderte Menge an reduziertem Glutathion, sowie eine deutliche Steigerung der Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen auf. Aktiverte T-Zellen, die mit HIV-1 Tat behandelt wurden, werden für T-Zellrezeptor induzierte Apoptose sensibilisiert. Es kommt zu einer beschleunigten und verstärkten CD95L-Expression. Oxidative Signale sind wichtige Bestandteile in der Apoptose-Regulation. Ein besseres Verständnis der Signalwege auf molekularer Ebene kann zu einer Therapie bei Krebs oder auch AIDS beitragen. Molekulare Signalmodulation bei der Apoptose von T-Zellen und ihre Bedeutung im hämatopoetischen System R. Arnold, D. Brenner, C. Frey, P.H. Krammer In Zusammenarbeit mit: F. Kiefer, Max-Planck-Institut für Vaskuläre Biologie c/o ZMBE - Institut für Zellbiologie, Münster Die Umschaltung von intrazellulären Signalwegen durch Phosphorylierung von Signalproteinen ist von zentraler Bedeutung für Leben oder Tod einer Zelle. In T-Zellen wird nach T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimulation die hämatopoetische Proteinkinase HPK1 phosphoryliert und aktiviert dadurch den SAPK / JNK sowie den NFκB Signalweg. Während der Initiation von Apoptose unterliegt HPK1 der Regulation durch Proteasespaltung. Dabei zerteilt eine Caspase-3 Aktivität HPK1 in eine N- und eine C-terminale Hälfte und verändert die Funktion der Kinase so, dass völlig andere Signale weitergeleitet werden. Die biologische Funktion dieser Umschaltung ist mit dem Aktivierungs-Induzierten Zelltod (AICD) in T-Zellen in Verbindung gebracht worden. In unserem AICD-Modellsystem fanden wir in primären T- Zellen dabei einen Zusammenhang der TCR abhängigen Kinase HPK1 mit dem CD95-System. Weiterhin zeigen unser Arbeiten an hämatopoetischen Vorläuferzellen, dass diese Umschaltung in der Funktion auch während der Differenzierung von Zellen benutzt wird. Damit kann diesem molekularen Schalter eine universelle Funktion zugedacht werden. Ste20-homologe Kinasen, zu denen HPK1 gehört, konnten bislang in allen untersuchten Modellorganismen gefunden werden. Wenig verstanden ist bislang allerdings die Funktion dieser Kinasen im Organismus und der Mechanismus, mit dem dabei ihre Aktivität reguliert wird. Hier konnten wir ein Modell der autokatalytischen Aktivierung aufstellen, das für Mitglieder innerhalb dieser Proteinfamilie die mechanistische Grundlage der Funktion liefert. Um dieses Modell weiter zu testen, untersuchen wir derzeit die Auswirkung verschiedene Ste20-Kinasen auf Apoptose und Differenzierung in transgenen bzw. knockout Mäusen. Daraus kann sich die Möglichkeit zur Herstellung von selektiven Inhibitoren und deren Nutzung zur Behandlung von unkontrolliertem Zellwachstum bei Tumoren ergeben. Publikation (* = externer Koautor) [6]Kiefer, F.*, Vogel, W.* and Arnold, R. (2002): Signal transduction and co-stimulatory pathways in lymphocytes. Transplant Immunol. 9 (2002)69-82.

237 Die Rolle des CD95-Liganden im ZNS Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie S. Kleber, C. Zuliani, S. Klussmann, C. Metzger, A. Beisel, P.H. Krammer, A. Martin-Villalba Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die bedeutendste Ursache von Behinderung in der westlichen Welt. Spinal- und Hirntraumata sind für die meisten Todesfälle und Behinderungen in der Bevölkerung unter 40 Jahre verantwortlich. Bei diesen pathologischen Zuständen ist die Expression von CD95-Ligand (CD95L) und TNF in den betroffenen Hirn- und Rückenmarksarealen erhöht. Um die Rolle dieser Liganden herauszufinden, haben wir präklinische Mausmodelle von Schlaganfall und Querschnittlähmung benutzt. Hierzu konnten wir zeigen, dass Hybride von TNFdefizienten und gld (ohne funktionellen CD95L) Mäusen stark resistent gegenüber schlaganfallinduziertem Schaden waren. Interessanterweise zeigten Mäuse, in denen eine Mischung von anti-cd95l und anti-tnf neutralisierende Antikörper therapeutisch verabreicht wurde, eine deutliche Verminderung des Infarktsareals und Mortalitätsrate. Auch die lokomotorische Aktivität der therapierten Mäuse war nahezu vergleichbar zu der Aktivität von schein-operierten Mäusen. In querschnittgelähmten Mäusen zeigten therapeutische Verabreichung von neutralisierenden anti-cd95l Antikörpern alleine oder in Kombination mit anti-tnf Antikörpern eine bedeutsame Verminderung des apoptotischen Zelltodes. Noch wichtiger, einige Wochen nach Verletzung zeigten solche therapierten Mäuse aktive Bewegungen der Hinterpfoten. Im embryonalem Gehirn ist CD95L konstitutiv exprimiert. Jedoch hat der Mangel an funktionellem CD95 oder CD95L (lpr und gld Mäuse) keinen erkennbaren Einfluß auf die Anzahl der Neuronen. Interessanterweise zeigten lpr Mäuse eine Atrophy der Dendriten pyramidaler Neuronen. Gemäß diesem Befund konnten wir zeigen, dass in 4 Tage alten hippocampalen und kortikalen Neuronen eine Behandlung mit CD95L eine erhöhtes Branching auslöst. Stimulation von CD95 in Neuronen, die mehr als 6 Tage alt waren, hatte jedoch keine Wirkung auf das Branching. In solchen gereiften Neuronen löst die Stimulation von CD95 Apoptose aus. Zusammenfassend beurteilt, kann ein Signal in der Kaskade unterhalb von CD95 entweder Apoptose, oder morphologische Veränderungen der Neuronen auslösen. Rolle und Funktion CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen E. Suri-Payer, N. Eberhardt, P.H. Krammer In Zusammenarbeit mit: Kajsa Wing und Dr. Anna Rudin, Dept. of Rheumatology, University of Gothenburg, Schweden; Dr. Jürgen Haas und Prof. Dr. Brigitte Wildemann, Neurologische Klinik, Universität Heidelberg; Dr. Christine Falk, Abtl. für Molekularbiologie, GSF, München Eine zentrale Fragestellung der Immunologie ist, welche Mechanismen halten die Immunhomeostase aufrecht und tragen zur Verhinderung von Autoimmunerkrankungen, Organzerstörung bei Infektionen, sowie zur Transplantations-Toleranz bei. Studien in Mausmodellen ergaben, dass hierbei regulatorischen T-Zellen, welche die Funktion von CD4 T-Helfer und CD8 zytotoxischen T-Zellen hemmen können, eine wichtige Rolle zukommt. Während einige immunsupprimierende Zellen durch die Ausscheidung immunsuppressiver Zytokine (TGFβ, IL-10) hemmend in Immunreaktionen eingreifen, ist der Funktionsmechanismus der CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen (Treg) unbekannt. Abteilung D030 Immungenetik Wir haben zunächst Treg im humanen System charakterisiert. Nur 1-3% der CD4 T-Zellen mit der höchsten CD25 Expression (CD25 ++ ) zeigen den für Treg charakteristischen Phänotyp (CD122 +, CTLA-4 +, GITR +, Foxp3 + ) und hemmen die Proliferation naiver T-Zellen in Kultur [1]. Studien aus Thymus, Nabelschnurblut und peripherem Blut isolierten Treg weisen darauf hin, dass Treg nach dem Verlassen des Thymus Selbstantigen in der Peripherie erkennen müssen, um eine Antigen-spezifische Hemmung (z.b. gegen Myelin dendrocyte glycoprotein (MOG)) aufzuweisen [2]. Die Tatsache, dass CD4 + CD25 + Treg von gesunden Probanden die Immunantwort gegen MOG, einem wichtigen Selbstantigen in Multipler Sklerose, hemmen, zeigt dass Treg auch im Menschen eine wichtige Rolle in der Verhinderung von Autoimmun-erkrankungen spielen. Vorläufige Untersuchungen an Patienten mit akuter Multipler Sklerose ergaben, dass die Anzahl der Treg nicht beeinträchtigt ist, diese Treg die Aktivierung anderer T-Zellen aber nur unzureichend unterdrücken können. Wir studieren nun den Mechanismus der Hemmung naiver T-Zellen durch Treg in der Zellkultur. Wir konnten etablieren, dass eine Vorstimulation der Treg in vitro ihre hemmende Wirkung verstärkt, d.h. weniger Treg werden benötigt um die Proliferation der CD4 + CD25 - naiven T-Zellen zu hemmen. Die Zugabe von Treg reduziert auch die Zytokinproduktion der T-Zellen (z.b. von IL-2, INFγ, TNFα, IL-4, IL-5, IL-13) schon ab 24 Stunden nach der Stimulation. Im Gegensatz hierzu wird die Produktion von IL-10 verstärkt wenn CD4 + CD25 + Treg mit CD4 + CD25 - T-Zellen zusammen kultiviert werden. Unsere Ziel ist es den molekularen Mechanismus der Hemmung der naiven T-Zellaktivierung zu verstehen, wobei wir uns auf die Regulation des IL-2 Genes konzentrieren. Die Aufklärung der Funktion der Treg wird neue Ansatzpunkte zur Therapie von Autoimmunerkrankungen bringen. Da die Aktivierung des Immunsystems gegen Krebs auch durch Treg unterdrückt wird, könnte die Manipulation der Treg in Krebspatienten auch zukünftig entscheidend zu einem Behandlungserfolg beitragen. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] *Wing K, *Ekmark A, *Karlsson H, *Rudin A, Suri-Payer E. Characterization of human CD25 + CD4 + T cells in thymus, cord and adult blood. Immunology Jun;106(2): [2] *Wing K, *Lindgren S, *Kollberg G, *Lundgren A, *Harris RA, *Rudin A, *Lundin S, Suri-Payer E. CD4 T cell activation by myelin oligodendrocyte glycoprotein is suppressed by adult but not cord blood CD25 + T cells. Eur J Immunol Mar;33(3):

238 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie D040 Apoptose Regulation 238 Apoptose-Regulation (D040) Leiter: Dr. Henning Walczak * Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Tom Ganten * Dr. Anne Große-Wilde * ( - 12/02) Dr. Ronald Koschny * Dr. Evgeni Sagulenko * (1/02-1/03) Dr. Jaromir Sykora * Dr. Markus Weigand * Doktoranden Tobias Haas (12/02 - ) Martin Sprick * Manuela Schader * Daniela Willen * Diplomanden Tobias Haas * (10/0-6/02) Marcello Lucas * (10/03 - ) Technische Assistenten Verena Buffy * Denise Pfeiffer * (7/03 - ) Claudia Rappl * Heiko Stahl * ( - 4/02) Bärbel Moos * Carl Leonard * ( - 11/02) Gastwissenschaftler Dr. Edmundo Aravena * (Chile) Patricia Hérnandez Casana * (Kuba) (2-6/03) Sekretariat Katharina Sporns (2/02 10/03) Claudia Feuro-Hintze (10/03 - ) * Finanziert durch Drittmittel Die Arbeitsgruppe Apoptoseregulation wurde im Mai 2000 gegründet, nachdem Dr. Henning Walczak den BioFuture-Preis für sein Projekt Neue Apoptosetargets erhalten hatte. Apoptose ist ein fundamentaler biologischer Prozess. Unter physiologischen Bedingungen gibt es ein Gleichgewicht zwischen Zellwachstum und Zelltod. Dieses Gleichgewicht spielt eine entscheidende Rolle für den Erhalt der Gewebshomöostase. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass pathologische Änderungen der Apoptose eine entscheidende Rolle für die Entwicklung und das Fortbestehen einer ganzen Reihe von verschiedenen Erkrankungen, u.a. von Krebs und Autoimmunerkrankungen, spielt. Dies führte dazu, dass die ersten rekombinanten Apoptose-induzierenden und -inhibierenden Proteine als spezifische therapeutische Agenzien eingesetzt werden, um diese Krankheiten zu bekämpfen. Neben der Apoptose spielen die Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie eine wichtige Rolle bei der Regulation einer Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse. Beispiele hierfür sind die Regulation der Immunabwehr und die Kontrolle zellulärer Differenzierungs- und Proliferationsprozesse. Ein besseres Verständnis der beteiligten Signalprozesse ist die Grundlage für ihre gezielte Beeinflussung. Erkrankungen bei denen die TNF-Familie eine Rolle spielt sind z.b. Immundefizienzen und Autoimmunerkrankungen. Die Wissenschaftler in der Arbeitsgruppe Apoptoseregulation untersuchen die biochemischen Signalwege des Zelltodes durch Apoptose, die Funktion verschiedener Mitglieder der TNF-Familie und die therapeutischen Möglichkeiten, die sich durch die Beeinflussung von Apoptose ergeben. Hierbei stehen zwei Themen im Zentrum des wissenschaftlichen Interesses: 1. Das Verstehen der grundlegenden Mechanismen der Signaltransduktion durch Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie Ein Schwerpunkt sind hier die Mechanismen der Apoptoseinduktion durch den sogenannten TNF-verwandten Apoptoseinduzierenden Liganden ( TNF-related apoptosisinducing ligand ) TRAIL, die physiologische Funktion des TRAIL/TRAIL-Rezeptorsystems und das therapeutische Potential der Apoptoseinduktion durch TRAIL bei Tumorerkrankungen; 2. Die Identifizierung und funktionelle Analyse neuer pro- und anti-apoptotischer Proteine und Bestimmung des Potentials dieser Proteine als Therapeutika bzw. als Zielstrukturen bei Erkrankungen mit dysregulierter Apoptose. Während der erste Themenkomplex bereits seit mehreren Jahren im Fokus der Forschungstätigkeit des Gruppenleiters und seiner Mitarbeiter stand, begannen die Untersuchung zu neuen Apoptoseproteinen im Jahr 2000, nachdem der BioFuture-Preis die Gründung der unabhängigen Arbeitsgruppe Apoptoseregulation und somit eine Ausweitung der bisher auf das TRAIL-System fokussierten Forschungsaktivitäten ermöglichte.

239 Das TRAIL-Apoptosesystem H. Walczak Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie In Kooperation mit: C. T. Rauch, Immunex Corp., Seattle, WA, USA; P. Juo und J. Blenis, Harvard Medical School, Boston, MA, USA; S. J. Martin, Trinity College, Dublin, Irland; H. Kalthoff, Universität Kiel; M. Leverkus und E.Kämpgen, Universität Würzburg; G. Schönrich, M. J. Raftery, F. Zipp, I. Bechmann und R. Nitsch, Charité, Humboldt Universität, Berlin; M. Lutz, Universität Erlangen; K. Schulze-Osthoff und M. Los, Universität Münster; C. D. Gerharz, Universität Düsseldorf; G. R. Screaton und A. K. Simon, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK; M. Weller, Universität Tübingen; P. Möller, J. Sträter, S. Fulda, C. Beltinger und K.-M. Debatin, Pathologie und Kinderklinik der Universität Ulm; P. H. Krammer, E. Greiner und G. Schütz, DKFZ. Im Rahmen des TRAIL-Projekts ist es das Ziel der Arbeitsgruppe Apoptoseregulation, die grundlegenden biochemischen Mechanismen der TRAIL-induzierten Apoptose aufzuklären, Faktoren zu identifizieren, welche Sensitivität versus Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose in normalen und in Tumorzellen regulieren, die physiologische Rolle des TRAIL-Systems zu bestimmen und geeignete TRAIL-Rezeptor-Agonisten für die Krebstherapie zu identifizieren. Im Dezember 1995 fanden Wiley et al. in einer öffentlich zugänglichen Sequenzdatenbank ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie. Sie bezeichneten dieses Protein aufgrund seiner Eigenschaft Apoptose auslösen zu können als TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL. Dabei wurde ein interessantes Phänomen offensichtlich: TRAIL induzierte Apoptose in vielen Tumorzelllinien, während normale, nicht-transformierte Zellen entweder nicht oder in einem sehr viel geringeren Ausmaß durch TRAIL getötet wurden als die entarteten Zellen des gleichen Gewebetyps. Die anderen bekannten Apoptose-auslösenden Mitglieder der TNF-Familie, CD95-Ligand and TNF, sind toxisch, wenn sie systemisch verabreicht werden. Die Eigenschaft von TRAIL Tumorzellen, nicht aber normale Zellen zu töten, führte uns dazu, das Antitumorpotential dieses Zytokins in vivo zu testen. Wir konnten zeigen, dass TRAIL in vivo in Tumorzellen Apoptose induziert ohne eine systemische Toxizität aufzuweisen und weitere Studien haben ergeben, dass diese Antitumoraktivität synergistisch mit Chemotherapie und/oder Bestrahlung wirkt. Auch hier war im Tiermodell keine Toxizität erkennbar. Nachdem zunächst eine Lebertoxizität für den Menschen angenommen wurde, geht man nun davon aus, dass Formen von TRAIL, die keine Protein-Aggregate enthalten, keine Toxizität aufweisen und daher für die klinische Anwendung entwickelt werden können. Um ein neues Todesrezeptor-Ligandensystem verstehen zu können, benötigt man neben dem Liganden auch den Rezeptor. Die Suche nach dem Rezeptor für TRAIL endete mit einem äußerst überraschenden Ergebnis: TRAIL bindet sowohl an zwei Apoptose-induzierende Rezeptoren (TRAIL- R1 and TRAIL-R2) als auch an drei nicht Apoptose-induzierende Rezeptoren (TRAIL-R3, TRAIL-R4 and OPG). Damit verfügt TRAIL über mehr Rezeptoren als alle anderen Mitglieder der TNF-Familie. Die Komplexität dieses Rezeptor- Ligandensystems deutete bereits seine biologische Vielseitigkeit an, jedoch war selbst einige Zeit nach Entdeckung von TRAIL und seiner Rezeptoren die physiologische Funktion dieses neuen Apoptose-induzierenden Systems unbekannt. In diesem Zusammenhang haben wir gezeigt, dass TRAIL keine Rolle beim aktivierungsinduzierten Zelltod von B-Zellen spielt und auch der Zelltod einer Reihe anderer D040 Apoptose Regulation Zellen des Immunsystems, die wir zunächst untersuchten, nicht durch TRAIL vermittelt wird. In der letzten Zeit konnte in einer Reihe von Studien nachgewiesen werden, dass TRAIL auf der Oberfläche verschiedener Effektorzellen des Immunsystems exprimiert wird, u.a. auf Typ II Interferon (IFN-γ)-stimulierten Monozyten, Cytomegalovirus (CMV)-infizierten Fibroblasten, Typ I IFN (IFN-α and IFN-β)- oder TCR-stimulierten T-Zellen, unstimulierten CD4 + T-Zellen, IFN-α- und IFN-γ-stimulierten sowie Masernvirus-infizierten dendritischen Zellen (DC) und natürlichen Killerzellen (NK). Interessanterweise war die funktionelle Expression von TRAIL häufig mit Interferonstimulation assoziiert. Es ist möglich, dass die antitumorale Wirkung der Interferone zumindest zum Teil durch TRAIL vermittelt wird, das den direkten Tumorzelltod bewirkt. Unstrittig ist jedoch, dass die Hauptfunktion der Interferone in ihrer antiviralen Aktivität besteht. Es wurde gezeigt, dass TRAIL spezifisch Apoptose in viral infizierten Zellen induziert und nicht-infizierte Zellen verschont bleiben. Es besteht daher die Möglichkeit, dass sich das TRAIL-Todessystem entwickelt hat, um virale Transformation zu kontrollieren. Die Tatsache, dass viele onkogen transformierte Zellen ebenfalls sensitiv gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind, könnte daher eine vorteilhafte Nebenwirkung der eigentlichen Funktion von TRAIL, nämlich des Abtötens viral transformierter Zellen darstellen. Die Untersuchung von Mäusen, die defizient für einen der TRAIL-Todesrezeptoren sind, wird eine genauere Untersuchung dieser Zusammenhänge ermöglichen. Diese Mäuse wurden kürzlich in der Arbeitsgruppe Apoptoseregulation in Zusammenarbeit mit der Abteilung von Prof. G. Schütz hergestellt und stehen der Arbeitsgruppe nun zur Verfügung. Die Deletion von T-Zellen durch Apoptose ist essentiell für die Homöostase im Immunsystem. Bei peripheren T-Zellen sind das CD95- sowie das TNF-System in diesem Deletionsprozess involviert. Zusammen mit unseren Kooperationspartnern konnten wir zeigen, dass TRAIL keine entscheidende Rolle beim aktivierungsinduzierten Zelltod peripherer T- Zellen spielt und dass TRAIL nicht an der negativen Selektion autoreaktiver T-Zellen im Thymus beteiligt ist. Kürzlich konnte allerdings auch gezeigt werden, dass vermutlich ein Defekt im TRAIL-Apoptoseweg peripherer T-Zellen bei ALPS II-Autoimmunpatienten für diese Erkrankung verantwortlich ist. Vor diesem Hintergrund kommt einer genauen Untersuchung sowohl von Regulation und Funktionalität der TRAIL-Rezeptoren auf peripheren T-Zellen, als auch des intrazellulären Apoptosesignalwegs in diesen Zellen eine besondere Bedeutung zu. Nach der molekularen Identifizierung von TRAIL und seiner fünf Rezeptoren rückte die Analyse der Signaltransduktion der TRAIL-Rezeptoren in den Mittelpunkt des Interesses. Eine Analyse des nativen Signalkomplexes, d.h. des Komplexes, der sich ausbildet, wenn auf der Zelloberfläche die TRAIL-Rezeptoren durch ihren Liganden TRAIL kreuzvernetzt werden, wurde anfänglich dadurch erschwert, dass die TRAIL-Rezeptoren aufgrund ihrer im Vergleich zum CD95- Rezeptor etwa zehnfach schwächeren Oberflächenexpression einen im Gegensatz zu diesem Todesrezeptor nur schwer detektierbaren Signalkomplex ausbilden. Mit Hilfe eines von uns verbesserten Verfahrens zur Immunpräzipitation der TRAIL-Signalkomplexe konnte schließlich gezeigt werden, dass der TRAIL-DISC die gleiche grundlegende Zusammensetzung für die Apoptoseinduktion aufweist wie der CD95-DISC. Diese Ergebnisse werfen die interessante Frage auf, warum viele Zelltypen eine unterschiedliche Sen- 239

240 240 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie sitivität gegenüber TRAIL und CD95 aufweisen. Die Identifizierung sensitivitätsdeterminierender Faktoren kann dabei helfen, Vorhersagen über die Zugänglichkeit von Tumoren für auf TRAIL basierende Therapieansätze zu ermöglichen. In weiteren Studien konnte die Protease Caspase-10 als eine neue Komponente des TRAIL-, und auch des CD95- DISC identifiziert werden [1]. Dieses Protein ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, da gezeigt wurde dass Caspase-10 bei Patienten die an der Autoimmunerkrankung ALPSII leiden, mutiert ist. Da Caspase-10 eine hohe Ähnlichkeit mit Caspase-8 aufweist wurde vermutet, dass beide Caspasen redundant sind. Wir konnten jedoch zeigen, dass Caspase-10 die Funktion von Caspase-8 nicht ersetzen kann, obwohl beide an die DISC-Komplexe rekrutiert werden. Wir vermuten daher, dass Caspase-10 eine Funktion in der Weiterleitung nicht-apoptotischer Signale hat [1]. Funktion und Biochemie von Caspase-10 M.R. Sprick, M.A. Weigand, A. Grosse-Wilde, E. Rieser, V. Buffy, D. Pfeiffer, H. Walczak Caspase-10 wurde von uns und anderen als Komponente des TRAIL- und CD95 DISCs identifiziert [1]. Anfänglich wurde vermutet, dass Caspase-10 und Caspase-8 eine redundante Funktion besitzen. Wir konnten jedoch zeigen, dass Caspase-10 die Funktion von Caspase-8 in der Apoptoseinduktion nicht ersetzen kann. Wir vermuten daher, dass Caspase-10 eine Rolle in der Weiterleitung alternativer Signale von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie spielt. Ein weiteres Indiz für eine wichtige Funktion von Caspase-10 sind pathologische Konditionen. So ist Caspase-10 in Patienten, die an der Autoimmunerkrankung ALPSII leiden, mutiert. Von besonderem Interesse für die Krebsforschung ist auch der Befund, dass in ca. 50% aller untersuchten Tumorzelllinien die Expression von Caspase-10 herunterreguliert ist. Caspase-10 spielt also möglicherweise nicht nur eine Rolle bei der Homöostase des Immunsystems sondern ist auch ein potentieller Tumorsuppressor. Zur Identifikation der zellulären Prozesse an denen Caspase-10 beteiligt ist, verfolgen wir verschiedene Ansätze. Zum einen produzieren wir rekombinante Caspase-10 in einer hochreinen und aktiven Form. In verschiedenen, neu entwickelten Assays verwenden wir dieses Protein für die Identifikation zellulärer Substrate und Interaktionspartner. In einem anderen Teilprojekt generieren wir monoklonale Antikörper gegen Caspase-10, welche es uns ermöglichen werden, Studien zur subzellulären Lokalisierung auf proteinbiochemischer und immunhistochemischer Ebene durchzuführen. D040 Apoptose Regulation Analyse des nativen TRAIL DISCs/Identifikation neuer Komponenten des TRAIL-DISCS T. Haas, M.R. Sprick, M. Lucas, C. Rappl, H. Walczak Nach der Identifizierung der TRAIL-Rezeptoren eröffnete sich die Frage, durch welche Moleküle die Signaltransduktion innerhalb der Zelle abläuft. In ersten Studien wurden Proteinüberexpressionssysteme verwendet um mögliche Interaktionen zwischen bekannten Molekülen und den TRAIL-Rezeptoren nachzuweisen. Es zeigte sich jedoch, dass diese Vorgehensweise anfällig für Artefakte war und viele widersprüchliche Resultate produzierte [2]. Die Isolierung des TRAIL-DISCs aus Zellen, welche native Mengen aller beteiligten Proteine produzieren stellte sich jedoch anfänglich als schwierig heraus. Erst mit Hilfe einer verbesserten Methode zur DISC-Immunpräzipitation konnte gezeigt werden, dass Caspase-8 und FADD essentielle Bestandteile für die TRAIL-induzierte Apoptose sind. Auch Caspase- 10 als eine neue Komponente des TRAIL und CD95-DISCs konnte mit dieser Methode nachgewiesen werden. In dem TRAIL-System sind jedoch noch einige Kernfragen ungelöst. TRAIL besitzt zwei Rezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, welche nach Stimulation Apoptose induzieren können. Diese Rezeptoren weisen ein unterschiedliches Expressionsmuster auf und unterscheiden sich auch in ihrer Fähigkeit, Apoptose zu induzieren. TRAIL-R1 und TRAIL-R2 können nach Stimulation auch gemischte Komplexe bilden. Wir sind an der Frage interessiert ob, und welche Moleküle mit den unterschiedlichen TRAIL-Rezeptorkomplexen assoziieren und welche Funktion diese Moleküle in der Signaltransduktion besitzen. Wir konnten kürzlich zeigen, dass TRAIL unter nativen Bedingungen nicht nur Apoptose induziert, sondern auch den NF-κB-Signalweg [3, 4]. Die Induktion des NFκB-Signalweges spielt möglicherweise eine Rolle bei der Vermittlung pro-inflammatorischer Signale unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die Identität der Moleküle, welche diese alternativen Signale vermitteln, ist jedoch noch ungeklärt. In dem Teilprojekt Analyse des nativen TRAIL DISCs/Identifikation neuer Komponenten des TRAIL-DISCs sollen neue Komponenten des TRAIL DISCs mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden identifiziert werden. Um die Sensitivität der Detektion zu erhöhen entwickeln wir neue Reagenzien, die eine höhere Reinheit und Ausbeute in der Immunpräzipitation der TRAIL-DISCs ermöglichen. Regulation der Apoptose-Sensitivität und - Resistenz T. Ganten, M.R. Sprick, T. Haas, J. Sykora, M. Leverkus, M. Neumann, H. Walczak In Kooperation mit: Peter H. Krammer, DKFZ; W. Stremmel, Abteilung IV, Medizinische Klinik, Universität Heidelberg; Martin Leverkus und Manfred Neumann, Universitätshautklinik, Universität Würzburg. In der Zelle existieren zwei Hauptwege für die Induktion der Apoptose: Der Todesrezeptor-vermittelte sowie der mitochondriale Weg. In vielen Tumorzellen sind einer oder beide dieser Wege durch Mutationen in essentiellen Komponenten oder durch Überexpression anti-apoptotischer Proteine blockiert. Dies resultiert in der Unfähigkeit der Tumorzelle nach Stimulation durch physiologische Signale Apoptose auszuführen. Als Folge daraus ist das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Zelltod gestört. In den letzten Jahren wurde herausgefunden, dass die meisten der gegenwärtig eingesetzten post-operativen Tumortherapien, d.h. Bestrahlung und Chemotherapie, ihren therapeutischen Effekt durch Induktion von Apoptose erzielen. Sowohl Chemo- als auch Strahlentherapie induzieren Apoptose hauptsächlich über den mitochondrialen Weg. Diese therapeutischen Maßnahmen schlagen auf lange Sicht jedoch oft fehl, da Tumorzellen Resistenzen gegen die Apoptoseinduktion über den mitochondrialen Weg erlangen. Eine Kombinationstherapie mit TRAIL und Chemotherapeutika, welche Apoptose über beide Signalwege gleichzeitig induziert sollte daher einen eindeutigen therapeutischen Vorteil bieten. Insbesondere die Sensitivierung resistenter Tumorzellen für TRAIL mit Hilfe von Chemotherapeutika eröffnet interessante therapeutische Möglichkeiten.

241 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie In einer Studie untersuchten wir drei Hepatomzelllinien, welche unterschiedliche Sensitivität gegenüber TRAIL aufweisen [12]. Eine Vorbehandlung mit Chemotherapeutika wie z.b. 5-Fluoruracil (5-FU) war in der Lage ursprünglich TRAIL-resistente Zelllinien für die Apoptoseinduktion durch TRAIL zu sensitivieren. Eine Analyse des nativen TRAIL- DISCs in diesen Zelllinien, sowie der Expression verschiedener pro- als auch anti-apoptotischer Proteine ergab, dass die Sensitivierung auf der Ebene des TRAIL-DISCs stattfindet. Mit Hilfe von sirna wurde das Protein cflip, welches die Aktivierung von Caspase-8 und -10 am TRAIL-DISC blockiert, als entscheidender Regulator der Sensitivität in diesem System identifiziert. Primäre Zellen weisen eine hohe Resistenz gegenüber Apoptoseinduktion durch TRAIL auf. Die Mechanismen dieser Resistenz sind von besonderem Interesse. Die Identifizierung dieser Mechanismen wird dabei helfen, mögliche Nebenwirkungen einer Therapie mit TRAIL abzuschätzen. Weiterhin ist es wahrscheinlich, dass diese Mechanismen der TRAIL-Resistenz auch von Tumorzellen genutzt werden um der Apoptoseinduktion durch TRAIL zu entgehen. Die Identifikation der beteiligten Faktoren bietet daher auch die Möglichkeit noch unbekannte Ziele von Tumortherapien aufzudecken. Wir haben die TRAIL-Resistenz primärer humaner Zellen anhand eines Modellsystems, welches aus primären humanen Keratinozyten und der transformierten Keratinozytenzelllinie HaCat besteht untersucht [3]. Wir konnten zeigen, dass die TRAIL-Resistenz dieser Zellen auf der Ebene der Aktivierung von Caspase-3 reguliert ist. So exprimieren primäre Keratinozyten im Gegensatz zu transformierten Keratinozyten hohe Mengen des Proteins XIAP. XIAP ist ein zellulärer Inhibitor der Caspase-3 und blockiert die autokatalytische Reifung von Caspase-3 und damit die Ausführung der Apoptose. XIAP wird auch in vielen Tumoren überexprimiert und Versuche zur Identifizierung pharmakologischer Antagonisten von XIAP werden bereits durchgeführt. Unsere Ergebnisse mit primären Keratinozyten deuten jedoch darauf hin, dass auch primäre Zellen durch XIAP vor Apoptoseinduktion geschützt werden. Eine sorgfältige Evaluation von XIAP-Antagonisten vor klinischen Tests scheint daher angeraten. Zusammengefasst zeigen diese Studien, dass die Resistenz gegenüber TRAIL auf verschiedenen Ebenen der Signalkaskade reguliert werden kann [11]. Weitere Studien zielen darauf ab weitere Resistenz-bestimmende Moleküle zu identifizieren und ihre Funktionsweise zu analysieren. Das Verständnis der TRAIL-Resistenz von Tumorzellen und normalen Zellen wird uns helfen, therapeutische Konzepte zu entwickeln, bei denen die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose nach Möglichkeit tumorspezifisch gebrochen werden kann. Physiologische Rolle des TRAIL-Systems A. Grosse-Wilde, M.A. Weigand, M.R. Sprick, J. Sykora, B. Washburn In Kooperation mit: B. Washburn, V. Schirrmacher, DKFZ; E. Greiner und G. Schütz, DKFZ; J. Sträter, P. Möller, C.S. Hasel, T. Lehnert, Institut für Pathologie, Universität Ulm; J.I. Dorr, S. Bechmann, F. Zipp, I. Nitsch, Abteilung für Neuroimmunologie, Charité, Berlin. D040 Apoptose Regulation Die physiologische Rolle des TRAIL-Systems blieb nach dessen Entdeckung für einige Zeit unbekannt. So konnten wir z.b. keine Funktion von TRAIL in dem aktivierungsinduzierten Zelltod von humanen B- und T-Zellen nachweisen. Kürzlich wurde jedoch die Expression von TRAIL auf einer Reihe von Zelltypen nachgewiesen werden, die ihre Zielzellen mit Hilfe eines bis dahin unbekannten Mechanismus eliminieren. Unter diesen Zelltypen befinden sich Interferon-α/β oder T-Zellrezeptor stimulierte T Zellen, Interferon-α und -γ stimulierte oder mit Masern-Virus infizierte dendritische Zellen, sowie NK-Zellen. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die antitumorale Wirkung des Newcastle-Disease- Virus über eine Hochregulation von TRAIL auf Monozyten vermittelt wird [5]. Die Assoziation von Interferonen mit viralen Infektionen legt die Vermutung nahe, dass das TRAIL- System sich unter anderem als Verteidigungssystem gegen virale Infektionen entwickelt hat. Eine weitere Rolle kommt dem TRAIL-System in der Kontrolle von Tumoren zu. So ist TRAIL z.b. wichtig für eine effektive Graft-Versus- Tumor Aktivität von allogen transplantierten hematopoietischen Zellen [6]. Weiterhin wurde gezeigt, dass TRAIL benötigt wird, die Bildung von Lebermetastasen in einem Maus-Tumormodell effizient zu unterdrücken. Als Effektorzellen wurden hier NK-Zellen der Leber identifiziert. Um die physiologische Funktion des TRAIL-Systems in vivo zu analysieren, haben wir in Kooperation mit der Abteilung Schütz am DKFZ eine konditionale TRAIL-Rezeptor Knockout-Maus hergestellt. Da in der Maus nur ein TRAIL-Todesrezeptor existiert, besitzt diese Maus einen kompletten Defekt in TRAIL-induzierter Apoptose. Zurzeit werden diese Mäuse in verschiedenen Modellsystemen analysiert. Eine genauere Kenntnis des Expressionsmusters von TRAIL und seiner Rezeptoren in humanen Tumoren sowie normalen Geweben lässt Rückschlüsse auf die Funktion von TRAIL unter physiologischen sowie pathologischen Bedingungen zu. Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern gegen TRAIL und die TRAIL-Rezeptoren, welche in unserer Abteilung entwickelt wurden, führen wir Studien in Kooperation mit verschiedenen Kliniken durch [7-10] Publikationen (* = externer Koautor) [1] Sprick, M.R., E. Rieser, H. Stahl, A. Grosse-Wilde, M.A. Weigand, and H. Walczak, Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. Embo J, (17): p [2] Sprick, M.R. and H. Walczak, Caspase Activation at the TNF- R Family Members Death Inducing Signaling Complexes (DISCs), in Caspases-Their Role In Cell Death and Cell Survival, M. Los and H. Walczak, Editors. 2002, Landes Bioscience/Kluwer Academic: New York, N.Y. / Georgetown, Texas. p [3] Leverkus, M.*, M.R. Sprick, T. Wachter*, T. Mengling*, B. Baumann*, E. Serfling*, E.B. Brocker*, M. Goebeler*, M. Neumann*, and H. Walczak, Proteasome inhibition results in TRAIL sensitization of primary keratinocytes by removing the resistance-mediating block of effector caspase maturation. Mol Cell Biol, (3): p [4] Leverkus, M.*, M.R. Sprick, T. Wachter*, A. Denk*, E.B. Brocker*, H. Walczak, and M. Neumann*, TRAIL-induced apoptosis and gene induction in HaCaT keratinocytes: differential contribution of TRAIL receptors 1 and 2. J Invest Dermatol, (1): p [5] Washburn, B., M.A. Weigand, A. Grosse-Wilde, M. Janke, H. Stahl, E. Rieser, M.R. Sprick, V. Schirrmacher, and H. Walczak, TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Mediates Tumoricidal Activity of Human Monocytes Stimulated by Newcastle Disease Virus. J Immunol, (4): p

242 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie D040 Apoptose Regulation 242 [6] Schmaltz, C.*, O. Alpdogan*, B.J. Kappel*, S.J. Muriglan*, J.A. Rotolo*, J. Ongchin*, L.M. Willis*, A.S. Greenberg*, J.M. Eng*, J.M. Crawford*, G.F. Murphy*, H. Yagita*, H. Walczak, J.J. Peschon*, and M.R. van den Brink*, T cells require TRAIL for optimal graft-versus-tumor activity. Nat Med, (12): p [7] Sträter*, J., H. Walczak, T. Pukrop*, L. Von Müller*, C. Hasel*, M. Kornmann*, T. Mertens*, and P. Möller*, TRAIL and its receptors in the colonic epithelium: a putative role in the defense of viral infections. Gastroenterology, (3): p [8] Sträter, J.*, U. Hinz*, H. Walczak, G. Mechtersheimer*, K. Koretz*, C. Herfarth*, P. Möller*, and T. Lehnert*, Expression of TRAIL and TRAIL receptors in colon carcinoma: TRAIL-R1 is an independent prognostic parameter. Clin Cancer Res, (12): p [9] Hasel, C.*, S. Dürr*, B. Rau*, J. Sträter*, R.M. Schmid*, H. Walczak, M.G. Bachem*, and P. Möller*, In chronic pancreatitis, widespread emergence of TRAIL receptors in epithelia coincides with neoexpression of TRAIL by pancreatic stellate cells of early fibrotic areas. Lab Invest, (6): p [10] Dörr, J.*, I. Bechmann*, S. Waiczies*, O. Aktas*, H. Walczak, P.H. Krammer, R. Nitsch*, and F. Zipp*, Lack of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand but presence of its receptors in the human brain. J Neurosci, (4): p. RC209. [11] Sprick, M.R. and H. Walczak, The interplay between the Bcl- 2 family and death receptor-mediated apoptosis. Biochim Biophys Acta, (2-3): [12] Ganten, T.M., T.L. Haas, J. Sykora, H. Stahl, M.R. Sprick, S.C. Fas, A. Krueger, M.A. Weigand, A. Grosse-Wilde, W. Stremmel*, P.H. Krammer, and H. Walczak, Enhanced Caspase-8 Recruitment to and activation at the DISC is Critical for Sensitisation of Human Hepatocellular Carcinoma cells to TRAILinduced Apoptosis by Chemotherapeutic Drugs. Cell Death Diff. In press.

243 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D050 Molekulare Immunologie Abteilung Molekulare Immunologie (D050) Leiter: Prof. Dr.rer.nat. Günter J. Hämmerling Arbeitsgruppenleiter PD Dr. rer. nat. Bernd Arnold Dr.rer.nat. Ruth Ganss Dr. med. Gerhard Moldenhauer PD Dr. med. Frank Momburg Wissenschaftliche Mitarbeiter (DKFZ, Drittmittel) Dr.rer.nat. Pascale Brocke ( - 9/02) PhD Anne Forde, Irland PhD Natalio Garbi, Spanien PhD Mitsuko Furuya, Japan (- 11/02) Dr.med. Steffen Heeger Dipl.Biol. Gorana Hollmann Dr.rer.nat. Birgit Liliensiek ( - 4/02) Dr.med. Thilo Oelert Dr.rer.nat. Thomas Schüler PhD Satoshi Tanaka, Japan ( - 8/03) Doktoranden und Diplomanden cand.med. Jörn Albring Dipl.Biol. Mario Berger Dipl.Biol. Mostafa Jarahian M.Sc. Microbiol. Kishore Kunapuli Dipl.Biol Sandra Lüttgau cand.med. Roland Reibke Dipl.Biol. Cordula Rumig Dipl.Biol. Simone Stahl Dipl.Biol. Karsten Tauber M.Sc. Biotechnol. Neeraj Tiwari Technische Angestellte (DKFZ, Drittmittel) Nadja Bulbuc Kathrin Frank Elvira Hallauer Alexandra Klevenz Günther Küblbeck Nathalie Michel Sanela Paljevic Georg Pougialis Esmail Rezavandi ( - 5/02) Diana Saal Christine Schmitt Sabine Schmitt Claudia Schumann ( - 3/02) Ludmilla Umanska Martin Wühl Sekretariat Birgit Vey Ein wichtiges Ziel der immunologischen Forschung ist es, das körpereigene Immunsystem zur Abwehr von Tumoren einzusetzen. Die für die Abwehr verantwortlichen T-Lymphozyten erkennen Antigene nur nach deren Spaltung in Peptide, die im Zytosol und in den Endosomen stattfindet. Diese Peptide binden an Haupthistokompatibilitätsmoleküle (MHC) der Klassen I und II und werden dadurch an die Zelloberfläche transportiert, wo sie von T-Lymphozyten entdeckt werden können, die den Körper laufend auf das Erscheinen von Fremdantigenen abtasten. Dementsprechend konzentrieren sich unsere Arbeiten auf die Prozessierung und Präsentation von Antigenen und deren Erkennung, wobei für MHC Klasse-I- und Klasse-II-Moleküle die Mechanismen und Hilfsmoleküle im Vordergrund stehen, die für die Peptidbeladung der MHC-Moleküle unerlässlich sind. Tumoren scheinen relativ häufig diese Erkennungsmechanismen abzuschalten, wodurch sie sich der Immunabwehr entziehen können. Die genauen Kenntnisse dieser Mechanismen sind für die Manipulation des Immunsystems und die Entwicklung von Vakzinen von Bedeutung. Die Erkennung des MHC/Peptidkomplexes kann nicht nur zur Aktivierung von T-Lymphozyten führen, sondern auch zu deren Inaktivierung (Toleranz). Dieses könnte erklären, warum Tumoren häufig nicht vom Immunsystem abgestossen werden, obwohl sie tumorspezifische Antigene besitzen. Deshalb sind weiterhin die Fragen der Toleranzinduktion und die Brechung der Toleranz für Tumoren zentrale Aspekte unserer Arbeit. Hierzu werden transgene Tumormäuse eingesetzt. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass Tumore häufig nicht von T-Killerzellen zerstört werden können, weil dieser Zugang in das Tumorgewebe blockiert ist. Änderungen im Mikromilieu des Tumors erlauben aber Infiltration und Zerstörung. Vergleichbare Beobachtungen konnten wir in transgenen Mausmodellen mit organspezifischer Autoimmunität machen. Das Verständnis des Mikromilieus und der Mechanismen, die den Killerzellen Zugang in ein Gewebe erlauben, kann zu neuen Therapiemassnahmen bei Autoimmunität und immunologischer Tumorbehandlung führen. Ein vielversprechender Ansatz zur immunologischen Tumorabwehr sind bispezifische Antikörper, die in vivo körpereigene Killerzellen direkt zu den Tumoren lenken und so deren Zerstörung bewirken können. Nach erfolgreicher Austestung im Tiermodell an menschlichen Tumoren werden diese bispezifischen Antikörper zur Zeit in klinischen Studien erprobt. 243

244 244 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Antigenpräsentation durch MHC II Moleküle Funktion von HLA-DM und HLA-DO und Tetraspan-Komplexen P. Brocke, K. Kunapuli, N. Garbi, M. Wühl, S. Schmidt, G.J. Hämmerling In Zusammenarbeit mit F. Batista, Cancer Research Institute, London, UK; L. Leserman, INSERM Marseille-Luminy, Frankreich; J. Neefjes, Netherlands Cancer Institue, Amsterdam, Niederlande; H. Kropshofer, Roche Center for Medical Genomics, Basel, Schweiz Die vornehmliche Funktion von MHC Klasse II-Molekülen ist es, körpereigene und fremde Antigene CD4-Zellen zu präsentieren. Sowohl endogene als auch von aussen aufgenommene Antigene werden in endosomalen Kompartimenten durch Proteasen in Peptide zerlegt und binden dort an MHC-II-Moleküle. Die MHC-II-Peptidkomplexe weren an die Zelloberfläche transportiert, wo sie von T-Helferzellen erkannt werden. Während der Biosynthese im endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziieren MHC-II-Moleküle mit der invarianten Kette (Ii), die aufgrund eines Sortierungssignals den Transport von MHC-II-Ii-Komplexen in endosomale Kompartimente bewirkt. Ii bindet an MHC-II-Moleküle vornehmlich durch ein Segment CLIP, welches die Peptidbindungsstelle blockiert. Nach proteolytischem Abbau von Ii in endosomalen Beladungskompartimenten verbleibt CLIP in der Bindungsgrube des Klasse-II-Moleküls und muss entfernt werden, bevor antigene Peptide binden können. Für diesen Prozess ist das akzessorische Molekül HLA-DM essentiell (H2-M in der Maus) (Kropshofer, H. et al. Immunol. Today 18: 77-82, 1997; Kropshofer, H. et al. Immunity 6: , 1997; Armandola, E.A. et al.. In: Frontiere della Biologia. Enciclopedia Italiana. Eds.: R. Levi-Montalcin et al. p , 1999; Vogt, A.B., et al. Seminars in Immunology 11, , 1999; Arndt, S.O. et al. EMBO J. 19: , 2000; Kropshofer, H. et al. Immunol. Rev. 172: , 1999]. Hierbei verändert DM die Konformation von MHC-II, was sich auf Erkennung durch T-Helferzellen auswirkt [1]. Ein Grossteil von HLA-DM ist sehr fest mit einem weiteren Molekül assoziiert, HLA-DO (in der Maus H2-O), dessen Funktion noch unklar und Gegenstand unserer Untersuchungen ist. MHC-Klasse-II, DMund DO-Komplexe sind wiederum in Superkomplexen (Mikrodomänen) mit verschiedenen Tetraspan-Molekülen wie CD82, CD53 und CD63 eingebunden, deren immunologische Funktion ebenfalls völlig unklar ist (Kropshofer, H., et al. Immunol. Rev. 172: , 1999 [2]). HLA-DO: ein Regulator für HLA-DM. HLA-DO ist ein MHC-II verwandtes Molekül, in MHC-kodiert, und geht mit DM hochaffine Komplexe im ER ein. Im Gegensatz zu DM ist DO nahezu ausschliesslich in B-Zellen exprimiert. Seine biologische Rolle ist jedoch nicht klar. Unsere in vitro-untersuchungen mit gereinigten Molekülen haben gezeigt, dass DO die Funktion bei DM in der Peptidbeladung verstärkt, aber nur im sauren ph der späten endosomalen Kompartimente [3]. Um die Funktion von H2-O in zellulären Systemen zu untersuchen, haben wir B-Zelllinien generiert, die H2-O überexprimieren, bzw. nach Transfektion mit Anti- Sense-Konstrukten stark reduziert exprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass H2-O in frühen endosomalen Kompartimenten die Präsentation verschiedener Antigene negativ moduliert, aber nicht die Präsentation von Antigen in späten, sauren endosomalen Kompartimenten [4]. Vergleichbare Befunde wurden mit H2-O-transgenen und H2-Oknockout Mäusen gemacht [4]. Wir postulieren, dass H2-O Abteilung D050 Molekulare Immunologie die Antigenpräsentation und damit Aktivierung der B-Zellen verhindert, die das Antigen über die Flüssigphase aufnehmen. Antigenpräsentation und Aktivierung mit Antikörperbildung würde dann wahrscheinlich für die Antigene erfolgen, die spezifisch über den B-Zellrezeptor BCR aufnehmen [2]. Diese Fragen werden z.zt. mit Zelllinien untersucht, die das Antigen über spezifische BCR aufnehmen und verschiedene Mengen von H2-O exprimieren, und auch mit H2-O knockout und BCR transgenen Mäusen. Um den Einfluss von Tetraspan Superkomplexen auf die Antigenpräsentation aufzuklären, haben wir erfolgreich CD82 und CD53 knockout-mäuse hergestellt, die gegenwärtig untersucht werden. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Verreck F.A.W., Fargeas C.A, Hämmerling G.J., Conformational alterations during biosynthesis of HLA-DR3 molecules controlled by invariant chain and HLA-DM. Eur.J.Immunol 31: , 2001 [2] Brocke, P., Garbi, N., Momburg, F., Hämmerling, G.J., HLA- DM, DO, and TAPASIN: Functional Similarities and differences. Current Opinion in Immunology, 14: 22-29, 2002 [3] Kropshofer, H., Vogt, A.B., *Thery, C., Armandola, E.A., Li, B.-C., Moldenhauer, G., *Amigorena, S. and Hämmerling, G.J. A role for HLA-DO as a co-chaperone of HLA-DM in peptide loading of MHC class II molecules. EMBO J. 17: , [4] Brocke, P., Armandola, E., Garbi, N., Hämmerling G.J., Downmodulation of antigen presentation by H2-O in B cell lines and primary B lymphocytes. Eur. J. Immunol. 33, , 2003 Periphere Toleranz im Immunsystem B. Arnold, R. Ganss, G.J. Hämmerling, A. Forde, G. Hollmann, G. Küblbeck, A. Klevenz, N. Michel, T. Oelert, S. Paljevic, G. Pougialis, R. Reibke, C. Rumig, T. Sacher, S. Schmitt, T. Schüler In Zusammenarbeit mit G. Opdenakker, Leuven, Belgien; D. Stern, New York, USA; G. Schütz, Heidelberg, D; T. Chavakis und P. Nawroth, Heidelberg; A. Limmer und P. Knolle, Bonn; S. Goerdt, Mannheim; G. Hoyne, Canberra, Australien Zur Entwicklung therapeutischer Ansätze bei Autoimmunerkrankungen und in der Transplantation sowie zum Einsatz des Immunsystems bei der Bekämpfung von Tumoren ist die Kenntnis der Zusammenhänge essentiell, unter denen Immunreaktionen in Toleranz bzw. Gewebezerstörung münden. Wir beschäftigen uns daher mit der Frage, wie periphere T-Zellen mit einer Spezifität für Antigene, die ausschliesslich in extralymphatischen Geweben unter physiologischen Bedingungen exprimiert werden, ruhiggestellt werden und welche Vorgänge zur Brechung dieser Toleranz führen können. Während der neonatalen Phase tragen verschiedene Prozesse zum Aufbau eines T-Zellrepertoires bei, das uns einerseits gegen Pathogene schützt, aber andererseits körpereigenes Gewebe nicht angreift. So expandieren die im Thymus gereiften T-Zellen in den peripheren lymphoiden Organen auch ohne die Anwesenheit der entsprechenden Pathogene, um den vorhandenen Platz zu füllen. Dabei entwickeln sie sich zum Teil in Gedächtniszellen, die möglicherweise im Falle einer Infektion zu einer schnelleren und damit effektiveren Bekämpfung des Erregers beitragen könnten [1]. Andererseits ist diese frühe Entwicklungsphase von besonderer Bedeutung für die Ausprägung immunologischer Toleranz. So können z.b. naive T-Zellen während der neonatalen Phase in hoher Zahl in Gewebe wie z.b. die Haut

245 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie einwandern. Ein direkter Kontakt mit einem Antigen, das sich nur auf Keratinozyten befindet - in unserem Modell das K b Antigen, das unter dem Keratin-IV-Promotor in transgenen Mäusen exprimiert ist (2.4KerIV-K b ) - ist somit möglich und induziert Toleranz in den entsprechenden T-Zellen, ohne sie zu eliminieren [2-4]. Diese Toleranz bleibt auch im Erwachsenenalter erhalten, obwohl die zu diesem Zeitpunkt neu aus dem Thymus exportierten Zellen nicht mehr in die Haut einwandern können und daher naiv bleiben. Wir müssen daher eine Form von dominanter Toleranz postulieren, die diese naiven, K b -reaktiven T-Zellen daran hindert, K b -positive Transplantate abzustossen. Da wir mit T-Zell- Rezeptor-transgenen Mäusen mit K b -Spezifität arbeiten, können wir die entsprechenden T-Zellen mit Hilfe eines anti-klonotypischen Antikörpers (Des-TCR) verfolgen. In Zelltransferstudien konnte gezeigt werden, dass tolerante CD8 +, Des-TCR + T-Zellen naive T-Zellen, die den gleichen T-Zell-Rezeptor tragen, an der Abstossung von K b -positiven Tumortransplantaten hindern können. Analysen der differentiellen Genexpression zwischen toleranten und aktivierten/naiven T-Zellen mit Hilfe der DNA micro array - Technologie von Affymetrix führten zur Identifizierung interessanter Kandidatengene, und haben damit die Grundlage zum Studium der molekularen Zusammenhänge dieser Form dominanter Toleranz gelegt. Neben der Haut haben wir auch die Leber als Zielorgan für unsere Toleranzstudien gewählt. Da die K b -spezifischen T- Zellen in den toleranten Des-TCRxCRP-K b -Mäusen (K b -Expression nur auf Hepatozyten in der Leber) und Des- TCRx2.4KerIV-K b -Mäusen (K b -Expression nur auf Keratinozyten in der Haut) noch immer vorhanden waren, stellten wir uns die Frage, ob die beobachtete Toleranz in vivo aufgehoben werden könnte, und ob dies Autoaggression zur Folge hätte. Wurden diese Mäuse mit syngenen Tumorzellen konfrontiert, die gleichzeitig das K b -Autoantigen und Interleukin (IL)-2 exprimieren, so wurde tatsächlich die Aufhebung der Toleranz erreicht. Autoaggression in der Leber der Des-TCRxCRP-K b -Tiere wurde jedoch nur beobachtet, wenn die Tiere zusätzlich zur Brechung von Toleranz mit einem leberspezifischen Pathogen infiziert wurden, oder wenn mit Hilfe eines CpG-Oligonukleotids eine Entzündungsreaktion in der Leber induziert wurde. Allerdings war die Autoaggression nur transient und konnte auch durch wiederholte Gabe des Oligonukleotids nicht in eine chronische Autoimmunerkrankung umgewandelt werden [5]. Die Schlussfolgerung aus diesen Untersuchungen ist, dass mindestens zwei Schritte für die organspezifische Autoimmunattacke notwendig sind, nämlich 1. Aktivierung autoreaktiver T-Zellen, und 2. Konditionierung des Organs durch eine Entzündungsreaktion, wodurch die Infiltration von autoreaktiven T-Zellen ermöglicht wird. Dieses Konzept wird auch unterstützt durch unsere tumorimmunologischen Studien. Da die Aktivierung autoreaktiver T-Zellen nicht notwendigerweise der bestimmende Schritt bei einer Autoimmunerkrankung sein muss, haben wir begonnen, Faktoren, denen eine grosse Bedeutung in chronischen Entzündungsprozessen zugedacht ist, in unsere Studien mit einzubeziehen. Es wurden daher knockout-mäuse für folgende Moleküle etabliert: Gelatinase B (in Zusammenarbeit mit G. Opdenakker, Leuven), Receptor für advanced glycation end products (RAGE) (in Zusammenarbeit mit P. Nawroth, Heidelberg), und Stabilin-1 sowie Stabilin-2 (in Zusammenarbeit mit S. Goerdt, Mannheim). Sowohl Gelatinase B- [6-8] wie auch RAGE- [9-13]-defiziente Tiere sind gegen bakteriell Abteilung D050 Molekulare Immunologie induzierte Sepsis geschützt. In Zusammenarbeit mit T. Chavakis konnten wir weiterhin beobachten, dass die Bindung zwischen RAGE auf Endothelzellen und dem β2-integrin Mac-1 auf Leukozyten zur Extravasation von Leukozyten in Entzündungsherde beiträgt [9]. Diese Befunde unterstreichen die wichtige Rolle von Gelatinase B und RAGE in Entzündungsprozessen. Die beiden Stabilin-knockout-Mäuse werden z.zt. charakterisiert. Um den Einfluss von Proteinen auf Entzündungsprozesse bzw. die Immunantwort im Detail studieren zu können, ist es wünschenswert, die entsprechende Genexpression gewebsspezifisch induzierbar und reversibel regulieren zu können. Wir versuchen, diese Regulation über das Tetrazyklinsystem bzw. über Hormone im Cre/loxP-System aufzubauen. Wir haben daher eine neuartige knockin-egfp (grün fluoreszierendes Protein)-Rezeptormaus etabliert, deren Zellen nach Cre-Rekombination grün aufleuchten. Das An- bzw. Ausschalten einer Genexpression kann auf diese Weise auf Einzelzellebene z.b. in histologischen Schnitten sichtbar gemacht werden [14]. Ferner wurden transgene Tie2- CreER T2 -Mäuse etabliert, in denen Cre-Expression mit Hilfe von Tamoxifen ausschliesslich in Endothelzellen induziert werden kann. Diese Tiere ermöglichen nun das An-, bzw. Abschalten einer Genexpression in Endothelzellen nach Kreuzung mit entsprechend gefloxten Mäusen [15]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Schuler T, Hämmerling GJ, Arnold B. Cutting Edge: IL-7-dependent homeostatic proliferation of CD8+ T cells in neonatal mice allows the generation of long-lived natural memory T cells. J Immunol. 2004, 172(1): [2] Alferink, J., Tafuri, A., Vestweber, D., Hallmann, R., Hämmerling, G.J. and Arnold, B. Peripheral T cell trafficking controls neonatal tolerance to tissue-antigens. Science 282: , [3] Alferink, J., Aigner, S., Reibke, R., Hämmerling, G. and Arnold, B. Peripheral T cell tolerance: the contribution of permissive T cell migration into parenchymal tissues of the neonate. Immunol. Rev. 169: , [4] Arnold B. Levels of peripheral T cell tolerance. Transpl Immunol. 2002,10(2-3): [5] Sacher T, *Knolle P, *Nichterlein T, Arnold B, Hämmerling GJ, Limmer A. CpG-ODN-induced inflammation is sufficient to cause T-cell-mediated autoaggression against hepatocytes. Eur J Immunol. 2002, 32(12): [6] *Dubois B, *Starckx S, *Pagenstecher A, *Oord J, Arnold B, *Opdenakker G. Gelatinase B deficiency protects against endotoxin shock. Eur J Immunol. 2002, 32(8): [7] *Starckx S, *Wuyts A, *Opsomer I, *Van Coillie E, *Proost P, Arnold B, *Van Damme J, *Opdenakker G. Recombinant mouse granulocyte chemotactic protein-2: production in bacteria, characterization, and systemic effects on leukocytes. J Interferon Cytokine Res. 2002, 22(9): [8] *Opdenakker G, *Van den Steen PE, *Laureys G, *Hunninck K, Arnold B. Neutralizing antibodies in gene-defective hosts. Trends Immunol. 2003, 24(2): [9] *Chavakis T, *Bierhaus A, *Al-Fakhri N, *Schneider D, *Witte S, *Linn T, *Nagashima M, *Morser J, Arnold B, *Preissner KT, *Nawroth PP. The pattern recognition receptor (RAGE) is a counterreceptor for leukocyte integrins: a novel pathway for inflammatory cell recruitment. J Exp Med. 2003, 198(10): [10] *Deane R, *Du Yan S, *Submamaryan RK, *LaRue B, *Jovanovic S, *Hogg E, *Welch D, *Manness L, *Lin C, *Yu J, *Zhu H, Ghiso J, *Frangione B, *Stern A, *Schmidt AM, *Armstrong DL, Arnold B, Liliensiek B, *Nawroth P, *Hofman F, *Kindy M, *Stern D, *Zlokovic B. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 2003; 9(7):

246 246 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie [11] *Wendt T, *Tanji N, *Guo J, *Hudson BI, *Bierhaus A, *Ramasamy R, Arnold B, Nawroth PP, *Yan SF, *D Agati V, *Schmidt AM., Glucose, glycation, and RAGE: implications for amplification of cellular dysfunction in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003, 14(5): [12] *Sakaguchi T, *Yan SF, *Yan SD, *Belov D, *Rong LL, *Sousa M, *Andrassy M, *Marso SP, *Duda S, Arnold B, *Liliensiek B, *Nawroth PP, *Stern DM, *Schmidt AM, *Naka Y. Central role of RAGE-dependent neointimal expansion in arterial restenosis. J Clin Invest. 2003, 111(7): [13] *Wendt TM, *Tanji N, *Guo J, *Kislinger TR, *Qu W, *Lu Y, *Bucciarelli LG, *Rong LL, *Moser B, *Markowitz GS, *Stein G, *Bierhaus A, Liliensiek B, Arnold B, *Nawroth PP, *Stern DM, *D Agati VD, *Schmidt AM. RAGE drives the development of glomerulosclerosis and implicates podocyte activation in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Am J Pathol. 2003, 162(4): [14] Constien, R., Forde, A., Liliensiek, B., Gröne, H.-J., Nawroth, P., Hämmerling, G.J., Arnold, B., Characterizationof a novel EGFP reporter mouse to monitor Cre recombination as demonstrated by a Tie2 Cre mouse line. Genesis 2001, 30: [15] Forde A, Constien R, Grone HJ, Hammerling G, Arnold B. Temporal Cre-mediated recombination exclusively in endothelial cells using Tie2 regulatory elements. Genesis. 2002, 33(4): Antigenpräsentation durch MHC-I-Moleküle Die Rolle von Chaperon-Molekülen und Aminopeptidasen im endoplasmatischen Retikulum F. Momburg, N. Garcia-Garbi, S. Tanaka, N. Tiwari, M. Papadopoulos, J. Albring, N. Bulbuc, G.J. Hämmerling In Zusammenarbeit mit: H. Hengel, Robert-Koch-Institut, Berlin; Y. Reiss, Tel Aviv University, Ramat Aviv, Israel; M. Lobigs, John Curtin School of Medical Research, Canberra, Australien Für eine erfolgreiche Immunantwort durch cytotoxische T-Zellen ist die spezifische Erkennung eines Antigens notwendig. Cytotoxische T-Zellen erkennen jedoch keine intakten Proteinantigene, sondern Peptide aus intrazellulären Molekülen (z.b. tumorassoziierte Antigene, virale Proteine), die von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Molekülen (MHC-I) auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Hierzu werden intrazelluläre Proteine zunächst durch das Proteasom, einem cytosolischen Proteasekomplex, in Peptidfragmente geschnitten. Aus dem Cytosol werden diese Peptide dann vom TAP-Peptidtransporter in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie mit MHC-I- Molekülen assoziieren und diese stabilisieren. Im Verlauf ihrer Reifung im ER werden MHC-I-Moleküle von verschiedenen Helfermolekülen (Chaperonen) begleitet, die die korrekte Molekülfaltung sowie die Bindung von Peptiden unterstützen. Nach erfolgreicher Peptidbeladung verlassen MHC-I- Moleküle das ER zur Zelloberfläche. In verschiedenen Projekten bearbeiten wir Teilaspekte des MHC-I-abhängigen Weges der Antigenpräsentation. Verschiedene Viren haben Strategien entwickelt, den Peptidtransport ins ER zu unterbinden, um einer von MHC-I- Molekülen abhängigen Immunantwort durch cytotoxische CD8 + T-Zellen auszuweichen [1]. Zusammen mit Dr. Hengel (RKI Berlin) haben wir das Cytomegalievirus-Protein gpus6 charakterisiert, welches an TAP im ER-Lumen bindet und den Peptidtransport inhibiert und dadurch eine verminderte MHC-I-Zelloberflächenexpression und Antigenpräsentation bewirkt [2, 3]. In einem laufenden Projekt bearbeiten wir die molekularen Strukturen innerhalb der humanen TAP- Abteilung D050 Molekulare Immunologie Untereinheiten TAP1 und TAP2, die von gpus6 im ER angegriffen werden. Andere Arten von Viren verfolgen die Strategie, die von NK(Natürliche Killer)-Zellen vermittelte Immunantwort zu unterlaufen. Zusammen mit unserem australischen Kooperationspartner Dr. Lobigs konnten wir zeigen, daß es während einer Infektion mit Flaviviren zu einer Erhöhung des TAP-vermittelten Peptidtransports kommt. Als Folge einer gesteigerten MHC-I-Zelloberflächenexpression ist die Erkennung der virusinfizierten Zellen durch NK-Zellen blockiert, welche normalerweise MHC-I-defiziente Zellen attackieren [4]. Zusammen mit unserem israelischen Kooperationspartner Dr. Reiss haben wir die Rolle des ATP-abhängigen 26S-Proteasoms beim Abbau von Modellantigenen in Peptide und den anschließenden TAP-vermittelten Transport über die ER-Membran untersucht. In einem In-Vitro-System ließ sich der gesamte Vorgang mit gereinigten Proteasomen und TAP-haltigen Membranen rekonstruieren. Proteasomen generierten aminoterminal verlängerte Vorläuferpeptide, die nach TAP-vermitteltem Transport im ER von einer Metalloaminopeptidase verkürzt wurden [5]. In laufenden Untersuchungen befassen wir uns mit der Rolle der noch wenig untersuchten Aminopeptidasen ERAP1 und L-RAP im ER. Die Peptidprozessierung durch ER-Aminopeptidasen wird nach unseren Befunden vom peptidbindenden MHC-I-Molekül innerhalb des so genannten TAP-abhängigen Peptidbeladungskomplexes gesteuert. Viele Peptide, die durch TAP ins ER importiert werden, finden dort aufgrund strenger Anforderungen an die Aminosäuresequenz kein geeignetes MHC-I-Molekül für eine stabile Bindung. Wir haben herausgefunden, auf welchem Weg solche Peptide schnell aus dem ER entfernt werden. Nach vorübergehender Bindung an ER-Chaperone verlassen überschüssige Peptide wieder das ER durch den Sec61- Kanal in Richtung Cytoplasma, wo sie abgebaut werden [5]. Auch fehlgefaltete Proteine verlassen das ER durch den Sec61-Kanal, der hauptsächlich als Kanal zum Import von Proteinen in das ER dient (Translokon-Funktion), um anschließend im Cytosol von Proteasomen abgebaut zu werden. Wir haben den Mechanismus dieser Protein-Retrotranslokation ins Cytosol näher untersucht und herausgefunden, daß ATP-abhängige Konformationsänderungen von ER-Chaperonen dabei eine wichtige Rolle spielen [7]. Das ER-residente Chaperon Tapasin ist zu einem zentralen Forschungsgegenstand der Arbeitsgruppe geworden. Tapasin ist ein Adaptormolekül, das es MHC-I-Molekülen ermöglicht, vorübergehend mit dem Peptidtransporter zu assoziieren. Von uns produzierte Tapasin-defiziente Mäuse zeigen eine stark verminderte MHC-I-Zelloberflächenexpression und Antigenpräsentation sowie eine reduzierte Anzahl von CD8 + cytotoxischen T-Zellen [8-10]. In Abwesenheit von Tapasin sind Immunantworten gegen verschiedene Pathogene beeinträchtigt, was auf eine wichtige Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-I hinweist. Wir konnten zeigen, daß die Tapasin-vermittelte Einbindung von MHC-I-Molekülen in molekulare Komplexe mit TAP für die Optimierung des Peptidrepertoires und die Stabilisierung von MHC-I-Molekülen von großer Bedeutung ist [11-13]. In laufenden Studien untersuchen wir, auf welche Art und Weise Tapasin zur Selektion von optimierten Antigenpeptiden beiträgt und wie Tapasin an MHC-I-Moleküle bindet. Darüberhinaus hat Tapasin eine Chaperon-Funktion für den TAP-Peptidtransporter, welcher in Abwesenheit von Tapasin nur eine sehr geringe Stabilität aufweist

247 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie [11-14]. Gegenwärtig untersuchen wir den molekularen Mechanismus der Stabilisierung von TAP durch Tapasin. Wir haben herausgefunden, daß MHC-I-Moleküle im ER mit der thiolabhängigen Oxidoreduktase ER60 assoziiert sind, wobei diese beiden Moleküle zeitweilig über eine Disulfidbrücke kovalent verknüpft sind [15, 16]. Die Proteinisomerase ER60 könnte die Funktion haben, intramolekulare Disulfidbrücken in MHC-I-Molekülen korrekt auszubilden bzw. diese im Verlauf einer Tapasin- und TAP-abhängigen Peptidbeladung vorübergehend wieder zu öffnen. Gegenwärtig studieren wir die Funktion dieses Chaperons in Bezug auf die MHC-I-vermittelte Antigenpräsentation anhand von In-Vitro-Modellen und ER60-defizienten Mäusen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Momburg, F., and *Hengel, H Obstructing the bottleneck: the transporter associated with antigen processing (TAP) as a target for immune subversion by viruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 269: [2] *Hengel, H. Koopmann, J.-O., *Muranyi, W., *Goulmy, E., Hämmerling, G.J., *Koszinowski, U.H., and Momburg, F A viral ER-resident glycoprotein inactivates the MHC-encoded peptide transporter. Immunity 6: [3] *Ulbrecht, M., *Hofmeister, V., *Yüksekdag, G., *Ellwart, J.W., *Hengel, H., Momburg, F., *Martinozzi, S., *Reboul, M., *Pla, M., and *Weiss, E.W HCMV glycoprotein US6 mediated inhibition of TAP does not affect HLA-E dependent protection of K-562 cells from NK cell lysis. Hum. Immunol. 64: [4] Momburg, F., *Müllbacher, A., and *Lobigs, M Modulation of transporter with antigen processing (TAP)-mediated peptide import into the endoplasmic reticulum by flavivirus infection. J. Virol. 75: [5] *Komlosh, A., Momburg, F., *Weinschenk, T., *Emmerich, N., *Schild, H., *Nadav, E., *Shaked, I., and *Reiss, Y A role for a novel luminal endoplasmic reticulum aminopeptidase in final trimming of 26S proteasome-generated major histocompatability complex class I antigenic peptides. J. Biol. Chem. 276: [6] Koopmann, J.-O., Albring, J., Hüter, E., Bulbuc, N., *Spee, P., *Neefjes, J., Hämmerling, G.J., and Momburg, F Export of antigenic peptides from the endoplasmic reticulum intersects with retrograde protein translocation through the Sec61p channel. Immunity 13: [7] Albring, J., Koopmann, J.O., Hämmerling, G.J., and Momburg. F. Retrotranslocation of MHC class I heavy chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol is dependent on ATP supply to the ER lumen. Mol. Immunol. 40: , [8] Garbi, N., Tan, P., *Diehl, A.D., *Chambers, B.J., *Ljunggren, H.-G., Momburg, F., and Hämmerling, G Impaired immune responses and altered peptide repertoire in tapasin-deficient mice. Nat. Immunol. 1: [9] Garbi, N., Tan, P., Momburg, F., and Hämmerling, G.J Role of tapasin in MHC class I antigen presentation in vivo. Adv. Exp. Med. Biol. 495: [10] Brocke, P., Garbi, N., Momburg, F., and Hämmerling, G.J HLA-DM, HLA-DO, and tapasin: Functional similarities and differences. Curr. Opin. Immunol. 14: [11] Tan, P., *Kropshofer, H., *Mandelboim, O., Hämmerling, G.J., and Momburg, F Recruitment of MHC class I molecules by tapasin into the TAP-associated complex is essential for optimal peptide loading. J. Immunol. 168: [12] Momburg, F., and Tan, P Tapasin - the keystone of the loading complex optimizing peptide binding by MHC class I molecules in the endoplasmic reticulum. Mol. Immunol. 39: Abteilung D050 Molekulare Immunologie [13] Tan, P., Hämmerling, G.J., and Momburg, F Optimization of MHC class I-bound peptides requires tapasin-mediated integration of class I molecules into the transporter associated with antigen processing-associated complex. In: J.A. Hansen, B. Dupont (Eds.). HLA 2004, Immunobiology of the Human MHC, im Druck. [14] Garbi, N., Tiwari, N., Momburg, F., and Hämmerling, G A major role for tapasin as a stabilizer of the TAP peptide transporter and consequences for MHC class I expression. Eur. J. Immunol. 33: [15] Lindquist, J.A., *Jensen, O.N., *Mann, M., and Hämmerling, G.J ER-60, a chaperone with thiol-dependent reductase activity involved in MHC class I assembly. EMBO J. 17: , [16] *Lindquist, J.A., Hämmerling, G.J., and *Trowsdale, J ER60/ERp57 forms dislufide-bonded intermediates with MHC class I heavy chain. FASEB J. 15: Antikörper-gestützte Immuntherapie menschlicher Karzinome und maligner Lymphome (D0404) G. Moldenhauer, E. Hallauer, S. Heeger, S. Lüttgau In Zusammenarbeit mit: F. Breitling, U. Haberkorn und M. Little, DKFZ; A. Marmé und M. Lindner, Frauenklinik der Universität Heidelberg; G. Egerer, M. Kornacker und H. Goldschmidt, Medizinische Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg; R. Haas, Medizinische Klinik der Universität Düsseldorf; A. Pezzutto, MDC Berlin-Buch; G. Strauß, Kinderklinik der Universität Ulm; P. Möller, Pathologisches Institut der Universität Ulm; C. Apostolides und T. Nikula, Institute for Transuranium Elements, Karlsruhe. Seit über 100 Jahren, ausgehend Paul Ehrlichs Vorstellung von Antikörpern als Zauberkugeln, sind Immunologen von der Idee fasziniert, Tumorzellen mit Antikörpermolekülen allein oder daraus gewonnenen Konjugaten zu zerstören. Mit Einführung der monoklonalen Antikörper 1975 durch Köhler und Milstein wurden hohe Erwartungen in eine neue Immuntherapie von Tumorerkrankungen gesetzt, die sich jedoch nur in bestimmten Fällen -vor allem bei Leukämien und malignen Lymphomen- erfüllt haben. Die Probleme, die bei der Antikörpertherapie auftraten, liegen auf verschiedenen Ebenen. Zum einen stellt die unzureichende Penetration monoklonaler Antikörper in das Tumorgewebe speziell bei soliden und wenig vaskularisierten Tumoren ein großes Hindernis dar. Eine zweite bedeutsame Ursache für das geringe Ansprechen mit unkonjugierten Antikörpern reflektiert die erkrankungsbedingte Beeinträchtigung der körpereigenen humoralen und zellulären Effektormechanismen, das heißt die tumorinduzierte Immunsuppression. Drittens reagiert die Mehrzahl der therapeutisch angewendeten Antikörper mit Differenzierungsantigenen, die (obgleich meist viel schwächer) auch auf Normalzellen exprimiert sind. Historisch sind die ersten therapeutisch genutzten monoklonalen Antikörper als bloße Immunglobuline eingesetzt worden. Später hat man die Spezifität der Antikörper dann genutzt, um sie als Vehikel für Toxine, Zytostatika oder radioaktive Substanzen einzusetzen. Einen Meilenstein in der therapeutischen Anwendung monoklonaler Antikörper stellte die Zulassung des chimären (Maus/Mensch) Antikörpers MabThera (Rituximab in den angloamerikanischen Ländern) dar, der gegen das CD20 Antigen gerichtet ist. Bei Non-Hodgkin-Lymphomen der B-Zellreihe wurden durch die Kombination von Mabthera â mit einer zystostatischen Therapie Ansprechraten von nahezu 100% erreicht. Trastuzumab (Herceptin ) stellt einen komplett humanisierten Antikörper dar, der spezifisch an den HER2-Rezeptor (humaner epider- 247

248 248 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie maler Wachstumsfaktor Rezeptor 2) bindet. Eine Überexpression des Rezeptors tritt bei etwa 25-30% der Patientinnen mit Mammakarzinom auf und ist assoziiert mit einer schlechteren Prognose des Krankheitsverlaufs. Die Firstline Therapie des metastasierten Mammakarzinoms mit HER2 Überexpression erbrachte in 26% der Fälle ein objektives Ansprechen auf die Antikörperbehandlung. Eine interessante neuere Therapiestategie basiert auf der Zielrichtung zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) auf Tumorzellen mittels bispezifischer Antikörper. Bei den bispezifischen Antikörpern handelt es sich um Hybridmoleküle, die zwei unterschiedliche Antigenbindungsstellen besitzen. Sie können entweder durch chemische Verknüpfung von zwei monovalenten Fab -Antikörperfragmenten oder eleganter durch Zellfusion zweier Hybridome zu einem Hybrid- Hybridom, welches bispezifische Antikörper sezerniert, erhalten werden. Die Spezifität zytotoxischer T-Zellen ist durch ihren Antigenrezeptor bestimmt, der auf der Zellmembran zusammen mit dem CD3 Molekül exprimiert wird. Physiologischerweise erkennen CTL Fremdantigene (genauer: Peptidbruchstücke derselben) nur in Assoziation mit Strukturen des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes (MHC). In grundlegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß sich CTL unter Umgehung ihrer genetisch determinierten Spezifität durch bispezifische Antikörper auf beliebige Zielzellen lenken lassen. Dabei wird durch die eine Valenz des Hybridantikörpers (zumeist anti-cd3) die T-Zelle aktiviert und durch die zweite Valenz die Zielzelle an die T- Zelle gebunden, von der sie nachfolgend lysiert wird. Die Selektivität der zytotoxischen Reaktion wird ausschließlich von der Spezifität des Antikörpers bestimmt und ist nicht MHC-restringiert. Bispezifische Antikörper zur Behandlung von B-Zellneoplasien: Wir haben Hybrid-Hybridome hergestellt, welche Antikörper der Spezifität CD19xCD3 sezernieren. Wir haben uns auf das CD19 Molekül als Zielantigen konzentriert, da es die breiteste Expression während der B-Zelldifferenzierung aufweist und auf praktisch allen Leukämie und Lymphomzellen vorkommt, die sich von den B-Lymphozyten herleiten. Der CD19xCD3 bispezifische Antikörper wurde einer umfassenden präklinischen Evaluation unterzogen, um seine in vitro Wirksamkeit zu belegen. Insbesondere konnten präaktivierte T-Lymphozyten nach Zugabe von bispezifischem CD19xCD3 Antikörper sowohl auf allogene als auch auf autologe Tumorzellen von Patienten mit call (common acute lymphoblastic leukemia) und B-CLL (chronic lymphocytic leukemia) gelenkt werden und diese effizient lysieren. In letzter Zeit haben wir uns auf die Erprobung einer neuen Art von Effektorzellen konzentriert, nämlich der Zytokininduzierten Killerzellen (CIK-Zellen). Hierbei handelt es sich um T-Lymphozyten, die den natürlichen Killerzellen (NK- Zellen) sehr ähnlich sind, indem sie eine MHC unabhängige spontane Zytotoxizität gegen verschiedene Tumorzellen aufweisen. Eine Besonderheit dieser Zellpopulation, die etwa 1% der peripheren weißen Blutzellen ausmacht, ist die Fähigkeit, in Gegenwart eines Gemisches aus IFN-γ, IL-2 und des Antikörpers OKT3 in Gewebekultur bis tausendfach zu expandieren. Die Kombination der CIK-Zellen mit dem CD19xCD3 bispezifischen Antikörper erbrachte eine dramatische Steigerung der Apoptoserate in autologen B-CLL Proben. Die GMP-gemäße Vermehrung der CIK-Zellen von Patienten wurde inzwischen von unseren klinischen Kooperationspartnern etabliert. Gegenwärtig bereiten wir Abteilung D050 Molekulare Immunologie eine Studie vor, welche die Wertigkeit mit Antikörpern beladener CIK-Zellen bei CLL Patienten evaluieren soll. Bispezifische Antikörper zur Behandlung von Karzinomen: In einem zweiten Projekt haben wir Hybrid-Hybridome der Spezifitäten HEA125xCD3 und HEA125xCD264 hergestellt. Der Antikörper HEA125 reagiert mit dem Membranglykoprotein Ep-CAM, das auf praktisch allen Karzinomzellen aber auch auf normalen epithelialen Zellen des Menschen (allerdings in geringerer Konzentration) exprimiert ist. Eine besondere Eigenschaft dieses Antigens liegt darin, daß es auch auf bösartig veränderten Tumorzellen niemals verloren geht, während viele andere Membranmarker während der Krebsentwicklung nicht mehr nachweisbar sind. Patientinnen mit Ovarialkarzinom entwickeln im Endstadium der Erkrankung häufig eine tumorbedingte Bauchwassersucht (maligner Aszites). Sie haben nicht nur eine begrenzte Lebenserwartung sondern auch eine stark eingeschränkte Lebensqualität. Der Aszites, der in der Regel ein Volumen von mehreren Litern aufweist, führt häufig zu schweren körperlichen Beeinträchtigungen wie Atemeinschränkung und Verlegung des Darmtrakts. Dies macht die wiederholte Punktion mit Ablassen der Aszitesflüssigkeit erforderlich, die allerdings oft binnen Tagen oder Wochen nachgebildet wird. Immunologische Zusatzbehandlungen scheinen eine geeignete palliative Möglichkeit für diese Gruppe von Patientinnen zu eröffnen, für die es kaum therapeutische Alternativen gibt. Bisher wurden 11 Patientinnen mit fortgeschrittenem und konventionell nicht mehr therapierbarem Ovarialkarzinom und massiver Aszitesbildung in eine klinische Studie aufgenommen, die wir zusammen mit der Frauenklinik der Universität Heidelberg durchführen. Das Behandlungsprotokoll schreibt die möglichst vollständige Abpunktion der Aszitesflüssigkeit und die nachfolgende Gabe von 1 Milligramm bispezifischen Antikörper HEA125xOKT3 in die Bauchhöhle vor. Die Behandlung wird viermal in wöchentlichem Abstand wiederholt. Alle Patientinnen sprachen klinisch auf die Behandlung an. Bei 9 Patientinnen kam es zu einem völligen Verschwinden der Aszitesproduktion, während 2 Patientinnen eine signifikante Rückbildung des Flüssigkeitsvolumens aufwiesen. Bemerkenswerterweise zeigten 8 Patientinnen eine Stabilisierung beziehungsweise einen Rückgang des Tumormarkers CA125 im Serum. Die beobachteten Nebenwirkungen waren für die Patientinnen tolerabel und bestanden vor allem in Fieber, Schüttelfrost, Blutdruckabsenkung und allergischen Hautreaktionen, die durch eine Begleitmedikation gut behandelbar waren. Als Ergebnis der Studie können wir zusammenfassen, daß alle Patientinnen zumindest im Sinne einer Verbesserung der Lebensqualität von der lokalen Antikörpertherapie profitiert haben, ohne belastende Nebenwirkungen in Kauf nehmen zu müssen. In Spätstadien des Mammakarzinoms tritt häufig - ähnlich wie beim Ovarialkarzinom - ein maligner Erguß auf, der in der Pleurahöhle lokalisiert ist und die Atmung stark behindert. Nach bereits erteiltem positivem Votum der örtlichen Ethik-Kommission steht der Beginn der klinischen Erprobung des HEA125xOKT3 Antikörpers als lokale Immuntherapie bei dieser Indikation unmittelbar bevor. Alpha-Immuntherapie von Non-Hodgkin- Lymphomen Die Alpha-Immuntherapie stellt eine experimentelle Form der Radioimmuntherapie dar, welche Antikörper als Carrier- Moleküle einsetzt, um eine an den Antikörper konjugierte

249 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D050 Molekulare Immunologie radioaktive Substanz mit hoher Spezifität an die Tumorzellen zu bringen. Aufgrund ihrer besonderen physikalischen Eigenschaften scheinen Alpha-Strahlen emittierende Radioisotope wie Bismuth-213 ( 213 Bi) besonders geeignet zu sein. Diese erlauben, bei einer geringen Eindringtiefe von nur wenigen Zelldurchmessern ( µm) aber hohem linearen Energietransfer (LET) von ca. 100 kev/µm, das selektive Applizieren von wesentlich höheren Strahlendosen als beispielsweise bei einer Therapie mit Betastrahlern. Nachdem präklinische Experimente mit 213 Bi-gekoppelten anti- CD19- und anti-cd20-antikörpern zur Behandlung des Non- Hodgkin Lymphoms (NHL) viel versprechende Resultate zeigten, wurde eine Phase I-Studie im Rahmen einer Kooperation des DKFZ mit der Medizinischen Universitätsklinik Heidelberg durchgeführt. Bisher wurden bei der Anwendung des mit einem Chelator versehenen und 213 Bi-markierten MabThera Antikörpers keine relevanten Toxizitäten bei den Patienten dieser Dosiseskalationsstudie beobachtet. Die Studie wird derzeit unter Einbeziehung des Universitätsklinkums Düsseldorf fortgesetzt. Rekombinante Antikörperkonstrukte: Um das therapeutische Potential von bispezifischen CD19xCD3 Konstrukten zu erhöhen, haben wir neue rekombinante Moleküle generiert. Zu diesen gehört ein tetravalentes bispezifisches Dimer mit einem Molekulargewicht von 114 kda ( Tandem diabody ) sowie ein bivalentes und bispezifisches Konstrukt mit 57 kda ( Single-chain diabody ). Verglichen mit einem konventionellen Diabody wiesen diese neuen, über einen Peptidlinker verbundenen, Reagenzien neben einer höheren Affinität und Stabilität in vivo auch eine längere Retentionszeit im Blut auf. Durch die Gabe des Tandem diabody zusammen mit humanen peripheren Blutlymphozyten und einem CD28 monoklonalen Antikörper konnten Lymphom-tragende SCID-Mäuse vollständig geheilt werden. Demgegenüber wurde mit dem konventionellen Diabody nur eine partielle Tumorregression erzielt. Diese Befunde deuten darauf hin, daß sich der Tandem diabody zu einem vielversprechenden Konstrukt für die Behandlung von B-Zellneoplasien entwikkeln könnte. Um die unerwünschten Nebenwirkungen von Antikörpertherapien zu umgehen, die auf der Reaktion gegen das fremde Immunglobulin beruhen, befassen wir uns mit der Chimärisierung/Humanisierung von Hybridomantikörpern. Am Beispiel des von der Maus stammenden monoklonalen Antikörpers HEA125 (gerichtet gegen das Tumor assoziierte Ep-CAM Antigen) haben wir eine Methode etabliert, durch den die konstanten Domänen von Antikörpern direkt in der sie produzierenden Hybridomzelle humanisiert werden können. Er basiert auf homologer Rekombination im Genom der Hybridomzelle. Die Mausgene, die für den konstanten Teil der leichten Kette des Antikörpers kodieren, konnten bereits durch dieselben humanen Gene ersetzt werden. Die Humanisierung der schweren Kette soll nach dem gleichen Prinzip geschehen. Neu bei der Durchführung der homologen Rekombination in diesem Fall ist, dass kein Marker zur Vorselektion mit eingebracht wird. Dieser wird normalerweise benötigt, um später die sehr wenigen homolog rekombinierten Zellen (etwa 1 Zelle in 10 Millionen) anreichern zu können. Jedoch verringert ein Selektionsmarker meist die Expressionsstärke des Zielgens und damit die Antikörperproduktion der Hybridomzellen. Um das zu verhindern, geschieht die Isolierung der Zellen, die chimäre Antikörper produzieren, ohne Vorselektion direkt mittels FACS- Sortierer (Fluorescence Activated Cell Sorting). Die Isolierung per FACS ist möglich, weil die humanisierten Antikörper auch auf der Oberfläche der sie produzierenden Zellen ausgeprägt werden und dort als Selektionsmerkmal dienen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Gemmel*, C., Cremer*, F.W., Weis*, M., Witzens*, M., Moldenhauer, G., Konizczek*, K.-H., Imbach*, U., Ho*, A.D., Moos*, M., and Goldschmidt*, H. Anti-CD20 antibody as consolidation therapy in a patient with primary plasma cell leukemia after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation. Ann. Hematol. 81: , [2] Moldenhauer, G. Antikörper-gestützte Therapieverfahren bei Non-Hodgkin-Lymphomen der B-Zellreihe (B-NHL). In: Onkologie (Hrsg. J.W. Zeller und H. zur Hausen), S. IV Ecomed Verlag, Landsberg, [3] Kipriyanov*, S.M., Cochlovius, B., Schäfer*, H., Moldenhauer, G., Bähre*, A., Le Gall*, F., Knackmuss, S., and Little, M. Therapy of Burkitt s lymphoma in severe combined immunodeficiency mice by human PBL in combination with bispecific CD19xCD3 and CD19xCD16 diabodies. J. Immunol. 169: , [4] Marmé*, A., Strauß*, G., Bastert*, G., Grischke*, E.-M., and Moldenhauer, G. Intraperitoneal bispecific antibody (HEA125xOKT3) therapy inhibits malignant ascites production in advanced ovarian carcinoma. Int. J. Cancer 101: , [5] Schweizer, C., Strauß*, G., Lindner*, M., Marmé*, A., Deo*, Y.M., and Moldenhauer, G. Efficient carcinoma cell killing by activated polymorphonuclear neutrophils targeted with an Ep- CAMxCD64 (HEA125x197) bispecific antibody. Cancer Immunol. Immunother. 51: , [6] Moldenhauer, G. und Marmé*, A. Entwicklung und Einsatz eines bispezifischen Antikörpers in der Behandlung des fortgeschrittenen Eierstockkrebses. In: Krebsforschung heute, Berichte aus dem Deutschen Krebsforschungszentrum 2002, Steinkopff Verlag, Darmstadt, p , [7] Moldenhauer, G. and Marmé*, A. Development and clinical application of a bispecific antibody in advanced ovarian carcinoma. In: Current Cancer Research Steinkopf Darmstadt, Springer New York, p , [8] Mollenhauer, J., Deichmann*, M., Helmke*, B., Müller, H., Kollender, G., Holmskov*, U., Ligtenberg*, T., Krebs, I., Wiemann, S., Bantel-Schaal, U., Madsen*, J., Bikker*, F., Klauck, S.M., Otto*, H.F., Moldenhauer, G., and Poustka, A. Frequent downregulation of DMBT1 and Galectin-3 in epithelial skin cancer. Int. J. Cancer 105: , [9] Kipriyanov*, S.M., Moldenhauer, G., Braunagel*, M., Reusch*, U., Cochlovius, B., Le Gall*, F., Kouprianova*, O.A., Von der Lieth, C.-W., and Little, M. Effect of domain order on the activity of bacterially produced bispecific single-chain Fv antibodies. J. Mol. Biol. 330: , [10] Le Gall*, F., Reusch*, U., Moldenhauer, G., Little, M., and Kipriyanov*, S.M. Immunosuppressive properties of an anti-cd3 single-chain Fv and diabody. J. Immunol. Meth. 285: , Transgene Tumormäuse: Kontrolle der Tumortoleranz und Immunität durch das Mikromilieu R. Ganss, N. Garbi, M. Berger, Y. Kawarada, M. Furuya, S. Stahl, K. Tauber, L. Umansky, C. Schmitt, K. Frank, B. Arnold, G.J. Hämmerling In Zusammenarbeit mit E. Klar, R. Ryschich, Universitätsklink Heidelberg; G. Bergers, UCSF, San Francisco, USA; P. Knolle, Universität Bonn; A. Hamann, Experimentelle Rheumatologie, Berlin; Siamon Gordon, Universität Oxford, UK. In den letzten Jahren durchgeführte Untersuchungen am Tiermodell und klinische Studien haben gezeigt, dass Tumo- 249

250 250 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie ren häufig trotz erfolgreicher Aktivierung von tumorspezifischen T Zellen weder eliminiert noch an ihrem Wachstum gehindert werden. Viele Tumoren sind jedoch eindeutig immunogen und tumorspezifische T Zellen sind in der Peripherie und in Tumor-infiltrierten Lymphknoten nachweisbar. In eigenen Studien wurde der Effektor-Arm der Tumorabwehr mit Hilfe eines transgenen Tumormodells (RIPTag) getestet, in dem die Expression von SV40 T Antigen im endokrinen Pankreas zur schrittweisen Ausbildung von Insulinomen führt. In diesem autochthonen Tumormodell konnten wir zeigen, dass die Kombination eines potenten Tumorantigens (T Antigen) und aktivierter, selbstreaktiver T Zellen nicht ausreichend ist, um Tumortoleranz aufzuheben (R. Ganss and D. Hanahan, Cancer Res. 58, , 1998). Allerdings führte die Kombination von Entzündungsreaktionen, z.b. ausgelöst durch Bestrahlung, und aktivierter tumorspezifischer Lymphozyten zur Extravasation der Effektorzellen in das Tumorgewebe (R. Ganss and D. Hanahan, Cancer Res. 58, , 1998). Diese Beobachtung führte zu der Arbeitshypothese, dass neben der Tumor-Antigenpräsentation und erfolgreichen Aktivierung von Effektorzellen das dem Tumor eigene Mikromilieu massgeblich zur mangelhaften, immunologischen Tumorabwehr beiträgt (Ganss R. et al., Immunol. Rev. 169, , 1999). Im RIPTag Mausmodell erfolgt das Tumorwachstum analog zur klinischen Situation sehr langsam und über gut charakterisierte Zwischenstadien. Dabei spielt die Ausbildung neuer Blutgefässe (Angioneogenese) als Bestandteil des Tumor Stromas eine Schlüsselrolle in der Expansion der Tumormasse und der Generierung des Tumor-Mikromilieus. Blutgefässe sind jedoch nicht nur ein wesentlicher Bestandteil der Sauerstoff- und Nahrungsmittelversorgung, sondern kontrollieren die Extravasation von Leukozyten in das Gewebe. Im Prinzip sollte die Rekrutierung und Extravasation antigenspezifischer T Zellen in Tumorgeweben den gleichen Gesetzmässigkeiten unterliegen wie in normalen Geweben. Allerdings treffen Effektorzellen im Tumor nicht auf ausdifferenzierte, der Gewebe-Funktion angepasste Endothelzellen, sondern auf eine aberrante, stark proliferierende und möglicherweise de-differenzierte Blutgefässstruktur. Unser Ziel ist es aufzuklären, welche lokalen Veränderungen im Tumor notwendig sind, um Endothelien zu aktivieren und die Leukozytenextravasation zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang untersuchen wir auch, welche molekularen Veränderungen während der Angioneogenese zum Aufbau der beobachteten Blut-Tumor-Barriere führen. Entzündungsreaktionen führen zur immunologischen Tumorabwehr Solide Tumoren im RIPTag Modell sind nicht infiltriert. Durch Bestrahlung ausgelöste Entzündungsreaktionen führen jedoch zur temporären Extravasation von Effektorzellen in das Tumorgewebe. Um diese Beobachtung therapeutisch zu nutzen, wurden tumortragende RIPTag Mäuse in Langzeitexperimenten mit einer Kombination aus Bestrahlung und wiederholten Transfers mit Tag-spezifischen T Zellen behandelt. Bestrahlung oder adoptive Transfers alleine haben keinen therapeutischen Effekt. Dahingegen bewirkt die Kombinationstherapie die Abstossung bereits etablierter, autochthoner Tumoren und das Überleben von Tagtransgene Tieren, das bis zu einem Jahr verfolgt wurde [1]. Beobachtet man den Verlauf der Tumorregression über mehrere Wochen so wird deutlich, dass sich zurückbildende Tumoren makroskopisch verändern und der durch vergrösserte Blutgefässe und Hämorrhagie bedingte rote Abteilung D050 Molekulare Immunologie Phänotyp verschwindet. In der Intravitalmikroskopie wird deutlich, dass sich während der Therapie die Tumorblutgefässe umbilden, sich dem Durchmesser normaler Gefässe anpassen und wieder hierarchische Strukturen ausbilden. Diese Normalisierung der Blutgefässe erfolgt zeitgleich mit der Extravasation der Effektorzellen und geht der kompletten Tumorabstossung voraus [1]. Aufgrund dieser Ergebnisse postulieren wir, dass die Kombination aus Entzündungsreaktion und adoptiven Transfers die Öffnung der Endothelbarriere für den Angriff der Effektorzellen ermöglicht. Bestrahlung ist nur eine Möglichkeit, um eine Entzündungsreaktion auszulösen. Von bakterieller DNA abgeleitete, unmethylierte CpG Oligonukleotide aktivieren das Immunsystem indem sie die Ausschüttung entzündungsfördernder Zytokine induzieren. In einer Reihe unterschiedlicher Maus- Transplantationstumoren konnten wir in der Tat zeigen, dass die Injektion von CpG-ODN in direkter Nähe des Tumors zur kompletten Regression bereits etablierter Tumoren führt. (Kawarada et al., J. Immunol 167, , 2001). Diese Befunde wurden auf das autochthone RIPTag Model übertragen. Systemische Applikation von CpG-ODN alleine hat keinen Effekt auf die Überlebensrate transgener Tiere. Allerdings konnten wir zeigen, dass intravenöse Injektion von CpG-ODN zur Hochregulation der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 in den Blutgefässen des Pankreas und der Insulinome führt. Diese Endothel-Aktivierung wird durch die Aufnahme von CpG-ODN durch Gewebe-Makrophagen bewirkt und die sehr wahrscheinlich mit der Ausschüttung von Entzündungsfaktoren verbunden ist. Kombiniert man nun CpG-ODN mit dem adoptiven Transfer tumor-spezifischer CD4 + und CD8 + Effektorzellen kommt es zur Abstossung bereits etablierter, solider Tumoren. Dieser überzeugende therapeutische Erfolg wird komplementiert durch die erfolgreiche Behandlung von wachsdenden Transplantationstumoren, die durch peritumorale injection von CpG- ODN abgestossen werden, wobei NK und tumorspezifische CD8 + T-Killerzellen induziert wurden [5]. Dieser Befund ist somit unserem Autoimmun-Modell vergleichbar, wo CpG- ODN die Autoaggression Lebers-pezifischer Lympozyten gegen Hepatozyten auslöst [3]. Histologische und Molekulare Definition der Blut- Tumor-Barriere Mit Hilfe intravitalmikroskopischer Untersuchungen konnten wir am RIPTag Mausmodell zum ersten Mal strukturelle und funktionelle Veränderungen des Tumorendothels in den verschiedenen Stadien des Tumorwachstums in vivo verfolgen. Diese Studien haben gezeigt, dass erste morphologische Veränderungen der Blutgefässe schon in den Frühstadien der Tumorentwicklung sichtbar werden; diese ersten aberranten Gefässstrukturen korrelieren noch nicht, wie allgemein angenommen wird, mit einem verstärkten Versorgungsbedarf stark expandierender Tumoren [4]. Interessanterweise haben wir schon in den frühen, strukturell-veränderten Blutgefässen ein deutlich verringertes Rolling und Sticking von Lymphozyten beobachtet, den ersten für eine Extravasation notwendigen Schritten. Diese Funktionsstörung bleibt auch in allen nachfolgenden Tumorstadien erhalten. Damit konnten wir zeigen, dass die Blutgefässe im Prozess der malignen Transformation die Infiltration bzw. die funktionelle Interaktion von T Zellen mit dem Tumorgewebe behindern. Um die in RIPTag Mäusen dokumentierten morphologischen und funktionellen Veränderung der Tumorblutgefässe [4] auch molekular zu charakterisieren, wurden Gefässe aus

251 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Insulinomen und Langerhans schen Inseln des Pankreas aufgereinigt. Ca Klone wurden in einer subtraktiven Hybridisierungs-Studie analysiert. Eines der signfikant hochregulierten Gene ist das RGS-5 Molekül (Regulator of G- protein Signaling-5), das speziell in den Tumorgefässen überexprimiert ist (Berger et al. in Vorbe.). RGS Moleküle inhibieren die Signalübertragung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren, die physiologische Funktion in vivo ist aber noch weitgehend ungeklärt. Ein sehr interessanter Befund unserer Genexpressionsstudie war, dass die Hochregulation von RGS-5 genau mit den ersten Gefässveränderungen in den frühen Tumorstadien korreliert. In therapierten Tumoren, in denen wir eine Normalisierung der Gefässe beschrieben haben [1], ist RGS-5 hingegen nur schwach exprimiert. Damit ist RGS-5 ein Marker für aktive Angioneogenese. Wir konnten auch feststellen, dass RGS- 5 in tumoralen perivaskulären Zellen angereichert ist und dass sich diese Zellen, ebenso wie endotheliale Zellen, qualitativ im Tumor Mikromilieu verändern. In weiterführenden Studien werden wir die Zelltyp-spezifische Interaktion von RGS-5 mit Rezeptoren studieren und die mögliche Auswirkungen auf die Funktion von Tumorblutgefässen. Vergleichende Analysen der Gefässstruktur in Tumor und Normalgewebe führen wir auch an einem weiteren trangenen Tiermodell durch, in dem die Expression von T Antigen in Hepatozyten zur Ausbildung von Leberkarzinomen führt (unveröffentlichte Ergebnisse). Induzierbare Maus-Tumormodelle Für die Erprobung neuer therapeutischer Ansätze sind Tumormodelle wünschenswert, die der klinischen Situation möglichst weitgehend entsprechen. Wir haben deshalb mit Hilfe der Cre-loxP-Technologie induzierbare Hepatommäuse entwickelt. Diese Mäuse tragen das Tag Onkogen unter der Kontrolle des Albuminpromotors. Transkription ist jedoch durch eine floxstop-kassette blockiert. Nach Injektion von Cre-Adenovirus, welches das Gen für Cre-Rekombinase trägt, schneidet diese die floxstop-kassette heraus, sodass das Onkogen exprimiert wird. Die Mäuse entwickeln innerhalb von drei Monaten Hepatome. Alternativ kann Rekombination durch Injection durch Cre-Fusionsprotein erreicht werden, welches durch eine Protein-Translokationsdomäne direkt von den Hepatozyten aufgenommen wird. Der Vorteil dieser Systeme ist, dass die Cre- Rekombinase titriert werden kann, sodass nur wenige Zellen transformiert werden und wir somit über ein sporadisches und induzierbares Tumormodell verfügen. Parallel dazu haben wir Mäuse hergestellt, die Tumoren in verschiedenen Organen entwickeln. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Ganss R., *Ryschich E., *Klar E., Arnold B., and Hämmerling G.J. Combination of T-cell therapy and trigger of inflammation induces remodeling of the vasculature and tumor eradication. Cancer Res. 2002, 63: [2] Garbi N., Gordon S., Arnold B. Hämmerling G.J., and Ganss R. CpG motifs as proinflammatory factors render autochthonous tumors permissive for infiltration and destruction. J. Immunol. Zur Veröffentlichung eingereicht. [3] Sacher T., *Knolle P., Arnold B., Hämmerling G.J., and *Limmer A. CpG-ODN induced inflammation is sufficient to cause T cell mediated autoaggression against hepatocytes. Eur. J. Immunol. 2002, 32: [4] *Ryschich E., *Schmidt J., Hämmerling G.J., *Klar E., and Ganss R. Transformation of the microvascular system during multistage tumorigenesis. Int. J. Cancer 2002, 97: Abteilung D050 Molekulare Immunologie [5] Kawarada, Y., Ganss, R., Garbi, N., Sacher, T., Arnold, B., and Hämmerling, G.J., NK and CD8 + T cell mediated Eradication of Established Tumors by Peritumoral Injection of CpG-oligodeoxynucleotides. J. Immunol. 2001, 167:

252 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D060) Leiterin: Prof. Dr. med. Margot Zöller 252 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Eberhard Amtmann Dr. Christoph Claas Dr. Wolfgang Friebolin (-12/03) Dr. Rachid Marhaba Dr. Claudia Paret Doktoranden Igor Berezovskiy (10/03-) Mehdi Bourouba Gerard Devitt Frank Fries Sabine Gesierich (12/02-) Pamela Klingbeil (7/02-) Markus Ladwein (1/02-) Nicole Stroh (-12/03) Joachim Wahl Technische Assistenten Anja Alles (11/03-) Waltraud Baader Dagmar Hildebrand (8/02-) Susanne Hummel Mario Vitacolonna Sekretariat Angelika Manz Das Programm der Abteilung zentriert sich um die Frage der Tumorprogression. Wir gehen davon aus, dass Metastasierung vornehmlich durch die Aufnahme physiologischer Programme durch maligne transformierte Zellen in Gang gesetzt wird. Basierend auf dieser Arbeitshypothese konzentrieren wir uns auf die Charakterisierung physiologischer Funktionen Metastasierung-assoziierter Moleküle, insbesondere auf deren Konnektivität und wechselseitige Einflussnahme. Funktionelle Studien orientieren sich an Programmen der Lymphozytenreifung und aktivierung. Wir erwarten, dass die Klärung physiologischer Funktionen Metastasierung-assoziierter Moleküle neue therapeutische Möglichkeiten in der Tumortherapie, aber auch bei Knochenmarkstransplantation und Autoimmunerkrankungen eröffnet. Neben diesem Grundlagen-orientierten Programm befassen wir uns mit zwei Therapieoptionen, dem therapeutischen Einsatz Tumor-assoziierter Antigene und der Optimierung einer neuen Platinverbindung, die sich durch eine signifikant gesteigerte Effizienz bei gleichzeitiger Reduktion der Nebenwirkungen auszeichnet. Immuntherapeutischen Studien konzentrieren sich auf die Identifikation neuer Nierenzellkarzinom-assoziierter Antigene und auf eine Optimierung von Vakzinierungsstrategien beim Nierenzellkarzinom und bei Leukämien unter Einschluss allogener Knochenmarkstransplantation. Um gegebenenfalls einen raschen Transfer in die Klinik zu erleichtern, werden die Untersuchungen nicht nur in syngenen Tiermodellen sondern auch in der humanisierten SCID-Maus durchgeführt. I. Tumorprogression und Metastasierung Wir haben auf einem Pankreaskarzinom der Ratte 5 Oberflächenmoleküle identifiziert, die auf allen bisher untersuchten metastasierenden, nicht aber auf nicht-metastasierenden Rattentumoren exprimiert werden. Die 5 Moleküle, variante Isoformen des Adhäsionsmoleküls CD44 (CD44v), das Tetraspanin D6.1A (Homolog von CO-029), ein dem Urokinase-Rezeptor verwandtes Molekül (C4.4A), D5.7A, das Rattenhomolog von Ep-CAM und das α6β4 Integrin, werden auch auf nicht transformierten Zellen exprimiert. Allerdings gibt es im erwachsenen Organismus keine Zelle, die alle 5 Moleküle trägt. Wir gehen daher davon aus, dass diese Moleküle miteinander interagieren und in konzertierter Aktivität Metastasierung-assoziierte Funktionen erfüllen. Die Tatsache, dass diese Moleküle in unveränderter Form auf gesundem Gewebe exprimiert werden, erlaubt es uns die physiologischen Funktionen der individuellen Moleküle zu evaluieren und diese mit den Funktionen der koordiniert aktiven Moleküle auf metastasierenden Tumorzellen zu vergleichen. Die Interaktion von Membranmolekülen ist ein bisher wenig untersuchter Aspekt der Zellbiologie, der jedoch speziell bei der Tumorprogression von maßgeblicher Bedeutung sein könnte. Ia. Variante CD44 Isoformen: Funktionelle Charakterisierung M. Bourouba, R. Marhaba, M. Zöller In Kooperation mit Prof. H. Ponta, Institut für Genetik, Forschungszentrum Karlsruhe; PD Dr. U. Günthert, Institut für Mikrobiologie, Universität Basel, Schweiz; PD P. Freyschmidt-Paul, Dermatologie, Universität Marburg; Prof. K. McElwee, Dermatologie, Universität Vancouver, Kanada. Zusatzfinanzierung: DFG In den letzten Jahren haben wir uns mit Untersuchungen zur physiologischen Funktionen von CD44v3, -v6, -v7 und -v10 im Kontext von Lymphozytenreifung, -aktivierung und -migration befasst, da diese Isoformen offensichtlich unterschiedliche Funktionen erfüllen [1]. CD44v3: Im Kontext mit der Tumorprogression konnte eine Korrelation zwischen der Metastasierungstendenz maligner Melanome und der Expression von CD44v3 beobachtet werden. Auf hämatopoetischen Zellen wird CD44v3 auf einem Subset CD4 + T-Zellen, auf Monozyten, B-Zellen und dendritischen Zellen (DC), aber auch auf aktivierten Endothelzellen exprimiert. Wir haben Evidenzen, dass CD44v3 auf Monozyten als kostimulatorisches Molekül agieren kann [2]. Daneben ist CD44v3 hauptsächlich in die Leukozytenwanderung, vornehmlich in die Haut, involviert [3]. Dem entspricht eine hohe Expressionsdichte von CD44v3 auf allergisch- und autoimmun-bedingten Leukozyteninfiltraten sowie der Befund, dass bei einer experimentell-induzierten allergischen Reaktion vom verzögerten Typ (DTH) die Extravasation von Leukozyten durch einen CD44v3-spezifischen Antikörper nahezu vollständig unterbunden werden konnte [4]. CD44v3 ist die einzige CD44 Isoform mit einer Heparinseitenkette und es wurde beschrieben, dass CD44v3 als membranständiges Proteoglykan als Fängermolekül für eine Reihe von Zytokinen und Chemokinen agiert. Da sich die Bedeutung von CD44v3 für die Extravasation von Leukozyten sehr wohl

253 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie über eine lokale, CD44v3-vermittelte Konzentrierung von Chemokinen erklären ließe, untersuchen wir z.zt. mittels eines CD44v3-Rezeptorglobulins mögliche CD44v3 Liganden zu identifizieren. CD44v10: CD44v10 ist eine weitere CD44 Isoform die vornehmlich auf Makrophagen und DC exprimiert wird. CD44v10 ist für die Anreicherung von Makrophagen in DTH Reaktionen, aber auch für die Anreicherung von T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen der Haut von maßgeblicher Bedeutung. Entsprechend können sowohl die Entwicklung von Kontaktallergien als auch die Induktion einer Alopecia areata, die als eine dermatologische Autoimmunerkrankung eingestuft wird, durch CD44v10-spezifische Antikörper unterbunden werden [5,6]. Eine mögliche Erklärung für diese Befunde bietet die Bindung von CD44v10 an Osteopontin. Osteopontin wurde bereits vor einigen Jahren als Ligand von CD44 beschrieben. Wir konnten nun nachweisen, dass Osteopontin ausschließlich an CD44v10 bindet [2]. CD44v6: Wie bereits erwähnt beruht unser Interesse an varianten CD44 Isoformen auf der Beobachtung, dass durch die Transfektion von CD44v cdna Metastasierung induziert und Metastasierung durch CD44v6-spezifische Antikörper blockiert werden kann. Die Tatsache, dass CD44v6 auch transient während der Hämatopoese und während der Lymphozytenaktivierung exprimiert werden, bot uns ein physiologisches Modell um das Wirkprinzip dieser CD44 Isoformen zu untersuchen. Neben der Etablierung von Antikörpern und Rezeptorglobulinen, hat die Bereitstellung von transgenen Mäusen, die Ratten CD44v4-v7 ausschließlich auf Thymozyten und reifen T-Zellen exprimieren (P. Herrlich, Institut für Genetik, Universität Karlsruhe) und von Mäusen mit einer targetierten Deletion von CD44v7 bzw. von CD44v6 und CD44v7 (U. Günthert, Basel Institut für Immunologie) unsere Arbeiten wesentlich erleichtert. CD44v6 wird auf frühen hämatopoetischen Progenitorzellen, auf Thymozytensubpopulationen und, transient auf T-Zellen während der Aktivierung exprimiert [1]. Eine Beteiligung von CD44v6 an der Thymozytenreifung konnte durch Antikörperblockade und den Einsatz CD44v4-v7 transgener bzw. CD44v6/v7 defizienter Mäuse gezeigt werden. CD44v6 unterstützt und beschleunigt den Prozess der Thymozytenreifung und damit den Prozess der Induktion von Toleranz. Die funktionelle Relevanz dieser Beobachtung ließ sich insbesondere bei einer allogenen Knochenmarksrekonstitution im nicht-myeloablativ konditionierten Wirt belegen [7]. Um die supportive Funktion von CD44v6 bei der T-Zellreifung weiter abzuklären untersuchen wir z. Zt. welche signal-transduzierenden Moleküle über CD44v6 aktiviert werden und worauf die unterschiedliche Aktivierung signal-transduzierender Moleküle über CD44s und CD44v6 beruht, obgleich sich die intrazytoplasmatischen Anteile dieser beiden CD44 Isoformen nicht unterscheiden. Die bisher erhobenen Befunde weisen darauf hin, dass sich CD44v6 in von CD44s unterschiedlichen Membrankompartimenten befindet und aufgrund dieser unterschiedlichen Membranlokalisation über die Ligandenbindung von CD44s und CD44v6 separate Signaltransduktionswege aktiviert werden. Unsere Daten weisen darauf hin, dass über anti-cd44v6 die Phosphorylierung von ZAP70 blockiert wird und damit die Aktivierung Antigen-spezifischer T-Zellen zwar nicht unterbunden aber signifikant reduziert werden kann. (R.Marhaba et al., in Vorb.). Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr CD44v7: CD44v7 wird auf Subpopulationen von Knochenmarkszellen und auf Stromazellen des Knochenmark exprimiert [1]. CD44v7 ist maßgeblich an der Adhäsion von Progenitorzellen am Knochenmarkstroma und am Homing von Stammzellen ins Knochenmark beteiligt. Dies konnte mittels Antikörperblockade und Mäusen mit einer targetierten Deletion von CD44v7 nachgewiesen werden [1]. Hinzukommt, dass sich CD44v7-spezifische Antikörper aufgrund dieser Funktion von CD44v7 in ganz besonderer Weise zur Mobilisation von Stammzellen eignen und bei einer Mobilisation über anti-cd44v7 keiner der Nachteile beobachtet wird, die beim Transfer von G-CSF mobilisierten Stammzellen beschrieben wurden, z.b. ist die Wiedererlangung von Immunkompetenz nach dem Transfer über anti-cd44v7 mobilisierter Stammzellen deutlich kürzer als nach dem Transfer G-CSF mobilisierter Stammzellen [7]. CD44v7 wird auch auf einer Subpopulation CD4+ Zellen und auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert [1]. Am nachhaltigsten konnte die funktionelle Bedeutung von CD44v7 bei der Lymphozytenaktivierung am Modell einer TNBS-induzierten Colitis belegt werden. Die Induktion der in über 90% der Tiere tödlich verlaufenden Erkrankung konnte durch anti-cd44v7 blockiert werden und eine florierende Colitis konnte durch anti-cd44v7 geheilt werden. Untersuchungen mit CD44v7 ko Tieren belegten, dass diese Tiere sich gegenüber der Induktion einer Colitis resistent verhalten und dass Tiere mit einer targetierten Deletion von IL-10, die spontan eine Colitis entwickeln, nicht erkrankten, sofern neben IL-10 auch CD44v7 deletiert war. Aufgrund dieser Befunde bot sich das Modell der induzierten Colitis an, um das Funktionsprinzip von CD44v7 weiter aufzuklären. Unsere Untersuchungen belegen, dass CD44v7 auf Monozyten und auf T-Zellen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Quervernetzung von CD44v7 auf Monozyten initiiert die Sekretion von Zytokinen, hauptsächlich von IL- 10. Wenn über anti-cd44v7 eine Interaktion zwischen CD44v7 (auf T-Zellen) und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) unterbunden wird, geht dies mit einer Blockade der Aktivierung regulatorischer T-Zellen einher. Diese Beobachtungen konnten in CD44v7 ko Mäusen bestätigt werden, wobei die Untersuchungen an den ko Tieren noch einen weiteren Hinweis auf das Funktionsprinzip von CD44v7 lieferten. In Entzündungsherden von CD44v7 ko Tieren findet sich eine signifikant höhere Anzahl apoptotischer Zellen als in Entzündungsherden CD44v7 kompetenter Tiere. Weiterführende Untersuchungen konnten nachweisen, dass CD44v7 nicht direkt in den Apoptosesignalweg involviert ist, vielmehr bei der Aktivierung anti-apoptotischer Moleküle eine zentrale Rolle spielt [8]. Dieses anti-apoptotische Wirkprinzip von CD44v7 ist nicht auf das experimentelle Modell einer ulzerösen Colitis beschränkt. Wir konnten den Befund auch in einem Alopecia areata Modell der Maus beobachten [9,10] und haben Hinweise, dass auch bei Autoimmunerkrankungen des Menschen die Überreaktivität Autoantigen-spezifischer T-Zellen durch eine CD44v7-vermittelte Unterdrückung von Aktivierung-induziertem Zelltod massgeblich unterstützt wird [11]. 253

254 254 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Ib. Funktion von C4.4A, D5.7A (EpCAM) und D6.1A (CO 029) C. Claas, F. Fries, M. Ladwein, C. Paret, J. Wahl, M. Zöller In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Prof. Dr. M. von Knebel Doeberitz, Abteilung molekulare Pathologie, Universität Heidelberg, Prof. Dr. K. Z graggen und PD Dr. J. Weitz, Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg, Prof. Dr. W. Tilgen. Dermatologische Klinik der Universität des Saarland, Prof. U. Weidle, Roche Diagnostics, Penzberg, Prof. Dr. K. Dano und Prof. Dr. M. Ploug, Finsen Laboratorien, Kopenhagen, Dänemark Zusatzfinanzierung: DFG, Deutsche Krebshilfe, Roche Diagnostics, TZHM C4.4A: C4.4A ist ein GPI-verankertes Membranmolekül mit Ähnlichkeit zum Urokinaserezeptor (upar). Über die Bindung und Aktivierung von upa trägt dieser Rezpetor wesentlich zur Degradation von Elementen der extrazellulären Matrix bei. Neuere Befunde belegen, dass upar darüber hinaus auch in proteolyse-unabhängige Signaltransduktion involviert ist, wozu seine Assoziation mit Integrinen wesentlich beiträgt. Sowohl in der Ratte als auch beim Menschen wird C4.4A nur in sehr geringem Umfang auf gesundem Gewebe, vornehmlich auf Epithelien der Basalschicht der Epidermis und sehr schwach auf Subpopulationen von Makrophagen, exprimiert. Hingegen wird C4.4A auf Karzinomen häufig exprimiert und es gibt Hinweise, dass die Expression mit der Metastasierungstendenz korreliert. Die im Vergleich zu upar sehr restringierte Expression auf Normalgewebe und die vergleichbar hohe Expression auf Tumoren lässt C4.4A als therapeutisches Kandidatenmolekül sehr geeignet erscheinen, sofern C4.4A upar-ähnliche Funktionen erfüllt. Um die physiologische Funktion des Moleküls zu evaluieren, haben wir die Generierung von C4.4A ko Mäusen in Angriff genommen. Zur Identifikation von potentiellen Liganden wurde rekombinantes, lösliches C4.4A erstellt. Erste Ergebnisse zeigen, dass C4.4A selektiv an Laminin 1 und Laminin 5 bindet (Paret et al, in Vorb.). Daneben erkennt es einen noch nicht-identifizierten Serumfaktor, der auch an upar bindet. Untersuchungen zu Promotor- und Enhancersequenzen von C4.4A sind weitgehend abgeschlossen. Diese Studien sind besonders im Hinblick auf die Hochregulation der Expression von C4.4A auf metastasierenden Tumorzellen wesentlich. Die bisher erzielten Ergebnisse bestätigen die Induzierbarkeit der Expression durch einen Serumfaktor, der noch definiert werden muss (Fries et al., in Vorb.). D5.7A / EpCAM: Wenngleich EpCAM bereits in den 80iger Jahren beschrieben wurde, ist die Funktion des Moleküls bisher weitgehend ungeklärt. Unser Interesse basiert vor allem auf der Beobachtung, dass EpCAM / D5.7A mit weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen, D6.1A und varianten CD44 Isoformen, assoziiert (siehe Ic) [12]. Um diese Assoziation genauer zu definieren, wurden Deletionsmutanten der einzelnen Domänen des Moleküls erstellt, deren funktionelle Charakterisierung zur Zeit erfolgt. D6.1A / CO-029: Neben varianten CD44 Isoformen ist für den Metastasierungsprozess mit hoher Wahrscheinlichkeit vor allem das Tetraspanin D6.1A von essentieller Bedeutung. Tetraspanine sind wichtig für Adhäsion, Migration, Proliferation, Aktivierung, Differenzierung und Metastasierung. Man geht davon aus, dass diese vielfältigen Funktionen auf der Fähigkeit der Tetraspanine beruht, Molekül- Cluster zu bilden, die neben weiteren Tetraspaninen vor allem Integrine einschließen. Für D6.1A konnten wir bisher Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr neben einer Assoziation mit dem Tetraspanin CD9, eine Assoziation mit α6β1, α3, und möglicherweise mit α6β4 Integrinen, sowie eine schwache Assoziation mit D5.7A und CD44 beobachten. Darüber hinaus konnte in Kooperation mit der zentralen Einheit für Proteinanalytik eine Assoziation mit FPRP nachgewiesen werden. Letztere erscheint von besonderem Interesse, da FPRP auch in direkter Assoziation mit CD9 gefunden wird und innerhalb der Familie der Tetraspanine D6.1A und CD9 sich besonders ähnlich sind. Dennoch zeichnen sich Unterschiede zwischen D6.1A und CD9 ab. Wie erwähnt, nehmen Tetraspanine Einfluss auf die Zellmigration. Dies geschieht u.a. durch die Internalisierung von Integrin-Tetraspanin-Komplexen und der Re- Expression des Integrins (oder des Komplexes) an der migratorischen Front der Zelle. Wir haben Hinweise, dass vornehmlich D6.1A an der Internalisierung und dem Transport in endosomalen Vesikeln von Integrinen beteiligt ist (Wahl et al., in Vorb.). Von besonderem Interesse für die Funktion von Tetraspaninkomplexen ist auch ihre Lokalisation in bestimmten Membransubdomänen, den sog. Lubrol rafts. Die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase ist eine Komponente von Tetraspaninkomplexen. Wenngleich Tetraspaninkomplexe auch ausserhalb von Lubrol rafts gefunden werden, wird die enzymatische Aktivität Tetraspaninkomplex-assoziierter Phosphatidyl-Inositol-4- Kinase (PI4K) essentiell vom Membranmikroenvironment bestimmt [13]. Die funktionelle Bedeutung der Assoziation speziell von D6.1A mit der PI4K erfordert weitere Untersuchungen. Ic. Konnektivität und konzertierte Aktivität Metastasierung-assoziierter Moleküle C. Claas, S. Gesierich, P. Klingbeil, M. Zöller Zusatzfinanzierung: DFG, Deutsche Krebshilfe, TZHM Die Überexpression der 5 beschriebenen Metastasierungassoziierten Moleküle wurde auf einer Reihe metastasierender Tumoren unterschiedlichen Ursprungs beobachtet. Es gibt zumindest zwei Möglichkeiten diese konzertierte Expression zu erklären: i. Die Expression dieser Moleküle wird über ein Gen reguliert; ii. Die Ko-Expression dieser Moleküle ist erforderlich, damit eine Tumorzelle alle Schritte der Metastasierungskaskade durchlaufen kann. Unabhängig davon, ob die konzertierte Expression dieser Moleküle auf die Aktivierung eines Master-Gens zurückzuführen ist oder auf einem Selektionsprozess beruht, besteht die Möglichkeit einer wechselseitigen Einflussnahme der funktionellen Aktivitäten dieser 5 Moleküle in dem Sinne, dass die Funktion der einzelnen Moleküle durch die Assoziation mit den weiteren Molekülen verändert wird. Wir haben eine Reihe von Evidenzen, die diese Arbeitshypothese unterstützen. i. Einige dieser Moleküle können miteinander interagieren: Das Tetraspanin D6.1A assoziiert mit dem Tetraspanin CD9, den Integrinen α6β1 und α3β1, mit D5.7A (EpCAM) und weiteren Membranmolekülen; C4.4A kann mit Integrinen assoziieren; die CD44v4-v7 Isoform, nicht aber die CD44 Standardisoform, assoziiert mit den Tetraspaninen CD9 und D6.1A sowie mit D5.7A [14]; ii. In Abhängigkeit davon, ob diese Moleküle isoliert oder als Komplex vorliegen, erfüllen sie unterschiedliche Funktionen: Im Kontext mit weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen unterstützt C4.4A den Abbau extrazellulärer Matrix, Überexpression von C4.4A bewirkt dies nicht; Die Induktion einer Verbrauchskoagulopathie durch D6.1A ist

255 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie ebenfalls von einer konzertierten Interaktion mit assoziierenden Membranmolekülen abhängig; Die Überexpression von α6ß4 hat in unserem Tumormodell keinen Einfluss auf das Metastasierungspotential, wohingegen die Überexpression von α6β4 und D6.1A das metastatische Potential erhöht. Wir haben begonnen speziell diesen letzten Befund weiter abzuklären. Unsere bisherigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die erhöhte Metastasierungkapazität von α6β4 und D6.1A überexprimierenden Tumoren auf eine selektive Assoziation der Tetraspanine CD151 und D6.1A mit α6β4 zurückzuführen ist, wobei entsprechende Stimuli eine rasche, D6.1A-initiierte Internalisierung des Komplexes in Gang setzen. Dies hat einen Wechsel der Tumorzellen von einem sessilen in einen migratorischen Phänotyp zur Folge [15]. Humane Pankreaskarzinome, von denen bekannt ist, dass sie bereits in einem sehr frühen Stadium metastasieren, exprimieren mehrheitlich sowohl α6β4 als auch D6.1A (CO-029). Erste Untersuchungen unterstützen unsere Arbeitshypothese, dass sich das hohe migratorische Potential dieser Tumorzellen auf eine CO-029-mediierte Internalisierung des Adhäsionsmoleküls α6β4 zurückführen lässt (Gesierich et al., in Vorb.). Letztlich gehen wir davon aus, dass auch die Lokalisation der Moleküle in definierten Membranmikrodomänen für selektive Funktionen der Komplexe von wesentlicher Bedeutung ist. Wie bereits erwähnt sind Tetraspanine im Bereich von sog. Lubrol rafts angereichert, die eine Plattform für Signaltransduktion darstellen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Anreicherung assoziierter Moleküle in diesen Membranmikrodomänen die Aktivierung einer Reihe Signal-transduzierender Moleküle erleichtert bzw. ermöglicht (Claas et al., in Vorb.). C4.4A ist aufgrund seiner Membranverankerung und unabhängig von assoziierenden Molekülen ebenfalls in glykolipidreichen Membranmikrodomänen lokalisiert. Wir haben 5 Membranmoleküle definiert, die in den Prozess der lymphatischen Metastasierung involviert sind: Ein Zell-Zell-Adhäsionsmolekül (D5.7A/EpCAM), zwei Zell-Matrix- Adhäsionsmoleküle (CD44v und α6β4), C4.4A, das möglicherweise in die Gruppe der Matrix-degradierenden Enzymsysteme einzureihen ist, und ein Tetraspanin. Von allen diesen Molekülfamilien ist bekannt, dass sie am Prozess der Metastasierung beteiligt sein können. Wir gehen davon aus, dass es nicht die einzelnen Moleküle sind, die dabei einen wesentlichen Beitrag leisten, sondern ihre konzertierte Aktion und wechselseitige Einflussnahme. Wir prüfen daher, inwieweit diese Moleküle miteinander interagieren und inwieweit durch eine solche Interaktion das Funktionsprinzip der einzelnen Moleküle moduliert wird. Wir erwarten, dass die Aufschlüsselung konzertierter Aktivitäten dieser Moleküle maßgeblich zum Verständnis der Mechanismen der Tumorprogression beitragen wird. Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr II. Tumortherapie Ia. Neue schwefelhaltige, antitumorale Platinkomplexe E. Amtmann, W. Fribolin In Kooperation mit G. Schilling, Chemisches Institut, Universität Heidelberg, Dr. Stefan Gromer, Biochemiezentrum, Universität Heidelberg Zusatzfinanzierung: Antisoma Platinkomplexe, wie Cisplatin, werden seit Jahrzehnten erfolgreich zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt. Als größte Probleme haben sich die erheblichen Nebenwirkungen und vor allem, die häufig eintretende Resistenz erwiesen. Wir haben die ersten antitumoral wirksamen Platinkomplexe, die nicht auf der von Cisplatin abgeleiteten cis-diaminostruktur basieren entdeckt. Unsere Erfindung dieser neuen Platinverbindung basiert auf unseren Arbeiten zur Funktion von Phospholipasen des Types C, speziell einer neutralen Sphinomyelinase, deren Blockade sich in der Therapie des septischen Schocks als hoch effizient erwies [16]. Bei einer Klasse der eingesetzten Inhibitoren, Dithiokarbonsäuren, beobachteten wir eine explizite Abhängigkeit funktioneller Aktivität von einem sauren Milieu. Basierend auf diesen Befunden haben wir eine ph-wert abhängig antitumoral wirksame Platinverbindung mit Schwefelkomplexbindung hergestellt (Thioplatin) [17]. Diese Verbindung wird im leicht sauren Milieu aktiviert. Da solide Tumoren ein leicht saures Milieu aufweisen, ist Thioplatin im Tumor 5-10 mal wirksamer als im Normalgewebe. Dies hat zur Folge, dass Thioplatin nur sehr geringe Nebenwirkungen aufweist, insbesondere wird die bei Cisplatin gefürchtete Knochenmarksdepression nicht beobachtet. Als von größter Bedeutung stellte sich heraus, dass Thioplatin die erworbene Resistenz gegen Cisplatin und verwandte Strukturen vollständig durchbrechen kann. Es wurden drei verschiedene Arten der Resistenzentwicklung untersucht: Membrantransport, Glutathionproduktion, DNA- Repair. Alle drei Arten der erworbenen Resistenz wurden durch Thioplatin durchbrochen. (L. Kelland, unveröffentlicht). Basierend auf unserer ersten Substanz haben wir eine Reihe von Derivaten von Thioplatin synthetisiert und charakterisiert [18, 19]. Es gelang uns Verbindungen mit bis zu 10- fach besserer antitumoraler Wirkung und insbesondere mit hoher Stabilität zu identifizieren. Im Rahmen einer Kooperation zwischen dem DKFZ und Antisoma, London, wurde die klinische Entwicklung von Thioplatin begonnen. Die präklinischen Untersuchungen (Toxikologie, Pharmakokinetik, Stabilität) sind abgeschlossen. Derzeit wird die Stabilität in galenischen Formulierungen unserer neuen Derivate mit Thioplatin verglichen. Klinische Studien sollen im Anschluss begonnen werden. Wir analysieren zurzeit den antitumoralen Wirkmechanismus unserer Schwefelplatinverbindungen. Von besonderem Interesse ist dabei Unterschiede zu Cisplatin zu identifizieren, um das Fehlen von Kreuzresistenz zu erklären. Daneben laufen Untersuchungen zum Wirkmechanismus. So konnten wir die DNA-Bindungsstellen von Thioplatin als von der für Cisplatin unterschiedlich identifizieren. Untersuchungen zum zytotoxischen Wirkmechanismus von Thioplatin ergaben, dass, im Gegensatz zu Cisplatin, nach Thioplatinbehandlung innerhalb von kurzer Zeit Sauerstoffradikale in Tumorzellen gebildet werden. Als potentielles Drug Target konnte die Thioredoxinreduktase identifiziert werden. Diese Arbeiten sind noch nicht abgeschlossen. 255

256 256 IIb. Immuntherapie G. Devitt, N. Stroh, M. Zöller Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie In Kooperation mit Dr. S. Eichmüller, Abteilung Dermato- Onkologie, DKFZ, Dr. T. Luft, Medizinische Klinik V, Universität Heidelberg, Prof. Dr. Kabelitz, Institut für Immunologie, Universität Kiel, Prof. R. Haas, Klinik für Hämatologie und Onkologie, Universität Düsseldorf, Prof. Dr. Richard Hautmann, Urologische Klinik, Universität Ulm, Dr. S. Stevanovic, Institut für Zellbiologie, Universität Tübingen, Prof. R. Apte, Gen Gurion University, Beer Sheva, Israel, Dr. J. Hammer, La Roche Inc, Nutley, NJ, USA Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe, Carreras Leukämie- Stiftung, Israel-Kooperation, TZHM Nierenzellkarzinom-assoziierte Antigene: Nierenzellkarzinome (RCC) verhalten sich in aller Regel resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie. Da sie in frühen Stadien weitgehend symptomlos sind, werden sie häufig erst in fortgeschrittenem Zustand detektiert. Dem entspricht eine 5 Jahresüberlebensrate von unter 5%. Immuntherapeutische Ansätze würden eine Alternative darstellen, zumal man davon ausgehen kann, dass es sich beim RCC um einen immunogenen Tumor handelt, bei dem auch - wenngleich selten - Spontanremissionen beobachtet werden. Bisher sind jedoch nur sehr wenige RCC-assoziierte Antigene bekannt. Wir haben daher in den letzten Jahren versucht, über suppressive subtraktive Hybridisierung (SSH) und serologisch nach rekombinanter Expressionsklonierung (SEREX) weitere immunogene RCC-assoziierte Antigene zu identifizieren. Für die SSH wurde normales Nierengewebe und Nierenzellkarzinomgewebe vom gleichen Patienten bzw. einer Gruppe von Patienten eingesetzt. Bei SSH und SEREX wurde das Expressionsprofil potentieller Kandidatengene an einem Panel von 35 Paaren an Normalund Tumorgewebe überprüft, um die klinische Relevanz einer de novo Expression bzw. einer signifikanten Erhöhung der Expression eines RCC-assoziierten Genes nachzuweisen. Wir konnten mit der SSH Methode ein weites Spektrum an Molekülen identifizieren, die bei 30%-100% der getesteten RCC signifikant überexprimiert waren. Mit einer Ausnahme handelte es sich jedoch ausschließlich um Genprodukte, die in den Prozess der Metastasierung involviert sind, die aber nicht als potentielles Immunogen erachtet werden können. Mit der SEREX-Methode, bei der wir sowohl eine Phagenexpressionsbibliothek von RCC-Gewebe als auch von Testisgewebe einsetzten, wurden bisher vornehmlich Autoantigene identifiziert, deren Expression im Gesamtorganismus uns zu verbreitet erscheint, um sie als Vakzine einzusetzen. Die Auswertung eines abschließenden Screening, bei dem erneut >100 potentielle RCCassoziierte Antigene identifiziert wurden, steht noch aus (Devitt et al., in Vorb.). Da unsere bisherigen Ergebnisse belegen, dass sowohl RAGE-1 als auch MAGE-9 mit hinreichender Frequenz auf RCC exprimiert werden, haben sich unsere weiterführenden Untersuchungen vornehmlich auf diese beiden RCC-assoziierten Antigene konzentriert. Optimierung von Vakzinierungsstrategien in der Therapie solider Tumoren (Nierenzellkarzinom): Modelle zur aktiven Vakzinierung: Die Induktion einer Tumor-spezifischen Immunantwort erfordert die Präsentation von Peptiden eines Tumorantigens im Kontext mit MHC Klasse I oder II Molekülen und ein zweites Signal, das in der Regel über kostimulatorische Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen initiiert wird. Die Summe dieser Voraussetzungen wird in aller Regel von Tumoren und vom Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr Tumor-tragenden Wirt nicht erfüllt. Deshalb sind supportive Maßnahmen, um eine effiziente Anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren, unumgänglich. Dies erfolgt entweder über die Modulation der Tumorzelle, um sie mit Eigenschaften einer Antigen-präsentierenden Zelle auszustatten, den passiven Transfer aktivierter Effektorzellen oder mittels aktiver Vakzinierung. Zur Vakzinierung können RNS, DNS, Protein oder Peptide eingesetzt werden, die in nativer Form oder verpackt appliziert werden. Als Trägersysteme eigenen sich insbesondere dendritische Zellen (DC) oder - beim Einsatz von DNS - transformierte und attenuierte Bakterien, z.b. Salmonellen. Da die klinischen Erfolge bisher weit hinter den Erwartungen zurückbleiben, ist es keine Frage, dass weitere experimentelle Studien notwendig sind, um Vakzinierungsprotokolle in der Tumortherapie zu verbessern [20]. Wir haben uns auf Modelle der aktiven Vakzinierung mittels DC und attenuierter Salmonellen (SL) konzentriert und dabei insbesondere die Vor- und Nachteile einer Helfer-T-Zell (TH)-orientierten Vakzinierung untersucht. In jüngster Zeit widmen wir uns insbesondere der Verbesserung von Verfahren der allogenen Knochenmarkstransplantation nach nicht-myeloablativer Konditionierung, da wir davon ausgehen, dass die allogene Rekonstitution eine optimale Plattform für aktive Vakzinierung bei Tumorpatienten darstellt [21,22]. Es sei an dieser Stelle für alle im folgenden skizzierten Studien, vermerkt, dass wir neben dem Prozess einer aktiven Immunsuppression häufig die Aktivierung von Tumoreskapemechanismen, wie z.b. den Verlust von Tumorantigenen oder von MHC Molekülen, beobachteten. Tumoreskape stellt eines der Probleme dar, von denen bei Tumor-immuntherapeutischen Ansätzen häufig berichtet wird. Hingegen haben wir, auch wenn Selbstantigene wie das Melanom-assoziierte Antigen gp100 eingesetzt wurden, keine schweren Formen von Autoimmunität beobachtet [23]. Unsere Vakzinierungsstudien befassten sich mehrheitlich mit dem Transfer Protein- oder Peptid-beladener DC und der oralen Vakzinierung mit transformierten SL. Die therapeutische Effizienz einer Vakzinierung mit DC umfasste Untersuchungen bei denen die DC mit Protein oder Peptiden beladen wurden, die entweder an MHC Klasse I oder II Moleküle binden. Der Einsatz MHC Klasse II bindender Peptide erschien uns wichtig, da in aller Regel die Aktivierung von TH-Zellen erforderlich ist, um alle Elemente des Immunsystems zu aktivieren. Da die Effizienz der Induktion einer CTL Antwort bei einer Vakzinierung mit dem Melanom-assoziierten Antigen gp100 gut charakterisiert ist, bot sich gp100 für unsere weiterführenden Studien an. Mit dem gp100 Protein beladene DC induzieren in vitro und in vivo vor allem eine TH-1 Antwort. In der Folge wurden gp100 Peptide untersucht, die mit Wahrscheinlichkeit an MHC II Moleküle binden. In vitro Studien belegten, dass die Reaktivität von PBL individueller Probanden mit einem bestimmten Peptid einen konstanten Faktor darstellt. Die Selektivität der Bindung definierter Peptide konnte in vivo (SCID- Maus) bestätigt werden. Die mit gp100 erhobenen Befunde konnten mit RAGE-1 und MAGE-9, zwei Nierenzellkarzinom-spezifischen Antigenen bestätigt werden (Stroh et al., in Vorb.). In diesen Studien wurden ausschließlich humane PBL und humane Tumoren im SCID-Maus-Modell getestet, das sich in besonderer Weise für Screeninguntersuchungen eignet. Aufgrund nicht zu vermeidender graft vs host (GvH) Reaktionen bei Langzeitvakzinierungsstudien in der humanisierten SCID Maus, haben wir in weiteren

257 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr Studien zur Optimierung von Vakzinierungsprotokollen auf syngene Maustumormodelle zurückgegriffen. Die Form des Antigens, das als DNA, RNA oder Protein / Peptid angeboten werden kann, stellt einen wesentlichen Faktor der Vakzinierung dar. Alle 3 Formen haben Vor- und Nachteile. So bietet sich eine DNA Vazinierung aufgrund der leichten Verfügbarkeit an, ist aber mit dem Nachteil einer häufig ineffizienten Transkriptionsrate versehen. Das Problem kann durch die Verpackung in geeignete Trägersysteme, u.a. attenuierte Bakterien, vermieden werden. Es ist bekannt, dass Salmonellen die Darmwand durchwandern und im Peritoneum von Makrophagen phagozytiert werden. Attenierte Salmonellen werden auf diese Weise in kürzester Zeit komplett eliminiert. Wenn diese Bakterien mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert wurden, der z.b. die DNA eines Tumorantigens enthält, wird die DNA ausschließlich in eukaryotischen Wirtzellen transkribiert. Wir haben in diesem Kontext 3 Fragen gestellt: i. Stellt die Verpackung von DNA in attenuierten Salmonellen einen Vorteil bei der Vakzinierung im Vergleich zu nackter DNA dar? ii. Ist eine DNA- oder eine Protein- Vakzinierung effizienter? iii. Ist auch bei einer DNA Vakzinierung eine Präsentation durch MHC II Moleküle effizienter und wie kann bei einer DNA Vakzinierung das translatierte Protein in den MHC II Präsentationsweg eingeschleust werden? Der Vergleich einer Vakzinierung mit nackter DNA und DNA, die in Form transformierter Salmonellen angeboten wurde, ergab, dass beide Vakzinierungsschemata geeignet erschienen, um das Tumorwachstum zu verzögern. Allerdings zeichnete sich die Vakzinierung mit transformierten Salmonellen durch eine signifikant gesteigerte Effizienz aus, die durch eine überwiegende Aktivierung von CTL charakterisiert war. Die Vakzinierung mit nackter DNA war hauptsächlich von einer unspezifischen Aktivierung, vermutlich aufgrund von DNA Sequenzen mit bekanntem adjuvantem Effekt, begleitet. Die Effizienz einer Vakzinierung mit Protein-beladenen DC übertraf jedoch die Effizienz der Vakzinierung mit transformierten Salmonellen. Ex vivo Untersuchungen wiesen darauf hin, dass der Vorteil der Proteinvakzinierung auf die präferentielle Aktivierung on TH-Zellen zurückzuführen war. Deshalb wurden in einer weiteren Studie Salmonellen mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert, in den die DNA des Tumorantigens mit der DNA eines Fragmentes der invarianten Kette als Fusionsprodukt integriert war. Die invariante Kette ist wesentlich an der Einschleusung von Proteinen in den MHC II Präsentationsweg beteiligt. Wir konnten zeigen, dass eine Vakzinierung mit diesen Salmonellen zur Aktivierung von TH-Zellen geeignet ist. Im Hinblick auf Überlebenszeit und Abstoßungsrate lieferte dieses Vakzinierungsprotokoll die bisher überzeugendsten Ergebnisse [23]. Allogene Stammzelltransplantation in der Therapie von Leukämien und soliden Tumoren: Die allogene Stammzelltransplantation wird als ein potentiell kuratives Verfahren nach Ausschöpfung aller konventionellen Therapiestrategien erachtet. Aufgrund der hohen Toxizität der myeloablativen Konditionierung konnte dieses Verfahren über lange Zeit nur sehr begrenzt eingesetzt werden. Erst seit wenigen Jahren ist bekannt, dass eine allogene Knochenmarkstransplantation auch nach nicht myeloablativer Konditionierung vorgenommen werden kann. Dies erweitert in ganz erheblichem Maße das mögliche Patientenkollektiv. Das Problem der graft vs host Reaktionen (GvHD) bleibt allerdings bestehen. Weiterhin muss die Frage geklärt werden, wie eine graft vs tumor (GvT) Reaktion bei einer Reduktion von GvHD aufrechterhalten werden kann. Letztlich ist bei einer nicht-myeloablativen Vorbehandlung auch mit host vs graft Reaktionen (HvGD) zu rechnen. Es ist bekannt, dass sowohl zytotoxische T-Zellen (CTL) als auch NK-Zellen an GvHD und HvGD beteiligt sind [20]. Unsere früheren Studien zur allogenen Knochenmarkstransplantation haben sich vornehmlich mit der Modulation von CTL Reaktionen über die Blockade kostimulatorischer Moleküle, u.a. CD44v6, nach myeloablativer Konditionierung befasst. Wir werden auf diese Untersuchungen im Kontext allogener Knochenmarksrekonstitution nach nicht myeloablativer Konditionierung zurückgreifen, sobald die laufenden Studien, in denen wir die Möglichkeit einer aktiven Vakzinierung nach allogener Stammzelltransplantation des nicht-myeloablativ konditionierten Wirts untersuchen, abgeschlossen sind. Bislang konnten wir zeigen, dass durch eine NK-Zell-Depletion des Wirts die Angehrate eines T- Zell-depletierten Transplantates signifikant verbessert werden kann. Wenngleich dieses Vorgehen mit einer verlängerten Phase der Immuninkompetenz belastet ist, konnte so GvHD deutlich abgeschwächt werden [24]. Wesentlich ist vor allem, dass bei diesem Protokoll Donor-T-Zellen im Wirt reifen und damit tolerant gegen den Wirt sind. Unsere Befunde weisen darauf hin, dass - ungeachtet der Induktion von Toleranz gegenüber dem Wirt - diese T-Zellen den Tumor als fremd erkennen. In Weiterführung dieser Studien haben wir begonnen die Tumorabstoßung im allogen rekonstituierten Tier durch eine nachgeschaltete aktive Vakzinierung zu verstärken. Auch hier zeigte sich, dass T-Zellen, die gegenüber dem Wirt tolerant sind, Tumorzellen erkennen und attackieren können. Allerdings ist die Toleranz der T-Zellen auch eine unabdingbare Voraussetzung, da anderenfalls schwere GvH Reaktionen auftreten. Eine weitere Verbesserung konnte durch die Stimulation der allogenen, wirt-toleranten T-Zellen mit tumorantigen-beladenen DC des Wirts erzielt werden [25]. Wir haben dies bisher ausschließlich an soliden Tumoren untersucht und planen den Einschluss leukämischer Tumoren. Da alle unsere bisherigen Studien zeigen, dass allogene T-Zellen nach Etablierung von Chimerismus Tumor-assoziierte Antigene als fremd erkennen, bietet eine allogene Stammzelltransplantation unter den genannten Konditionierungsbedingungen die optimale Plattform für aktive Vakzinierung in der Tumortherapie und wir werden in den folgenden Jahren vornehmlich dieses Therapiekonzept weiter ausarbeiten. Dies schließt eine Optimierung der Vakzinierungsstrategien (Aktivierung von TH-Zellen, orale DNA Vakzinierung mittels transformierter attenuierter Salmonellen) ein. Darüber hinaus sind weitere Maßnahmen zur Sicherung der Akzeptanz des allogenen Knochenmarkstransplantates erforderlich. Letztlich wollen wir versuchen noch verbleibende GvH Reaktionen weiter zu minimieren [22,38]. Ich möchte die Folgerungen aus unseren bisherigen Vakzinierungsstudien kurz zusammenfassen: i. Es erscheint wesentlich, dass das Antigen in einer Form angeboten wird, die zur Präsentation im Kontext mit MHC II geeignet ist; ii. Eine Vakzinierung mit attenuierten Salmonellen führt zu einer sehr effizienten Präsentation des Tumorantigens durch Makrophagen und DC und ist zudem vergleichsweise leicht zu handhaben und kostengünstig; iii. Eine allogene Stammzelltransplantation nach nicht-myeloablativer Konditionierung stellt möglicherweise die optimale Voraussetzung 257

258 258 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie für eine aktive Tumorvakzinierung dar, da die im Wirt gereiften und somit gegenüber dem Wirt toleranten T-Zellen Tumorantigene weiterhin als fremd erkennen; iv. Es muss erwähnt werden, dass wir bei allen bisherigen Vakzinierungsprotokollen entweder mit Tumoreskapemechanismen oder Gegenattacken durch den Tumor konfrontiert wurden. Wenngleich Tumoreskape bzw. Gegenattacken durch den Tumor den Therapieeffekt nicht aufgehoben haben, könnte die Erfolgs- / Heilungsquote bei Überwindung dieser Hindernisse deutlich gesteigert werden. Wir werden entsprechende Überlegungen in unsere weiterführenden Untersuchungen einschließen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Marhaba M and Zöller M. CD44 in cancer progression: Adhesion, migration and growth regulation. Histochemical J, 35: , [2] Engel P. Liganden und Funktion von CD44v10 und CD44v3 beim Lymphozytentraffik. Fachbereich Biologie, Universität Oldenburg, [3] Zöller M, McElwee KJ*, Engel P, Hoffmann R*. Transient CD44 variant isoform expression and reduction in CD4+/CD25+ regulatory T cells in C3H/HeJ mice with alopecia areata. J Invest Dermatol, 118: , [4] McElwee KJ*, Freyschmidt-Paul P*, Zöller M, Hoffmann R*. Alopecia areata susceptibility in rodent models. J Investig Dermatol Symp Proc, 8: 182-7, [5] Zöller M, Freyschmidt-Paul P*, Vitacolonna M, McElwee KJ*, Hummel S, Hoffmann R. Chronic delayed type hypersensitivity reaction as a means to cure alopecia areata. Clin Exp Immunol, 135: , 2004 [6] Zöller M, McElwee KJ*, Vitacolonna M, Hoffmann R*. The progressive state of alopecia areata and therapeutic response towards a contact sensitizer are reflected in peripheral blood mononuclear cells, Exp Derm, in press [7] Christ O, Schmidt DS, Günthert U*, Zöller M. The CD44v6 isoform supports stem cell and lymphoid progenitor maturation. 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Palmitoylation of tetraspanin proteins: Modulation of CD151 lateral interactions, subcellular distribution, and integrin-dependent cell morphology Mol Biol Cell 13: , [14] Schmidt DS, Schnölzer M, Klingbeil P, Zöller M. CD44 variant isoforms associate with tetraspanins and selectively with EpCAM: consequences on cell cell and cell matrix adhesion. Exp Cell Res., 2004 (E pub ahead of print) [15] Herlevsen M, Schmidt DS, Miyazaki K*, Zöller M.The association of the tetraspanin D6.1A with the alpha6beta4 integrin supports cell motility and liver metastasis formation. J Cell Sci, 116: , [16] Amtmann E, Baader W, Zöller M. Neutral sphingomyelinase inhibitor C11AG prevents lipopolysaccharide-induced macrophage activation. Drugs Exp Clin Res, 29: 5-13, Abteilung D060 Tumorprogression und Tumorabwehr [17] Amtmann E, Zöller M. Stimulation of CD95 induced apoptosis in T-cells by a subtype specific neutral sphingomyelinase inhibitor. Biochemical Pharmacology, in press [18] Friebolin W, Schilling G, Zöller M, Amtmann E. Synthesis and structure-activity relationship in vitro of novel antitumoral platinum xanthate complexes. J Med Chem,47: , 2004 [19] Millet R*, Urig S*, Gromer S*, Lemaire A*, Amtmann E, Moulinoux JP*, Schirmer H*, Becker K*, Davioud-Charvet E*. Synthesis of 5-Nitro-2-furancarbohydrazides and their cis- DiamminedichloroPlatinum Complexes as Irreversible Inhibitors of Human Thioredoxin Reductase. J Med Chem, in revision [20] Zöller M. Immunotherapy of cancer by active vaccination: does allogeneic bone marrow transplantation after nonmyeloablative conditioning provide a new option? Technol Cancer Res Treat, 2: , [21] Zöller M, Matzku S. Active vaccination after allogeneic bone marrow cell transplantation: a new option in the immunotherapy of cancer? Arch Immun Ther Exper, 50: , [22] Zöller M. Immunotherapy of Cancer: Allogeneic bone marrow transplantation after non-myeloablative conditioning as a new option for the elderly patient. Cancer Immunol Immunother, 2004 (E pub ahead of print) [23] Zöller M. Tolerance induction by tumor vaccination, J Immunother, 25: , [24] Hummel S, Wilms D, Vitacolonna M, Zöller M. Improved therapeutic efficacy of allogeneic bone marrow cell reconstitution in the non-myeloablatively conditioned tumor bearing host by donor T cell and host NK depletion. J Leukoc Biol, 72: , [25] Zöller M. Tumor vaccination after allogeneic bone marrow cell reconstitution of the non-myeloablatively conditioned tumorbearing host, J Immunol, 171: , 2003.

259 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Klinische Kooperationseinheit D070 Dermato-Onkologie Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D070) Leiter: Prof. Dr. med. Dirk Schadendorf Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. rer. nat. Stefan Eichmüller Dr. rer. nat. Claudia Kistler (11/03-) Dr. med. Jan Müller-Berghaus Dr. rer. nat. Wolfram Osen Dr. rer. nat. Annette Paschen Dr. med. Adina Thoelke (6/03-) PD Dr. med. Selma Ugurel PD Dr. rer. nat. Dr. med. Viktor Umansky Dr. med. Wolfram Fink (7/03- Forschungsaufenthalt in Brüssel) Ärzteteam Dr. med. Saskia Bouwhuis (9/02-2/03) Dr. med. Heike Röckmann Hans-Peter Schmid, AiP (5/03-) Dr. med. Anette Zimpfer Dr. med. Christine Zimpfer-Rechner Doktoranden Dipl. Biol. Friederike Fellenburg Dipl. oecothroph. Nicole Gottstein Dipl. Biol. Tanja Hartmann Dipl. Biol. Daniel Kolitsch (3/03-) Dipl. Biol. Mieun Lee Dipl. Biol. Tanja Lehmann (4/03-) Dipl. Biol. Annette Reitz Dipl. Biol. Heike Rothfels (-4/02) Dr. med. Mingxia Song Dipl. Chem. Ebil-Lun Gelen (-12/03) Dipl. Biol. Daniela Thomas (-3/03) Dipl. Biol. Dirk Usener (-4/03) Tierärztin Katrin van der Geer (2/03-) Stipendiaten Weiqing Jing (Shandong, China) (4/01-3/03) Studienassistenten im Prüfzentrum ( Study Nurse ) Sr. Annette Novak Technische Mitarbeiter Judith Bartels (MTA) (-9/03) Anita Dahlke (MTA) Elke Dickes (UTA) (11/03-) Angela Funk (BTA) (5/03-) Willi Eickelbaum (MTA) Christina Fehér (MTA) Brigitte Gschwendt (CTA) Ricarda Heber (BTA) (5/01-4/03) Bettina Hill (MTA) (1/03) Magdalena Pföhler (CTA) Claudia Sterzik (MTA) Sandra Striegel (MTA) (10/03-) Antje Sucker (MTA) Yvonne Nowak (Laborassistentin) Sekretariat Margaret Vazansky Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie ist eine Abteilung des Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) an der Hautklinik des Klinikum Mannheim der Universität Heidelberg. Dermatoonkologie befaßt sich mit der Prävention, Diagnose und Therapie von Tumoren der Haut. Dazu zählen Plattenepithelkarzinome der Haut und Hautanhangsorgane, Lymphome der Haut sowie das maligne Melanom, das für ¾ der hautkrebsbedingten Todesfälle verantwortlich ist. Die optimale Betreuung von Tumorpatienten ist eine interdisziplinäre Aufgabe, die guten Kontakt und Kooperation zu anderen Abteilungen wie Chirurgie, Pathologie, Radiologie, Hämatologie/Onkologie benötigt. Für die klinische Betreuung dieser Patienten im Haus sind spezielle Nachsorgesprechstunden eingerichtet. Die Klinische Kooperationseinheit für Dermatoonkologie besteht seit April 1997 und umfaßt Labore im DKFZ und in Mannheim. Dazu zählen ein großzügiger Laborbereich und eine spezielle dermatoonkologische Ambulanz in Mannheim mit der Möglichkeit auch ambulante Chemotherapien und Lymphknoten-Ultraschalluntersuchungen durchzuführen. Darüber hinaus stehen durch den Kooperationsvertrag zwischen dem DKFZ, der Universität Heidelberg und dem Klinikum Mannheim 4 Betten zur stationären Versorgung von Hautkrebspatienten zur Verfügung. Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit ist die enge Verzahnung von Klinik mit aktuellen, experimentellen Fortschritten im Labor. Im Zentrum der Bemühungen stehen Patienten mit malignen Melanomen in allen Stadien, jedoch auch fortgeschrittene Plattenepithelkarzinome und Lymphome der Haut werden umfassend stationär und ambulant versorgt. Es besteht die Möglichkeit Patienten bei den regelmäßig stattfindenden Dermatoonkologischen Konferenzen (mittwochs nachmittags, Anmeldung erbeten) vorzustellen. Homepage: 259

260 260 Chemoresistenz: Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie H. Röckmann (Helmbach), B. Gschwendt, S. Englisch, C. Kissel In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Hermann Lage, Prof. Manfred Dietel (Charité, Pathologie Berlin) und Prof. Dr. Pranav Sinha (Klinische Chemie, Klagenfurt, Österreich), Prof. Dr. Annemarie Poustka (DKFZ, Abt. B050), Prof. Peter Krammer (DKFZ, Abt. D030), Prof. Dr. Peter Lichter (DKFZ, Abt. B060). Im fortgeschrittenen Stadium hat das Melanom eine schlechte Prognose, hauptsächlich aufgrund der Ineffektivität von Chemotherapie. Einige Studien haben gezeigt, daß die Mechanismen, die zur Chemoresistenz von hämatologischen Tumoren führen, bei soliden Tumoren wie dem Melanom nicht wirksam sind. Aus diesem Grund müssen die Mechanismen, die mit Chemoresistenz bei Melanomerkrankungen in Zusammenhang stehen könnten, durch breitgefächerte Studienansätze analysiert werden. Die Auslösung von Apoptosis wird als einer der wichtigsten Mechanismen angesehen, durch die zytostatische Substanzen Tumorzellen töten. Infolgdessen könnten Defekte oder Veränderungen in der Apoptosiskaskade bei Melanomzellen die Wirksamkeit von Chemotherapeutika einschränken und zur Chemoresistenz führen. Es ist anzunehmen, daß es viele unbekannte Mechanismen auf der molekularen Ebene gibt, die zu Chemoresistenz führen, die jetzt mittels molekularbiologischen Untersuchungen gesucht werden [1-3]. Da experimentelle Beobachtungen zu Chemoresistenz in der Regel nicht direkt an Patienten vorgenommen werden können, haben wir ein in-vitro Modellsystem entwickelt, um sehr spezifische und reproduzierbare Analysen chemoresistenter Mechanismen ausführen zu können. Apoptosis-Defizienz Apoptosis (programmierter Zelltod) wurde als wichtigster Mechanismus erkannt, durch den Zytostatika anfällige (sensitive) Tumorzellen töten. Verschiedene Studien lassen vermuten, daß Resistenz gegen antineoplastische Substanzen durch Inhibition oder Dysregulation der Apoptosis verursacht wird. Untersuchungen an anderen Tumorsystemen haben ergeben, daß die Induktion von Apoptosis durch einige Zytostatika entweder durch Todesrezeptor-Ligand-Interaktionen, wie z. B. beim CD95-System, oder durch mitochondriale Prozesse vermittelt wird. Für das humane Melanom ist wenig über die Induktion von Apoptosis durch Chemotherapeutika oder über Störungen der apoptotischen Kaskaden, die Chemoresistenz bewirken, bekannt. Wir haben den apoptotischen Pfad analysiert, über den Cisplatin und Etoposid den Zelltod in chemo-sensitiven MeWo Zellen herbeiführen, und ihn mit den zum Zelltod führenden Pfaden bei chemoresistenten MeWo Zellen verglichen. Der durch Etoposid und Cisplatin induzierte apoptotische Zelltod wird durch mitochondriale Prozesse vermittelt. Eine analog durchgeführte Analyse an Etoposidresistenten Zellen zeigte ein anderes Muster. Defizient ablaufende apoptotische Prozesse wurden durch eine reduzierte Freisetzung von Cytochrom c durch die Mitochondrien sowie eine verminderte stromabwärts laufende Signaltransduktion charakterisiert. Der Zelltod in Cisplatin-resistenten Zellen kommt auch über veränderte Pfade (im Vergleich zu den Pfaden bei sensitiven Zellen) zustande, wenngleich andere Mechanismen tangiert werden [2]. Identifikation differentiell exprimierter Moleküle Es ist davon auszugehen, daß es noch weitere bisher unentdeckte Resistenz-vermittelnde Mechanismen gibt. Um hier zu einem tieferen Verständnis zu gelangen, haben wir mittels differential display reverse transcription-polymerase Klinische Kooperationseinheit D070 Dermato-Onkologie (DDRT-PCR) sowie complex cdna hybridisation (CCH) MeWo-Zellvarianten charakterisiert. Dieser Ansatz wurde durch eine Analyse der globalen Proteinexpression (Proteomanalyse) unter Verwendung einer zweidimensionalen Gelelektrophorese ergänzt, um weiteren noch unbekannten Mechanismen der Chemoresistenz beim humanen Melanom auf die Spur zu kommen [3, 4]. Ergebnisse: Mittels DDRT-PCR und Northern Blot Analysen konnten 11 cdns Klone als differentiell exprimierte Gene identifiziert werden[5]. Funktionelle Analysen haben gezeigt, daß DSM-2 (ICERE) eine Rolle in der Resistenz gegen Etoposid spielt[6]. Mittels complex cdna-hybridisation konnten weitere 120 differentiell exprimierte Gene identifiziert werden[7]. Durch 2-D-Gel Analyse konnten wir mehr als 70 differentiell exprimierte Proteine (ph 2,8-pH 10) identifizieren und in sensitiven und resistenten MeWo Melanomzelllinien vergleichen [4, 8]. Immuntherapie und Vakzinentwicklung A. Paschen, W. Osen, W. Jing, D. Thomas, E. Gelen, A. Reitz, T. Lehmann, D. Kolitsch, A. Sucker, C. Sterzik, R. Heber, J. Müller-Berghaus In Zusammenarbeit mit: Prof. Pierre Coulie (Ludwig Institut, Brüssel, Belgien); Prof. Georgio Parmiani (National Cancer Institute, Mailand, Italien), Prof. Dr. Marcus Maeurer (Mikrobiologie, Mainz), Prof. Dr. Hans-Georg Rammensee (Tübingen), Prof. Dr. Reinhard Dummer (Zürich, Schweiz), Prof. Dr. Carmen Scheibenbogen (Charité Berlin), Prof. Frederico Garrido (Granada, Spanien), PD Dr. Gerd Sutter & Dr. Ingo Drexler (Virologie, GSF München), Prof. Lutz Gissmann (DKFZ, Abt. F020), Prof. Dr. Harald Klüter & Dr. X D. Nguyen (Transfusionsmedizin, Mannheim), Dr. Siegfried Weiss (GBF Braunschweig) Prof. T. Chakraborty & PD Dr. E. Domann (Mikrobiologie, Gießen), PD Dr. Harald Kropshofer und PD Dr. Anne Vogt (Roche Institut für Molecular Genetics, Basel, Schweiz). Die zunehmende Anzahl der experimentellen Belege dafür, daß tumorassoziierte Antigene (tumor-associated antigens = TAA) durch das Immunsystem spezifisch erkannt werden, ließen das Konzept der Tumorvakzinierung aussichtsreich erscheinen und führte zu der Entwicklung verschiedener Tumor-spezifischer Vakzinierungsstrategien [9]. Die Anwendung solcher Behandlungsstrategien in klinischen Phase I/ II Studien führte jedoch zu therapeutischem Erfolg in nur einer kleinen Anzahl von Krebspatienten [10]. Dieses Ergebnis ist zum Teil darauf zurückzuführen, daß die Patienten in diesen Studien schon in fortgeschrittenen Krankheitsstadien waren, aber möglicherweise auch darauf, daß die meisten Vazinierungsstrategien ausschließlich auf die Induktion einer tumorspezifischen CD8+-T-Zell (CTL) Immunreaktion ausgerichtet waren. Obwohl CTL die Fähigkeit besitzen, Tumorzellen unmittelbar zu töten, hängen die Induktion und Erhaltung ihrer Effektorfunktion sehr stark von der Teilnahme antigenspezifischer CD4+ T-Helferzellen an der Immunreaktion ab. Aus diesem Grund muß eine Immuntherapie für Krebserkrankungen auf die Mobilisierung von sowohl CD8+ wie auch CD4+ T-Zellen hinsteuern. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen zuerst die von den Tumorzellen präsentierten immunogenen TAA-spezifischen T-Zellepitopen identifiziert werden. Die Arbeitsgruppe Immuntherapie und Vakzinentwicklung verfolgt daher zwei Hauptzielen: (I) die Identifizierung antigenspezifischer T-Zellepitopen als eine Voraussetzung für (II) die Entwicklung wirksamer antigenspezifischer, auf T- Zellen gerichteter Immuntherapien.

261 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Bisher haben die von unserer Gruppe durchgeführten Untersuchungen sich hauptsächlich mit der Charakterisierung immunogener HLA-Klasse I restriktivierter Peptiden, die aus Melanom-assoziierten Antigenen (melanoma associated antigens = MAA) stammen, befaßt. Das experimentelle Verfahren für die Identifizierung dieser Peptide basierte auf einer immunologischen Umkehrstrategie, d. h. die in vitro Stimulierung von T-Lymphozyten durch CTL-Epitopen, für die eine bestimmte Wirkung vorausgesagt wurde. Auf diese Weise konnten wir die immunogenen Peptidepitopen identifizieren, die für die qualitativ unterschiedliche Prozessierung der Antigenen in Tumorzellen verantwortlich sind [11-13]. Neben diesem Umkehrverfahren werden wir jetzt direkte Strategien zur Identifizierung von Epitopen unter Anwendung globaler Tumorantigenen in vitro und in vivo einsetzen. Dendritische Zellen (DC) werden mit Antigen-kodierender RNS oder rekombiniertem Protein geladen und HLA-transgene Mäuse werden mittels rekombinanter DNS, Protein oder rekombinanter mikrobiellen Vektorvakzinen immunisiert. Wir setzen direkte und Umkehrstrategien nebeneinander ein, um der Tatsache Rechnung zu tragen, daß Tumorzellen und antigenpräsentierende Zellen (antigenpresenting cells = APC) Unterschiede hinsichtlich des Spektrums der immunogener Peptide, die von einem gegebenen Tumorantigen generiert werden, aufzeigen könnten. Kenntnisse über beide Gruppen von Peptiden ist für die Entwicklung von Krebsvakzinen potentiell von Bedeutung. Im Bewußtsein der entscheidenden Rolle, die CD4+ T-Helferzellen in der Induktion und Erhaltung CTL-vermittelter Immunität spielen, haben wir unseren Ansatz mit einer Analyse der immunogenen TAA-derivierten Peptide, die von HLA-Klasse II Molekülen präsentiert werden, erweitert. Analog zu dem Verfahren beim HLA-Klasse I-System werden beide experimentelle Strategien (Umkehr- und direkt, in vitro/in vivo) angewendet. Die Versuche zur Identifikation von Epitopen werden auch die neuen TAA-spezifischen Antigene einschließen, die von der Arbeitsgruppe Identifikation und Charakterisierung neuer Tumorantigene in Laborversuchen identifiziert wurden. Die Charakterisierung der oben beschriebenen TAA bildet das Fundament für die zweite wichtige Zielsetzung der Arbeitsgruppe, die Entwicklung wirksamer, T-Zell aktivierender Krebsvakzine. Um dieses Ziel zu erreichen, schlagen wir zwei Wege ein: (I) Optimierung der schon entwickelten Vakzine und (II) Entwicklung neuer alternativer Vakzine. Wir glauben, daß auf dendritischen Zellen basierende Impfstoffe ein immunologisches Werkzeug mit beträchtlichem Potential für die Prophylaxe und Therapie darstellen, und die beeindruckende therapeutische Wirkung, die mit der Behandlung von Melanompatienten mit Peptid-beladenen autologen dendritischen Zellen schon erzielt werden konnte, bestätigt dieses Urteil [14]. Dieses Vakzin wollen wir noch weiter verbessern, in dem dendritische Zellen mit den antigenspezifischen CD4 + und CD8 + T-Zellepitopen geladen werden, die in den oben beschrieben experimentellen Arbeiten identifiziert wurden. Da aber die Herstellung autologer DC-Vakzine sehr kostspielig ist, suchen wir nach alternativen Vakzin-Vektorensystemen, die solche Antigene in vivo direkt in die dendritischen Zellen bringen können. Zu diesem Zweck benutzen wir das fakultative intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes um die TAA zu transportieren. Von uns durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß dieses Bakterium in der Lage ist, humane dendritische Zellen effektiv zu infizieren und dadurch phänotypische DC-Maturation und die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine auszulösen [15]. Klinische Kooperationseinheit D070 Dermato-Onkologie Neben diesem bakteriellen System werden wir den modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA) als virales Vektorensystem einsetzen. Für beide Vektorensysteme sind rekombinante Variante verfügbar, die Melanomantigene (melanoma differentiation antigens = MDA) transportieren können. Da MDA als Zielstrukturen für zelluläre Immunreaktionen in Melanompatienten schon bekannt und ausführlich in Tiermodellen untersucht worden sind, haben wir sie für die Evaluierung unserer Vakzinierungsstrategien gewählt. Die Effizienz dieser neuen Vakzinvektoren wird dementsprechend in humanen Zellkultursystemen und in Tierexperimenten, basierend auf dem B16 Melanom-Mausmodell und HLAtransgenen Mäusen, getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sollen dann in die Entwicklung von neuen experimentellen klinischen Therapien durch unsere Einheit einfließen. Identifikation und Charakterisierung neuer Tumorantigene S. Eichmüller, J. Zeng, D. Usener, F. Fellenberg, T. Hartmann, A. Dahlke, J. Bartels In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Michael Pawlita (DKFZ, Abt. F020), Prof. Reinhard Dummer (Dermatologie, Zürich, Schweiz), PD Dr. Edgar Dippel (Dermatologie, Mannheim). Mittelpunkt der Arbeit dieser Gruppe ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA) und die Einschätzung ihrer möglichen Anwendbarkeit für Diagnostik und Therapie. Die verschiedenen Projekte beziehen sich auf drei Hauptthemen: (1) die Suche nach Tumorantigenen mittels Screening, (2) Evaluierung der neu entdeckten TAA, ctage-1 und GBP-TA, und (3) die Entwicklung diagnostischer Werkzeuge. Wir verwenden verschiedene Screening-Verfahren wie das SEREX-Verfahren, eine serologische Screeningmethode von Phagenbanken, um neue tumorassoziierte Antigene oder Homologe von schon vorher entdeckten TAA zu identifizieren. Die Screeningversuche haben sich initial hauptsächlich auf das Kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bezogen, eine lymphoproliferative Erkrankung der Haut, für die nur eine begrenzte Anzahl tumorspezifischer Antigene bekannt sind [16], und konzentrieren sich jetzt auch auf des Melanom. Zusätzlich zu der Suche nach neuen Antigenen wurde die Expression bekannter tumorassoziierter Antigene, insbesondere derjenigen, die der cancer-germline-antigen Gruppe angehören, in verschiedenen Geweben und Zelllinien (CTCL, Melanom) untersucht. Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit war, daß in diesen CTCL-Proben das Antigen LAGE-1 und die Antigengruppe GAGE reichlich exprimiert wurden und deswegen vielversprechende Ansatzpunkte für therapeutische und diagnostische Maßnahmen darbieten könnten [17]. In der letzten Zeit haben wir angefangen nach Testis-Antigenen, die in malignen Melanomen exprimiert werden, zu suchen [18]. In einer Reihe von Versuchen neue CTCL-Antigene zu detektieren, konnten wir einige tumorassoziierte Antigene identifizieren, die ein interessantes serologisches Reaktionsmuster zeigten. Darüber hinaus konnten wir demonstrieren, daß eines der tumorassoziierten Antigene, die schon bekannt waren (SCP-1) und zwei neu entdeckte TAA (ctage-1 und GBP-TA) ein differentielles Expressionsmuster aufzeigen, das sie als wichtige potentielle Ziele für Immuntherapie erscheinen lässt [16, 17, 19-21]. Solche tumorspezifische Antigene könnten für Zell-basierten Immuntherapien oder - wenn sie auf der Zelloberfläche exprimiert werden - für Behandlungen, die auf Antikörpern basieren, ver- 261

262 262 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie wendet werden. Aus diesem Grund bilden die Bemühungen um eine vollständige Analyse der neu identifizierten Tumorantigene mittels Expressionsanalyse (RNS und Protein) und Immunhistologie sowie die Überprüfung der Antikörperreaktivität in Patientenseren wichtige Schwerpunkte der Forschung unserer Gruppe. Was ctage-1, das erste beim CTCL detektierte TAA, betrifft, konnten wir inzwischen zeigen, daß dieses Antigen Mitglied einer größeren Familie ist, zu der sogar ein zweites tumorspezifisches Mitglied gehört (ctage-5a) [21]. Sämtliche neue tumorassoziierte Antigene, die im Verlauf der beschriebenen Screeningverfahren sich zumindest in ihrer serologischen Reaktivität als tumorspezifisch darstellten, werden jetzt weiteren Untersuchungen auf der Proteinebene unterzogen. Das Ziel dieses Unternehmens ist es, neue diagnostische Werkzeuge durch das Generieren antigenspezifischer Antikörper und die Entwicklung eines ELISA-Systems bereitzustellen, um Patientenseren auf die Anwesenheit tumorspezifischer Antikörper überprüfen zu können. Experimentelle Therapie S. Ugurel, C. Zimpfer-Rechner, W. Fink, A. Novak, A. Zimpfer, H.-P. Schmid, W. Eickelbaum, M. Pföhler In Zusammenarbeit mit: Prof. Alexander Enk (Mainz), Prof. Gerold Schuler (Erlangen), Dr. Eckehard Kämpgen (Würzburg), Prof. Stefan Grabbe (Münster), PD Dr. Frank Nestle (Zürich, Schweiz), Prof. Dr. Ulrich Keilholz (Berlin), Prof. Dr. Claus Garbe (Tübingen), PD Dr. Axel Hauschild (Kiel), Prof. Graham Pawlec (Tübingen), Dr. Vera Rebmann & Prof. Dr. Grosse-Wilde (Essen). Eine Hauptzielsetzung der Arbeit der Gruppe ist eine möglichst direkte und effektive Übertragung neuer Ergebnisse aus dem Labor in erste klinische Anwendungen, sowohl im diagnostischen Bereich, z. B. durch den Einsatz neu entdeckter Serummarker, wie auch im therapeutischen Bereich, z. B. durch die Anwendung innovativer Vakzinierungsstrategien. Die Erreichung diese Ziels setzt eine enge Zusammenarbeit mit allen Projektgruppen der Einheit voraus und wird durch die räumliche Unterbringung eines Forschungslabors, eines GMP-Labors und der Ambulanz der dermatologischen Klinik im gleichen Haus besonders begünstigt. Da es immer noch keine anerkannte Standardtherapie für Melanom im fortgeschrittenen Stadium gibt, spielen klinische Studien eine entscheidende Rolle in der Überprüfung der Durchführbarkeit und therapeutische Wirksamkeit von neuen therapeutischen Ansätzen [22]. Einem Großteil der Patienten mit kutanen Neoplasien werden innovative Therapien unter konstanter und sorgfältiger Überwachung angeboten, die zuvor in vitro oder in Tiermodellen erprobt worden sind. Das Ansprechen auf die therapeutischen Maßnahmen sowie alle negative Auswirkungen werden genau und ausführlich nach den strengen Kriterien für good clinical practice (GCP) dokumentiert. Die Ausführung der Studienprotokolle und Dokumentation der klinischen Daten werden periodisch durch eine externe Gruppe von Experten begutachtet. Die Klinische Kooperationseinheit für Dermatoonkologie hat seit ihrem Entstehen an einer großen Anzahl verschiedenartiger klinischer Studien teilgenommen. Die schon abgeschlossenen und die noch laufenden Studien schließen große randomisierte multizentrische Studien auf nationaler sowie internationaler Ebene, die unter der Schirmherrschaft von anerkannten Gremien wie der Dermatologischen Onkologischen Arbeitsgruppe (ADO) der Deutschen Krebsgesell- Klinische Kooperationseinheit D070 Dermato-Onkologie schaft [23-25] oder der European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) ein [26], aber auch kleine kooperative Projekte mit 2 bis 4 anderen Kliniken. Das GMP-Labor der Einheit, in der z. B. Humanvakzine unter streng hygienisch kontrollierten Bedingungen hergestellt werden können, ermöglicht eine schnelle Umsetzung von experimentellen Strategien in die klinische Anwendung. Dieser Vorteil kam zur besonderen Geltung in der ersten Pilotstudie zur Vakzination mit autologen dendritischen Zellen in Patienten mit metastasiertem malignem Melanom [27] und führte zu der Initiierung einer multizentrischen Phase-III Studie zur Prüfung der Wirksamkeit dieser Vakzinationstherapie im Vergleich mit einer zytostatischen Therapie an einer großen Zahl von Patienten. Während der Vorbereitungsphase dieser Studie kamen medizinische und labortechnische Mitarbeiter der anderen Prüfzentren zu unserer Einheit in Mannheim, um die notwendigen Verfahren unter Einhaltung der strengen GCP und GMP Vorschriften zu erlernen. Eine weitere Vakzinierungsstrategie unter Verwendung Peptidepitopen aus den Melanom-assoziierten Antigenen Tyrosinase and GM-CSF wurde in einer Phase-II Studie an Patienten mit einer fortgeschrittenen metastasierten Melanomerkrankung untersucht [28-30]. ELISPOT Analysen zeigten eine spezifische Induktion Tyrosinase-reaktiver T- Zellen in nur 4 von 16 Patienten. Ausgehend von diesen vorläufigen Ergebnissen wurde ein zweites Studienprotokoll initiiert, um verschiedene zusätzlich verabreichte Adjuvantien hinsichtlich ihrer Fähigkeit Tyrosinase-spezifische T-Zell Reaktionen zu verstärken, zu vergleichen. Verschiedene experimentelle Arbeiten in der Grundlagenforschung, die von den Wissenschaftlern und technischen Assistenten in unserem Labor durchgeführt wurden, haben jetzt den Punkt erreicht, da sie in klinischen Phase I/II Studien als therapeutische Ansätze angewendet werden können. Große Fortschritte, die in der Identifizierung und Charakterisierung neuer Antigenen für das kutane T-Zell Lymphom erreicht wurden [19], werden jetzt in Hinsicht auf ihre Anwendbarkeit für Immuntherapie überprüft. Darüber hinaus konnten durch eine andere Gruppe neue tumorassoziierte Antigene für das Melanom identifiziert und charakterisiert werden [12, 13], die möglicherweise für Vazinierungsstrategien geeignet sind. Spezifische T-Zellepitopen für beide maligne Erkrankungen werden letzten Analysen und Prüfungen im Labor unterzogen, bevor sie in der nächsten Zukunft zum Einsatz in klinischen Studien kommen. Da unsere Einheit über ein eigenes GMP-Labor verfügt, kann der Transfer vom Labor zur klinischen Anwendung unmittelbar und ohne unnötige Verzögerungen stattfinden. Die von unserer Einheit geleisteten Forschungsarbeiten zu schon bekannten prognostischen Markern und zu den durch eigene Arbeiten neu entdeckten serologischen Markern werden in einem nächsten Schritt in größeren Patientengruppen erprobt und analysiert. Diese Untersuchungen stehen im Zusammenhang mit einem kooperativen Forschungsprojekt (in Kooperation mit 6 externen Forschungsgruppen und finanziert durch Förderungsmittel der EU) mit dem Ziel, Untersuchungsmaterial von Melanompatienten für genomische und proteomische Analysen zu sammeln. Ein weiteres kooperatives Projekt (in Kooperation mit Prof. C. Garbe und PD A. Hauschild) befaßt sich mit der Evaluierung der Nachsorge des Malignen Melanoms. Die aus diesen drei Projekten gewonnenen Daten werden in einer hochleistungsfähigen, Computer-unterstützen Datenbank zusammengefaßt, so daß klinische und Laborergebnisse schnell und akkurat abgerufen und verglichen werden können.

263 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie Damit werden die Voraussetzungen dafür geschaffen, daß neue serologische und an Gewebe gebundenen Markerproteine in groß angelegten Studien mit größeren Teilnehmerzahlen hinsichtlich ihrer Tauglichkeit, das Ansprechen auf eine bestimmte Therapie oder die voraussichtliche Lebenserwartung eines Patienten zu prognostizieren. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Helmbach, H., Rossmann, E., Kern, M.A., Schadendorf, D.: Drug-resistance in human melanoma. Int J Cancer, (5): [2] Helmbach, H., Kern, M.A., Rossmann, E., Renz, K., Kissel, C., Gschwendt, B., Schadendorf, D.: Drug resistance towards etoposide and cisplatin in human melanoma cells is associated with drug-dependent apoptosis deficiency. J Invest Dermatol, (6): [3] *Poland, J., Schadendorf, D., *Lage, H., Schnoelzer, M., *Celis, J.E., *Sinha, P.: Study of therapy resistance in cancer cells with functional proteome analysis. Clin Chem Lab Med, (3): [4] *Sinha, P., *Kohl, S., *Fischer, J., *Hutter, G., Kern, M., *Kottgen, E., *Dietel, M., *Lage, H., Schnoelzer, M., Schadendorf, D.: Identification of novel proteins associated with the development of chemoresistance in malignant melanoma using two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis, (14): [5] Grottke, C., *Mantwill, K., *Dietel, M., Schadendorf, D., *Lage, H.: Identification of differentially expressed genes in human melanoma cells with acquired resistance to various antineoplastic drugs. Int J Cancer, (4): [6] *Lage, H., Helmbach, H., *Grottke, C., *Dietel, M., Schadendorf, D.: DFNA5 (ICERE-1) contributes to acquired etoposide resistance in melanoma cells. FEBS Lett, (1-2): [7] Wittig, R., Nessling, M., Will, R.D., Mollenhauer, J., Salowsky, R., Munstermann, E., Schick, M., Helmbach, H., Gschwendt, B., Korn, B., Kioschis, P., Lichter, P., Schadendorf, D., Poustka, A.: Candidate genes for cross-resistance against DNA-damaging drugs. Cancer Res, (22): [8] *Sinha, P., *Poland, J., *Kohl, S., Schnoelzer, M., Helmbach, H., *Huetter, G., *Lage, H., Schadendorf, D.: Study of the development of chemoresistance in melanoma cell lines using proteome analysis. Electophoresis, : [9] Sun, Y., Paschen, A., Schadendorf, D.: Cell-based vaccination against melanoma-background, preliminary results, and perspective. J Mol Med, (8): [10] *Möller, P., *Möller, H., Sun, Y., *Dorbic, T., *Henz, B.M., *Wittig, B., Schadendorf, D.: Increased non-major histocompatibility complex-restricted lytic activity in melanoma patients vaccinated with cytokine gene-transfected autologous tumor cells. Cancer Gene Ther, (7): [11] Sun, Y., Song, M., *Stevanovic, S., Jankowiak, C., Paschen, A., *Rammensee, H.G., Schadendorf, D.: Identification of a new HLA-A(*)0201-restricted T-cell epitope from the tyrosinase-related protein 2 (TRP2) melanoma antigen. Int J Cancer, (3): [12] Sun, Y., *Sijts, A.J., Song, M., *Janek, K., *Nussbaum, A.K., *Kral, S., *Schirle, M., *Stevanovic, S., Paschen, A., *Schild, H., *Kloetzel, P.M., Schadendorf, D.: Expression of the proteasome activator PA28 rescues the presentation of a cytotoxic T lymphocyte epitope on melanoma cells. Cancer Res, (10): [13] *Scheibenbogen, C., Sun, Y., *Keilholz, U., Song, M., *Stevanovic, S., *Asemissen, A.M., *Nagorsen, D., *Thiel, E., *Rammensee, H.G., Schadendorf, D.: Identification of known and novel immunogenic T-cell epitopes from tumor antigens recognized by peripheral blood T cells from patients responding to IL-2-based treatment. Int J Cancer, (3): [14] *Nestle, F.O., *Alijagic, S., *Gilliet, M., Sun, Y., *Grabbe, S., *Dummer, R., *Burg, G., Schadendorf, D.: Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat Med, (3): Klinische Kooperationseinheit D070 Dermato-Onkologie [15] Paschen, A., *Dittmar, K.E.J., *Grenningloh, R., *Rohde, M., Schadendorf, D., Domann, E.,Chakraborty, T., *Weiss, S.: Human dendritic cells infected by Listeria monocytogenes: induction of maturation, requirements for phagolysosomal escape and antigen presentation capacity. Eur J Immunol, (12): [16] Eichmüller, S., Towards defining specific antigens for cutaneous lymphomas. Onkologie, : [17] Eichmüller, S., Usener, D., Thiel, D., Schadendorf, D.: Tumorspecific antigens in cutaneous T-cell lymphoma: expression and sero-reactivity. Int J Cancer, (4): [18] Eichmüller, S., Usener, D., Jochim, A., Schadendorf, D.: mrna expression of tumor-associated antigens in melanoma tissues and cell lines. Exp Dermatol, (4): [19] Eichmüller, S., Usener, D., *Dummer, R., Stein, A., Thiel, D., Schadendorf, D.: Serological detection of cutaneous T-cell lymphoma-associated antigens. PNAS, (2): [20] Usener, D., Gerhardt, A., Schadendorf, D., Eichmüller, S.: Sero-reactivity against MAGE-A and LAGE-1 proteins in melanoma patients. Br J Dermatol, : [21] Usener, D., Schadendorf, D., *Koch, J., *Dübel, S., Eichmüller, S.: ctage: a cutaneous T-cell lymphoma associated antigen family with tumor-specific splicing. J Invest. Dermatol., (1): [22] Schadendorf, D.: Hat die Vakzination von Tumorpatienten eine Zukunft ind der klinischen Onkologie? Onkologie, : [23] *Becker, J.C., *Terheyden, P., *Kampgen, E., *Wagner, S., *Neumann, C., Schadendorf, D., *Steinmann, A., *Wittenberg, G., *Lieb, W., *Broecker, E.B.: Treatment of disseminated ocular melanoma with sequential fotemustine, interferon α, and interleukin 2. Br J Cancer, (8): [24] Zimpfer-Rechner, C., Hofmann, U., Figl, R., *Becker, J., *Trefzer, U., *Keller, I., *Hauschild, A., Schadendorf, D.: Randomized phase II study of weekly paclitaxel versus paclitaxel and carboplatin as second-line therapy in disseminated melanoma: a multicentre trial of the Dermatologic Co-operative Oncology Group (DeCOG). Melanoma Research, : [25] *Hauschild, A., *Weichenthal, M., *Balda, B.-R., *Becker, J., *Wolff, H.H., *Tilgen, W., *Schulte, K.-W., *Ring, J., Schadendorf, D., *Lischner, S., *Burg, G., *Dummer, R.: Prospective-randomised trial of Interferon α-2b and Interleukin-2 as adjuvant treatment for resected intermediate- and high-risk primary melanoma without clinically detectable node metastases. J Clin Oncol, : [26] *Keilholz, U., *Martus, P., *Punt, C.J., *Kruit, W., *Mooser, G., Schadendorf, D., *Lienard, D., *Dummer, R., *Koller, J., *Voit, C., *Eggermont, A.M.: Prognostic factors for survival and factors associated with long-term remission in patients with advanced melanoma receiving cytokine-based treatments: second analysis of a randomised EORTC Melanoma Group trial comparing interferon-α2a (IFNα) and interleukin 2 (IL-2) with or without cisplatin. Eur J Cancer, (11): [27] Schadendorf, D. and *Nestle, F.O.: Autologous dendritic cells for treatment of advanced cancer - an update. Recent Results Cancer Res, : [28] *Keilholz, U., *Scheibenbogen, C., *Thiel, E., Schadendorf, D.: Rational development of peptide vaccination in clinical oncology. Onkologie, (2): 174. [29] *Scheibenbogen, C., *Schmittel, A., *Keilholz, U., Allgauer, T.: Hofmann, U., *Max, R., *Thiel, E., Schadendorf, D., Phase 2 trial of vaccination with tyrosinase peptides and granulocytemacrophage colony-stimulating factor in patients with metastatic melanoma. J Immunother, (2): [30] *Scheibenbogen, C., Schadendorf, D., *Bechrakis, N.E., *Nagorsen, D., Hofmann, U., *Servetopoulou, F., *Letsch, A., *Philipp, A., *Foerster, M.H., *Schmittel, A.,*Thiel, E., *Keilholz, U.: Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and foreign helper protein as immunologic adjuvants on the T-cell response to vaccination with tyrosinase peptides. Int J Cancer, (2):

264 Forschungsschwerpunkt D Tumorimmunologie D080 Angeborene Immunität Arbeitsgruppe Angeborene Immunität (D080) Leiterin: Dr. Adelheid Cerwenka 264 Doktoranden Norman Nausch (08/03- ) Kai Zanzinger (10/03- ) Technische Assistentin Sandra Kosten (06/03- ) Das angeborene Immunsystem stellt die erste Immunabwehr gegen eindringende Pathogene dar und hat das Potential Tumorzellen als fremd zu erkennen und abzuwehren. Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.b. Natürliche Killerzellen (NK Zellen), NKT Zellen, Makrophagen und γδ T Zellen können virus-infizierte Zellen oder Tumorzellen direkt erkennen und bekämpfen. Sie aktivieren auch das adaptive Immunsystem, das Tumorspezifische Gedächtniszellen ausbilden kann. Im Blickpunkt der Forschung der neu gegründeten Arbeitsgruppe Angeborene Immunität ist es, die molekularen Signalketten in Immunzellen des angeborenen Immunsystems und deren Erkennungsstrukturen auf Tumorzellen zu erforschen. Diese Projekte haben das Ziel, neue Strategien zur Tumorbekämpfung durch das Immunsystem zu entwickeln. Erkennungsstrukturen für Natürliche Killerzellen auf Tumorzellen N. Nausch In Zusammenarbeit mit Prof. Peter Angel, Prof. Günter Schütz und Prof. Günter Hämmerling, alle DKFZ Natürlichen Killerzellen (NK Zellen) haben das Potential Tumorzellen als fremd zu erkennen und zu eliminieren. Die spezifische Erkennung von Oberflächenmolekülen, die auf Tumorzellen exprimiert sind, und die Eliminierung der Tumorzellen durch Zellyse, wird durch aktivierende Rezeptoren auf NK Zellen vermittelt. Diese aktivierenden Rezeptoren stehen oft unter der Kontrolle von hemmenden Signalen, die über inhibierende Rezeptoren, hemmende Zytokine oder immunsupprimierende Zellpopulationen vermittelt werden können. In unseren Studien entdeckten wir, dass die Familie der retinoic acid inducible genes I (RAE-1), die auf Tumorzellen und nicht auf gesunden Zellen exprimiert ist, an den aktivierenden Rezeptor NKG2D bindet. Unsere Experimente zeigten, dass die Expression dieser Liganden für den aktivierenden Rezeptor NKG2D auf Tumorzellen zur Tumorabstoßung durch NK Zellen in einem Melanomund Lymphom- Mausmodell führt. Wir untersuchen nun Stress-Signale, die die Expression von Erkennungsstrukturen für aktivierende NK Zellrezeptoren auf Tumorzellen regulieren. Insbesondere beschäftigen wir uns mit den Mechanismen, die der NK Zell-vermittelten Tumorabwehr entgegen wirken. Um die Rolle von Liganden für aktivierende Rezeptoren in der Immunantwort besser zu verstehen, etablieren wir gewebsspezifische, induzierbare, transgene Mausstämme. Funktionelle Genomik von Signalwegen des angeborenen Immunsystems K. Zanzinger, S. Kosten In Zusammenarbeit mit Prof. Vaclav Horejsi, Institute of Molecular Genetics, Prag, Tschechische Republik. Zellen des angeborenen Immunsystems werden durch Signalwege aktiviert, die zu der Ausschüttung Entzündungsfördender Botenstoffe, zu Zelldifferenzierung oder Lyse von Tumorzellen führen können. Diese Signalwege, wie zum Beispiel der Toll Signalweg, sind oft konserviert in Invertebraten und Säugern. Unser Projekt zielt darauf ab, neue Moleküle in Signalketten zu identifizieren, die eine wichtige Rolle bei der Tumor Attacke durch NK Zellen spielen oder Entzündungsreaktionen hervorrufen. Wir untersuchen im speziellen die Aktivierung von Signalketten, die Adaptermoleküle mit ITAM (Immunrezeptor Tyrosin-basierende Aktivierungs Motiven) oder PI3-Kinase Motiven involvieren. Zu diesem Zweck etablieren wir neue Methoden des retroviralen Expressionsklonierens, der funktionellen Genomik und Proteomik. Insbesondere widmen wir uns der Erforschung von Molekülen, die für Proteinabbau durch Ubiquitinierung von Bedeutung sind. Die identifizierten Moleküle validieren wir durch RNAi vermittelten Gene-knock-down oder durch Studien der Genüberexpression in murinen und humanen Zellinien oder primären Zellen. Diese Studien sollen grundlegende Erkenntnisse der Zellaktivierung in der Tumorantwort gewinnen. Publikationen Diese Gruppe wurde erst im April 2003 im DKFZ etabliert. Die angeführten Publikationen wurden in Zusammenarbeit mit der früheren Arbeitsstelle durchgeführt. [1] A. Cerwenka, J. L. Baron, and L. L. Lanier Ectopic expression of retinoic acid early inducible-1 gene (RAE-1) permits NK cell-mediated rejection of a MHC class I-bearing tumor in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98: [2] A. Cerwenka, L. L. Lanier Ligands of natural killer cell receptors: redundancy or specificity, Immunol. Rev. 181: [3] A. Cerwenka, L. L. Lanier NK cells, viruses and cancer. Nature Immunol. Rev. 1:41-49 [4] A. Cerwenka, C.A. O Callaghan, J.A. Hamerman, R. Yadav, W. Ajayi, D.C. Roopenian, S. Joyce, L.L. Lanier The minor histocompatibility antigen H60 peptide interacts with both H-2Kb and NKG2D. J. Immunol. 168:

265 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie übersicht Forschungsschwerpunkt Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Sprecher: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Wolfhard Semmler Radiologie (E010) Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Kauczor TEL , FAX HU.Kauczor@DKFZ.de Medizinische Physik in der Radiologie (E020) Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Wolfhard Semmler TEL , FAX Wolfhard.Semmler@DKFZ.de Radiopharmazeutische Chemie (E030) Prof. Dr. rer. nat. Michael Eisenhut TEL , FAX M.Eisenhut@DKFZ.de Medizinische Physik in der Strahlentherapie(E040) Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Schlegel TEL , FAX W.Schlegel@DKFZ.de Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050) Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Jürgen Debus TEL , FAX J.Debus@DKFZ.de Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060) Prof. Dr. med. Uwe Haberkorn TEL , FAX TEL U.Haberkorn@DKFZ.de Molekulare Toxikologie (E080) Prof. Dr. med. M. Wießler TEL , FAX M.Wiessler@DKFZ.de Zelluläre und Molekulare Pathologie (E090) Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne TEL , FAX H.-J.Groene@DKFZ.de Toxikologie und Chemotherapie (E100) Prof. Dr. med. Martin Berger TEL , FAX M.Berger@DKFZ.de Gentherapie von Tumoren (E110) Prof. Dr. med. Magnus von Knebel-Doeberitz TEL knebel@med.uni-heidelberg.de Pharmakologie der Krebsbehandlung (E120) Prof. Dr. med. Jens W. Zeller TEL , FAX J.Zeller@DKFZ.de Rekombinante Antikörper (E130) Prof. Dr. Melvyn Little TEL , FAX M.Little@DKFZ.de Experimentelle Therapie (E140) Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Kauczor (kommissarisch) TEL , FAX HU.Kauczor@DKFZ.de Molekulare Therapie (E150) N.N. Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (E160) Dr. med. Martin Görner TEL , FAX Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (E170) Prof. Dr. med. Kulozik TEL Andreas.Kulozik@med.uni-heidelberg.de Klinische Kooperationseinheit Gastroenterologische-Onkologie (E180) Prof. Dr. med. Matthias Löhr TEL , FAX M.Loehr@dkfz.de Hochauflösende Optische Mikroskopie (E190) Prof. Dr. rer. nat. Stefan Hell TEL , FAX S.Hell@DKFZ.de Ziel des Forschungsschwerpunktes Innovative Krebsdiagnostik und -therapie ist es, neue Erkenntnisse, Methoden und Techniken in die onkologische Diagnostik und Therapie einzuführen, um die Tumorbehandlung individuell an den Patienten anzupassen und die lokale und systemische Tumorkontrolle zu verbessern. Das multidisziplinäre Forschungsprogramm setzt sich aus zwei Teilbereichen zusammen: einem Bereich Radiologische Onkologie mit physikalischen Methoden als Grundlagen, dem die Abteilungen E010 bis E060 und E190, und einem Bereich Medizinische Onkologie, dem die Abteilungen E080 bis E180 angehören. Der Bereich Radiologische Onkologie wird getragen von vier Abteilungen, von zwei klinischen Kooperationseinheiten und einer selbständigen Arbeitsgruppe. Entsprechend der komplexen Thematik arbeiten in diesem Bereich Ärzte verschiedener Fachrichtungen, Physiker, Mathematiker, Informatiker, Ingenieure, Chemiker und Biologen zusammen. Der Bereich Medizinische Onkologie stellt sich die Aufgabe, in der Zusammenführung von grundlagen- und klinisch orientierten Arbeitsgruppen Voraussetzungen für die Entwicklung neuer systemischer therapeutischer und diagnostischer Verfahren zu schaffen, die unmittelbar in die Klinik umgesetzt werden sollen. Dies soll über eine intensive Kooperation zwischen den grundlagenorientierten Abteilungen des Forschungsschwerpunktes und den klinischen Kooperationseinheiten erzielt werden. Die Zielvorgaben der Abteilung Radiologie (früher: Onkologische Diagnostik und Therapie) sind eine möglichst frühe Erkennung des Tumors, die Feststellung des Ausbreitungsgrades, die prognostische Beurteilung, die Unterstützung der Therapieplanung, die Beurteilung des Therapieerfolgs und die Nachsorgediagnostik sowie die Sekundärprävention mit bildgebenden Verfahren. Neben verbesserter Visualisierung des Tumors spielt die Bestimmung funktioneller Parameter des Tumorgewebes (z. B. zur Mikrozirkulation oder zum Metabolismus) eine wichtige Rolle für die Beurteilung der individuellen Krebserkrankung. Diese werden zunehmend in die Strahlentherapie und in das Therapie-Monitoring einbezogen. In Begleitung dieser klinisch-wissenschaftlichen Projekte werden in Zusammenarbeit mit den grundlagenorientierten Abteilungen 265

266 266 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie übersicht des DKFZ experimentelle Studien durchgeführt. Für diese genannten Aufgaben werden die modernen Schnittbildtechniken wie Mehrschicht-Spiral-CT, Magnetresonanztomographie, Magnetresonanz-Spektroskopie, computerunterstützte Sonographie sowie Farbdoppler- Sonographie eingesetzt. Technische Verbesserungen und Innovationen erfolgen in enger Zusammenarbeit mit der Abteilung für Medizinische Physik in der Radiologie. Die klinische Erprobung und kritische Evaluation erfolgt in Zusammenarbeit mit den Klinischen Kooperationseinheiten für Strahlentherapie und Nuklearmedizin sowie den Kliniken des Tumorzentrums Heidelberg/Mannheim. Das Forschungsprogramm der Abteilung Medizinische Physik in der Radiologie (früher: Biophysik und medizinische Strahlenphysik) (E020) ist multidisziplinär ausgerichtet und umfasst physikalische, technische und biologische Forschungsarbeiten auf den Gebieten der Tumordiagnostik. Ziel dieser Arbeiten, ist die methodischen Voraussetzungen für eine verbesserte Tumordiagnostik und damit für eine Individualisierung der Tumortherapie zu erarbeiten. Es werden bildgebende Methoden entwickelt und verbessert, die eine Tumorcharakterisierung nicht nur nach morphologischen, sondern auch nach funktionellen und physiologischen Parametern und insbesondere auch molekularen Parametern ermöglicht. Hierfür sind grundlegende Forschungsarbeiten auf den genannten Gebieten die Basis für die Weiterentwicklung der Verfahren. Neue Arbeitsbereiche erschließen sich auf dem Gebiet der interventionellen Verfahren, insbesondere der interventionellen MRT, die neue Möglichkeiten bieten, z.b. zuverlässig Biopsien zu gewinnen und die onkologische Therapie via Gefäßzugang oder perkutanem Zugang zu verbessern und gleichzeitig die Belastung für den Patienten zu verringern. Die diagnostische Wertigkeit der PET soll durch Anwendung von tracerspezifischen Modellen der kinetischen Bildanalyse verbessert werden, um diese durch optimierte Korrektur- und Bildrekonstruktionsverfahren als einen Eckpfeiler in der Tumordiagnostik zu etablieren. Zurzeit wird eine Arbeitsgruppe Molekulare Diagnostik, aufgebaut, die neue Ansätze für eine organ- und krankheitsspezifische Diagnostik verfolgt. In der Abteilung Radiopharmazeutische Chemie (früher: Radiochemie und Radiopharmakologie, E030) steht die Entwicklung und präklinische Testung neuer Radiopharmaka im Vordergrund, die zur klinischen Anwendung für die Positronen-Emissions-Tomography (PET) und Single-Photon-Emissions-Computer-Tomography (SPECT) geeignet sind. Des Weiteren werden Radiopharmaka nach GMP-Richtlinien hergestellt, die in der Klinischen Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060) eingesetzt werden. Dazu gehören neben der Herstellung auch die Qualitätsprüfung der Präparate, die Validierung von Herstellungsverfahren und Qualitätsprüfung sowie die Ausarbeitung der Dokumentation für behördliche Genehmigungen. Weitere Schwerpunkte sind die Erforschung von Pretargeting-Methoden für die Immunszintigraphie (IS) und die Radioimmuntherapie (RIT) unter Verwendung bispezifischer Antikörper und radioaktiv markierter Metallkomplexe. Des Weiteren werden 68 Ga-Komplex-markierte rezeptoraffine Peptide und Trägermoleküle für den zielgerichteten Transport von Wirkstoffen in Tumorzellen entwickelt. Zu den Wirkstoffen zählen radioaktive Partikelstrahler, Zytostatika, Antisense- Oligonukleotide und andere zytotoxische Agentien. Die Strahlentherapie der nächsten Jahrzehnte wird sich in einem verstärkten Maße auf eine effizientere, nebenwirkungsfreie Behandlung lokal wachsender Tumoren konzentrieren. Besonders Erfolg versprechend sind hierbei physikalisch technische Konzepte einer so genannten tumorkonformen Strahlentherapie. Ziel dieser Ansätze und damit der Abteilung Medizinische Physik in der Strahlentherapie (früher: Medizinische Physik) (E040) ist eine Konzentration der Energiedosis im Tumor- bzw. Zielvolumen. Dies gelingt beispielsweise durch individuelle Anpassung der Strahlenfeldform zusammen mit komplizierten computerunterstützten Planungs- und Bestrahlungstechniken wie der stereotaktischen Strahlentherapie oder der intensitätsmodulierten Strahlentherapie (IMRT). Es ist dabei davon auszugehen, dass auch in den nächsten 20 Jahren die Strahlenbehandlungen mit Hilfe ultraharter Röntgenstrahlen (Photonen) aus Elektronen-Linearbeschleunigern die Bestrahlungstechnik mit der größten Verbreitung bleiben werden. Für bestimmte spezielle Tumorerkrankungen wird in zunehmenden Maße auch Teilchenstrahlung (Protonen, schwerere Ionen) eingesetzt. Die Forschungs- und Entwicklungsarbeit der Abteilung konzentriert sich dabei auf die Art und Weise, wie diese Photonen- oder Teilchen-Strahlen zukünftig im Zielvolumen appliziert werden. Das wichtigste Ziel ist in diesem Zusammenhang die räumliche, zeitliche und biologische Anpassung der lokalen Strahlendosisverteilung an das Zielvolumen ( Adaptive Strahlentherapie ). Eine wesentliche Rolle spielt dabei die Verknüpfung der Strahlenbehandlung mit morphologischer, funktioneller oder metabolischer Bildgebung (CT, MRI, fmri, MRS, SPECT und PET) Mit Hilfe klinischer Studien, die in Zusammenarbeit mit der Radiologischen Klinik der Universität Heidelberg durchgeführt werden, sollen die Praktikabilität der neuen Verfahren der adaptiven Strahlentherapie und die zu erwartende Wirkungssteigerung untersucht werden. Dabei werden nicht nur kurative Ansätze verfolgt, sondern auch die Einschränkung der Metastasierung, sowie verbesserte palliative Behandlungskonzepte. Die wissenschaftliche Zielsetzung der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050), die in enger Zusammenarbeit mit der Strahlenklinik der Universität und den Abteilungen des Forschungsschwerpunktes steht, umfasst neben der Radiochirurgie die konformierende fraktionierte Strahlentherapie von Hirntumoren, insbesondere der Schädelbasis. Ein neuer Anwendungsbereich für diese Methode ist die extracranielle Strahlentherapie von Leber- und Lungenmetastasen sowie paraspinal gelegner strahlenresistenter Tumoren. Durch eine spezielle Form der Fixierung und durch Einsatz komplexer Bestrahlungsplanungssysteme wird ein enger Dosisgradient zu strahlenempfindlichen Strukturen möglich. Ziel ist eine verbesserte lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger Schonung des Normalgewebes. Die intensitätsmodulierte Strahlentherapie als neues Bestrahlungsverfahren wird mit dem Ziel der weiteren Verbesserung der Dosisapplikation im Tumor eingesetzt. Darüber hinaus erfolgt neben der Anwendung ultraharter Röntgenstrahlung auch die Strahlentherapie mit Kohlenstoffionen in Zusammenarbeit mit der GSI in Darmstadt. Ergänzend zu den klinischen Projekten werden molekularbiologische und strahlenbiologische Untersuchungen durchgeführt. Die Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060) verbindet Aktivitäten in der Universitätsklinik Heidelberg und dem DKFZ bei der Nutzung nuklearmedizinischer Methoden wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Single Photon Emission Tomography (SPECT),

267 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie um biochemische und physiologische Prozesse in Tumoren im Rahmen klinischer, tierexperimenteller und zellbiologischer Studien zu erforschen. Ein weiterer Ansatz ist die Verlaufsbeobachtung von neuen Therapieansätzen wie Gentherapie maligner Tumoren und Antiangiogenese. Hier beschäftigt sich die Abteilung mit der Konstruktion gewebespezifischer viraler Vektoren, dem Nachweis der Genexpression und den Effekten auf Perfusion, Stoffwechsel, Apoptose und Proliferation. Andere Projekte betreffen radioaktiv markierte antisense Oligonukleotide, radioaktiv markierte Chemotherapeutika, die Verfolgung von Apoptose sowie die Entwicklung neuer nuklearmedizinischer Therapien. Im Rahmen dieser Aktivitäten sollen neue Biomoleküle über neue Techniken wie z.b. Phagen-Display gewonnen werden. Die damit identifizierten Moleküle können dann nach Radioaktiv-Markierung sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie eingesetzt werden. Die Forschungsziele der Abteilung Molekulare Toxikologie (E080) konzentrieren sich auf toxikologische Fragestellungen, auf die Entwicklung neuer Tumortherapeutika und die Untersuchung von Therapieresistenz. In der Toxikologie liegt das Schwergewicht auf der Analyse und der Strukturaufklärung von DNA-Addukten, die verwendet werden können, um die Belastung durch Umweltgifte zu erfassen (Biomonitoring). Die derzeit empfindlichste Methode zu diesem Zweck ist die ³²P-postlabeling-Analyse, die jedoch den Nachteil hat, dass mit hohen Mengen an Radioaktivität gearbeitet werden muss. Mit einem von uns entwickelten Verfahren können DNA-Addukte jedoch auch mit einem Fluoreszenzmarker versehen und durch Kapillarelektrophorese bestimmt werden. So konnten so genannte endogene aber auch von Umweltgiften verursachte DNA- Addukte nachgewiesen werden. In der Abteilung werden neue Arzneimittel entwickelt, welche auf dem Konzept der Kopplung von Tumortherapeutika an Saccharide basieren, um den Transport zum Tumor und die Aufnahme in die Tumorzellen zu erleichtern. Wir haben einen Hemmstoff eines DNA Reparaturenzyms als Zuckerkonjugat synthetisiert, der für eine Anwendung in der Tumortherapie weiterentwickelt wird. Die spezifische Aufnahme solcher Glykokonjugate durch Transportsysteme führt zu einer Anreicherung der Substanzen im Zielorgan und reduziert unerwünschte Nebenwirkungen. Komplexe synthetische Oligosaccharidmimetika wurden synthetisiert und auf ihre Fähigkeit hin untersucht an Zucker erkennende Moleküle auf der Zelle zu binden und Zell-Matrix Interaktionen zu beeinflussen. Eine weitere Möglichkeit, Arzneimittel zielgenau an Tumoren zu bringen, ist ihre kovalente Kopplung an humanes Serumalbumin. Tumorzellen nehmen Albuminkonjugate über Endozytose auf, im Lysosom, dem Magen der Zelle, wird das gekoppelte Therapeutikum freigesetzt und tötet die Zelle. Wir haben Proteine auf der Zelloberfläche identifiziert, die Albumin binden und erweitern das Konzept auf andere Medikamente. In einer Kooperation mit der HNO-Klinik der Universität und der Thoraxklinik Heidelberg wurde ein Verfahren zur Testung der Chemosensibilität von Tumorexplantaten entwickelt. Die Arbeiten der Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (E090) befassen sich mit Mechanismen der Abstoßung von Tumorgewebe und allogen-transplantierter Organe. Eine Arbeitsgruppe der Abteilung beschäftigt sich mit der detaillierten histomorphologischen Analyse von transgenen Tieren mit modernen morphologischen Verfahren. Eine weitere Arbeitsgruppe der Abteilung betreibt übersicht eine spezielle Diagnostik an humanen Gewebsproben. In die Abteilung integriert ist die zentrale Tumorbank des DKFZ. Das Ziel der Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie (E100) ist es, Methoden zu entwickeln, die einer verbesserten Diagnostik und Therapie von Krebs dienen sowie Mechanismen verstehen zu lernen, die der toxischen und karzinogenen Wirkung von Medikamenten und sonstigen Chemikalien zu Grunde liegen. Die klinische Kooperationseinheit Gentherapie von Tumoren (E110) ist eine lange bestehende Kooperation des Forschungsschwerpunkts mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg. Schwerpunkt der Arbeiten ist die Identifizierung von Tumormarkern und tumorassoziierten Antigenen in mikrosatelliteninstabilen Tumoren sowie in Karzinomen die durch humane Papillomviren hervorgerufenen Tumoren. Für mikrosatelliteninstabile Tumoren wurden zahlreiche neue und hochspezifische Marker und Targets identifiziert und umfassend charakterisiert. Diese Marker werden als neue Diagnostika in der Krebsdiagnostik zur Stratifizierung von Patienten mit hereditären Formen des Kolonkarzinoms (HNPCC) verwendet. Klinische Untersuchungen zur Verwendung der identifizierten Targets werden bereits durchgeführt. Analog konnten für die HPV-assoziierten Tumoren, insbesondere das Zervixkarzinom, neue diagnostische Marker identifiziert werden. Krebsfrüherkennungsverfahren, die auf diesen Forschungsergebnissen basieren, konnten in weniger als 2 Jahren durch Kooperation mit einem neu gegründeten Biotech-Unternehmen (mtm.laboratories AG) zur Zulassung und auf den Markt gebracht werden. Ferner koordiniert die klinische Kooperationseinheit das interdisziplinäre Projekt Familiärer Dickdarmkrebs der Deutschen Krebshilfe in Heidelberg. Im Rahmen dieses Projekts werden mehr als 400 Patienten mit erblichen Formen des Dickdarmkrebses umfassend beraten und betreut. Im Zentrum der Aktivitäten der Arbeitseinheit Pharmakologie der Krebsbehandlung (E120) stehen Untersuchungen zum retroviralen Gentransfer und zur Risikoabschätzung des Gentransfers mit Hilfe von Integrationsanalysen sowie Untersuchungen zur Suizidgen-Therapie von Sarkomen und Mesotheliomen mit raav-2-vektoren. Daneben wird mit nichtinvasiven Messverfahren die Pharmakokinetik von Zytostatika in Geweben untersucht. Die Arbeitsgruppe Rekombinante Antikörper (E130) befasst sich zum einen mit Fragen der Methodik zur Verbesserung der Herstellung rekombinanter Antikörper. Daneben wird die Möglichkeit eines therapeutischen Einsatzes z. B. über zytolytische Konjugate erprobt. Die Leitung der Abteilung Experimentelle Therapie (E140) wird kommissarisch von Herrn Prof. Kauczor geführt. Seine Hauptaufgabe ist die Konzepterstellung für den Aufbau des Comprehensive Cancer Centers Heidelberg, sowie nach erfolgreicher Begutachtung die praktische Umsetzung des Konzepts mit Schaffung der notwendigen Infrastruktur für die Programmbereiche Experimentelle Diagnostik und Therapie sowie Präventive Onkologie. Die Leitung der Abteilung Molekulare Therapie (E150) ist vakant. Die klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie/Onkologie (E160) hat sich in der Vergangenheit auf immuntherapeutische Ansätze im Kontext allogener Stammzelltransplantation konzentriert. Die Leitung der Kooperationseinheit ist zurzeit vakant. 267

268 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie übersicht 268 Die Leitung der klinischen Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (E170) ist derzeit vakant und kommissarisch durch den Direktor der Abteilung Pädiatrische Onkologie am Universitätsklinikum besetzt. Eine Arbeitsgruppe befasst sich mit der Regulation des physiologischen Zelltodes (Apoptose) bei hämatologischen Erkrankungen und dem Transfer der erzielten Ergebnisse in die Leukämietherapie bei Kindern. An der Abteilung des Klinikums ist eine Arbeitsgruppe mit der funktionellen Genomanalyse und der Proteomanalyse bei Leukämien des Kindesalters befasst und zielt auf die Identifikation von prognostischen Faktoren bei der T-ALL. Eine andere Arbeitsgruppe an der Abteilung des Klinikums befasst sich mit einem grundlegenden Mechanismus der post-transkriptionalen Kontrolle der Genexpression, der als RNA surveillance durch Nonsense Mediatred Decay bezeichnet wird. Hierbei handelt es sich um einen phylogenetisch hoch-konservierten Mechanismus, der an der Regulation einer Vielzahl physiologischer und onkologisch relevanter Prozesse beteiligt ist (z.b. Telomerenmaintenance und Schutz vor dominant negativen Effekten mutierter Onkogene). Die klinische Kooperationseinheit Gastroenterologische Onkologie (E180) beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit den hepatopankreatobiliären Tumoren, speziell dem Pankreaskarzinom. Gegenstand hier ist die Karzinogenese, untersucht anhand proprietärer humaner in vitro Stufenmodelle, komplementiert durch die Analyse kontributierender Faktoren. Angewandt werden Methoden der Zell- und Molekularbiologie sowie globale Analysestrategien auf RNA- und Proteinebene. Weitere Arbeitsfelder sind die Chemoresistenz sowie die Entwicklung innovativer neuer Therapiekonzepte, z.b. mit genetisch veränderten, mikroverkapselten Zellen. Die im Aufbau befindliche selbständige Arbeitsgruppe Hochauflösende Optische Mikroskopie (E190) befasst sich mit der Entwicklung und Erprobung von innovativen optischen Verfahren zur hochauflösenden Abbildung von Zellen und Zellverbänden. Einer der Hauptschwerpunkte ist die nichtinvasive Abbildung subzellulärer Strukturen auf der bisher als unerreichbar geltenden Nanoskala.

269 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E010 Radiologie Abteilung Radiologie (E010) Leiter: Prof. Dr. med. Gerhard van Kaick (-9/02) PD Dr. Stefan Delorme (10/02-1/03) Prof. Dr. H.-U. Kauczor (1/03 -) Wissenschaftler Leitender OA PD Dr. Stefan Delorme OA PD Dr. Marco Essig OA PD Dr. Heinz-Peter Schlemmer (-5/02) Dr. Jutta Debus (-4/03) Dr. Ljubica Dukic (-6/03) Dr. Jörg Ederle (12/02 -) Dr. Monika Eichinger (8/03 -) Dr. Christian Fink Dr. Maria-Katharina Ganten Dr. Frederik Giesel Dr. Stefan Heckl (5/02 -) Dr. Svitlana Iliyushenko (2/03 -) Dr. Fabian Kiessling (- 12/02) Dr. Martin Krix Dr. Sebastian Ley (12/02 -) Dr. Matthias Lichy (- 12/03) Dr. Christian Plathow (3/03 -) Dr. Michael Puderbach (7/02 -) Dr. Cornelia Rehm (4/03) Dr. Bram Stieltjes (6/02 -) Dr. Hendrik von Tengg-Kobligk (8/03 -) Dr. Klaus Wasser (- 6/02) Dr. Marc-André Weber (2/03 -) Technische Assistenten Peter Bontzol Adelheid Fuxa Jürgen Heiss René Hertel (10/03 -) Martina Jochim Kathleen Knauer (9/02 -) Marlies Leissner (-09/02) Barbara Rimmler (2/02) Heike Streib-Retzbach Heike Wegs (3/03 -) Susanne Yubai Marie Zuna Die Zielvorgaben der Abteilung Radiologie (früher: Onkologische Diagnostik und Therapie) (E010) sind eine möglichst frühe Erkennung des Tumors, die Feststellung des Ausbreitungsgrades, die prognostische Beurteilung, die Unterstützung der Therapieplanung, die Beurteilung des Therapieerfolgs und die Nachsorgediagnostik sowie die Sekundärprävention mit bildgebenden Verfahren. Neben verbesserter Visualisierung des Tumors spielt die Bestimmung funktioneller Parameter des Tumorgewebes (z. B. zur Mikrozirkulation oder zum Metabolismus) eine wichtige Rolle für die Beurteilung der individuellen Krebserkrankung. Diese werden zunehmend in die Strahlentherapie und in das Therapie-Monitoring einbezogen. In Begleitung dieser klinisch-wissenschaftlichen Projekte werden in Zusammenarbeit mit den grundlagenorientierten Abteilungen des DKFZ experimentelle Studien durchgeführt. Für diese genannten Aufgaben werden die modernen Schnittbildtechniken wie Mehrschicht-Spiral-CT, Magnetresonanztomographie, Magnetresonanz-Spektroskopie, computerunterstützte Sonographie sowie Farbdoppler- Sonographie eingesetzt. Technische Verbesserungen und Innovationen erfolgen in enger Zusammenarbeit mit der Abteilung für Medizinische Physik in der Radiologie. Die klinische Erprobung und kritische Evaluation erfolgt in Zusammenarbeit mit den Klinischen Kooperationseinheiten für Strahlentherapie und Nuklearmedizin sowie den Kliniken des Tumorzentrums Heidelberg/Mannheim. 1 Zentralnervensystem M. Essig, H.-P. Schlemmer, J. Debus, L. Dukic, F. Giesel, M. Lichy, C. Rehm, B. Stieltjes, M.A. Weber 1.1 Einleitung Im Bereich des Zentralnervensystems (ZNS) wurden in den Jahren 2002 und 2003 mehrere Forschungsschwerpunkte etabliert oder ausgebaut zum einen der traditionelle neuroonkologische Schwerpunkt in enger Zusammenarbeit mit der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapie im Hause und der Abteilung Strahlentherapie an der Universitätsklinik. Weitere Kooperationen bestanden auf diesem Gebiet mit der Neurochirurgischen Klinik Heidelberg und den Neurologischen Kliniken Heidelberg und Mannheim. Neben der Entwicklung weiterer optimierter morphologischer Verfahren wurden funktionelle Verfahren zunehmend in die Therapieplanung und in das Therapieverlaufsmonitoring integriert. Der Schwerpunkt Gefäßmissbildungen im ZNS hat die Möglichkeiten der nicht invasiven Schnittbilddiagnostik zerebraler Gefäßmissbildungen/Erkrankungen über methodische Verfahren erweitert und auch erste klinische Ergebnisse mit diesen Verfahren erzielt. Des Weiteren wurden in einer größeren Studie strahlentherapeutische Ergebnisse der letzten 5 Jahren evaluiert und entsprechend publiziert. Die Arbeitsgruppe morphologische und funktionelle Bildgebung in der Psychiatrie konnte in den entsprechenden Jahren durchgreifende Ergebnisse in den Bereichen Schizophrenie und neurodegenerative Erkrankungen erlangen. Insbesondere der Schwerpunkt Demenzdiagnostik hat sich deutlich erweitert und wichtige Ergebnisse erzielt. Im Folgenden werden die einzelnen Schwerpunkte separat beschrieben. 1.2 Neuroonkologie Morphologie In einem Teilprojekt wurde bizentrisch der Stellenwert eines neuartigen MRT-Kontrastmittels (Gadobenate-dimeglumine) bei 27 Patienten mit hochgradigen Gliomen oder Hirnmetastasen evaluiert. Dabei wurden die optimale Kontrastmitteldosis und der optimale Bildaufnahmezeitpunkt nach Kontrastmittelgabe ermittelt. Das neuartige MRT-Kontrastmittel ergab dabei in der Standarddosierung einen signifikant höheren Kontrast von Tumorgewebe verglichen mit gesundem Hirngewebe als ein Standard MRT-Kontrastmittel (Gadopentetate-dimeglumine) und vermag so zu einer besseren Tumorabgrenzung zu verhelfen. Dies ist bei der Resektions- und Strahlentherapieplanung, sowie beim frühzeitigen Nachweis einer Tumormalignisierung niedergradiger Gliome vorteilhaft. [1, 21, 25, 96, 97, 100, 123, 131] Perfusion Die Tumorperfusion ist ein wichtiger Parameter bei Differenzialdiagnose und Therapie-Monitoring von Hirntumoren. Als Perfusion wird der Blutfluss durch das Kapillarnetz im Gewebe - die sog. Mikrozirkulation - bezogen auf die Masse des Gewebes bezeichnet. Methoden zur Bestimmung der Perfusion beruhen auf der Verabreichung von Trägermolekülen, sog. Tracern. Hierzu eignen sich sowohl endogene als auch exogene Substanzen, die sich bei ihrer Passage durch das Kapillarbett eindeutig abgrenzen lassen und somit eine Quantifizierung der Perfusion erlauben. Heute 269

270 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E010 Radiologie 270 Abbildung 1: 59-jährige Patientin mit links frontaler Melanommetastase. 6 Wochen unter stereotaktischer Bestrahlung zeigte der Tumor einen 142%igen Volumenanstieg, wohingegen die 86%ige Blutvolumenabnahme ein Ansprechen auf die Therapie andeutet. Nach 3 Monaten sind sowohl das Tumor- als auch das Blutvolumen kleiner als vor stereotaktischer Bestrahlung. Abbildung 2: 52-jähriger Patient mit rechts okzipitaler Nierenkarzinommetastase. Obwohl das Tumorvolumen nach 6 Wochen abnahm, deutete der Blutvolumenanstieg ein Therapieversagen an. Nach 3 Monaten ist dieses aufgrund der im Vergleich zur Bestrahlungsplanungsuntersuchung deutlich erhöhten Werte für Tumor- und Blutvolumen vor und unter Bestrahlung offensichtlich. werden in der MRT dabei exogene paramagnetische Tracer (kontrastmittelverstärkte T2*-Dynamik) oder endogene Tracer (Arterial Spin-Labeling Technik) eingesetzt. Beide Techniken wurden am DKFZ für den Einsatz bei neuroonkologischen Fragestellungen optimiert. Die Perfusionswerte beider Techniken korrelieren signifikant miteinander. 62 Patienten mit stereotaktisch bestrahlten Hirnmetastasen wurden bis zu fünfmal im Verlauf mit kontrastmittelverstärkter T2*-Dynamik und Arterial-Spin Labeling Technik untersucht. Die Perfusionswerte korrelierten hochsignifikant. Im gesunden Hirnparenchym zeigten sich keine Perfusionsänderungen als ein weiterer Hinweis für die geringe Dosisbelastung des gesunden Hirngewebes bei stereotaktischer Bestrahlung. Der Wert neuartiger MRT-Kontrastmittel wie Gadobenatedimeglumine und Gadobutrol bei der Messung der Perfusion mit der kontrastmittelverstärkten T2*-Dynamik wurde in einem weiteren Teilprojekt zunächst im gesunden Hirnparenchym im Rahmen einer intraindividuellen Probandenvergleichsstudie evaluiert. Im Vergleich zu herkömmlichen Kontrastmitteln genügte dabei die Gabe einer Einfachdosis, um qualitativ hochwertige Perfusionskarten mit physiologisch validen absoluten Blutfluss- und Blutvolumenwerten des Gehirns zu erzeugen. In Hirntumoren ist die Blut-Hirn- Schranke gestört, so dass es bei intravenöser Gabe eines MRT-Kontrastmittels zu einer Extravasation in das Interstitium kommt. Diese Tatsche stört die physikalischen Grundprinzipien der kontrastmittelverstärkten T2*-Dynamik zur Messung der Tumorperfusion. Der Einfluss dieser Blut-Hirn-Schrankenstörung auf die Genauigkeit verschiedener Messtechniken der kontrastmittelverstärkten T2*- Dynamik wurde bei 60 Patienten mit zerebralen Gliomen untersucht. Dabei konnte die Empfehlung abgegeben werden, dass bei Hirntumoren ohne Kontrastmittelanreicherung eine Gradientenechosequenz vorzuziehen ist und bei Hirntumoren mit Kontrastmittelanreicherung eine Spin-Echo Sequenz verwendet werden sollte. Es wurde sich in weiteren Teilprojekten mit dem Wert von Perfusionsmessungen im Rahmen des Therapie-Monitorings nach Strahlentherapie bei Hirnmetastasen beschäftigt. Hirnmetastasen machen etwa 50% aller supratentoriellen Hirntumoren aus. Bei der Verlaufsbeobachtung von Hirnmetastasen nach stereotaktischer Strahlentherapie kann die konventionelle, anatomische MRT nicht sicher zwischen Strahlennekrose und Tumorrezidiv unterscheiden, da beide mit einer Zunahme der Kontrastmittel-Aufnahme einhergehen, die sich bei Vorliegen einer Strahlennekrose langsam wieder zurück bildet. Da beide Möglichkeiten aber gänzlich andere Therapien erfordern, ist eine frühzeitige Differenzierung zur Verbesserung des Therapieergebnisses entscheidend. Die MR-Spektroskopie vermag bei dieser Fragestellung ebenfalls wichtige Hinweise zu liefern, ist aber aufgrund der kalottennahen Lage der Metastasen und der dadurch bedingten Suszeptibilitätsartefakte oft in ihrer Aussagekraft eingeschränkt oder gar nicht durchführbar. Durch Bestimmung des regionalen Blutvolumens mit einer kontrastmittelverstärkten T2*-Dynamik war bei stereotaktisch bestrahlten Hirnmetastasen eine Prädiktion des Therapieansprechens möglich. Bei 18 untersuchten Patienten zeigte eine Abnahme des Metastasen-Blutvolumens mit einer Sensitivität und Spezifität von 91% bzw. 71% ein Therapieansprechen (Tumorremission oder gleich bleibender Tumor) an, während eine Änderung des Tumorvolumens nur eine Sensitivität von 64% und eine Spezifität von 43% hatte. Dabei zeigte eine posttherapeutische Blutvolumen-Reduktion ein Therapieansprechen an, unabhängig ob es in der Kontrolluntersuchung nach 6 Wochen zu einer (transienten) Vergrößerung der Kontrastmittelanreicherung kam - als Folge einer strahlenbedingten Störung der Blut-Hirn-Schranke (Abb. 1). Bei den Metastasen, die nicht auf die Strahlenbehandlung ansprachen (Tumorprogress), konnte ein Anstieg des Blutvolumens um 10% 6 Wochen und um

271 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie 38% 12 Wochen nach Bestrahlung festgestellt werden (Abb. 2). Die Ergebnisse dieser nur mit einer Messschicht möglichen Technik konnten durch Verwendung neuerer Techniken, die mehrere Messschichten und somit die parallele Evaluation von bis zu 3 bestrahlten Hirnmetastasen pro Patient erlauben, reproduziert werden. In diesem Teilprojekt wurden 25 Patienten mit insgesamt 28 Hirnmetastasen mit Arterial-Spin Labeling Techniken und der kontrastmittelverstärkten T2*-Dynamik untersucht. Eine Abnahme der Perfusion nach Radiatio, gemessen mit der Arterial-Spin Labeling Technik, sagte dabei das Therapieansprechen sogar in allen Fällen korrekt voraus. In beiden Studien hatte die prätherapeutische Metastasenperfusion keine prädiktive Aussagekraft. [21, 22, 23, 25, 26, 126, 127, 136, 137, 138] 1.3 Gefäßmissbildungen Arteriovenöse Malformationen (AVM) als angeborene Gefäßkrankheiten des ZNS werden im DKFZ radiochirurgisch behandelt. Seit mehreren Jahren beschäftigt sich die Arbeitsgruppe mit der Thematik einer optimierten Therapieplanung und Verlaufskontrolle. Im Jahr 2002 konnte eine Studie zum Abschluss gebracht werden, welche den Einsatz Kontrastmittel-unterstützter gegenüber nativer MRangiographischer Sequenzen evaluiert. So konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz kontrastmittelunterstützter ultraschneller MR-angiographischer Aufnahmen eine Abgrenzung des Nidus und insbesondere eine Visualisierung kleinerer und kleinster Gefäßmissbildungen deutlich erleichtert ist. Diese Zusatzinformation konnte in die Strahlentherapieplanung integriert werden, die Ergebnisse eines Verlaufsmonitorings mit dieser Methode sind Gegenstand aktueller Untersuchungen. In einer weiteren Untersuchung wurden kognitive Veränderungen bei Patienten mit zerebralen arterio-venösen Malformationen vor und nach einer strahlentherapeutischen Behandlung untersucht. Hier konnten wir aufzeigen, dass sich durch eine erfolgreiche Bestrahlung verbunden mit einer Normalisierung der Blutflussverhältnisse innerhalb des Gehirns eine deutliche Besserung neurokognitiver Funktionen bei Patienten mit AVM ergibt. Neben den kognitiven Funktionen wurden auch morphologische Veränderungen nach Radiochirurgie bei Patienten mit solchen Malformationen evaluiert. Hierbei konnte eine deutliche Korrelation mit der Dosisverteilung und dem strahlentherapeutischen Ansprechen festgestellt werden. [16, 79, 110] 1.4 Bildgebung in der biologischen Psychiatrie Morphologische Bildgebungsmethoden wurden in der Diagnostik von Schizophrenien und neurodegenerativen Veränderungen, hier insbesondere beim Morbus Alzheimer, eingesetzt. In mehrere Arbeiten konnten folgende Ergebnisse erreicht werden. Bei Patienten mit leichten kognitiven Veränderungen konnte aufgezeigt werden, dass sich bereits in einer Frühphase der Veränderungen am Gyrus Parahippocampalis deutliche Volumendefizite nachweisen lassen. Diese Veränderungen sind möglicherweise in der Lage, bereits zu einem frühen Zeitpunkt Hinweise auf ein progredientes neurodegeneratives Syndrom zu liefern. Bei schizophrenen Veränderungen konnten ebenfalls in einer frühen Phase der Erkrankung noch vor Beginn einer systematischen Therapie morphologische Veränderungen insbesondere am Corpus callosum festgestellt werden. Der Einsatz funktioneller Bildgebungsmethoden wurde ebenfalls in ersten Studien nachgewiesen und dargestellt. So wurde in Anbetracht ihrer klinischen Bedeutung wichtige Gedächtnissysteme, wie das Arbeitsgedächtnis, das Abteilung E010 Radiologie prozedurale und das deklarative Gedächtnis untersucht. Störungen dieser Gedächtnisleistungen werden regelmäßig nicht nur bei psychischen Erkrankungen, wie schizophrenen Psychosen oder Demenzen, sondern auch im Gefolge von zerebralen Raumforderungen, nach Zytostatikaoder Bestrahlungstherapie beobachtet. Die genannten Gedächtnisfunktionen sind neuropsychologisch stark vom Trainingszustand der Untersuchten abhängig. Hypothetisch kann Letzterer auch die korrespondierende Hirnaktivierung beeinflussen. Gerade hierdurch wird jedoch die Stabilität der im fmrt dargestellten Aktivierungsmuster und damit ihre klinisch-diagnostische Aussagekraft relativiert. Deshalb wurde in den folgenden Studien stets die fmrt mehrfach vor und nach Training der jeweiligen Gedächtnisaufgaben durchgeführt. Für den klinischen Einsatz wurde zunächst eine Probandenstudie als Kontrollkollektiv untersucht und evaluiert. Im Anschluss sind 10 Patienten im Alter von 25 bis 31 Jahren diagnostiziert mit Psychose (nach DSM IV) mit den zwei MR-Techniken untersucht worden. Aus vorausgehenden Arbeiten wurde das visuo-spatiale n-back Paradigma verwandt. Das blockparadigm (n-back) enthielt während der fmrt zum jeweiligen Schweregrad 4 Repetitionen in einem 1,5 T MR Scanner. FMRT-Bildanalysen erfolgte mittels SPM99. Die Perfusionsmessung in Ruhe wurde mittels arterial spin labeling Technik (ASL) durchgeführt. Zur Quantifizierung wurden drei verschiedene Regions-of-Interest (ROI) mit einer Fläche von 200 mm 2 in den Frontal-, Parieto-, Temporal- und Occipitallappen gelegt. Die untersuchten Patienten zeigten im BOLD-Kontrast im Gegensatz zum Probandenkollektiv eine deutlich heterogene kortikale Aktivierung. Diese war dominant im interparietalen sulcus, hingegen waren frontale Dysfunktionen durch eine geringere BOLD-Kontrastierung mit geringerem T-Wert im Vergleich zu Kontrollgruppe zu quantifizieren. [4, 47, 90-92, , 111, 140] 2 Thorax H.-U. Kauczor, J. Ederle, M. Eichinger, C. Fink, S. Iliyushenko, S. Ley, C. Plathow, M. Puderbach 2.1 Lungenperfusion Moderne, so genannte parallele MR-Bildgebungstechniken erlauben die Aufnahme mehrerer dreidimensionaler Bild- Datensätze während der raschen Injektion eines gadoliniumhaltigen MR-Kontrastmittels. Hierdurch ist es möglich, mit hoher Zeitauflösung die Verteilung des MR-Kontrastmittels in einem Zielgewebe zu visualisieren. In mehreren Studien wurde die Technik sowohl tierexperimentell als auch klinisch bei gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen kardiovaskulären und pulmonalen Erkrankungen evaluiert [33-36, 40, 41] Dreidimensionale Erfassung mittels paralleler Magnetresonanztomographie In einer Kooperation mit der Abteilung Radiologie der Thoraxklinik Heidelberg wurde der Einsatz paralleler MR- Bildgebungstechniken für die dreidimensionale Visualisierung der Lungenperfusion in der MRT evaluiert. In einer ersten Machbarkeitsstudie wurden 2 gesunde Probanden und 14 Patienten an einem 1.5 T Ganzkörper MRT mit einer kontrastverstärkten 3D MRT mit partiell-paralleler Bildakquisition (FLASH 3D, Rekonstruktionsalgorithmus: GRAP- PA, TE/TR/α: 0,8 ms/1,9 ms/40º, Beschleunigungsfaktor 3, Voxelgröße 3,6x2,0x5,0 mm 3, TA: 1,5 s) untersucht. 271

272 272 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abbildung 3: MRT der Lungenperfusion bei einem 56-jährigen Patienten mit Bronchialkarzinom des rechten Oberlappens. A.B.C. Koronare, sagittale und transversale T1-gewichtete MRT mit Visualisierung des Tumors in Segment 2 des rechten Oberlappens (Pfeile).D.E.F. Korrespondierende Schichten der 3D MRT der Lungenperfusion mit Nachweis eines tumorbedingten Perfusionsdefektes (Pfeile). G. Konventionelle Perfusionsszintigraphie der Lunge mit Nachweis des tumorbedingten Perfusionsdefektes (Pfeil). Insgesamt wurden 8 bis 15 konsekutive 3D-Datensätze nach intravenöser Injektion von 0,1 mmol/kg Körpergewicht Gd-DTPA aufgenommen. Die Bildanalyse wurde von zwei Radiologen in Konsensus durchgeführt und beinhaltete die Berechnung von Signalintensitäts-(SI)-Zeit-Kurven sowie eine Analyse des Signal-zu-Rausch Verhältnisses (SNR) in Bereichen mit normaler oder verminderter Lungenperfusion. Basierend auf den Signal-Zeit-Kurven der Lunge konnten mittels einfacher Subtraktion qualitativ hochwertige 3D Perfusionsdatensätze der Lunge berechnet werden. Diese erlaubten eine klare Abgrenzung von Perfusionsstörungen gegenüber dem normal-durchbluteten Lungengewebe (Abb. 3). Eine normale Lungenperfusion wurde bei 9 Fällen und eine pathologische Lungenperfusion bei 7 Fällen beobachtet. Der Vergleich mit der konventionellen Lungenszintigraphie zeigte sich eine gute Übereinstimmung (kappa= 0,74). In der SNR-Analyse konnte ein hoher Unterschied der SNR zwischen normal durchbluteter Lunge (17 ± 7) und den Perfusionsausfällen (7 ± 1) gezeigt werden. Aus diesen Ergebnissen wurde abgeleitet, dass durch den Einsatz paralleler Bildgebungstechniken eine dreidimensionale Bildgebung der Lungenperfusion möglich ist. Im Anschluss an die Machbarkeitsstudie wurde die Methode der MR-Perfusion der Lunge an einer größeren Gruppe gesunder Probanden (n=7) und Patienten mit Bronchialkarzinom (n=20) evaluiert. Bei Probanden wurden die 3D Perfusionsdatensätze auf die zeitliche und räumliche Verteilung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses (SNR) untersucht. Bei Patienten erfolgte die Bestimmung der Genauigkeit (Sensitivität, Spezifität) der MR-Perfusion bezüglich der Detektion tumorbedingter Perfusionsdefekte. Hierbei zeigte Abteilung E010 Radiologie sich bei Probanden ein mit bis zu 327% signifikant höheres SNR in lageabhängigen Lungenabschnitten. Im Vergleich zur Perfusionsszintigraphie erzielte die MR-Perfusion bei Patienten eine hohe Sensitivität (88-94%) und Spezifität (100%) für die Detektion tumorbedingter Perfusionsdefekte. Hierbei bestand eine gute Übereinstimmung der Auswerter (kappa=0.86). Hieraus folgt, dass die MR-Perfusion bei höherer räumlicher und zeitlicher Auflösung eine zum Goldstandard Perfusionsszintigraphie vergleichbare Genauigkeit erzielt. [19, 20, 27, 34, 35, 36, 38, 42, 80-82] Einfluss verschiedener MR-Kontrastmittelprotokolle In einer Probandenstudie wurde untersucht, inwieweit die qualitative Erfassung der Lungenperfusion mittels MR-Perfusionsmessung von der Wahl von Kontrastmittel und Untersuchungsprotokoll abhängt. Bei den verwendeten Kontrastmitteln handelte es sich um das hochkonzentrierte Kontrastmittel 1.0 M Gadobutrol sowie um das bisher gebräuchliche, 0,5 molare MR-Kontrastmittel Gd-DTPA. Es wurden 10 gesunde Probanden (3 Frauen, 7 Männer, medianes Alter: 27 Jahre) untersucht. Im Detail wurden 25 konsekutive Datensätze nach intravenöser Injektion von 0,025, 0,05 und 0,1 mmol/kg Körpergewicht (KG) Gadobutrol und Gd-DTPA akquiriert. Es erfolgten Messungen des maximalen SNR in beiden Lungen durch drei Auswerter. Zusätzlich erfolgte eine Bestimmung der Transitzeit des Kontrastmittelbolus durch die Lunge. Es zeigte sich ein vergleichbares maximales SNR für Gadobutrol und Gd-DTPA bei allen Dosisstufen (15,7 vs. 15,5 bei 0,1 mmol/ kg KG; 12,9 vs. 12,5 bei 0,05 mmol/kg KG; 7,6 vs. 8,9 bei 0,025 mmol/kg KG). Eine Dosis von 0,1 mmol/kg KG erzielte das höchste SNR im Vergleich zu den anderen Dosisstufen (p<0.05) (Abb. 4). Insgesamt erwies sich, dass höher konzentrierte MR-Kontrastmittel bei den verwendeten Injektions- und Sequenzparametern keine Vorteile bezüglich des maximalen SNR der Lunge aufweisen. [33, 41] Abbildung 4: Perfusions MRT der Lunge bei einem gesunden Probanden nach Injektion von (von links nach rechts) 0,1, 0,05 und 0,025 mmol/kg KG Gadobutrol (obere Reihe) und Gd-DTPA (untere Reihe) Quantifizierung der 3D MR-Perfusionsmessung der Lunge In einer Pilotstudie wurde der Einsatz der parallelen Bildgebung (PAT) zur quantitativen Analyse der Lungenperfusion bei Patienten mit kardiopulmonalen Erkrankungen evaluiert. Hierzu wurden acht Patienten mit Lungenembolie oder pulmonaler Hypertension mit einer zeitlich-aufgelös-

273 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E010 Radiologie Abbildung 5: Staging der mediastinalen Tumorinfiltration in der MRT. A: T1-gewichtete MRT mit Nachweis einer intakten Fettlamelle zwischen Aorta und dem Tumor des linken Oberlappens (Pfeile). B: In der CT ist dagegen aufgrund des schlechteren Weichteilkontrastes keine eindeutige Fettlamelle abgrenzbar. ten 3D Gradientenecho Pulssequenz mit PAT (FLASH 3D, TE/TR: 0.8/1.9 ms; Flipwinkel: 40º; GRAPPA) untersucht. Eine quantitative Perfusionsanalyse basierend auf der Indikator-Verdünnungsmethode wurde mit einer dedizierten Software durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten mit Lungenembolie oder chronischer thromboembolischer, pulmonaler Hypertension charakteristische keilförmige Perfusionsausfälle in der Perfusions-MRT hatten. Die Perfusionsdefekte wiesen einen verringerten pulmonalen Blutfluss (PBF) und pulmonales Blutvolumen (PBV) sowie eine erhöhte mittlere Transitzeit (MTT) auf. Patienten mit primärer pulmonaler Hypertension oder Eisenmenger Syndrom zeigten ein im Vergleich homogeneres Perfusionsmuster. Die mittlere MTT aller Patienten betrug 3,3-4,7 s. Der mittlere PBF und das mittlere PBV zeigten eine größere interindividuelle Schwankung (PBF: ml/100ml/min; PBV: 8-21 ml/100 ml). Es wird gefolgert, dass die zeitlich aufgelöste 3D MRT zumindest eine semiquantitative Analyse der Lungenperfusion erlaubt. Weitere Studien müssen den klinischen Nutzen dieser quantitativen Information für die Diagnose und Therapie kardiopulmonaler Erkrankungen evaluieren. [34, 36, 40] 2.2 Bronchialkarzinom Die Zielsetzung einer andauernden, in Kooperation mit der Abteilung Thoraxchirurgie der Thoraxklinik Heidelberg-Rohrbach durchgeführten Studie ist die Evaluation der Genauigkeit der hochauflösenden MRT im Tumorstaging des Bronchialkarzinoms und Mesothelioms im Vergleich zur Mehrschicht-Spiral CT und zum Operationsbefund. Zum Einsatz kommen hierzu parallele Bildgebungstechniken die bei verkürzter Messzeit mit geringerer Anfälligkeit für Atemartefakte eine verbesserte räumliche Auflösung ermöglichen. Erste Ergebnisse zeigen, dass die MRT aufgrund des hohen Weichteilkontrastes der Computertomographie bei bestimmten Fragestellungen (mediastinale Infiltration) und Tumorlokalisationen (Pancoast Tumor) überlegen sein könnte (Abb. 5). Eine weitere Studie beschäftigt sich mit der Integration funktioneller MR-Daten in die Operations- bzw. Strahlentherapieplanung. 2.3 Atemmechanik und Therapieplanung Bei zahlreichen Erkrankungen der Lunge, wie der Lungenfibrose, dem Lungenemphysem, kardialen und onkologischen Erkrankungen, kommt es im Krankheitsverlauf oder nach Therapie zu einer deutlichen Einschränkung der Atembeweglichkeit und konsekutiven Funktionseinschränkungen aufgrund einer Veränderung der Lungen- und Atemmechanik. Bei den betroffenen Patienten führt das im Krankheitsverlauf zu Störungen der Atmung, z.t. mit Dyspnoe. Herkömmliche Techniken der Lungenfunktion wie die Spirometrie oder die Bodyplethysmographie sind in der Lage, globale Veränderungen der Lungenfunktion zu erfassen. Lokale und frühe Veränderungen sind mit diesen Techniken kaum erfassbar. Ebenfalls sind bisherige radiologische Verfahren häufig nicht in der Lage, diese Veränderungen in einem frühen Stadium, wo eine therapeutische Intervention und damit eine Progression der Lungenveränderung verhindert werden kann, zu erfassen. Neue Techniken der onkologischen Therapie, insbesondere der Strahlentherapie, sind in der Lage, die Zielvolumina immer präziser zu erfassen bei bestmöglicher Schonung des umliegenden gesunden Gewebes. Die Integration der Bewegung des Zielvolumens im Atemzyklus stellt ein großes, noch immer nicht zufriedenstellend gelöstes Problem hochpräziser Therapieverfahren dar. So sind bisherige radiologische Verfahren nur eingeschränkt in der Lage, die gesamte Bewegung eines Lungentumors im Kontext der umgebenden anatomischen Strukturen zu erfassen. Neue Techniken der MRT bieten seit kurzer Zeit vielversprechende Ansätze zur Beantwortung oben genannter Fragestellungen. Es konnte in ersten Untersuchungen gezeigt werden, dass unter Verwendung der CINE-MRT eine kontinuierliche und valide Darstellung der Bewegung des Zwerchfells und der Brustwand mit signifikanter Korrelation zur Spirometrie möglich ist [98]. Unter Verwendung eines neuen volumetrischen Models war ebenfalls eine valide Volumenbestimmung mit Aussagen zur Lungenmechanik, basierend auf der MRT Bildgebung möglich. Es konnte gezeigt werden, dass bereits lokale Veränderungen, welche noch keinen Einfluss auf die globalen Lungenfunktionsparameter ausüben mittels der MRT erfassbar sind. In einer Studie zur Darstellung der Tumorbeweglichkeit während des Atemzyklus konnte bei Patienten mit einem solitären Lungentumor gezeigt werden, dass die MRT eine kontinuierliche Darstellung und Quantifizierung der Tumorbeweglichkeit, in Abhängigkeit von der Tumorlokalisation ermöglicht (Abb. 6). Es konnte eine signifikant geringere Abbildung 6: MRT der Lungenbewegung und Tumormobilität während des Atemzyklus eines Patienten mit einem solitären Tumor im linken Lungenflügel. 273

274 274 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Tumormobilität kranial gelegener Lungentumoren im Vergleich zu kaudal gelegenen Lungentumoren sowohl bei forcierter, wie auch ruhiger Atmung nachgewiesen werden. Durch eine frühzeitige und präzise Erfassung der Lungenmechanik hoffen wir in weiteren Untersuchungen eine weitere Präzisierung bisheriger Therapie- und Nachsorgeschemata und damit die Möglichkeit einer optimaler auf das Krankheitsstadium adaptierten Therapie erreichen zu können. Durch eine Integration dieser neuen Methoden in die Planung hochpräziser Therapietechniken scheint eine weitere Optimierung der Zielvolumendefinition mit besserer Schonung des umliegenden gesunden Gewebes möglich. [55, 98] Publikationen zum Themenkomplex Thorax, die während der Tätigkeit der Mitarbeiter an den Universitätskliniken Heidelberg und Mainz entstanden und 2002/2003 publiziert wurden: [2, 15, 17, 30, 43-46, 49, 54, 56, 58-66, 81, 82, 85, 112, 114]. 3 Tumoren des lymphatischen Systems S. Delorme, K. Wasser Beim multiplen Myelom (MM), einer Erkrankung aus dem Formenkreis der niedrig malignen Non-Hodgkin-Lymphome, handelt es sich um eine klonale Vermehrung von Plasmazellen, die sich v.a. im blutbildenen Knochenmark manifestiert. Ein Tumorbefall kann sowohl fokal vorliegen, in Form umschriebener, den Knochen zerstörender Tumorknoten, als auch diffus. Das multiple Myelom verursacht neben umschriebenen Knochendestruktionen eine humoral vermittelte Osteoporose, eine Verdrängung des blutbildenden Knochenmarks mit den Folgen einer Anämie, Leukound Thrombopenie sowie eine fortschreitende Nierenschädigung durch glomerulär filtrierte Paraproteine. Abteilung E010 Radiologie Seit mehreren Jahren besteht eine enge Zusammenarbeit mit der Medizinischen Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg, in der die Lendenwirbelsäule von Patienten mit MM vor und im Verlauf einer Therapie mit Chemotherapie und der antiangiogen wirksamen Substanz Thalidomid mit der dynamischen Magnetresonanztomographie (dmrt) untersucht werden. Bei der dmrt werden während und nach Infusion eines Kontrastmittels Bilder in rascher Folge aufgenommen, um anhand des An- und Abflutens der Substanz im Tumor oder Knochenmark Rückschlüsse über dessen Blutversorgung ziehen zu können. Die Quantifizierung geschieht anhand zweier Parameter, die mit Hilfe eines der Pharmakokinetik entlehnten Zweikompartimente- Modells berechnet werden, der Amplitude A (dies ist die relative Signalzunahme durch das Kontrastmittel) und die Austauschratenkonstante k ep (diese beschreibt den Stoffaustausch zwischen dem intravasalen und dem extravasalen, extrazellulären Kompartiment). Da das multiple Myelom u.a. durch Produktion des angiogenen Faktors VEGF zu einer lokalen Vermehrung der Mikrogefäße führt, sind Myelomherde in der dmrt anhand einer vermehrten Kontrastmittelaufnahme und daher erhöhten Parametern A und k ep zu erkennen. In Pilotstudien wurde auch gesehen, dass eine Therapie mit Chemotherapeutika in Verbindung mit Thalidomid zu einem Rückgang der Parameter führen kann. In einer gesonderten, histologisch kontrollierten Studie bei 24 Patienten mit MM wurde untersucht, ob es sich bei den in der dmrt auffälligen Arealen tatsächlich um tumorbefallene Herde im Knochenmark handelte. Hierfür wurde vor einer aus klinischen Gründen indizierten Stanzbiopsie des Beckenkamms die geplante Biopsiestelle, die Spina iliaca posterior superior, mit der dmrt untersucht. In einer Kontroll-MRT direkt im Anschluss an die Biopsie wurde der Stichkanal aufgesucht. Durch Vergleich mit diesen Bildern wurde die Biopsiestelle auf den vor der Entnahme angefertigten dmrt-aufnahmen lokalisiert und hier die Region of Interest platziert, in der die Parameter A und k ep zu berechnen waren. Am Biopsat erfolgte semiquantitativ eine Klassifizierung des Tumorbefalls als fehlend, schwach oder ausgeprägt. Zusätzlich wurde semiquantitativ die Gefäßdichte in der Probe eingeschätzt. Es zeigte sich, dass bei Nachweis eines ausgeprägten Tumorbefalls sowohl A als auch k ep höher waren als bei schwachem oder fehlendem Befall (p>0,05). Eine Unterscheidung zwischen fehlendem und schwachem Befall war anhand der dmrt hingegen nicht möglich. Zusätzlich erwies sich, dass bei erhöhter Gefäßdichte die Amplitude höher war als bei niedriger Gefäßdichte, nicht jedoch k ep. Abbildung 7: a: dmrt bei einem 57-jährigen Patienten mit therapierefrektärem multiplem Myelom und Zeichen einer fokalen Infiltration des Knochenmarks (kurzer Pfeil). Im Bereich der kaudal gelegenen Anreicherung (gestrichelter Pfeil) besteht eine Sinterungsfraktur mit osteosynthetischer Stabilisierung. b: Nach 6 Monaten einer Thalidomid-Monotherapie zeigt sich ein deutlicher Rückgang der Amplitude. Abbildung 8: Veränderungen der Parameter A und k ep unter TCED-Therapie nach dem 3. Chemotherapie-Zyklus (d.h. durchschnittlich 4 Monate nach Therapiebeginn) bei 18 Patienten mit Zeichen des Befalls in der dmrt (alle Patienten mit klinischem Ansprechen).

275 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Insgesamt kann man also davon ausgehen, dass es sich bei Arealen mit erhöhten Werten für A und k ep tatsächlich um tumorbefallenes Knochenmark handelt. Bei Therapiestudien mit Verlaufsuntersuchungen sollten sich die Messungen von A und k ep auf diese Areale beziehen. In einer prospektiven Studie wurden unter Thalidomid- Monotherapie oder Kombinationstherapie aus Thalidomid und CED (Cyclophosphamid, Etoposid, Dexamethason) die Veränderungen im Knochenmark anhand der dmrt untersucht. Die Auswertung umfasst 63 Patienten mit sekundär refraktärem MM, die vor und im Verlauf der Behandlung eine zeitlich hochaufgelöste dmrt-untersuchungen der LWS erhielten. Das klinische Ansprechen wurde gemäß international festgelegter Kriterien bestimmt. Unter Thalidomid-Monotherapie (n=38) zeigten 14 Patienten ein klinisches Ansprechen, darunter 9 nur mit minimaler Remission. Im Verlauf der Therapie wurden keine signifikanten Veränderungen der dmrt-parameter beobachtet, auch unter Berücksichtigung des klinischen Ansprechens und der initialen Einstufung des Knochenmarkbefalls. Unter Kombinationstherapie (n=25) zeigten 23 Patienten ein klinisches Ansprechen, darunter 16 mit partieller oder kompletter Remission. 18 Patienten mit klinischem Ansprechen und Zeichen der Knochenmarksinfiltration in der initialen dmrt hatten einen signifikanten Rückgang der Austauschratenkonstante (p=0,01) (Abb. 7 und 8). Die Amplitude war deutlich rückläufig, jedoch nicht signifikant (p=0,09). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass quantitativ fassbare Veränderungen der Kontrastmitteldynamik nur unter Thalidomid-CED-Therapie beobachtet werden, nicht unter Thalidomid-Monotherapie. 4 Prostatakarzinom S. Delorme, J. Ederle, F. Kiessling, M. Lichy, H.-P. Schlemmer Das Prostatakarzinom stellt in Deutschland den häufigsten bösartigen Tumor des Mannes dar und ist verantwortlich für 11% aller krebsverursachten Todesfälle. Ein genaues präoperatives Staging ist bislang nicht sicher möglich und viele Patienten werden möglicherweise einem zu aggressiven, operativen Therapieverfahren zugeführt. Für die Wahl der geeigneten Therapie bzw. die Prognose ist die Bewertung der biologischen Aggressivität des Tumors entscheidend. Die Entstehung einer Gefäßarchitektur innerhalb des Tumors (Tumorangiogenese) beeinflusst maßgeblich Wachstum, Progression und Metastasierung. Die MR-Tomographie besitzt eine hohe räumliche Auflösung und Sensitivität zur Erfassung der Tumorlokalisation und -Ausdehnung. Allerdings besitzt sie nur eine geringe Spezifität und lässt keine Aussagen über die Tumoraggressivität zu. Der Stellenwert der funktionellen und dynamischen, KM-unterstützten MRT, bei der mikrovaskularisationsabhängige Gewebeparameter von Tumoren erfasst werden können, ist beim Prostata- Karzinom noch umstritten und Gegenstand der Forschung. Bei Tumoren in der peripheren Zone wurden zwar signifikante Unterschiede der Kontrastmittel-Kinetik festgestellt, ein Zusammenhang mit dem Gleason Score fand sich jedoch nicht. Mit der In-vivo- 1 H-MR-Spektroskopie können im Prostatagewebe nichtinvasiv Metabolite (Citrat, Cholin) detektiert werden, die eine Differenzierung von malignen und benignen Veränderungen ermöglichen. Im Rahmen eines vom Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim geförderten Projektes, in dem die Urologische Klinik Abteilung E010 Radiologie und das Pathologische Institut des Universitätsklinikums Mannheim, sowie die Abteilungen Strahlentherapie und Radiologie des DKFZ zusammenarbeiten, wird die Wertigkeit der 3D- 1 H-MR-Spektroskopie und der dynamischen KM-MRT im Hinblick auf eine topographische und biologische Charakterisierung des Prostatakarzinom analysiert. In einer Tierversuchsstudie [68] wurde die nichtinvasive Charakterisierung eines orthotop in der Ratte implantierten Prostatakarzinoms mittels Gd-DTPA gestützter dynamischer MRT (dmri) und der 1 H-MRS untersucht. 6 Ratten wurden 5 und 14 Tage nach Tumorinduktion mit dmri und 1 H-MRS mit einem 1,5 T-Magnetresonanztomographen untersucht. 6 tumorfreie Ratten dienten als Kontrollgruppe. Ein offenes 2-Kompartment-Modell wurde verwendet um die Parameter Amplitude (A) und Austauschratenkonstante kep aus der Signalzeitkurve der dmri zu berechnen. Die relativen Signalintensitäten (Cho/Cr) der Cholin-Resonanz (Cho) und des Creatin-Phosphocreatin-Komplex (Cr) wurden aus den MR-Spektren berechnet. Schon nach 5 Tagen konnte der Tumor in der Prostata deutlich an einem Abfall der T2w- gewichteten Signalintensität und einem Anstieg von A und kep identifiziert werden. Hohe Cho/Cr-Level und Resonanzen zweier Lipidfraktionen Lip1 bei ppm und Lip2 bei ppm wurden mit der MRS in hochnekrotischen Tumoren beobachtet. Das orthotope Prostatakarzinom der Ratte stimmt hinsichtlich MR-Morphologie, dmri und 1 H-MRS mit dem humanen Prostatakarzinom überein. Die nichtinvasive Charakterisierung der Perfusion und des Stoffwechsels macht vergleichende Untersuchungen unterschiedlicher Therapiemodalitäten möglich. In einer weiteren Studie [71] wurde der Zusammenhang dynamischer Parameter des 2-Kompartment-Modells für das Prostatakarzinom und ihre Korrelation mit der Tumormikrogefäßdichte untersucht. 43 Patienten mit bioptisch gesichertem Prostatakarzinom wurden in der Studie eingeschlossen. Signal-zeit-kurven wurden mit einem offenen 2-Kompartment-Modell in Amplitude und Austauschratenkonstanten kep parametrisiert. Die Mikrogefäßdichte der resektierten Prostatae wurde histologisch bestimmt. Dabei fiel auf, dass die Mikrogefäßdichte im Tumor signifikant höher war, als im benachbarten gesunden Gewebe und mit den kep-werten der dynamischen MRT korrelierte. Prostatakarzinome der peripheren Zone demaskierten sich durch die Amplitude und kep. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass das Prostatakarzinom nicht nur mittels dynamischer T1-gewichteter MRT unter Verwendung eines 2-Kompartment-Modells dargestellt werden kann, sondern dass die Austauschratenkonstante kep die Mikrogefäßdichte des Tumors widerspiegelt und somit wichtige klinische Informationen zur Charakterisierung des Tumors liefert. [71] 5 Degenerative Gefäßerkrankungen (Aortenaneurisma) M. Ganten, H. von Tengg-Kobligk In den letzten Jahren hat die Technik der Computertomographie revolutionäre Fortschritte gemacht. Die Einführung der Spiral-CT sowie die Bildakquisition mit mehreren Detektoren erlauben eine erheblich schnellere Bildgebung mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung: Durch neue

276 276 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Zeilen-CT-Technik mit synchroner EKG Aufzeichnung ist es jetzt möglich, in einer Untersuchung zur Morphologie [89] auch die Aortenwandbewegung darzustellen. 5.1 Elastizitätsmessung der Aortenwand mit der Multislice-CT: Eine im Ex-vivo-Experiment validierte Patientenstudie Funktionelle Parameter der Aortenwand könnten zur Risikoabschätzung der Aortenruptur von Bedeutung sein. Ziel der Studie war die Elastizität der Aortenwand mittels EKG-gestützter Multislice-CT zu bestimmen. Um eine zusätzliche Strahlenbelastung zu vermeiden, sollten Rekonstruktionsalgorithmen entwickelt werden, die es erlauben, CT- Daten aus Standardangiographien zu verwenden. Die Elastizität der Aorta kann als Verhältnis der relativen Querschnittsänderung und des zugehörigen intraluminalen Druckunterschieds bestimmt werden. CT-Aufnahmen mit einem Standardprotokoll für Aortenangiographie und synchroner EKG-Aufzeichnung erlauben die Bestimmung der Querschnittsänderung. Eine hohe Zeitauflösung von etwa 100 ms wurde durch Multiphasen-Bildrekonstruktionsalgorithmen erreicht. Zunächst wurde die Methode im Ex-vivo-Experiment an 5 Schweineaorten validiert. Die Querschnittsänderung wurde mit einem optischen System mit hoher Orts- und Zeitauflösung gemessen: Pulsatile Querschnittsänderungen konnten bei allen Aorten dargestellt werden (Abb. 9). Die gleiche Methode wurde bei 100 Patienten angewandt, die eine CT-Angiographie erhielten. Da die Messung des intraluminalen Druckunterschieds aufgrund der Invasivität verworfen wurde, wurde die Elastizität näherungsweise mit dem am Arm gemessene Blutdruck bestimmt. Abbildung 9: Die pulsatile Flächenänderung der rekonstruierten CT Bilder (a) wurden mit den Durchmesser-Daten der CCD- Kamera (b) verglichen und es wurde eine gute Übereinstimmung gefunden. Bei allen Patienten war es möglich, mit den CT-Daten der Standardangiographie, der synchronen EKG-Aufzeichnung und der Blutdruckmessung die Elastizität der Bauchaortenwand zu bestimmen. Unser Experiment zeigt, dass man funktionelle Informationen der Aortenwand mit einer Standard-CT-Untersuchung erhalten kann. Zur Abschätzung des prädiktiven Wertes der Aortenwandelastizität sind nun Patientenverlaufsbeobachtungen geplant. 6 Ultraschall S. Delorme, F. Kiessling, M. Krix Schwerpunktthema der Ultraschallforschung in der Abteilung Radiologe war die Entwicklung von quantitativen Methoden des kontrastmittelverstärkten Ultraschalls, sowie deren Anwendung in der Tumordetektion, -charakterisierung und der funktioneller Analyse, insbesondere in der Untersuchung von Tumorangiogenese und dem Monitoring antiangiogener Therapien. Abteilung E010 Radiologie Die Entwicklung moderner Kontrastmittel hat in der Ultraschalldiagnostik zu einer Verbesserung in der Detektion und Charakterisierung von Tumoren geführt. Die Kontrastmittel besitzen zudem im Vergleich zu Kontrastmittel anderer radiologischer Verfahren einige Eigenschaften, die insbesondere bei der funktionellen Diagnostik von Tumorperfusion vorteilhaft sind. Ultraschallkontrastmittel bestehen aus Mikrobläschen, die sich nach intravenöser Injektion rasch rein intravasal verteilen, und nicht, wie gängige CT- oder MRT-Kontrastmittel, in den extrazellulären Raum übertreten. Neueste technische Entwicklungen der Ultraschallgeräte erlauben eine sensitive Detektion dieser Kontrastmittel, im Prinzip sogar die Registrierung einzelner Bläschen. Dabei ist es möglich, das Kontrastmittel in Echtzeit in der Ultraschalluntersuchung zu beobachten, oder es durch hochenergetische Ultraschallpulse lokal zu zerstören. Die Analyse der daran anschließenden Wiederanflutung erlaubt z.b. in Tumoren eine quantitative Bestimmung von Perfusionsparametern wie Blutfluss, Blutvolumen oder Blutgeschwindigkeit. Eine Bestimmung derartiger funktioneller Parameter ist in der Beurteilung von Angiogenese in vivo oder dem Monitoring anti- oder pro-angiogener Therapien essentiell. Wir haben vorangegangene Studien zur Entwicklung einer neuen Ultraschallmethode für die Quantifizierung von Tumorperfusion mittels Analyse von Wiederanflutungskinetiken nach einer einzelnen Kontrastmittelbolusgabe fortgesetzt [77]. Die Methode wurde validiert, und es zeigte sich in experimentellen Tumoren eine signifikante Korrelation von Parametern des lokalen Blutvolumens mit der histologisch bestimmten Mikrogefäßdichte von Tumoren sowie mit Parametern der dynamischen kontrastverstärkten Magnetresonanztomographie [69]. Hierdurch bietet sich die Möglichkeit, Perfusion, d.h. den lokalen Blutfluss einschließlich der Mikrozirkulation nicht-invasiv zu bestimmen. Ein neues mathematisches Modell wurde entwickelt, welches das Wiederanfluten von Mikrobläschen nach lokaler Zerstörung durch den Ultraschall genauer beschreiben kann und somit die Messung der Gewebeperfusion umfassender und detaillierter ermöglicht [76, 78]. Durch die enge Kooperation mit der Abteilung Karzinogenese und Differenzierung des DKFZ gelang das Monitoring einer antiangiogenen Therapie mit Antikörper gegen den VEGF-Rezeptor 2 in einem murinen Tumormodell. Eine signifikante Reduktion von funktionellen Perfusionsparametern konnte in vivo gemessen werden, vor einer Abnahme des Tumorvolumens [75]. Durch weitere Projekte mit den klinischen Kooperationseinheiten Strahlentherapie und Nuklearmedizin konnte die Wirksamkeit weiterer antiangiogener Konzepte (Kombination von direkter und indirekter antiangiogener Therapie) und ein reduziertes Wachstum von transfizierten (erhöhte Expression von Angiostatin oder Troponin I) experimentellen Tumoren durch die kontrastverstärkte Sonographie quantitativ nachgewiesen werden. In ersten Studien wurde das neu entwickelte Verfahren auch klinisch zur Quantifizierung der Vaskularisation von Lebermetastasen einschließlich der Bestimmung der Perfusion des umgebenden Lebergewebes eingesetzt. Dabei wurde das mathematische Modell zur Perfusionsquantifizierung mittels kontrastverstärktem Ultraschall auf die komplexen Perfusionsverhältnisse in der Leber hin adaptiert. [5, 10, 69, 75-78, 83]

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Eur Radiol (im Druck) [96] Plathow C, Schulz-Ertner D, Thilmann C, Zuna I, Lichy MP, Weber MA, Schlemmer HP*, Wannenmacher M*, Debus J. Fractionated stereotactic radiotherapy in low-grade astrocytomas: long-term outcome and prognostic factors. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003;57: [97] Plathow C, Ley S, Fink C, Puderbach M, Heilmann M, Zuna I, Kauczor H-U. Evaluation of chest motion and volumetry during the breathing cycle by dynamic MRI in health subjects: Comparison with pulmonary function tests. Invest Radiol (im Druck) [98] Plathow C, Acalovschi D*, Debus J. CT-Myelography in tumor therapy of the spine. Rom J Neurol (im Druck) [99] Schlemmer HP*, Bachert P, Henze M, Klatt HU*, Herfarth KK*, Debus J, van Kaick G. Differentiation of radiation necrosis from tumor progression using proton magnetic resonance spectroscopy. Neuroradiology 2002;44: [100] Schönberg SO, Essig M, Hallscheidt P*, Sharafuddin MJ*, Stolpen AH*, Knopp MV, Yuh WT*. Multiphase magnetic resonance angiography of the abdominal and pelvic arteries: results of a bicenter multireader analysis. Invest Radiol 2002;37:20-28 [101] Schönberg SO. Bildgebung des Bronchialkarzinoms mit radiologischen und nuklearmedizinischen Verfahren. Uni-Med 2002;50-62 [102] Schönberg SO, Knopp MV, Londy FJ*, Krishnan S*, Zuna I, Lang N*, Essig M, Hawighorst H, Maki J*, Stafford-Johnson D*, Kallinowski F*, Chenevert T*, Prince M*. Morphologic and Functional Magnetic Resonance Imaging of Renal Artery Stenosis: A Multireader Tricencer Study. J Am Soc Neprology 2002;13: [103] Schönberg SO. Magnetresonanztomographie. In: Drings,P., ed. Management des Lungenkarzinoms. Heidelberg. Springer, 2002; [104] Schönknecht P*, Pantel J*, Essig M, Amann M, Schad LR, Schröder J*. Progression of hippocampal atrophy is associated with clinical deterioration in Alzheimer s disease. Eur Psychiatry 2002;17:110 [105] Schönknecht P*, Pantel J*, Essig M, Amann M, Schad LR, Schröder J*. Quantitative Magnetresonanztomographie und klinischer Schweregrad im Verlauf der Alzheimer-Demenz. In: Gutzmann,H., ed. Die Gerontopsychiatrie und ihre Nachbardisziplinen. Berlin, Bonn, Frankfurt, Saarbrücken. Deutsche Gesellschaft für Gerontopsychiatrie und -psychotherapie, 2002; [106] Schönknecht P*, Pantel J*, Hartmann T*, Werle E*, Volkmann M*, Essig M, Amann M, Zanabili N*, Bardenheuer H*, Hunt A*, Schröder J*. Cerebrospinal fluid tau levels in Alzheimer s disease are elevated when compared with vascular dementia but do not correlate with measures of cerebral atrophy. Psychiatry Res 2003;120:

280 280 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [107] Schröder J*, Pantel J*, Schönknecht P*, Essig M. Die Magnetresonanztomographie in der klinischen Demenzdiagnostik. Radiologe 2003;43: [108] Semmler W, Bachert P, Schlemmer HP. Klinische MR- Spektroskopie. In: Reiser,M., ed. Magnetresonanztomographie, 3. Auflage. Berlin, Heidelberg, New York. Springer, 2002; [109] Steinvorth S*, Wenz F*, Wildermuth S*, Essig M, Fuss M, Lohr F*, Debus J, Wannenmacher M*, Hacke W*. Cognitive function in patients with cerebral arteriovenous malformations after radiosurgery: prospective long-term follow-up. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;54: [110] Stieltjes B, Schluter M*, Hahn HK*, Wilhelm T*, Essig M. Diffusions-Tensor-Bildgebung. Theorie, Sequenzoptimierung und Anwendungen bei Morbus Alzheimer. Radiologe 2003;43: [111] Uematsu H*, Hatabu H*, Fink C, Kauczor H-U. MR Pulmonary Perfusion. In: Kauczor,H.-U., ed. Functional MRI of the Chest. Springer, 2003; [112] van Beek EJ*, Wild JM*, Fink C, Moody AR*, Kauczor H-U, Oudkerk M*. MRI for the diagnosis of Pulmonary Embolism. J Magn Reson Imaging 2003;18: [113] van Kaick G, Semmler W. Medizin und Naturwissenschaft im Berufsbild des diagnostischen Radiologen. Fortschr Rontgenstr 2003;175: [114] Volm M, Koomägi R. Case reviews: prognostic relevance of angiogenic, proliferative and apotpotic factors in lung carcinomas. In: Driscoll,B., ed. Methods in Molecular Medicine. Lung Cancer Vol. 1: Molecular Pathology Methods and Reviews. Totowa NJ. Humana Press, 2002; [115] Volm M, Koomägi R, Rittgen W. Cellular predictive factors of drug resistance in non-small cell lung carcinomas. In: Driscoll,B., ed. Methods in Molecular Medicine. Lung Cancer Vol. 2: Diagnostic and Therapeutic Methods and Reviews. Totowa NJ. Humana Press, 2002 [116] Vomweg TW*, Buscema M*, Kauczor H-U, Teifke A*, Intraligi M*, Terzi S*, Heussel CP*, Achenbach T*, Rieker O*, Mayer D*, Thelen M*. Improved artificial neural networks in prediction of malignancy of lesions in contrast-enhanced MR-mammography. Med Phys 2003;30: [117] Wasser K, Sinn HP*, Fink C, Klein SK*, Junkermann H*, Ludemann H*, Zuna I, Delorme S. Accuracy of tumor size measurement in breast cancer using MRI is influenced by histological regression induced by neoadjuvant chemotherapy. Eur Radiol 2003;13: [118] Wasser K, Klein SK*, Fink C, Junkermann H*, Sinn HP*, Zuna I, Knopp MV, Delorme S. Evaluation of neoadjuvant chemotherapeutic response of breast cancer using dynamic MRI with high temporal resolution. Eur Radiol 2003;13:80-87 [119] Weber MA, Groos S*, Aumuller G*, Konrad L*. Post-natal development of the rat testis: steroid hormone receptor distribution and extracellular matrix deposition. Andrologia 2002;34:41-54 [120] Weber MA, Delorme S. Routinenachsorge 16 Jahre nach Adrenalektomie links aufgrund eines Nebennierenrindenkarzinoms. Radiologe 2002;42: [121] Weber MA, Wasser K, Schwenger V*, Hallscheidt P*, Nahm AM*, Delorme S. Palpable Resistenz unterhalb des rechten Rippenbogens. Radiologe 2002;42:46-50 [122] Weber MA, Lichy MP, Reimer P*. Raumforderung im Bereich des 3. Ventrikels. Zerebrale pseudozystische Metastase eines neuroendocrine Karzinoms bei unbekanntem Primärtumor. Radiologe 2002;42: [123] Weber MA, Steiner T*, Fiebach J*. Ungewöhnliche Ursache einer akuten Bewusstseinseintrübung. Dekompensierter Hydrozephalus bei Blockade der Foramina Monroi durch eine Megadolichobasilaris. Radiologe 2002;42: [124] Weber MA, Kulkens S*, Meyding-Lamade U*, Mohr A*. Drehschwindel und Ohrensausen. Radiologe 2003;43: Abteilung E010 Radiologie [125] Weber MA, Thilmann C, Lichy MP, Günther M*, Delorme S, Zuna I, Bongers A, Schad LR, Debus J, Kauczor H-U, Essig M, Schlemmer HP. Assessment of irradiated brain metastases by means of arterial spin-labeling and dynamic susceptibilityweighted contrast-enhanced perfusion MRI - initial results. Invest Radiol 2004;39: [126] Weber MA, Risse F, Giesel FL, Schad LR, Kauczor H-U, Essig M. Perfusionsmessung mit der T2*-Kontrastmitteldynamik in der Neuroonkologie: Physikalische Grundlagen und klinische Anwendungen. Radiologe (im Druck) [127] Weber MA, Fiebach J*, Lichy MP, Weber R*, Schwark C*, Grau A*. Bilateral cerebral air embolism. J Neurol 2003;250: [128] Weber MA, Lichy MP, Kulkens S*, Steiner T*, Hartmann M*. Akute Kopfschmerzen und Halbseitensymptomatik links. Radiologe 2003;43: [129] Weber MA, Steiner T*, Mohr A*. Plötzlich einsetzende Hemisymptomatik rechts. Unilateraler venöser Infarkt des linken Thalamus bei Thrombose der inneren Hirnvenen. Radiologe 2003;43:77-80 [130] Weber MA, Plathow C. Bilaterale Akustikusneurinome. Radiologe 2003;43: [131] Weber MA, Jacobi C*, Storch-Hagenlocher B*, Schwaninger M*, Schramm P*. Akuter Querschnitt. Spontane intraspinale Marcumar-assoziierte Blutung. Radiologe (im Druck) [132] Weber MA, Rieger S*, Sellner J*, Storch-Hagenlocher B*, Hartmann M*. Tetraspastik, demenzielle Entwicklung und erstmaliger Krampfanfall. Radiologe 2003;43: [133] Weber MA, Acalovschi D*, Fiebach J*, Weber R*. Right hemiparesis and aphasia after delivery - infarction in the territory of the left arteria cerebi media due to bilateral dissections of the carotid and vertebral arteries. Rom J Neurol (im Druck) [134] Weber MA, Plathow C, Acalovschi D*, Schönffeldt-Varas P*, Kress B*, Steiner T*. Sudden painful femoral nerve palsy - a case report. Rom J Neurol (im Druck) [135] Weber MA, Kroll A*, Günther M*, Delorme S, Debus J, Giesel FL, Essig M, Kauczor H-U, Schad LR. Nichtinvasive Messung des relativen zerebralen Blutflusses mit der MR- Blutbolusmarkierungstechnik (Arterial Spin-Labeling): Physikalische Grundlagen und klinische Anwendungen. Radiologe (im Druck) [136] Weber MA, Lichy MP, Thilmann C, Günther M*, Bachert P, Maudsley AA*, Delorme S, Schad LR, Debus J, Schlemmer HP*. Verlaufsbeobachtung bestrahlter Hirnmetastasen mittels MR- Perfusionsbildgebung und 1 H-MR-Spektroskopie. Radiologe 2003;43: [137] Weber MA, Günther M, Lichy MP, Delorme S, Bongers A, Thilmann C, Essig M, Zuna I, Schad LR, Debus J, Schlemmer HP. Comparison of arterial spin-labeling techniques and dynamic susceptibility-weighted contrast-enhanced MRI in perfusion imaging of normal brain tissue. Invest Radiol 2003;38: [138] Weber MA, Schönknecht P*, Pilz J*, Storch-Hagenlocher B*. Post-Polio-Syndrom: Neurologische und psychiatrische Aspekte. Nervenarzt 2004;75: [139] Wüstenberg T*, Jordan K*, Giesel FL, Villringer A*. Physiologische und technische Grenzen der funktionellen Magnetresonanztomographie und die damit verbundenen Konsequenzen für die klinische Anwendung. Radiologe 2003;43:

281 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie Abteilung Medizinische Physik in der Radiologie (E020) (früher Biophysik und medizinische Strahlenphysik) Leiter: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Wolfhard Semmler Dr. Michael Amann Dr. Folker Amelung Prof. Dr. Peter Bachert Dr. Reiner Bader Dr. Michael Bock Dr. Jan Boese (- 12/02) Dr. Josef Doll Dr. Andreas Eisenmenger Dr. Renate Jerecic (- 3/02) Dr. Oliver Nix Dr. Jörg Peter Dr. Rainer Saffrich (- 3/03) Prof. Dr. Lothar Schad Dr. Reiner Umathum Dr. Horst Wesch (- 10/02) Dr. Gerd Wolber (- 9/03) Doktoranden Dr. Silke Aumann (- 6/02) André Bongers Olaf Bublitz ( - 3/02) Julia Dittrich Melanie Heilmann Stefan Kirsch Alexander Kroll Falko Lohberger Sven Müller Sonia Nielles-Vallespin Guido Rademaker Karaneh Razavi Frank Risse Dr. Steffen Sammet (- 7/02) Christian Schmitz (- 2/03) Leif Schröder Ralf Schulz Peter Siegler Rui Sun Steffen Volz Sven Zühlsdorff Hendrik Zimmermann Diplomanden Ulrich Felzmann (- 12/03) Marion Lang Jurek Maßner Jens Moll Christian Schuster Markus Streckenbach (- 3/02) Michael Wormit Technische Assistenten Adolf Bindl (- 2/02) Jutta Helber Frauke Spiecker Das Forschungsprogramm der Abteilung ist multidisziplinär ausgerichtet und umfasst physikalische, technische und biologische Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Bereich der Tumordiagnostik. Die Arbeiten werden in enger Kooperation mit der Abteilung für Onkologische Diagnostik und Therapie (G. van Kaick) - seit 1/03 Abteilung für Radiologie (H.-U. Kauczor) -, der Abteilung für Radiochemie und Radiopharmakologie (M. Eisenhut), der Abteilung für Medizinische Physik (W. Schlegel), der klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie (J. Debus) und der Radiologischen Klinik der Universität Heidelberg durchgeführt. Das Ziel des Forschungsprogramms ist die Bereitstellung der Basisdaten für eine individuelle Tumortherapie und eine verbesserte lokale Tumorkontrolle. Dies bedeutet eine vollständige qualitative und quantitative Erfassung der morphologischen, funktionellen und molekularen Parameter unter Benutzung bildgebender Verfahren wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Magnetresonanz-Tomographie (MRT), Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS), Ultraschall-Diagnostik und Computer-Tomographie (CT). Diese Basisdaten können sowohl für eine individuelle Behandlungsplanung dienen (z. B. Bestrahlung, Hyperthermie, Medikamente oder eine Kombination daraus) als auch als Grundlage für die Beurteilung der Therapie während und nach der Behandlung herangezogen werden. Voraussetzungen für diese Arbeiten werden in dieser Abteilung geschaffen; die Weiterentwicklung und Optimierung der vorhandenen und die Einführung neuer Verfahren in die Diagnostik und Therapie. So soll u.a. durch optimierte Korrektur- und Bildrekonstruktionsverfahren und durch Anwendung von tracerspezifischen Modellen der kinetischen Bildanalyse die diagnostische Wertigkeit der PET verbessert werden. Als zwei neue Arbeitsgebiete sind hier die interventionelle MRT und die Molekulare Diagnostik zu nennen, die aufgebaut wurden bzw. werden und die entscheidende Fortschritte in der onkologischen Diagnostik und Therpie erwarten lassen. 281

282 282 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Funktionelle und Physiologische Bildgebung mit der MR L.R. Schad, M. Amann, A. Bongers, M. Heilmann, A. Kroll, F. Lohberger, S. Nielles-Vallespin, J. Massmer, G. Rademaker, K. Razavi, F. Risse, P. Siegler In Zusammenarbeit mit: E010, DKFZ; Strahlentherapie, Heidelberg; Psychiatrie, Heidelberg; Radiodiagnostik, Heidelberg; Zentralinstitut für Seelische Gesundheit, Mannheim; Informatik V, Mannheim; Psychologie, Mannheim; Anästhesie, Mannheim; Physik, Würzburg; Kardiologie, Würzburg; Technische Universität, Prag, Tschechische Republik; EU-Projekt COST B11, Brüssel, Belgien; Siemens AG, Erlangen Abb. 1: Messung der Gewebeoxygenierung (BOLD) bei einem Patienten mit Astrozytom III: Überlagerung der BOLD-Signalanstiegskarte (rot) auf FDG-PET und IMT-SPECT Daten mit ringförmigem Signalanstieg im Tumorrandbereich (Dissertation Bongers DKFZ/2003). Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie 3D Bildkorrelation in der Bestrahlungsplanung Eine bessere Anpassung der therapeutischen Strahlendosis an das Zielvolumen zur Schonung des gesunden Gewebes und von benachbarten Risikoorganen stellt eine der wichtigsten Aufgaben in der onkologischen Strahlentherapie dar. Bei der individuellen Festlegung des Zielvolumens bietet in den letzten Jahren die MR bei der Behandlung von Läsionen des menschlichen Gehirns aufgrund des guten Weichteilkontrastes hervorragende Möglichkeiten. Insbesondere bei der stereotaktischen Bestrahlungsplanung konnten neue MR-Techniken (3D FLASH, dynamische MRT, Diffusion, Perfusion, MRA, Blutbolus-Markierung) entwikkelt und klinisch erfolgreich in der Therapieplanung und -kontrolle eingesetzt werden. Funktionelle/Physiologische MR-Bildgebung Es wurden ferner schnelle Messmethoden (spiral-epi) entwickelt, um auch hämodynamische Parameter (Blutfluss, Akzelerationszeit, Pulswellengeschwindigkeit) im Menschen bestimmen zu können. Außerdem wurden die Möglichkeiten einer nicht-invasiven funktionellen MR-Bildgebung bei Hirnstimulationen (z.b. des motorischen Kortex) und deren Einsatz zur besseren Abgrenzung von Risikostrukturen in der stereotaktischen Hochdosisbestrahlung untersucht. Zudem wurden Messtechniken entwickelt, um die Oxygenierung und Perfusion von Gewebe nicht-invasiv zu bestimmen (T2*- bzw. T1-Technik). Neben den Protonen wurden auch Schnellbildtechniken zur Bildgebung mit Natrium-23 entwickelt, um Aufschlüsse über die Na-K-Pumpe in-vivo zu erhalten. Diese Techniken wurden am Beispiel der myokardialen Durchblutung überprüft und sind von grundsätzlichem Interesse für die Onkologie. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Wacker CM, *Wiesmann F, Bock M, *Jakob P, *Sandstede JJW, *Lehning A, *Ertl G, Schad LR, *Haase A, *Bauer WR. Determination of regional blood volume and intra-extracapillary water exchange in human myocardium using feruglose: First clinical results in patients with coronary artery disease. Mag Res Med 2002;47: [2] Amann M, Bock M, *Floemer F, Schoenberg SO, Schad LR. Three-dimensional spiral MR imaging: application to renal multiphase contrast enhanced angiography. Mag Res Med 2002; 48(2): [3] Schad LR. Funktionelle Magnetresonanztomographie (fmrt). Teil 1: Grundlagen und Messtechniken. Radiologe 2002;42: [4] *Pantel J, *Hüger DR, *Kratz B, *Minnemann E, *Martin M, Schad LR, Essig M, *Schröder J. Strukturelle zerebrale Veränderungen bei Probanden mit leichter kognitiver Beeinträchtigung. Nervenarzt 2002;73: [5] Schad LR. Funktionelle Magnetresonanz-tomographie (fmrt). Teil 2: Datenanalyse und Anwendungen. Radiologe 2002;42: [6] Kiessling F, Heilmann M, Vosseler S, Lichy M, Krix M, Fink C, Kiessling I, Steinbauer H, Schad L, Fusenig NE, Delorme S. Dynamic T1-weighted monitoring of vascularization in human carcinoma heterotransplants by magnetic resonance imaging. Int J Cancer. 2003;104(1): [7] Karger CP, Hipp P, Henze M, Echner G, Höss A, Schad L, Hartmann GH. Stereotactic imaging for radiotherapy: Accuracy of CT, MRI, PET and SPECT. Phys Med Biol 2003;48: [8] Wacker CM, Hartlep AW, Pfleger S, Schad LR, Ertl G, Bauer WR. Susceptibility-sensitive magnetic resonance imaging detects human myocardium supplied by a stenotic coronary artery without a contrast agent. J Am Coll Cardiol 2003;41(5): [9] Weber MA, Lichy MP, Thilmann C, Günther M, Bachert P, Maudsley AA, Delorme S, Schad LR, Debus J, Schlemmer HP. Verlaufsbeobachtung bestrahlter Hirnmetastasen mittels MR- Perfusionsbildgebung und 1 H-MR-Spektroskopie. Radiologe 2003;43: [10] Rademaker G, Jenne JW, Rastert R, Röder D, Schad LR. Vergleich nichtinvasiver MRT-Verfahren zur Temperaturmessung für den Einsatz bei medizinischen Thermotherapien. Z Med Phys 2003;13: [11] Weber MA, Günther M, Lichy MP, Delorme S, Bongers A, Thilmann C, Essig M, Zuna I, Schad LR, Debus J, Schlemmer HP. Comparison of arterial spin-labeling techniques and dynamic susceptibility-weighted contrast-enhanced MRI in perfusion imaging of normal brain tissue. Invest Radiol 2003;38: [12] Bankamp A, Schad LR. Comparison of TSE, TGSE, and CPMG measurement techniques for MR polymer gel dosimetry. Mag Res Imag 2003;21: [13] Krug R, Boese JM, Schad LR. Determination of aortic compliance from magnetic resonance images using an automatic active contour model. Phys Med Biol 2003;48: [14] Schad LR, Baudendistel K, *Wenz F. Funktionelle Magnetresonanztomographie (fmrt). In: Reiser M, Semmler W, eds. Magnetresonanztomographie, 3. Auflage, Berlin Heidelberg New York: Springer, 2002: [15] Schad LR. Bildkorrelation/Registrierung von MRT, CT und PET in der streotaktischen Operations- und Bestrahlungsplanung. In: Reiser M, Semmler W, eds. Magnetresonanztomographie, 3. Auflage, Berlin Heidelberg New York: Springer, 2002:

283 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [16] Schad LR. Anwendungen und Techniken der MRT in der Strahlentherapieplanung. In: Schlegel W, Bille J, eds. Medizinische Physik 2 (ISBN X). Berlin Heidelberg New York: Springer, 2002: [17] Semmler W, Schad L. Medizinische Physik In: Semmler W, Schad L, eds. (ISBN ). Deutsche Gesellschaft für Medizinische Physik e.v [18] G. Rademaker: Nichtinvasives Temperaturmonitoring mit der Magnetresonanz-Tomographie bei medizinischen Thermotherapien mit fokussiertem Ultraschall oder Laser. Dissertation, Heidelberg [19] A. Bankamp: Entwicklung von hochauflösenden T2-Messverfahren zur Bestimmung von dreidimensionalen Dosisverteilungen mit Hilfe der MR-Gel-Dosimetrie und deren Anwendung in der Strahlentherapie. Dissertation, Heidelberg [20] R. Krug: Determination of Aortic Elasticity from MR- and CT- Images Using an Automatic Active Contour Model. Dissertation, Heidelberg Metabolische und physiologische Charakterisierung von Tumoren mit MR-Spektroskopie P. Bachert, U. Felzmann, S. Kirsch, M. Lang, S. Sammet, C. Schmitz, L. Schröder, C. Schuster, M. Streckenbach, M. Wormit In Zusammenarbeit mit: G. van Kaick, H.-U. Kauczor und Mitarbeiter, DKFZ; R.E. Port, DKFZ; J. Debus, Universitätsstrahlenklinik, Universität Heidelberg; A. Schulze, Universitätskinderklinik, Universität Heidelberg; F. Hamprecht, Institut für wissenschaftliches Rechnen, Universität Heidelberg; H.K. Seitz, Krankenhaus Salem, Heidelberg; G. Ende, ZISG, Mannheim; H.-P. Schlemmer, Universität Tübingen; S. Röll, Siemens Medical Solutions, Erlangen; A. Heerschap, University Medical Center, Nijmegen, Niederlande Mit der Magnetischen Resonanz-Spektroskopie (MRS) können Stoffwechselvorgänge im lebenden Gewebe (in vivo) nicht-invasiv beobachtet werden. In der Arbeitsgruppe wird diese Technik weiterentwickelt und angewendet, insbesondere um Tumoren in Patienten vor, im Verlauf und nach der Therapie zu untersuchen. Wir arbeiten dabei intensiv mit der Abteilung Radiologie zusammen. Die MRS-Untersuchungen werden an einem Ganzkörper-MR-Tomographen mit magnetischer Feldinduktion von 1,5 Tesla, exzellenter Feldhomogenität sowie zwei parallelen Hochfrequenzsystemen für heteronukleare Doppelresonanz durchgeführt. Speziell für die Diagnostik von Hirntumoren konnte in Untersuchungen an zahlreichen Patienten gezeigt werden, dass die Protonen-MRS ( 1 H-MRS) sowohl als Single-Voxel- Technik als auch als spektroskopische Bildgebung (SI = spectroscopic imaging) wichtige biochemische Information liefert, die es erlaubt, neoplastische (Tumorrezidiv) und nicht neoplastische Gewebeveränderungen (Radionekrose) nach stereotaktischer Strahlentherapie zu unterscheiden [1, 2]. Dieser Ansatz wird derzeit für das Prostata-Karzinom in einer internationalen Multicenter-Studie fortgeführt, an der unsere Arbeitsgruppe beteiligt ist und in der das Potential des 1 H-SI für die Diagnostik dieser Tumorentität erforscht werden soll. Die Daten zur Tumor-MRS werden zurzeit fortgeschrittenen statistischen Auswerte-Algorithmen zugeführt. Im Rahmen der langjährigen Kooperation mit der Kinderklinik der Universität Heidelberg, in der wir Patienten mit angeborenen Stoffwechselerkrankungen mit der MRS untersuchen, konnte weltweit erstmals bei einem erwachsenen Patienten mit Guanidinoacetat-Methyl-Transferase-Mangel (GAMT) die Therapie erfolgreich mit 1 H- und 31 P-MRS verfolgt werden [3]. Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie Bei den physikalischen Projekten haben wir Techniken zur T 1ρ -gewichteten MR-Bildgebung (T 1ρ = Spin-Gitter-Relaxationszeit im rotierenden Koordinatensystem, möglicher neuer MRT-Kontrastparameter) [4], zur schnellen spektroskopischen Bildgebung [5], zur Gewebe-Segmentierung und CSF-Korrektur beim 1 H-SI des Gehirns [6] und zur Signalverstärkung von 31 P-MR-Spektren mittels heteronuklearer Doppelresonanz [7] untersucht. Schließlich haben wir in hochaufgelösten 1 H-MR Spektren des Wadenmuskels (M. gastrocnemius) asymmetrische Satelliten Linien an den Resonanzen des Dipeptids Carnosin entdeckt, die durch residuale Dipol-Dipol-Kopplung infolge starker Bewegungseinschränkung des Moleküls in den Muskelzellen verursacht werden [8]. Zurzeit dehnen wir die Analyse aus, um Informationen über Reorientierung und Bindungsstellen des Carnosins im lebenden, intakten Muskelgewebe zu gewinnen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Schlemmer, H. P.; Bachert, P.; Henze, M.; *Buslei, R.; Herfarth, K.K.; Debus, J.; van Kaick, G.: Differentiation of radiation necrosis from tumor progression using proton magnetic resonance spectroscopy. Neuroradiology 44 (2002) [2] Lichy, M.P.; Bachert, P.; Henze, M.; Lichy, C.M.; Debus, J.; Schlemmer, H.-P.: Monitoring individual response to brain-tumour chemotherapy: proton MR spectroscopy in a patient with recurrent glioma after stereotactic radiotherapy. Neuroradiology 46 (2004) [3] *Schulze, A.; Bachert, P.; Schlemmer, H.-P.; *Harting, I.; *Polster, T.; *Salomons, G.S.; *Verhoeven, N.M.; *Jakobs, C.; *Fowler, B.; *Hoffmann, G.F.; *Mayatepek, E.: Lack of creatine in muscle and brain in an adult with GAMT deficiency. Annals in Neurology 53 (2003): [4] Sammet, S.; Bock, M.; Streckenbach, M.; Bachert, P.: Protonen-Spinlock und T1ρ-gewichtete MR Bildgebung bei 1,5 T. Zeitschrift für Medizinische Physik 12 (2002) [5] Wilhelm, T.; Aisenbrey, C.; Bachert, P.: Schnelle 1 H-MR-spektroskopische Bildgebung am Gehirn des Menschen. Zeitschrift für Medizinische Physik 13 (2003): [6] *Weber-Fahr, W.; *Ende, G.; *Braus, D.F.; Bachert, P.; *Soher, B.J.; *Henn, F.A.; *Büchel, C.: A fully automated method for tissue segmentation and CSF-correction of proton MRSI metabolites corroborates abnormal hippocampal NAA in schizophrenia. NeuroImage 16 (2002): [7] *Weber-Fahr, W.; Bachert, P.; *Henn, F.A.; *Braus, D.F.; *Ende, G.: Signal enhancement through heteronuclear polarisation transfer in in vivo 31 P MR spectroscopy of the human brain. MAGMA (im Druck). [8] Schröder, L.; Bachert, P.: Evidence for a dipolar-coupled AM system in carnosine in human calf muscle from in vivo 1 H NMR spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance 164 (2003): Qualitätssicherung R. Bader In Zusammenarbeit mit: Arbeitskreis NMR der Deutschen Gesellschaft für Medizinische Physik, Gruppe Qualitätssicherung Hauptgegenstand und -ziel der Arbeitsgruppe ist seit 2000 eine abteilungsübergreifende projektgebundene Qualitätssicherung in den Bereichen der Magnetresonanztomographie, der Computertomographie, der Positronen-Emissions- Tomographie und der mammographischen Röntgendiagnostik. Unterschiedliche Kontrollverfahren, geeignete Testobjekte und automatische Datenauswertungen werden entwickelt, um die Qualität der Messtechniken und -abläufe im Forschungsschwerpunkt zu kontrollieren und zu verbessern. 283

284 284 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Eine leistungsfähige medizinische Ausrüstung auf hohem qualitativem Standard ist eine wesentliche Grundlage für eine aussagekräftige Diagnostik. Um hierfür die gerätetechnische Situation zu überprüfen und Verbesserungen zu erreichen, werden im Rahmen von nationalen und internationalen Qualitätssicherungsstudien ständig vergleichende Kontrollen durchgeführt und die Entwicklung neuer Messmethoden vorangetrieben. Zur Erreichung und Unterstützung dieser Ziele wird die Einführung eines zertifizierten Qualitätsmanagementsystems angestrebt, das nach den EG-Richtlinien sowie den nationalen gesetzlichen Bestimmungen für medizinische Einrichtungen zukünftig gefordert und für die Zulassung selbst entwickelter Produkte in der medizinischen Forschung entscheidende Voraussetzung sein wird. Funktionelle und Molekulare Emissionstomographie J. Peter, J. Doll, O. Nix, R. Saffrich, S. Loukianiouk, R. Schulz In Zusammenarbeit mit: U. Haberkorn, L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou-Strauss, M. Henze, J. Hoffend, K. Schmidt, R. Bendl, J. Debus, DKFZ; M.F. Smith, Thomas Jefferson National Accelerator Facility, Newport News, USA; R.J. Jasczcak, Department of Radiology, Duke University Medical Center, Durham, USA; F. Beekmann, Image Science Institute, University Medical Center Utrecht, Niederlande; V. Ntziachristos, Center for Molecular Imaging Research, MGH Harvard University, USA Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie Forschungsinhalte dieser Arbeitsgruppe sind primär die in der Nuklearmedizin angewandten emissionstomographischen bildgebenden Verfahren Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Einzel-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT). Als Folge neuartiger, in der Arbeitsgruppe entwickelter Konzepte zur simultanen Bildgebung kleiner Tiere mittels SPECT und optischer Verfahren (SPECT-OT), ist die Erforschung mathematisch/physikalischer Aspekte optischer Photonenausbreitungen im Gewebe ebenso ein zentraler Forschungsgegenstand. Die Ziele dieser Arbeitsgruppe sind darauf ausgerichtet, die diagnostische Wertigkeit der Modalitäten durch anwendungsspezifische Instrumentierungsoptimierung und durch Entwicklung von tracer-/markerspezifischen Modellen der kinetischen Bildanalyse zu verbessern, und sie durch optimierte Korrektur-, Bildrekonstruktions- und Registrierungsverfahren als Eckpfeiler in der Tumordiagnostik zu etablieren. Entwickelt wurden und gegenwärtig werden in dieser Gruppe ebenso modernste Algorithmen und Applikationen zur realistischen Simulation von emissionstomographischen und optischen bildgebenden Verfahren. Hierfür wurden komplexe hybride anthropomorphische Phantome entwickelt, mittels derer PET und SPECT Projektionsdatensätze erzeugt werden, die unter Berücksichtigung zum Teil neu entwickelter statistischer Streuund Schwächungskorrekturmethoden rekonstruiert werden. Sie dienen auch zur Erzeugung dynamischer Verteilungen, um kinetische Modellierungsansätze für radiomarkierte Tracer zu evaluieren. Instrumentierung und MC Simulation Wissenschaftliche Studien wurden durchgeführt, um die anwendungsspezifische Leistungsfähigkeit tomographischer Systeme unter diversen Aufnahmeprotokollen zu bewerten und zu optimieren. Um durch Aktivitätsanreicherungen außerhalb des Gesichtsfeldes bei 3D PET-Messungen verursachte, algorithmisch unkorrigierbare Streuanteile in den Projektionen zu minimieren, wurde eine Vorrichtung konstruiert, mit der eine deutliche Verringerung dieser Streuanteile und somit ein verbessertes Signal zu Rauschen Verhältnis erzielt werden konnte. Basierend auf einem neuentwickelten Monte Carlo (MC) Simulationsprogramm wurde ein auf Einzellochkollimation basierter Dualmodalitäten- Kleintiertomograph konstruiert, der es ermöglicht, radioisotopische und optische Photonenverteilungen simultan und vom gleichen Projektionswinkel mit räumlich erzielbaren Auflösungen von weniger als 1mm zu detektieren [1, 2]. Aufgrund der exakten physikalischen Modellierung und der vielseitigen Anwendbarkeit des MC Simulationsalgorithmus sowohl in SPECT und PET als auch in optischen Systemen wurde das Programm in einer Anzahl von Instrumentierungsstudien eingesetzt [3-6, 9]. Neben der Entwicklung von analytischen Phantommodellen gelang es erstmals biologische Modelle des Tumorwachstums vollständig in die MC Simulation zu integrieren. Bildrekonstruktion und Registrierung Die der Bildrekonstruktion zugrunde liegenden mathematischen Verfahren haben einen entscheidenden Einfluss auf die erzielbare Bild- und folglich diagnostische Qualität. Kernprojekte der Arbeitsgruppe sind daher das Studium und die Entwicklung von Rekonstruktionsalgorithmen, sowie darin integrierte Streu- und Schwächungskorrekturverfahren. Eine existierende Methode zur Streukorrektur wurde mittels eines neuartigen Modelansatzes algorithmisch weiterentwickelt und signifikant hinsichtlich der klinischen Anwendbarkeit optimiert [8]. Möglichkeiten zur Überlagerung von PET Daten mit anatomischen bildgebenden Verfahren - Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) - wurden ausführlich studiert, besonders im Bezug auf die Anwendbarkeit in der Strahlentherapie. Ein besonderer Schwerpunkt bildet die Registrierung von MRI-PET und CT-PET Hirndaten, wobei ein auf Mutual Informationen basierter Algorithmus exakte Ergebnisse liefert. Tracermodellierung und Modelevaluation Die Entwicklung und Bewertung von tracerspezifischen pharmakokinetischen (PK) Modellen sowie die Implementierung von kinetischen Analysemethoden innerhalb von optimierten Rekonstruktionsstrategien ist zentraler Forschungsgegenstand [7]. Hierbei erwies sich die Integration von Kompartimentmodellen in die analytische Repräsentation anthropomorphischer Phantome als integraler Bestandteil der MC Simulation von PET Systemen als außerordentlich wertvoll für das Studium statistisch-mathematischer Aspekte von PK Modellen. So konnten Untersuchungsprotokolle für dynamische PET Studien optimiert und Wechselbeziehungen bestimmter physikalischer Parameter des Aufnahmesystems (intrinsische Kameraauflösung, 2D/3D Akquisitionsmodi) mit der Güte kinetischer Modelle nachgewiesen werden. Publikationen (* = externer Ko-Autor) [1] J. Peter, M. Bock Design Study of A Novel Dual-Modality Emission Micro-Imaging Tomograph for Radiopharmaceutical and Bioluminescent/Fluorescent Molecular Approaches Proc. 1st IEEE/NIH/NIBIB International Symposium on Biomedical Imaging, Washington, D.C., USA: ISBI, pp , [2] J. Peter Dual-Modality Emission Micro-Imaging Tomography Device. (Patent), [3] J.E. Bowsher*, M.P. Tornai*, S.D. Metzler*, J. Peter, R.J. Jaszczak* SPECT breast imaging using more nearly complete orbits and combined pinhole-parallel-beam collimation. IEEE Transactions on Nuclear Science, vol. 49, pp , 2002.

285 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [4] J.E. Bowsher*, M.P. Tornai*, J. Peter, A. Kroll*, D.R. Gilland*, D. Gonzalez-Trotter*, R.J. Jaszczak* Multiple Transmission Sources and Modeling the Axial Resolution of a Line Source. IEEE Transactions on Medical Imaging, vol. 21, no. 3, pp , [5] M. Chen*, J. Peter, R.J. Jaszczak*, D.R. Gilland*, J.E. Bowsher*, M.P. Tornai*, S.D. Metzler* Observer Studies of Cardiac Lesion Detectability with Triple-Head 360 Deg. Vs. Dual-Head 180 Deg. SPECT Acquisition Using Simulated Projection Data. IEEE Transactions on Nuclear Science, vol. 48, no. 4, pp , [6] S.D. Metzler*, J.E. Bowsher*, M.P. Tornai*, B.C. Pieper*, J. Peter, R.J. Jaszczak* SPECT Breast Imaging Combining Horizontal and Vertical Axes of Rotation. IEEE Transactions on Nuclear Science, vol. 49, no. 1, pp , [7] G. Brix*, M.E. Bellemann*, H. Hauser, J. Doll, Recovery- Koeffizienten zur Quantifizierung der arteriellen Inputfunktion aus dynamischen PET-Messungen: experimentelle und theoretische Bestimmung Nuklearmedizin, vol. 41, pp , [8] A. Werling, O. Bublitz, J. Doll, L. Adam*, G. Brix* Fast implementation of the single scatter simulation algorithm and its use in iterative image reconstruction on PET data Physics in Medicine & Biology, vol. 47, pp , [9] M.P. Tornai*, J.E. Bowsher*, C.N. Archer*, J. Peter, R.J. Jaszczak*, L.R. MacDonald*, B.E. Patt*, J.S. Iwanczyk* A 3D Gantry Single Photon Emission Tomograph with Hemispherical Coverage for Dedicated Breast Imaging. Nuclear Inst. and Methods in Physics Research A, vol. 497(1), pp , Interventionelle Verfahren M. Bock, B. Dillenberger, S. Ferrari, S. Müller, J. Sikora, R. Umathum, S. Volz, H. Zimmermann, S. Zühlsdorff In Zusammenarbeit mit: S. Delorme, C. Fink, G. van Kaick, H.-U. Kauczor, DKFZ; G. Kauffmann, P. Hallscheidt, Radiologische Universitätsklinik Heidelberg; W. Nitz, P. Speyer, H. Meyer, S. Thesen, Siemens Medical Solutions, Erlangen; B. Guttmann, T. Remmele, Innomedic GmbH, Herxheim; E. Hempel, H. Fischer, Forschungszentrum Karlsruhe; A. Mølgaard-Nielsen, William Cook Europe ApS, Bjaeverskov, Dänemark. In der interventionellen Radiologie werden Therapieformen verwendet, die im Vergleich zu konventionellen, offenen Operationen einen minimal-invasiven Zugang zum Zielorgan über Biopsienadeln oder Katheter suchen. In der Arbeitsgruppe Interventionelle Verfahren werden hierfür magnetresonanztomographische (MR) Verfahren entwickelt, die in der onkologischen, interventionellen Radiologie eingesetzt werden sollen. Da es schwierig ist, minimal-invasive Operationen an geschlossenen Hochfeld-MR-Tomographen durchzuführen, wurde die MR Tomographie bisher nahezu ausschließlich in der diagnostischen Radiologie eingesetzt. Die MR-Bildgebung bietet jedoch eine große Vielfalt an diagnostischen Informationen sowohl über die Gewebegestalt (Morphologie) als auch die Gewebefunktion, was sie zu einer idealen Bildgebungsmodalität für viele interventionelle Eingriffe machen würde. An einem speziell installierten 1,5 Tesla Ganzkörpertomographen wurden Techniken zur Durchführung von intravasalen interventionellen Eingriffen implementiert. Hierbei erfolgt der Eingriff mit Hilfe von Kathetern, die unter MR- Kontrolle durch die Blutgefäße zum Zielorgan vorgeschoben werden. Folgende Arbeitsbereiche wurden dabei behandelt: MR-Angiographie: Um für einen interventionellen Eingriff eine Übersicht über das Blutgefäßsystem zu gewinnen, wurden mit Hilfe schnel- Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie ler Messverfahren MR-Angiographiemessprotokolle entwikkelt, die den Transit eines Kontrastmittelbolus durch die Gefäße eines Patienten sichtbar machen können [1]. Ziel dieser Untersuchungen war es, mit einer einzigen Kontrastmittelgabe getrennt die arteriellen und venösen Blutgefäßsysteme [2-6] als auch die Blutversorgung der Organe darzustellen. Hierzu wurden im Tiermodell und am Patienten teilweise experimentelle Kontrastmittel verwendet, deren spezielle Eigenschaften (Intravasalität, Tumoraffinität, o.ä.) zur Darstellung und teilweise auch zur Quantifizierung der Gewebeperfusion eingesetzt wurden [7-11]. Interaktive, automatisierte Messsteuerung: Um dem Operateur die Steuerung des Eingriffs zu erleichtern [12], wurden aktive Katheter entwickelt, an deren Spitze sich kleine Hochfrequenzspulen befinden. Das Signal der Hochfrequenzspulen dient hierbei zur Lokalisation der Spulen und erlaubt die Messung der Katheterlage in Raum in nur wenigen Millisekunden. In Verbindung mit Echtzeitaufnahmetechniken konnte ein Bildgebungsverfahren implementiert werden, das mit einer Wiederholfrequenz von 3 Hz Bilder aus der direkten Umgebung des Katheters aufnimmt. Die Lage der Messschicht folgt dabei automatisch der Katheterbewegung. Über ein speziell entwickeltes Steuerinterface kann zur Laufzeit der Messung der Bildkontrast gewechselt werden, um beispielsweise den Durchfluss eines Kontrastmittelbolus zu beobachten [13-15]. Schließlich wurden auch schnelle Messverfahren zur Quantifizierung des Blutflusses in das Konzept integriert [16]. Hochfrequenzspulen: Um die Operationsinstrumente im Raum lokalisieren zu können, wurden spezielle Hochfrequenzspulen entwickelt. Diese Spulen wurden entweder als aktive Spulen mit direkter Verbindung zum MR-Tomographen ausgeführt, oder als induktiv gekoppelte Spulen, bei denen die Signalüberhöhung in einem Resonanzkreis ausgenutzt wird. Für aktive Spulensysteme wurden spezielle Vorverstärker konstruiert. Da eine leitende elektrische Verbindung zwischen Spule und Empfänger immer die Gefahr einer resonanten Einkopplung mit Wärmeentwicklung birgt, wurde alternativ ein optischer Sensor zur Positionsbestimmung entwickelt. Dieser Sensor misst mit Hilfe des Faradayeffektes die lokale Magnetfeldstärke im Tomographen, die gezielt durch das Schalten zusätzlicher Magnetfelder moduliert wird. Die verschiedenen Techniken wurden in Tierexperimenten am Versuchsschwein evaluiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine vollständig MR-geführte Nierenembolisation in nur wenigen Minuten mit geeigneten MR-Kathetern durchgeführt werden kann [17]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Amann M, Bock M, *Floemer F, Schoenberg SO, Schad LR. Three-dimensional spiral MR imaging: Application to renal multiphase contrast-enhanced angiography. Magnetic Resonance In Medicine (2002) 48: [2] Eichhorn J*, Fink C, Bock M, Delorme S, Brockmeier K*, Ulmer HU*. Time-Resolved Three-Dimensional Magnetic Resonance Angiography in the Assessment of a Pulmonary Artery Sling in a Pediatric Patient. Circulation (2002) 106:E61-E62. [3] Fink C, Eichhorn J*, Bock M. Images in cardiology - Pulmonary arteriovenous malformation and aortopulmonary collateral imaged by time resolved contrast enhanced magnetic resonance angiography. Heart (2002) 88:

286 286 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [4] Fink C, Schmaehl A*, Bock M, Tuengerthal S*, Delorme S. Pulmonary Vein Stenosis After Radiofrequency Ablation for Atrial Fibrillation: Image Findings with Multiphasic Pulmonary Magnetic Resonance Angiography. Circulation (2003) 107: [5] Grau AJ*, Schoenberg SO, Lichy C, Buggle F*, Bock M, Hacke W*. Lack of evidence for pulmonary venous thrombosis in cryptogenic stroke - A magnetic resonance angiography study. Stroke (2002) 33: [6] Fink C, Bock M, Kiessling F, Delorme S. Interstitial Magnetic Resonance Lymphography with Gadobutrol in Rats: Evaluation of Contrast Kinetics. Investigative Radiology (2002) 37: [7] Aumann S, Schoenberg SO, Just A*, Briley-Saebo K*, Bjornerud A*, Bock M, Brix G*. Quantification of Renal Perfusion Using an Intravascular Contrast Agent (Part 1): Results in a Canine Model. Magnetic Resonance In Medicine (2003) 49: [8] Schoenberg SO, Aumann S, Just A*, Bock M, Knopp MV*, Johansson LO*, Ahlstrom H*. Quantification of renal perfusion abnormalities using an intravascular contrast agent (Part 2): results in animals and patients with renal artery stenosis. Magnetic Resonance In Medicine (2003) 49: [9] Kiessling F, Fink C, Hansen M*, Bock M, Sinn H, Schrenk HH*, Krix M, Egelhof T*, Fusenig NE, Delorme S. Magnetic resonance imaging of nude mice with heterotransplanted high-grade squamous cell carcinomas: use of a low-loaded, covalently bound Gd- HSA conjugate as contrast agent with high tumor affinity. Investigative Radiology (2002) 37: [10] Knopp MV, Schoenberg SO, Rehm C, Floemer F*, von Tengg-Kobligk H, Bock M, Hentrich HR*. Assessment of Gadobeate Dimeglumine (Gd-BOPTA) for MR Angiography: Phase I Studies. Investigative Radiology (2002) 37: [11] Wacker CM*, Wiesmann F*, Bock M, Jakob P*, Sandstede JJW*, Lehning A*, Ertl G*, Schad LR, Haase A*, Bauer WR*. Determination of regional blood volume and Intra-extracapillary water exchange in human myocardium using feruglose: First clinical results in patients with coronary artery disease. Magnetic Resonance In Medicine (2002) 47: [12] Bock M. Interventionelle Magnetresonanztomographie (Editorial). Zeitschrift für Medizinische Physik (2002) 12:1. [13] Bock M, Volz S, Zühlsdorff S, Umathum R, Fink C, Hallscheidt P, Semmler W. Automatische Schichtverfolgung in der interventionellen Magnetresonanztomographie. Zeitschrift für Medizinische Physik (2003) 13: [14] Bock M, Volz S, Zühlsdorff S, Umathum R, Fink C, Hallscheidt P, Semmler W. MR-Guided intravascular procedures: Real-time parameter control and automated slice positioning with active tracking coils. Journal of Magnetic Resonance Imaging (2004) 19: [15] Zühlsdorff S, Umathum R, Volz S, Hallscheidt P, Fink C, Semmler W, Bock M. MR Coil Design for Simultaneous Tip Tracking and Curvature Delineation of a Catheter. Magnetic Resonance In Medicine (im Druck). [16] Volz S, Zühlsdorff S, Umathum R, Hallscheidt P, Fink C, Semmler W, Bock M.Semiquantitative fast flow velocity measurements using catheter coils with a limited sensitivity profile. Magnetic Resonance in Medicine (2004) 72: [17] Fink C, Bock M, Umathum R, Volz S, Zühlsdorff S, Grobholz R*, Hallscheidt P. Renal Embolization: Feasibility of MR-Guidance Using Active Catheter Tracking and Intra-Arterial MR Angiography. Investigative Radiology (im Druck). Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie Das Ziel der laufenden dosimetrischen Untersuchungen ist der Nachweis, dass ein speziell formulierter Bor-10-Träger unter praktisch relevanten dosimetrischen Bestrahlungsbedingungen in vivo eine merkliche Steigerung der biologischen Strahleneffekte schneller Neutronen bewirken kann. Das grundlegende pharmakologische Problem maximaler Aufnahme eines Bor-10-Präparates im Kern von Krebszellen wird in der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie, AG Biologie (K. Braun) bearbeitet. Das dort entwickelte Trägersystem kann die Zell- und Kernmembran überwinden, und damit den Strahleneffekt der Bor-10-Zerfallsprodukte in die unmittelbare Nachbarschaft der DNA verlegen, welche das wesentliche Ziel strahlentherapeutischer Interventionen darstellt. Erste Versuche in vitro an HeLa-S-Zellen, die zurzeit verifiziert und erweitert werden, haben gezeigt, dass nach 1,5 Gy schnellen Neutronen im Moderator in Verbindung mit den dort entstehenden langsamen Neutronen ein deutlicher zusätzlicher Effekt auf das Überleben der Zellen zu beobachten ist (Überlebensrate S = 0% mit Bor-10 gegenüber S = 20% ohne Bor-10). In einem zylindrischen Plexiglasphantom wurden die Dosis der schnellen Neutronen mit einer gewebeäquivalenten Ionisationskammer sowie die Fluenzen der in wasserstoffhaltigem Material moderierten Neutronen mit der Gold-Cadmium-Methode in Abhängigkeit von der Tiefe im Phantom der Neutronenenergie und der Größe des Neutronenfeldes gemessen. Aus dem Quotienten F = Thermische Fluenz pro Gray Dosis zusammen mit der Bor-10-Konzentration im Zielgebiet lässt sich die zusätzliche BNC-Dosis abschätzen. Als Ergebnis zeigt sich, dass sowohl die Dosis der schnellen als auch die Fluenz der langsamen Neutronen mit der Feldgröße ansteigen und zwar so, dass der Parameter F ebenfalls eine steigende Funktion der Feldgröße wird. Neutronendosimetrie G. Wolber In Zusammenarbeit mit: P. Peschke, K. Braun, J. Schuhmacher, H. Hauser, H. Wesch DKFZ Die in früheren Berichten begründeten Arbeiten zur Untersuchung der strahlenphysikalischen und biologischen bzw. pharmakologischen Grundlagen einer Bor-Neutronen- Einfang-Therapie (BNCT = Boron Neutron Capture Therapy) mit schnellen Neutronen stehen vor dem Abschluss. Abb. 1: Abhängigkeit der Messgrößen Dosis D der schnellen Neutronen, thermischer Fluss φth und des Parameters F = φth/d vom Feldumfang Das heißt umgekehrt, dass gerade bei kleinen Feldern, die im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung günstig sind, der Beitrag der langsamen Neutronen zur lokalen Gesamtdosis suboptimal erscheint. Es wird daher sehr auf die Effektivität des Bor-10-Präparates ankommen, ob diese therapeutische Modalität auch

287 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E020 Medizinische Physik in der Radiologie unter ungünstigen physikalischen Bedingungen praktisch, d. h. klinisch relevant wird. Die strahlenbiologischen Untersuchungen werden zurzeit zur Verifikation wiederholt und anschließend mit Blick auf das Verhalten in vivo (Spezifität, Toxizität, Organverteilung) fortgesetzt. Molekulare Diagnostik F. Kiessling, M. Le-Huu, F. Spieker, R. Sun, J. Dittrich, J. Moll Das Ziel der im Aufbau befindlichen Arbeitsgruppe Molekulare Diagnostik ist die Entwicklung krankheitsspezifischer Kontrastmittel und die Erforschung pathophysiologischer Vorgänge im Mikromilieu durch nicht-invasive bildgebende Diagnostik, insbesondere für optische Verfahren und die Magnetresonanz-Tomographie. Hierbei stehen neben einer funktionellen Untersuchung der Tumorvaskularisation (Angiogenese), molekulare Besonderheiten von Tumoren, die über hochspezifische Kontrastmittel nicht-invasiv dargestellt werden, im Vordergrund. Die entwickelten Kontrastmittel und Verfahren sollen es ermöglichen kleinste Metastasen aufzufinden und die Eigenschaften von Tumoren und Metastasen, wie zum Beispiel den Grad der Malignität ohne weitere Biopsien schon bei den ersten radiologischen Untersuchungen bestimmen zu können. Auf der Basis dieser bildgebenden Feindiagnostik soll die optimale Therapieform ausgewählt werden können. Im April 2003 hat Herr Kießling die Arbeitsgruppe übernommen. Unterstützt durch intensive Kooperationen innerhalb des DKFZ (Prof. Norbert Fusenig, Prof. Herrmann- Joseph Gröne) wurde in vitro mit der Markierung verschiedener Zellen für die MRT begonnen. Erste erfolgversprechende Ergebnisse wurden mit Progenitorzellen, Leukozyten und Fibroblasten erzielt, die mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln markiert wurden. Auch im Tierexperiment gelang es bereits die Wanderung markierter Progenitorzellen in Leber, Knochenmark, Milz und Tumoren zu verfolgen. Eine erste Patientenstudie ist in Vorbereitung und bereits durch die lokale Ethikkomission bewilligt. Im nächsten Jahr ist die Einrichtung eines Chemielabors vorgesehen, so dass dann auch Zell-spezifische Kontrastmittel synthetisiert werden können, die nach in vivo Applikation an die Zielzellen binden sollen. Die zweite Arbeitsrichtung ist die Erforschung der Konsequenzen der Angiogenese auf die Durchblutung und Gefäßpermeabilität maligner Tumoren. In dem vergangenen Jahr wurden hierfür in Kooperation mit der Abteilung Carcinogenese und Differenzierung und der Abteilung für Radiologie des DKFZ dynamische MR- und Ultraschall-Verfahren optimiert [1, 2, 3, 4, 5]. Die Verfahren wurden dann zur Verlaufsbeobachtung antiangiogener Therapien im Tiermodell erfolgreich eingesetzt [5, 6]. Es konnte gezeigt werden, dass Veränderungen an der Vaskularisation der experimentellen Tumoren vor deren Größenänderung fassbar sind, was in der geplanten klinischen Umsetzung eine verbesserte Individualisierung der Therapien (z.b. frühzeitigere Beurteilung des Therapieansprechens und Adaptierung der Therapeutikadosis) ermöglichen kann. Abb. 1: Berliner-Blau Eisenfärbung von mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) beladenen humanen Fibroblasten (links) und immortalisierten Ratten-Progenitorzellen (rechts). In der Mitte sind T2 gewichtete MR-Bilder von gewaschenen Pellets dieser Zellen gezeigt. Die Zellen wurden vorher mit unterschiedlichen Dosen von SPIO inkubiert. Man sieht abhängig von der SPIO-Konzentration während der Inkubation eine Abnahme der Signalintensität im Zell-Pellet als Zeichen für die dosisabhängige SPIO-Aufnahme. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kiessling F., Heilmann M., Vosseler S., Lichy M., Krix M., Fink C., Kiessling I., Schad L., Fusenig N.E., Delorme S.: Dynamic T1- weighted Monitoring of Vascularization in Human Carcinoma Heterotransplants by Magnetic Resonance Imaging. Int J Cancer 104 (2003) [2] Kiessling F., Krix M., Heilmann M., Vosseler S., Lichy M., Fink C., Farhan N., Kleinschmidt K., Schad L., Fusenig N.E., Delorme S: Comparing dynamic parameters of tumor vascularization in nude mice revealed by MRI and contrast enhanced intermittent power Doppler sonography. Invest Radiol 38 (2003) [3] Kiessling F., Lichy M., Grobholz G.*, Heilmann M., Huber P., Meding J., Peschke P., Kauczor H.-U., Schlemmer H.-P: Hämodynamische und metabolische Charakterisierung orthotoper Prostatakarzinome der Ratte mittels dynamischer MRT und Protonen- MR-Spektroskopie. Radiologe 43 (2003) [4] Krix M., Kiessling F., Farhan N., Schmidt K.*, Hoffend J.*, Delorme S.: A multivessel model describing replenishment kinetics of ultrasound contrast agent for quantification of tissue perfusion. Ultrasound Med Biol 29 (2003) [5] Kiessling F., Huber P.E., Grobholz R.*, Heilmann M., Meding J., Lichy M.P., Fink C., Krix M., Peschke P., Schlemmer H.P.: Dynamic magnetic resonance tomography and proton magnetic resonance spectroscopy of prostate cancers in rats treated by radiotherapy. Invest Radiol 39 (2004) [6] Krix M., Kiessling F., Vosseler S., Farhan N., Mueller M.M., Bohlen P.*, Fusenig N., Delorme S: Sensitive Non-invasive Monitoring of Tumor Perfusion during Antiangiogenic Therapy by Intermittent, Bolus-Contrast Power Doppler Sonography. Cancer Res: im Druck [7] Kiessling F., Farhan N., Lichy M., Vosseler S., Heilmann M., Krix M., Bohlen P.*, Miller D.W., Mueller M.A., Kauczor H.U., Fusenig N.E., Delorme S.: Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging rapidly indicates vessel regression in human squamous cell carcinomas grown in nude mice caused by VEGF receptor 2 blockade with DC101. Neoplasia 6 (2004)

288 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie Abteilung Radiopharmazeutische Chemie (E030) Leiter: Prof. Dr. rer. nat Michael Eisenhut (kommissarisch) 288 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Joseph Eisenbarth Dr. Matthias Gilbert (- 7/03) Dr. Jochen Schuhmacher Dr. Hannsjörg Sinn (- 8/03) Dipl. Chem. Klaus Weber Priv. Doz. Dr. Andreas Wunder Doktoranden Apotheker Markus Wolf (5/02-) Qin Wang (- 5/03) Gastwissenschaftler Dr. Claudia Bauer (4/02-) Technische Angestellte Ulrike Bauder-Wüst (1/02-) Gertrud Golz (- 6/03) Harald Hauser Heike Marx Ronald Matys Armin Runz Hans-Hermann Schrenk (-1/03) Ulrike Wagner-Utermann Martin Schäfer (FH-Praktikant, 9/03-) Sascha Endres (FH-Praktikant, 1-9/02) Nicole DiGallo (Azubi,- 6/01) Bettina Helfert (Azubi, 7/02-) Stefan Rahn (Azubi, 9/02-) Sekretariat Angela Celso In der Abteilung Radiopharmazeutische Chemie werden Arzneimittel entwickelt, die für die Tumordiagnostik und Tumortherapie verwendet werden können. Die weitergehende präklinische und klinische Prüfung von neuentwickelten Radiopharmaka wird in Zusammenarbeit mit der Klinischen Kooperationseinheit Nuklearmedizin durchgeführt (siehe E060). Die Single Photon Emission Tomography (SPECT) und die Positron Emission Tomography (PET) sind bildgebende Verfahren, welche physikalisch kurzlebige Radioisotope gekoppget mit speziellen Trägermolekülen im Körper ortsaufgelöst nachweisen. Die radiomarkierten Trägermoleküle ermöglichen die Anreicherung in z.b. Tumorgewebe und damit die Aufkonzentrierung der anhängenden Radioisotope. Beide Teile, die Radiosotopenproduktion und die Synthese von geeigneten Trägermolekülen, setzen sehr unterschiedliche Arbeitstechniken voraus. Für die eigene Herstellung von Radioisotopen (hier ausschließlich Positronenstrahler) wird ein Zyklotron eingesetzt (siehe auch E020). Die Entwicklung von Trägersubstanzen wird in chemischen Syntheselabors durchgeführt. Die Zusammenführung von beiden Verfahren, die dann zu sogenannten Radiopharmaka führen sollen, findet in speziell ausgerüsteten Laboratorien statt (Strahlenschutzbereich, Reinraum). Die Anwendung neuer Studienpräparate am Patienten ziehen umfangreiche Vorarbeiten nach sich. Zuerst ist ein Genehmigungsverfahren bei der für die Herstellung aufsichtsführenden Behörde zu durchlaufen. Gleichzeitig müssen durch die Medizin Genehmigungsverfahren für die Durchführung klinischer Studien auf den Weg gebracht werden (E060). Die Zeitdauer bis zur Genehmigung beträgt erfahrungsgemäß zusammen ca Monate. Zur Bearbeitung der hier genannten Aufgaben und wissenschaftlichen Projekte sind vier Arbeitsgruppen aktiv: Gruppe Funktion Leiter E0301 Radiopharmazie Dr. J. Eisenbarth und K. Weber E0302 Immundiagnostika Dr. J. Schuhmacher E0303 Wirkstoff-Transporter Prof. M. Eisenhut E0304 Neue Radiopharmaka Prof. M. Eisenhut Die Radiopharmakaherstellung wird unter der Verantwortung von Herstellungsleiter und Kontrolleiter nach GMP- Richtlinien durchgeführt. In diesem Zusammenhang sind die umfangreichen Validierungen von Herstellungs- und Qualitätskontroll-Verfahren zu nennen, die für die Zulassung von [ 18 F]FDG aber auch für andere Studienpräparate notwendig sind. Hierzu gehören detaillierte Dokumentationen, die den Herstellungsverfahren behördlich geforderte Kontrollstrukturen verleiht. Die Vision P. Ehrlichs, Antikörper als Magic Bullet bei der Behandlung von Tumorerkrankungen verwenden zu können, wurde von der Nuklearmedizin auch für die onkologische Diagnostik und Therapie aufgegriffen. Die Verwendung von Antikörpern und Antikörperfragmenten als Trägermoleküle von Radioisotopen einzusetzen, hat in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte gemacht. Nach der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern steht jetzt die Entwicklung und Anwendung rekombinanter Antikörper im Vordergrund. Gekoppelt mit dem sogenannten Pretargeting-Verfahren sind interessante Arbeiten entstanden, die klinische Anwendungen auch auf dem therapeutischen Anwendungsgebiet ermöglichen können. Pretargetingstrategien werden insbesondere mit dem Generatorisotop 68 Ga verfolgt. Außerdem sind im Rahmen von klinischen Prüfungen 68 Ga markierte Peptide im Einsatz. Die Entwicklung von Trägermolekülen, die über spezifische Anreicherungsmechanismen Radioisotope in Tumorzellen einschleusen, gehört zum Prinzip der nuklearmedizinischen Diagnostik. So ist es nicht verwunderlich, dass aus diesem Forschungsfeld Entwicklungsarbeiten entspringen, die sich mit dem Transport von Wirkstoffen beschäftigen. Erleichternd für diese Forschung kommt die Möglichkeit hinzu, Trägermoleküle zusätzlich mit Radioisotopen zu markieren, um Informationen über die In-Vivo-Eigenschaften der Neuentwicklungen zu erhalten. Ein Projekt, das zu diesem Themenbereich gehört, ist die Verwendung von rezeptoraffinen Peptiden als Transporter von Oligodeoxynukleotiden (ODN). Die Aufnahme in Tumorzellen führt über die rezeptorvermittelte Endozytose zu der ansonsten nur in geringem Umfang stattfindenden Aufnahme von ODN s. Zu dem Thema Neue Radiopharmaka zählen Arbeiten über die Synthese neuer Nucleoside als Proliferationsmarker von Tumoren. Hier wurden insbesondere neue Markierungsvorläufer synthetisiert, die zur automatisierten Herstellung des neuen Radiopharmakons eingesetzt werden sollen. Schließlich hat für die Behandlung von Tumoren der programmierte Zelltod (Apoptose) eine immer deutlicher erkennbare Funktion. Deshalb wird die Bildgebung dieses zellbiologischen Vorgangs mit der Entwicklung von radiomarkierten Verbindungen angegangen.

289 Radiopharmazie (E0301) Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie J. Eisenbarth, K. Weber, H. Marx, A. Runz, U. Wagner-Utermann Kooperationen: U. Haberkorn, L. Strauss, J. Debus, alle DKFZ Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt in der Versorgung der Nuklearmedizin mit Tracersubstanzen für die Positronenemissionstomographie (PET). Im onkologischen Bereich ist PET von hohem Informationsgehalt bezüglich der Tumorbzw. Metastasenfindung, Tumorstaging, Therapieverlaufskontrolle und Rezidiv- bzw. Narbenbeurteilung nach operativen und strahlentherapeutischen Eingriffen. Auch außerhalb des onkologischen Bereichs hat PET ein breites Anwendungsspektrum, z.b. in der Kardiologie, Neurologie und Psychiatrie. Je nach klinischer Fragestellung kommen unterschiedliche Tracer zum Einsatz. Hierbei muss zwischen sogenannten zugelassenen Arzneimitteln und Studienpräparaten unterschieden werden. Allen Herstellungsverfahren unterliegen GMP und GLP -Richtlinien, wie sie z. B. in der Betriebsverordnung für pharmazeutische Unternehmen vorgeschrieben werden. Zur Erfüllung dieser Richtlinien sind extrem hohe Anforderungen bezüglich der mikrobiologischen Überwachung sowohl der Produktionsstätte als auch des Herstellungsprozesses, des Endproduktes und des Herstellungspersonals zu erfüllen. Die Qualitätskontrolle und Prozessdokumentation werden ebenfalls nach gesetzlichen Vorgaben durchgeführt (Betriebsverordnung, AMG). Die Einhaltung dieser Qualitätsstandards wird von dem zuständigen Regierungspräsidium überwacht. Es kommt bei den von uns hergestellten Radiopharmaka erschwerend hinzu, dass die Haltbarkeit bzw. Verwendbarkeit der Arzneimittel durch die Nuklid-Halbwertszeiten von 3 bis 108 Minuten stark eingeschränkt ist. Außerdem sind Richtlinien für den Strahlenschutz zu beachten, welche die Strahlenbelastung des Herstellungspersonals so gering wie möglich halten soll. Um alle Auflagen erfüllen zu können, wurde unter hohem Kosten- und Personalaufwand ein Produktionsreinraum und ein Abfüllraum der Klasse C gebaut, der mit pharmazeutischen Isolatoren der Klasse A ausgestattet ist. In diesem Reinraum werden die PET-Radiopharmaka 2 -[ 18 F]-fluoro- 2 -deoxy-d-glucose ([ 18 F]FDG) und 3 -deoxy-3 -[ 18 F]- fluoro-thymidin ([ 18 F]FLT) hergestellt. Ein Großteil der Arbeiten dieser Gruppe bestand in der Antragstellung für eine Zulassung von [ 18 F]FDG beim Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM, Bonn). Dieser Aufwand war nötig geworden, weil die Abgabe von [ 18 F]FDG nicht mehr für Studienzwecke genehmigt wurde. Obwohl eine Herstellungsgenehmigung vorhanden war, mussten neben der Aufstellung umfangreicher Dokumentationen über das Produkt, eine Vielzahl experimentell nachzuweisender Validierungen von Herstellungs- und Qualitätskontroll-Verfahren durchgeführt werden. Das Volumen des Antrags belief sich auf 20 Ordner. Hier wird deutlich, dass der Gesetzgeber zur Vereinfachung der Zulassung von Radiopharmaka für ausschließlich eigene Anwendung aktiv werden muss. Die Forschungsaktivitäten konzentrierten sich auf die Synthese von Vorläufersubstanzen, deren stereoselektive Markierung mit [ 18 F]F - das 3 -deoxy-3 -[ 18 F]fluoro-thymidin ([ 18 F]FLT), einen viel versprechenden neuen Proliferationsmarker ergibt [1]. Im Zuge dieser Arbeiten wurden eine große Anzahl von Vorläufermolekülen synthetisiert, bspw. 5 -O-Dimethoxytrityl-O 2,3 -cyclothymidin, 3-N-Boc Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie 1-(5-O-(4,4 -dimethoxytrityl)-3-o-nosyl-2-deoxy-b-dlyxofuranosyl)thymin und 1-(3 -O-mesyl-2,5 -anhydro-b-dlyxofuranosyl)thymin [2]. Bisher konnte [ 18 F]-FLT mit diesen Precursoren in einer radiochemischen Ausbeute von 18% (EOB) erhalten werden. Das Verfahren wurde für die anstehenden klinischen Studien auf einen automatisierten Syntheseprozess umgestellt. Die Reinigung von bestrahltem [ 18 O]Wasser wird routinemäßig durch Destillation in Anwesenheit von KMnO 4 /NaOH durchgeführt. Diese Methode beseitigt die organisch chemischen Verunreinigungen nicht vollständig, so dass Probleme bei der Wiederverwendung des wertvollen [ 18 O]H 2 O auftreten. Es wurde eine elektrolytische Reinigungsmethode entwickelt, die eindrucksvolle Ergebnisse zeigte. Nach Bau einer automatisierten Anlage wurde die Apparatur für die Routine in Betrieb genommen [3]. Ein weiterethema war die Darstellung von markierungsfähigen Nucleosiden wie den 5-(2-radiohaloethyl)- und den 5- (2-radiohalovinyl)-2 -deoxyuridinen bzw. den in vivo metabolisch stabileren 2 -fluoro-2 -deoxyanaloga. Diese Substanzklasse sollten als Reportertracer in der Gen-Therapie mit dem Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase Suizidsytem (HSV-Tk) eingesetzt werden. Dabei wird als Prodrug eine Pyrimidinbase, die mit einer funktionellen Gruppe modifiziert ist (z.b. Ganciclovir), durch HSV-Tk und zelluläre Kinasen zum antimetabolisch-wirkenden Agens aktiviert. Dieser Vorgang führt dann zum Absterben der Zelle. Dasselbe geschieht mit dem Reportertracer, der, metabolisch eingefangen, Informationen über den Transfektionsgrad der Gentherapie liefert [4-6]. Publikationen (*= externer Koautor) [1] W. Mier*, U. Haberkorn, M. Eisenhut. Editorial: [ 18 F]FLT; Portrait of a Proliferation Marker. Eur J Nucl Med. 2002; 29: [2] S.J. Martin, J.A. Eisenbarth, U. Wagner-Utermann, W. Mier*, M. Henze, H. Pritzkow*, U. Haberkorn, M. Eisenhut. A new precursor for the radiosynthesis of [ 18 F]FLT.Nucl Med Biol, 2002; 29: [3] K. Weber, H. Marx, J. Vierling, U. Wittstadt*, M. Eisenhut. Electrolytic purification of [ 18 O]water. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S279, [4] Nader MW, Oberdorfer F. Syntheses of [carbonyl- 11 C]2-(2- benzoylphenoxy)-n-phenylacetamide from [ 11 C]carbon monoxide by the Suzuki and the Stille reactions. Appl Radiat Isot Nov;57(5): [5] Yu CS, Oberdorfer F. Synthesis of a novel aldehyde: 4-O-methyl-5-formylmethyl-2'-deoxyuridine. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003;22(1): [6] Yu CS, Eisenbarth J, Runz A, Weber K, Zeisler S., Oberdorfer F. Syntheses of 5-(2-radiohaloethyl)- and 5-(2-radiohalovinyl)-2 - deoxyuridines. Novel types of radiotracer for monitoring cancer gene therapy with PET. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: 421, Gallium-68 Peptiddiagnostika (E0302) J. Schuhmacher, H. Hauser, R. Matys Kooperationen: Priv.-Doz. Dr. S. Kaul, Prof. Dr. G. Bastert, Universitäts-Frauenklinik; Prof. Dr. H. Mäcke, Abt. für Nuklearmedizin, Kantonsspital Basel; Dr. S. Froidevaux, Prof. Dr. A. Eberle, Abt. für Endokrinologie, Kantonsspital Basel; Dr. M. Henze, Prof. Dr. U. Haberkorn, Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060), Dr. P. Peschke (E050). Von entscheidender Bedeutung für eine effektive nuklearmedizinische Tumordiagnostik und Therapie ist die Anwendung spezifischer, radioaktiv markierter Tracer mit hoher Anreicherung im Zielgewebe bei gleichzeitig schneller 289

290 290 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Ausscheidung der Radioaktivität aus den Normalgeweben. Als geeignete Trägermoleküle für eine radioaktive Markierung haben sich regulatorische, niedermolekulare Peptide erwiesen, die sich selektiv an Tumorzellen mit den entsprechenden Rezeptoren binden. Bei den bildgebenden Verfahren in der nuklearmedizinischen Diagnostik nimmt die Positronenemissionstomographie auf Grund ihrer hohen Empfindlichkeit, ihrer Option zur quantitativen Bestimmung der Aktivitätsverteilung sowie ihrer guten Kontrast- und Ortsauflösung eine besondere Stellung ein. Mit Positronenstrahlern markierte Peptide erscheinen deshalb als erfolgversprechende Radiotracer für eine spezifische Tumordiagnostik mit PET. Unsere Ansätze für die Darstellung von Tumoren mit PET basieren auf Gallium-Chelatkomplexen, die sich durch eine hohe In-Vivo-Stabilität auszeichnen. Diese Komplexe können gebunden an proteolysestabile Peptidhormonanaloga zum Targeting von Tumoren eingesetzt werden. Zur Markierung dieser Komplexe stehen zwei Radionuklide zur Verfügung: Gallium-67 - ein Gammastrahler mit 78 h Halbwertszeit - und Gallium-68 - ein Positronenstrahler mit 68 min Halbwertszeit. Gallium-68 wird durch Elution eines langlebigen Germanium-68/Gallium-68 Radionuklidgenerators hergestellt und ist damit über einen langen Zeitraum permanent verfügbar. Rezeptordarstellung neuroendokriner Tumoren mit PET Viele Tumoren neuroendokrinen Ursprungs wie das Pankreas-Ca, Meningiome, kleinzellige Bronchial-Ca oder Karzinoide zeigen eine stark erhöhte Expression von Somatostatinrezeptoren. Somatostatin ist ein zyklisches Peptidhormon aus 14 Aminosäuren und wird von neuroendokrinen Zellen sezerniert. Es beeinflusst das zentrale Nervensystem, den Hypothalamus und den Gastrointestinal- Trakt. Darüber hinaus wirkt es inhibitorisch auf die Produktion des Wachstumshormons Somatotropin und besitzt damit eine antiproliferative Wirkung auf rezeptor-positive Tumoren. Als Therapeutikum ist Somatostatin jedoch auf Grund seines raschen enzymatischen Abbaus im Blut ungeeignet und wurde deshalb durch ein Analogon, das wesentlich stabilere Oktapeptid Octreotide, ersetzt. Octreotide besitzt eine hohe Bindungsaffinität für die Typ II und V Somatostatin-Rezeptoren und wird deshalb mit Indium-111-DTPA markiert zum spezifischen Nachweis endokriner Tumoren in der nuklearmedizinischen Diagnostik eingesetzt. Ein Nachteil dieser Methode ist ihre geringe Sensitivität beim Nachweis kleinerer Tumoren (< 2,5 cm), die durch die Verwendung des Gammastrahlers Indium-111 und die damit verbundene Bildgebung mit konventionellen Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie Gammakameras bedingt ist. Durch Kopplung des makrozyklischen Komplexbildners DOTA an Octreotide entsteht ein Peptidkonjugat (DOTA-Octreotide), das neben Indium-111 mit einer Vielzahl anderer metallischer Radionuklide markiert werden kann. Wir haben eine schnelle Methode zur Markierung des DOTA- Octreotide mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Gallium- 68 entwickelt, die > 80% Markierungsausbeute und eine hohe spezifische Aktivität von ca. 20 MBq 68 Ga/mg Peptid liefert. 68 Ga-DOTA-Octreotide zeigt eine hohe In-Vivo-Stabilität und auf Grund seiner hydrophileren Eigenschaften eine schnellere Clearance von nichtgebundenem Peptid als das 111 In-DTPA-Octreotide. In einer ersten klinischen Studie werden durch die Klinische Kooperationseinheit (E060) 200 Patienten mit Meningiomen und Karzinoiden untersucht, dabei liefert die PET-Szintigraphie ab 60 min p.i. kontrastreiche Darstellungen auch kleinerer Läsionen von 7-8 mm Durchmesser (Abb. 1). Rezeptordarstellung von Melanomen mit PET a-melanozyten stimulierendes Hormon (a-msh) ist ein Tridekapeptid, das mit hoher Affinität an Melanocortin-Rezeptoren des Typs MC-1 bindet. MC-1 ist einer von insgesamt 5 Rezeptorsubtypen und wird überwiegend von Melanozyten in der Basalschicht der Epidermis exprimiert Abb. 1: PET-Aufnahme eines 31- jährigen Patienten nach Resektion eines neuroendokrinen Tumors der rechten Niere. Die Pfeile zeigen bis dato unbekannte Metastasen. Abb. 2: Coronale und transversale PET-Aufnahmen von Mäusen mit subkutan in die rechte Flanke transplantierten B16 F1 Melanomen 1 h nach Injektion von 68 Ga a-msh (4-11).

291 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie und kontrolliert die Pigmentierung der Haut. Auf Grund der erhöhten MC-1 Expression beim malignen Melanom könnten a-msh Analoga als spezifische Tracer eine große klinische Bedeutung für die Diagnostik und Therapie, insbesondere von Fernmetastasen, erlangen. In Zusammenarbeit mit der Abteilung für Endokrinologie des Kantonspitals Basel wurde ein neues a-msh Analogon [Nle 4, Asp 5, D-Phe 7, Lys 11 (DOTA)] - a-msh (4-11), das nach einem ähnlichen Schema wie das DOTA-Octreotide mit 68 Ga markiert werden kann, tierexperimentell untersucht. Biokinetische Verteilungsstudien an tumortragenden Mäusen zeigten eine rasche und hohe Tumoranreicherung des 68 Ga a-msh 4-11 bei gleichzeitig schneller renaler Clearance, so dass Tumor-zu-Blut Quotienten von ³ 15 bereits 1 Stunde nach Applikation erreicht wurden (Abb. 2). Auf Grund seiner geringen Radioaktivitätsretention in den Nieren erscheint dieses Peptid auch für eine therapeutische Anwendung mit Radionukliden geeignet. Rezeptordarstellung GRP-positiver Tumoren mit Bombesin und PET Bombesin (BN) ist ein amphibisches Neuropeptid, das aus 14 Aminosäuren besteht und ebenso wie das säugetierspezifische Gastrin Releasing Peptide (GRP) an humane GRP- Rezeptoren bindet. Neben seiner physiologischen Wirkung auf das ZNS und seiner ebenfalls rezeptorvermittelten Steuerungsfunktion auf die Ausschüttung gastrointestinaler Hormone wirkt BN als autokriner Wachstumsfaktor auf eine Reihe menschlicher Tumoren. Eine Überexpression des GRP- Rezeptors wurde insbesondere bei Pankreastumoren, kleinzelligen Lungen-Carcinomen, sowie dem Prostata- und bei einem großen Teil der Mamma-Carcinome festgestellt. In Zusammenarbeit mit der Abteilung für Nuklearmedizin des Kantonspitals Basel wurde ein neues BN Analogon das DOTA-DOO-BN (6-14) mit 67/68 Ga markiert und in der Zellkultur sowie im Nacktmaus-Modell untersucht. Die In-vitro-Daten zeigen eine hohe Bindungsaffinität (K a = 2 x 10 9 M -1 ) und eine schnelle, konzentrationsunabhängige Internalisierung des markierten Peptids verbunden mit einer nur langsamen Radioaktivitätsausscheidung aus der Zelle (t 1/2 ~15 h). Die Bioverteilung in tumortragenden Nacktmäusen zeigt neben der Anreicherung im Tumor auch eine rezeptorvermittelte Aktivitätsaufnahme im Pankreas und Darm, während Blut und allen anderen Organen nur eine geringe Aktivitätsretention aufweisen (Abb. 3). Trotz dieser erhöhten, physiologischen Aktivitätsverteilung sollten mit Hilfe der PET auch Metastasen im Abdominalbereich, insbesondere des Prostata-Carcinoms, nachweisbar sein. Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kowalski J, Henze M, Schuhmacher J, *Mäcke HR, *Hofmann M, Haberkorn U. Evaluation of positron emission tomography imaging using 68 Ga-DOTA-DPhe 1 -Tyr 3 -Octreotide in comparison to 111 In DTPAOC SPECT. First results in patients with neuro endocrine tumors. Molecular Imaging and Biology 2003;5: [2] *Froidevaux S, *Calame-Christe M, Schuhmacher J, *Tanner H, Saffrich R, Henze M, *Eberle AN. A Gallium labeled DOTA-a- Melanocyte-Stimulating Hormone analog for PET imaging of melanoma metastases. J Nucl Med 2004; 45: [3] Henze M, Schuhmacher J, Dimitrakopoulou-Strauss A, Strauss LG, *Mäcke HR, Eisenhut M, Haberkorn U. Exceptional increase of Somatostatin receptor expression in pancreatic neuroendocrine tumour visualized with 68 Ga-DOTATOC-PET: Eur J Nucl Med 2004, 31: 466. [4] Henze M, Herfarth K, Schlemmer H, Mohammed A, Mier W, Eisenhut M, Haberkorn U, Debus J, Hoffner S, Haufe S. PET and SPECT for detection of tumor progression in irradiated low-grade astrocytomas: An ROC analysis. J Nucl Med 2004,45: [5] Henze M, Mohammed A, Schlemmer H, Herfarth K, Mier W, Eisenhut M, Debus J, Haberkorn U. Detection of tumor progression in the follow-up of irradiated low grade gliomas: Comparison of Alpha-Methyl-L-Tyrosine- and 99m Tc-Sestamibi SPECT. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2002;29: [6] Henze M, Mohammed A, Mier W, Nollert J, Rudat V, Dietz A, Eisenhut M, Haberkorn U. Pretreatment Evaluation of the Hypopharynx and Larynx Carcinoma with 18 F-Fluorodeoxyglucose (FDG), 123 I-[Alpha]-Methyl-Tyrosine (IMT) and 99m Tc-Sestamibi (MIBI). Eur J Nucl Med 2002; 29: [7] Brix G*, Bellemann ME, Hauser H, Doll J. Recovery coefficients for the quantification of the arterial input functions from dynamic PET measurements: experimental and theoretical determinatio] Nuklearmedizin. 2002; 41(4): Wirkstofftransporter: HSA-Konjugate (E 0303) H. Sinn, A. Wunder, H.H. Schrenk Kooperationen: E. Frei, F. Kießling, T. Haase, U. Zillmann alle DKFZ; P. Kremer, Neurochirurgie, Univ. Heidelberg; T. Egelhof, Neuroradiologie Univ. Essen; M. Becker Augenklinik, Univ. Heidelberg; C. Fiehn, T. Möhler und R. Max, alle Univ. Heidelberg, Poliklinik V; G. Hartung III. Med. Klinik, Univ. Klinik Mannheim jetzt Univ. Rostock; G. Stehle I. Med. Klinik, Univ. Klinik Mannheim; E.H.K. Stelzer, EMBL Heidelberg; Industrie: Klinge Pharma GmbH, München; Orpegen, Heidelberg. Zusatzfinanzierung: Mittel aus dem Technologietransfer an die Fa. Klinge Pharma GmbH Ein Schwerpunkt in den Arbeiten auf dem Gebiet der Wirkstofftransporter lag in der Vergangenheit auf der Entwicklung neuer humaner Serum Albumin (HSA) Konjugate mit zytostatisch wirksamen Verbindungen. Nach der erfolgreichen Synthese von Methotrexat-HSA und dessen Einsatz bei experimentellen und klinischen Ansätzen wur- 291 Abb. 3: Coronale und transversale PET-Aufnahmen A R 42 J tumortragender Nacktmäuse 1 h nach Injektion von 68 Ga BN (6-14). Neben den Tumoren in der Flanke ist eine hohe Aktivitätsanreicherung im Pankreas sowie eine diffuse Aktivitätsverteilung im Abdominalbereich, hervorgerufen durch den Darm, sichtbar.

292 292 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie den kürzlich Aminopterin, cis-platin und Ellipticin an HSA ankonjugiert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen, solide Tumore mit Aminopterin-HSA zu behandeln, ergaben eine hohe Wirksamkeit dieses neuen Albumin-Konjugats [1]. Ein weiterer Ansatz ist die Nutzung von Fluoreszenzfarbstoff- Albumin Konjugaten zur diagnostischen Unterstützung des Neurochirurgen bei der Operation von Hirntumoren. Klinische Erprobungen zeigten eindrucksvoll das Potenzial dieser Verbindung in der Neurochirurgie. Daraus wurde eine Phase-I/II Studie mit Aminofluorescein-HSA entwickelt und in Heidelberg zur Genehmigung eingereicht. In den Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis reichert sich Methotrexat-HSA an. Im Vergleich zu Methotrexat allein zeigte das Methotrexat-HSA-Konjugat eine signifikant höhere Anreicherung in den entzündeten Bereichen bei geringerer Akkumulation in Leber und Nieren. Bei der Behandlung eines Arthritis-Tiermodells war das Konjugat daher wirksamer als Methotrexat allein. Es scheint daher ein interessantes Anti-Arthritis-Medikament vorzuliegen, das einer klinischen Prüfung bedarf [2 5]. HSA-Konjugate mit Metallkomplexen wurden als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Bildgebung (MR) hergestellt und im Tierexperiment getestet. Dazu gehört die Ermittlung biokinetischer Daten und Bestimmung der Organverteilung, die z.z. in Heidelberg und Essen durchgeführt werden. Ziel dieser Experimente ist es, kontrastreiche Darstellung solider Tumore, deren Metastasen und sogenannter Sentinel Lymphnodes. Letztgenannte sind Wächter- Lymphknoten, die den Lymphabfluss in der nächsten Nähe eines Tumors kontrollieren [6-9]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kremer P*; Hartung G*; Bauder-Wüst U; Schrenk HH; Wunder A; Heckel S; Zillmann U; Sinn H: Efficacy and tolerability of an aminopterin-albumin conjugate in tumor-bearing rats. Anti- Cancer Drugs, 13 (2002) [2] Fiehn C*, Wunder A, Krienke S*, Max R*, Ho AD*, Moehler T*: Lack of evidence for inhibition of angiogenesis as a central mechanism of the antiarthritic effect of methotrexate. Rheumatol Int Nov 15 [Epub ahead of print]. [3] Wunder A, Müller-Ladner U*, Stelzer EH*, Funk J*, Neumann E*, Stehle G*, Pap T*, Sinn H, Gay S*, Fiehn C*: Albumin-based drug delivery as novel therapeutic approach for rheumatoid arthritis. J Immunol May 1;170(9): [4] Fiehn C*, Neumann E*, Wunder A, Krienke S*, Ho AD*, Gay S*, Schölmerich J*, and Müller-Ladner U*: Methotrexate (MTX) and albumin-coupled MTX (MTX-HSA) suppress synovial fibroblast invasion and cartilage degradation in vivo. Ann. Rheum. Dis (in press) [5] Wunder A, Grimm J*, Müller-Ladner U*: Molecular imaging in rheumatoid arthritis. Z Rheumatol. 2003;62 Suppl 2:II33-II36. [6] Kiessling F; Fink C; Hansen M; Bock M; Sinn H; Schrenk HH; Krix M; Egelhof T; Fusenig NE; Delorme S: Magnetic resonance imaging of nude mice with heterotransplanted high-grade squamous cell carcinomas: Use of a low-loaded, covalently bound Gd- HSA conjugate as contrast agent with high tumor affinity. Investigative Radiology, 37 (2002) [7] Weigand M; Hartung G*; Roboz J*; Sieger S; Wolf M*; Sinn H; Schrenk HH; Wiessler M; Frei E: Anti-Cancer Drug Design, 16 (2002) [8] Grimm J*, Potthast A*, Wunder A, Moore A*: Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer Sep 20;106(5): Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie [9] Vajkoczy P*; Farhadi M*; Gaumann A*; Heidenreich R*; Erber R*; Wunder A; Tonn JC*; Menger MD*; Breler G*: Microtumor growth initiates angiogenic sprouting with simultaneous expression of VEGF, VEGF receptor-2, and angiopoietin-2. Journal of Clinical Investigation, 109(6) (2002) Neue Radiopharmaka (E0304) M. Eisenhut, J. Eisenbarth, K. Weber, U. Wagner- Utermann, C. Bauer, M. Wolf, Q. Wang, M. Gilbert Kooperationen: U. Haberkorn, P. Krammer, H. Weyd DKFZ; W. Mier und A. Mohammed, Univ.-Klinikum Heidelberg; A. Mahmood, A. Jones, M. Friebe, Harvard Medical School, Boston, USA; M. Little, S. Knackmuss, Affimed Therapeutics AG, Heidelberg; A. Popkov, University of South Bohemia, Tschechische Republik. Zusatzfinanzierung: Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim Unter dem breitgefassten Titel Neue Radiopharmaka wurden Entwicklungsarbeiten durchgeführt, die in die vier Themenbereiche aufgeteilt sind: a. die nuklearmedizinischen Bildgebung des Programmierten Zelltods (Apoptose), b. radioiodierte und 99m Tc-markierte Benzamide für die Melanomdiagnostik, c. Zytostatika-Benzamidkonjugate für die zielgerichtete Behandlung von Melanommetastasen, d. somatostatinrezeptoraffine Liganden für den Oligodesoxynukleotidtransport in Tumorzellen, e. Konjugationschemie und f. Verschiedenes. Als Anwendungsbereich eines potentiellen Radiopharmakons für die PET- oder SPECT-Darstellung von Apoptose ist die onkologische Therapiekontrolle und Gewebsischämie in z.b. Herz oder Gehirn anzusehen. Caspasen, eine Reihe proteolytisch wirkender Enzyme, haben eine Schlüsselrolle inne und sind deshalb als ein Zielmolekül für die Apoptose- Bildgebung ausgewählt worden. Caspasen wirken innerhalb der intrazellulären Signalkaskade und liegen vermehrt nur während der Apoptose in aktivierter Form vor. In einem ersten Versuchsansatz wurde daher Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp(O-methyl)-fluoromethylketon [Z-VAD-fmk], ein Pan-Caspase-Inhibitor, der irreversibel an aktivierte Caspasen bindet, als potentieller Apoptosetracer untersucht. Wegen der grundsätzlichen Nachteile einen Enzyminhibitor für die Bildgebung zu nehmen (Sättigung), wurde die Entwicklung auf peptidische Caspasesubstrate gerichtet. Enzymsubstrate haben den Vorteil die spezifisch aktivierten Enzyme nicht zu blockieren. Es wurde eine Reihe von Peptiden mit den Erkennungssequenzen DEVDG und NQVNG synthetisiert. Die C- und N-terminalen Modifikationen sahen verschiedene 99m Tc-Liganden, 131 I-Gruppen und peptidische Transportersequenzen vor [1]. Die frühzeitige Lokalisation von Metastasen ist für die Behandlung des aggressiv wachsenden Melanoms von großer klinischer Bedeutung. Seit längerem wird daher an der Entwicklung neuer Radiopharmaka gearbeitet, welche den spezifischen Nachweis von Melanommetastasen mit nuklearmedizinischen Methoden ermöglichen. In der Vergangenheit wurden radioiodierte Benzamide entwickelt, welche neben hoher Melanomaffinität eine für die Bildgebung günstige Pharmakokinetik im Untergrundgewebe zeigten. Der erzielte Fortschritt lag in dem wesentlich verbesserten szintigraphischen Bildkontrast. Weitere Arbeiten zeigten, dass sich die Melanomaufnahme mit der Einführung von verschiedenen Substituenten deutlich steigern ließ. Die viel versprechenden Eigenschaften dieser Verbindungsklasse wurden auf 99m Tc-Komplexe übertragen. Die Vorteile der 99m Tc-Chemie sollten zusammen mit den günstigen physikalischen Eigenschaften und den vergleichsweise ge-

293 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie ringen Tracerkosten der klinischen Melanomdiagnostik zugute kommen. Dazu wurden N 2 S 2 - bzw. N 3 S-Liganden synthetisiert, die einerseits vom sogenannten BAT-Ligandentyp sind [BAT: Bis(aminoethanethiol)] und andererseit auf dem DADS-Ligandentyp basieren (DADS: Diamidodisulfhydryl). Beide Ligandentypen bilden mit Tc(V) stabile Komplexe, die als 99m Tc-BAT-Komplexe ungeladen und als 99m Tc-DADS- Komplexe negativ geladen sind. In Anlehnung an die aus eigenen Vorarbeiten gewonnene Erkenntnis, dass die 2-Dimethylaminoethylgruppe ein für die Melanomaufnahme optimales Strukturelement radioiodierter Benzamide darstellt, wurden die Synthesen der Liganden ausschließlich mit dem Pharmakophor N-(2-diethylaminoethyl)benzamid vorgenommen. Neben den oben genannten Liganden wurde auch die Hydrazinonicotinsäure (HYNIC) an 2-Diethylaminoethylamin konjugiert und mit dem Koliganden Tricin an Tc(V) komplexiert. Einer der 99m Tc-Komplexe, der mit dem Liganden 4-(S-benzoyl-2-thioacetyl-glycyl-glycylamido)-N-(2-diethylaminoethyl)benzamid erhalten wurde, zeigte die bisher höchsten Anreicherung in dem murinen B16 Melanom/C57Bl6-Maus-Modell [2-4]. Durch die außerordentlich hohe Anreicherung in B16 Melanomen sollte geprüft werden, ob N,N-(Dialkylamino)benzamide (BA) als Transporter von zytotoxischen Substanzen geeignet sind. Der Anlass für dieses Vorhaben basierte auf experimentellen Ergebnissen, bei denen keine Sättigung bei der Melanomaufnahme von radioiodierten BA beobachtet wurde, obwohl sich die spezifische Aktivität der Substanzen verringerte. Die hohe Transportkapazität von BA erschien daher für die zielgerichtete Einschleusung von zytotoxischen Verbindungen attraktiv. Es zeigte sich, dass BA als niedermolekulare, melanomaffine Trägersubstanzen für Zytostatika in Betracht kommen, weil sie sich in B16-Melanomzellen besser anreichern als die unveränderten Zytostatika. Es wurde jedoch beobachtet, dass durch Konjugation die Wirkung von CA auf andere Tumorzellen ebenfalls verstärkt wurde. Unklar ist, wie sich die Konjugate auf Normalgewebe auswirken. Es sind daher Therapieexperimente mit melanomtragenden Mäusen vorgesehen, um Aufschluss über die Wirksamkeit und das In-Vivo- Targeting zu erhalten [5]. In einem weiteren Projekt wurden Octreotid-Oligonukleotid-Konjugate untersucht, die einerseits ein Oligonukleotid enthalten, dessen Sequenz einer intrazellulären Nukleinsäuresequenz komplementär ist (z.b. mrna) und andererseits ein Peptid enthalten, das an dem Somatostatinrezeptor bindet. Die Idee, die sich dahinter verbirgt, ist die Ausnutzung der nach Bildung des Rezeptor/Liganden-Komplexes stattfindenden Endozytose für die intrazelluläre Einschleusung von Oligonucleotidsequenzen. Oligonucleotide werden bekanntermaßen nur schlecht durch Zellembranen transportiert. Der rezeptoraffine Teil dieses Konjugats stellt eine zielgerichtete Aufnahme sicher, welche die Therapie von Tumoren gewährleistet, bei denen der Somatostatin-Rezeptor (SSTR) überexprimiert wird. Für die Nukleinsäuresequenz des Konjugats wurde beispielhaft das Protoncogen Bcl-2 ausgesucht, das durch die t(14;18) Translokation in B-Zell-Lymphomen überexprimiert ist. Dieser Tumortyp enthält auch vermehrt Somatostatinrezeptoren und könnte daher für eine Therapie mit Octreotid-Oligonukleotid-Konjugaten zugänglich sein. Die Bemühungen, mit Octreotid-Oligonukleotid-Konjugaten die Antisensetherapie zu verbessern, erscheinen aussichtsreich, da diese Moleküle trotz der molekularen Größenunterschiede zwischen dem Peptid- (ca Da) und Oligonukleotidteil Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie (ca Da) sowohl stark rezeptoraffin sind, als auch unveränderte Hybridisierungseigenschaften zeigen [6]. In diesem Zusammenhang wurden auch eine Reihe von Modifikationen an dem Somatostitin-Rezeptor-Liganden Octreotat durchgeführt. Dabei wurden die C- und N-terminalen Modifikationen systematisch untersucht [7-10]. Heterobifunktionelle 99m Tc Liganden stellen wichtige Werkzeuge für die Antikörpermarkierung nach der Precomplexation Route dar. Es wurde daher ein Ligand synthetisiert, der ausreichende Stabilität aufweist, um ihn mit 99m Tc komplexieren zu können, ohne dass die labile Konjugationsgruppe inaktiviert wird. Es wurde mit dem Liganden 2,3,5,6- Tetrafluorophenyl N-(S-benzoylthioacetyl)glycylglycyl-paminobenzoate (OC2) >60% des 99m Tc-Komplexes erhalten. O S O H N O OC2 N H O H N O O F 99m Tc-OC2 wurde in ungeträgerter Form mit dem monoklonalen Antikörper mab425 in hoher Ausbeute erhalten. Im Vergleich zu den bislang beschriebenen Methoden, die eine In-Situ-Aktivierung der 99m Tc-Komplexes vorsehen, stellt das Verfahren, das zu diesem Komplex führt eine deutliche Verbesserung dar [11].Verschiedene andere Konjugationsmethoden, die für die Chelatorkonjugation an Peptide nützlich sind, wurden ebenfalls entwickelt. Unter anderem konnte ein 4-Nitrophenyl-mono-Ester des Liganden DOTA hergestellt werden, der als vielseitiges Synthon für N-terminale Peptidkonjugation eingesetzt werden kann [12-15]. Es existieren nur wenige Berichte über die asymmetrische Synthese von 11 C markierten a-methyl-aminosäuren. Im Rahmen einer Kooperation wurde ein Ni(II) Komplex aus der Schiffschen Base (S)-N-benzylproline-(2-benzoylphenyl)- amide (BPB) und a-phenylalanin hergestellt. Die [ 11 C]Methylierung verlief wie erwartet wegen sterischer Behinderung mit einer vergleichsweise geringen radiochemischen Ausbeute und führte zu einer Mischung diastereomerer a-[ 11 C]methylDOPA Komplexe, die über die HPLC auftrennbar waren [16]. Nitroimidazole werden außer als Antibiotika und Strahlensensitizer seit einigen Jahren auch als mögliche Tracer zur Darstellung hypoxischer Gewebe evaluiert. Die zumindest theoretische Möglichkeit, hypoxische Gewebe als mehrspeichernd szintigraphisch darzustellen, ist für eine klinische Anwendung sehr interessant. Vor allem bei kardiovaskulären Erkrankungen treten Gewebehypoxien im Rahmen ischämischer Ereignisse auf, die auch das wesentliche diagnostische Problem der kardiologischen Nuklearmedizin darstellen. Der in der Abteilung Radiochemie entwickelte Technetium-Komplexbildner BAT (bis-aminoethanethiol) wurde mit einer 2-Nitroimidazolgruppe (NI) gekoppelt. Der daraus resultierende Komplex 99m TcO(BAT-NI) wurde mit den Vergleichstracern 99m TcO(BAT-I) (ohne Nitrogruppe), 99m TcO(BAT-Br) (ohne NI-Gruppe) und 125 IP-NI (Tracer ohne 99m TcO-BAT) systematisch in vivo, in klinisch relevanten Modellen myokardialer Ischämie, durch Autoradiographie, planare Szintigraphie, Organverteilungsstudien und HPLC untersucht. Nachdem Vorbefunde eine Anreicherung von 99m TcO(BAT-NI) im ischämischen Rand experimenteller Myokardinfarkte in vivo gezeigt hatten, konnten weitere Un- F F F 293

294 294 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie tersuchungen nach Ausdehnung des ischämischen Areals auf größere Myokardabschnitte erfolgen. Dazu wurde ein low-flow Ischämiemodell entwickelt, bei dem über repetitive Messungen der Gewebeperfusion mit der Wasserstoff- Clearance Technik eine über 90 min etwa konstante, ca. 50 prozentige Minderung des myokardialen Blutflusses induziert wurde. In diesen experimentellen Ischämien läßt sich die Speicherung von 99m TcO(BAT-NI) mit dem Parameter myokardialer Blutfluß korrellieren [17,18]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] W. Mier*, J. Hoffend*, U. Haberkorn and M. Eisenhut. Current strategies in tumor-targeting. In Apoptotic Pathways as Targets for Novel Therapies in Cancer & Other Diseases (Eds. Spencer B. Gibson, Marek Los). Kluwer Academic Publ. Dordrecht, Boston, London. 2004, in press. [2] Z. Cheng*, A. Mahmood*, D. Kramer*, M. Friebe*, C. Bolzati*, M. Eisenhut, A. Davison*, A. G. Jones*. 99m Tc-Labeled compounds with high melanoma affinity: Evaluation in subcutaneous and metastatic tumor models. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S400, [3] A. Mahmood*, Z. Cheng*, H. Li*, D. Kramer*, M. Eisenhut, A. Davison*, A. G. Jones*. N,N-Diethylaminoethyl-benzamidecontaining amine-amide-dithiol 99m Tc-complexes (AADT) with melanoma affinity. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S399, [4] M. Eisenhut, A. Mohammed*, W. Mier*, M. Friebe*, A. Mahmood*, A. G. Jones*, U. Haberkorn. Melanoma Affine 99m Tc Complexes Comprising the N-(2-diethylaminoethyl)benzamide Structure Element. J Med Chem, 2002; 45: [5] M. Wolf, U. Bauder-Wüst, A. Mohammed*, F. Schönsiegel, W. Mier*, U. Haberkorn, M. Eisenhut. Alkylating benzamides with melanoma cytotoxicity. Melanoma Res 2004; in press. [6] W. Mier*, R. Eritja*, A. Mohammed*, U. Haberkorn, M. Eisenhut. Peptid-PNA-Konjugate: gezielter Transport von Antisense-Oligonucleotiden in Tumoren. Angewandte Chemie, 42: , 2003 [7] K. Graham*, Q. Wang, U. Haberkorn, M. Eisenhut, W. Mier*. Synthesis and evaluation of C-terminally modified derivatives of Tyr 3 -Octreotate. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S71, [8] Graham K.A.N. *, Wang Q., Eisenhut M., Haberkorn U., Mier W*. A general method for functionalising both the C- and N-terminals of Tyr 3 -octreotate. Tetrahedron Letters 43 (2002) [9] Q. Wang, K. Graham*, T. Schauer*, T. Fietz, A. Mohammed*, U. Haberkorn, M. Eisenhut, W. Mier*. Pharmacological properties of hydrophilic and lipophilic derivatives of octreotate. Nucl Med Biol 2004, 31: [10] K. Graham*, Q. Wang, U. Haberkorn, M. Eisenhut, W. Mier*. Synthesis of DOTATATE derivatives with an intercalating moiety. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S259, [11] O. Calderon Sanchez*, A. Mohammed*, W. Mier*, K. Graham*, J. Schuhmacher, S.O. Arndt*, U. Haberkorn, R. Mocelo* and M. Eisenhut. 2,3,5,6-Tetrafluorophenyl N-(Sbenzoylthioacetyl)glycylglycyl-p-amino-benzoate, a heterobifunctional 99m Tc ligand for precomplexed antibody labeling. Bioconjugate Chem 2003, 14: [12] O. Calderon Sanchez*, A. Mohammed*, W. Mier*, K. Graham*, U. Haberkorn and M. Eisenhut. Synthesis, protein Synthesis, 99m Tc Complexation and Protein Conjugation of 2,3,5,6- Tetrafluorophenyl N-(S-benzoylthioacetyl)glycylglycyl-p-aminobenzoate. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S247, [13] Mier W*, Hoffend J*, Schuhmacher J, Eisenhut M, Haberkorn U. Conjugation of DOTA using isolated phenolic active esters: the labeling and biodistribution of albumin as blood pool marker. Bioconjugate Chemistry 2004; in press. Abteilung E030 Radiochemie und Radiopharmakologie [14] R. Repp*, H.H. van Ojik*, T. Valerius*, G. Groenewegen*, G. Wieland*, C. Oetzel*, M. Eisenhut, B. Stockmeyer*, W. Becker*, H. Steininger*, Y.M. Deo*, G.H. Blijham*, J.R. Kalden*, J.G.J. van de Winkel*, M. Gramatzki*. Phase I clinical trial of the bispecific antibody MDX-H210 (anti-fcgri x anti HER-2/neu) in combination with Filgrastim (G-CSF) for treatment of advanced breast cancer. Brit J Cancer 2003, 89: [15] S. Wagner, R. Eritja*, M. Zuhayra, F. Oberdorfer, A. Mohammed*, W. Mier*, U. Haberkorn and M. Eisenhut. Synthesis and Properties of Radiolabeled CPTA-Oligonucleotides. J labelled Comp Radiopharm 46: (2003). [16] A. Popkov*, M. Nádvorník*, P. Kružberská*, A. Lyèka*, M. Eisenhut, N.M. Gillings*. Asymmetric synthesis of 11 C-labelled a- methyl amino acids via metallocomplex chiral synthons. J. labelled Comp. Radiopharm. 46: S227, [17] J. Hoffend*, G. Linke*, A. Mohammed*, C.P. Tiefenbacher*, M. Eisenhut, U. Haberkorn. 99m TcO(BAT-NI), a novel nitroimidazole tracer: in vivo uptake studies in ischemic myocardium. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2003; 30, [18] M. Eisenhut. Nuklearmedizinische Schmerztherapie.In AINS, H Beck, E Martin, J Motsch, J Schulte am Esch (Eds); Band 4 Schmerztherapie Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2002: [19] M. Eisenhut, W. Mier*. Radioiodination chemistry and radioiodinated compounds. In Handbook of Nuclear Chemistry (A. Vertes, S. Nagy, Z. Klencsar, Eds.). Kluwer Academic Publ. Dordrecht, Boston, London. 2003,

295 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Abteilung Medizinische Physik (E040) Leiter: Prof. Dr. Wolfgang Schlegel Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Simone Barthold-Beß Dr. Rolf Bendl Dr. Klaus Borkenstein Dr. Andreas Eisenmenger (3/02-12/03) Silvia Handlos Prof. Dr. Günther Hartmann Dr. Peter Heeg Dr. Bernd Hesse Dr. Ralf Hinderer (10/03 -) Angelika Höss Ina Kyas (1-10/03) Priv. Doz. Dr. Oliver Jäkel Dr. Christian Karger Dr. Sabine Levegrün (- 8/03) Dr. Andreas Lüttgau (8/02-5/03) Dr. Simeon Nill (1/02 -) Priv. Doz. Dr. Uwe Oelfke Dr. Mike Partridge (- 6/02) Dr. Maria Scherer (3-7/02) Marc Schneberger (12/02-3/03) Dr. Hanitra Szymanowski Christian Thieke (- 11/03) Gastwissenschaftler Mohammad Anisuzzaman Bhiyan (8-9/03) Dhaka, Bangladesh Valentin Artemiev (8-9/02) Minsk, Belarus Sarah Banu (8-09/03) Dhaka, Bangladesh A. N. M. Monirul Huda (8-9/03) Dhaka, Bangladesh Abu Sinha Khalid (8-9/03) Dhaka, Bangladesh Luciana Pavel (- 12/02) Cluzj, Rumänien Muhammad Masud Rana (8-09/03) Dhaka, Bangladesh Sylwia Pysklak (1-2/03) Krakau, Polen Prof. Valery Vengrinovich (6/03) Minsk, Belarus Anna Wysocka (10/03 -) Krakau, Polen Doktoranden Lars Dietrich (4/02 -) Christian Frühling (5/02 -) Rüdiger Hofmann (- 5/03) Robert Illés (2/03 -) Werner Korb (- 5/02) Ina Kyas (11/03 -) Gerhard Lechsel (3/03 -) Thorsten Liebler (-12/03) Andreas Lüttgau (- 7/02) Urban Malsch (6/03 -) Thomas Neff (11/02 -) Simeon Nill (- 1/02) Irmtraud Reitz (1/03 -) Maria Scherer (- 2/02) Marc Schneberger (- 11/02) Christian Scholz Christian Thieke (- 10/03) Thomas Tücking (12/02 -) Jan Unkelbach (11/02 -) Jan Wilkens Diplomanden Michael Becker (5/02-8/03) Katrin Faiß (12/03 -) Oksana Filipenko (7/03 -) Christian Frühling (5/02 -) Biljana Gigic (8/03 -) Martin Högner (9/02-8/03) Stefanie Hürtgen (5/03 -) Martina Hub (8/02-12/03) Elisabeth Janisch (10/02-12/03) Ina Kyas (- 12/02) Gerhard Lechsel (2/02-2/03) Arne Littmann (- 4/02) Urban Malsch (- 4/03) Thomas Neff (- 11/02) Sima Qamhiyeh (3-12/03) Petra Reiß (1-12/03) Christian Sanner (- 7/02) Nadine Siemer (2/02-2/03) Martin Tacke (12/03 -) Thomas Tücking (-12/02) Eugen Wehrwein (4/03 -) Tim Weiskat (11/02-6/03) H. J. Wertz (04/02-11/02) Wissenschaftliche Hilfskräfte Leyla Cira (10/02-6/03) Silvana Halbauer (9/03 -) Bettina Reck (11/03 -) Anja Tropp (4/03 -) Praktikanten Johanna Schneider (6-7/03) Ryan Smith (5-8/02) Auszubildende Cosima Helbig (9/02-) BA Studentin Christian Opitz (9/03 -) BA Student Ariane Pölking (9/03 -) BA Studentin Sven Süptitz (9/03 -) BA Student Sabine Willius (9/02 -) BA Studentin Technische Mitarbeiter Karin Beinert Christoph Döttling Gernot Echner Clemens Lang (10/02 -) Wilfried Müller Andreas Rau (- 4/02) Susanne Schmitt (- 10/02) Zivildienstleistende James Anderson (5-8/02) Hendrik Burgdörfer (8/02-5/03) Matthais Häfner (8/02-5/03) Sebastian Hohl (9/03 -) Thomas Oberniedermayr (9/03 -) Die Abteilung Medizinische Physik greift neue Ansätze aus der Mathematik, den Natur- und Ingenieurwissenschaften sowie den dreidimensionalen bildgebenden Verfahren der Radiologie (CT, MRT, PET und SPECT) auf, um sie in schonende und effiziente lokale Therapieverfahren umzusetzen. So arbeitet die Abteilung u.a. an der Entwicklung von neuen, rechnergestützten Therapie-Planungsverfahren. Im Mittelpunkt stehen derzeit die Planungsverfahren der sog. Inversen Strahlentherapieplanung, die einen völlig neuen Ansatz vor allem bei der Behandlung von Tumoren in der Nähe strahlenempfindlicher Organe bilden. Um solche neuen Planungsverfahren einsetzen zu können, müssen ebenfalls neue Behandlungstechniken entwickelt werden. Ein weiteres Forschungs- und Entwicklungsgebiet betrifft daher die Bestrahlungstechniken selbst. So werden z.b. für die Strahlentherapie dynamisch steuerbare Blendensysteme (sog. Multileafkollimatoren ) entwickelt, um durch die Überlagerung intensitätsmodulierter Strahlenfelder (IMRT) tumorkonforme Strahlendosisverteilungen erzielen zu können. Ein anderer Weg ist der Einsatz energievariabler scannender Protonen- oder Schwerionenstrahlen. Hier ist die Abteilung in Kooperationsprojekte mit physikalischen Grundlagenforschungsinstituten, die über solche Bestrahlungsmöglichkeiten verfügen, eingebunden und betreibt zusammen mit der Universitätsklinik Heidelberg und der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt die Planung und Vorbereitung einer klinischen Hadronen-Therapie-Anlage in Heidelberg, die in den Jahren 2006/2007 den klinischen Betrieb aufnehmen soll. Geometrische Ungenauigkeiten bei der Applikation einer Tumortherapie beeinträchtigen die Erfolgsaussichten einer lokalen Tumorbehandlung wesentlich. Ingenieure und Physiker der Abteilung arbeiten daher an neuen, stereotaktischen Lokalisations- und Immobilisierungsverfahren, die eine wesentlich größere Genauigkeit der Applikation von Strahlung versprechen. Ein neuer und vielversprechender Ansatz ist die Integration bildgebender Verfahren in das Bestrahlungsgerät, um die Lage und Ausdehnung von Tumoren unmittelbar vor und auch während der Behandlung bei dem in der Bestrahlungsposition gelagerten Patienten erfassen und berücksichtigen zu können. Für diese sog. Adaptive Strahlentherapie werden spezielle Flächendetektoren und Rekonstruktionsalgorithmen zur Berechnung dreidimensionale CT- Bilder eingesetzt. Die Adaptive Strahlentherapie verspricht bei all den Strahlenbehandlungsverfahren verbesserte Erfolgsaussichten, die bisher wegen der Lage- und Formvariabilität des Zielvolumens sehr mit der Konformationstherapie oder der IMRT schwierig zu behandeln waren. Neben der zeitlich adaptierten Strahlentherapie soll zukünftig auch an einer biologisch adaptierten Therapie gearbeitet werden. Die Grundlage hierfür sind die neuen Verfahren der biologischen Bildgebung wie physiologische, funktionelle und metabolische PET- und SPECT- 295

296 296 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Untersuchungen mit Therapie-relevanten Markern, fmri und MRS. Eine bessere biologische Differenzierung des Tumorgewebes könnte z.b. zu einer weiteren verbesserten Anpassung der Strahlendosisverteilungen an ein Zielvolumen auch bezüglich der Variabilität der Strahlenempfindlichkeit führen, während die adäquate Berücksichtigung der heterogenen Strahlenempfindlichkeit von Risikoorganen das Potential der Verringerung von Nebenwirkungen hat. Die unterschiedlichen interdisziplinären Forschungs- und Entwicklungsansätze der Abteilung, die alle das gemeinsame Ziel haben, Nebenwirkungen von Tumorbehandlungen zu verringern und die therapeutische Wirkung zu steigern, werden in den folgenden Beiträge anhand einiger ausgewählter Aspekte erläutert. Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Physikalische Modelle (E0401) U. Oelfke, B.-M. Hesse, M. Partridge, S. Nill, H. Szymanowski, R. Hinderer, C. Thieke, L. Pavel, C. Scholz, J. Unkelbach, J. Wilkens, L. Dietrich, T. Tücking, I. Reitz, N. Siemer, E. Janisch In Zusammenarbeit mit Prof. G. Hartmann, A. Höss, Dr. R. Bendl, DKFZ, Abt. Medizinische Physik; B. Rhein, P. Häring, DKFZ, Zentraler Strahlenschutz; PD Dr. Dr. J. Debus, PD Dr. C. Thilmann, Dr. M. Münther, DKFZ, Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie; Dr. M. Aleksi Keller-Reichenbecher, Dr. C. Schulze, Dr. M. Lauterbach, Dr. J. Stein, Siemens (OCS) Heidelberg; Prof. S. Webb, Dr. M. Partridge, Royal Marsden Hospital, ICR, Sutton, UK; Prof. M. Karlsson, Dr. B. Zackrisson, L. Olofson, Department of Oncology, University of Umea, Schweden; Dr. M. Svatos, Dr. D. Hristov, Dr. S. Gliessmann, Siemens Oncology Care Systems (OCS), Concord, USA; Dr. A. Lomax, Paul Scherrer Institute (PSI), Villigen, Schweiz; Prof. T. Bortfeld, Prof. Dr. H. Paganetti, Massachusetts General Hospital, Dept. of Radiation Oncology, Boston, USA; Prof. M. Kröning, Dr. M. Maisel, Dr. S. Gondrom, Dr. H. Reiter, Fraunhofer Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren (IZFP), Saarbrücken; Prof. A. K. Louis, Institut für Angewandte Mathematik, Universität des Saarlandes, Saarbrücken; PD Dr. K.-H. Küfer, Dr. H. Trinkaus, Institut für Techno- und Wirtschaftsmathematik, Kaiserslautern; Prof. V. Malka. Laboratoire Optique Apliquee (LOA), Paris, Frankreich; Dr. L. Müller, IBA Advanced Radiotherapy, Schwarzenbruck; Prof. R. Männer, PD Dr. J. Hesser, Universität Mannheim, Lehrstuhl für Informatik V. Zusatzfinanzierung: Die F&E-Arbeiten der Arbeitsgruppe werden durch Mittel der DFG, der Deutschen Krebshilfe,des Tumorzentrums Heidelberg-Mannheim sowie der Fa. Siemens (OCS) Concorde unterstützt. Ziel der Arbeiten unserer Gruppe ist die Verbesserung der Tumortherapie durch Entwicklung und Anwendung mathematisch-physikalischer Modelle. Die Arbeiten befassen sich sowohl mit grundlegenden Problemen der Wechselwirkung zwischen Strahlung und Geweben als auch mit der Entwicklung von Methoden zur klinisch relevanten Dosisapplikation und Therapieverifikation. Der Schwerpunkt liegt auf der Optimierung der Strahlentherapie, insbesondere auf den Gebieten der sogenannten intensitätsmodulierten Radiotherapie (IMRT) mit Photonen als auch neuer Therapieformen, die Ionenstrahlen zur Tumortherapie verwenden. Aufbauend auf unseren Entwicklungsarbeiten der vergangenen Jahre konnten seit 1997 mehr als 500 Patienten am DKFZ mit der Methode der IMRT und unter Verwendung des von uns entwickelten Planungssystems KonRad behandelt werden [1,2]. Dadurch war es bei diesen Patienten möglich, das zu bestrahlende Zielvolumen mit einer höheren Dosis zu behandeln und/oder empfindliche gesunde Organe bei der Bestrahlung weniger zu belasten. Das DKFZ ist damit eines der in Europa führenden Institute zur Anwendung der IMRT in der klinischen Praxis. Erstes Ziel zur Verbesserung und Erweiterung der Optimierung der konventionellen IMRT mit Photonen war die Entwicklung eines neuen Planungskonzeptes, das es dem Therapeuten ermöglicht alle klinisch sinnvollen Kompromisse zwischen Tumorkontrolle und Nebenwirkungswahrscheinlichkeiten sicher und schnell zu finden. Das Konzept dieser sogenannten multi-kriteriellen Optimierung der Strahlentherapie wurde in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer Institut für Wirtschaftsmathematik und dem Massachussets General Hospital in Boston entwickelt. Die ersten Ergebnisse dieser Arbeit im Rahmen einer Dissertation [3] wurden mit dem ESTRO Preis für die beste wissenschaftliche Arbeit auf dem Gebiet der Medizin-Physik im Jahr 2003 ausgezeichnet.

297 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Des weiteren wurde die klinische Version der Planungs- Plattform KonRad weiter verbessert. Neben der Entwicklung neuer Zielfunktionen, mit denen eine gezieltere Dosishomogenität im Tumor erreicht werden kann [4], wurden die Verwendung weiterer biologischer Parameter, wie die equivalent uniform dose (EUD), für die inverse Planung evaluiert [5,6,7]. Ein weiteres wichtiges Projekt war die Integration eines äußerst präzisen Dosisalgorithmus in die iterative Optimierung [8]. Wie in Abb. 1 gezeigt, konnte damit insbesondere eine deutliche Verbesserung in der Bestrahlung von Lungentumoren erreicht werden [9]. Zur Beschleunigung der inversen Therapieplanung wurde zudem ein neues Verfahren entwickelt, dass auf einem statistischen Importance-Sampling des Dosiskerns beruht und damit die Optimierungszeit um ca. einen Faktor 3 reduziert ohne dabei die klinisch erforderliche Dosisgenauigkeit zu unterschreiten [10]. Im Bereich der Photonen IMRT wurden zudem Planungsstudien zur Dosisapplikation mit verschiedenen Multi-Leaf Kollimatoren (MLK) durchgeführt [11]. Des weiteren wurde in Zusammenarbeit mit der Fa. Siemens die Anbindung eines neuen Multi-Leaf Kollimators mit extrem kleiner Leafbreite an den Linearbeschleunigers des DKFZ realisiert, so dass auch hochkomplexe Zielvolumina optimal mit Dosis versorgt werden können [12]. Abb. 1: Links: 3D Dosisverteilung eines Lungentumors bei der Optimierung mit einem konventionellen Dosisberechnungsalgorithmus Die 95% Isodose umfasst nicht das gesamte Planungszielvolumen (PTV). Rechts: Optimierte 3D Dosisverteilung durch den Einsatz hoch präziser Dosisberechnungsalgorithmen. Die 95% Isodose umschließt nun das ganze Planungszielvolumen und gewährleistet die Zerstörung des Tumors. Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeit ist zur Zeit die Anwendung des Konzeptes der IMRT auf Bestrahlungen mit geladenen Teilchen, insbesondere auf die Protonentherapie (IMPT, intensitätsmodulierte Protonentherapie) [13]. Die Methoden der inversen Therapieplanung für Photonen wurden dazu um eine Dimension erweitert, um auch die Energien der geladenen Teilchen mit zu optimieren [14]. Erste klinische Beispiele für die Optimierung der IMPT wurden zunächst mit einem einfachen Protonen-Dosisberechnungsalgorithmus berechnet. Im Berichtszeitraum wurde ein neuer Dosisalgorithmus für die Protonentherapie entwickelt, der insbesondere die Dosis beim Auftreten von Gewebeinhomogenitäten schnelle und präzise bestimmt. Als Beispiel wird in Abb. 2 gezeigt, wie Dosisfehler von bis zu 10% beim Auftreten von Lufthöhlen oder Knochen im Strahlengang mit dem neuen Verfahren vermieden werden können. Zudem wurde ein Modell zur Berechnung der physikalischen Dosis eines Kohlenstoffionenstrahls ( 12 C) in das Planungsmodul integriert und zu ersten vergleichenden Patientenstudien zwischen Photon-IMRT und IMRT mit Protonen und 12 C-Ionen benutzt. Bei der Behandlung mit Protonen konnte bei gleichbleibender Dosisqualität im Zielvolumen eine signifikante Reduktion der Dosis in den Risikoorganen festgestellt werden [17]. Die Anwendung der neuen IMPT Planungsverfahren und weitere Entwicklungen, z.b. im Hinblick auf biologische Eigenschaften geladener Teilchen, werden weiter untersucht. Aufbauend auf einem neuen Verfahren zur Berechnung 3-dimensionaler LET Verteilungen [18] und eines phänomenologischen Modells zur Beschreibung der relativen biologischen Wirksamkeit konnten erstmals neueste IMPT Techniken unter Berücksichtigung dieser biologischen Aspekte der Teilchentherapie optimiert werden [19]. Weitere im Berichtszeitraum begonnene Untersuchungen zum Einsatz geladener Teilchen in der Strahlentherapie befassten sich mit der Evaluierung von Monte-Carlo Methoden (GEANT4) zur Protonendosisberechnung sowie der Optimierung intensitätsmodulierter Elektronenstrahlen zur Behandlung des Mamma-Karzinoms [20]. Weil schon geringe Abweichungen bei der Applikation der therapeutischen Strahlung den Erfolg der Behandlung wesentlich beeinträchtigen können, ist der Aspekt der Therapieverifikation und der zeitlichen Adaption des Therapiekonzeptes ebenso wichtig wie die genaue Berechnung und Optimierung der Dosisverteilung. Aus diesem Grunde wurden unsere erfolgreichen Ansätze zur Therapieverifikation mit dem Ziel erweitert, neue Strategien zur zeit-adaptierten Strahlentherapie zu entwickeln. Neben der Realisierung neuer Hardware-Konzepte zum Patienten-Monitoring, wie z. Bsp. der Integration einer kv-röntgenquelle am Therapiebeschleuniger, sollen die gewonnenen Information über Patientenanatomie und 297 Abb. 2: Fehlerdarstellung bei der Protonen Dosisberechnung in inhomogenen Medien (Lufteinschluss in cm Tiefe). Links: Prozentualer Unterschied in der Energiedosis zwischen 1D Pencil Beam Algorithmus und Monte Carlo Simulation. Es sind deutliche Abweichung bis zu 10% zu beobachten. Rechts: Bei dem Einsatz der neu entwickelten 2D analytischen Skalierung wird der maximale Fehler ca. 2-3 % reduziert.

298 298 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie tatsächlich applizierter Dosis in die Therapieplanung zurückgeführt werden und so zu einer weiteren Verbesserung der Strahlentherapie im Körperstammbereich führen. Erste Ansätze zur zeit-adaptierten inversen Planung wurden im Berichtszeitraum entwickelt and anhand theoretischer Modelle evaluiert [21]. Für die Therapieverifikation ist uns erstmals in einem Experiment mit einem Rando-Alderson Phantom gelungen die Absolutdosis eines IMRT Plans mit einem electronic portal imager device (EPID) durch Transitdosimetrie zu verifizieren [23]. Diese Arbeit, bei der die Patienten-Geometrie durch eine MV-Computertomographie mit dem Strahl des Linearbeschleunigers rekonstruiert wurde, beruht auf einem verbesserten Verfahren zur Korrektur, der im Patienten erzeugten Streustrahlung. Die Entwicklung und Evaluierung dieses Verfahrens im Rahmen einer Diplomarbeit [24] wurde im Jahr 2002 mit dem Vortragspreis der DGMP ausgezeichnet. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Münter MW; Thilmann C; Hof H*; Didinger B*; Rhein B; Nill S; Schlegel W; Wannenmacher M*; Debus J: Stereotactic intensity modulated radiation therapy and inverse treatment planning for tumors of the head and neck region: clinical implementation of the step and shoot approach and first clinical results. Radiotherapy and Oncology, 66(3) (2003) [2] Münter MW; Nill S; Thilmann C; Hof H*; Höss A; Häring P; Partridge M; Manegold C*; Wannenmacher M*; Debus J: Stereotactic intensity-modulated radiation therapy (IMRT) and inverse treatment planning for advanced pleural mesothelioma. Feasibility and initial results. Strahlentherapie und Onkologie, 179(8) (2003) [3] Thieke C, Multicriteria Optimization in Inverse Radiationtherapy Planning, Dissertation, Universität Heidelberg, Fakultät für Physik und Astronomie, 2003 [4] Janisch E, Optimization of IMRT: Feasibility studies with enhanced objective functions, Diplomarbeit, Universität Heidelberg, Fakultät für Physik und Astronomie, 2003 [5] Oelfke U, Siemer N, Nill S, Inverse treatment planning based on EUD: analyzing first order biological effects, Medical Physics 29 (6), pp. 1284, 2002 [6] Siemer N, Inverse Planning with EUD based Objective Functions, Diplarbeit, Universität Heidelberg, Fakultät für Physik und Astronomie, 2002 [7] Thieke C, Bortfeld T*, Niemierko A*, Nill S: From physical dose constraints to equivalent uniform dose constraints in inverse radiotherapy planning. Medical Physics, 30(9) (2003) [8] Scholz C, Schulze C, Oelfke U, Bortfeld T*: Development and clinical application of a fast superposition algorithm in radiation therapy. Radiotherapy and Oncology, 69(1) (2003) [9] Scholz C, Nill S, Oelfke U: Comparison of IMRT optimization based on a pencil beam and a superposition algorithm. Medical Physics, 30(7) (2003) [10] Thieke C, Nill S., Oelfke U and Bortfeld T*, Acceleration of IMRT dose calculation by importance sampling of the calculation matrices, Medical Physics, Vol. 29 (5), pp , 2002 [11] Tücking, T, Nill, S, Thilmann, C*, Oelfke, U : Application of a new exterrnal MMLC for high precision IMRT - a feasibility study. Radiotherapy and Oncology, 68 (Sup1) (2003) S75. [12] Tücking T, Nill S, Oelfke U: IMRT-application with an add-on MMLC, Journal of Applied Clinical Medical Physics, 4(4) (2003) [13] Oelfke U, The potential of charged particle beams in conformal radiation therapy, Shaker Verlag, ISBN , 125 S., 2002 Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie [14] Nill S, Bortfeld T, Oelfke U: Inverse Planning of Intensity Modulated Proton Therapy, Zeitschrift für Medizinische Physik, 14 (1) (2004) [15] Szymanowski H, Oelfke U: CT calibration for two-dimensional scaling of proton pencil beams. Physics in Medicine and Biology, 48 (7) (2003) [16] Szymanowski H, Oelfke U: Two-dimensional pencil beam scaling: an improved proton dose algorithm for heterogeneous media. Physics in Medicine and Biology, 47 (2002) [17] Oelfke U, Bortfeld T: Optimization of physical dose distributions with hadron beams: Comparing photon IMRT with IMPT. Technology in Cancer Research & Treatment, 2 (2003) [18] Wilkens JJ, Oelfke U: Analytical linear energy transfer calculations for proton therapy. Medical Physics, 30 (2003) [19] Wilkens JJ, Oelfke U: RBW in der inversen Bestrahlungsplanung: ein neuer Optimierungsansatz für die Protonentherapie. In: Medizinische Physik Hrsg.: W. Semmler, L. Schad. Heidelberg: DGMP, (2003) [20] Olofsson L*, Xiangkui M*, Nill S, Oelfke U, Zackrisson B*, Karlsson M*, Optimized energy modulated radiotherapy with electrons, Radiotherapy and Oncology, Vol. 64, pp. S52, 2002 [21] Unkelbach, J, Oelfke, U: Inclusion of stochastic organ movements in IMRT treatment planning. Radiotherapy and Oncology, 68 (Sup1) (2003) S101. [22] Partridge M, Ebert M, Hesse BM, IMRT verification by three dimensional dose reconstruction from portal beam measurements, Medical Physcis 29(8), pp , 2002 [23] Kyas I, Partridge M, Hesse BM, Oelfke U, Schlegel W, Validierung eines Verfahrens zur Korrektur der Streustrahlung bei der IMRT-Verifikation mit Hilfe eines Portal Imaging Systems, Tagungsband des DGMP/ÖGMP, SGSMP Meetings, ISBN , Gmunden, August 20 Biologische Modelle (E0402) S. Levegrün, M. Becker, K. Borkenstein, I. Kyas In Zusammenarbeit mit: Dr. A. Jackson, Dr. C.C. Ling, Department of Medical Physics, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA; Dr. M.J. Zelefsky, Dr. Z. Fuks, Dr. S. Leibel, Department of Radiation Oncology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA; Prof. Dr. Dr. Jürgen Debus, Dr. H. Hof, Dr. P. Peschke, Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie, E050, DKFZ; PD Dr. M. Essig, Abteilung Radiologie, E010, DKFZ Drittmittel: DFG: 1 Stelle (BAT IIa) Mit der zunehmenden klinischen Einführung konformaler Bestrahlungstechniken, wie der intensitätsmodulierten Radiotherapie (IMRT), ist die Strahlentherapie in der Lage, hochpräzise Dosisverteilungen zu erzeugen. Diese Techniken haben zum Ziel, den Tumor mit einer möglichst hohen Dosis zu bestrahlen und gleichzeitig das umliegende Normalgewebe weitgehend zu schonen. Es ist Aufgabe des Strahlentherapeuten, für jeden Patienten diejenige Dosisverteilungen zu finden, die einen sinnvollen Kompromiss zwischen hoher Tumorkontrollwahrscheinlichkeit (TCP) und niedriger Komplikationswahrscheinlichkeit (NTCP) darstellt. Diese Entscheidung wird bisher aufgrund klinischer Erfahrungen mit Toleranzdosen und Volumeneffekten getroffen. Die biologische Modellierung versucht, diese Erfahrungswerte durch eine modellhafte Beschreibung der Reaktion von Tumoren und Normalgewebe auf Bestrahlung zu ergänzen. Die Quantifizierung des biologischen Effektes einer gewählten physikalischen Dosisverteilung soll für jeden einzelnen Patienten eine Vorhersage über die erreichbare Tumorkontrolle und die induzierten Nebenwirkungen erlauben. Computergestützte Simulationen, die auf klinisch validierten biologischen Modellen aufbauen, sollen den Therapeuten in der Bestrahlungsplanung unterstützen.

299 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Das Ziel der Arbeitsgruppe Biologische Modelle ist es, die Antwort von Tumoren und Normalgeweben auf Strahlentherapie zu modellieren und Volumeneffekte und Dosis/ Volumen-Wirkungskurven zu quantifizieren. Eine weitere wichtige Aufgabe besteht darin, durch Vergleiche von Modellvorhersagen mit klinischen und experimentellen Daten die Bedeutung biologischer Modelle für die Bestrahlungsplanung zu untersuchen. Um diesen Zielen näher zu kommen, werden sowohl statistische und analytische Modelle als auch Modelle auf zellulärer Ebene untersucht. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Radiobiologie der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie wurde ein seit 1998 erarbeitetes radiobiologisches Modell verfeinert, das Tumorwachstum, Tumorangiogenese und Tumorantwort auf Strahlentherapie auf zellulärer Ebene beschreibt [1-4]. Dieser Ansatz, in dem jede einzelne Tumorzelle und jede einzelne Kapillarzelle berücksichtigt werden, erlaubt eine realistischere Modellierung des Tumorverhaltens als bisherige Modelle. Das Tumorwachstum wird durch die Dauer der Zellzyklusphasen, die Wachstumsfraktion, das Apoptosevermögen, die Blutgefäßdichte des umliegenden Normalgewebes und den Grad der Tumorangiogenese bestimmt. Die Tumorantwort auf Strahlentherapie hängt ab von den Strahlenempfindlichkeiten des linear-quadratischen Modells und dem Reparaturvermögen des Tumors. Computersimulationen werden auf einem 3D kubischen Gitter durchgeführt, ausgehend von einer einzelnen Tumorzelle. Zufällige Prozesse, wie Zellverschiebungen nach Zellteilung oder DNA-Schäden nach Bestrahlung, werden durch Monte-Carlo Methoden simuliert. Das Modell erlaubt die Simulation wichtiger zeitabhängiger Effekte in der Strahlentherapie, wie der Repopulation, der Reparatur und Reoxigenierung. Mit Hilfe dieses Modells wurden Computersimulationen durchgeführt, die eine quantitative Abschätzung der Tumorantwort auf Strahlentherapie liefern. Drei Aspekte, die in der Strahlentherapie von besonderer Bedeutung sind, bildeten im Berichtszeitraum den Schwerpunkt der Untersuchungen. Eine Reihe klinischer Studien haben in den letzen Jahren die Bedeutung der Sauerstoffverteilung im Tumor für den Erfolg der Strahlentherapie verdeutlicht. Um zu klären, unter welchen Bedingungen Tumorangiogenese und die daraus resultierende höhere Sauerstoffkonzentration die Tumorkontrolle erschwert, wurden Strahlentherapien für Tumoren mit unterschiedlichem Grad an Tumorangiogenese simuliert (siehe Abb. 1-3). Um einen sinnvollen Kompromiss zwischen Tumorkontrolle und Normalgewebskomplikationen zu erhalten, wird in der Strahlentherapie die Gesamtdosis meist fraktioniert über einen Zeitraum von mehreren Wochen appliziert. Die Simulation unterschiedlicher Fraktionierungsschemata sollte klären, welche Tumoren überhaupt von neueren (aufwändigeren) beschleunigten Fraktionierungen profitieren (vgl. Tab. 1). Ein großes Problem stellt in der konformalen Strahlentherapie die Bewegung von Tumoren sowohl während einer Fraktion als auch zwischen mehreren Fraktionen dar. In mehreren Studien wurde der Zusammenhang zwischen Tumorbewegung und der für die Tumorkontrolle benötigten Gesamtstrahlendosis abgeschätzt. Für die Tumorbewegung wurden dabei Werte angenommen, wie sie für Prostatatumoren typisch sind. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Radiobiologie wurden Simulationsergebnisse von ungestörtem Tumorwachstum und von unterschiedlich fraktionierten Bestrahlungen mit experimentell beobachteten Daten von Copenhagenratten mit Dunning R3327 Prostatatumoren verglichen. Abb 1: Schnitte durch einen Tumor mit 8 Mio. Zellen. Die Simulation von Tumorproliferation erfolgte mit einer Zellzykluszeit T C =5d, einer Wachstumsfraktion von 100%, ohne Apoptose und ohne Angiogenese. Es gibt nekrotische Zentren im Tumorinneren (schwarz). Der Anteil oxischer Zellen (blau) ist 56%. Ca. 16% der Tumorzellen sind hypoxisch (grün). Kapillarzellen (rot) wurden vom Tumor verdrängt. Abb 2: Schnitte durch einen Tumor mit 8 Mio. Zellen, der mit denselben zellkinetischen Parametern simuliert wurde, wie der Tumor in Abb. 1, aber mit Angiogenese. Es gibt kaum Nekrose, weniger hypoxische Areale, und die oxische Fraktion beträgt 84%. Angiogenese wurde von hypoxischen Arealen der Größe 50 oder mehr hypoxischen Zellen induziert. 299 α = 0.35 Gy -1 konventionelle akzellerierte α/β = 10 Gy Fraktionierung Fraktionierung Dosis D [Gy] Dosis D [Gy] T pot = 2d 82.9 ± ± 3.5 T pot = 5d 72.2 ± ± 5.8 Tab. 1: Abhängigkeit der zur Tumorkontrolle benötigten Gesamtstrahlendosis in Abhängigkeit von Tumorzellkinetik und Fraktionierungsschema. Schnell-proliferierende Tumoren, wie z.b. Kopf- Hals Tumoren, profitieren mehr von einer akzellerierten Therapie als langsam proliferierende.

300 300 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abb 3: Tumorantwort auf eine konventionell fraktionierte Strahlentherapie mit 2 Gy pro Tag für Tumoren mit gleicher Strahlenempfindlichkeit aber unterschiedlicher Zellkinetik und unterschiedlicher Fähigkeit Angiogenese zu stimulieren. Abb 3 a) zeigt Tumoren mit (gepunktet) und ohne Angiogenese für Tpot = 2 d. Abb 3 b) zeigt die gleichen Simulationen für Tumoren mit Tpot = 2 d. Ein Ende 2003 begonnenes Projekt widmet sich der Modellierung von TCP und NTCP bei Lungentumoren, mit über Neuerkrankungen pro Jahr der häufigste Krebs in Deutschland. In diesem Projekt geht es darum, bestehende radiobiologische Modelle zu validieren und sie mit Hilfe von Parametern, die sich aus der biologischen Bildgebung bestimmen lassen, zu ergänzen. Ein weiteres Ziel dieses Projekts ist es, anhand statistischer Methoden, radiobiologische und physikalische Parameter zu identifizieren, die eine Vorhersage über die resultierende TCP und NTCP erlauben. In Zusammenarbeit mit dem Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, wurde die lokale Tumorkontrolle bei Patienten mit Prostatatumoren ausgewertet, die dort im Rahmen einer Dosis-Eskalationsstudie behandelt wurden. Dieses Projekt konnte während des Berichtszeitraumes zum Abschluß gebracht werden [5, 6]. Das Ziel eines weiteren Projektes der Arbeitsgruppe bestand in der Untersuchung später Strahlenfolgen im Gehirn nach stereotaktischer Einzeit-Hochdosisbestrahlung von Patienten mit zerebralen arteriovenösen Malformationen (AVM). In einer retrospektiven Untersuchung wurden für 73 AVM Patienten strahleninduzierte Normalgewebeveränderungen im Gehirn, d.h. Ödeme und Störungen der Blut-Hirn-Schranke, ausgewertet, welche anhand von MR Bildgebung während der Nachsorge erfassbar sind. Je nach Ausdehnung der Normalgewebeveränderung wurden die Endpunkte Ödem und Schrankenstörung weiter Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie in drei Stufen differenziert (gering, mittelgroß, groß). Eine erste Untersuchung der Daten [7] konnte eine Korrelation der Normalgewebeveränderungen mit verschiedenen Charakteristika der dreidimensionalen physikalischen Dosisverteilung im Gehirn aufzeigen, welche für jeden Patienten individuell berechnet wurden. Dabei zeigte sich, daß das Risiko für das Auftreten von Normalgewebeveränderungen gleich gut durch verschiedene einzelne Parameter beschrieben wird, die sowohl von der applizierten Dosis als auch vom bestrahlten Gehirnvolumen abhängen. Dazu gehören die mittlere Dosis in einem Volumen von 20 cm 3 und das absolute Hirnvolumen, das eine Dosis von mindestens 12 Gy erhält. In einer zweiten Untersuchung [8] wurden Dosis/Volumen-Wirkungsbeziehungen für die verschiedenen Endpunkte aufgestellt, die die aktuarischen Risiken für das Auftreten der betrachteten Normalgewebeveränderungen innerhalb von 2,5 Jahren nach Strahlenchirurgie beschreiben. Diese Wirkungsbeziehungen erlauben eine quantitative Abschätzung des Risikos für strahleninduzierte Normalgewebeveränderungen im Gehirn nach stereotaktischer Einzeit-Hochdosisbestrahlung von AVM Patienten. Ein tieferes Verständnis der Ursache dieser Normalgewebeveränderungen und ihrer Korrelation mit der angestrebten Obliteration ist Gegenstand einer derzeit laufenden Untersuchung. Die genaue Kenntnis der Dosis/Volumen-Wirkungsbeziehungen kann zukünftig zur Optimierung der Strahlentherapie in AVM Patienten beitragen. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] Borkenstein K, Levegrün S: Computer simulation of the response to radiotherapy of angiogenic tumors. Radiother Oncol (2003); 67 (Suppl 1): 26. [2] Borkenstein K, Levegrün S, Peschke P: Computersimulation von Tumorantwort auf Strahlentherapie: Auswirkung unterschiedlicher Fraktionierungsschemata. Strahlenther Onkol (2003); 179 (Abstractband zum DEGRO Kongress): 79. [3] Becker M, Borkenstein K, Levegrün S: Computersimulation von Tumorantwort auf Strahlentherapie: Auswirkung von Dosisinhomogenitäten. Strahlenther Onkol (2003) 179 (Abstractband zum DEGRO Kongress): 79. [4] Borkenstein K, Levegrün S, Peschke P: Biological Modeling and Computer simulations of tumor growth and tumor response to radiotherapy. Rad Res (2004); 162 (1): [5] Levegrün S, Jackson A*, Zelefsky MJ*, Venkatraman ES*, Skwarchuk MW*, Schlegel W, Fuks Z*, Leibel SA*, Ling CC*: Risk Group Dependence of Dose-Response for Biopsy Outcome after Three-Dimensional Conformal Radiation Therapy of Prostate Cancer. Radiother Oncol (2002); 63: [6] Levegrün S: Modeling Tumor Control after Three-Dimensional Conformal Radiotherapy (3D-CRT) of Prostate Cancer. Radiother Oncol (2003); 68 (Suppl. 1): S 61. [7] Levegrün S, Hof H, Essig M, Schlegel W, Debus J: Radiation- Induced Changes of Brain Tissue after Radiosurgery in Patients with Arteriovenous Malformations: Correlation with Dose-Distribution Parameters. Int J Radiat Oncol Biol Phys, (2004); 59 (3): [8] Levegrün S, Hof H, Essig M, Schlegel W, Debus J: Radiation- Induced Brain Tissue Changes after Radiosurgery (RS) of Patients with Cerebral Arteriovenous Malformations (AVM): Correlation with Dose Distribution Variables and Dose Response. Int J Radiat Oncol Biol Phys (2003); 57(2) (Suppl):

301 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Therapieplanung - Entwicklung (E0403) R. Bendl, C. Frühling, S. Handlos, G. Lechsel, U. Malsch, A. Littmann, A. Lüttgau, T. Neff, A. Rau In Zusammenarbeit mit: Dr. S. Barthold-Beß, PD Dr. J. Debus, Dr. B. Didinger, Dr. J. Doll, Prof. Dr. G. Hartmann, A. Höss, PD Dr. O. Jäkel, PD Dr. U. Oelfke, Dr. C. Thilmann, DKFZ; Prof. Dr. V. Sturm, Dr. K. Luyken, Dr. H. Treuer, Klinik für stereotaktische und funktionelle Neurochirurgie, Universität Köln; Prof. Dr. J. F. Bille, Institut für Angewandte Physik, Universität Heidelberg; Dr. H. Fuchs, Dr. H. Kluge, Dr. C. Rethfeld, Hahn-Meitner-Institut, Berlin ; Dr. Nausner, Dr. Bechrakis, Universitätsklinikum Benjamin- Franklin, Berlin; K. Welte, H. Rath, Stryker-Leibinger, Freiburg; Dr. M.A. Keller-Reichenbecher, Dr. M. Götz, Dr. S. Fischer, MRC Systems, Heidelberg; PD Dr. K.H. Küfer, Dr. R Rösch, ITWM Kaiserslautern Die Aufgabe der Arbeitsgruppe Therapieplanung - Entwicklung ist die Entwicklung und Implementierung von computergestützten Werkzeugen, die die Planung, Simulation und Evaluation minimal- und nicht-invasiver Behandungstechniken in der Onkologie verbessern können. Ärzte und Therapeuten sollen damit in die Lage versetzt werden, ihre Behandlungsstrategie prä-therapeutisch zu testen und zu optimieren. Es besteht kein Zweifel, dass eine prä-therapeutische Optimierung das Behandlungsergebnis verbessern kann: bessere lokale Tumorkontrolle, geringere Nebenwirkungen, eine Verringerung der Operationszeiten bei chirurgischen Eingriffen und schließlich eine schnellere Wiederherstellung des Patienten führen auch zu einer Reduktion der Behandlungskosten. Aufgrund der engen Kooperation von Ärzten, Physikern und Informatikern ist unser Forschungsschwerpunkt eine ideale Umgebung um computergestützte Planungs- und Simulationsmethoden mit klinischer Relevanz zu entwickeln. Dabei sollen die Entwicklungen so weit geführt werden, dass ihre Vorteile direkt in einer verbesserten Patientenbehandlung demonstriert werden können. Die Hauptaktivitäten der Arbeitsgruppe konzentrierten sich auf Methoden für die dreidimensionale tumorkonforme Strahlentherapieplanung. Da viele Methoden auch sinnvoll zur Planung und Simulation anderer Behandlungskonzepte eingesetzt werden könnten, versuchen wir die entwickelten Konzepte zu verallgemeinern, so dass sie auch für andere therapeutische Ansätze nutzbar werden. Die derzeitigen Arbeitsgebiete umfassen alle Schritte der Therapieplanung, die durch computergestützte Werkzeuge verbessert werden können. Von besonderer Bedeutung sind die Bildverarbeitung und die Registrierung multi-modaler Bildsequenzen, Segmentierung, dreidimensionale Modellierung, und visuelle Präsentation anatomischer Strukturen, visuelle Simulation der Behandlungskonzepte, Präsentierung der Ergebnisse numerischer Simulationsergebnisse und Entwicklung geeigneter Evaluierungswerkzeuge, wissensbasierte Systeme zur Unterstützung der Therapieplanung sowie Werkzeuge zum Therapiemonitoring. Die bisherigen Aktivitäten gliedern sich in sechs Projekte: Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie 1. Registrierung multi-modaler Bildsequenzen, Segmentierung und Repräsentation anatomischer Strukturen 2. VIRTUOS - VIRTUal RadiOtherapy Simulator 3. TAPIR - Wissensbasierte Strahlentherapieplanung 4. IRIS Internet based Radiotherapy Information System 5. OCTOPUS - Planungssystem für die Protonentherapie von Augentumoren 6. STELA - STereotaktische LAser-Neurochirurgie Die künftigen Vorhaben lassen sich in zwei Teilziele unterteilen. Das Erste ist die kontinuierliche Weiterentwicklung der existierenden Planungsprogramme für die Strahlentherapie zur Unterstützung der klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie (PD Dr. Debus, E050), um es dieser Gruppe zu ermöglichen, ihre wissenschaftliche Arbeit fortzusetzen und auszudehnen [1]. Dazu wird ein zuverlässiges Planungssystem benötigt, das es erlaubt, neue Funktionalitäten bei Bedarf schnell zu integrieren. Neben den Aktivitäten 1, 2 und 3 gehört dazu auch die Weiterentwicklung des Systems für die Anwendung innerhalb des Schwerionen-Therapieprojekts (Dr. Jäkel, GSI/ DA-Projekt E0409). Aktivität 1 gewinnt dabei zunehmend an Bedeutung, da hierbei Methoden entwickelt werden, die es erlauben sollen, zeitliche Lage-, Größen- und Formveränderungen von Zielvolumen und Risikoorganen adäquat zu berücksichtigen. Solche Veränderungen müssen bisher durch ausreichend große Sicherheitsbereiche kompensiert werden. Mit dem Konzept der adaptiven Strahlentherapie will man in Zukunft versuchen, diese Veränderungen möglichst vor jeder Dosisfraktion mit Hilfe von Verifikationsaufnahmen zu detektieren und durch eine Modifikation der Behandlungsparameter zu kompensieren. Eine wichtige Voraussetzung sind schnelle Segmentierungsalgorithmen und elastische Registrierungsverfahren, die es erlauben, Veränderungen der individuellen Patientenanatomie automatisiert zu erkennen [2, 3]. In Aktivität 3 wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der nicht nur die Generierung von dreidimensionalen Behandlungsplänen erheblich beschleunigen kann, sondern es auch erlaubt, Behandlungsstrategien systematisch zu sammeln und auszutauschen. Gemeinsam mit Aktivität 4 wurden Methoden entwickelt, die eine einfachere Verbreitung anerkannter Behandlungskonzepte über das Internet er- Abb.: IRIS Internet-based Radiotherapy Information System 301

302 302 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie möglichen sollen. Dazu gehört auch die Integration von Video-Conferencing und Consulting Möglichkeiten [5]. Das zweite Teilziel der AG E0403 ist die Erweiterung und Anpassung der entwickelten Planungsstrategien für andere minimal-invasive Therapieformen. In Aktivität 5 haben wir zusammen mit Dr. H. Fuchs und Dr. H. Kluge, Hahn- Meitner-Institut Berlin, ein Planungssystem für die Therapie von Augentumoren mit Protonen entwickelt [4]. Das System wird derzeit bei den Partnern in Berlin unter klinischen Bedingungen getestet. Ein weiterer Ansatz wurde mit Prof. V. Sturm, Klinik für stereotaktische Neurochirurgie, Köln und MRC Systems, Heidelberg in Aktivität 6 Stereotaktische Laserneurochirurgie untersucht. Mit einem Ultra-Kurzpulslaser sollen tiefliegende Hirntumore ohne thermische Schädigung des umgebenden gesunden Gehirngewebes entfernt werden. In dieser Kooperation war das DKFZ verantwortlich für die Entwicklung eines geeigneten Planungssystems. Auf Grund auslaufender Drittmittel und chronischem Mangel an qualifiziertem Personal wurden beide Aktivitäten zu Gunsten der anderen Projekte vorerst eingestellt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Thilmann C, Zabel A, Kuhn S, Bendl R, Rhein B, *Wannenmacher M, Debus J (2002) Invers optimierte intensitätsmodulierte Strahlenbehandlung bei einer Patientin mit rechtsseitigem Mammacarcinom und Trichterbrust. Strahlenther Onkol, 178 (11): [2] Littmann C (2002) Implementierung eines Verfahrens zur elastischen Anpassung von segmentierten Planungsvolumina (Tumor, Risikoorgane) an CT-Verifikationsaufnahmen im Rahmen fraktionierter Strahlentherapie, Diplomarbeit Med. Informatik, Universität Heidelberg [3] Lechsel G (2003) Semi-automatische Segmentierung von Risikoorganen mit Hilfe von aktiven Konturmodellen für die Therapieplanung, Diplomarbeit Physik, Universität Heidelberg [4] B. Dobler, R. Bendl: Precise Modelling of the eye for proton therapy of intra-ocular tumours. Phys. Med. Biol. 47 (2002): [5] A. Luettgau, R. Bendl: Technical Aspects of Internet Based Knowledge Presentation in Radiotherapy. Med. Inform. Vol. 26, No. 4 (2001): Therapieplanung - Anwendung (E0404) A. Höss In Zusammenarbeit mit: PD Dr. U. Oelfke, Dr. S. Nill (E0401), Dr. R. Bendl (E0403), G. Echner (E0405), Prof. Dr. G. Hartmann (E0408), PD Dr. O. Jäkel, PD Dr. C. Karger (E0409), Abt. Medizinische Physik in der Strahlentherapie, DKFZ; Prof. Dr. Dr. J. Debus et al., Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050), DKFZ; B. Rhein, P. Häring, J. Pruisken, Strahlenschutz und Dosimetrie (W060), DKFZ; PD Dr. S. Delorme, Abt. Radiologie (E010), DKFZ; Prof. Dr. L. Schad, Abt. Medizinische Physik in der Diagnostik (E020), DKFZ; Prof. Dr. N. Ayache, INRIA, Sophia Antipolis, Frankreich; Prof. Dr. H. Blattmann, Dr. A. Lomax, Paul Scherrer Institut, Villigen, Schweiz; Dr. D.T.L. Jones, E. De Kock, ithemba LABS, Faure, Südafrika; Prof. Dr. G. Kraft, GSI, Darmstadt; Prof. Dr. G. Nemeth, Dr. O. Esik, National Institute of Oncology, Budapest, Ungarn; Dr. S. Scheib, S. Gianolini, Klinik Im Park, Zürich, Schweiz; Prof. Dr. R. Schmidt, Dr. T. Frenzel, Abt. Strahlentherapie, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf, Hamburg; Dr. U. Schneider, Klinik für Radio-Onkologie und Nuklearmedizin, Zürich, Schweiz; Siemens AG, MED OCS Heidelberg; Prof. V. Smith, Dr. A. Pirzkall, Dept. of Radiation Oncology, UCSF, USA; Stryker Leibinger GmbH, Freiburg; Prof. Dr. V. Sturm, Klinik für Neurochirurgie der Universität Köln; Prof. Dr. M. Wannenmacher, Dr. D. Oetzel, Radiologische Universitätsklinik, Heidelberg; Prof. Dr. S. Webb, Dr. J. Bedford, The Institute of Cancer Research, Sutton, England, UK Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Die Arbeitsgruppe befasst sich mit dem Betrieb, der Anwenderunterstützung und der Qualitätssicherung der in der Abteilung Medizinische Physik in der Strahlentherapie (E040) entwickelten Softwarepakete für die dreidimensionale Strahlentherapieplanung. Diese Software - das konventionelle 3D Planungssystem VOXELPLAN/VIRTUOS und das von Siemens MED OCS Heidelberg vertriebene IMRT Plug- In KonRad - dient sowohl als modulare Forschungs- und Entwicklungsumgebung für die Mitarbeiter der Abteilung und deren Kooperationspartner als auch als vollwertiges, von der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050) im Rahmen von klinischen Studien [1-2,4-7] am Patienten eingesetztes Therapieplanungssystem. Die Arbeitsgruppe konzentriert sich auf die Systembetreuung und Qualitätssicherung der Installationen, die sich im klinischen Einsatz befinden, um einerseits den gesetzlichen Anforderungen an Betriebssicherheit und Ergebnisgenauigkeit gerecht zu werden und andererseits die aus dem klinischen Einsatz gewonnenen Erkenntnisse in die Weiterentwicklung der Software einfließen zu lassen. Eine weitere wesentliche Aufgabe der Arbeitsgruppe besteht in der Verifikation und Validierung von neu entstandenen Software-Modulen bis hin zu deren Freigabe für die klinische Prüfung sowie in der Durchführung und Dokumentation von sicherheits- und messtechnischen Kontrollen (s.u.) im Sinne einer regelmäßigen Konstanzprüfung aller im klinischen Einsatz befindlichen Software- und Hardware-Komponenten inklusive der für die Therapieplanung herangezogenen bildgebenden Modalitäten [3]. Im Berichtszeitraum wurde - in enger Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen Therapieplanung - Entwicklung (E0403), Physikalische Modelle (E0401) und Strahlenschutz und Dosimetrie (W060) - eine PC-basierte LINUX Version von VOXELPLAN/VIRTUOS getestet und für die klinische Prüfung freigegeben. Diese Version enthält eine Vielzahl neuer Funktionen, insbesondere ein neues Modul für den DICOM-Import von CT- und MR-Daten, wodurch die Bestrahlungsplanung im Ablauf weiter vereinfacht und beschleunigt wird, was die Implementierung und Evaluation neuer Bestrahlungstechniken erleichtert. Aufgrund des erheblichen Mehraufwandes, der durch die Einhaltung des MPG (s.u.) sowohl bei ständigem Betrieb eines nichtzertifizierten Bestrahlungsplanungssystems wie VOXELPLAN/ VIRTUOS als auch bei der Inbetriebnahme neu entwickelter Software-Module oder -Versionen entsteht, wurden die Bemühungen verstärkt, Routineaufgaben an CEzertifizierte Systeme zu verlagern. Die für die Radiochirurgie im Kopf-/Halsbereich betriebene UNIX Version des kommerziellen Bestrahlungsplanungssystems STP 4 der Stryker Leibinger GmbH wurde durch eine leistungsfähigere PCbasierte Windows-NT Version ersetzt. Die vor Inbetriebnahme erforderliche Funktionsprüfung und (nichtdosimetrische) Abnahme dieses Systems wurde von der Arbeitsgruppe ebenso übernommen wie alle mit dem Betrieb eines solchen Systems verbundenen Qualitätssicherungsaufgaben und Dokumentationsverpflichtungen. Seit Inkrafttreten des Medizinproduktegesetzes (MPG) - das auch auf Software und Software-Komponenten anzuwenden ist - hat sich die Arbeitsgruppe mit den daraus resultierenden Konsequenzen für Herstellung und Betrieb von Medizinprodukten durch die Abteilung Medizinische Physik in der Strahlentherapie und deren Anwendung durch die Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie beschäftigt. Da sämtliche klinisch relevanten In-Haus-Herstellungen - sowohl am Patienten angewandte Medizinprodukte als auch zu Prüfzwecken angefertigte Messphantome - den

303 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Aufsichtsbehörden vor Inbetriebnahme gemeldet werden müssen, erfüllt die Arbeitsgruppe kontinuierlich die mit einer solchen Anzeige und dem darauffolgenden Einsatz verbundenen Auflagen bzgl. der Prüfung und Überwachung dieser Medizinprodukte (insbes. Dokumentationsverpflichtungen) sowie alle Verpflichtungen, die sich aus Änderungen des MPG sowie durch den Erlass und die Änderung von Rechtsverordnungen ergeben. Im Berichtszeitraum wurde - in enger Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Hardware-Entwicklung (E0405) - die Medizinprodukte-Betreiberverordnung (MPBetreibV) umgesetzt, die sowohl für In-Haus-Herstellungen als auch für käuflich erworbene, CE-zertifizierte Medizinprodukte gilt und u.a. ein Bestandsverzeichnis der Medizinprodukte, das Vorhandensein von Gebrauchsanweisungen, die Einweisung des Bedienpersonals, die Führung von Medizinproduktebüchern und die Durchführung und/oder Überwachung von sicherheits- und messtechnischen Kontrollen sowie von Instandhaltungsmaßnahmen fordert. Das für die Abteilung Medizinische Physik in der Strahlentherapie erstellte Bestandsverzeichnis umfasst z.zt. knapp 300 am DKFZ, der Radiologischen Universitätsklinik Heidelberg und der GSI Darmstadt in der klinischen Anwendung befindliche Medizinprodukte. Auf Grundlage der erhobenen Daten überwacht, koordiniert und dokumentiert die Arbeitsgruppe sämtliche sicherheits- und messtechnischen Kontrollen sowie alle Wartungs- und Instandhaltungsmaßnahmen, wodurch insbesondere ein sicherer und effizienter Einsatz der In-Haus- Herstellungen gewährleistet werden soll. Die Aktivitäten der Arbeitsgruppe auf dem Gebiet der Umsetzung von MPG und MPBetreibV in der patientennahen Forschung und Entwicklung haben Pilotcharakter für das gesamte DKFZ. Der erarbeitete Prototyp eines tagesaktuellen Bestandsverzeichnisses dient als Spezifikation für eine DKFZ-weite Medizinprodukte-Datenbank, die Anfang 2004 implementiert und getestet werden soll. Publikationen (* = externer Koautor): [1] Herfarth KK, Hof H, Bahner ML, Lohr F, Höss A, van Kaick G, *Wannenmacher M, Debus J: Assessment of focal liver reaction by multiphasic CT after stereotactic single-dose radiotherapy of liver tumors. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 57(2) (2003) [2] Hof H, Herfarth KK, Münter M, Höss A, *Motsch J, *Wannenmacher M, Debus J: Stereotactic single-dose radiotherapy of stage I non-small-cell lung cancer (NSCLC). Int J Radiat Oncol Biol Phys, 56(2) (2003) [3] Karger CP, Hipp P, Henze M, Echner G, Höss A, Schad L, Hartmann GH: Stereotactic imaging for radiotherapy: accuracy of CT, MRI, PET and SPECT. Phys Med Biol, 48(2) (2003) [4] Milker-Zabel S, Zabel A, Thilmann C, Zuna I, Hoess A, *Wannenmacher M, Debus J: Results of three-dimensional stereotactically-guided radiotherapy in recurrent medulloblastoma. J Neuro-Oncol, 60 (2002) [5] Münter MW, Nill S, Thilmann C, Hof H, Hoss A, Haering P, *Partridge M, *Manegold C, *Wannenmacher M, Debus J: Stereotactic intensity-modulated radiation therapy (IMRT) and inverse treatment planning for advanced pleural mesothelioma. Feasibility and initial results. Strahlenther Onkol, 179(8) (2003) [6] Pirzkall A, Debus J, Haering P, Rhein B, Grosser KH, Höss A, *Wannenmacher M: Intensity modulated radiotherapy (IMRT) for recurrent, residual, or untreated skull-base meningiomas: preliminary clinical experience. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 55(2) (2003) [7] Thilmann C, Zabel A, Nill S, Rhein B, Hoess A, Haering P, Milker-Zabel S, *Harms W, Schlegel W, *Wannenmacher M, Debus J: Intensity-modulated radiotherapy of the female breast. Med Dosim, 27 (2002) Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Hardware Entwicklung (E0405) G. Echner, C. Lang Medizintechnik (E0406) S. Barthold-Beß, S. Halbauer, M. Hub, R. Illés, W. Korb, T. Liebler, C. Sanner, M. Scherer, M. Schneberger, T. Weiskat In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Dr. J. Debus, Klinische Kooperationseinheit Radiotherapeutische Onkologie (E050), DKFZ; Zentrale Einheit Strahlenschutz und Dosimetrie (W060), DKFZ; Prof. Dr. J. Richter, Department for Medical Physics, Universität Würzburg; Prof. Dr. V. Sturm, Clinic for Stereotaxy and Functional Neurosurgery, Universität Köln; Prof. S. Webb, Institute of Cancer Research/Royal Marsden Hospital, Sutton, UK; Siemens SMS/OCS, Concord USA und Heidelberg; Stryker Leibinger GmbH, Freiburg; Nexsys GmbH, Leimen; Cadcon GmbH, Sandhausen Die Hauptaufgabe der Forschungsgruppe E0405 ist die Entwicklung und Evaluierung von neuen Vorrichtungen, Geräten oder Modulen für die Stereotaxie und fraktionierte Strahlentherapie für unterschiedliche Zielvolumina, die Untersuchung und der Test von neuen Hardwarekomponenten für die konforme Strahlentherapie und angrenzende Forschungsgebiete. Weitere Aufgaben liegen in der Qualitätssicherung der entwickelten Hardwarekomponenten. Hauptarbeitsgebiet der Forschungsgruppe E0406 ist die Entwicklung von Methoden und Komponenten zur Verbesserung der Patientenpositionierung sowie zur Bewegungskontrolle während der Behandlung einschließlich die Entwicklung und Implementierung von spezieller Hardwareund Softwarekomponenten für die Positionsüberwachung von Patienten vor und während der Therapie einschliesslich Bildverarbeitungswerkzeugen. Entwicklung von Komponenten für die Patientenpositionierung Ein Ziel unserer Tätigkeiten ist die Entwicklung einer Plattform für die Patientenpositionierung - Fast Integrated Videobased Environment (FIVE) - um diese für die klinische und experimentelle Zwecke bereitzustellen [1,2,3,5]. Die Plattform besteht aus Soft- und Hardwarekomponenten und steht derzeit für verschiedene Anwendungsgebiete zur Verfügung. Das Grundmodul des FIVE basiert auf einem optischen Trackingsystem, welches zu Mess- und Navigationszwecken genutzt werden kann. Zu den vorhandenen Modulen für die Bestimmung der Patientenposition wurden in den letzen beiden Jahren ein Differenzbildmodul und ein Modul zur Trennung des Hintergrundes (Blue Room) neu erstellt. Differenzbildmodul für die Positionierung von Mammapatientinnen: Um die Qualität der Therapie weiter zu erhöhen, wurde ein Verfahren gesucht, das ohne nennenswerten zusätzlichen Material- und Zeitaufwand eine noch höhere Genauigkeit gewährleistet. Eine Möglichkeit hierzu besteht in der Analyse von Differenzbildern aus Videoaufnahmen [4]. Dabei ist eine Berücksichtigung der Verschiebbarkeit der Brust relativ zum Brustkorb erstrebenswert. Das Verfahren basiert auf Laserprojektionen, die durch einen ausreichend großen Helligkeitsunterschied gegenüber der Umgebung, unabhängig von den Beleuchtungsbedingungen, aus den Videobildern extrahiert werden können. Die Positionen der Linien in den Kamerabildern lassen durch Vergleich mit den Referenzbildern erkennen, ob sich die Brust in der gewünschten Position befindet oder nicht, dabei werden die Linien von der zugehörigen Software online extrahiert. 303

304 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Zusätzliche visuelle Information über die Position der Brust lässt sich nun, bei geeigneter Ausrichtung der Diodenlaserlinien relativ zueinander, ihrem Abstand im Kamerabild entnehmen. Das Verfahren wurde in einem weiteren Schritt so modifiziert, dass es für das Gating des Linearbeschleunigers genutzt werden kann. Dabei wird jedes Einzelbild für eine Bewertung der Brustposition herangezogen. Bewertet wird dabei ein Schwellabstand zwischen Referenzbild und Livebild, befindet sich dieser innerhalb dieses wird die Position als ok eingeordnet (Abb. 1). Diese Informationen können genutzt werden, um die Einschaltzeiten des Linac für die Therapie zu steuern. Mit Hilfe dieses Moduls kann die Genauigkeit der Dosisapplikation in Hinsicht auf das Zielvolumen verbessert werden. Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Im Gegensatz zum MLC wird hierbei der Kollimator über das zu modulierende Feld bewegt, d.h. man scannt ein größeres Feld mit einem kleinen Kollimator ab, innerhalb dessen Öffnungsfenster verschiebbare konische Stäbe angebracht sind, die eine zusätzliche Ausblendung in kleinen quadratischen Bereichen ermöglichen. Zur Umsetzung des physikalischen Modells in die Praxis, wurden dosimetrische Messungen durchgeführt, deren Ergebnisse zu einer geeigneten Hardwarekonstruktion herangezogen werden sollen. In einem weiteren Schritt soll die Implementierung der systemspezifischen Feldmuster in die inverse Bestrahlungsplanung erfolgen, bevor das fertige Gerät dann letztendlich in der Praxis zum Einsatz kommt.zur Herstellung intensitätsmodulierter Felder benötigt das System einen VAC-Kollimator mit einem offenen rechteckigen Strahlenfenster. Das Fenster definiert ein zweidimensionales Feld aus n Spalten und m Reihen. Im Falle dieses Projektes wurde eine Feldgröße von 4 Spalten und 5 Reihen definiert (Abb. 2). Der VAC-Kollimator besitzt innerhalb des Fensters konische, stabförmige Blenden, die in der Regel paarweise in jeder Spalte des Fensters angeordnet sind. Diese Stäbe können einzeln entlang der Spalten in diskreten Schritten bewegt werden (s. Abb. 4). 304 Abb. 1: Differenzbild beim Gating Blue Room Modul: Bei der Blue Room Methode verwendet man eine retroreflexierende Oberfläche als Hintergrund und beleuchtet ein 3D Objekt, z.b. Patient mit Infrarotlicht. Mit Hilfe von Tageslichtsperrfiltern werden Kameraufnahmen im Infrarotbereich gemacht. Mit dieser Methode kann man die beleuchteten Objekte gut segmentieren, da die Hintergrundpixel weiss und die Objektpixel schwarz sind. Man erhält so ein 2D Projektionsbild von 3D Objekten. Entwicklung eines Stab-Kollimators (VAC- Collimator) Ziel des Gemeinschaftsprojektes zwischen dem DKFZ und dem Institute of Cancer Research (ICR) ist die Entwicklung einer alternativen, im Vergleich zum Multi-Leaf-Collimator (MLC) wesentlich weniger komplexen Technik zur Erzeugung intensitätsmodulierter Felder für den Einsatz in der intensitätsmodulierten Strahlentherapie (IMRT). Gerade im Bereich kleiner Feldgrößen erhofft man sich auf Grundlage dieser Technik ein größeres Leistungspotential, als bei Nutzung des MLC. Das Projekt basiert auf einem physikalischen Modell von Steve Webb (ICR) welches VAC (Variable Aperture Collimator) genannt wurde und gliedert sich in drei Hauptteile [6]: physikalische Dosimetrie Hardwareentwicklung und -erprobung Implementierung der spezifischen Feldmuster in die inverse Bestrahlungsplanung Abb. 2: Feldmatrix Schematische Darstellung einer Feldmatrix aus 4 Spalten und 5 Reihen mit 8 Stäben in Parkposition (links) und in einer der möglichen Anordnungsoptionen (rechts). Der gesamte Kollimator soll linear-, eventuell auch rotationsbeweglich und zur Strahlenquelle fokussierend gelagert sein, um größere Felder abzuscannen, bzw. um die Anordnungsoptionen weiter zu erhöhen. Ein solcher Kollimatortyp wurde im Jahr 2001 zum Patent angemeldet. Erste dosimetrische Messungen (siehe Abb. 3) für unterschiedliche Stabquerschnitte mit einer Auflösung von 5x5mm² bzw. 10x10mm² (bezogen auf das Isozentrum) haben folgendes ergeben: Aufgrund großer Abweichungen in der Feldlänge (bis zu 50%) und einer geringen Dosismodulation (maximal 65%) scheint mit der hochauflösenden VAC-Ausführung von 5mm im Isozentrum eine sinnvolle Nutzung im Sinne der IMRT nicht möglich. Aus diesem Grund wird die Entwicklung an einem VAC-Prototypen auf Grundlage einer 10mm Auflösung im Isozentrum weitergeführt. Das Verfahren wurde 2003 zum Patent angemeldet [6].

305 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Abb. 5: Mamma Phantom Da das 1:1-Modell eines Torso für Messungen mit einem Flachdetektor zu groß war, wurde ein verkleinertes Modell des Phantoms entwickelt und gebaut, welches außer den Eigenschaften des ursprünglichen Mamma-Phantoms noch Knochenstrukturen enthält. Abb. 6 zeigt die Aufnahme einer Scheibe des Phantoms mit eingebauter Lungen-und Knochenstruktur. 305 Abb. 3: Aufbau zur dosimetrischen Messung Die Abbildung zeigt den Messaufbau unter dem Strahlerkopf. Die auf der beweglich gelagerten Plexiglasplatte montierten Stäbe (SBA) sind nach der Strahlendivergenz ausgerichtet. Der Aufbau ist so gestaltet, dass ein SCD=520mm eingehalten wird. Die Filmemulsion liegt auf der Isozentrumsebene. Abb. 4: Aufbau Einschubplatte Das Photo zeigt die auf der Linac- Einschubplatte befestigte Adapterplatte mit zur Strahlenquelle fokussierend montierten Stäben. Entwicklung von Phantomen für die Qualitätssicherung Mamma-Phantom Zur Verifizierung von Bestrahlungsplänen, speziell im extracraniellen Bereich wurde ein sogenanntes Mamma-Phantom entwickelt, das aus 30 Scheiben des Materials RW3 besteht (jeweils 1cm dick), in das lungenäquivalentes Material eingebettet ist (Abb. 5). Zusätzlich besteht die Möglichkeit, im Bereich der Lunge einen dreidimensionalen Tumor aus RW3 einzubringen. Die einzelnen Scheiben wurden nach einem CT-Datensatz gefertigt, dessen Bilder mittels CAD-Software in Fräsprogramme umgewandelt wurden. Zur Qualitätssicherung von Bestrahlungsplänen können zwischen die einzelnen Schichten Röntgenfilme eingelegt und das Phantom bestrahlt werden. Durch die Auswertung des Films können Rückschlüsse auf die Qualität des Bestrahlungsplans gezogen werden. Abb. 6: Scheibe des verkleinerten Mamma-Phantoms mit Lungenund Knochenstruktur Stabphantom Zur Überprüfung der Genauigkeit stereotaktischer Koordinaten im CT, MR, PET und SPECT wurde ein universell einsetzbares Stabphantom entwickelt (Abb. 7). Hierbei können stereotaktisch gemessene Koordinaten von Strukturen innerhalb des Phantoms mit deren mechanisch definierten Koordinaten verglichen werden. Das Phantom besteht aus Plexiglas-Stäben unterschiedlicher Längen mit Bohrungen als Zielpunkt (Abb. 8). Diese Bohrungen können mit Flüssigkeit gefüllt, abgedichtet und mittels eines Deckels verschlossen werden. Vier der Stäbe sind mit langen Bohrungen ausgestattet, die ebenfalls mit Flüssigkeit gefüllt werden können. Bei Messungen im MR wurde mit zwei unterschiedlichen Anordnungen für T1- und T2-Wichtungen Aufnahmen gemacht und die Zielpunkte mittels der Auswertungssoftware bestimmt. Ein Vergleich mit den bekannten mechanisch definierten Positionen der Zielpunkte ergab für die beiden Anordnungen eine mittlere radiale Abweichung von 0,69±0,22mm und 1,35±0,51mm. Die mittlere Abweichung für CT lag bei 0,40±0,17mm und für PET bei 1,13±0,50mm bzw. 2,75±1,03mm. Als mittlere

306 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Abweichungen bei SPECT-Aufnahmen wurden 1,95±0,52mm und 2,05±0,58mm ermittelt. Das Phantom ist gut geeignet zur Überprüfung der Genauigkeit stereotaktischer Lokalisatoren für CT, MR, PET und SPECT und damit ein gutes Hilfsmittel für die Qualitätssicherung der Geräte und Lokalisatoren speziell für den Kopf-Halsbereich. Abb. 7: Zusammenbau des Stabphantoms Abb. 9: Entwurf des Zielgerätes 306 Abb. 8: Unterschiedliche Stabtypen Motorisch einstellbarer Zielpunktsimulator für die stereotaktische Neurochirurgie Die stereotaktische Neurochirurgie ist eine minimalinvasive Operationstechnik. Da der Chirurg keinen direkten Blick auf das Operationsfeld hat ist, eine Simulation notwendig, damit sichergestellt ist, dass der Zielpunkt der Operation mit den Instrumenten auch erreicht werden kann. Bekannte Systeme sind Jahrzehnte alt und bergen einige Risiken der Fehleinstellung. Zusammen mit zwei Kooperationspartnern wurde ein System entwickelt, welches zu bestehenden Stereotaxiesystemen kompatibel ist. Hierbei kann ein stereotaktischer Kopfrahmen mit dem motorisch einstellbaren Zielpunktsimulator verbunden und Instrumente am Rahmen befestigt werden (siehe Abb. 9 und Abb. 10). Mittels dreier motorisch angetriebener computergesteuerter Linearachsen kann eine konische Spitze, die den Zielpunkt definiert, zum gewünschten Zielpunkt gefahren werden. Zur Ansteuerung der Achsen können Daten aus einem Planungssystem verwendet werden, die entweder manuell oder automatisch - beispielsweise mittels serieller oder paralleler Schnittstelle - übertragen werden. Ein erste Prototyp der Vorrichtung wurde gebaut und ein Programm geschrieben, das die Ansteuerung der Achsen erlaubt. In einem ersten Schritt wurde nur die manuelle Ansteuerung der Achsen verwirklicht, die durch Eingabe von Daten über einen eingebauten Touchscreen erfolgt. Als nächste Schritte stehen Kalibrierung und Test des Systems an. Abb. 10: Prototyp des motorisch einstellbaren Zielpunktsimulators Publikationen und Patente (* = externer Koautor): [1] Liebler Th; Sanner Ch; Thilmann Ch; Schneberger M; Echner G: Implementierung eines Differenzbildverfahrens zur Repositionierung von Patientinnen mit Mamma-Karzinom. In: Medizinische Physik 2002, (CD-ROM). [2] Liebler Th; Schneberger M; Schlegel W: A general application framework for the integration of video-based patient positioning techniques. In: Proceedings of the 2nd European Medical & Biological Engineering Conference (EMBEC 02), (2002) [3] Schneberger M; Liebler Th; Schlegel W: High precision 3D acquisition: video-based patient positioning and optical tracking. In: Proceedings of the 2nd European Medical & Biological Engineering Conference (EMBEC 02), (2002) [4] Hub M; Liebler T; Sanner C; Schneberger M; Barthold-Bess S; Thilmann C; Schlegel W: Evaluierung und Optimierung eines Differenzbildverfahrens (DBV) zur Repositionierung von Patientinnen mit Mammakarzinom. In: Medizinische Physik Hrsg.: W. Semmler, L. Schad. Heidelberg: DGMP, (2003) [5] Liebler T; Hub M; Sanner C; Schlegel W: An application framework for computer-aided patient positioning in radiation therapy. Medical Informatics and the Internet in Medicine, 28(3) (2003) [6] Britische Patent Anmeldung Method and apparatus for producing an intesity modulated beam of radiation Erfinder: Schlegel, Echner, Hartmann, Webb*

307 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Anwendung von neuen Methoden in der Strahlentherapie (E0408) G. Hartmann, F. Föhlisch, R. Hofmann, E. Wehrwein Kooperationen Prof. J. Debus, Radiologische Klinik der Universität Heidelberg; PD P. Huber, Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie des DKFZ; Dr. Hörandl, Universität und Forschungszentrum Karlsruhe, Institut für Kernphysik; Sánchez- Doblado F, Hospital Universitario Virgen Macarena, Radiofísica, Sevilla, Spanien Die Arbeitsgruppe befaßt sich in enger Zusammenarbeit mit anderen Arbeitsgruppen der Abteilung mit der Weiterentwicklung und der klinischen Anwendung von neuen Methoden in der Strahlentherapie. Einzelne Projekte sind: a) Qualitätssicherung in der Dosimetrie Die Möglichkeiten für eine hochpräzise und standardisierte Messung der Wasser-Energiedosis haben sich in den letzten Jahren sehr verbessert. In Deutschland sind entsprechende normative Regeln in DIN festgelegt. Die Internationale Atomenergiebehörde in Wien hat einen neuen Code of Practice zur Bestimmung der Energiedosis in der externen Strahlentherapie herausgegeben (TRS- 398). Ziel ist es, diese Standards in einer klinischen Umgebung zu implementieren, zu testen und, falls erforderlich, zu einer weiteren Verbesserung insbesondere bei einzelnen Korrektionsfaktoren sowie in der praktischen Anwendbarkeit beizutragen. TRS 398 Dieser CoP beansprucht für sich, die Anforderungen an ein systematisches und international vereinheitlichtes Verfahren zur Kalibrierung von Ionisationskammern, sowie zu deren Anwendung zur Bestimmung der Wasser-Energiedosis in therapeutischen Bestrahlungsfeldern zu erfüllen. Es war daher notwendig, sowohl Verfahren als auch Ergebnisse zu vergleichen, die gemäß diesem Dokument und die nach der Deutschen Norm gewonnen werden. Ein Vergleich wurde bei 6 MV und 15 MV Photonen, sowie bei 12 MeV und 18 MeV Elektronen durchgeführt. Obwohl eine ganze Reihe von Unterschieden, insbesondere bei den Feldstörungs-Korrektionen, festgestellt werden kann, liegen die Übereinstimmung in den Ergebnissen der Dosisbestimmung letztlich innerhalb des zugehörigen Unsicherheitsbereichs [11,19]. DIN Im Vergleich zur TRS 398 sollte die Deutschen Norm in einigen Punkten verbessert werden: (a) die praktische Anwendung für den Anwender in der Klinik kann erleichtert werden, (b) neuere Daten zur Dosisbestimmung sollten berücksichtigt werden, und (c) ein besserer Anschluß an internationale Empfehlungen sollte angestrebt werden. Die Mitarbeit im zugehörigen DIN Arbeitskreis hat die Berücksichtigung der genannten Punkte zum Ziel. Dosimetrie unter Nicht-Referenzbedingungen Die Ionisationskammerdosimetrie in der Stereotaxie oder IMRT weicht üblicherweise erheblich von den Messbedingungen der Standarddosimetrie ab. Es sind daher Abweichungen zwischen gemessener und tatsächlicher Dosis zu erwarten. Abweichungen wurden quantitativ untersucht [18,20] Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie b) Einführung von motorisch getriebenen und computergesteuerten Lamellenblenden in die klinische Anwendung Die Entwicklung von motorisch betriebenen und computerkontrollierten Lamellenblenden (Multi-Leaf-Collimator, MLC) hat ganz wesentlich die Realisierung neuer, dosiskonformierender Bestrahlungstechniken ermöglicht. Beispiele sind die konformale Strahlentherapie und insbesondere die intensitätsmodulierte Strahlentherapie (IMRT), die überwiegend auf der Verfügbarkeit von geeigneten MLC-s beruht. Aufgabe ist es, die in der Abteilung oder in Zusammenabeit mit der Abteilung entwickelten MLCs dosimetrisch zu charakterisieren, einer Qualitätskontrolle zu unterziehen und sie in die klinische Testphase zu bringen. - Mittelfeld MLC (Firma MRC, jetzt Siemens) [7] - Mittelfeld MLC des DKFZ (mit beweglicher Leaf- Kantenverstellung) - Prototyp eines MLC für große Felder (bis 40 x 40 cm 2 ) c) Entwicklung von Vielkanal-Detektorsystemen zur dreidimensionalen Dosimetrie Die neuen Bestrahlungstechniken sind komplex in ihrem zeitlichen Ablauf, die klinische Anwendung erfordert häufig die Überprüfung der geplanten dreidimensionalen Dosisverteilung vor der Behandlung des Patienten (Dosisverifikation). Wünschenswert sind Viel-Kanal-Systeme, die Dosisbestimmungen an mehreren Orten gleichzeitig zulassen. Unser Ansatz ist es, eine segmentierte Flüssigkeitsionisationskammer hierfür einzusetzen. Vorteil dieser Methode ist es, daß (a) eine Segmentierung bis in den Millimeterbereich noch eine genügend hohe Signalausbeute liefert und (b) zweidimensionale Detektorarrays in einfacher Weise in einem dreidimensionalen Stapel angeordnet werden können (3D Detektor). Ziel ist die Entwicklung eines Prototyps mit automatisierter Meßwerterfassung sowie von effizienter Software, die in real-time einen vollständigen Vergleich zwischen der gemessenen und der berechneten Dosis ermöglicht. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Kerntechnik, FZ Karlsruhe, wurde eine segmentierte zweidimensionale Flüssigkeitsionisationskammer konstruiert, deren Segmentierung an die Lamellenbreite eines Mittelfeld-MLC angepaßt wurde. Parallel dazu wurde ein Multikanal-Auslesesystemen mit 500 Kanälen entwickelt, das eine vollständige und simultane Ladungsmessung aller Kanäle in Schritten von 100 msec erlaubt. Ein erster Prototyp lieferte bereits vielversprechende Ergebnisse [10]. d) Strahlenreaktionen nach Radiochirurgie am Tiermodell. Bei der Strahlentherapie im Kopf-Hals-Bereich stellen mögliche späte Strahlenschäden im Gehirn und am Rückenmark ein großes Risiko dar. Besonderes kritisch ist dabei die Entstehung von Nekrosen. Zur Abschätzung und Minimierung dieses Risikos muß deren Abhängigkeit von der Dosis und von anderen Bestrahlungsparametern gut bekannt sein. Dies hat uns veranlaßt, die Dosis-Wirkungsbeziehung an einem Tiermodell zu untersuchen. Der Vorteil bei einem Tiermodell ist, daß eine Dosiswirkungsbeziehung quantitativ und mit hoher Genauigkeit gemessen werden kann. Ziel ist es, zunächst eine Referenzbeziehung zu etablieren um dann den Einfluß von anderen Bestrahlungsparametern, wie z.b. eine veränderte Fraktionierung oder Strahlenart (Photonen, 12 C-Ionen) zu bestimmen zu können. 307

308 308 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Es wurden sowohl radiochirurgische Einzeitbestrahlungen am Rattenhirn (bestrahltes Volumen: 5 mm Durchmesser) als auch Fraktionierte Bestrahlungen am Rückenmark der Ratte durchgeführt (Länge des bestrahltes Segments: 15 mm). Die strahleninduzierten Veränderungen wurden bei den Hirnbestrahlungen mit Hilfe der Magnetresonanz- Tomographie über einen Zeitraum von 1½ Jahren verfolgt und ausgewertet. Im Fall der Rückenmarksbestrahlungen wurde eine Parese II nach 9 Monaten als biologischer Endpunkt gewählt. Für alle Experimente wurden aus den Dosis-Wirkungskurven die Toleranzdosis D 50 (Dosis mit 50% Komplikationswahrscheinlichkeit) bestimmt. Histologische Ergebnisse zeigten, daß die erzeugten Strahlenschäden auf das bestrahlte Areal beschränkt bleiben. Die Experimente wurden sowohl mit einer Photonen- als auch mit einer Kohlenstoff-Ionen-Bestrahlung durchgeführt, so daß es durch die Bestimmung der Toleranzdosen D 50 möglich war die relative biologische Wirksamkeit von Kohlenstoff-Ionen in Bezug auf eine Photonenbestrahlung zu bestimmen. Obwohl sich die Struktur von Gehirn (parallele Struktur) und Rückenmark (serielle Struktur) unterscheiden wurde eine vergleichbare relative biologische Wirksamkeit gefunden. Die stützt die Hypothese, daß Daten zur relativen biologischen Wirksamkeit, die am Rückenmark gemessen wurden auf Gehirn übertragen werden können. Dies ist insbesondere deswegen von Bedeutung, da die Experimente am Rückenmark mit wesentlich geringerem Aufwand durchgeführt werden können. Zur Zeit laufen Rückenmarksexperimente mit 6 und 18 Fraktionen unter Verwendung von Photonen- und Kohlenstoffstrahlen. Ziel der Experimente ist es, die relative biologische Wirksamkeit für klinisch relevante Fraktionierungsschemata zu bestimmen. Mit Hilfe bereits vorhandener Daten zur Rückenmarkstoleranz ist es außerdem möglich, quantitative Parameter zu bestimmen mit der sich die Gewebetoleranz für verschiedene Fraktionierungsschemata ineinander umrechnen läßt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Karger C.P., Hartmann G.H.: Determination of tolerance dose uncertainties and optimal design of dose response experiments with small animal numbers. Strahlentherapie und Onkologie 177, 37-42, 2001 [2] Jäkel O., Krämer M., Karger C.P., Debus J.: Treatment planning for heavy ion radiotherapy: clinical implementation and application. Physics in Medicine and Biology 46, , 2001 [3] Münter M.W., Karger C.P., Schröck H., de Vries A., Schneider H.-M., Wannenmacher M., Debus J.: Spätveränderungen nach kleinvolumiger radiochirurgischer Bestrahlung des Rattenhirns: Messung des lokalen cerebralen Blutflusses und histopathologische Untersuchungen. Strahlentherapie und Onkologie 177, , 2001 [4] Karger C.P., Hartmann G.H., Heeg P., Jäkel O.: A method for determining the alignment accuracy of the treatment table axis at an isocentric irradiation facility. Physics in Medicine and Biology 46, N19-N26, 2001 [5] Karger C.P., Jäkel O., Debus J., Kuhn S., Hartmann G.H.: Three- dimensional accuracy and interfractional reproducibility of patient fixation and positioning using a stereotactic head mask system. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics 49, , 2001 [6] Jäkel O., Jacob C., Schardt D., Karger C.P., Hartmann G.H.: Relation between carbon ion ranges and x-ray CT numbers for tissue equivalent phantom materials. Medical Physics 28, , 2001 Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie [7] Hartmann GH, Föhlisch F: Dosimetric characterization of a new miniature multileaf collimator. Physics in Medicine and Biology 47, N171-N177, 2002 [8] Karger C.P., Münter M.W., Heiland S., Peschke P. Debus J., Hartmann G.H.: Dose response curves and tolerance doses for late functional changes in the normal rat brain after stereotactic radiosurgery evaluated by magnetic resonance imaging: influence of end points and follow-up time. Radiation Research 157, , 2002 [9] Karger CP; Jäkel O; Heeg P; Hartmann GH: Klinische Dosimetrie für schwere geladene Teilchen. Zeitschrift für Medizinische Physik, 12 (2002) [10] Eberle K., Engler J., Hartmann G., Hofmann R., Hörandl J. R.: First tests of a liquit ionization chamber to monitor intensity modulated radiation beams. Phys Med Biol 48 (2003) [11] Hartmann G. H.: Absorbed dose determination for high energy photon and electron beams at a PRIMUS linear accelerator using the documents DIN and TRS-398. Zeitschrift für Medizinische Physik 13 (2003) [12] Karger CP; Hipp P; Henze M; Echner G; Hoess A; Schad L; Hartmann GH: Stereotactic imaging for radiotherapy: accuracy of CT, MRI, PET and SPECT. Physics in Medicine and Biology, 48 (2003) [13] Veigel C. Hartmann G. H., Weber K.-J.: Dosimetrie im Nahbereich einer 192 Ir-Quelle für Applikationen an Ösaphagus und Bronchus in der Brachytherapie. Zeitschrift für Medizinische Physik 13 (2003) [14] Schulz-Ertner D., Nikoghosyan A., Didinger B., Karger C.P., Jäkel O., *Wannenmacher M., Debus J.: Treatment planning intercomparison for spinal chordomas using intensity-modulated photon radiation therapy (IMRT) and carbon ions. Physics in Medicine and Biology 48, , 2003 [15] Webb S, Hartmann G, Echner G, Schlegel W.: Intensitymodulated radiation therapy using a variable-aperture collimator. Phys Med Biol May 7;48(9): [16] Karger C.P., Schulz-Ertner D., Didinger B.H., Debus J., Jäkel O.: Influence of setup errors on spinal cord dose and treatment plan quality for cervical spine tumors: A phantom study for photon IMRT and heavy charged particle radiotherapy. Physics in Medicine and Biology 48, , 2003 [17] Schulz-Ertner D., Nikoghosyan A., Thilmann C., Haberer T., Jäkel O., Karger C.P., Scholz M., *Kraft G., *Wannenmacher M., Debus J.: Carbon ion radiotherapy for chordomas and low-grade chondrosarcomas of the skull base: Results in 67 patients. Strahlentherapie und Onkologie 179, , 2003 [18] *Capote R, *Sánchez-Doblado F, *Leal A, *Lagares JI, *Arráns R, Hartmann GH: An EGSnrc Monte Carlo study of the microionization chamber for reference dosimetry of narrow irregular IMRT beamlets. Medical Physics 31, , 2004 [19] Karger C.P., Hartmann G.H.: Experimental correction for ionic recombination in ionization chambers for pulsed radiation according to DIN and TRS 398. Z. Med. Phys. (accepted). [20] *Sánchez-Doblado F, *Capote R, *Leal A, *Rosello JV, *Lagares JI, *Arráns R, Hartmann GH: Clinical implication of the absolute dosimetry in IMRT verification. Phys Med Biol (accepted)

309 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Schwerionentherapieprojekt (E0409) O. Jäkel, A. Eisenmenger, O. Filipenko, P. Heeg, C.P. Karger, S. Qamhiyeh, P. Reiss, H.J. Wertz In Zusammenarbeit mit: PD Dr. D. Schulz-Ertner, Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapeutische Onkologie des DKFZ; Prof. J. Debus, Radiologische Klinik der Universität Heidelberg; Prof. G. Kraft, Arbeitsgruppe Biophysik, Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) Darmstadt; Dr. R. Bendl, Abt. Medizinische Physik, DKFZ. Die Arbeiten wurden teilweise durch den Strategiefonds des BMBF sowie durch das EU-Projekt ENLIGHT unterstützt. Das Schwerionentherapieprojekt wird in Zusammenarbeit zwischen der Universitätsklinik, dem DKFZ und der GSI am Schwerionensynchrotron der GSI durchgeführt. Von Dezember 1997 bis Ende 2003 wurden im Rahmen klinischer Studien mehr als 200 Patienten mit Kohlenstoffionen strahlentherapeutisch behandelt. Dabei kommt ein sogenanntes Rasterscanverfahren zum Einsatz, welches eine dreidimensionale Anpassung der Dosisverteilung auch an sehr komplizierte Tumoren ermöglicht. Zusammen mit der erhöhten biologischen Wirkung der Ionenstrahlen wird damit ein besseres Ansprechen der Tumoren erwartet. Unsere Arbeitsgruppe ist in diesem Projekt für die medizinphysikalischen Aspekte verantwortlich [1]. Dies sind die klinische Dosimetrie [6,9,11], die Bestrahlungsplanung [1,3,4,5,7,8,10], die Patientenpositionierung [2], sowie die Qualitätssicherung für diese Bereiche. Im Bereich der Dosimetrie bestanden die Hauptarbeiten in der Verbesserung des Dosimetrieprotokolls und einer Optmierung der Dosisverifikation von Bestrahlungsplänen. In Zusammenarbeit mit dem Karolinska Institut, Stockholm, wurden Untersuchungen des Einflusses der nuklearen Fragmentierung auf die Dosismessung mit Hilfe von Monte Carlo Simulationen begonnen. Mit einer Reihe von Messungen wurden verschiedene Korrekturfaktoren in der Schwerionendosimetrie genauer quantifiziert. Abb. 1: Dosisverteilung für eine Boost-Bestrahlung der Prostata, wie sie mit einer Gegenfeldbestrahlung mit Kohlenstoffionen erreicht werden kann. Die geringe Dosisbelastung im Rektum (blau) reduziert die Strahlentoxizität erheblich. Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Das Bestrahlungsplanungsprogramm, welches auf der in unserer Abteilung entwickelten graphischen Benutzeroberfläche VIRTUOS und dem an der GSI entwickelten Schwerionenalgorithmus TRiP aufbaut, wurde auch 2002/2003 weiter verbessert. Das Planungsprogramm unterstützt nun auch die Optimierung von Kombinationstherapien aus konventioneller Bestrahlung und Schwerionentherapie. Ferner unterstützt die Therapieplanung nun auch die Behandlung von Patienten in sitzender Position, was eine höhere Flexibilität bei der Auswahl der Bestrahlungswinkel ermöglicht. In einer Reihe von Planungsstudien wurde für verschiedene Indikationen untersucht, welche klinische Wertigkeit die Schwerionentherapie im Vergleich zur Intensitätsmodulierten Strahlentherapie (IMRT) mit konventioneller Bestrahlung bietet. Untersucht wurden dabei u.a. der Einfluss von Positionierfehlern auf die Qualität von Therapieplänen für Patienten mit spinalen Chordomen im Vergleich zwischen IMRT und Schwerionentherapie und die Optimierung von Kombinationstherapien aus Ionenstrahlung und IMRT für adenoidzystische Karzinome und Prostatakarzinome. Abb. 1 zeigt eine Dosisverteilung wie sie mit einem Therapieplan für einen Patienten mit Prostatakarzinom zur Boostbestrahlung mit der Schwerionentherapie möglich ist. Der hohe Grad der Anpassung des Hochdosisbereiches an das Zielvolumen ist hier sehr deutlich zu erkennen. In Abb. 2 ist ein Therapieplan für eine Kombinationstherapie aus IMRT und Schwerionentherapie zu sehen wie sie derzeit an der GSI bereits angewandt wird. Nur der makroskopisch sichtbare Tumor wird mit Ionenstrahlen behandelt und insgesamt höher dosiert, während ein erheblich größeres Volumen mit konventioneller Strahlung behandelt wird. Mehrere Diplomarbeiten beschäftigten sich mit der Quantifizierung der Genauigkeit der Reichweiteberechnung der Ionen im Gewebe. Dabei wurden der Einfluss von Röntgenkontrastmittel [5], Metallimplantaten [4] und der Kalibrierung des Computertomographen [3] untersucht. 309 Abb. 2: Dosisverteilung eines Therapieplanes für eine Kombinationstherapie aus IMRT und Schwerionentherapie für einen Patienten mit adenoidzystischem Karzinom. Nur das makroskopisch sichtbare Tumorvolumen wird mit Ionenstrahlen behandelt und insgesamt höher dosiert. Hirnstamm (grün) und Sehnerven (gelb, blau) können nahezu völlig aus dem Hochdosisbereich ausgespart werden.

310 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E040 Medizinische Physik in der Strahlentherapie Die Arbeitsgruppe ist zudem für die Leitung der Arbeitsgruppe Therapieplanung im EU-Projekt ENLIGHT zuständig. Im Rahmen dieses Projektes wurde eine Übersicht über die klinischen Einsatzmöglichkeiten, Bestrahlungstechniken, Therapieplanungssysteme und Basisdaten für die Schwerionentherapie erarbeitet. Ziel des Projektes ist es, alle verfügbaren Erfahrungen in der Ionentherapie zu bündeln und in Form von Empfehlungen allgemein zur Verfügung zu stellen. Um eine größere Flexibilität bei der Einstrahlrichtung auf den Patienten zu erhalten, wurde zusätzlich zum Bestrahlungstisch ein Behandlungsstuhl im Bestrahlungsraum installiert. Aufgrund der durchgeführten Qualitätssicherungsmaßnahmen wurde 2003 die Genehmigung zum Einsatz des Stuhles erteilt. Der klinische Einsatz kann nach Abschluss der Arbeiten an der Planungssoftware und zur Positioniergenauigkeit voraussichtlich Anfang 2004 erfolgen. Im Berichtszeitraum wurden insgesamt 86 Patientenbestrahlungen mit Schwerionen an der GSI durchgeführt. Das entspricht einer Steigerung um 25% gegenüber dem Berichtszeitraum 2000/2001. Den Schwerpunkt bildeten dabei die Behandlung von Chordomen und Chondrosarkomen der Schädelbasis mit alleiniger Schwerionentherapie. 310 Publikationen (* = externer Koautor) [1] Jäkel O., Schulz-Ertner D., Karger C.P., Nikoghosyan A., Debus J.: Heavy ion therapy: status and perspectives. Technology in Cancer Research and Treatment 2, , 2003 [2] Karger C.P., Schulz-Ertner D., Didinger B.H., Debus J., Jäkel O.: Influence of setup errors on spinal cord dose and treatment plan quality for cervical spine tumors: A phantom study for photon IMRT and heavy charged particle radiotherapy. Phys. Med. Biol. 48, , 2003 [3] Qamhiyeh S: Hounsfield units to range calibration in heavy ion therapy, Master Thesis, Universität Heidelberg, [4] Reiss P: Die Auswirkung von Metallartefakten bei der Computertomographie auf die Reichweiteberechnung von Schwerionen in der Strahlentherapie, Diplomarbeit, Universität Heidelberg, [5] Wertz HJ: Der Einfluss von Jod-Kontrastmittel auf die CTbasierte Reichweitenberechnung in der Schwerionentherapieplanung. Diplomarbeit, Fachhochschule Giessen-Friedberg, Heidelberg, [6] Karger C.P., Jäkel O., Heeg P., Hartmann G.H.: Klinische Dosimetrie für schwere geladene Teilchen. Zeitschrift für Medizinische Physik 12 (2002) [7] Jäkel O: Bestrahlungsplanung für die Schwerionentherapie, ISBN , Shaker Verlag, Aachen, [8] Jäkel O., Schulz-Ertner D., Krämer M., *Kraft G., *Wannenmacher M., Debus J: Approaching the Limits: IMRT with Carbon Ions. In: Progress in Radio-Oncology VII , Eds. Kogelnik H.D., Lukas P., Sedlmayer F.Bologna, [9] Jäkel O., Dosimetry of C12-ion beams at the German Heavy Ion Therapy Facility - Comparison between the currently used approach and the new TRS-398. In: Proceedings of the IAEA Standards and Codes of Practice in Medical Radiation Dosimetry, Vienna, [10] Wertz H., Jäkel O: The influence of iodine contrast agents on the range calculations of ion beams in radiotherapy. Medical Physics 31 (2004) [11] Jäkel O., Hartmann GH, Karger CP, Heeg P., Vatnitsky S: A calibration procedure for beam monitors in a scanned beam of heavy charged particles. Medical Physics 31 (2004)

311 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie (E050) Leiter: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Jürgen Debus Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Amir Abdollahi Dr. Klaus Braun Dr. Oktay Celebi Dr. Heike Corban-Wilhelm Dr. Stephanie Combs (6/03-) Dr. Bernd Didinger Prof. Friedrich Eckhardt PD Dr. Klaus Herfarth Dr. Karin Henke-Wendt* Peter Hipp (-12/02) Dr. Holger Hof PD. Dr. Dr. Peter Huber Dr. Jürgen Jenne Dr. Jesus Barranco Junco (8-9/03) Dr. Phoebe Kaiser (-9/02) Dr. Maria Kissel (-12/02) Dr. Stefanie Milker-Zabel (-12/02) Dr. Frank Lohr (-12/02) Dr. Marc Münter Dr. Anna Nikoghosyan Dr. Stefanie Oertel (9/03-) Dr. Peter Peschke* Dr. Ralf Rastert (-4/03) Gregor Remmert (-9/02) PD Dr. Daniela Schulz-Ertner Dr. Anke Strunz (-12/02) PD Dr. Christoph Thilmann* Dr. Angelika Zabel Prof. Ivan Zuna* Doktoranden Leyla Cira (5/02-) Gabriela Divkovic* (4/02-) Kerstin Dohme* (8/03-) Ping Gong (6/02-) Gu Xiaoyin (02/03-) Benjamin Hanebeck (4/03-) Michael Hlavac (-12/02) Twan Lammers (9/02-) Minglun Li (7/03-) Sylvia Münter (-12/02) Daniel Poerschke (-12/03) Alexandra Roth (-12/02) Mathias Schäfer Florian Sterzing Leonie von Brasch Heike Zieher Technische Mitarbeiter Marion Bachmann* Gabriele Becker* Viola Göller (-6/02) Dietmar Greulich* Stefan Hauser (-5/02) Annette Jödicke Katja Kuhn* (5/02-) Sabine Kuhn Rainer Kühnlein* Miriam Lenz (-3/02) Johanna Meixner-Krempien (3-12/03) Elisabeth Rittinghausen* (1/02-) Alexandra Tietz Doris Wipfler (-6/03) Sekretariat Renate Haselmann* Nicole Helker* (6/03-) Ingrid Reinke (-10/02) Heike Reutner* Zivildienstleistende Michael Thiemer (-4/02) Christoph Guggenberger (-5/02) Daniel Burns (-8/03) Pascal Büscher (8/03-) Philipp Ratzek (10/03-) Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit Strahlentherapie ist die Entwicklung neuer radio-onkologischer Behandlungsmethoden. Dabei sollen diese neuen Bestrahlungsmethoden nicht nur verbesserte technische Ansätze verfolgen, sondern im Besonderen soll auch die Möglichkeiten einer biologisch basierten Optimierung der Strahlenwirkung untersucht werden. Eine wesentliche Aufgabe der klinischen Forschungseinheit ist die Durchführung von Phase I/II- und Phase II-Studien, welche die Sicherheit und Zuverlässigkeit hier neu etablierter Behandlungsverfahren und Therapieplanungsverfahren überprüfen. Die Optimierung der computergestützten Strahlentherapieplanung und Simulation kann hierzu wesentliche Beiträge leisten. Es soll darüber hinaus untersucht werden, inwieweit durch molekularbiologische Verfahren die Strahlensensibilität vorhergesagt und gezielt beeinflusst werden kann. Schwerionenstrahlen zeigen eine höhere biologische Effektivität und eine günstigere Dosisdeposition als Photonenstrahlen. Im Rahmen einer Studie wird die Anwendung der Schwerionenstrahlentherapie am Patienten in Zusammenarbeit mit der GSI Darmstadt klinisch geprüft. Weiterhin werden Untersuchungen zum Einsatz neuer nicht-invasiver Therapieverfahren, wie zum Beispiel der Einsatz der Ultraschalltherapie in der Tumorbehandlung durchgeführt. 311 * = DKFZ Haushalt

312 312 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Konformierende Strahlentherapie C. Thilmann, B. Didinger, M. Münter, A. Nikoghosian, H. Hof, K. Herfarth, D. Schulz-Ertner, P. Huber, J. Debus Das Ziel der Strahlentherapie ist die Zerstörung des Tumors, ohne dabei Nebenwirkungen hervorzurufen. Meist wird jedoch die für eine sichere Tumorkontrolle erforderliche Dosis durch die Strahlenempfindlichkeit des umliegenden gesunden Gewebes begrenzt. Die moderne Konformationsstrahlentherapie versucht, die physikalische Dosisverteilung möglichst genau an die Form des Zielvolumens anzupassen. Dies gelingt meist durch die Verwendung mehrerer Photonenfelder, deren Form individuell an die Kontur des Tumors angepasst ist. Bei der Bestrahlung komplex geformter Tumoren in unmittelbarer Nähe zu Risikoorganen stoßen konventionelle Techniken mit Bestrahlungsfeldern konstanter Dosis an ihre Grenzen. Besonders problematisch sind Zielvolumina, die konkav geformte Einbuchtungen aufweisen, die ein Risikoorgan umschließen. Eine Verbesserung der Dosisverteilung ist hier zu erreichen, wenn Photonenfelder appliziert werden, deren Intensität beliebig über den Strahlquerschnitt variiert werden kann. Dies erlaubt in vielen Fällen eine Dosiseskalation unter Beachtung der dosislimitierenden benachbarten Strukturen ohne Steigerung der Komplikationsrate oder eine Dosisreduktion an Risikostrukturen, ohne gleichzeitig Dosiseinbußen im Zielvolumen hinnehmen zu müssen. Diese stereotaktischen Techniken werden auf den ganzen Körper, besonders bei Lungen -und Lebertumoren sowie bei wirbelsäulennahen Tumoren angwandt. Konformierende Strahlentherapie mit intensitätsmodulierten Bestrahlungsfeldern In den vergangenen Jahren lag der Schwerpunkt der Arbeiten darauf, Instrumente zur Planung, Umsetzung und Verifikation intensitätsmodulierter Bestrahlungstechniken zu schaffen. Am DKFZ wurde ein inverses Bestrahlungsplanungsmodul (KonRad ) entwickelt, das in der jeweiligen Bestrahlungssituation für eine vorgegebene Solldosisverteilung die optimalen Intensitätsprofile berechnet. Mit der step-and-shoot-technik, also der Zerlegung der intensitätsmodulierten Felder in einzelne Bestrahlungsfelder mit einem isointensen Dosisprofil, steht ein Instrument zur Verfügung, mit dem die intensitätsmodulierte Strahlentherapie (IMRT) sicher am Patienten eingesetzt werden kann. Ein automatisiertes Dosimetrieverfahren erlaubt die Verifikation eines jeden Bestrahlungsplanes, der zur Patientenbestrahlung eingesetzt werden/- soll, mit einem für die klinische Routine vertretbaren Zeitaufwand von min. [10] Es ermöglicht, die Umsetzung der geplanten Solldosisverteilung zu überprüfen und Abweichungen gegebenenfalls zu korrigieren. Es konnte von uns gezeigt werden, dass die von uns entwickelte Form der IMRT sowohl im Körperstammbereich als auch im Bereich des Kopfes präzise und zuverlässig angewendet werden kann. Am DKFZ wurden bis zum insgesamt 540 Patienten mit der IMRT behandelt. Der Schwerpunkt der Aktivitäten liegt derzeit in der Entwicklung neuer Therapiekonzepte (z.b. Pleuramesotheliom) oder neue Dosierungskonzepte (z.b. integriertes Boostkonzept) [3]. Darüber hinaus sollen anhand klinischer Untersuchungen Vorteile der IMRT gegenüber einer konventionellen Strahlentherapie herausgearbeitet werden. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie 1. IMRT des lokalisierten Prostatakarzinoms Eine wichtige Indikation für die IMRT-Technik ist die primäre kurative Strahlenbehandlung des lokalisierten (nicht metastasierten) Prostatakarzinoms. Für eine langfristige Heilung ist in bestimmten Fällen die Verabreichung einer sehr hohen Strahlendosis von über Gy innerhalb der Prostata notwendig. Gleichzeitig befinden sich jedoch relativ strahlenempfindliche Organe (Mastdarm, Harnblase) in unmittelbarer Nähe des Zielvolumens. Die intensitätsmodulierte Strahlentherapie eröffnet die Möglichkeit der Dosiseskalation ohne erhöhtes Risiko strahlenbedingter Schäden. Im Rahmen einer klinischen Phase I/II-Studie wurden seit 1998 bislang 60 Patienten mit Strahlendosen von 72 bis 76 Gy behandelt [1]. Mittels dreidimensionaler überlagerter hochauflösender CT- und MRT-Bildgebung war eine präzise Zielvolumen- und Organsegmentation möglich. Es entstanden Bestrahlungspläne mit 5 isozentrischen, koplanaren intensitätsmodulierten Feldern. Die sichere Applikation der Strahlung wurde durch individuelle dosimetrische Verifikation und regelmäßige CT-Lagerungskontrollen während der Therapieserie gewährleistet. Alle Patienten zeigten eine exzellente Verträglichkeit der hochdosierten Strahlentherapie ohne stärkergradige akute oder frühe chronische Nebenwirkungen. Die klinische und laborchemische Nachsorge ergab bisher bei keinem Patienten einen Hinweis auf ein Tumorrezidiv. Derzeit wird geprüft, ob eine Zielvolumendefinition, die die individuelle Lagevariabilität der Prostata anhand von fünf vor Beginn der Strahlentherapie durchgeführten Planungs- CT-Untersuchungen berücksichtigt, Vorteile gegenüber einer konventionellen Zielvolumendefinition bietet. 2. IMRT bei Kopf-Hals-Tumoren Die invers geplante und intensitätsmodulierte Strahlentherapie (IMRT) bietet bei Tumoren des Kopf-Hals-Bereiches gegenüber konventioneller Techniken Vorteile. Neben neuartigen Dosierungskonzepten mit einer integrierten Boostbestrahlung lässt sich eine gezielte Dosisreduktion der Ohrspeicheldrüsen erreichen. Im DKFZ wurden bisher 60 Patienten mit Tumoren im Kopf- und Halsbereich in kurativer Intention behandelt. Besonderes Augenmerk wurde der Schonung mindestens einer Ohrspeicheldrüse gewidmet, deren Funktion prospektiv erfaßt wurde. Die Behandlungszeit betrug zwischen 8 und 18 Minuten. Die Therapie wurde von allen Patienten gut toleriert. Gemäß RTOG/EORTC wurde keine höhere Frühtoxizität als Grad 3 beobachtet. Lediglich eine Grad 4 Spätkomplikation wurde bisher beobachtet. Die invers geplante und intensitätsmodulierte Strahlentherapie ist in der klinischen Routine zur Bestrahlung von Kopf-Halstumoren einsetzbar. Es können hohe Dosen im Zielvolumen bei gleichzeitiger Schonung der Risikostrukturen appliziert werden. Vielversprechend sind die bisherigen Ergebnisse bezüglich der posttherapeutischen Speicheldrüsenfunktion, die einen klinisch messbaren Vorteil gegenüber einer Strahlenbehandlung in konventioneller Technik vermuten lassen. 3. IMRT des Mammacarcinoms Zur brusterhaltenden Therapie beim Mammacarcinom wurde von uns ein Verfahren entwickelt, das die inverse Bestrahlungsplanung zur IMRT anwendbar macht [5]. Hierbei wird rechnerisch zur Erzeugung der Strahlintensitäten mit dem Softwaremodul KonRad (MRC, Heidelberg) ein gedachter Bolus aufgelegt. Die Dosis wird separat mit dem am DKFZ entwickelte Bestrahlungsplanungssystem VIRTUOS

313 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie ohne Bolus berechnet. Damit kann eine IMRT in Viel-Felder- Technik generiert werden, die präzise und zuverlässig in komplexen Bestrahlungssituationen wie zur Mitbestrahlung des lokoregionären Lymphabflusses oder bei bilateralem Befall klinisch einsetzbar ist [7]. Die Ergebnisse einer Planvergleichsstudie mit 20 Patientinnen zeigen, dass bei Mitbestrahlung der lokoregionären Lymphknoten die IMRT Dosisverteilungen liefern kann, die einen klinischen Vorteil gegenüber einer konventionellen Bestrahlung erwarten lassen. Mit der IMRT konnte im Vergleich zu konventionellen Techniken eine deutlich verbesserte Konformität ans Zielvolumen und eine bessere Schonung der ipsilateralen Lunge erreicht werden. Bei Patientinnen mit linksseitigem Tumor war zusätzlich eine signifikante Herzschonung erreichbar. Bei alleiniger Brustbestrahlung ohne regionären Lymphabfluss steht einer verbesserten Konformität ans Zielvolumen eine höhere integrale Dosis im Normalgewebe entgegen. Derzeit wird die IMRT bei Patientinnen eingesetzt, die sich in der Radiologischen Klinik der Universität Heidelberg zur Brustbestrahlung unter Einschluss der Mammaria-Interna- Lymphknoten vorstellen und bei denen mit der konventionellen Therapie keine befriedigende Dosisverteilung erreicht werden kann. Voraussetzung für die Anwendung der IMRT ist eine hinsichtlich Homogenität im Zielvolumen bzw. Dosisbelastung an Risikostrukturen verbesserte Dosisverteilung im Vergleich zur geeignetsten konventionellen Therapieform [6-9]. Bei alleiniger Brustbestrahlung ohne regionären Lymphabfluss steht einer verbesserten Konformität ans Zielvolumen eine höhere integrale Dosis im Normalgewebe entgegen. Die entwickelte Technik erlaubt den klinischen Einsatz der invers geplanten IMRT in der adjuvanten Situation des Mammacarcinoms. Aufgrund des großen Aufwandes hinsichtlich Planung und Lagerung und der Erhöhung der integralen Dosis im Normalgewebe bleibt die Viel-Felder-Technik Patientinnen vorbehalten, bei denen konventionell keine befriedigende Dosisverteilung zu erzielen ist. Bisher wurden 25 Patientinnen mit Brustkrebs mit der IMRT bei hervorragender Verträglichkeit bestrahlt. 4. IMRT bei Schädelbasistumoren Nachdem die konventionelle konformierende Strahlentherapie bei Schädelbasistumoren sehr erfolgreich eingesetzt werden konnte, wurde bei besonders schwierig gelegenen Tumoren in enger Nachbarschaft zu mehreren Risikostrukturen die Methode der IMRT angewandt. Die ersten klinischen Daten zeigen, dass hiermit eine weitere Verbesserung der Schonung von Risikoorganen wie den Sehnerven zu erreichen ist [10]. 5. Ganzkörperstereotaxie In Analogie zur stereotaktischen Bestrahlung von Hirnmetastasen, wurde bereits 1997 an der Radiologischen Klinik in Heidelberg eine Phase I/II Studie zur Durchführung einer stereotaktischen Einzeitbestrahlung von singulären inoperablen Lebertumoren und Lungentumoren begonnen [11-12]. Es konnte gezeigt werden, dass eine hohe Präzision in der Lagerung des Patienten und in der Repositionierung des zu behandelnden Tumors erreicht werden kann, die eine Einzeittherapie erlaubt. Bis in das Jahr 2000 wurden die ersten Bestrahlungen von Lungentumoren unter Vollnarkose in Jet-Ventilation durchgeführt. Dies geschah unter der Vorstellung, eine Minimierung der atmungsbedingten Lungenexkursionen zu erreichen, um eine genauere Erfassung des Zielvolumens zu erlauben. Diese Methode ist allerdings aufwendig und erfordert eine enge Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Kooperation mit einer anästhesiologischen Klinik. Seit Herbst 2000 wurden daher die Bestrahlungen unter Spontanatmung des Patienten durchgeführt. Es zeigte sich, dass auch im Bereich der Lunge die bereits bei der Lebereinzeitbestrahlung erfolgreich eingesetzte Abdominalkompression zur Minderung der Tumorverschieblichkeit erfolgreich verwendet werden konnte. Die bislang erzielten Ergebnisse sind sehr vielversprechend, liegen sie doch deutlich über den veröffentlichten Daten nach konventionell fraktionierter Bestrahlung. Insgesamt scheint die einzeitige Hochdosisbestrahlung von lokalisierten Lungentumoren und Lebertumoren eine wenig belastende, effektive und sichere Therapiemodalität darzustellen, die mit verhältnismäßig geringem Aufwand betrieben werden kann. Von besonderem Vorteil für den Patienten ist, dass im Vergleich zur konventionellen Bestrahlung die Gesamttherapiedauer deutlich verkürzt wird. Ebenso stellt die IMRT bei wirbelsäulennahen Tumoren einen wesentlichen Fortschritt der Tumortherapie dar [13]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Debus J, Zierhut D*, Didinger B, Schlegel W, Wannenmacher M*. Inverse planning and intensity-modulated radiotherapy in patients with prostate cancer. Front Radiat Ther Oncol. 36:25-34 (2002). [2] Pirzkall A, Carol M*, Lohr F*, Hoess A, Wannenmacher M*, Debus J. Comparison of intensity-modulated radiotherapy with conventional conformal radiotherapy for complex-shaped tumors. Int J Radiat Oncol Biol Phys 48: (2000) [3] Thilmann C, Zabel A, Grosser KH, Hoess A, Wannenmacher M*, Debus J. Intensity Modulated Radiotherapy (IMRT) with an Integrated Boost to the Macroscopic Tumor Volume in the Treatment of High Grade Gliomas. Int J Cancer 96, (2001) [4] Thilmann C., Schulz-Ertner D, Zabel A, Herfarth KK, Wannenmacher M*, Debus J. Short communication: Intensity modulated radiotherapy of sacral chordoma: a case report and a comparison to stereotactic conformal radiotherapy. Acta oncol 41, (2002) [5] Thilmann C, Grosser KH, Rhein B, Zabel A, Wannenmacher M*, Debus J. Virtueller Bolus zur inversen Bestrahlungsplanung bei intensitätsmodulierter Radiotherapie des Mammakarzinoms im Rahmen der adjuvanten Therapie. Strahlenther Onkol 178: (2002) [6] Thilmann C, Zabel A, Kuhn S, Bendl R, Rhein B, Wannenmacher M*, Debus J. Invers optimierte intensitätsmodulierte Strahlenbehandlung bei einer Patientin mit rechtsseitigem Mammakarzinom und Trichterbrust. Strahlentherap Onkol 178, (2002) [7] Thilmann C, Zabel A, Milker-Zabel S, Schlegel W, Rhein B, Wannenmacher M*, Debus J. Number and Orientation of Beams in Inversely Optimised Intensity Modulated Radiotherapy of the Female Breast and the Parasternal Lymph Nodes. Am J Clin Oncol 26 E136-E143 (2003) [8] Thilmann C, Zabel A, Rhein B, Häring P, Hoess A, Milker-Zabel S, Harms W*, Schlegel W, Wannenmacher M*, Debus J. Inversely Optimised Intensity Modulated Radiotherapy of the Female Breast. Med Dosim 27, (2002) [9] Thilmann C, Sroka-Perez G*, Krempien R*, Hoess A, Wannenmacher M*, Debus J, Inveresly Planned Intensity Modulated Radiotherapy of the Breast Including the Internal Mammary cain: a Plan Comparision Study. Technol Cancer Res Treat 2, (2004). [10] Zabel A, Thilmann C, Zuna I, Schlegel W, Wannenmacher M*, Debus J. Comparison of forward planned conformal radiation therapy and inverse planned intensity modulated radiation therapy for esthesioneuroblastoma. British Journal of Radiology 75: (2002) 313

314 314 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [11] Hof H, Herfarth KK, Munter M, Hoess A, Motsch J, Wannenmacher M*, Debus J J. Stereotactic single-dose radiotherapy of stage I non-small-cell lung cancer (NSCLC). Int J Radiat Oncol Biol Phys;56(2): (2003). [12] Herfarth KK, Debus J, Lohr F, Bahner ML, Rhein B, Fritz P, Hoess A, Schlegel W, Wannenmacher MF. Stereotactic singledose radiation therapy of liver tumors: results of a phase I/II trial J Clin Oncol. 19(1): (2001). [13] Milker-Zabel S, Zabel A, Thilmann C, Schlegel W, Wannenmacher M, Debus J. Clinical results of retreatment of vertebral bone metastases by stereotactic conformal radiotherapy and intensity-modulated radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 55(1): (2003) Strahlentherapie mit schweren Ionen D. Schulz-Ertner, J. Debus In Zusammenarbeit mit: Abteilungen E010, E020, E040, DKFZ; Prof. Dr. Dr. Wannenmacher, Radiologische Universitätsklinik Heidelberg; Prof. Kraft, Dr. T. Haberer, GSI Darmstadt; Dr. Enghardt, Forschungszentrum Rossendorf Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Ziele der Arbeitsgruppe sind die Erarbeitung von klinischen Indikationen, die Optimierung der Schwerionentherapie und ihre Einführung in die klinische Routine. Bei der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt, Deutschland, wird die Kohlenstoffbehandlung bei Patienten seit Dezember 1997 angewandt. Die GSI ist ein weltweit durch Kooperationen vernetztes physikalisches Institut. Das Schwerionen- Synchroton (SIS) bei der GSI ist in der Lage, geladene Teilchen bis hin zum Uran zu beschleunigen. Die Schwerionenstrahlung wird derzeit für die Strahlentherapie in drei Behandlungsblöcken realisiert, wobei jeder Block aus 20 aufeinanderfolgenden Tagen besteht. Die Zuständigkeit für die Patientenbehandlung liegt bei der Universität in Heidelberg. Die Strahlapplikation erfolgt mittels Rasterscanntechnik [1]. Verglichen mit passiven Dosisapplikationstechniken ist die Dosis im Eingangskanal sowie die im Austrittskanal reduziert, so dass eine bessere Schonung des umgebenden Normalgewebes möglich wird. Die Rasterscanntechnik zusammen mit einer biologischen Planungsoptimierung verspricht eine optimale Behandlung mit Schwerionen bei Tumoren der Schädelbasis sowie bei spinalen Tumoren, die von strahlenempfindlichen Organen umgeben sind [2-5]. Eine klinische Phase I/II zur Kohlenstoffionentherapie bei Schädelbasischordomen und low-grade Chondrosarkome wurde bereits abgeschlossen. Eine Phase I/II zur kombinierten Photonen- und Schwerionentherapie bei extrakraniellen Chordome, Chondrosarkome und adenoidzystischen Karzinomen ist derzeit aktiv. Von Dezember 1997 bis Dezember 2003 wurden196 Patienten bei der GSI mit Kohlenstoffionen behandelt. Die lokale Kontrollrate lag nach 3 Jahren für Schädelbasischordome bei 81%, für Chondrosarkome bei 100% und für lokal fortgeschrittene adenoidzystische Karzinome bei 62%. 15 von 17 Patienten mit spinal (8/9) und sakralen (7/8) Chordomen oder Chondrosarkome und 11 von 15 Patienten mit anderen Schädelbasistumoren konnten des weiteren lokal kontrolliert werden. Sechs von 12 Patienten, die eine Rebestrahlung erhielten, zeigten bisher keine Zeichen einer erneuten Tumorprogression. Toxizitäten CTC Grad 4 und 5 konnten bisher nicht beobachtet werden. Unter dem Aspekt der Toxizität ist die Schwerionentherapie ein sicherer Therapieansatz bei gleichzeitig hohen Kontrollraten bei Chordomen und low-grade Chondrosarkome der Schädelbasis sowie bei lokal fortgeschrittenen adenoidzystischen Karzinomen. Eine klinische Phase I/II Studie zur kombinierten Photonen- und Kohlenstoffionentherapie beim lokal fortgeschrittenen Prostatakarzinom wird derzeit vorbereitet. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Haberer T*, Becher W*, Schardt D*, et al. Magnetic scanning system for heavy ion therapy. Nucl Instr Meth Phys Res 1993; 330: [2] Krämer M*, Jäkel O, Haberer T*, et al. Treatment planning for heavy ion radiotherapie: Physical beam model and dose optimization. Phys Med Biol 2002; 45: [3] Krämer M*, Scholz M*. Treatment planning for heavy-ion radiotherapy: Calculation and optimization of biologically effective dose. Phys Med Biol 2000; 45: [4] Jäkel O, Hartmann GH*, Karger CP*, et al. Quality assurance for a treatment planning system in scanned ion beam therapy. Med Phys 2000; 27: [5] Scholz M*, Kellerer AM*, Kraft-Weyrather W*, et al. Computation of cell survival in heavy ion beams for therapy. The model and its approximation. Radiat Environ Biophys 1997; 36: Experimentelle Teilchentherapie in vitro und in vivo P. Peschke, A. Abdollahi, P. Huber, J. Debus In Zusammenarbeit mit: C. Karger, DKFZ E040, R. Sanchez- Brandelik DKFZ V230, S. Heiland, Universität Heidelberg; M. Scholz, GSI Darmstadt, B. Stierstorfer, Universität München Die Bestrahlung von Krebspatienten mit schweren Ionen ist ein wichtiger Beitrag zur Verbesserung der Therapie von inoperablen, örtlich begrenzt wachsenden Tumoren. Die vorteilhaften Eigenschaften des Partikelstrahls in Kombination mit einem intensitätsmodulierten Rasterscannverfahren und einem biologisch-orientiertem Planungssystem erlauben eine effiziente und konforme Bestrahlung des Zielvolumens. Die laufenden klinischen Studien zur Behandlung von fortgeschrittenen Tumoren der Schädelbasis, die zur Zeit bei der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) erfolgen, werden durch ein biologisches Forschungsprogramm zur Charakterisierung des therapeutischen Schwerionenstrahls begleitet. Dabei beschäftigt sich ein Projekt mit der Bestimmung der relativen biologischen Effektivität (RBW) von Kohlenstoffionen im Vergleich zu Photonen. Im Mittelpunkt der tierexperimentellen Studien stehen strahlenbedingte Spätschäden des zentralen Nervensystems (CNS). Relative biologische Wirksamkeit (RBW) und Charakterisierung von Strahlenspätschäden am Rückenmark der Ratte nach Photonen- und Schwerionenbestrahlung In einer ersten Serie von Untersuchungen wurde der craniale Anteil des cervicalen Rückenmarks von Ratten mit ein bzw. zwei Fraktionen Kohlenstoffionen oder Photonen bestrahlt. Das Zielvolumen (Feldgröße: 10 x 15 mm) war entweder im Eingangsbereich (Plateau-Region) eines 270 MeV/u 12 C-Strahls oder zentral im erweiterten Bragg-Peak eines 140 MeV/u 12 C-Strahls positioniert. Die Bestrahlungen mit Photonen wurden an einem Linearbeschleuniger (Siemens MPX, 15 MeV) mit einer Dosisrate von 5 Gy/Min. unter Referenzbedingungen durchgeführt. Die Behandlungsfelder wurden über einen Multileaf-Kollimator mit einer Blende von 10 x 15 mm definiert. Pro Behandlungsarm wurden 30 Tiere, unterteilt in 5 Gruppen (n = 6) mit

315 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie unterschiedlichen Dosen (Range: 12 Gy - 61 Gy) bestrahlt. Als Kontrolle dienten zwei Gruppen mit jeweils 6 Tieren. Die biologischen Endpunkte in der Nachbeobachtungsphase waren: akute strahleninduzierte Reaktionen sowie Latenzzeit und Häufigkeit des Auftretens neurologischer Veränderungen. Aus den ermittelten Daten wurden Dosis- Wirkungskurven erstellt. Die resultierenden ED 50 -Werte (Dosis mit 50%iger Komplikationswahrscheinlichkeit) für das Entstehen einer strahlenbedingten Myelopathie wurden für RBE-Kalkulationen herangezogen [1, 2]. Die Latenzzeit bis zum Auftreten neurologischer Veränderungen betrug im Mittel 167 Tage, wobei 80 % aller Symptome zwischen 136 und 212 Tagen auftraten. Die mediane Latenzzeit nach Schwerionen war bei dem im Bragg- Peak bestrahlten Tiere kürzer (T 50 = 157 Tage) als bei Tieren, die mit Kohlenstoffionen aus der Plateau-Region behandelt wurden (T 50 = 178 Tage). Die effektive Dosis, bei der sich eine Schadenswahrscheinlichkeit von 50 % ergibt (ED 50 ) betrug für Bestrahlungen im Eingangsbereich des Kohlenstoffstrahls 17.1±0.8 Gy für Einzeldosen und 24.9±0.7 Gy für 2 Fraktionen im zeitlichen Abstand von 24 Stunden. Bestrahlungen des Rückenmarks im Bragg-Peak ergab ED 50 -Werte von 13.9±0.8, und 15.8±0.7 Gy für 1 bzw. 2 Fraktionen. Die hieraus resultierenden Fraktionierungseffekte waren bei Bestrahlung im 12 C Bragg Maximum deutlich verringert. Die aus den Messungen kalkulierten RBE-Werte betrugen 1.43±0.08 und 1.37±0.12 (für 1 bzw. 2 Fraktionen im Eingangsbereich) und 1.76±0.05, bzw. 2.16±0.11 (für 1 und 2 Fraktionen im Bragg-Peak). Die gefundenen Fraktionierungseffekte im Eingangsbereich der Schwerionen bestätigen die erhoffte Schonung des dort liegenden Normalgewebes. Der geringe Fraktionierungseffekt im Bragg-Peak unterstreicht die hohe Effizienz dieser Bestrahlungsform. Die gefundenen Daten zeigen auch ein gute Übereinstimmung mit Untersuchungen zu Strahlenspätschäden des normalen Hirngewebes nach Photonen- und Schwerionenbestrahlung [3]. Im Rahmen grundlegender Studien zur Strahlenwirkung wurde an Modelltumoren geprüft, ob eine superfraktionierte Bestrahlung mit Einzelfraktionen hoher Dosisleistung eine kontinuierliche Langzeitbestrahlung mit niedriger Dosisleistung isoeffektiv ersetzen kann [4,5]. Ein zweites Projekt beschäftigte sich auf Zellkulturebene mit dem Mechanismus der Strahlensensibilisierung bei einer Chemo-Radiotherapie mit Pentoxifylline [6]. Um die spezifische biologische Effektivität von C12 Strahlen gegenüber Photonen zu verstehen, untersuchen wir in einem weiteren Projekt in vitro die grundlegende differentielle Reponse von Normalgewebs- und Tumorzellen mittels genomweiten cdna Arrays und Proteinanalysen. Insbesondere wird die differentielle Gen- und Proteinexpression in humanen primären Endothelzellen und Fibroblasten, humanen Glioblastom und Prostatakarzinomzellen nach physikalisch dosisäquivalenten Bestrahlungen mittels Photonen und C12 Ionen verglichen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Debus J., Scholz M.*, Haberer T.*, Peschke P., Jäkel O., Karger C.P., Wannenmacher M.* Radiation tolerance of the rat spinal cord after irradiation with high-dose photons and carbon ions. Radiat Res, 160 (2003) [2] Peschke P., Karger C.P., Scholz M.*, Debus J. Radiation myelitis of the rat spinal cord after single and split doses of photons and carbon ions. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 57(2 Suppl) (2003) S348. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie [3] Karger C.P., Münter M.W., Heiland S.*, Peschke P., Debus J., Hartmann G.H. Dose response curves and tolerance doses for late functional changes in the normal rat brain after stereotactic radiosurgery evaluated by magnetic resonance imaging: influence of endpoints and follow up time. Radiat Res, 157 (2002) [4] Harms W.*, Peschke P., Weber K.J.*, Hensley F.W.*, Wolber G., Debus J., Wannenmacher M. Dose-dependent differential effects of low and pulsed dose-rate brachytherapy in a radioresistant syngenic rat prostate tumour model. Int J Radiat Biol, 78 (2002) [5] Harms W.*, Peschke P., Ehemann V.*, Weber K.*, Zuna I., Debus J., Wannenmacher M.* Differential effects of interstitial PDR and CLDR brachytherapy on cell cycle progression in a syngeneic rat prostate tumor model. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 57(2 Suppl) (2003) S [6] Strunz A.M., Peschke P., Waldeck W., Ehemann V.*, Kissel M., Debus J. Preferential radiosensitization in p53-mutated human tumour cell lines by pentoxifylline-mediated disruption of the G2/ M-checkpoint control. International Journal of Radiation Biology, 78, (2002) Wasserlösliche synthetische Polymere zur Verbesserung des tumorgerichteten Transports von Wirkstoffen. T. Lammers, P. Peschke, M. Kissel, J. Debus In Zusammenarbeit mit: J. Schuhmacher DKFZ E030, F. Kiessling DKFZ E020, U. Haberkorn DKFZ E060, V. Ehemann, Universität Heidelberg, E. Friedrich, Universität Koblenz-Landau, K. Ulbrich, V. Subr, M. Pechar, Institut of Macromolecular Chemistry, Academy of Science, Prag, Tschechische Republik, S. Lavi, Tel Aviv University, Israel, G. Storm, Utrecht University, Netherlands, R.P. Mason UT Southwestern Medical Center Dallas TX, USA. Zahlreiche tierexperimentelle und klinische Studien belegen, dass die Wirksamkeit vieler Chemotherapeutika, insbesondere in soliden Tumoren, eher begrenzt ist. Zurückführen lässt sich dies u. a. auf zelluläre Resistenzmechanismen aber auch auf das ungünstige pharmakologische Verhalten der meist niedermolekularen Substanzen, mit denen therapeutisch wirksame Konzentrationen in soliden Tumoren bei tolerierbaren Nebenwirkungen derzeit nur schwer erzielt werden können. Um die klinischen Wirkungen dieser Substanzen zu optimieren und um therapiebegrenzende Nebenwirkungen zu reduzieren, sind Verbesserungen im Bereich des tumorgerichteten Transportes, der pharmakokinetischen Verteilung sowie der Anreicherung von aktiven zytotoxischen Substanzen in soliden Tumoren notwendig. Diesen Forderungen entsprechen Verfahren, mit deren Hilfe pharmakologische Wirkstoffe selektiv in gewünschte Zielstrukturen transportiert werden (Drug Delivery). Klassische Beispiele sind zelluläre Carrier (z.b. Erythrozyten, Leukozyten), partikuläre Carrier (z.b. Liposomen, Mikro/Nanosphären) sowie makromolekulare Carrier (z.b. Antikörper, Polyzucker, Polypeptide und synthetische Polymere), die sich derzeit in präklinischen und klinischen Überprüfungen befinden. Die Konjugation oder Verpackung von Wirkstoffen in Trägermoleküle hat grundsätzliche Auswirkungen auf das pharmakokinetische und pharmakodynamische Verhalten der Substanzen, und soll helfen tumorassoziierte Barrieren und körpereigene Mechanismen zur Erhaltung der Homeostasis zu überwinden. Ziel der vorliegenden Forschungsaktivität ist die Synthese und die biologische Charakterisierung eines polymer-gestützten Trägersystems für den Einsatz in der kombinierten Radio-Chemotherapie. Wasserlösliche Polymere auf der Basis von Poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamid) (phpma) er- 315

316 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie 316 höhen die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen, einerseits durch Verlängerung der Plasmahalbwertszeiten, andererseits durch Schutz der Wirkstoffe vor enzymatischer Degradation. Zusätzlich zeigen diese Polymere eine bevorzugte Anreicherung in soliden Tumoren aufgrund des sog. EPR - Effektes (enhanced permeability and retention effect). Dieser basiert auf der höheren Durchlässigkeit von Tumorgefäße, auf dem in soliden Tumoren häufig erweiterten interstitiellen Raum sowie auf dem Fehlen eines funktionellen lymphatischen Entsorgungssystems. In der ersten Phase des Projektes galt es die Pharmakokinetik und die Bioverteilung des Trägermoleküls phpma genauer zu untersuchen. Für die Untersuchungen standen zwei HPMA-Polymere mit einem Molekulargewicht von Da (HE-21) und Da (HE-41) aus dem Institut für Makromolekulare Chemie der Akademie der Wissenschaften (Leiter: Prof. Dr. K. Ulbrich) in Prag, Cz zur Verfügung. Die Polymere wurden auf zwei unterschiedlichen Sublinien eines syngenen Tumormodells der Ratte getestet. Die Tumoren des radio- und chemoresistenten Prostata Karzinoms R3327 (Sublinie AT1) zeichnen sich durch schnelles anaplastisches Wachstum eine gute kapillare Vaskularisierung und geringe Metastasierungsneigung aus. Um den möglichen Einfluss des Transplantationsortes in die Studien mit einzubeziehen wurden die Tumoren sowohl subkutan als auch intramuskulär in männliche Copenhagenratten transplantiert. Tumoren der Sublinie R3327-H wachsen deutlich langsamer, sind hormonabhängig und besitzen eine gut ausgebildete differenziertere Vaskularisierung. Die vaskuläre und tumorphysiologische Eigenschaften dieses Tumormodells wurden mit verschiedenen Techniken im Detail evaluiert [1, 2, 3]. Die in den Abbildungen 1 und 2 gezeigte Bioverteilung der Polymere 7 Tage nach intravenöser Applikation von 131- Jod-markiertem HPMA bestätigt die Hypothese einer passiven Anreicherung von Makromolekülen über permeable Gefäßstrukturen. Tumoren der Sublinie R3327-H zeigen eine geringere Polymeraufnahme, u.a. aufgrund ihres reiferen und dadurch weniger durchlässigen Gefäßsystems. Wie erwartet, reichert HE-41 in allen übrigen Organen signifikant höher an als HE-21, was durch das Molekulargewicht des Polymers, das jenseits der renalen Eliminationsgrenze von 45 kd liegt begründet ist. Beide Substanzen zeigen die höchste relative Anreicherung in der Milz, gefolgt von Tumor Lunge und Leber. Die Kurven in Abb. 3 repräsentieren die Menge der beiden unterschiedlichen HPMA-Polymere in der Zirkulation über einen Zeitraum von 168 Stunden. Die unterschiedliche Zirkulationsverhalten in Abhängigkeit des Molekulargewichtes ist deutlich sichtbar. Obwohl pharmakokinetische Untersuchungen mittels dynamischer Szintigraphie vielseitig einsetzbar sind [4, 5] haben wir als Ergänzung außerdem ein Verfahren zur zellulären Lokalisation von synthetischen Polymeren entwickelt [6]. Darüber hinaus wurde im Rahmen einer Kooperation die Technik der orthotopen Transplantation von Prostatatumoren in unserem Labor etabliert [7]. Als Wirkstoff für den Einsatz in der kombinierten Radio-Chemotherapie mit makromolekularen Trägersystemen wurde die Substanz 2,2 Difluorodeoxycytidin (Gemcitabine) ausgewählt. Inzwischen stehen uns mehrere Konjugate in unterschiedlichem Design bezüglich Molekulargewicht, Beladungsdichte und chemischer Verknüpfung von Wirkstoff und Träger zur Verfügung. Derzeit erfolgt die Wirksamkeitsprüfung der Konjugate hinsichtlich Toxizität und Strahlensensibilisierung in der Zellkultur sowie in einem syngenen Tumormodell. Außerdem werden mit Hilfe der multiparametrischen Durchflusszytometrie die zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismen genauer analysiert. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Bellemann M.E., Bruckner J.*, Peschke P, Brix G., Mason R.P.* Quantification and visualization of oxygen partial pressure in vivo by 19 F NMR imaging of perfluorocarbons. Biomed Tech (Berl), 47 Suppl 1 Pt 1 (2002) [2] Fink C., Kiessling F., Bock M., Lichy M.P., Misselwitz B., Peschke P., Fusenig N.E., Grobholz R., Delorme S. High-resolution three-dimensional MR angiography of rodent tumors: morphologic characterization of intratumoral vasculature. J Magn Reson Imaging,18 (2003) [3] Mason R.P.*, Hunjan S.*, Constantinescu A.*, Song Y.*, Zhao D.*, Hahn E.W., Antich P.P.*, Peschke P. Tumor oximetry: comparison of 19 F MR EPI and electrodes. Adv Exp Med Biol; 530 (2003) [4] Haberkorn U., Kinscherf R.*, Kissel M., Kubler W., Mahmut M.*, Sieger S., Eisenhut M., Peschke P., Altmann A. Enhanced iodide transport after transfer of the human sodium iodide symporter gene is associated with lack of retention and low absorbed dose. Gene Ther,10 (2003) [5] Altmann A., Kissel M., Zitzmann S., Kubler W., Mahmut M.*, Peschke P., Haberkorn U. Increased MIBG Uptake After Transfer of the Human Norepinephrine Transporter Gene in Rat Hepatoma. J Nucl Med, 44 (2003) [6] Kissel M., Peschke P., Subr V.*, Ulbrich K.*, Strunz A.M., Kühnlein R., Debus J., Friedrich E.*; Detection and cellular localization of the synthetic soluble macromolecular drug carrier phpma. European Journal of Nuclear Medicine 29, (2002), [7] Kiessling F., Lichy M., Grobholz R., Heilmann M., Huber P.E., Meding J., Peschke P., Kauczor H.U., Schlemmer H.P.. Hemodynamic and metabolic characterization of orthotopic rat prostate carcinomas using dynamic MRI and proton magnetic resonance spectroscopy Radiologe, 43 (2003) Abb. 1: Organverteilung von 131-Jod-markiertem HPMA 7 Tage nach I.V. Applikation

317 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abb. 2: Szintigraphische Bildgebung der Körperverteilung von 131-Jod-markiertem HPMA Abb. 3: Pharmakokinetik (% der applizierten Menge in Blut) für HE-21 (30,5 kd) und HE-41 (64,5 kd) Gentherapeutische Strategien in der Strahlentherapie K. Braun, H. Corban-Wilhelm, S. Münter, L. von Brasch, J. Debus In Zusammenarbeit mit: W.E. Hull (B090), J. Jenne (E050), R. Pipkorn (V270), H. Spring (V209), C.W. Von der Lieth (B090), W. Waldeck (B045) alle DKFZ, V. Ehemann Pathologie, Universität Heidelberg, U. Nehrbass Institut Louis Pasteur, Paris, Frankreich Cytosindeaminase versus Thymidinkinase: Ein Vergleich der antitumoralen Wirkung Suizidgene kodieren für Enzyme, die lokal in der gentherapeutisch veränderten Zelle ein Pharmakon (Prodrug) in eine hoch-toxische Substanz (Drug) verwandeln, so dass die transduzierte Zelle Suizid begeht. Durch intrazelluläre Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Expression des Gens der Herpes-simplex-Virus Thymidinkinase (HSV TK) wird Ganciclovir (GCV) mit hoher Aktivität monophosphoryliert. Zelluläre Enzyme phosphorylieren das entstandene GCV-Monophosphat zum Triphosphat. Diese Substanz wird bei Teilung der Zelle in die synthetisierte DNA inkorporiert und führt dadurch zum Zelltod. Neben der HSV TK findet ein weiteres Suizid-System Verwendung. Hier verleiht das bakterielle Enzym Cytosindeaminase (CD) den Tumorzellen die Fähigkeit, das nicht-toxische 5-Fluorocytosin (5-FC) in das Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) zu verwandeln. Die eingesetzten Medikamente GCV, 5-FC und 5-FU besitzen den Vorteil, dass umfangreiche pharmakologische Informationen zu Verfügung stehen, da diese antivirale, antimykotische und chemotherapeutische Substanzen schone lange Zeit klinisch erprobt sind. Für die folgenden Studien wurde eine stabil transduzierte Prostatakarzinomzelllinie der Ratte (R3327 AT-1), die das Fusionsgen CDglyTK enthält, verwendet. In-vitro Studien zeigten, dass ein deutlicher synergistischer Effekt der beiden Enzyme zu beobachten ist. Dieses Ergebnis konnte durch in-vivo Studien an Copenhagen Ratten bestätigt werden. Bei einer Monotherapie trat eine vollständige Tumorremission bei 83% der Tiere mit dem TK/GCV und bei 57% mit dem CD/5-FC System auf. Nur bei der Kombinationstherapie konnte über einen Zeitraum von 180 Tagen bei allen Tieren eine vollständige Tumorremission erzielt werden. Um den Erfolg einer Suizidgentherapie abschätzen zu können, kann die Berechnung des Grads und des Potentials der Aktivierung verwendet werden. Der Grad der Aktivierung erhält man aus der Inhibitionskonzentration (IC50) für die Prodrug in wildtyp-zellen (R3327 AT-1) geteilt durch die IC50 der Prodrug in transduzierten Zellen (R3327 AT- 1/CDglyTK). Die Berechnung für das Potential der Aktivierung benutzt die IC50 der Prodrug (5-FC) in wildtyp-zellen geteilt durch die IC50 der Drug (5-FU) in wildtyp-zellen. In unserem Fall besitzt das CD/5-FC System einen niedrigen Grad der Aktivierung (Wert 40) was zur Folge hat, dass auch in-vivo nur 57% der Tiere eine vollständige Tumorremission zeigten [1]. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Umsetzung von 5-FC zu 5-FU nicht nur eine Störung auf DNA-Ebene hervorruft, sondern auch wahrscheinlich eine auf RNA-Ebene. Was zur Folge hat, dass die Zellen sich wieder erholen und nicht absterben. Aus diesem Grund ist es notwendig unterschiedliche Toxizitätstests durchzuführen, um vergleichbare Daten zu erhalten. Dieses Phänomen konnte nicht bei der Behandlung der AT-1/CDglyTK Zellen mit GCV beobachtet werden [2]. Ebenso das nicht vorhanden sein eines Bystander-Effektes in dem verwendeten Modell wird auf einen kombinatorischen Effekt zurückgeführt. Zum einen konnten nur geringe Mengen an Connexin (Gap-junctions) nachgewiesen werden, zum anderen die schnelle intrazellulär Konversion von 5-FU zu Fluoronukleotiden, welche die Zelle nicht verlassen können [3]. Molekulares Modulares Transportsystem Gentherapeutische Ansätze gelten allgemein als mögliche Strategien bei einer Vielzahl von Erkrankungen. Das größte Hindernis bei der Gentherapie stellt der gezielte Transfer der therapeutisch relevanten Substanzen dar. Aus diesem Grund ist es bis heute noch nicht gelungen eine erfolgreiche Gentherapie zu etablieren, die als effektiv im Hinblick auf die Behandlung des Menschen gelten könnte. 317

318 318 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Fortschritte in der Festphasen-Peptidsynthese ermöglichen eine facettenreiche Produktion von Molekülen, die als potenzielle Therapeutika Einsatz finden könnten [4]. Hierzu zählen die protease- und nukleaseresistenten Peptidnukleinsäuren (PNA), bei denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch Ethylen-Amin verbundene α-amino-ethyl-glycin- Einheiten substituiert ist. PNAs sind in der Lage mit Komplementärsequenzen in höherer Affinität zu hybridisieren (Ausbildung einer Hoogsteen Bindung) verglichen mit analogen DNA- oder RNA-Oligomeren. Allein der unzureichende zelluläre Import von PNAs ist der zentrale limitierende Faktor und erfordert ein effizientes Carrierystem. Der Transfer durch die Zellmembran und Kernhülle wird durch eines von uns entwickelten nicht-viralen modular aufgebauten Transport-Systems erzielt. Dieser sog. Bio- Shuttle besteht aus einem modularen Transport- und Adresspeptide mit Sollbruchstellen, das den effizienten zytoplasmatischen Transport plus der präzisen Adressierung in Zellkompartimente gewährleistet. Das Adressproteinmodul (Nuclear Localisation Site (NLS)) ermöglicht den Transport von Wirksubstanzen in den Zellkern, wie PNA oder DNA, in geringeren Konzentrationen als bisher. Von Bedeutung ist das Vorhandensein einer im Zytoplasma spaltbaren Redox-Kopplung zwischen Transport- und Adressmodul. Mittels Konfocaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) konnte der zellkerngerichtete Transport gezeigt werden. Hierzu wurden DU-145 Zellen mit dem BioShuttle, das zum einen eine spaltbare und zum anderen eine nicht-spaltbare Disulfid- Kopplung besitzt, inkubiert. Wir konnten zeigen, dass eine grüne Fluoreszenz im Zellkernbereich auftritt, wenn eine spaltbare Disulfid-Kopplung eingesetzt wird. Bei Applikation des BioShuttle-Konjugates ohne spaltbare Disulfid-Kopplung konnte kein Fluoreszenzsignal im Zellkern detektiert werden, es ist lediglich eine Mischfluoreszenz im Zytoplasma sichtbar, weil dann die NLS-Sequenz nicht erreichbar ist [5]. Unsere Ergebnisse zeigen einen effektiven, kompartimentgerichteten Transport in lebende Zellen mit Hilfe eines synthetisch hergestellten, modularen, nicht toxischen Oligopeptid-Transporters. Penetratin-S-S-NLS-KK-PNA Penetratin-NLS-KK-PNA Alexa-Labelling FITC-Labelling Alexa-Labelling FITC-Labelling Abb. 1: DU-145 Zellen inkubiert mit dem BioShuttle, mit und ohne Disulfid-Kopplung, welche zusätzlich zwei Fluorenzfarbstoffe (Alexa und FITC) einmal vor und einmal nach der Disulfid-Kopplung besitzen. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Auf Grundlage des entwickelten BioShuttles haben wir ein auf antisense-basierendes Molekül für die molekulare Bildgebung (Molecular Imaging) entwickelt. Mit Hilfe des Molecular Imaging (MI) können biologische Prozesse auf zellulärer und molekularer Ebene im lebenden Organismus gemessen und charakterisiert werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen diagnostischen Bildgebungsverfahren werden nicht anatomische Ausprägungen oder Effekte einer bestimmten Krankheit detektiert, sondern biologische Prozesse, die der Krankheit zugrunde liegen, auf zellulärer Ebene nachgewiesen. Dadurch lassen sich Krankheiten bereits im Frühstadium erkennen und im Idealfall noch vor Erscheinen des eigentlichen Krankheitsbildes therapieren. Fortschritte in der Magnet Resonanz Bildgebung (MRI) mit dem Kontrastmittel Gadolinium (Gd) konnten die Präzision in der Diagnostik deutlich verbessern. Dennoch ist eine zelluläre Darstellung nicht möglich im Gegensatz zur extrazellulären, intravasalen Darstellung mit dem handelsüblichen Gd-Kontrastmittel. Vorraussetzung für eine MI- Methode in der MRI ist das eindringen des Gd-Kontrastmittels in die Zelle. Aus diesem Grund haben wir das weit verbreitete, interstitielle Gd-Kontrastmittel durch Design eines Antisense-Conjugated-Gadolinium-Transporter (ACGT) so weit verändert, dass eine zellspezifische intrazelluläre Aufnahme möglich ist. Dieses modulare Konstrukt besteht aus einem Gd 3+ -Komplexmodul, das an ein Transmembran-Transportmodul gebunden ist, welches wiederum mit einem Addressmodul (hier eine c-myc mrna gerichtete Antisense-Sequenz) verbunden ist. Mit Hilfe der MRI, konnten wir das Element Gadolinium sowohl in Zervix Karzinomzellen (Hela) als auch in Nicht-Tumorzellen (Lymphozyten) nachweisen. Unser ACGT-Konstrukt wurde im Experiment rasch aus den Nicht-Tumorzellen wieder heraustransportiert im Gegensatz zu den Tumorzellen, bei denen das Konstrukt aufgrund der Antisense c-myc mrna weitgehend intrazellulär gebunden wurde. Der dadurch erzeugte Unterschied im Kontrast erlaubt Tumor- von Nicht-Tumorzellen zu unterscheiden [6-9]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Corban-Wilhelm,H., Becker,G., Bauder-Wust,U., Greulich,D., Debus,J., Cytosine deaminase versus thymidine kinase: a comparison of the antitumor activity, Clin. Exp. Med., 3 (2003) [2] Corban-Wilhelm,H., Ehemann, V., Becker,G., Greulich,D., Braun, K., Debus,J., Comparison of different methods to assess the cytotoxic effects of cytosine deaminase and thymidine kinase gene therapy, Cancer Gene Therapy, Epub ahead of print (2003) [3] Corban-Wilhelm,H., Hull,W.E., Becker,G., Bauder-Wust,U., Greulich,D., Debus,J., Cytosine deaminase and thymidine kinase gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: absence of bystander effects and characterisation of 5-fluorocytosine metabolism with (19)F-NMR spectroscopy, Gene Ther., 9 (2002) [4] Pipkorn R., Waldeck W., Braun K. Synthesis and Application of functional Peptides in the Treatment of malignant Diseases. Review Article. J Mol Recognit, 16 (2003) [5] Braun,K., Peschke,P., Pipkorn,R., Lampel,S., Wachsmuth,M., Waldeck,W., Friedrich,E., Debus,J., A biological transporter for the delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclear compartment of living cells, J. Mol. Biol., 318 (2002) [6] Heckl,S., Debus,J., Jenne,J., Pipkorn,R., Waldeck,W., Spring,H., Rastert,R., von der Lieth,C.W., Braun,K., CNN-Gd 3+ enables Cell Nucleus Molecular Imaging of Prostate Cancer Cells - the last 600 nm-, Cancer Res., 62 (2002) [7] Heckl S, Debus J, Pipkorn R, Rastert R, Waldeck W, van Kaick G, Braun K, Novel Transporter for Gadolinium enables fast and specific cellular uptake into tumor cells. Mol Imag; 1(2) (2002) 125 [8] Heckl S., Braun K., Debus J.. Molekular Imaging A Future Diagnostic Method in Neurooncology? Tumor Diagnostik und Therapie, 23 (2002)

319 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [9] Heckl S, Pipkorn R, Waldeck W, Spring H, Jenne J, von der Lieth CW., Corban-Wilhelm H, Debus J, Braun K. Intracellular Visualization of Prostate Cancer using Magnetic Resonance Imaging. Cancer Research, 63 (2003) [10] Heckl,S., Braun,K., van Kaick,G., Kunze,S., Debus,J., Successful long-term treatment of multiple metastases from renal cell carcinoma: combination of stereotactically guided percutaneous single- dose convergent beam irradiation and surgery, Nervenarzt, 73 (2002) [11] Westphal,G., Berg-Stein,S., Braun,K., Knoch,T.A., Dummerling,M., Langowski,J., Debus,J., Friedrich,E., Detection of NGF-receptors TrkA and p75ntr in human tumor cell lines and effect of NGF on the growth characteristic of the UT-7/EPO cell line, J. Exp. Clin. Cancer Res., 21 (2002) [12] Westphal,G., Braun,K., Debus,J., Detection and quantification of the soluble form of the human erythropoietin receptor (sepor) in the growth medium of tumor cell lines and in the plasma of blood samples, Clin. Exp. Med., 2 (2002) [13] Braun,K., Wolber,G., Waldeck,W., Pipkorn,R., Jenne,J., Rastert,R., Ehemann,V.*, Eisenmenger,A., Corban-Wilhelm,H., Braun,I., Heckl,S., Debus,J., The enhancement of neutron irradiation of HeLa-S cervix carcinoma cells by cell-nucleus-addressed deca-p-boronophenylalanine, Eur. J. Med. Chem., 38 (2003) [14] Heckl,S., Braun,K., Debus,J., Kunze,S., Cerebral metastasis after primary renal cell carcinoma, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 74 (2003) 141 [15] Pipkorn R., Braun K., Waldeck W., Koch M., Debus J. Synthesis and Application of functional Peptides for Therapy of HPV18 positive Cervix Carcinoma Cells. Biopolymers 71(3): 73; 2003 Neue bildgestützte minimalinvasive Tumortherapieverfahren J. Jenne, R. Rastert, G. Divkovic, A. Abdollahi, S. Hauser, P. Huber In Zusammenarbeit mit: G. Rademaker, L. Schad (E020, DKFZ), K Hynynen, F Jolesz (Harvard Medical School, Boston, USA) R. Riedlinger (TH Karlsruhe) Therapie mit hochenergetischem fokussiertem Ultraschall Die Wirkung von hochenergetischem Ultraschall auf biologisches Gewebe wird in thermische und nicht thermische, bzw. mechanische Effekte aufgeteilt, wobei die nicht thermischen Effekte hauptsächlich von der Kavitation hervorgerufen werden. Diese beiden grundlegend verschiedenen Wirkungsweisen des Ultraschalls können in der lokalen Tumortherapie angewandt werden. Als besonders erfolgversprechend gilt die Therapie mit hochenergetischem fokussiertem Ultraschall (HIFU, engl. High Intensity Focused Ultrasound). Mit ihr ist es möglich Gewebe nichtinvasiv, zielgenau im Körperinnern thermisch zu zerstören. Die Präzision ist dabei so hoch, dass die Grenzschicht zwischen induzierter Koagulationsnekrose und nicht behandeltem Gewebe nur einige Zellschichten beträgt. Dieses Verfahren wird daher auch als Ultraschall-Chirurgie (FUS, engl. Focused Ultrasound Surgery) bezeichnet [4,5]. Notwendige Voraussetzung einer erfolgreichen Therapie mit HIFU ist ein effektives Therapiemonitoring, welches sowohl die Zielvolumendefinition, als auch die Beurteilung des Therapiefortschrittes und des Behandlungsergebnisses erlaubt. Hierfür hat sich die Magnetresonanztomographie (MRT), aufgrund ihrer hohen Temperatursensitivität und ihrer guten morphologischen Abbildungsqualität als besonders geeignet erwiesen [6]. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Primäres Ziel war die MRT gesteuerte FUS des Mammakarzinoms. Hierzu wurde eine Behandlungseinheit entwikkelt, die speziell für die Therapie von Tumoren der Mamma konzipiert wurde. Das Herzstück der Therapieeinheit bildet der Therapieapplikator, der auf der Liege des Magnetresonanz-Tomographen installiert wird. Dieser beinhaltet die Ultraschallquelle und ein Positioniersystem, welches ein ferngesteuertes Abscannen des Tumorvolumens ermöglicht. Während der Ultraschalltherapie liegt die Patientin auf der MRT-Liege, wobei die betroffene Brust in eine Vertiefung des US-Applikators vor die positionierbaren Ultraschallquelle fixiert wird [1]. Nach Umfangreichen Tests an verschiedenen Tiermodellen wurde mit einer prospektiven Phase I/II Studie zur Therapie des Mammakarzinoms begonnen. Wir konnten zeigen, dass eine nicht invasive Behandlung mittels hochenergetischen fokussierten Ultraschalls unter MRT online Kontrolle möglich und sicher ist. Neben der effektiven Darstellung des Temperaturfokus im geplanten Zielgebiet mittels spezieller thermosensitiver MRT-Sequenzen, war es möglich die durch die Behandlung induzierte Gewebeveränderungen darzustellen und so den Behandlungserfolg zu verfolgen (Abb. 1) [2]. Ein für diese neue Art von Therapie kritischer Faktor ist die relativ lange Therapiezeit. Ursache hierfür ist, dass der kleine Ultraschallfokus mit einem Volumen von einigen mm³ zwar eine sehr präzise Destruktion des Gewebe ermöglicht, sich hieraus bei großen Tumorvolumina aber eine lange Therapiezeit ergibt. Daher wurden von uns mehrere Methoden zur Verkürzung der Therapiezeit entwickelt und getestet. Durch eine geschickt gewählte Applikationsfolge der einzelnen Ultraschallpulse und durch die Variation der Schallfeldgeometrie ist es uns gelungen die Therapiezeit auf die Hälfte zu reduzieren. Durch ein verbessertes Design der therapeutischen Ultraschallwandler soll in Zukunft die Therapiezeit weiter verkürzt werden. Darüber hinaus soll die Flexibilität der Beschallungsanlage erhöht werden, so dass auch andere Organe einer FUS-Therapie zugänglich gemacht werden können [3]. Die Magnet Resonanz-gesteuerte fokussierte Ultraschalltherapie (MRgFUS: Magnetic Resonance guided Focused Ultrasound Surgery) ist somit ein bildgestütztes, nichtinvasives interventionelles Tumortherapie-Verfahren, welches aufgrund der Therapieplanung in der Zielgenauigkeit der stereotaktischen Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen gleicht. Klinisch kann sich die MRgFUS zu einer effektiven und nebenwirkungsarmen Option in der adjuvanten, neoadjuvanten, palliativen oder auch kurativen Situation beim Mammakarzinom, Prostatakarzinom, Nierenzellkarzinom, und bei Tumoren im Gehirn entwickeln. Zelluläre Mechanismen von therapeutischen Ultraschallwellen Wir konnten sowohl in vitro als auch in vivo am Dunning Prostata Tumor R3327-AT1 auf Copenhagen Ratten und am Gefäßsystem von Kaninchen zeigen, dass durch Ultraschallwellen der Gentransfer und die Transfektionsraten von Plasmid DNA erhöhen werden kann [7]. Klinisch könnte diese nebenwirkungsarme lokale Transfektionserhöhung durch Ultraschall bei gentherapeutischen Ansätzen der Onkologie und cardiovaskulärer Erkrankungen nützlich sein, die gegenwärtig noch mit erheblichen Problemen bei der Suche nach geeigneten in vivo Vektoren behaftet sind. 319

320 320 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie An humanen Lymphoblastenzellinien mit unterschiedlichem p53 Status wurde gezeigt, dass Ultraschall Apoptose in Korrelation mit dem p53 Status induzieren kann. Ferner wurde auch gezeigt, dass Zellzyklusänderungen wie G1 Block und G2 Block zellspezifisch durch Beschallung ausgelöst werden können. Das könnte klinisch in der lokalen Tumortherapie besonders bei Lymphomen in der Kombination mit etablierten Methoden wie ionisierender Strahlung eingesetzt werden. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Jenne J, Rastert R, Oppelt A*, Huber PE, Debus J. The Heidelberg MRgFUS system for the treatment of breast cancer ISMRM Workshop on MRI-Guided Focused Ultrasound Surgery. [2] Jenne J, Rastert R, Simiantonakis I, Debus J, Huber P. MRI guided focused ultrasound surgery for the treatment of breast cancer. Yuhas, D. E. and Schneider, S. C. 2, New York, IEEE. IEEE Ultrasonics Symposium Proceedings. [3] Divkovic G, Jenne J, Rastert R. Linsendesign für HIFU Therapie in Medizinische Physik 2003, Ed. Semmler W, Schad L , 2003 [4] Jenne JW, Divkovic G, Rastret R, Debus J, Huber PE. Fokussierte Ultraschallchirurgie. Radiologe 43: (2003) [5] Jenne JW, Rastert R, Rademaker G, Divkovic G, Debus J, Huber PE. MRI-guided focused ultrasound technology for breast cancer therapy Z Med Phys. 2003; 13(3): [6] Rademaker G, Jenne JW, Rastert R, Röder D, Schad LR. Vergleich nichtinvasiver MRT-Verfahren zur Temperaturmessung für den Einsatz bei medizinischen Thermotherapien. Z Med Phys 2003;13: [7] Huber PE, Mann MJ*, Melo LG*, Ehsan A*, Peschke P, Jolesz F*, Dzau VJ*, Hynynen K*. Focused Ultrasound Induces Localized Enhancement of Reporter Gene Expression in Rabbit Carotid Artery. Gene Therapy, 10: , Abb. 1: (A) T1 gewichtete MRT-Mammographie in der standard MRT-Brust-Spule zwei Tage vor der Ultraschall-Therapie. Deutlich ist ein invasives Mammakarzinom zu erkennen. Nach Kontrastmittelgabe zeigt sich eine starke Kontrastmittelanreicherung im Tumor (unten). (B) T1w MRT-Bilder akquiriert mit der Ultraschall Behandlungseinheit: kurz vor der Ultraschalltherapie (oben) und nach Therapieende mit Kontrastmittelgabe (unten). Nach der FUS Therapie wird im behandelten Gewebe kein Kontrastmittel mehr angereichert. Dies deutet auf einen kompletten Ausfall der Durchblutung hin. (C) T2w MRT-Planungsaufnahme vor der US- Therapie (oben). MRT-Thermometrie während der Ultraschallapplikation (unten). Die Farbkarte zeigt die punktuelle Temperaturerhöhung an. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie Klinisch-Experimentelle Radioonkologie A. Abdollahi, P. Huber In Kooperation mit: St Wiemann, Chr Maercker, B Korn (RZPD), H-J Gröne (DKFZ), F. Kiessling, M Krix (DKFZ); W Ansorge, A Richter, Chr Schwager, A Gerlhof (EMBL Heidelberg); KJ Weber, M Bischof, R Krempien (Radiologische Universitätsklinik Heidelberg); A Sckell (Stiftung Orthopädische Universitätsklinik Heidelberg-Schlierbach); L Hlatky, J. Folkman (Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, USA). Die Untersuchungen zur vaskulären Biologie und Angiogenese beinhaltet Grundlagenuntersuchungen zur Tumorangiogenese im Zusammenhang mit Mechanismen der Strahlentherapie als etablierter Krebstherapie. Gleichzeitig gehen wir von der Möglichkeit aus, dass künftig eine medikamentöse Hemmung der Tumorangioneogenese in multimodalen Tumor-Therapieschemata eingesetzt werden wird. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer Untersuchung der Kombinationseffekte von Strahlentherapie mit medikamentösen Inhibitoren der Angiogenese. Die Wirkungen ionisierender Strahlung auf Gefäße und Endothelien sind wesentliche Komponenten strahlentherapeutischer Effekte [1]. Im Bereich Strahlentherapie und Angiogenese sind unsere Ziele die Analyse der molekularen und funktionellen Eigenschaften angiogener Endothelzellen sowie die Charakterisierung molekularer Signale und Mechanismen bei der Gefäßbildung. Besonderer Schwerpunkt ist hier die strahleninduzierte Wechselwirkung von Tumor mit seiner Vaskulatur und allgemein dem Nicht-Tumorzellkompartment. Ein Ziel ist hierbei die Erforschung und Beeinflussung der Normalgewebstoleranz gegenüber ionisierender Strahlung und die Untersuchung unterschiedlicher biologischen Wirkungen verschiedener Strahlqualitäten. Dabei analysieren wir die infolge der Aktivierung von endothelialen Zellen auftretende veränderte Phänomenologie sowie die geänderte Gen/Protein-expression in Reaktion auf relevante Stimuli wie Strahlung, Hypoxie und angiogene bzw. antiangiogene Faktoren. Hypoxie in Endothelzellen Hypoxie spielt bei der Progression von Tumoren und besonders bei der Tumorangiogenese eine wichtige Rolle. Wir haben humane primäre Endothelzellen in vitro einer Hypoxie ausgesetzt und die Änderungen auf RNA- und Proteinniveau untersucht [2]. Mittels eines cdna-chips und Proteinarrays konnten wir Expressionsprofile des kompletten humanen Unigene clusters (Stand 2002) mit ca. 76,000 Elementen erstellen sowie Proteinregulationen untersuchen. Modulation der Effekte ionisierender Strahlung In der Vergangenheit hat sich die Strahlenbiologie hauptsächlich mit dem Tumorzellkompartment beschäftigt. Die Interaktion von Strahlung, Tumor und Nicht-Tumorzellkompartment mit seiner extrazellulären Matrix, Zytokinen, Integrinen und Endothelzellen ist im wesentlichen unbekannt. Wir haben in klassischen Angiogenese-Assays gefunden, dass ionisierende Strahlung einen potenten antiangiogenen Effekt aufweist, und dabei die Proliferation, das Überleben, Invasion, Migration und Tubeformation von Endothelzellen hemmt. Dabei scheinen Endothelzellen strahlensensibler zu sein als z.b. PC3 Prostata-Tumorzellen. Die Zytokine VEGF and bfgf beschützen hingegen Endothelien vor Strahlenschäden. Wir haben zusätzlich gefunden, dass Endothelzellen radiosensitiver werden, indem man die VEGF und bfgf Kaskaden mit Inhibitoren ihrer Rezeptor Tyrosin Kinasen blockiert. Gleichzeitig führt Strahlung zur

321 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Hochregulation von VEGF and bfgf z.b. in PC3 Tumorzellen und ebenfalls zur Hochregulation von VEGFR2 und dem Integrin α V β 3 in Endothelzellen. Diese Resultate fügen sich zu einem Modell, welches erklärt, wie Tumoren ihre eigene Vaskulatur vor Strahlenschäden schützen können. Gleichzeitig weist es darauf hin, dass der kombinierte Einsatz medikamentöser Inhibitoren der Tumorangiogenese und Strahlentherapie in der Therapie von Tumoren sinnvoll sein kann. Diese in vitro Erkenntnisse werden zur Therapie von Tumoren auf das Nacktmausmodell in vivo übertragen. Tiere mit humanen Tumor-Xenotransplantaten werden mit verschiedenen Substanzen, darunter Inhibitoren der Rezeptoren für VEGF, PDGF, bfgf, sowie Inhibitoren von COX-2 und α V β 3 behandelt. Die Resultate zeigen, dass eine kombinierte Behandlung mit ionisierenden Strahlen sinnvoll erscheint, um die Antitumorwirkung zu verstärken [3-6]. Ausserdem wurden Erkenntnisse hinsichtlich der Rolle von PDGF bei der strahleninduzierten Fibrose gewonnen, was dazu beitragen kann, dass künftig die Fibroseentstehung als schwerwiegende Nebenwirkung der Bestrahlung deutlich reduziert werden könnte. Abteilung E050 Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie [7] Huber PE, Li M, Gong P, Plathow C, Peschke P, Groene H, Kiessling F, Zieher H, Debus J, Lipson K, Abdollahi A. Potential signaling and attenuation of radiation-induced lung fibrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys Oct 1;57 (2 Suppl):S160. [8] Abdollahi A, *Wang J, Rastert R, *Ansorge W, *Hahnfeldt P, *Hlatky L, Debus J, Huber PE. Identification of Endostatin-Activated Pathways with Antibody and DNA Array. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res 43: 845, [9] Abdollahi, A., *Lipson, K. E., *Sckell, A., Zieher, H., *Klenke, F., Poerschke, D., Roth, A., Han, X., Krix, M., *Bischof, M., *Hahnfeldt, P., Grone, H. J., Debus, J., *Hlatky, L., and Huber, P. E. Combined therapy with direct and indirect angiogenesis inhibition results in enhanced antiangiogenic and antitumor effects. Cancer Res., 63: , [10] Abdollahi, A., *Hahnfeldt, P., *Maercker, C., Gröne, H. J., Debus, J., *Ansorge, W., *Folkman, J., *Hlatky, L., Huber, P. E. Endostatin s Antiangiogenic Signaling Network. Mol. Cell, 13: , Antiangiogene Regulation in Endothelzellen Mittels cdna chips (nach Unigene /NCBI) konnten wir Expressionsprofile von humanen Endothelzellen nach Behandlung mit recombinant hergestelltem humanen Endostatin erstellen. Weiterhin wurde durch einen 400 Antikörper umfassenden Protein Chip der Phosphorylierungsstatus verschiedener wichtiger Komponenten der Signaltransduktion analysiert und dabei die auf DNA-Niveau prädiktierten Pathways konfirmiert. Auf diese Weise wurden bislang unbekannte Signalkaskaden der Angiogenese in Endothelzellen aufgedeckt [8-10]. 321 Publikationen (* = externer Koautor) [1] Huber PE, Debus J, Hawighorst H, *Fuss M, van Kaick G, *Wannenmacher M. Transient enlargement of contrast uptake on MRI after linear accelerator (linac) stereotactic radiosurgery for Brain Metastases. Int J Radiat Oncol Biol Phys 49: , [2] Abdollahi A, *Wollscheid V, Rastert R, *Weber K, *Ansorge W, *Hahnfeldt P, *Hlatky L, Debus J, *Wannenmacher M, Huber PE. Hypoxia-Induced Differentially Expressed Proteins and Genes in Human Microvascular Endothelial Cells Using Protein and DNA Chip Technology. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res: 844, [3] Abdollahi, A., Gong, P., Rastert, R., Debus, J., *Hlatky, L.,* Hahnfeldt, P., Maercker, C., and Huber, P. E. Genome wide expression profiling of irradiated human lung endothelial cells reveals the activation of genes involved in coagulation, inflammation and angiogenic pathways. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., (1st ed.), 44: 6155, [4] Abdollahi, A.,* Lipson, K. E., Han, X., Krempien, R., *Trinh, T., *Weber, K. J., *Hahnfeldt, P., *Hlatky, L., Debus, J.,* Howlett, A. R., and Huber, P. E. SU5416 and SU6668 attenuate the angiogenic effects of radiation-induced tumor cell growth factor production and amplify the direct anti-endothelial action of radiation in vitro. Cancer Res., 63: , 2003 [5] *Han X, Abdollahi A, *Weber KJ, *Krempien R, *Wannenmacher MF, Debus J, Huber PE. Effect of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Basic Fibroblastic Growth Factor (bfgf) on the Radiosensitivity of Human Microvascular Endothelial cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys 51: 154, [6] Abdollahi A, *Han X, *Lipson K, *Howlett AR, *McMahon G, *Weber KJ, *Krempien R, *Wannenmacher MF, Debus J, Huber PE. Combined effects of angiogenesis inhibitors and radiation on human microvascular endothelial cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys 51: 227, 2001.

322 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E060) Leiter: Prof. Dr. med. Uwe Haberkorn 322 Wissenschaftler Dr. rer. nat. Annette Altmann (½) Prof. Dr. med. John H. Clorius (- 2/03) Dr. med. Antonia Dimitrakopoulou-Strauss (1/02 -) Dr. med. Marcus Henze (- 12/03) Dr. med. Simone Hoffner (4/03-) Dr. med. Johannes Hoffend Dr. med. Gisela Irngartinger (½) (1/02 -) Dr. med. Jürgen Mattern Prof. Dr. med. Ludwig G. Strauss (1/02 -) Dr. rer. nat. Sabine Zitzmann (10/02 -) Gastwissenschaftler Ruham Tsipi (1-2/02; Uni Beer-Shera, Israel) Calcagni, Maria Lucia (Universita Cattolica Roma, Italien) Doktoranden Petra Beuter Stefan Claßen (- 3/03) Stefanie Döser Kerstin Filsinger Carl Freiherr von Gall (1/03 -) Michael Heinold (- 10/02) Pierre Kunz Necla Özdemir-Sahin (5/02 -) Kerstin Schmidt Frank Schönsiegel (Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim[TZ], - 7/03) Stephanie Sieger (- 3/03) Trias Thireu (- 2/02) Technisches Personal Fabian Birkle (3/02 -) Helmut Eskerski (3/02 -) Gabriela Glensch (8/03 -) Karin Leotta Miriam Mahmut Iris Morr Sigrid Peschke (½, 11/02 -) Pia Poppek (Wilhelm-Sanders-Stiftung, - 5/02) Irmgard Preugschat-Gumbrecht (½; TZ, - 6/03) Vanessa Rebel (3/02 -) Ursula Schierbaum (4/01 -) Christian Schoppa Ruska Siegert (½, 8/03 -) Sekretariat Ellen Bender Die Abteilung beschäftigt sich vorwiegend mit der Entwicklung und Anwendung nuklearmedizinischer Verfahren zur Diagnostik und Therapie maligner Tumoren. Die Struktur der Abteilung mit Lokalisation am DKFZ bzw. dem CCC und eine enge Kooperation mit der Abteilung für Nuklearmedizin (beide Abteilungen werden von Professor Haberkorn geleitet) an der Universität Heidelberg und der Abteilung Radiochemie und Radiopharmakologie (Professor Eisenhut, DKFZ) bieten optimale Bedingungen für eine Kombination von Methoden und Erkenntnissen der Grundlagenforschung mit nuklearmedizinischen Methoden. Weiterhin ermöglicht diese Struktur einen schnellen Transfer von Ergebnissen der Grundlagenforschung in die klinische Anwendung. Das Zukunftspotential der Nuklearmedizin liegt dabei in der starken Ausrichtung des Fachs an Biochemie und Molekularbiologie und der damit verbundenen Vielfalt möglicher neuer radioaktiv markierter Moleküle. Dabei bestimmt das zur Markierung verwendete Isotop den Einsatz des Tracers entweder für die Diagnostik oder für die Therapie. Durch die Verwendung verschiedener Isotope kann somit ein Molekül zunächst zur Therapieplanung und dann zur Therapie selbst eingesetzt werden. Die Schwerpunkte der Abteilung liegen derzeit bei 1. der Identifizierung tumoraffiner Moleküle. Hier werden vor allem Phage Display Techniken eingesetzt, um ein Targeting von Peptiden gegen Prostata- und Schilddrüsenkarzinome zu erreichen. Die in diesen Studien erhaltenen Informationen werden für die Optimierung der Peptide für die Diagnostik der Tumoren sowie für therapeutische Zwecke durch Kopplung der Peptide an potentielle Therapeutika eingesetzt. Als Kopplungspartner kommen sowohl Chemotherapeutika als auch radioaktive Isotope in Frage. Ferner werden in präklinischen und klinischen Studien radioaktiv-markierte Antikörper zur Therapie von Lymphomen aber auch von soliden Tumoren evaluiert. 2. dem Erfassen von Gentransfer bzw. dessen Effekte auf den Tumor. Hier werden Suizidgene wie die HSV Thymidin Kinase oder die Cytosin Deaminase verwendet. Ferner kommen Gene zum Einsatz, die zur Anreicherung radioaktiver Isotope führen sollen. Diese Strategie orientiert sich zum einen am Konzept der Radiojodtherapie und versucht durch den Transfer der Gene für den Natrium-Jodidsymporter oder von Peroxidasen eine Speicherung von 131 I in den Tumoren zu erreichen. Zum andern wird versucht durch den Transfer des Norepinephrintransportergens eine Anreicherung von 131 I-MIBG zu erzielen. Erste Ergebnisse zeigen, dass der Transfer dieser Gene per se nicht zu therapeutisch nutzbaren Dosen führt, der Natrium- Jodidsymporter aber als in vivo Reportergen zur nichtinvasiven Darstellung von Gentransfer oder der Promoteraktivierung eingesetzt werden kann. Der Transfer von Genen für Schilddrüsen-Transkriptionsfaktoren wie TTF1 und pax-8 oder des Gens für PPARγ kann zur Darstellung von funktionellen Protein-Protein-Interaktionen genutzt werden. Ferner werden die Effekte dieser Faktoren auf die Redifferenzierung von Tumoren untersucht. Parallel findet in Kooperation mit der Abteilung Endokrinologie der Universität eine klinische Studie zur Redifferenzierung nicht-jodspeichernder Schilddrüsenkarzinome statt. Ferner können durch die Generierung von Tumorlinien mit Expression von Caspasen oder Rezeptoren neue Tracer zur Darstellung von Apoptose bzw. der Rezeptorexpression von Tumoren evaluiert werden. 3. der Entwicklung von Tumormodellen mit Expression von Genen zur Antiangiogenese. Dies erlaubt die Messung der funktionellen Konsequenzen von Antiangiogenesestrategien mittels Positronenemissionstomographie (PET) sowie den Vergleich dieser nuklearmedizinischen Daten mit histologischen (Immunhistologie) und molekularbiologischen (Expressionsmuster) Daten. Das Projekt wird in enger Kooperation mit PD Dr. Ralf Kinscherf (Abteilung für Anatomie und Zellbiologie III. Universität Heidelberg) und mit Dr. D. Koczaw/ Prof. Dr. H. J. Thiesen (Institut für Immunologie, Universität Rostock) durchgeführt. An diesen Modellen können die funktionellen Konsequenzen wie die Wirkung auf Perfusion, Proliferation oder Apoptose aber auch Ab-

323 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie wehrmechanismen des Tumors näher charakterisiert werden. 4. der Konstruktion von gewebe- bzw. tumorspezifischen viralen Vektoren. Hier kommen Promotoren und Enhancer schilddrüsenspezifischer Gene wie Natrium-Jodid-Symporter, Peroxidase und Thyreoglobulin, sowie der Promotor/Enhancer für den Glukosetransporter Typ 1 (GLUT1) als tumorspezifisches System zum Einsatz. GLUT1 wird in den meisten Tumoren und auch sehr frühzeitig nach maligner Transformation von benignen Zellen überexprimiert. 5. der Entwicklung neuer nuklearmedizinischer Methoden zur Tumorcharakterisierung und zum Therapiemonitoring. Neben Stoffwechselmarkern kommen auch Tracer zur Darstellung von Proliferation (3'-[ 18 F]Fluor- 3'-deoxythymidin), Apoptose (Anexin V, Caspaseinhibitoren, Caspasesubstrate), Rezeptorexpression (Somatostatin, Bombesin, Melanocortin) und Angiogenese zur Anwendung. In diesen Schwerpunkt fallen auch korrelative Untersuchungen von Tracerkinetik und molekularbiologischen Parametern und die Entwicklung von Quantifizierungsverfahren (Kompartmentversus Non-Kompartmentanalysen, parametrisches Imaging, Bildrekonstruktionsverfahren). Effekte der Expression von humanem Angiopoietin-2 in Rattenhepatomen P. Kunz, J. Hoffend*, L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou- Strauss, R. Kinscherf**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg Angiopoietin-2 (Ang-2) ist ein Antagonist von Angiopoietin- 1, der die vaskuläre Reifung und Stabilität reduziert, gleichzeitig aber den Zugang von VEGF an Endothelzellen erleichtert. Die vorliegende Studie untersuchte die Effekte des Ang-2 Gentransfers auf Tumorwachstum und Perfusion. Nach Infektion von Morrishepatomzellen (MH3924A) mit einem bicistronischen retroviralen Vektor und Generieren von Ang-2-exprimierenden Linien wurden Messungen der 15 Perfusion mit PET-H 2 O, des Tumorwachstums und histologischer Veränderungen an tumortragenden Tieren vorgenommen. Die histologische Analyse erfasste dabei die Nekrosefläche sowie die Gefäßdichte mit Antikörpern gegen α-aktin und CD31. Ferner wurde die Proliferation mittels PCNA-Färbung und der Anteil apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Assay bestimmt. Ang-2-exprimierende Tumoren zeigten im Vergleich zu den Wildtyptumoren eine Wachstumshemmung. Die dynamische PET wurde mittels eines pharmakokinetischen Modells quantifiziert und ergab einen Anstieg in K1 um ca. 300%. Die histologische Analyse lieferte korrespondierende Daten mit einem Anstieg der α-aktin und CD31-Färbung um 200 bis 300% und einem deutlichen Abfall der Nekrosefläche. Ang-2 führt in diesem Tumormodell zu einer Steigerung der Perfusion, die offensichtlich zum Teil durch eine Hochregulation der Gefäßneubildung bedingt ist. Weitere Studien zur Änderung des Expressionsmusters werden derzeit mittels Chip-Analyse durchgeführt. Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Transfer von Angiostatin und Troponin I in Morrishepatome: Änderungen von Perfusion und Proliferation K. Schmidt, J. Hoffend*, L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou-Strauss, A. Altmann, R. Kinscherf**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg Angiostatin (ANG) und Troponin I (TnI) sind effiziente Inhibitoren der Proliferation endothelialer Zellen, die die Angiogenese und das Tumorwachstum hemmen können. Stabil transfizierte Morrishepatom Zell-Linien mit Expression dieser Gene zeigten eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums (90%), und Induktion von Apoptose (80-90%) in vivo. Dennoch war die Perfusion in der Tumoren, gemessen mit H 2 15 O PET, um 85% gesteigert in Angiostatinund unverändert in Troponin I-exprimierenden Tumoren. Diese Daten fanden ihre Entsprechung in der immunhistochemisch quantifizierten CD31-positiven Fläche. Um Änderungen des Expressionsmusters als eine generelle Reaktion der Tumoren auf die Expression von Angiostatin oder Troponin I Aktivität zu bestimmen, wurde eine gene array Analyse durchgeführt. Diese ergab eine veränderte Expression von Angiogenese-, Entzündungs- und Apoptosebezogener Genes bei den gentechnisch modifizierten Hepatomen. Diese Ergebnisse sind Evidenz dafür, dass humanes Angiostatin und Troponin I das Tumorwachstum über eine Modulation sowohl der Perfusion als auch der Apoptose bzw. Proliferation regulieren. Expression des löslichen Rezeptors für VEGF in Hepatomen. K. Schmidt, B. Engelhardt**, J. Hoffend*, L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou-Strauss, A. Altmann, R. Kinscherf**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg Mittels eines bicistronischen retroviralen Vektors für den Transfer des löslichen Rezeptors für VEGF (sflt) und des Hygromycinresistenzgens wurden stabile Hepatom-Zell-Linien mit sflt-expression generiert. In Kokulturexperimenten mit humanen Umbilicalvenen Endothezellen (HUVEC) wurde die Proliferationshemmung durch sflt-exprimierende Hepatomzellen mittels Coulter counter und einem Thymidininkorporations assay bestimmt. Weiterhin erfolgten in vivo Experimente zur Erfassung des Tumorwachstums und der Perfusion. Die Tumoren wurden schließlich weiter charakterisiert mittels Immunhistologie und DNA Chip Analyse. Stabile sflt-exprimierende Hepatomzellen hemmten die Proliferation der Endothelzellen in vitro. In vivo wuchsen die genetisch modifizierten Tumor ebenfalls langsamer. 15 Dennoch war die mittels H 2 O PET bestimmte Perfusion unverändert. Dies entsprach auch der CD31- und α-actin positiven Fläche. Die Anzahl der apoptotischen Zellen war in sflt-exprimierenden Tumoren jedoch um das Dreifache gesteigert. Eine DNA Chip Analyse zeigte einen Anstieg von Apoptose- und oxidativen Stress-bezogener Gene. Die sflt Expression scheint daher das Tumorwachstum eher durch einen Anstieg in der Apoptose und des oxidativen Stresses in diesem Tumormodell zu hemmen. 323

324 324 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Gallium-68-DOTA-Albumin, ein cyclotronunabhängiger PET-Blutpoolmarker; Evaluierung im Rattenmodell in vivo J. Hoffend*, W. Mier*, L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou-Strauss, A. Altmann, R. Kinscherf**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg Zur Blutpoolmarkierung für Studien zur Tumor- oder Hirnperfusion stehen bisher nur wenige PET-fähige Tracer zur Verfügung, die ein in-house Cyclotron voraussetzen (C 15 O, 62 Cu-Verbindungen) und eine sehr kurze physikalische Halbwertszeit besitzen. Wir beschreiben die tierexperimentelle Evaluierung eines Albumin-Konjugats, das mit 68 Ga, einem für die PET günstigen, generator-generierten Nuklid markiert wurde. 68 Ga ist wegen der Halbwertszeit des Mutternuklids des verwendeten 68 Ge/ 68 Ga-Generators permanent verfügbar. Die Experimente erfolgten an tumortragenden (MH3924A) ACI Ratten unter Inhalationsnarkose. In zwei Tieren erfolgte nach Applikation von MBq 68 Ga-DOTA-Albumin i. v. über 1 min nur eine PET Messung (3D Modus, 10x30 s, 5x60 s, 5x120 s, 8x300 s, Matrix 256x256, Siemens ECAT EXACT HR+, iterative Rekonstruktion). Bei 3 weiteren Tieren wurde gleichzeitig zur PET (2D Modus, sonst wie oben) die Blutpool Aktivität kontinuierlich in einem arterio-venösen Shunt mit pumpenkontrollierter Flussrate in einem Detektor bestimmt. Aus den PET Daten wurden jeweils durch manuelle Platzierung von regions of interest (ROIs) über Herz, Leber, Harnblase und Tumor Zeit-Aktivitätskurven (ZAK) der jeweiligen standardised uptake values (SUV) generiert. In zwei weiteren ACI Ratten wurden jeweils 2 MBq 67 Ga-DOTA-Albumin i. v. appliziert und 60 min p. i. nach Laparotomie Blut aus der Aorta und Urin aus der Harnblase für die anschließende HPLC-Analyse entnommen, die über Größenausschluss-Säulen erfolgte. Die ZAK der Herzregion fiel nach einem ausgeprägten Peak allmählich ab, die Leber und Tumor ZAK erreichten nach wenigen Minuten ein Plateau, die Blasenaktivität stieg nach 5 min p. i. deutlich an. In den Experimenten mit Shunt zeigten 60 min p. i. die ZAK im Shunt bzw. in der Herz-ROI im Median 72% bzw. 63% der Peak-Aktivität. Mediane SUV 60 min p. i. betrugen in Herz, Leber, Tumor und Blase 3,1, 1,9, 0,69 bzw. 11,1. Der Sammelurin 60 min p. i. zeigte 6% der injizierten Dosis in der Harnblase. Im Plasma eluierte 60 min p. i. nur das 67 Ga-markierte Albumin-DOTA-Konjugat, während im Urin nur ein Peak wesentlich niedrigeren Molekulargewichts nachweisbar war, der dem markierten DOTA- Chelator entsprach. 68 Ga-DOTA-Albumin ist ein Blutpool-Marker mit für die PET praktikabel langer physikalischer Halbwertszeit und protrahierter Clearance aus dem Blut, die der jodmarkierter Albumine entspricht [Matias C et al. J Nucl Med 1991; 32: ]. In vivo ist 68 Ga-DOTA-Albumin im Plasma stabil, es ist ein Metabolit nachweisbar, der in geringen Mengen im Urin ausgeschieden wird. Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Gewebespezifische Expression der Herpes Simplex Virus Thymidin Kinase in malignen Melanomen F. Schönsiegel, D. Schadendorf*, J.A. Kleinschmidt**, U. Haberkorn * D070 DKFZ; **F010 DKFZ Gentherapie des malignen Melanoms mit Suizidgenen erfordert neben einem effizienten Gentransfer auch eine selektive Expression des therapeutischen Gens. Diese Studie untersucht die gewebespezifische Expression eines Reportergens und eines therapeutischen Gens durch die Verwendung von melanom-spezifischen Promotor/Enhancer Konstrukten. Die Gene für das enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Herpes Simplex Virus Thymidin Kinase (HSVtk) wurden hinter den Promotor des Gens für die melanomainhibitory-activity (MIA) und multiple Enhancer des Tyrosinasegens in Adeno assoziierte Virus (AAV) Vektoren kloniert. Als Kontrolle diente der CMV Promotor. Die rekombinanten AAV-Partikel wurden anschließend zur Infektion von 3 Melanom- und einer Cervixkarzinom-Zell-Linie benutzt und die Expression des jeweiligen Gens mittels FACS Analyse oder durch die Anreicherung von 3 H- Gancyclovir erfasst. Nach Infektion mit HSVtk-Konstrukten wurde nach Therapie mit Gancyclovir die Hemmung des Thymidineinbaus in die DNA sowie die Wachstumshemmung mittels Coulter-Counter gemessen. Nach Generieren einer stabilen HSVtk-exprimierenden Melanomlinie erfolgten in vivo Experimente an Nacktmäusen. Viruspartikel, die den Tyrosin Enhancer/MIA Promotor enthielten führten nur in Melanomzellen zu Reportergenaktivität, während Infektionen mit dem unspezifischen CMV Promotor nur unspezifische Genexpression erzeugte. Transiente Transduktion mit viralen Partikeln mit dem HSVtk Gen unter der Kontrolle der Tyrosin/MIA regulatorischen Elemente erzeugte gesteigerten 3 H-Gancyclovir Uptake und Wachstumshemmung unter Gancyclovir (GCV) nur in Melanomzellen. In vivo reicherten HSVtk-exprimierende Melanome das spezifische Substrat 131 I-deoxycytidine vermehrt an und verschwanden unter systemischer Therapie mit GCV. Die Kombination aus Tyrosinase Enhancer und MIA Promotor führt zu gewebespezifischer Expression in Melanomzellen. Tumor spezifische Genexpression mittels regulatorischer Elemente des Glukosetransporter 1 (GLUT1) Gens S. Sieger, A. Altmann, J.A. Kleinschmidt*, U. Haberkorn *F010 DKFZ Zum tumorspezifischen Targeting von Adeno assoziiertem Virus (AAV)-vermittelter Genexpression, wurden regulatorische Elemente des Glukosetransporter 1 (GLUT1) Gens upstream eines Reportergens und eines Suizidgens kloniert. Die AAV Vektoren enthielten die folgenden GLUT1 regulatorischen Elemente: Enhancer1 (SBb) und/oder Promotor (GTI-1.3). Das Herpes Simples Virus Thymidin Kinase (HSVtk)-Gen oder das Reportergen EGFP wurden exprimiert entweder unter der Kontrolle des GLUT1 Promotor/Enhancers oder des unspezifischen CMV Promotors. In vitro Assays mit Tumor- (MH3924A, HCT116, Jurkat)

325 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie und Nicht-Tumor Zell-Linien (HUVEC, HaCaT, HaCaT-RT3) erfolgten mit FACS zur Kontrolle der Spezifität der GLUT1 Regulation des EGFP-Gens in Tumorzellen. Ferner wurden Versuche zur Aufnahme von 3 H-Gancyclovir und zur Toxizität des HSVtk/Gancyclovir-Systems nach transienter Infektion der Zellen mit den verschiedenen AAV-Partikeln und Inkubation mit Gancyclovir durchgeführt. Tumorzellen und die ras-transformierte Zell-Linie HaCaT-RT3 zeigten eine signifikante Reduktion in der Zellzahl (HCT116: 55,05%; MH3924A: 42,91%, HaCaT-RT3: 34,29%). Weiterhin wurde eine Reduktion des 3 H-Thymidin-Einbaus in die DNA nach Inkubation mit GCV beobachtet (HCT116: 37,75%; MH3924A: 32,79%; HaCaT-RT3: 36,33%). Evidenz für die Phosphorylierung des HSVtk Substrats GCV wurde in allen Tumorzell-Linien gefunden (HCT116: 80,26%; MH3924A: 74,51%; HaCaT-RT3: 257,41%), nicht jedoch in Nicht-Tumor-Linien. Um auszuschließen, dass die raav/gti-1.3 Partikel auch Promotoraktivität in Zellen des Immunsystems und primären Gewebekulturzellen zeigen, wurden T-Lymphocyten und humane primäre endotheliale Zellen mit raav/gti-1.3egfp infiziert. Eine FACS Analyse ergab nur eine schwache Reportergenaktivität in allen Nicht- Tumorzellen. Stabil mit HSVtk transduzierte MH3924A Zellen zeigten eine gesteigerte Anreicherung des HSVtk Substrats 125 I-Deoxycytidin. Die in vitro Daten sind Evidenz für eine tumorspezifische Aktivität des GLUT1 Promotors/Enhancers. Kombiniert mit dem Gen für HSVtk kann dieser therapeutische Ansatz nicht-invasiv in vivo mittels spezifischer Substrate wie 131 I- deoxycytidin verfolgt werden. Expression des Natrium Jodid Symporters unter der Kontrolle des Glukosetransporter 1 Promotors S. Sieger, A. Altmann, J.A. Kleinschmidt*, U. Haberkorn *F010 DKFZ Gerichteter Transfer des Natrium Jodid Symportergens (NIS) in Tumorzellen könnte zur Radiojodtherapie von Nicht- Schilddrüsentumoren genutzt werden. Wir untersuchten die Jodaufnahme in Hepatomzellen in vitro und in vivo nach Transfer des hnis G Gens unter der Kontrolle eines möglicherweise tumor-spezifischen regulatorischen Elements, dem Promotor des Glukosetransporter 1 Gens (GTI-1.3). Mittels eines selbst-inaktivierenden bicistronischen retroviralen Vektors für den Transfer des hnis und des Hygromycinresistenzgens wurden Morrishepatomzellen (MH3924A) infiziert und anschließend hnis-exprimierende Zellen generiert. 125 I - Uptake und Efflux-Messungen erfolgten in genetisch modifizierten und Wildtyp-Zellen. Ferner wurde die Jodid-Verteilung in Ratten mit Wildtyp und genetisch modifizierten Hepatomen erfasst. HNIS-exprimierende MH3924A-Zellen reicherten bis zu 30- fach mehr Jodid an als Wildtypzellen mit einem maximalen Jodiduptake nach 30 Minuten. Kompetitionsexperimente in Anwesenheit von Natriumperchlorat zeigten einen Abfall des Jodiduptakes (80% to 84%). Ouabain führte ebenfalls zu einer verminderten Anreicherung (81%) während DIDS den I-Uptake steigern konnte (87%). Ein rascher Efflux der Radioaktivität (70%) wurde 20 Minuten nach Austausch des Kulturmediums beobachtet. Lithium hatte in vitro keinen positiven Effekt auf den Efflux. In vivo reicherten die hnis-exprimierenden Tumore 22-fach mehr Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Jodid an als Wildtyp-Tumore. Auch hier wurde ein rascher Efflux beobachtet. Dosimetrische Berechnungen ergaben eine absorbierte Dosis von 85 mgy in Wildtyp-Tumoren und 830 mgy in hnis-exprimierenden Tumoren nach Gabe von 18.5 MBq 131 I. Die Transduktion des hnis Gens unter der Kontrolle des GLUT1 Promotorelements induziert also gesteigerten Jodidtransport in Morrishepatomen in vitro und in vivo. Für eine therapeutische Anwendung sind jedoch weitere Modifikationen, die den Jodid-Efflux hemmen, nötig. Messung von AP1 Aktivierung nach Transfer des humanen Natrium-Jodid Symporter Gens A. Altmann, U. Haberkorn Ziel war die Konstruktion eines Reportersystems zur Visualisierung von Stressreaktionen durch Monitoring der Induktion des activator protein 1 (AP1) und des stress-activated protein kinase/jun N-terminal kinase (SAPK/JNK) Signaltransduktionswegs. Zunächst erfolgte die Klonierung eines Expressionsvektors mit den Genen für den humanen Natrium Jodid Symporter (hnis) und Hygromycinresistenz unter der Kontrolle von 4 Tandemkopien des AP1 Enhancers fusioniert mit dem minimal Herpes simplex virus Thymidin Kinase Promoter. In diesem Konstrukt induziert die Bindung von Transkriptionsfaktoren an AP1 die Transkription des Reportergens. Zur simultanen Expression der Gene für hnis und Hygromycinresistenz sowie zur Stabilisierung der mrna wurde ein synthetisches Intron und eine internal ribosomal entry site (IRES) des Encephalomyocarditis Virus zwischen die Gene kloniert. Nach Lipofektion von humanen Cervixkarzinomzellen (HeLa) und Rattenhepatomzellen (MH3924A) und Selektion stabiler Zell-Linien wurden Jodid Uptake Experimente mit und ohne Anwesenheit eines Phorbol Esters (TPA) durchgeführt. Bei Hela Zellen wurde in Abwesenheit von TPA kein Unterschied zwischen Wildtyp und genetisch modifizierten Zellen beobachtet. Zugabe von TPA führte jedoch zu einer 11-fachen Steigerung der Jodid-Anreicherung. Dieser Anstieg war dosis-abhängig mit einem Plateau bei 8 µm TPA und zeitabhängig mit einem Plateau nach 6 h Stimulation mit 8 µm TPA. Bei MH Zellen wurde ein bis zu 58- facher Anstieg der Jodanreicherung bereits in nicht-stimulierten Zellen gemessen. Inkubation mit TPA führte zu einem weiteren (1.7-fach) Anstieg des Uptakes Wir fanden verschiedene Basalaktivitäten für den Jodidtransport in genetisch modifizierten HeLa und Morris Hepatom Zellen, was auf Unterschiede in der AP1 Aktivierung bei diesen Tumorzellen hinweist. Stimulation des regulatorischen Elements für AP1 führte zu einer Steigerung des Jodid Uptakes in beiden Tumortypen. Systeme, die regulatorische Elemente der Signaltransduktionswege mit in vivo Reportergenen wie dem hnis kombinieren, könnten für die biologische Charakterisierung von Tumoren sowie die nichtinvasive Charakterisierung von Signaltransduktionsaktivierung eingesetzt werden. 325

326 326 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Evaluation der Drosophila melanogaster multisubstrate deoxyribonucleosid Kinase (DMdNK) als ein neues Suizid- und Reportergen. A. Altmann, W. Mier*, M. Eisenhut**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **E030 DKFZ Nach Transfektion von Rattenhepatomzellen (MH3924A) mit einem bicistronischen retroviralen Vektor zum Transfer des DM-dNK Gens und Neomycinresistenzgens wurden verschiedene Klone mittels G418 Selektion etabliert. Danach erfolgten Uptake-Messungen bei einer DMdNK-exprimierenden Zell-Linie, einer HSVtk-exprimierenden Linie und der Wildtyp-Linie mit verschiedenen potentiellen Substraten: Thymidin, Fluordeoxyuridin, Ioddeoxyuridin (IUdR), Bromdeoxyuridin (BrUdR), Fluordeoxycytidin, Chlordeoxyadenosin, FIAU, Gancyclovir (GCV), BVDU, Ioddeoxycytidin (ICdR) und Gemcitabine. Weiterhin wurde die Wachstumshemmung in Anwesenheit verschiedener Dosen Gemcitabine erfasst. Nach 3 h Inkubation zeigten DMdNK-exprimierende Zellen einen erhöhten Uptake für IUdR (2-fach), BrUdR (2-fach), TdR (3-fach), Gemcitabine (5-fach), IcdR (6-fach), FIAU (10-fach), BVDU (37-fach). Im Unterschied zu den HSVtkexprimierenden Zellen war der GCV- Uptake nicht gesteigert. Weiterhin war der Tracer-Uptake in HSVtkexprimierenden Zellen höher für FIAU, GCV, BVDU, BrUdR und TdR, während Gemcitabine mehr (1,8-fach) von DMdNKexprimierenden Zellen angereichert wurde. Inkubation der Zellen mit 10, 50 oder 100 nm Gemcitabine führte zu einer Wachstumshemmung von 25, 69 und 87% (DMdNK), 17, 45 und 70% (HSVtk) und 0, 21 und 59% (Wildtyp). Der Transfer des DM-dNK-Gens führt demnach zu einer gesteigerten Aufnahme verschiedener Nucleosidanaloga mit einem zu HSVtk unterschiedlichen Muster. Weiterhin führt das Enzym zu einer erhöhten Gemcitabine-Aufnahme mit höherer Sensitivität der Zellen Transfer des Gens für den humanen Norepinephrine Transporter zur Steigerung der MIBG Aufnahme in Hepatomzellen. A. Altmann, W. Mier*, M. Eisenhut**, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg; **E030 DKFZ Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Der Transport von Meta-Iodbenzylguanidin (MIBG) durch den humanen Norepinephrintransporter (hnet) stellt einen kritischen Schritt bei der Behandlung von MIBG-anreichernden Tumoren dar. Wir untersuchten daher, ob eine Anreicherung von MIBG durch Transfer des hnet-gens in Morris-Hepatomzellen erreicht werden kann. Mithilfe eines bicistronischen retroviralen Vektors für den Transfer des hnet-gens und des Hygromycinresistenzgens wurden Morris-Hepatomzellen (MH3924A) infiziert und hnet-exprimierende Zell-Linien generiert. Anschließend erfolgte Experimente zur Aufnahme und Efflux von 3 H- Norepinephrin oder 131 I-MIBG in transfizierten und Wildtyp- Zellen. Weiterhin wurde die 131 I-MIBG-Verteilung in Ratten und Nacktmäusen mit Wildtyp und NET-exprimierenden Hepatomen erfasst. hnet-exprimierende Hepatom-Linien reicherten bis zu 36- fach mehr Norepinephrin an als Wildtyp-Zellen und 8-fach mehr als die NET-exprimierende Neuroblastom-Linie SK-N- SH. Zugabe von Nisoxetin, einem selektiven Inhibitor des Noradrenalin-Uptake, führte zur Hemmung der Traceraufnahme. Eine maximale 131 I-MIBG-Anreicherung konnte nach 2 h Inkubation beobachtet werden, allerdings mit 43 % Efflux während 4 h nach Wechsel des Kulturmediums. In vivo Experimente mit Nacktmäusen ergaben, verglichen mit den Wildtyp-Tumoren, eine 10-fach höhere Anreicherung von 131 I-MIBG in den gentechnisch modifizierten Tumoren. Dennoch führte dies nur zu einer absorbierten Dosis von 605 mgy in hnet-exprimierenden Tumoren versus 75 mgy in Wildtyp-Tumoren. Die Transduktion des hnet-gens in Morris-Hepatomzellen führt zu gesteigertem Uptake von Norepinephrin und MIBG. Die Retention von 131 MIBG ist jedoch nur von kurzer Dauer und ergibt keine therapeutisch relevante Dosis. Jodid Kinetik nach Transfer des humanen Natrium-Jodid Symportergens in Schilddrüsenkarzinomzellen der Ratte U. Haberkorn, A. Altmann Der Transfer des Natrium Iodid Symporter (hnis) Gens wurde als ein neues therapeutisches Prinzip zur Gentherapie von Tumoren vorgeschlagen. Diese Studie evaluiert die Jodidkinetik und Dosimetrie in hnis-exprimierenden Schilddrüsenkarzinomzellen unter optimierten Bedingungen. Mittels eines bicistronischen retroviralen Vektors für den Transfer des hnis und des Hygromycinresistenzgens wurden hnis-exprimierende Rattenschilddrüsenkarzinomzellen (L2) generiert. Danach erfolgten Messungen des Na 125 I- Uptake und Efflux in gentechnisch modifizierten und Wildtyp-Zellen. Weiterhin wurde in Nacktmäusen nach ablativer Therapie der Schilddrüse und Transplantation von Wildtyptumoren und genetisch modifizierten Schilddrüsenkarzinomen die 131 I-Verteilung mit und ohne Gabe von Lithium-Carbonat erfaßt. hnis-exprimierende Zellen reicherten bis zu 49-mal mehr Jodid an als Wildtypzellen mit einem maximalen Jodid-Uptake nach 30 minütiger Inkubation. Ferner wurde ein 90%-iger Efflux der Radioaktivität während der ersten 20 Minuten nach Austausch des Kulturmediums beobachtet. In Nacktmäusen reicherten die hnis-exprimierenden Tumore bis zu 23 (Lithium) und 19.5 (Kontrolle) mal mehr Jodid an als die Wildtyp-Tumore. Ein Efflux konnte jedoch auch in vivo beobachtet werden: nach 24 h verloren die hnisexprimierenden Tumore 82.5% bzw. 80.4% der initialen Aktivität. Dosimetrische Berechnungen ergaben für die Gabe von 1650 MBq 131 I/m 2 Werte von 5.4 bzw. 5.2 Gy (Wildtyp 0.24 bzw. 0.26). Die Transduktion des hnis Gens induziert gesteigerten Jodidtransport in Schilddrüsenkarzinomzellen der Ratte, der jedoch mit raschem Efflux und niedriger absorbierter Dosis assoziiert ist. Lithium-Carbonat hat keinen Effekt auf die Retention von Jodid. Ein neues prostata-spezifisches Peptid (DUP-1) für Tumorimaging und Tumortherapie S. Zitzmann, W. Mier*, U. Haberkorn *Nuklearmedizin, Universität Heidelberg Prostatakarzinome gehören zu den häufigsten Tumoren mit steigender Tendenz. Die gängigen bildgebenden Verfahren wie Ultraschall, Computertomographie, aber auch PET weisen häufig nur bescheidene Ergebnisse auf. Peptide als Tracer mit hoher Sensitivität und Spezifität wären für die Diagnostik wünschenswert. Mit einer Phagen-Display-Bibliothek aus 12 aa Peptiden wurden 6 in vitro-selektionsrunden, bestehend aus neg.

327 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Selektion gegen 293-Zellen und pos. Selektion gegen DU- 145-Zellen durchgeführt. Phagen, die sich angereichert hatten, wurden isoliert und das von ihnen exprimierte Peptid durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Ein synthetisch hergestelltes Peptid wurde mit Iod-125 markiert und die Bindung des Peptids, sowie eine Kompetition der Bindung, wurde an verschiedene Tumorzelllinien in vitro getestet. Die Kinetik der Bindung sowie der ID50-Wert wurde an DU-145-Zellen bestimmt. Für Organverteilungsstudien wurde das Peptid mit Iod-131 markiert und i. v. in Tumortragende Mäuse (DU-145-Zellen und PC-3-Zellen) injiziert. Mit Hilfe einer Phagen-Display-Bibliothek konnte das Peptid DUP-1 mit der Sequenz FRPNRAQDYNTN identifiziert werden. In vitro-bindungsstudien zeigen, dass DUP-1 an DU und PC-3-Zellen bindet und diese Bindung zu mehr als 95% kompetitiert werden kann. Der ID50-Wert beträgt etwa 50 µm. Die Kinetik der Bindung ist schnell mit einem Peak bei 10 Minuten. Zusätzlich bindet DUP-1 auch an zwei Schilddrüsenzelllinien, eine Brustkrebszelllinie und eine Neuroblastomzelllinie, nicht aber an die primären Endothelzellen (HUVEC). Organverteilungsstudien mit s. c. transplantierten DU-145- und PC-3-Zellen zeigen, dass sich im Tumor mehr Radioaktivität befindet als in den übrigen Organen, mit Ausnahme der Niere, die anfänglich mehr Radioaktivität zeigt als der Tumor, dann aber auf unter Tumorniveau absinkt (Tab.1). Allerdings befindet sich im Blut mehr Radioaktivität als im Tumor. Die vorläufigen Stabilitätsstudien zeigen, dass DUP-1 in Serum und Blut sehr instabil ist. Das Peptid DUP-1 scheint mit seiner spezifischen, schnellen und hohen Bindungskapazität ein aussichtsreicher Ausgangspunkt für ein prostata-spezifisches Peptid zu ein, das für Tumortherapie und Tumorimaging eingesetzt werden kann. Untersuchungen darüber, welche von den 12 aa für die Bindung wichtig sind, und wie das Peptid stabilisiert werden kann, werden gegenwärtig durchgeführt. Tab. 1 Organverteilung von I-131 markiertem DUP min 45 min 135 min Blut 6,92 7,31 3,72 Herz 2,62 2,32 1,09 Leber 3,24 3,28 1,51 Milz 2,82 2,50 1,08 Niere 5,20 5,54 2,45 Muskel 3,02 1,21 0,72 Gehirn 0,53 0,46 0,15 Tumor 4,09 3,49 2,99 Prognostische Aspekte der PET-FDG-Kinetik bei FOLFOX-therapierten Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom A. Dimitrakopoulou-Strauss, L.G. Strauss, C. Burger*, A. Rühl**, G. Irngartinger, W. Stremmel***, J. Rudi**** *Nuklearmedizin, Universität Zürich, Schweiz; **Biologie, Universität München; ***Abteilung Innere Medizin V, Universität Heidelberg; ****Innere Medizin, Theresienkrankenhaus und St. Hedwig Klinik, Mannheim Es wurden quantitative Messungen mit F-18-Fluorodeoxyglucose (FDG) und Positronenemissionstomographie (PET) ausgewertet und verschiedene Quantifizierungsmethoden hinsichtlich ihrer Vorhersage des Überlebens bei Patienten Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin mit metastasierten kolorektalen Tumoren unter FOLFOX- Chemotherapie (5-Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin) verglichen. Methoden: Die laufende Studie umfasst 25 Patienten mit 41 Metastasen. Alle Patienten wurden vor, nach dem ersten und nach dem vierten Zyklus der FOLFOX-Therapie untersucht. Die Daten-Analyse umfasste SUV, fraktale Dimension (FD), 2-Kompartment-Modell mit Berechnung von k1, k2, k3, k4 und Distributionsvolumen (VB). Überlebensdaten wurden in Bezug zu den PET-Daten ausgewertet / als Referenz für die PET-Daten benutzt. Diskriminanzanalyse (DA), Regressionsanalyse und die best subset Methode wurden auf die Daten angewendet. Ergebnisse: 20 von 25 Patienten verstarben innerhalb von 801 Tagen nach der ersten PET-Untersuchung. Das mediane Überleben lag bei 290 Tagen und wurde als Trennpunkt zur Klassifikation der Patienten in 2 Gruppen benutzt. Mit Hilfe der DA wurden SUV und kinetische Parameter des FDG-Stoffwechsels auf ihre Vorhersagekraft hinsichtlich der Zugehörigkeit zu den beiden Patientengruppen getestet. Mittels SUV ergab sich eine korrekte Klassifikationsrate (CCR) zwischen 58 und 67 %. Die besten Ergebnisse erhielten wir unter Berücksichtigung der kinetischen Parameter (k1, k3, VB, FD) als Vorhersage-Variablen. Die CCR der kinetischen Daten der ersten und dritten Messreihe lag bei 78 %, im Vergleich zu 67 % für die SUVs. Eine multiple lineare Regressionsanalyse wurde auf die Daten angewandt um die Beziehung zwischen dem Überleben und den PET-Daten abzuschätzen. Mit der best subset Methode ergab sich ein Korrelationskoeffizient von 0,901 für die kinetischen Parameter der zweiten (k3, k4) und der dritten Messreihe (k1-k4, VB, SUV). Schlussfolgerung: Die Kombination kinetischer Parameter der ersten und dritten Messreihe ermöglicht eine Klassifikation der Patienten in Kurz- oder Langzeit-Überlebende. Eine individuelle Prognose des Überlebens kann am besten durch kinetische Parameter der zweiten und dritten Messreihe erreicht werden. Die fraktale Natur dynamischer positronenemissionstomographischer (PET) Datensätze A. Dimitrakopoulou-Strauss, L.G. Strauss, K. Mikolaijczyk*, C. Burger**, T. Lehnert***, L. Bernd****, V. Ewerbeck**** *Technische Universität Warschau, Polen; **Nuklearmedizin Zürich, Schweiz; ***Chirurgische Onkologie, Universität Heidelberg; ****Orthopädische Universitätsklinik Heidelberg Die Quantifizierung von dynamischen PET-Untersuchungen basiert im Allgemeinen auf Kompartment-basierten Methoden. Dies ist ein Bericht über die Einführung und Bewertung einer neuen, nicht Kompartment-basierten Methode. Die fraktale Dimension (FD) als Parameter zur Analyse dynamischer PET-Daten basiert auf dem box counting (BC)- Verfahren der Chaos-Theorie. Die Auswertung umfasste 200 maligne Läsionen bei 159 Patienten mit unterschiedlichen Tumorentitäten sowie 57 benigne Läsionen zum Vergleich. 101 der 200 malignen Läsionen waren mit Chemotherapie vorbehandelt, wohingegen die restlichen 99 sowie alle 57 benignen Läsionen in den letzten 6 Monaten vor Durchführung der PET mit F-18-Fluorodeoxyglucose FDG ohne Behandlung waren. Die Auswertung der FDG- Kinetik erfolgte mittels BC-basierter fraktaler Dimension der Zeitaktivitätsdaten. Die visuelle Beurteilung zeigte im Allgemeinen unterschiedliche FDG-Aufnahmemuster in den konventionellen Bildern und den parametrischen Bildern der 327

328 328 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie FD. FD-Werte waren von der Boxenanzahl und dem Maximalwert der Berechnung abhängig. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Diskrimanzanalyse. FD ergab eine Genauigkeit von % für alle Patienten, 67.7 % für die unbehandelten und % für die behandelten Patienten in Bezug auf die Differenzierung maligner versus benigner Läsionen. Der Einsatz der BC-basierten FD ist eine zuverlässige neue Methode zur Quantifizierung dynamischer PET-Untersuchungen und scheint insbesondere hilfreich in der Bewertung vorbehandelter maligner Läsionen. Ein verkürztes PET-Akquisitionsprotokoll für die Quantifizierung der 18 F-FDG-Kinetik L.G. Strauss, A. Dimitrakopoulou-Strauss, U. Haberkorn Wir definierten und evaluierten ein modifiziertes verkürztes Akquisitionsprotokoll zur Vorhersage kinetischer Parameter der 18 F-FDG-Kinetik aus dynamischen PET-Messungen. Methoden: Die Auswertung umfasste 151 Datensätze von 60 Patienten, die mit einem dynamischen Datenakquisitionsprotokoll über 60 Minuten untersucht wurden. Der SUV (standardized uptake value) wurde für die einzelnen Frames berechnet und ein 2-Kompartment-Modell wurde auf die Daten angewendet. Die kinetischen Parameter und der 18 F-FDG Influx, der aus den Modell-Daten errechnet wurde, dienten als Referenzwerte der Analyse. Korrelationen zwischen SUV und den Referenzdaten wurden berechnet. Mit Hilfe des best subset -Verfahrens wurden Zeitintervalle identifiziert, die zur Vorhersage der auf einer polynomialen Funktion zweiter Ordnung basierenden Referenz-Parameter genutzt werden können. Ergebnisse: Wir fanden signifikante Korrelationen für SUV- Werte und den 18 F-FDG Influx, das Distributionsvolumen (VB) und die Transportkonstante k1. Der Influx war hauptsächlich mit den SUVs der späten Akquisitionszeiten assoziiert, wohingegen stärkere Korrelationen für die frühen Akquisitionszeiten und VB sowie k1 gefunden wurden. Ein kurzes dynamisches Akquisitionsprotokoll wurde auf der Basis einer kurzen dynamischen Sequenz 1-10 Minuten nach Tracerinjektion und einer statischen Akquisition Minuten nach Tracerinjektion definiert. Die Korrelationskoeffizienten erreichten 0,9 für Influx, VB und k1, wenn die SUVs der Input-Region (Blut) und der Zielregion zur Vorhersage der kinetischen Parameter herangezogen wurden. Schlussfolgerung: Ein kurzes dynamisches Akquisitionsprotokoll kann eingesetzt werden, um detaillierte Informationen über die 18 F-FDG-Kinetik zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass der 18 F-FDG Influx, VB und k1 mit großer Genauigkeit aus den SUVs abgeschätzt werden können. PET-FDG zur Vorhersage des Therapieansprechens bei kolorektalen Karzinomen A. Dimitrakopoulou-Strauss, L.G. Strauss, J. Rudi* *Innere Medizin Theresienkrankenhaus und St. Hedwig Klinik, Mannheim Ziel dieser Studie war die Einschätzung des prognostischen Wertes quantitativer dynamischer PET-Untersuchungen bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom, die eine FOLFOX (Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin) Chemotherapie erhalten. Methoden: In die Auswertung wurden 28 Patienten mit 55 Metastasen eines primären kolorektalen Karzinoms eingeschlossen. Als Referenz für die PET- Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin Untersuchungen dienten die klinischen Response-Daten gemäß der WHO-Klassifikation. Es wurden 3 Response-Gruppen definiert: Progression (progressive disease PD), keine Änderung (stable disease SD) und partielle Remission (partial response PR). Die FDG-Untersuchungen wurden als dynamische Serie über 60 Minuten durchgeführt. Die Berechnung der FDG-Kinetik erfolgte mittels Bestimmung des SUV und der fraktalen Dimension (FD) der Zeitaktivitätskurven, basierend auf dem Box Counting Verfahren (Parameter der Inhomogenität des Tumors). Ergebnisse: Der mediane SUV war in den Tumorläsionen vor FOLFOX-Therapie 3.15, im Vergleich zu 2.68 SUV nach dem ersten und 2.61 SUV nach dem zweiten Zyklus. Die Diskriminanzanalyse (DA) wurde zur Klassifikation der Daten in 3 Kategorien eingesetzt. Basierend auf beiden Parametern, SUV und FD, wurden die Metastasen in zwei Gruppen, nämlich PD und SD klassifiziert. Eine richtige Klassifikation der PR-Patienten wurde nur bei 10 % der PR-Patienten mittels FD beider Untersuchungen erreicht. Überhaupt neigt die DA dazu, Daten fälschlicherweise in Richtung PD zu klassifizieren. Sogar die erste PET-Untersuchung war voraussagend hinsichtlich Behandlungsergebnis (96 % für PD und 47 % für SD) nur unter Berücksichtigung des Baseline-SUV). Metastasen mit einem Baseline-SUV kleiner 4.6 sprachen nicht auf die FOLFOX-Therapie an. Die Kombination von SUV und FD der ersten Untersuchung führten zu einer korrekten Klassifikation von 95 % der PD und 60 % der SD. Die besten Ergebnisse erhielten wir für die FD der initialen PET-Untersuchung (90 % für PD und 75 % für SD) sowie für die FD beider Untersuchungen (77 % für PD, 73 % für SD, 10 % für PR). Schlussfolgerung: Quantitative dynamische FDG-PET sollte bevorzugt zum Therapiemonitoring bei chemotherapierten Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom eingesetzt werden. Bereits die erste PET-Untersuchung vor Beginn der Chemotherapie ist vorhersagend für das initiale Ansprechen auf die Therapie. Evaluierung der Hauptkomponentenanalyse bei dynamischen FDG-PET Untersuchungen von Kolonkarzinomrezidiven T Thireou*, LG Strauss, A Dimitrakopoulou-Strauss, G Kontaxakis**, S Pavlopoulos*, A Santos** *Technische Universität Athen, Griechenland; **Technische Universität Madrid, Spanien; Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde bei dynamischen FDG-PET-Untersuchungen von Patienten mit Rezidiven eines kolonrektalen Karzinoms evaluiert. Hauptkomponentenbilder (PCI) von 17 iterativ rekonstruierten Datensätzen wurden visuell und semiquantitativ bewertet. Die Parameter des F-18-FDG-Kompartment-Modells wurden mittels polynomialer Regression abgeschätzt. Alle Strukturen waren in PCI 1 vorhanden. PCI 2 korrelierte mit der vaskulären Komponente und PCI 3 mit der Vitalität des Tumors. Das Distributionsvolumen (VB) im Tumor konnte mit einem Korrelationskoeffizient von abgeschätzt werden. Die PCA unterstützt die visuelle Beurteilung von dynamischen F-18-FDG-PET Untersuchungen, vereinfacht die Anwendung des Kompartment-Modells und ist eine vielversprechende Quantifizierungsmethode.

329 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Iterative Bildrekonstruktion in der klinischen PET mit Hilfe von Ordered-Subsets, Median Root Prior und einem Web-basierten Interface G. Kontaxakis*, L.G. Strauss, T. Thireou**, M. Ledesma-Carbayo*, A. Santos*, S. Pavlopoulos**, A. Dimitrakopoulou-Strauss *Technische Universität Madrid, Spanien; **Technische Universität Athen, Griechenland; Ziel: Die Entwicklung, Implementierung und Validierung von einfachen, flexiblen und effizienten iterativen Bildrekonstruktionsmethoden (IIR) und ihre Aufnahme in statische oder dynamische klinische Routine-PET-Untersuchungen. Methoden: Die ordered-subsets (OS) Technik, die zur Beschleunigung des maximum likelihood expectation maximization (MLEM) IIR Algorithmus angewendet wird, wurde hier evaluiert, um die weighted least-squares (WLS), image space reconstruction algorithm (ISRA) und space alternating generalized EM (SAGE) Algorithmen mit einzuschließen. Der Median Root Prior wurde erfolgreich als Bayes sche Regulierung zur Rauschkontrolle der rekonstruierten Bilder eingesetzt. Alle Methoden wurden auf verschiedenen, vernetzten Pentium-Systemen installiert und anhand simulierten PET-Daten eines Hirn-Phantoms getestet. Ein Javascript wurde zur Einleitung der Rekonstruktion benutzt. Ergebnisse: Unter Berücksichtigung der Bildqualität und der benötigten Rekonstruktionszeit scheint der MRP-OSEM (ordered-subsets expectation maximization) nach 4 bis 8 Iterationen, 4 subsets und einem MRP-Koeffizienten zwischen 0.2 und 0.4 die besten Ergebnisse zu liefern. Eine iterative Rekonstruktion der Transmissionsaufnahmen mit OS-Beschleunigung und einer MRP-Korrektur sowie nachfolgender Kalkulation der Schwächungskorrekturfaktoren (ACFs) war effektiv für die Entfernung von Sternartefakten auf den Emissionsbildern, insbesondere für Bereiche mit einer hohen Schwächung. Schlussfolgerung: Eine leistungsfähige Implementierung basierend auf ein quasi parallel-proccessing der Daten und eines web-basierten Interface erlaubt die Rekonstruktion eines Frames (mit 63 Querschnittsschichten) innerhalb von wenigen Minuten. Diese Arbeit zeigt, dass übliche PC-Systeme eine schnelle Ausführung der iterativen Bildrekonstruktion erlauben und somit für eine Routineanwendung geeignet sind. Das Argument der langen Rekonstruktionszeiten, welches eine weitere Verbreitung der IIR in heutigen modernen PET-Systemen verhindert hat, kann somit widerlegt werden. Quantitative 18 F-FDG-PET Untersuchungen in der Differenzierung von malignen und benignen Knochenläsionen A. Dimitrakopoulou-Strauss, L.G. Strauss, T. Heichel*, H. Wu**, C. Burger***, L. Bernd*, V. Ewerbeck* *Orthopädische Universitätsklinik Heidelberg; **Nuklearmedizin, Universität Wuhan, China; ***Nuklearmedizin, Universität Zürich, Schweiz; Die Bedeutung quantitativer 18 F-FDG PET-Untersuchungen für die Differenzierung von benignen und malignen Knochenläsionen ist immer noch unklar. Methoden: Unsere Auswertung umfasste 83 Patienten mit 37 histologisch nachgewiesenen malignen und 46 benignen Läsionen. 35 der 46 benignen Läsionen waren histologisch gesichert. Die 18 F-FDG Untersuchungen wurden als dynamische Serien über 60 Minuten durchgeführt. Die Auswertung der Abteilung E060 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin 18 F-FDG-Kinetik erfolgte mit folgenden Parametern: standardized uptake value SUV, globaler Influx (Ki), Berechnung der Transportkonstanten k1 bis k4 unter Berücksichtigung des Distributionsvolumens (VB) gemäß eines 2-Kompartment-Modells, fraktale Dimension basierend auf dem Box Counting Verfahren (Parameter für die Inhomogenität des Tumors). Ergebnisse: Der mittlere SUV, das Distributionsvolumen VB, k1 und k3 waren signifikant höher in malignen Tumoren im Vergleich zu benignen Läsionen (t test; p<0.05). Obwohl der 18 F-FDG-SUV hilfreich in der Differenzierung von benignen und malignen Tumoren war, existierte eine Überlappung der Werte, welche die diagnostische Genauigkeit beeinträchtigte. Auf Basis der Diskrimanzanalyse zeigte der SUV allein nur eine Sensitivität von %, eine Spezifität von % und eine diagnostische Genauigkeit von %. Die fraktale Dimension war überlegen und zeigte eine Sensitivität von %, eine Spezifität von % und eine diagnostische Genauigkeit von %. Die Kombination von SUV, fraktaler Dimension, VB, k1-k4 und Ki erreichte die besten Resultate mit einer Sensitivität von %, einer Spezifität von % und einer Genauigkeit von %. Die Bayes-Analyse zeigt richtig-positive Ergebnisse auf einem Level von 0.8 für eine niedrige Erkrankungswahrscheinlichkeit (0.235) unter Berücksichtigung aller dynamischen Parameter in der Bewertung. Schlussfolgerung: 18 F-FDG PET besitzt eine hohe Spezifität zum Ausschluss eines malignen Knochentumors. Bewertung der kompletten FDG- Kinetik und die Anwendung der Diskriminanzanalyse sind notwendig und können zur prospektiven Klassifikation einer Knochenläsion in maligne oder benigne genutzt werden. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dimitrakopoulou-Strauss A, Strauss LG, *Heichel T, *Wu H, *Burger C, *Bernd L, *Ewerbeck V. The role of quantitative (18)F-FDG PET studies for the differentiation of malignant and benign bone lesions. J Nucl Med 2002;43: [2] *Mier W, Haberkorn U, Eisenhut M. [ 18 F]FLT; Portrait of a Proliferation Marker. Eur J Nucl Med 2002;29: [3] Haberkorn U, Altmann A, Eisenhut M. Functional genomics and proteomics - the role of nuclear medicine. 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333 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E080 Molekulare Toxikologie Abteilung Molekulare Toxikologie (E080) Leiter: Prof. Dr. Manfred Wießler Wissenschaftler Dr. Christian A. Bieler 1/03-6/04 Dr. Eva Frei Prof. Dr. Christof Granzow 4/02- Dr. Susanne Krämer (½) 1-6/03 Dr. Hans-Christian Kliem (seit 9/03: ½) Dr. Marijana Kopun-Granzow (½) 4/02- PD. Dr. Heinz H. Schmeiser Dr. Bernd Sorg 1/01-7/02 ½ Wissenschaftliche Mitarbeiter ohne Vergütung Dr. Ralph Dollner 4/02-3/04 Dr. Alexandra Rueß 4/02 - Gastwissenschaftler Dr. Marie Stiborová (Prag, Tschech. Rep.) 7-9/02, 7-9/03 Dr. Amitava Chatterjee (Kolkata, Indien) 4-5/02 Dr. Mamdouh M. Ali Hassan (Kairo, Ägypten) 4-6/03 Dr. Lucie Borek-Dohalska (Prag, Tschech. Rep.) 9-12/02 Dr. Sabin Aurel Cinca (Bukarest, Rumänien) 7-9/03 Doktoranden Tobias Baumbusch 4/02-12/03 Michael Cornelius 6/02-5/04 Nadine Eschen 7/01-12/02 Thomas Fritzsche -8/03 Regine Garcia-Boy 3/01-3/04 Claas Gronewold 10/02-10/04 Michael Heuser 4/02-7/03 Thomas Kastell 5-8/02 Evelyn Kim - 12/02 Erwin P. Mark - 10/03 Bettina Meister - 3/04 Marcel Simon 4/02-12/03 Dirk Stach - 1/04 Christoph Tacheci -1/04 Sonja Wolf - 3/04 Technische Mitarbeiter Andrea Breuer Karl Albert Klokow - 5/02 Barbara Liebetrau (½) 4/02- Peter Lorenz Eduard Müller Nicole Di Gallo 2-4/03 Hans-Herrmann Schrenk 2/03- Diplomanden Michael Wolf - 12/02 Sabrina Ehnert 10/02-2/03 Sekretärin Hélène Boittin (½) Auszubildende Nicole Di Gallo 9/99-1/03 Marina Guschl 9/02-3/06 Bettina Helfert 9/98-3/02 Anna Beil 9/03-3/07 Pratikanten Claudia Baumann 8-10/03 Heinz Fleischhacker 11-12/03 Jacobo Gómez 7-9/03 Marlis Herberth 3-7/03 Manuel Kirschmayr -3/02 Kristian Kowollik 3-8/02 Annette Krais 8-9/02 Volker Mathes 9/03-1/04 Martin Smollich 2-4/02 Die Forschungsschwerpunkte der Abteilung Molekulare Toxikologie sind Biomonitoring von Umweltgiften, die Entwicklung von Arzneistoffen und die Untersuchung von Therapieresistenz. Biomonitoring ist ein Verfahren zur Bestimmung der Exposition eines Individuums oder einer Population gegenüber Fremdstoffen. Besonders erstrebenswert ist die Ermittlung der biologisch wirksamen Dosis des Fremdstoffes oder Umweltschadstoffes, da somit individuelle oder speziesbedingte Unterschiede in der Pharmakokinetik berücksichtigt werden. Für genotoxische Substanzen kann die biologisch wirksame Dosis als Veränderung der DNA oder von Proteinen, den DNA- bzw. Proteinaddukten, bestimmt werden. Ein Schwerpunkt unserer Abteilung liegt in der Analyse von DNA-Addukten, da diese Addukte mutagen sind und eine direkte Risikobewertung durch den Vergleich mit Daten aus Tierversuchen möglich ist. Als Beispiel für ein erfolgreiches, wenngleich unerfreuliches Biomonitoring, sei hier die Chinese Herbs Nephropathy (CHN) genannt. Eine Erkrankung, die bei Patientinnen auftrat, die im Rahmen einer Schlankheitskur Produkte eingenommen hatten, welche versehentlich Aristolochiasäure enthielten. Das DNA-Adduktmuster im Nierengewebe dieser Patientinnen entsprach demjenigen, das in Tieren gefunden wurde, die nach Aristolochiasäure-Behandlung Tumoren entwickelt hatten und war selbst zehn Jahre nach Absetzen der Behandlung im Gewebe der Patientinnen noch nachweisbar. Wir haben mittlerweile Enzyme in menschlichem Gewebe identifiziert, die für die DNA-Addukt bildende Aktivierung der Aristolochiasäure verantwortlich sind. Die ³²P-postlabeling Methode, die für diese Analysen angewandt wird, ist die zur Zeit empfindlichste Methode zur Detektion von DNA-Addukten bekannten und unbekannten Ursprungs. Sie hat jedoch den Nachteil, dass mit hohen Radioaktivitätsmengen umgegangen werden muss und dass die Analysebedingungen für empfindliche Addukte zu drastisch sind. Durch Fluoreszenzmarkierung von Nukleotiden, die nach enzymatischem Verdau der DNA entstehen, konnte mittels Kapillarelektrophorese und laserinduzierter Fluoreszenzdetektion 5 -Methylcytosin von den normalen DNA-Bausteinen getrennt und quantifiziert werden. Diese Methode erlaubt auch die Analyse von DNA-Addukten, die durch Umweltschadstoffe hervorgerufen wurden. Die Entwicklung von an Saccharide oder an humanes Serumalbumin gekoppelten Arzneistoffen zur zielgerichteten Therapie (drug targeting) von Tumoren, ist der zweite Schwerpunkt unserer Abteilung. Die Substanz Glufosfamid, ein Konjugat aus Glucose und Ifosfamid Mustard, ist ein in der Abteilung entwickeltes Krebstherapeutikum, welches in klinischer Phase 2 geprüft wurde. Glufosfamid ist von der Firma Baxter (ehemals Asta Medica) an die Firma Threshhold Pharmaceuticals mit der Verpflichtung zur wissenschaftlichen Weiterentwicklung, insbesondere zur Therapie von Pankreastumoren, auslizenziert worden. Aber auch mehrere Explantate von menschlichen Kopf-Hals-Tumoren sprachen in vitro sehr gut auf Glufosfamid ein. Diese Tumoren sind mit sonstigen Chemotherapeutika nur schwer zu beeinflussen. DNA-Reparatur, speziell die durch 0 6 -Methylguanin- DNA-methyltransferase (MGMT) vermittelte, spielt eine wesentliche Rolle in der Entstehung von Resistenzen gegenüber alkylierenden Zytostatika. Konjugate neuer MGMT Inhibitoren mit Monosacchariden zeigten eine gute Aufnahme in die Zelle und hemmten, wie gewünscht, die MGMT, wenn der Abstand zwischen Monosaccharid und Effektormolekül groß genug war. Diese Arbeit wird mit Substanzen fortgesetzt, die 5 -Methylcytosin-Transferasen beeinflussen, welche durch ihre genregulatorische Funktion bei der Tumorentstehung eine Rolle spielen. Eine weitere Entwicklung betrifft die Darstel- 333

334 334 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie lung Bor-reicher Verbindungen für die Bor-Neutronen- Einfangtherapie (BNCT: Boron Neutron Capture Therapy). Hier gelang die Synthese eines Saccharid-modifizierten Moleküls mit insgesamt 40 Bor-Atomen, dessen therapeutische Wirkung Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein wird. Oligosaccharide dienen wegen ihrer komplexen Struktur als Informationsträger auf Zelloberflächen, indem sie an Proteine - sogenannte Lektine - binden, die spezifisch eine Struktur erkennen. Da die Synthese natürlicher Oligosaccharide sehr aufwendig ist, haben wir Oligosaccharid-Mimetika synthetisiert. Die Verwendung von Mimetika erlaubt es auch Bibliotheken solcher Moleküle zu generieren. Aus diesen Bibliotheken wurden Strukturen ermittelt, die spezifisch an die Zelloberfläche binden und die Adhäsion von Tumorzellen an die extrazelluläre Matrix und/oder deren Migration durch diese Matrix hemmen. Die Zellen eines Tumors haben einen hohen Bedarf an Energie und Aminosäuren, den sie auch durch die Aufnahme von Plasmaproteinen wie Albumin decken. Diese Eigenschaft wird ausgenutzt, um mit Albumin als Träger Tumortherapeutika in die entartete Zelle zu schleusen. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt durch Endozytose,und nach lysosomalem Abbau wird das toxische Therapeutikum freigesetzt. Durch Kopplung an Albumin können toxische Substanzen gezielt zum Tumor dirigiert und Resistenzen gegen die nicht gekoppelten niedermolekularen toxischen Substanzen überwunden werden. Wir konnten Proteine auf der Tumorzelle identifizieren, die Albumin binden und vielleicht seine Endozytose vermitteln. Da die systemische Toxizität der Albumin-Konjugate deutlich geringer ist als die des freien niedermolekularen Liganden, soll das Prinzip der Kopplung an Albumin auf andere Therapeutika ausgeweitet werden. Eine weitere Aktivität der Abteilung gilt der Theapieresistenz von Tumoren. Wir arbeiten dabei mit der Universitäts-HNO-Klinik und der Thoraxklinik Heidelberg zusammen. Sinn dieser Zusammenarbeit ist die klinische Nutzbarmachung von experimentell erzielten Fortschritten auf dem Gebiet der Chemosensibilitäts-Testung von Tumoren. Im Berichtszeitraum bestätigten Studien an Kopf- Hals-Tumoren die zuvor bei Lungentumoren gemachte Feststellung, dass Stromazellen der Tumoren Chemoresistenz aufweisen. Die Berücksichtigung dieser Tatsache verbessert die Vorhersagbarkeit der Wirkung von Chemotherapie entscheidend. Ein entsprechendes Testverfahren wurde an Kopf-Hals-Tumoren erfolgreich erprobt. Es soll weiter optimiert und in eine prospektive klinische Studie eingebracht werden. Eine wichtige Voraussetzung dafür ist die tierexperimentelle Validierung des Tests. Die kalifornische Biotechnologiefirma AntiCancer (Präsident: Prof. Robert Hoffmann) führt entsprechende Tierexperimente in unserem Auftrag durch. Abteilung E080 Molekulare Toxikologie Metabolische Aktivierung des carcinogenen Pflanzen-Inhaltsstoffes Aristolochiasäure im Menschen H.H. Schmeiser, M. Stiborová, C.A. Bieler, E. Frei und M. Wießler In Zusammenarbeit mit: Dr. Volker M. Arlt, Section of Molecular Carcinogenesis, Institute of Cancer Research, Sutton, UK; Dr. Joelle L. Nortier und Prof. Jean-Louis Vanherweghem, Nephrology Department, Hopital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Belgien; Prof. Jean-Pierre Cosyns, University of Louvain, Medical School, Brüssel, Belgien; Annie Leszkowicz, Ecole Nationale Agronomique de Toulouse, Auzeville Tolosane, Frankreich. Aristolochiasäure (AA), das Hauptalkaloid der Aristolochia- Arten, ist in hohen Dosen im Menschen nephrotoxisch, außerdem mutagen und carcinogen im Tierversuch [1] wurden Heilkräuter, die Pflanzen-Arten der Gattung Aristolochia enthalten, von der IARC als Krebs erregend für den Menschen eingestuft [IARC Sci Publ 82 (2002)]. Dieser Beschluß gründet sich auf das gehäufte Auftreten von Harnleiter-Krebs in einer belgischen Patientengruppe (ca. 100 Fälle) mit terminalem Nierenversagen (Chinesische Heilkräuter Nephropathie Patienten, CHN-Patienten) [Nortier et al., New England Journal of Medicine 342 (2000) ]. Alle diese CHN-Patienten haben in einer Klinik in Brüssel an einer Schlankheitskur teilgenommen, während der chinesische Heilkräuter, darunter auch Aristolochia fangchi, verabreicht wurden. Durch unsere Untersuchungen konnten wir nun die Beteiligung anderer Risikofaktoren außer der in A. fangchi enthaltenen AA an der Krebsentstehung in CHN-Patienten ausschließen [1][ [Nortier et al., New England Journal of Medicine 342 (2000) ; Lord et al., Lancet 358 (2001) ]. Diese Untersuchungen basieren auf dem Nachweis von Aristolochiasäure-spezifischen DNA- Addukten in den Nieren und Harnleitern von CHN-Patienten mit der hoch-empfindlichen ³²P-postlabeling Methode. Bisher schien das Auftreten von Tumoren in CHN-Patienten an das terminale Nierenversagen gebunden zu sein. Ein weiterer Fall aus der belgischen Patientengruppe belegt nun, dass Harnleiter-Krebs auch ohne Beeinträchtigung der Nieren auftreten kann [2]. Dies bedeutet, dass die carcinogene Wirkung von AA unabhängig von der nierenschädigenden Wirkung ist und somit alle Personen ( ca. 1500), die an der Schlankheitskur teilgenommen haben, ein erhöhtes Krebsrisiko aufweisen. In den letzten Jahren haben Berichte über das Auftreten von CHN außerhalb der belgischen Kohorte besonders im asiatischen Raum stark zugenommen. In den meisten Fällen konnte AA in den eingenommenen Kräutern nachgewiesen werden. In ländlichen Gebieten auf dem Balkan (Rumänien, Kroatien, Bosnien, Serbien und Bulgarien) kennt man seit Jahrzehnten eine Krankheit, die der CHN sehr ähnlich ist, die endemische Balkan Nephropathie (BEN). Auch BEN-Patienten erkranken häufig an Harnleiter-Krebs. Der Nachweis von Aristolochiasäure-spezifischen DNA- Addukten in den Nieren zweier von 3 untersuchten BEN- Patienten zeigt eindeutig, daß diese mit AA exponiert wurden und nährt den Verdacht, dass AA auch ursächlich mit BEN verbunden ist [3]. Chemisch ist AA ein Gemisch, welches im wesentlichen aus den Nitrophenanthrencarbonsäuren Aristolochiasäure I (AAI) und Aristolochiasäure II (AAII), die sich nur durch eine Methoxygruppe unterscheiden, besteht. Bedingt durch die Bildung prämutagener Addukte mit der DNA sind

335 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie beide Aristolochiasäuren genotoxische Mutagene. Die Addukt-Bildung erfolgt erst nach metabolischer Aktivierung von AA durch einfache Reduktion der Nitrogruppe und führt zu mehreren Produkten [1]. Das von AA in vivo hauptsächlich gebildete DNA-Addukt ist ein persistentes Desoxyadenosin-Addukt (da-aai), welches noch nach Jahren in der DNA von CHN-Patienten detektierbar ist. Sowohl mikrosomale als auch cytosolische Säuger-Enzyme, die in der Lage sind diese reduktive Aktivierung zu katalysieren, konnten bisher identifiziert werden (Prostaglandin H Synthase, Xanthin Oxidase, DT-Diaphorase, Peroxidasen, NADPH:P450 Reduktase und die Cytochrome P450 1A1 und 1A2) [1] [Stiborová et al., Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) ]. Verwendet man humane Leber-Mikrosomen als metabolisches System, so sind im wesentlichen die Cytochrome P450 1A1 und 1A2 für die Aktivierung von AAI und AAII verantwortlich. Metabolismus- Studien zur Beeinflussung der AA-spezifischen DNA- Adduktbildung durch spezifische Enzym-Inhibitoren bzw. Induktoren und Cofaktoren mit cytosolischen Fraktionen von Ratten-Lebern und Ratten-Nieren ergaben, dass vorallem die DT-Diaphorase (NAD(P)H:Chinon Oxidoreduktase) für die cytosolische Aktivierung von AA verantwortlich ist [4]. Analoge Studien mit humanem Cytosol von Leber und Niere bestätigten, daß die AA aktivierende Aktivität hauptsächlich von der DT-Diaphorase ausgeht, aber auch eine Beteiligung der Xanthin Oxidase nicht ausgeschlossen werden kann [5]. Alle cytosolischen Fraktionen, sowohl von der Ratte als auch vom Mensch waren in der Lage AA metabolisch zu aktivieren und führten zur Bildung von DNA- Addukten, deren Analyse mit dem ³²P-postlabeling Verfahren AA-spezifische Adduktmuster, wie man sie von AAexponierten Personen (CHN-Patienten) kennt, mit dem Desoxyadenosin-Addukt (da-aai) als Hauptaddukt, ergaben. Die Identifizierung humaner Enzyme, welche an der Aktivierung von AA beteiligt sind, bildet die Grundlage für weitere Studien zur Bestimmung der individuellen Empfindlichkeit des Menschen gegenüber der krebsauslösenden Wirkung von AA. Eine neue Wirkungsweise des Tumortherapeutikums Ellipticin E. Frei, M. Stiborová, C.A. Bieler, A. Breuer, L. Borek-Dohalská In Zusammenarbeit mit dem Fachbereich Biochemie der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karls Universität Prag (Leitung Prof. Dr. M. Stiborová). Ellipticin ist ein Pflanzeninhaltsstoff mit guter tumortherapeutischer Aktivität, gegen Brustkrebsmetastasen, Nierensarcome und Hirntumoren. Ellipticin ist auch aktiv gegen HIV. Die zelluläre Wirkung von Ellipticin ist sehr weit gefächert, bisher wurden Angriffspunkte an der DNA (Interkalierung und Topoisomerase II Hemmung) an regulatorischen Proteinen (p53) und an Mitochondrien (Entkopplung der Atmungskette) beobachtet (siehe [Stiborová M. et al. Biochem. Pharmacol. 62 (2001) 1675]). In einer lange währenden Kooperation zwischen der Abteilung Molekulare Toxikologie und dem Fachbereich Biochemie der Karls Universität Prag wurde ein weiterer Wirkmechanismus für Ellipticin entdeckt und weitgehend charakterisiert. Ein Zufallsbefund zeigte, dass Ellipticin sich nicht nur in die DNA einlagert, sondern dort auch kovalent bindet und mindestens zwei spezifische DNA-Addukte bildet, die durch Abteilung E080 Molekulare Toxikologie die ³²P-postlabeling Methode gefunden wurden. Wie für viele andere Fremdstoffe ist für diese DNA-Adduktbildung eine enzymatische Aktivierung nötig. Dass Ellipticin im Körper verstoffwechselt wird, war aus Untersuchungen des Urins von Menschen, die mit Ellipticin behandelt wurden, bekannt, dort tauchte 9-Hydroxy-Ellipticin als Hauptmetabolit auf (siehe Schema). Aromatische Verbindungen derartiger Struktur, werden fast immer durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP) oxidiert, damit sie wasserlöslich und ausgeschieden werden können. Die Familie der CYP kommt hauptsächlich in der Leber, aber auch in anderen Organen vor. Die Untersuchung von Lebermikrosomen-Fraktionen verschiedener Spezies auf ihre Fähigkeit hin, Ellipticin zu aktivieren und DNA-Addukte zu bilden, ergab, dass Kaninchenlebern sehr aktiv waren, gefolgt von Rattenlebern, und Lebern aus Zwergschweinen, die ähnlich denen aus Menschen waren [Stiborová M. et al. Biochem. Pharmacol. 62 (2001) 1675]. Mit verschiedenen Methoden wurde nun versucht, die für die Aktivierung von Ellipticin verantwortlichen CYP zu identifizieren. Da bekannt ist, dass z.b. Brusttumoren eine andere CYP Ausstattung haben als normales Brustgewebe, postulierten wir, dass eine tumorspezifische Aktivierung von Ellipticin erfolgen könnte. CYP lassen sich in Versuchstieren mit verschiedenen Substanzen induzieren und hemmen. Menschliche CYP sind gentechnisch in Insektenzellen exprimiert zu erwerben. Mit diesen Methoden war es möglich zu zeigen, dass in Menschen und Ratten die gleichen zwei CYP Isoenzyme für die Aktivierung von Ellipticin verantwortlich sind, CYP 3A4 bzw. 3A1 und CYP 1A1/2. In Kaninchen hingegen ist eine ganz andere CYP Spezies aktiv. Ratten bieten sich daher als ideale Modelle an, um die Wirkung von Ellipticin zu untersuchen und Rückschlüsse auf den Menschen ziehen zu können. Diese CYP Enzyme sind in Brusttumoren und Nierenzellcarcinomen erhöht, sodass damit unser Postulat einer tumorspezifischen Ellipticin Aktivierung einen Stützpfeiler erhalten hat. [6]. Ellipticin selbst induziert zudem CYP 1A1/2 in der Leber, und somit dort seinen eigenen Stoffwechsel [7]. Ratten wurden mit Ellipticin behandelt und die DNA Addukte in verschiedenen Organen untersucht. In den Organen wurden die gleichen zwei Addukte gefunden, die auch mit isolierten Leberfraktionen und zugesetzter DNA beobachtet wurden, zusätzlich aber noch drei weitere Addukte. Wie erwartet wurden in der Leber die meisten Addukte gemessen, gefolgt von der Milz, der Lunge, dem Herzen und dem Hirn. Keine Addukte wurden in den Hoden dieser Ratten gefunden [8,9]. Inzwischen ist es uns gelungen, in einem gesunden Brustgewebe und in einem Brusttumor von weiblichen Ratten die typischen Ellipticin-DNA- Addukte nachzuweisen. Als Bindeglied zwischen isolierten Leberfraktionen aus Mensch und Tier und dem Gesamtorganismus Tier werden Hamsterzellen verwendet, die durch Transfektion menschliche CYP Enzyme exprimieren. In Versuchen mit solchen Zellen hat sich gezeigt, dass auch hier die gleichen Isoenzyme für die Aktivierung zu DNA bindenden Spezies verantwortlich sind. Das Adduktmuster in den Zellen glich dem in Tieren. Die Versuche zeigten allerdings, dass die Giftigkeit von Ellipticin für diese Zellen nicht abhängig von der enzymatischen Ausstattung dieser gentechnisch transformierten Zellen war. Alle Zelllinien waren gleich empfindlich, die Hälfte der Zellen starb nach 48h in Gegenwart von 0,25-0,4mM Ellipticin [10]. Im Moment laufen Untersuchungen an menschlichen Tumorzelllinien verschiedenen 335

336 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E080 Molekulare Toxikologie 336 Ursprungs. In diesen Zellen zeichnet sich sehr wohl eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Ellipticin ab [11]. Mit der ³²P-postlabeling Methode lässt sich leider nichts über die Struktur der DNA Addukte einer bestimmten Substanz aussagen. Wenn man allerdings statt DNA nur Oligodesoxynukleotide einer Spezies z.b. poly dg/dc oder Nukleotid-3 -Phosphate einsetzt, lassen sich die Zielbasen der Adduktbildung in der DNA identifizieren. Im Falle von Ellipticin ergaben diese Untersuchungen, dass für die zwei Hauptaddukte Guanin die Zielbase ist und nur zu einem geringen Anteil Adenin. Pyrimidine sind nicht adduktiert [6]. Die Struktur des mit der DNA reagierenden Metaboliten sowie der genaue Angriffspunkt an der DNA Base sind schwieriger zu identifizieren. Die durch Leberfraktionen aus Ellipticin gebildeten Metabolite lassen sich zwar chromatografisch trennen, aber nur schwierig isolieren. Massenspektrometrisch wurden einige der fünf Metabolite identifiziert. Die bekannten Metabolite 7-Hydroxyellipticin und 9-Hydroxyellipticin wurden synthetisiert und auf ihre DNA Adduktbildung untersucht. Keiner der beiden Metabolite führte zu DNA Addukten, somit stellen diese wahrscheinlich klassische Entgiftungs- und Ausscheidungsprodukte von Ellipticin dar. Die anderen im Schema gezeigten Metabolite kommen eher als sogenannte ultimale Carcinogene in Frage, d.h. als diejenigen Metabolite, die DNA-Addukte bilden. Ihre durch CYP katalysierte Entstehung in verschiedenen Systemen korreliert z.b. mit der DNA-Adduktmenge. Mit diesen Ergebnissen ist das unten stehende Stoffwechselschema für Ellipticin postuliert worden. Die genaue Strukturaufklärung der Addukte und der Metabolite M3 und M2 steht noch aus. Weitere Tierversuche an weiblichen Ratten sollen Auskunft über die Persistenz der DNA- Addukte, d.h. ihre biologische Stabilität, in Ziel- und Nichtzielorganen einer Tumortherapie mit Ellipticin oder neuen Ellipticin-Konjugaten ergeben. HO HO Metabolische Inaktivierung N N CH 3 CH 3 7-OH-Ellipticin M4 CH 3 CH 3 9-OH-Ellipticin M1 N N CYP1A1/2 CYP1A1/2 N CYP3A4 CYP2C9 N Metabolische Aktivierung CH 3 CH 3 Ellipticin CH 2 N OH N CH 3 11-OH-Ellipticin? M2 CYP3A4 CYP2D6 CYP1A1/2 CYP3A4 CYP1A1 Polonowski Umlagerung N CH 3 N CH 2 OH 5-OH-Ellipticin? M3 N CH 3 N CH 3 Ellipticin-N(2)-Oxid M5 O Synthese neuartiger Borverbindungen für die Bor-Neutronen Einfangtherapie und Elektronenmikroskopie S. Raddatz, H.-C. Kliem, C. Granzow, M. Wießler In Zusammenarbeit mit: Dr. M. Marcello, Dr. H. Tröster, Prof. M. F. Trendelenburg (Strukturelle Genanalyse, DKFZ), Dr. T. Oeser (Institut für Organische Chemie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg) Die Bor-Neutronen Einfangtherapie (BNCT: Boron Neutron Capture Therapy) ist eine Form der Strahlentherapie, bei der Bor-reiche Verbindungen in malignes Gewebe eingebracht und mit thermischen Neutronen bestrahlt werden. In einer Kernreaktion entstehen dann aus Boratomen (Isotop 10 B) energiereiche Helium- ( 4 He) und Lithium- ( 7 Li) Atome, die lokal das sie umgebende Gewebe zerstören. Insbesondere der zerstörerische Effekt auf den Zellkern führt zum Tod der Zelle. Obwohl erste klinische Untersuchungen in den frühen 50er und 60er Jahren stattgefunden haben, fehlt es noch heute an Substanzen, die einerseits eine genügend große Dichte an Boratomen enthalten und andererseits, bei geringer allgemeiner Cytotoxizität, selektiv von Tumorzellen aufgenommen werden. Die Elektronen filternde Transmissions Elektronenmikroskopie (EFTEM) ist eine besondere Form der Elektronenmikroskopie, bei der das inelastische Streuverhalten von Elektronen an Elementatomen zur Visualisierung von markierten biologischen Proben ausgenutzt wird. Auch hier werden Bor-reiche Verbindungen als Markierungsmoleküle benötigt. Geeignete Verbindungen für BNCT als auch EFTEM müssen daher so konzipiert sein, dass sie erstens eine hohe Dichte an Boratomen aufweisen und zweitens wasserlöslich sind, um in biologischem Material eingesetzt werden zu können. Wir haben es uns daher zur Aufgabe gemacht, Grundstrukturen zu finden, die diese Anforderungen erfüllen. Wasserlöslichkeit und Selektivität der Zielstrukturen sollte dabei durch unser Targeting-Konzept der Glykosidierung erreicht werden. So konnte in einer mehrstufigen Synthese [12] zunächst das Tetracarboranylketon erhalten werden. H 10 B 10 H 10 B 10 O B 10 H 10 B 10 H 10 O1 C2 C3 C36 C4 C30 C35 C31 C34 C33 C32

337 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Röntgenstruktur des Tetracarboranylketons Dieses Keton zeichnet sich dadurch aus, dass es mit seinen 40 Boratomen einen auf die Atommasse bezogenen Gehalt von 63% Bor hat und damit eine der Bor-reichsten Verbindungen ist. Ein entscheidender Vorteil dieser Verbindung ist jedoch die Carbonylfunktion im Molekül, die weitere Modifizierungen des Grundbausteins erlaubt. So konnten in ersten Versuchen Verbindungen enthalten werden, die neben dem Grundbaustein bereits ein Saccharidmolekül (Glukose) oder ein Nukleosid enthalten. H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 B 10 H 10 O B 10 H 10 B 10 H 10 O B 10 H 10 H 10 B 10 H 10 B 10 O O P O O HNEt 3 B 10 H 10 O O O B 10 H 10 O O N NH O O O OH HOH OH OH Schließlich gelang sogar die Kopplung des Tetracarboranylketons zu einem 80 Boratome enthaltenden Cluster. H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 H 10 B 10 O O B 10 H 10 B 10 H 10 COOH COOH Diese Beispiele zeigen das große Potential des Tetracarboranylketons zur Darstellung von geeigneten Verbindungen für die Verwendung in der BNCT und bei der EFTEM. Die geringe Cytotoxizität dieser Verbindung bei ersten in vitro Tests ermutigt uns zum weitern Studium dieser Verbindungsklasse. Abteilung E080 Molekulare Toxikologie Furan-Saccharid-Mimetika M. Wießler, B. Meister, S. Wolf, E. Frei, C. Gronewold, H.-C. Kliem, C. Tacheci Neben den Protein-Protein-Interaktionen sind Protein- Saccharid-Interaktionen an den Prozessen der Zell-Zell-Erkennung und durch die Beeinflussung von Wegen der Signaltransduktion auch an Steuerungsprozessen in der Zelle beteiligt. Ein sehr gut untersuchtes Beispiel für die Beteiligung von Protein-Saccharid-Interaktionen stellt das Homing der Lymphozyten dar. An diesem Beispiel wird auch deutlich, dass diese Wechselwirkungen eher zu den schwachen Interaktionen zählen, im Vergleich zu Protein- Protein-Interaktionen. Dennoch kann die Stärke dieser Wechselwirkungen durch die Mehrfach-Präsentation von beteiligten Saccharid-Einheiten, die sogenannte Multivalenz, deutlich gesteigert werden. Darüber hinaus werden aber die Mechanismen dieser Interaktionen bisher nur wenig verstanden. Zumal aus der Immunologie Antikörper bekannt sind, die gegen Glycostrukturen auf Antigenen gerichtet sind und mit hoher Bindungsstärke an ihre Zielstrukturen binden. Für gezielte Untersuchungen zur Analyse dieser Protein- Saccharid-Interaktionen im Rahmen von Struktur-Wirkungsbeziehungen stehen bisher eine zu geringe Zahl strukturell eindeutig definierter Oligosaccharide zur Verfügung. Fortschritte bei der Festphasensynthese von Oligosacchariden lassen eine deutliche Verbesserung dieser Situation durch die Einführung kombinatorischer Ansätze erwarten. Hinsichtlich der geforderten strukturellen Diversität von Oligosacchariden ist es sinnvoll auch Saccharidmimetika in diese Überlegungen mit einzubeziehen. Diese haben den Vorteil, dass sie oft einfacher herzustellen sind und in biologischen Systemen über die größere Stabilität im Vergleich zu reinen Oligosacchariden verfügen. Zum Nachweis der Interaktionen von Oligosacchariden oder Oligosaccharid- Mimetika mit Proteinen bedarf es in den meisten Fällen der Einführung von Reportermolekülen, da diese Art der Wechselwirkungen mit anderen Methoden nur schwierig nachweisbar sind. Die Verknüpfung von synthetischen Oligosacchariden mit geeigneten Reportermolekülen z.b. Farbstoffen oder Biotin, erfordert oftmals einen zusätzlichen erheblichen präparativen Aufwand. Wir haben in den letzten Jahren einen Ansatz entwickelt, der auf der Basis von Furfurylalkoholen sowohl die Darstellung von glycosilierten Furanen als Saccharidmimetika als auch deren anschließende Funktionalisierung mit Reportermolekülen durch die Diels-Alder-Reaktion (DAR) gestattet [13]. Die benötigten Furan-Verbindungen sind auf Grund der strukturellen Verwandtschaft mit Sacchariden in vielen Fällen aus diesen oder ihren Derivate leicht zugänglich oder sind mit Hilfe einfacher synthetischen Methoden aus billigen Vorstufen erhältlich. Damit folgen wir mit diesem Ansatz auch der Forderung nach Nachhaltigkeit bei der Entwicklung neuer Therapeutika [14]. Furan und seine Derivate verhalten sich als klassische Diene in der Diels-Alder- Reaktion, die als synthetische Methode auf Grund ihrer Einfachheit in den letzten Jahren zur Herstellung komplexer Naturstoffe eine Renaissance erlebt hat. Bei Verwendung von Maleinimiden als Dienophile, die mit Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffen substituiert sind - diese sind ebenfalls in großer Zahl käuflich erwerbbar - verläuft die Reaktion mit Furanen oftmals bei Raumtemperatur und kann auch in wässrigem Milieu durchgeführt werden. Dieses Verhalten kommt uns sehr entgegen, da wir somit unsere Furan- Saccharidmimetika für die DAR bereits ohne Schutzgruppen 337

338 338 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie einsetzen können. Damit verbunden ist die Erfahrung, dass die DAR in Wasser schneller abläuft als in organischen Lösungsmitteln und sie vor allem in diesem Medium auch durch Einsatz von Mikrowellen weiter beschleunigt werden kann. Erst eigene Untersuchungen bestätigen dieses Verhalten. Mit dem von uns entwickelten Ansatz verfolgen wir mehrere Ziele. Lektine, definitionsgemäß Saccharid bindende Proteine, sind am Prozess der Zell-Zell-Interaktion beteiligt. Wir prüfen, ob die von uns dargestellten Furan-Saccharid-Mimetika an diese Lektine binden können und damit in diesen Prozess eingreifen können. Dabei gestattet die Funktionalisierung mit z.b. Biotin den einfachen Nachweis dieser Bindung und damit auch den Nachweis der Lektine oder Saccharid bindenden Proteine. Aufbauend auf diese Untersuchungen können die Furan-Saccharid- Mimetika als Therapeutika entwickelt werden, wobei wir vor allem an einer Inhibition der Metastasierung durch diese Substanzen arbeiten. Die DAR der Furan-Saccharid-Mimetika kann aber auch noch in anderer Weise genutzt werden. Viele Proteine treten unter physiologischen Bedingungen als Glycoproteine auf. Die biologische Funktion dieser Glycosilierung ist in vielen Fällen noch nicht geklärt, doch scheint die Lebensdauer der Proteine dadurch bestimmt zu werden. Mit Hilfe der DAR lassen sich Proteine nun nach Einführung eines Dienophils, z.b. Maleinimid, in definierter Weise mit unseren Furan-Saccharid-Mimetika modifizieren, so dass Struktur-Wirkungsbeziehungen ermittelt werden können. Auch zur Entwicklung von Glyco-Chips, die mit diesen Furan- Saccharid-Mimetika beladen sind, lässt sich diese Technologie einsetzen. Die Bedeutung chemoresistenter Stromazellen für die Vorhersage der Wirkung von Chemotherapie bei menschlichen Tumoren C. Granzow, M. Kopun-Granzow, M. Heuser, M. Simon In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Andreas Dietz, Dr. Ralph Dollner und Dr. A. Rueß, Universitäts-HNO-Klinik Heidelberg; Prof. Dr. Heinrich D. Becker und PD Dr. Felix Herth, Thoraxklinik Heidelberg; Dr. Mamdouh Moawad Ali Hassan, Biochemistry Dept., Div. of Genetic Engineering and Biotechnology, National Research Centre, Kairo, Ägypten; Prof. Dr. Herwig Ponstingl, DKFZ. Menschliche Tumoren beinhalten mehrere proliferierende Zelltypen (Mikroheterogenität). Neben für die jeweilige Tumorart spezifischen, malignen Zellverbänden findet man im Tumorgewebe variierende Anteile von sogenannten Stromazellen. Es handelt sich dabei um nichtmaligne Zellen, vor allem Fibroblasten, Endothelzellen und sonstige Elemente des Gefäßbindegewebes, das die Tumoren stützt und ernährt. Der herrschenden Lehrmeinung zufolge kommt Chemoresistenz nur bei den malignen Tumorzellen vor, während Stromazellen prinzipiell als empfindlich für Zytostatika gelten. Unsere gemeinsam mit der Thoraxklinik unter Einsatz eines innovativen Verfahrens durchgeführten in vitro-untersuchungen an Explantaten von Lungentumoren hatten schon früher gezeigt, dass Fibroblasten und Endothelzellen des Tumorstromas in Wirklichkeit häufig exzessive Resistenz gegenüber einzelnen, meist jedoch mehreren Zytostatika (sog. Multidrogenresistenz) aufweisen. Das Resistenzverhalten von Tumor- und Stromazellen ist zudem häufig diskordant: chemoresistente Tumorzellen können sowohl mit sensiblen als auch mit chemoresistenten Stromazellen koexistieren. Dasselbe gilt für chemosensible Tumorzellen, ohne dass hierfür bisher Regeln erkennbar Abteilung E080 Molekulare Toxikologie sind. Gleichartige Feststellungen haben wir im Berichtszeitraum bei menschlichen Kopf-Hals-Tumoren gemacht [15]. Zusammen mit Einzelbeobachtungen an weiteren Tumorentitäten berechtigt uns dies zu der Annahme, ein generell gültiges Prinzip identifiziert zu haben. Die diesbezügliche Lehrmeinung ist entsprechend zu revidieren. Die genannten Fakten sind von ganz entscheidender Bedeutung für die Vorhersagbarkeit der Wirkung von Chemotherapie beim Patienten durch in vitro-tests an explantiertem Tumorgewebe. Natürlich vereitelt die Anwesenheit mehrerer, unabhängig voneinander zur Resistenzbildung befähigter Zelltypen im Explantat zwangsläufig eine klinisch verwertbare, prätherapeutische Identifizierung von Sensibilität oder Resistenz der malignen Tumorzellen gegenüber Chemotherapie, solange das Verhalten der einzelnen in Frage kommenden Zelltypen nicht separat ermittelt wird. Unsere Beobachtungen könnten helfen zu erklären, warum die zahlreichen konventionell, d.h. ohne eine solche Differenzierung durchgeführten Testverfahren in der Klinik ausnahmslos versagt haben. Gemeinsam mit unseren klinischen Partnern konnten wir praxiskonforme Verfahren zur Chemosensibilitätstestung etablieren, die zwischen den beteiligten Zelltypen differenzieren [15]. Solche Tests erlauben spezifische Feststellungen zur Sensibilität oder Resistenz der für den Erfolg von Chemotherapie maßgeblichen, malignen Zellen. Sie werden zur künftigen Therapieplanung beitragen [16]. In einem anderen Projekt wird die Modulierbarkeit der Chemoresistenz von Tumorzellen bearbeitet. Unter Anwendung des Sensitizers Verapamil und des photoreaktiven Zytostatikums Napavin konnte die durch P-Glykoprotein vermittelte Multidrogenresistenz in vitro rasch und vollständig behoben werden [17]. Die zu erwartende Übertragbarkeit des Verfahrens auf weitere resistenzvermittelnde Transportproteine, z. B. MRP1, ist Gegenstand laufender Untersuchungen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Arlt, V.M., Stiborová, M., Schmeiser, H.H.: Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis 17 (2002) [2] *NortierJ.L., Schmeiser H.H., *Muniz M.-C., Arlt V.M., *Vervaet C., *Garbar C.H., *Daelemans P., *Vanherweghem J.- L.*: Invasive urothelial carcinoma after exposure to Chinese herbal medicine containing aristolochic acid may occur without severe renal failure. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2003) [3] *Arlt V.M., *Ferluga D., Stiborová M., *Pfohl-Leszkowicz A., *Vukelic M., *Ceovic S., Schmeiser H.H., *Cosyns J.-P. : Is aristolochic acid a risk factor for Balkan endemic nephropathyassociated urothelial cancer? International Journal Cancer 101 (2002) [4] Stiborová M, Frei E., *Sopko B., Wiessler M., Schmeiser H.H.: Carcinogenic aristolochic acids upon activation by DT-diaphorase form adducts found in DNA of patients with Chinese herbs nephropathy. Carcinogenesis 23 (2002) [5] Stiborová M., Frei E., *Sopko B., *Sopková K., *Marková V., *Lanková M., *Kumstýrová T., Wiessler M., Schmeiser H.H.: Human cytosolic enzymes involved in the metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid: evidence for reductive activation by human DT-diaphorase. Carcinogenesis 24 (2003) [6] Stiborová M., *Stiborová-Rupertová M., *Borek-Dohalska L., Wiessler M., Frei E.: Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (2003)

339 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E080 Molekulare Toxikologie [7] *Aimová D., *Dlouhá, Frei E., Stiborová M.: Anticancer drug ellipticine acts as an inducer of CYP1A1/2 and potentiates its own pharmacological efficiency. In: Cytochromes P450, Biochemistry, Biophysics and Drug Metabolism, P. Anzenbacher, J. Hudecek eds. Manduzzi Editore, Bologna, (2003) [8] Stiborová M., Breuer A., *Aimová D., *Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine in rats determined by ³²P postlabeling. Int. J. Cancer 107 (2003) [9] Stiborová M., Frei E.: Utilization of cytochromes P450 to explain a new mode of action of anticancer drug ellipticine. In: Cytochromes P450, Biochemistry, Biophysics and Drug Metabolism, P. Anzenbacher, J. Hudecek eds. Manduzzi Editore, Bologna, (2003) [10] Frei E., Bieler C. A., *Arlt V. M., Wiessler M., Stiborová M.: Covalent binding of the anticancer drug ellipticine to DNA in V79 cells transfected with human cytochrome P450 enzymes. Biochem. Pharmacol. 64 (2002) [11] Borek-Dohalska L., Frei E., Stiborová M.: DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine and its hydroxy derivatives in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. Collect. Czech. Chem. Commun. 69 (2004) [12] Raddatz S., Marcello M., Kliem H.-C., Tröster H., Trendelenburg M. F., Oeser T., Granzow C., Wiessler M.: Synthesis of new boron-rich building blocks for boron neutron capture therapy or energy-filtering transmission electron microscopy. ChemBioChem 5 (2004) [13] Wiessler M., Sauerbrei B., Kliem H.-C., Schmauser B.: Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Saccharidkonjugaten durch Diels-Alder-Reaktion und ihre Verwendung als Therapeutika oder Diagnostika. Patent Deutschland Nr [14] Wiessler M.: Biologische Abbaubarkeit als Kriterium bei der Wirkstoffentwicklung. In: Spurenstoffe in Gewässern, T. Track, G. Kreysa, Wiley-VCH (2003) [15] Dollner R., Granzow C., *Helmke B., Ruess A., *Schad A., *Dietz A.: The impact of stromal cell contamination on chemosensitivity testing of head and neck carcinoma. Anticancer Research 24 (2004) [16] Dollner R., Granzow C, *Werner J. A., *Dietz A.: Is there a role for chemosensitivity tests in head and neck cancer? Onkologie 27 (2004) [17] Granzow C., Kopun-Granzow M., Ponstingl H., Gros G., Hefft I., Stöhr M.: Pharmazeutische Zusammensetzung zur Aufhebung der membranvermittelten Resistenz von Zellen, US-Patent 6,376,224 ( ), Europäisches Patent ( ) 339

340 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Abteilung E090 Zelluläre und Molekulare Pathologie Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (E090) Leiter: Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne 340 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Eva Kiss Dr. sc. hum. Yanhua Li Dr. rer. nat. Roger Sandhoff Dr. rer. nat. Qiang Sun Richard Jennemann Doktoranden Claudio Diema Yanhong Li Zhen Li Tamara Licina Shijun Wang Gastwissenschaftler Prof. Dr. rer. nat. Herbert. Wiegandt, Universität Marburg, (1/ 02-12/03) Technisches Personal Mahnaz Bonrouhi Sylvia Kaden Iris Moll Ursula Naab Ulrike Rothermel Elisabeth Röbel Claudia Schmidt Gabriele Schmidt Benita von Tümpling-Radosta Martina Volz Sekretariat Jennifer Rauschenbach Christine Zesch Tumorbank Dr. med. dent. Elisabeth F. Gröne Technisches Personal Mariana Enulescu Florian Flatow (Zivildienstleistender) Histopathologische Spezialdiagnostik Prof. Dr. med. H.-J. Gröne Die Abteilung soll als Bindeglied zwischen Grundlagen-orientierter Forschung im DKFZ und anwendungsbezogener Forschung in der klinischen Diagnostik und Therapie fungieren. Die Abteilung versucht dieser Aufgabe Rechnung zu tragen, indem sie 1. kliniknahe Fragestellungen unter Einbeziehung von Grundlagen-Erkenntnissen und in enger Kooperation mit theoretisch-ausgerichteten Wissenschaftlern des DKFZ bearbeitet, 2. in der histopathologischen Analyse von Tierexperimenten, insbesondere transgenen Tieren mit Arbeitsgruppen des DFKZ kooperiert, 3. selbst eine spezielle humane histopathologische Diagnostik durchführt und 4. humanes Material Abteilungen des DKFZ zur genomischen und proteomischen Aufarbeitung zur Verfügung stellt (Tumorbank). Die wissenschaftlichen Schwerpunkten der Abteilungsind: 1. Die Aufklärung der Mechanismen der Abstoßung von Tumorgewebe und allogen- bzw. xenogen-transplantierten Organen. Hierbei wird die Rejektion allogentransplantierter Organe als Modellsystem für die Rejektion eines malignen Tumors angesehen. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen steht die Analyse der Interaktion von Monozyten/ Makrophagen mit Endothelzellen und Tumorzellen. 2. Die Einführung molekularbiologischer Methoden in die histopathologische Diagnostik am Beispiel des Gene Expression Profiling für Prostatakarzinome und Nierenerkrankungen. Rolle immunkompetenter Zellen insbesondere von Monozyten/Makrophagen bei der Rejektion von Gewebe Ein Ziel unserer Arbeiten ist die Aufklärung von zellulären und molekularen Mechanismen, die zur Abstoßung von Geweben führen. Experimentelle allogene Transplantationen solider Organe werden hierbei als relevante Modellsysteme angesehen, da der Beginn einer Rejektion,die Qualität und die Schwere des Abstoßungsvorgangs bei experimentellen allogenen Transplantationen genau definiert werden können. Im Vordergrund unseres Interesses steht hierbei die Interaktion von Monozyten mit Endothelzellen. Monozyten sind immunkompetente Zellen, die zur Synthese zahlreicher Substanzen befähigt sind, die bei der Abstoßung eines Gewebes unerläßlich sind. Monozyten werden deshalb von uns als die wesentlichen Effektorzellen einer Rejektion angesehen. Endothelzellen sind in soliden transplantierten Organen die primär vom Rejektionsprozess betroffenen Zielzellen. Sie sind als erste Zellen des abgestoßenen Organs einer humoralen und zellulären Abstoßungsantwort ausgesetzt. Wir erhoffen uns von der Analyse der Interaktion von Monozyten und Endothel in allogen-transplantierten Organen Erkenntnisse, die zu diagnostischen und therapeutischen Anwendungen führen könnten. Chemokine als wesentliche Modulatoren der Frühphase einer allogenen Rejektion H.-J. Gröne, E. Kiss, E.F. Gröne In Kooperation mit: Peter Nelson Ph.D., Medizinische Poliklinik, Arbeitsgruppe Klinische Biochemie der LMU München und Amanda Proudfoot, Ph.D, Serono Genf, Schweiz Die Transplantation allogener solider Organe in der Ratte ist ein geeignetes System um die Mechanismen, die für die Generation und die Aufrechterhaltung einer Rejektion oder Toleranz gegenüber einem immunologischen Prozess notwendig sind, zu erarbeiten. Eine Toleranzinduktion bei allogener Organtransplantation oder eine Rejektionsinduktion bei malignem Tumorwachstum wären von großem klinischen Nutzen. Die bekannten Unterschiede der MHC-Loci von Spender und Empfänger ermöglichen es, die Schwere der Allograft-Rejektion festzulegen; der Beginn und der Verlauf der Transplantat-Rejektion wie auch ihre morphologischen Phänomene sind gut definiert. Tierexperimente und klinische Daten weisen darauf hin, daß eine kurzfristige, frühe Inhibition der vaskulären Alloreaktivität wesentlich zur langfristigen Allograftakzeptanz beitragen könnte. Durch die Inhibition der Arretierung von T-Zellen und Monozyten an das Endothel mit Hilfe der Blockade von Chemokinrezeptoren konnten Chemokine von unserer Arbeitsgruppe als wichtige pathogenetische Faktoren bei der Transplantatrejektion erkannt werden. Chemokine sind chemotaktische Peptide mit einem Molekulargewicht zwischen 6 und 15 kda, die wie ihre zugehörigen Rezeptoren von zahlreichen Zellen, unter anderem von Endothelzellen, Leukozyten und Fibroblasten synthetisiert werden. Das ß-Chemokin-RANTES ist ein potentes Chemokin für die Chemotaxie von Monozyten, dendritischen Zellen und T-Zellen. Aufgrund des Nachweises einer Expression des ß-Chemokin-RANTES in tubulären Epithelien abstoßender Nierentransplantate und in atherosklerotischen Plaques von Coronararterien transplantierter Herzen wurde die Rolle des

341 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Chemokin: RANTES bei der akuten Abstoßung allogener Transplantate funktionell untersucht. Die intravenöse Gabe des antagonistischen Chemokin-Analogs Met-RANTES und des nicht peptidergen Chemokin-Rezeptor CCR1 Antagonisten BX 471 bewirkte eine Reduktion der akuten Entzündung und eine Abnahme der Abstoßung in Nieren-, Herz- und Dünndarmtransplantaten. Wir konnten zudem zeigen, daß Met-RANTES die Wirkung einer niedrig-dosierten Cyclosporin A Immunsuppression wirkungsvoll verstärkte. In vitro Untersuchungen zum möglichen Mechanismus dieser Met-RANTES Wirkung ergaben, daß unter physiologischen Flußbedingungen die Arretierung von Monozyten an aktiviertes mikrovaskuläres Endothel durch eine Blockade RANTES-zugehöriger Chemokinrezeptoren unterdrückt wurde. Diese Untersuchungen demonstrierten die funktionelle Bedeutung von Chemokinen für die Rejektion eines allogenen transplantierten Organs. Diese Experimente unterstützen insgesamt die Annahme, daß Chemokine die Interaktion von Endothel und immunkompetenten Zellen in einer Alloreaktivitätsreaktion wesentlich beeinflussen. Weitere Analysen zur Rolle von Chemokinen bei der Entwicklung der chronischen Transplantatdysfunktion werden durchgeführt. Analyse der Rolle von Sauerstoff-reaktiven Spezies bei der Gewebsrejektion K. Sun, Y. Li, H.-J. Gröne In Kooperation mit: Dr. med. Tomislav Stojanovic, Chirurgische Klinik der Universität Göttingen, Prof. Dr. rer. nat. Ernst Malle, Klinische Biochemie der Universität Graz, Prof. Dr. med. Ton Rabelink, Medizinische Klinik, Universität Utrecht Ein wichtiger Modulator der endothelialen Funktion ist das Radikal NO. Das durch die endotheliale NO-Synthase konstitutiv synthetisierte NO besitzt mehrere Endothel-zytoprotektive Eigenschaften (Hemmung der Thrombozytenadhäsion/aggregation, Verminderung der Endothelpermeabilität, Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen und Vasodilatation). In einem allogenen Rattennieren- Transplantationsmodell konnten wir belegen, daß die Inhibition der konstitutiven endothelialen NO-Synthese zu einer deutlichen Verschlechterung der Transplantatfunktion und zu einer ausgeprägten vaskulären Abstoßung des Organs führt. Es gelang somit einen nicht-immunologischen Einfluß auf die Alloreaktivität des Nierentransplantates zu nehmen. Dieser tierexperimentelle Befund könnte durchaus klinische Bedeutung besitzen, da Inhibitoren der NO- Synthase (L-ADMA, L-NMMA) beim akuten Nierenversagen, das direkt nach Transplantation bei einem nicht geringen Prozentsatz allogen Transplantierter vorliegt, akkumulieren können und über eine Inhibition der endothelialen NO- Synthase frühe Rejektionsphänomene verstärken könnten. In Erweiterung dieser Untersuchungen konnten wir durch die selektive Hemmung der induzierbaren NO-Synthase, die bei Rejektion überwiegend von immunkompetenten Zellen (z.b. Monozyten/Makrophagen) exprimiert wird und wegen hoher generierter NO- und O 2- -Mengen zytotoxische Effekte auslöst, eine Reduktion interstitieller Rejektionsphänomene erreichen. Die Generation von O 2 - durch NO- Synthasen kann durch Cofaktoren der NO-Synthese z.b. Tetrahydrobiopterin und durch Supplementierung von Arginin signifikant reduziert werden; hiermit wird ein benefizieller Einfluß auf Rejektionsprozesse in allogenen Transplantaten erreicht. In weiteren Versuchen zur Bedeutung von reaktiven Sauerstoffspezies konnten wir durch Abteilung E090 Zelluläre und Molekulare Pathologie eine Inhibition der Xanthinoxidoreduktase eine Hemmung allogener Rejektionsprozesse erreichen. Rolle sulfatierter Glycosphingolipide bei immunologischen Prozessen R. Sandhoff, R. Jennemann, H. Wiegandt, H.-J. Gröne Sulfatide sind Sulfo-Glycosphingolipide (S-GSL). Sulfatide werden in den Tumor infiltrierenden mononukleären Zellen exprimiert. Weitere Befunde weisen auf adhäsive Eigenschaften von Sulfatiden bei Endothel-Monozyt-Interaktionen hin. Eine spezifische Bindung von sulfatierten Glykolipiden mit Chemokinen wurde von uns erstmals beschrieben und führte zu einer wesentlichen Modulation der Chemokin-Wirkungen. RNA-Expressionsprofile bei Prostata-Karzinom und Nierenerkrankungen Das Prostatakarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung des Mannes. Die histopathologische Diagnostik ist die entscheidene diagnostische Maßnahme beim Prostatakarzinom und bestimmt wesentlich die Therapie. Die Supplementierung der Histolopathologie durch weitere objektive diagnostische Parameter ist ein wünschenswertes Ziel. Unsere Abteilung hat durch Genexpressionsprofile getrennt für Epithelien und Stromazellen in nicht malignen und malignen Prostata-Anteilen eine klare Trennung zwischen benignen und malignen prostatischen Veränderungen erreichen können. Es ist wahrscheinlich, daß durch diese und folgende Untersuchungen die histopathologische Diagnostik des Prostatakarzinoms wesentlich optimiert werden kann. In analogen Versuchen bei entzündlichen Nierenerkrankungen konnten wir belegen, daß Genexpression Fingerprints exakt mit der exkretorischen Nierenfunktion ätiologisch unterschiedlicher Nierenerkrankungen korreliert werden können und zur Prognoseabschätzung von immunologisch bedingten Nierenerkrankungen unabhängig von der Therapie geeignet sind. Diese Untersuchungen müssen durch weitere kontrollierte Studien validiert und ergänzt werden. Histopathologische Spezialdiagnostik H.-J. Gröne Es wurde eine Arbeitsgruppe für histopathologische Spezialdiagnostik eingerichtet, die in ausgewählten Gebieten der Pathologie eine wissenschaftlich orientierte Diagnostik durchführt. Es wird so erreicht, dass (1) die in der Abteilung tätigen Pathologen die für die Beratung anderer Abteilungen des DKFZ und für ihre eigene wissenschaftliche Arbeit notwendige humanpathologische Expertise behalten, (2) humanes Material verschiedenen Abteilungen des DKFZ zur Verfügung gestellt werden kann (3) die Abteilung selbst, das humane Material in korrelativen Untersuchungen zu experimentellen Befunden einsetzen kann und (4) das DKFZ seit Gründung der Abteilung, eine von der Deutschen Ärztekammer anerkannte Ausbildungsstätte für Pathologie ist. Histopathologische Analyse transgener Tiere H.-J. Gröne, E. Kiss Die Abteilung hat eine Arbeitsgruppe gebildet, die sich speziell mit der konsultativen histopathologischen Diagnostik transgener Tiere beschäftigt. Die umfassende morphologische Analyse transgener und knock-out Tiere ist für die 341

342 342 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Interpretation der Bedeutung eines überexprimierten oder nicht-exprimierten Gens entscheidend. In der morphologischen Analyse werden neben einer konventionell-morphologischen Aufarbeitung moderne Verfahren der Pathomorphologie eingesetzt: Immunhistologie, In Situ Hybridisierung, ultrastrukturelle Untersuchung am Transmissionselektronenmikroskop und am Rasterelektronenmikroskop. Tumorbank E. Gröne, M. Enulescu, F. Flatow In Kooperation mit: Klinikum Göppingen, Institut für Pathologie (Frau Prof. Dr. Sorger/PD Dr. Bürkle); Universitätskliniken Heidelberg: Urologische Klinik (Prof. Dr. Stähler/Prof. Dr. Hohenfellner); Klinik Salem: Abteilung für Urologie (PD Dr. Ikinger); Krankenhaus Mannheim: Abteilung für Urologie (PD. Dr. Tschada) Die Tumorbank der Abteilung ist eine Serviceeinrichtung für das DKFZ um primäre immortalisierte Zellkulturen und seit Anfang 1999 nicht fixiertes, gefrorenes, nicht tumoröses und tumoröses humanes Material zur Verfügung zu stellen. Die Arbeitsgruppe bemüht sich, durch engen Kontakt mit den koopierierenden Kliniken Gewebe fachgerecht diagnostiziert zu sammeln und zu katalogisieren, um der Abteilung selbst und anderen Abteilungen des DKFZ genomische und proteomische Untersuchungen an diesem Material zu ermöglichen. Die Tumorbank wird in Zukunft in die Tumorbank des Comprehensive Cancer Center integriert. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Anders H.J., *Vielhauer V., *Frink M., *Linde Y., *Cohen C.D., *Blattner S.M., *Kretzler M., *Strutz F., *Mack M., Gröne H.-J., *Onuffer J., *Horuk R., *Nelson P.J., *Schlöndorff D.: A chemokine receptor-1-specific non-peptide antagonist reduces progressive fibrosis of the kidney. J. Clin. 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Kidney Dis. 39: E11, [6] *Cohen C.D., Gröne H.-J., Gröne E.F., *Nelson P.J., *Schlöndorff D., *Kretzler M.: Laser microdissection and gene expression analysis on formaldehyde-fixed archival tissue: IP-10 and RANTES in renal allograft rejection. Kidney Int. 61: , [7] *Eitner F., *Ostendorf T, Van Roeyen C., *Kitahara M., *Li X., *Aase K., Gröne H.-J., *Eriksson U., *Floege J.: Expression of a novel PDGF isoform, PDGF-C, in normal and diseased rat kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 13: , [8] Ernst T., Hergenhahn M., Kenzelmann M., *Cohen C.D., Bonrouhi M., Weninger A., Klaren R., Gröne E.F., *Wiesel M., *Guedemann C., *Küster J., *Schott W., *Staehler G., *Kretzler M., Hollstein M., Gröne H.-J.: Decrease and gain of gene expression are equally discriminatory markers for prostate carcinoma: a gene expression analysis on total and microdissected prostate tissue. Am. J. 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Invest. 82: 5-14, [13] Gröne H.-J., *Cohen C.D., Schmidt C., *Kretzler M., Gröne E.F., *Schlöndorff D., *Nelson P.: Spatial and Temporally Restricted Expression of Chemokines and Chemokine Receptors in the Developing Human Kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 13: , 2002 [14] *Gunzer F., *Hennig-Pauka I., *Waldmann K.H., Sandhoff R., Gröne H.-J., *Kreipe, H.H., *Matussek A., *Mengel M.: Gnotobiotic piglets develop thrombotic microangiopathy after oral infection with enterohemorrhagic Escherichia coli Am. J. Clin. Pathol. 118: , 2002 [15] *Henning B.F, Gröne H.-J., *Tepel M., *Buchner N., *Kirchner J., *Zidek W.: A rare cause of pulmonary-renal syndrome Nephron 91: , 2002 [16] *Hepbildikler S.T., Sandhoff R., *Koelzer M., *Proia R.L., *Sandhoff K.: Physiological substrates for human lyosomal (beta)-hexosaminidase S. J. Biol. Chem. 277: , [17] *Huisman A., *Vos I., *van Faassen E.E., *Joles J.A., Gröne H.-J., *Martasek P., *van Zonneveld A.J., *Vanin A.F., *Rabelink T.J. Anti-inflammatory effects of tetrahydrobiopterin on early rejection in renal allografts: modulation of inducible nitric oxide synthase. FASEB J. 16: , 2002 [18] *Joles J.A., Gröne H.-J., *Rabelink T.J.: Inducible NOS in renal transplantation. Kidney Int. 61: , [19] *Mizukami H., *Mi Y., *Wada R., *Kono M., *Yamashita T., Liu Y, *Werth N. Sandhoff R., *Sandhoff K., *Proia R.L. Systemic inflammation in glucocerebrosidase-deficient mice with minimal glucosylceramide storage. J. Clin Invest 109: , 2002 [20] Sandhoff R., *Hepbildikler S.T., Jennemann R., *Geyer R., *Gieselmann V., *Proia R.L., Wiegandt H., Gröne H.-J.: Kidney sulfatides in mouse models of inherited glycosphingolipid disorders: determination by nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. 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Res. 39: 51-58, [24] *Wichmann D., Gröne H.-J., *Frese M., *Pavlovic J., *Anheier B., *Haller O., *Klenk H.D., *Feldmann H.: Hantaan virus infection causes an acute neurological disease that is fatal in adult laboratory mice. J. Virol. 76: , 2002.

343 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [25] Abdollahi A., Lipson K.E., Sckell A., Zieher H., Klenke F., Poerschke D., Roth A., Han X., Krix M., Bischof M., Hahnfeldt P., Gröne H.-J., Debus J., Hlatky L., Huber P.E.; Combined therapy with direct and indirect angiogenesis inhibition results in enhanced anti-angiogenic and anti-tumor effects Cancer Research 15: , 2003 [26] *Anders H.J., *Banas B., *Linde Y., *Weller L., *Cohen C.D. *Kretzler M., *Martin S., *Vielhauer V., *Schlöndorff D., Gröne H.-J.: Bacterial CpG-DNA aggravates Immune Complex Glomerulonephritis. Role of TLR9-mediated Expression of Chemokines and Chemokine Receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 14: , 2003 [27] *Anders H.J., *Frink M, *Linde Y., *Banas B., *Wörnle M., *Cohen C.D., *Vielhauer V., *Nelson P.J., Gröne H.-J., *Schlöndorff D.: CC Chemokine Ligand 5/RANTES Chemokine Antagonists aggravate Glomerulonephritis despite reduction of Glomerular Leukocyte Infiltration. J. 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344 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie E100 Toxikologie und Chemotherapie 344 Toxikologie und Chemotherapie (E100) Leiter: Prof. Dr. med. Martin Berger Gastwissenschaftler Dr. Spiro M. Konstantinov (5-8/02, 12/03; Sofia, Bulgarien) Dr. Milka Georgieva (5-7/02, 12/02-2/03, 10-12/03, Sofia, Bulgarien) Prof. Dr. Iana Tsoneva (10-12/02, 5-7/03, Sofia, Bulgarien) Doktoranden Cristina Voß Hassan Adwan Maike Leible (- 10/02) Jan Sänger (- 10/02) Tobias Bäuerle (- 12/03) Magdalena Kraus (- 12/03) Michael Rodenbach (1/03 -) Ergyl Eyol (1/03 -) Jenny Mohr (5/03 -) Diplomanden Nils Burger (6/03 -) Technisches Personal Birgit Kaiser (½) Gerd Braun Therapeutische Fortschritte in der Onkologie sind eng an den verbesserten Nachweis geringer Mengen von Tumorzellen und an die Entwicklung und toxikologische Beurteilung von Substanzen gekoppelt, die Krebswachstum hemmen. Der Nachweis von wenigen Tumorzellen ist durch molekularbiologische Techniken prinzipiell möglich geworden, muss für jede Tumorart in der Praxis aber erst etabliert werden. Diese Arbeit ist sinnvoll, weil geringe Mengen an Tumorzellen therapeutisch leichter positiv beeinflussbar sind. In diesem Zusammenhang ist die Detektion von Tumorzellen zu sehen, die mit Hilfe von Mutationen des K-ras Gens oder mittels epithelialer Marker (Cytokeratin 20, Guanylylcyclase C) nachgewiesen wurden. Neue, mehr selektiv antineoplastisch wirksame Verbindungen beeinflussen häufig die Signaltransduktion der Zelle. Alkylphosphocholine, eine neue Gruppe membranwirksamer Verbindungen, hemmen das Krebswachstum konzentrationsabhängig (sowohl zytotoxisch als auch Apoptose- auslösend und differenzierend). Die Identifizierung der molekularen Wirkungen ist ein weiteres mittelfristiges Forschungsziel. Die Wirkung auf Metastasen im Skelett und in der Leber wird an spezifischen Modellen untersucht, die pathophysiologisch den klinischen Vorbildern möglichst nahe kommen. Nachweis von disseminierten Kolonkarzinomzellen (E100-01) M.R. Berger, C. Dieterle, M. Conzelmann, M. Kraus In Zusammenarbeit mit Dr. U. Linnemann, Städtisches Klinikum Nord, Nürnberg Kolonkarzinome weisen in der Hälfte aller Fälle Mutationen des K-ras Gens auf. Der sensitive Nachweis dieser Mutation mittels PCR-RFLP sowie der Nachweis epithelialer Marker (CK20, GCC) mittels RT-PCR wurde verwendet, um geringe Mengen K-ras mutierter Kolonkarzinomzellen bzw. epithelialer Zellen in verschiedenen Geweben (Leber, Lymphknoten, Knochenmark) von Patienten nachzuweisen, die wegen eines Kolonkarzinoms operiert wurden. Die Sensitivität des Nachweises aller drei Marker (K-ras, CK20, GCC) ist gegenüber der Histologie deutlich verbessert. Das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen in potentiellen Zielgeweben einer Metastasierung erlaubt eine genauere Klassifizierung der Patienten [1-2]. Alkylphosphocholine (E100-02) M.R. Berger, S.M. Konstantinov, M. Georgieva, I. Tsoneva In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Eibl, Max Planck Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen; Prof. Dr. C. Unger, Klinik für Tumorbiologie, Freiburg Alkylphosphocholine sind Verbindungen, die sich -wegen ihrer hohen Ähnlichkeit mit natürlichen Membranbestandteilen- in Zellmembranen anreichern und dort Wirkungen auslösen, die als antineoplastisch, antiviral und antileishmanial charakterisiert werden können. Der Mechanismus der antineoplastischen Wirkung beruht -zumindest teilweise- auf der Auslösung von Apoptose in den exponierten Krebszellen. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen haben gezeigt, daß Alkylphosphocholine mit einer Kettenlänge von 22 Kohlenstoff-Atomen sowie einer Doppelbindung in der Alkoholkette intravenös applizierbar werden und deshalb als eigene Untergruppe gewertet werden können. Insgesamt ist diese Gruppe von antineoplastischen Verbindungen arm an schädlichen Nebenwirkungen und weist Eigenwirkungen auf, wie die Stimulation von hämatopoetischen Zellen, die diese Gruppe als Bestandteil einer Kombinationschemotherapie besonders geeignet erscheinen lassen, z.b. mit spezifischen Antisense Oligonukleotiden (Abb. 1) [3-5,7]. 120 CFU - K562 combination therapy % Control observed values expected values 20 Abb. 1: Eine synergistische Wirkung (beobachtete Effekte) resultiert aus der Kombination des Alkylphosphocholins ErPC3 mit einem Antisense Oligonukleotid, das gegen bcr gerichtet ist. 0 Control ErPC3(10)+ASO(5) ErPC3(10)+ASO(10) ErPC3(20)+ASO(5) ErPC3(20)+ASO(10) ErPC3(30)+ASO(5) ErPC3(30)+ASO(10) Experimental groups

345 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie E100 Toxikologie und Chemotherapie Tiermodelle zur Metastasierung (E100-03) M.R. Berger, H. Adwan, T. Bäuerle, M. Leible, J. Sänger, M. Rodenbach, E. Eyol In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. G. Golomb, Hebrew University of Jerusalem, Israel; Dr. M. Seelig, Abteilung für Chirurgie, Städtisches Klinikum, Ludwigshafen Da der Primärtumor meist therapeutisch beherrscht werden kann, ist das Auftreten von Metastasen oft die finale Etappe einer Krebserkrankung. Tiermodelle, die diese Krankheitsstufe modellieren sollen, sind technisch aufwendiger und können nur jeweils besondere Aspekte der Metastasierung darstellen. Ein Rattenmodell zur Metastasierung von kolorektalen Tumoren in die Leber wurde dazu so modifiziert, dass ein Markergen die Quantifizierung der Tumorzellen nach intraportaler Injektion in die Leber auch bei diffuser Metastasierung ermöglicht. Ein weiteres Rattenmodell stellt die Metastasierung in den Knochen nach. Dazu werden ebenfalls mit einem Markergen versehene Mammakarzinomzellen in einen Seitenast der A. femoralis injiziert und bilden danach im Bereich des distalen Ober- und proximalen Unterschenkels lytische Metastasen. Derzeit laufende Therapiestudien mit diesen Modellen werden dazu beitragen, verbesserte Therapiemöglichkeiten zu entwickeln [6]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Schimanski C.C., *Linnemann U., *Galle P.R., *Arbogast R., Berger M.R.: Hepatic disseminated tumor cells in colorectal cancer UICC stage 4 patients: Prognostic implications. Int. J. Oncol. 23, (2003) [2] Conzelmann M., Dieterle C.P., *Linnemann U., Berger M. R.: Cytokeratin 20 and guanylyl cyclase C mrna is largely present in lymph node and liver specimens of colorectal cancer patients. Int. J. Cancer 107, (2003) [3] Georgieva M.C., Konstantinov, S.M., *Topashka-Ancheva, M., Berger, M.R.: Combination effects of alkylphosphocholines and gemcitabine in malignant and normal hematopoietic cells. Cancer Letters: 182, (2002) [4] Konstantinov, S. M., Georgieva, M. C., *Topashka- Ancheva, M., *Eibl, H., Berger M. R.: Combination with an antisense oligonucleotide synergistically improves the antileukemic efficacy of erucylphospho-n,n,n-trimethylpropyl-ammonium in CML cell lines. Molecular Cancer Therapeutics 1, (2002) [5] Konstantinov, S. M. *Kostovski, A. Berger M. R.: Will human urinary bladder carcinoma respond to treatment with alkylphosphocholines and curcumin? Facta Universitatis (Nis), Series Medicine and Biology, 9, (2002) [6] *Bödeker H., Kamphorst E.J., *Wünsch P. H., *Linnemann U., Berger M. R.: Superiority of combined chemo-embolization and portal infusion with 5-fluorouracil over locoregional infusion concepts in Novikoff hepatoma-bearing rats. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129, (2003) [7] Berger M. R., Tsoneva I.,. Konstantinov S. M., Eibl H.: Induction of apoptosis by erucylphospho-n,n,ntrimethylammonium is associated with changes in signal molecule expression and location. Ann NY Acad Sci. 1010: , (2003) 345

346 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie E110 Gentherapie von Tumoren Gentherapie von Tumoren (E110) Leiter: Prof. Dr. med. Magnus von Knebel-Doeberitz (Abt. f. Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg) 346 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat. Susanne Dihlmann* Dr. rer. nat. Johannes Gebert* Dr. med. Matthias Kloor* Dr. rer. nat. Robert Koesters PD Dr. rer. nat. Jürgen Kopitz* Dr. rer. nat. Michael Linnebacher* Dr. rer. nat. Yvette Schwitalle* Dr. rer. nat. Svetlana Vinokurova Dr. med. Nicolas Wentzensen* Dr. med. Stefan Wörner* Technisches Personal Beate Kuchenbuch* Heike Sartor* Irina Vöhringer Doktoranden Tibor Friedrich* Corina Ziegert* Carmen Gurolla-Diaz* Dalibor Antolovic* Eva Ripberger* Anja Germann Ingrid Metz* Christine Fallsehr* Diplomanden Sabine Merx* *Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg Die Kooperationsabteilung besteht aus der Abteilung für Molekulare Pathologie der Universität Heidelberg und der Arbeitsgruppe Gentherapie von Tumoren am DKFZ. Die Abteilung beschäftigt sich sowohl mit der Entwicklung neuer Verfahren für die Früherkennung und Diagnostik solider Tumoren, als auch mit der Entwicklung immuntherapeutischer Ansätze bei diesen Tumorentitäten. Im Mittelpunkt stehen dabei anogenitale Tumoren, die in der Folge von Hochrisiko-Papillomvirus (HR-HPV)- Infektionen entstehen und Tumoren, die mit dem hereditären nicht-polyposen Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC) assoziiert sind. Die Abteilung leitet das Heidelberger Zentrum Familiärer Darmkrebs, das als eines von sieben nationalen Zentren mit Unterstützung der Deutschen Krebshilfe aufgebaut wurde. Neue tumorspezifische Marker werden sowohl über evidenzbasierte Verfahren als auch über differenzielle Genexpressionsanalyseverfahren identifiziert und dann in Studien mit klinischen Kooperationspartnern evaluiert. Im weiteren Verlauf werden dann einzelne Marker auf ihre Eignung im Einsatz als immuntherapeutische Zielproteine untersucht. Derzeit sind verschiedene Vakzinierungsstudien für Patienten mit erblichen kolorektalen Karzinomen und Zervixkarzinomen in der Planung. Molekulare Pathogenese und davon abgeleitete diagnostische Anwendungen Molekulare Pathogenese von Mikrosatelliteninstabilen (MSI) Tumoren Hereditäres nichtpolypöses Kolonkarzinom (HNPCC) Aktivität vorwiegend der Universitäts-Abteilung zugeordnet In Zusammenarbeit mit PD Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; Prof. Dr. C.M. Becker, Institut für Biochemie der Universität Erlangen; Prof. Dr. J. Rüschoff, Institut für Pathologie, Städtische Kliniken, Kassel / Deutsches HNPCC - Verbundprojekt; Prof. Dr. H. Vogelsang, Chirurgische Klinik, TU München; Prof. Dr. D. Schmidt, Institut für Pathologie, Mannheim; Prof. Dr. Wagner, Institut für Pathologie, Klinikum Kaiserslautern; Prof. Dr. Dippold, Abteilung Innere Medizin, St. Vincenz und Elisabeth Krankenhaus, Mainz; Prof. Dr. Seitz, Abteilung Innere Medizin, Salem Krankenhaus, Heidelberg; Prof. Dr. A. Sieg, Östringen; Dr. G. Munk- Schulenburg, Institut für Humangenetik, Universität Freiburg; Prof. Dr. Riemann, Klinikum Ludwigshafen Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe Bis zu 15% der Karzinome entstehen durch Veränderungen in einem bestimmten DNA-Reparatursystem, das für die Korrektur von Fehlpaarungen und kleine Insertionen/ Deletionen, die bei der Replikation von DNA auftreten, zuständig ist. Der Großteil dieser Karzinome ist mit dem HNPCC-Syndrom assoziiert, bei dem es aufgrund von Keimbahnmutationen in Genen, die für Reparaturenzyme kodieren (z.b. MLH1, MSH2, MSH6, PMS1+2, MMR-Enzyme), zum familiär gehäuften Auftreten bestimmter Tumore kommt. Im Vordergrund stehen dabei das Kolonkarzinom und das Endometriumkarzinom, seltener kommen auch Tumoren des Ovars, der Harnwege, des Magens, des hepatobiliären Systems und des Gehirns vor. Beim Ausfall des Reparatursystems akkumulieren die Mutationen zunächst in kurzen repetitiven DNA-Sequenzen (Mikrosatelliten), da hier die meisten Fehler bei der Replikation auftreten (Mikrosatelliten-Instabilität, MSI). Bei Mutationen in kodierenden Mikrosatelliten (cms) können durch die Verschiebung des Leserasters neue Peptide entstehen, die vom Körper als Fremdproteine erkannt werden (Frameshiftpeptide). In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Peer Bork am EMBL durchsuchten wir das menschliche Genom nach kodierenden Gensequenzen mit Mikrosatelliten und bestimmten deren Mutationsraten in MSI-positiven Karzinomen [43]. Die Mutationsfrequenz eines kodierenden Mikrosatelliten ist einerseits von der Länge der Sequenz abhängig, andererseits von einem durch die Mutation entstehenden Selektionsvorteil. Auf der Grundlage einer vergleichenden Analyse der cms-mutationsraten erstellten wir ein mathematisches Modell [42], das eine Vorhersage über die funktionelle Bedeutung einer cms-mutation erlaubt. Im Rahmen dieses Projektes etablierten wir mit Unterstützung durch die Deutsche Krebshilfe ein Zentrum für Familiären Darmkrebs zusammen mit der Chirurgischen Universitätsklinik, dem Institut für Humangenetik und der Abteilung Psychosoziale Onkologie der Chirurgischen Universitätsklinik ( Als Teil dieses Programms überwachen wir mehr als 400 Familien mit familiärem Kolorektalkrebs [5, 6, 8, 11, 12, 29, 32, 44, Kloor et al. eingereicht, Baehring et al. eingereicht]. Wir bestimmten routinemäßig den MSI Status und die MMR - Proteinexpression in Tumorgewebe. Anschließend werden

347 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Krankheits-verursachende Keimbahnmutationen durch DNA- Sequenzierung verifiziert. Mit dieser Strategie haben wir 126 MSI-positive Tumoren und 40 HNPCC Familien mit MMR -Keimbahnmutationen gefunden. Als Teil einer nationalen Multicenter-Studie trug unser Labor zur Begutachtung der Verläßlichkeit und der Qualitätskontrolle bei der MSI Analyse bei [46]. Die Notwendigkeit eines diagnostischen Satzes von fünf Mikrosatteliten für die MSI Klassifikation veranlasste uns, ein effizienteres und kosteneffektiveres Multiplex-PCR-System zu entwickeln, mit dem die MSI-Typisierung mit derselben Qualität durchgeführt werden kann wie mit dem internationalen Referenz Marker - Panel [47]. Zusätzlich identifizierten wir einen neuen Mikrosatellitenmarker, der in Kombination mit einem etablierten Mononukleotidmarker MSI in kolorektalen Karzinomen mit 100% Sensitivität und Spezifität nachweisen konnte ohne dabei auf korrespondierendes Normalgewebe angewiesen zu sein (Findeisen et al. in Vorbereitung). Zusammen mit der Gruppe von Prof. C.-M. Becker am Institut für Biochemie der Universität Erlangen entwickeln wir neuartige Massenspektrometrie-gestützte diagnostische Methoden für die Analyse des MSI-Status von humanem Gewebe sowie für die Identifikation von pathogenen Mutationen in der Keimzell-DNA von Patienten mit erblichen Krebsformen [1, 2]. Karzinogenese von Papillomvirus (HPV) - assoziierten Tumoren Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe Humane Papillomviren sind ein entscheidender Faktor bei der Entstehung von anogenitalen Dysplasien und Neoplasien. Die Forschungen unserer Gruppe sind seit Jahren auf die grundlegenden Mechanismen der HPV-assoziierten Onkogenese gerichtet und die sich daraus ergebenden Konsequenzen für Diagnostik und Therapie der assoziierten Karzinome. Die zwei viralen Gene E6 und E7 sind essentiell für den neoplastischen Phänotyp der Zervixkarzinomzelle. Das zelluläre Tumorsuppressorgen p16ink4a wird aufgrund der HPV-E7 Onkogenexpression in epithelialen Stammzellen stark überexprimiert. E7 interferiert mit dem RB-E2F Komplex, der in normalen Zellen die Expression von p16ink4a unterdrückt. Die Überexpression von p16ink4a könnte ein attraktiver Marker sowohl für das primäre Screening als auch die Bestätigung von Dysplasien sein, weil falsch positive Testergebnisse wie bei dem direkten HPV-Nachweis als Screeningmethode vermieden werden. Durch die Untersuchung von zahlreichen histologischen Präparaten und Abstrichproben der Zervix aus der ganzen Welt konnten wir inzwischen das Konzept belegen und zeigen, dass p16ink4a ein wichtiger Marker für Dysplasien der Zervix ist [15, 16, 33, 34, 37, 40]. Die viralen E6- und E7-Proteine induzieren starke chromosomale Instabilität in den Wirtszellen durch Interferenz mit dem mitotischen Spindelapparat. Durch diesen Mechanismus kommt es zur Integration des HPV-Genoms in das Wirtszellgenom mit fortschreitender Dysplasie. Entsprechend wäre der Nachweis des integrierten viralen Genoms ein interessantes Werkzeug zur Entdeckung von HPV-infizierten Läsionen, die ein besonders hohes Risiko der Entwicklung zu invasiven Karzinomen tragen. Umfangreiche klinische Prüfungen an mehr als 2000 Patientinnen belegten, dass der Nachweis des integrierten viralen Genoms einen hohen Vorhersagewert für die Entwicklung von E110 Gentherapie von Tumoren invasiven Karzinomen hat [48, 27]. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Orte der Integration über das ganze Genom verteilt sind, dies spricht gegen eine Insertionsmutagenese als Progressionsfaktor bei HPV-assoziierten Läsionen [39, 49, 45]. Differentielle Genexpressionanalysen zur Identifizierung neuer Biomarker für die Krebsfrüherkennung und -diagnostik Aktivität vorwiegend der Universitäts-Abteilung zugeordnet In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. S. Post, Prof. Dr. F. Willeke, Chirurgische Universitätsklinik, Mannheim; Prof.Dr.Dr.h.c. M. Büchler, PD Dr. P. Kienle, PD Dr. J. Weitz, Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg; Prof.Dr. W. Dippold, St. Vincenz- u. Elisabeth-Hospital, Mainz; Prof. R. Wagner, Institut für Pathologie, Kaiserslautern; Prof. Dr. C.-M. Becher, Institut für Biochemie, Erlangen; Dr. J. Hoheisel, Prof. Dr. M. Little, DKFZ; Prof. Dr. W. Ansorge, Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; ATD-Consortium, INSERM, Marseille - Paris, Frankreich Zusatzfinanzierung: BMBF; Forschungsförderung der Universität Heidelberg; Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim; The ATD-Consortium, 6. EU Rahmenprogramm ( ) Unter Verwendung verschiedener Techniken für die differentielle Genexpression (Suppressive Subtraktive Hybridisierung [SSH], cdna- und Oligonukleotid-Arrays, SELDI- TOF) vergleichen wir Expressionsmuster von neoplastischen und nicht-neoplastischen Geweben, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Diverse Markerkandidatengene wurden definiert, gegenwärtig wird ihr diagnostischer oder therapeutischer Nutzen untersucht [7, 25, 41]. Zu den isolierten Kandidaten gehört die Glycinrezeptoralpha Kette (GLRA), die stark in neuroendokrinen Bronchialkarzinomzellen, nicht aber im normalen Lungengewebe exprimiert ist. Die Überexpression ist Folge einer tumorspezifischen Inaktivierung der Repression dieses Gens durch den neuronenspezifischen Silencing Factor (NRSF) [9]. Eingesetzt wird dieser Marker beim Nachweis einzelner Tumorzellen im Sputum von Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom [25]. Ein weiterer potentieller Marker ist eine endogene retrovirale Sequenz, die ein bisher unbekanntes offenes Leseraster enthält. Diese Sequenz wird in bis zu 30% von verschiedenen kolorektalen und anderen gastrointestinalen Läsionen überexprimiert [41]. Wir etablierten eine sehr sensitive und spezifische Technik zum Nachweis disseminierter Darmkrebszellen in Knochenmarksproben, Lympknoten und peripherem Blut (Amplifikation von CK20 mrna - Transkripten). Die Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit PD Dr. Jürgen Weitz und seinen Kollegen in der Chirurgischen Klinik Heidelberg durchgeführt. Die bisherigen Daten [50, 51, 13, 14, 17, 18, 35, 38] zeigen, dass der Nachweis von disseminierten Tumorzellen mit dieser Technik einen sehr starken und unabhängigen Prognosewert hat. Studien zur Anwendung bei der Entscheidungsfindung zur adjuvanten Therapie insbesondere bei Hochrisikopatienten mit Darmkrebs im UICC- Stadium II sind in Planung. 347

348 348 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Funktionen von Gangliosiden, Galectinen und Sialidasen während der onkogenen Transformation Aktivität vorwiegend der Universitäts-Abteilung zugeordnet In Zusammenarbeit mit Prof. H-J. Gabius, Inst. f. Physiologische Chemie, München; Dr. M. Schnölzer and PD Dr. D. Kübler, DKFZ; Prof. A. Heck, Center for Biomolecular Research, Utrecht University, Niederlande; Prof. K. Wasano, Kyushu University, Fukuoka, Japan; Prof. I. Kuwabara, University of California, Sacramento, USA; Prof. C.G. Dotti, Turin, Italien. Ganglioside sind Glycosphingolipide die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie sind Bestandteil der Plasmamembran aller Vertebraten und modulieren verschiedene zelluläre Funktionen. Neben ihren normalen Funktionen könnnen Ganglioside auch bei der onkogenen Transformation von Zellen eine Rolle spielen. Alle Tumorzellen produzieren von der Ausgangszelle unterschiedliche Profile und Strukturen der Zelloberflächen-Glycosphingolipide. Daher sind diese Bestandteile und ihre Bindungspartner nicht nur ein geeigneter Ansatzpunkt für die Diagnose und Therapie von menschlichen Tumoren, sondern möglicherweise auch an der Karzinogenese direkt beteiligt. Spezifische Änderungen der Gangliosidbildung während der Tumorgenese entstehen durch die Modifikation der Gangliosid- Biosynthese und der Plasmamembran-gebundenen Sialidase, die Sialinsäure von bestimmten Gangliosiden abspaltet. In einem Zellkulturmodell konnten wir zeigen, dass die Aktivität der Sialidase bei der Wachstumskontrolle von Tumorzellen eine Rolle spielt. Jüngste Ergebnisse einer Kooperation mit Prof. H.-J. Gabius demonstrierten, dass β- Galactosid-bindende Lectine, die Galectine, Bindungspartner und Effektoren in der Sialidase-abhängigen Wachstumskontrolle sind. In einer Kooperation mit Dr. Martina Schnölzer und PD Dr. D. Kübler untersuchen wir gegenwärtig den Signalübertragungsweg, der das Sialidase-Gangliosid- Galectin-Netzwerk beeinflußt [10, 23, 24, 28, 31, 36]. E110 Gentherapie von Tumoren Der Wnt/β-Catenin Signalweg als therapeutisches Ziel in kolorektalen Tumoren Ziel des Projektes ist die Aufklärung der molekularen und biochemischen Mechanismen, die der Pathogenese kolorektaler Tumoren unterliegen, um sie für neue Therapien nutzbar zu machen. Insbesondere werden Mechanismen untersucht, über welche die Signalaktivität von β-catenin selektiv in Kolontumorzellen inhibiert werden kann. Beta- Catenin ist zentraler Bestandteil des Wnt-/β-catenin-Signalweges, der maßgeblich an der Regulation von Zellteilung, Migration und Differenzierung von Epithelzellen beteiligt ist. Die überwiegende Mehrheit kolorektaler Tumoren, aber auch andere Tumorentitäten, werden durch Mutationen in verschiedenen Komponenten dieses Signalweges ausgelöst [20, 21, 22]. Mit Hilfe eines Reportergen-Testsystems gelang es uns zu zeigen, dass sowohl Aspirin wie Indomethacin die β-catenin/ TCF-vermittelte Signalaktivität selektiv in Kolonkarzinomzellen inhibieren. Ursache hierfür scheint eine erhöhte Stabilität der Serin/Threonin-Phosphorylierung von β-catenin zu sein. Zudem wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung der Glykogensynthasekinase-3β (GSK-3β), welche wie b-catenin Bestandteil des Wnt-/β-catenin-Signalweges ist, ebenfalls stabilisiert wird [3, 4]. Über die Hybridisierung von Oligonucleotid-Microarrays konnten im folgenden Gene identifiziert werden, deren Expression durch Aspirin und Butyrat beeinflußt wird. Hierzu gehören insbesondere Zielgene des Wnt-/β-catenin- sowie des Ras-Signalweges (cyclin D1, cyclin E, c-myc, Fosl1, c- fos, Cd44, und follistatin). Sowohl Aspirin wie Butyrat scheinen hierbei der onkogenen Aktivität von ras bzw. b-catenin entgegen zu wirken. Die Arbeiten unterstreichen die Bedeutung der Feinregulation von b-catenin für die Pathogenese des Kolonkarzinoms und weisen es als Schlüsselmolekül zur Entwicklung zielgerichteter Krebstherapien aus [7]. Experimentelle Therapie, Vakzinierung Analyse der Immunmechanismen gegen MSI- Frameshift-Peptide von MSI + -Tumoren (T Zell- und Antikörper-Antworten) Aktivität vorwiegend der Universitäts-Abteilung zugeordnet Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe ( ) Aus einer Vielzahl von MSI-induzierten Frameshiftpeptiden wurden 10 Neopeptide für eine eingehendere immunologische Analyse aufgrund der Mutationsrate und der immunologischen Eigenschaften ausgewählt. Die bisherigen Ergebnisse zeigen: (I) Die Neopeptide induzieren eine starke humorale und zelluläre Immunität bei Patienten mit MSI-Tumoren. (II) Keimbahnmutationsträger ohne manifeste Erkrankung (gesunde Anlageträger) zeigen eine starke Immunantwort gegen Frameshift-Neopeptide [26, 30, Schwitalle et al. eingereicht]. Dagegen wurde keine solche Reaktion bei gesunden Kontrollpersonen beobachtet. Die Immunantwort ist daher sehr wahrscheinlich an der Kontrolle der MSI-Tumoren beteiligt. Dementsprechend könnten Vakzinen auf der Basis solcher MSI-induzierter Neopeptide HNPCC-Risiko-Patienten schützen. Auf der Basis dieser Ergebnisse bereiten wir derzeit klinische Vakzinierungsstudien vor. Analyse der Immunmechanismen gegen p16ink4a bei Patienten mit HPV-assoziierten Tumoren (T Zell- und Antikörper-Antworten) Aktivität vorwiegend der Universitäts-Abteilung zugeordnet Als Folge der deregulierten Expression von HPV E7 kommt es zu einer starken Überexpression von p16ink4a in HR- HPV induzierten Dysplasien und Karzinomen. Normalerweise wird p16ink4a nur in wenigen Zellen des Körpers im Zellkern exprimiert, während es bei HPV-assoziierten Dysplasien zu einer massiven Überexpression in Zytoplasma und Kern kommt, die zu einer Immunreaktion gegen das körpereigene Protein führen könnte. Wir konnten p16ink4a-reaktive T-Zellen aus Biopsien von Patienten mit hochgradigen Zervixdysplasien oder invasiven Tumoren isolieren. Die p16ink4a-spezifischen T-Zellen waren zytotoxisch und konnten Zervixkarzinomzellen in einem HLArestringierten Modell lysieren. Außerdem konnte nachge- Abb.: Beispiele für die histologischen und cytologischen Färbeeigenschaften des p16ink4a Antigens in Proben erhalten von einer hochgradigen Zervix Dysplasie.

349 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie wiesen werden, dass Patientinnen mit Zervixkarzinomen eine humorale Immunantwort gegen p16ink4a entwickeln, die von diagnostischem und eventuell prognostischem Wert für die Beurteilung von Patienten mit Präneoplasien sein könnte (Linnebacher et al., Manuskript in Vorbereitung). Entwicklung einer Antigen-spezifischen Vakzine mit CTA1-DD Fusionsproteinen in einem Rattenmodell der DMH-induzierten kolorektalen Karzinogenese CTA1-DD ist eine Kombination aus Teilen des Choleratoxins, das starke adjuvante Eigenschaften hat, und des Proteins A von S. aureus, das eine Ig-Bindungsdomäne besitzt. Das Fusionsprotein wird gegenwärtig benutzt, um effiziente Vakzinen gegen verschiedene mikrobielle Antigene zu entwickeln. In dieser Studie untersuchen wir den Einsatz des CTA1-DD Fusionsproteins als Adjuvanz für die Entwicklung einer therapeutischen, antigen-spezifischen Kolonkarzinomvakzine. Wir haben mehrere tumorspezifischen Antigene in einem bekannten Ratten-Modellsystem von chemisch induzierten Kolontumoren und der aus diesem Modell abgeleiteten Zelllinie CC531 identifiziert [7, 19], unter diesen mutierte Onkogene wie k-ras oder β-catenin und tumorspezifisch überexprimierte Gene wie cyclin E, p16ink4a, BNP, und WT1, die auch als relevante Tumor-Antigene in menschlichen Kolon- und anderen soliden Tumoren gefunden wurden [52 21, 22]. Diese Modellantigene werden zur Zeit auf ihre Fähigkeit untersucht, eine effiziente antitumorale Immunantwort in Ratten zu erzeugen, zunächst in einem therapeutischen und dann in einem präventiven Ansatz. Publikationen [1] Bonk, T. et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry-based detection of microsatellite instabilities in coding DNA sequences: a novel approach to identify DNA-mismatch repair-deficient cancer cells. Clin.Chem (2003): [2] Bonk, T. et al. Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis (FAP): genotyping of adenomatous polyposis coli (APC) alleles by MALDI-TOF mass spectrometry. Clin.Biochem (2002): [3] Dihlmann, S., S. Klein, and M. von Knebel Doeberitz. Reduction of beta-catenin/t-cell transcription factor signaling by aspirin and indomethacin is caused by an increased stabilization of phosphorylated beta-catenin. Mol.Cancer Ther. 2.6 (2003): [4] Dihlmann, S., A. Siermann, and Doeberitz M. von Knebel. The nonsteroidal anti-inflammatory drugs aspirin and indomethacin attenuate beta-catenin/tcf-4 signaling. Oncogene 20.5 (2001): [5] Foulkes, W. D. et al. The founder mutation MSH2*1906G->C is an important cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer in the Ashkenazi Jewish population. Am.J.Hum.Genet (2002): [6] Gebert, J. et al. Molecular profiling of sporadic colorectal tumors by microsatellite analysis. Int.J.Oncol (2000): [7] Germann, A. et al. Expression profiling of CC531 colon carcinoma cells reveals similar regulation of beta-catenin target genes by both butyrate and aspirin. Int.J.Cancer (2003): [8] Grips, E. et al. [Glioblastoma multiforme as a manifestation of Turcot syndrome]. Nervenarzt 73.2 (2002): [9] Gurrola-Diaz, C. et al. Reduced expression of the neuron restrictive silencer factor permits transcription of glycine receptor alpha1 subunit in small-cell lung cancer cells. Oncogene (2003): E110 Gentherapie von Tumoren [10] Kalka, D. et al. The plasma membrane ganglioside sialidase cofractionates with markers of lipid rafts. Biochem.Biophys.Res.Commun (2001): [11] Keller, M. et al. Comprehensive genetic counseling for families at risk for HNPCC: impact on distress and perceptions. Genet.Test. 6.4 (2002): [12] Keller, M. et al. Acceptance of and attitude towards genetic for HNPCC: a comparison of participants and non-participants in genetic counselling. Dis.Colon Rectum 47 (2004): [13] Kienle, P. et al. Decreased detection rate of disseminated tumor cells of rectal cancer patients after preoperative chemoradiation: a first step towards a molecular surrogate marker for neoadjuvant treatment in colorectal cancer. Ann.Surg (2003): [14] Kienle, P. et al. Detection of isolated disseminated tumor cells in bone marrow and blood samples of patients with hepatocellular carcinoma. Arch.Surg (2000): [15] Klaes, R. et al. p16ink4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am.J.Surg.Pathol (2002): [16] Klaes, R. et al. Overexpression of p16(ink4a) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int.J.Cancer 92.2 (2001): [17] Koch, M. et al. Hematogenous tumor cell dissemination during colonoscopy for colorectal cancer. Surg.Endosc (2004): [18] Koch, M. et al. Comparative analysis of tumor cell dissemination in mesenteric, central, and peripheral venous blood in patients with colorectal cancer. Arch.Surg (2001): [19] Koesters, R. et al. Predominant mutation of codon 41 of the beta-catenin proto-oncogene in rat colon tumors induced by 1,2- dimethylhydrazine using a complete carcinogenic protocol. Carcinogenesis (2001): [20] Koesters, R. et al. WT1 is a tumor-associated antigen in colon cancer that can be recognized by in vitro stimulated cytotoxic T cells. Int.J.Cancer (2004): [21] Koesters, R. et al. Nuclear accumulation of beta-catenin protein in Wilms tumours. J.Pathol (2003): [22] Koesters, R. and Doeberitz M. von Knebel. The Wnt signaling pathway in solid childhood tumors. Cancer Lett (2003): [23] Kopitz, J. et al. Homodimeric galectin-7 (p53-induced gene 1) is a negative growth regulator for human neuroblastoma cells. Oncogene (2003): [24] Kopitz, J., C. Oehler, and M. Cantz. Desialylation of extracellular GD1a-neoganglioprotein suggests cell surface orientation of the plasma membrane-bound ganglioside sialidase activity in human neuroblastoma cells. FEBS Lett (2001): [25] Lacroix, J. et al. Sensitive detection of rare cancer cells in sputum and peripheral blood samples of patients with lung cancer by preprogrp-specific RT-PCR. Int.J.Cancer 92.1 (2001): 1-8. [26] Linnebacher, M. et al. Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens. Int.J.Cancer 93.1 (2001): [27] Luft, F. et al. Detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR (DIPS-PCR) and molecular characterization in cervical cancer cells. Int.J.Cancer 92.1 (2001): [28] Oehler, C., J. Kopitz, and M. Cantz. Substrate specificity and inhibitor studies of a membrane-bound ganglioside sialidase isolated from human brain tissue. Biol.Chem (2002): [29] Plaschke, J. et al. Eight novel MSH6 germline mutations in patients with familial and nonfamilial colorectal cancer selected by loss of protein expression in tumor tissue. Hum.Mutat (2004):

350 350 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie [30] Ripberger, E. et al. Identification of an HLA-A0201-restricted CTL epitope generated by a tumor-specific frameshift mutation in a coding microsatellite of the OGT gene. J.Clin.Immunol (2003): [31] Siebert, H. C. et al. Unique conformer selection of human growth-regulatory lectin galectin-1 for ganglioside GM1 versus bacterial toxins. Biochemistry (2003): [32] Sutter, C. et al. Molecular analysis of endometrial hyperplasia in HNPCC-suspicious patients may predict progression to endometrial carcinoma. Int.J.Gynecol.Pathol (2004): [33] Trunk, M, Dallenbach-Hellweg, G, Ridder, R., Petry, U, Ikenberg, H, Schneider, V., and von Knebel Doeberitz M. Morphological Characteristics of p16ink4a Positive Cells in Cervical Cytology Samples. Acta Cytol [34] von Knebel, Doeberitz M. New molecular tools for efficient screening of cervical cancer. Dis.Markers 17.3 (2001): [35] von Knebel, Doeberitz M. et al. Molecular tools in the detection of micrometastatic cancer cells-technical aspects and clinical relevance. Recent Results Cancer Res. 158: (2001): [36] von Reitzenstein, C. et al. Differential functional relevance of a plasma membrane ganglioside sialidase in cholinergic and adrenergic neuroblastoma cell lines. Eur.J.Biochem (2001): [37] Wang, S. S., Trunk-Gehmacher, M., Schiffman, M., Herrero, R., Sherman, M. E., Burk, R. D., Hildesheim, A., Bratti, M. C., Wright, T., Rodriguez, A. C., Chen, S., Reichert, A., von Knebel Doeberitz C., Ridder, R., von Knebel Doeberitz M. Validation of p16ink4a as a marker of oncogenic HPV infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 13.8 (2004): [38] Weitz, J. et al. Detection of hematogenic tumor cell dissemination in patients undergoing resection of liver metastases of colorectal cancer. Ann.Surg (2000): [39] Wentzensen, N. et al. Characterization of viral-cellular fusion transcripts in a large series of HPV16 and 18 positive anogenital lesions. Oncogene 21.3 (2002): [40] Wentzensen, N. and Doeberitz M. von Knebel. Pathologe 25.1 (2004): [41] Wentzensen, N. et al. Identification of differentially expressed genes in colorectal adenoma compared to normal tissue by suppression subtractive hybridization. Int.J.Oncol (2004): [42] Woerner, S. M. et al. Pathogenesis of DNA repair-deficient cancers: a statistical meta-analysis of putative Real Common Target genes. Oncogene (2003): [43] Woerner, S. M. et al. Systematic identification of genes with coding microsatellites mutated in DNA mismatch repair-deficient cancer cells. Int.J.Cancer 93.1 (2001): [44] Wullenweber, H. P. et al. Evaluation of Bethesda guidelines in relation to microsatellite instability. Dis.Colon Rectum 44.9 (2001): [45] Ziegert, C. et al. A comprehensive analysis of HPV integration loci in anogenital lesions combining transcript and genomebased amplification techniques. Oncogene (2003): [46] Bocker, T. et al. Microsatellite instability analysis: a multicenter study for reliability and quality control. Cancer Res (1997): [47] Sutter, C. et al. Molecular screening of potential HNPCC patients using a multiplex microsatellite PCR system. Mol.Cell Probes 13.2 (1999): [48] Klaes, R. et al. Detection of high-risk cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer by amplification of transcripts derived from integrated papillomavirus oncogenes. Cancer Res (1999): [49] Wentzensen, N. et al. Systematic review of genomic integration sites of human papillomavirus genomes in epithelial dysplasia and invasive cancer of the female lower genital tract. Cancer Res (2004): E110 Gentherapie von Tumoren [50] Weitz, J. et al. Dissemination of tumor cells in patients undergoing surgery for colorectal cancer. Clin.Cancer Res. 4.2 (1998): [51] Weitz, J. et al. Detection of disseminated colorectal cancer cells in lymph nodes, blood and bone marrow. Clin.Cancer Res. 5.7 (1999): [52] Koesters, R. et al. Mutational activation of the beta-catenin proto-oncogene is a common event in the development of Wilms tumors. Cancer Res (1999):

351 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie E120 Pharmakologie der Krebsbehandlung Pharmakologie der Krebsbehandlung (E120) Leiter: Prof. Dr. med. W. Jens Zeller Wissenschaftler Dr. Stephanie Laufs Dr. Rüdiger Port Dr. Renate Port Dr. Marlon Veldwijk Studenten/Doktoranden cand.med. Simone Berlinghoff cand. med. Fara Bozorgmehr cand.med. Falk Dillmann cand.med. Frank Giordano cand.med. Marius Stiefelhagen cand.med. Moritz Schad Dipl.biol. Zsuzsanna Nagy cand.med. Aleksandar Radujkovic cand.med. Daniel Ribeiro cand.med. Timon Seeger Technische Assistenten Bernhard Berkus Hans-Jürgen Engel Sigrid Heil (½) Sekretärin Brigitte Pétillion (1/3) Integrationsanalyse von retroviralen Vektoren in hämatopoetischen Stammzellen S. Laufs, K.Z. Nagy, F. Giordano, S. Fruehauf*, W.J. Zeller * Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg Mit Hilfe der Insertionsmutagenese durch das murine Leukämievirus konnte eine Vielzahl für die Krebsentstehung relevanter Wirtsgene identifiziert werden. Während so die Insertionsmutagenese von retroviralen Vektoren wesentliche Erkenntnisse über die Krebsentstehung ermöglicht hat, stellt sie andererseits bei den Ansätzen, die Viren als Vektoren für die medizinische Anwendung einsetzen möchten (Gentherapie), ein ernsthaftes Problem dar. Zwei Studien haben verdeutlicht, dass das Risiko der Insertionsmutagenese beträchtlich sein kann. So zeigten retroviral transduzierte hämatopoetische Zellen in einem Mausmodell der Knochenmarktransplantation erstmals das Potential der Vektorinsertionsmutagenese bei der Leukämieinduktion. Im leukämischen Klon fand sich die Aktivierung des Protoonkogens evi-1 infolge der Insertion einer einzigen Kopie des retroviralen Vektors. Nur wenige Monate nach dieser Publikation wurden zwei Fälle leukämischer Komplikationen in einer klinischen Gentherapiestudie für eine schwere kombinierte Immundefizienz (X-SCID) nach retroviraler Modifikation von Knochenmarkstammzellen bekannt. Auch hier spielte die Aktivierung eines zellulären Onkogens (LMO2) nach Insertion des retroviralen Vektors eine entscheidende Rolle. In beiden Fällen, sowohl im Mausmodel als auch bei den X-SCID-Patienten, führte die virale Integration zur transkriptionellen Aktivierung eines Protoonkogens. Von uns wurden humane periphere Blutvorläuferzellen mit dem neuen retroviralen SF91m3-Vektor, der das humane MDR1-Gen enthält, transduziert und anschließend in NOD/ SCID-Mäuse transplantiert. Anschließend wurde von uns auf Basis der ligationsmediierten PCR (LM-PCR) eine Methode entwickelt und optimiert, die es ermöglicht, gleichzeitig mehrere Integrationsstellen von transduzierten gemischten Zellpopulationen wie chimäres Mausknochenmark, das transduzierte menschliche Stammzellen enthält, zu untersuchen [1-3]. Weiterhin wurde von uns für klonale Zellpopulationen eine Methode (PCR mit arbiträren Primern) zur Insertionsanalyse in peripheren Blutstammzellen entwickelt. Beide Methoden konnten zum ersten Mal mittels 24-Farben-FISH validiert werden [3]. Neueste Untersuchungen unserer Gruppe zeigen, dass das Integrationsverhalten von Onkoretroviren und Lentiviren in humanen peripheren Blutvorläuferzellen keinesfalls wie bisher angenommen, zufällig ist. Es konnte eine vermehrte Integration von Onkoretroviren in den Chromosomen 17 und 19 gezeigt werden [3]. Für onkoretroviral transduzierte menschliche Blutstammzellen mit Langzeit-Repopulationspotential in immundefizienten Mäusen konnten wir erstmals eine bevorzugte Vektorintegration im ersten Intron von Genen identifizieren. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Fruehauf S, Veldwijk MR, Zeller WJ, Laufs S. Prospects and RISC score of viral gene therapy for sarcoma. Expert Opin Biol Ther Dec;3(8): [2] Gentner B, Laufs S, Nagy KZ, Zeller WJ, *Fruehauf S. Rapid detection of retroviral vector integration sites in colony-forming human peripheral blood progenitor cells using PCR with arbitrary primers. Gene Ther May;10(9): [3] Laufs S, Gentner B, Nagy KZ, *Jauch A, Benner A, *Naundorf S, *Kuehlcke K, *Schiedlmeier B, *Ho AD, Zeller WJ, *Fruehauf S. Retroviral vector integration occurs in preferred genomic targets of human bone marrow-repopulating cells. Blood Mar 15;101(6): Epub 2002 Nov 07. Rekombinante Adeno-assoziiertes-Virus-2-Suizidvektoren für die Behandlung von Sarkomen und Mesotheliomen M.R. Veldwijk, S. Berlinghoff, S. Laufs, F. Wenz*, S. Fruehauf** und W.J. Zeller *Department of Radiation Oncology, Universitätsklinikum Mannheim, Universität Heidelberg ** Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg Trotz Fortschritten in der konventionellen Therapie von Sarkomen und malignen Mesotheliomen ist die Behandlung dieser Tumorentitäten insbesondere in fortgeschrittenen Stadien unverändert eine große Herausforderung und die Prognose ist bei einem hohen Prozentsatz dieser Patienten schlecht. Auf der Suche nach neuen Behandlungsmöglichkeiten stellen virale Suizidvektoren einen vielversprechenden neuen Ansatz dar [1-3]. In vorangegangenen Untersuchungen beobachteten wir die höchste Suszeptibilität bei Bindegewebssarkomzellen (HS-1) für den rekombinanten adeno-assoziierten-virus-2 (raav-2)-vektor [Veldwijk et al., Eur J Cancer 35 (1999): ; Veldwijk et al. Cancer Gene Ther 7 (2000): ]. Jetzt wurden diese Ergebnisse an fünf weiteren menschlichen Sarkomzelllinien bestätigt: Fibrosarkom (HT-1080), Ewing Sarkom (RD-ES), Askin Tumor (SK-N- MC), Rhabdomyosarkom (A-204) und Weichteilsarkom (WSKL-1) [4]. Darüber hinaus zeigte sich, dass raav-2 sowohl hohe Transduktionsraten als auch eine hohe GFP- Expression in menschlichen Mesotheliomzelllinien (H-Meso- 1, MSTO-211H and NCI-H-28) erreicht [5, 6]. Aus raav-2- Konstrukten, die verschiedene Promotoren enthalten, zeigte der EF-1 alpha (Elongations-Faktor-1 alpha) enthaltende Vektor nach Transduktion die höchsten Expressionsraten sowohl in Sarkom- als auch in Mesotheliomzelllinien [4, 5]. Um eine konstante Anzahl von Vektorpartikeln sicherzustellen, wurden die stocks zum einen mittels funktionaler Titrierung, zum anderen mit einer von uns etablierten, auf real-time PCR-basierenden Methode titriert [7]. 351

352 352 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Mehrere neue Vektoren, die das Thymidinkinase-Gen (TK) enthalten und entweder unter der Kontrolle des Zytomegalievirus- (CMV) oder des EF-1-alpha-Promotors stehen, wurden erzeugt und ausgetestet [4, 7]. Eine höhere Expression des Transgens (im Vergleich zum CMV-Promotor) konnte bei EF-1-alpha-enthaltenden Vektoren in Sarkomund Mesotheliomzelllinien beobachtet werden. Für Sarkomzellen haben wir eine komplette Abtötung von raav-ef1α- TK/eGFP (enthält Thymidinkinase/enhanced GFP) -transduzierten Tumorzellen nach Exposition gegenüber Ganciclovir (2,5 µg/ml) (GCV) in vitro beobachten können, während bei dieser Ganciclovir-Dosis >90% der nichttransduzierten Zellen überlebten [4]. Bei Mesotheliomzellen konnte eine fast komplette Tumorabtötung von transduzierten und GCV-behandelten Zellen erreicht werden [5]. Xenotransplantations-Tumor-Modelle (intraperitoneal, subkutan) wurden für Sarkom- und Mesotheliomzellinien in NOD/SCID Mäusen etabliert. In proof-of-principle -Experimenten wurden Mäusen raav-tk/egfp-transduzierte und zusätzlich GCV-exponierte Sarkom- und Mesotheliomzellen transplantiert, wonach diese >5 Monate überlebten, während bei gleichem Ansatz mit nicht-transduzierten Zellen alle Mäuse ca. 1 Monat nach Tumorinokulation verstarben [4, 5]. Unsere Ergebnisse sind vielversprechend und empfehlen die Weiterentwicklung einer auf raav-2 basierenden Suizidgentherapie für den Einsatz bei Sarkomen und Mesotheliomen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Fruehauf S*, Veldwijk MR, Zeller WJ, Laufs S. Prospects and RISC score of viral gene therapy for sarcoma. Expert Opin Biol Ther : [2] Fruehauf S*, Veldwijk MR, Berlinghoff S, Basara N*, Baum C*, Flasshove M*, Hegewisch-Becker S*, Kröger N*, Licht T*, Moritz T*, Zeller WJ and Laufs S (2002). Gene therapy for sarcoma. Cells Tissues Organs 172: [3] Cziepluch C, Schlehofer JR and Veldwijk MR. Parvoviren in der Krebs- und Gentherapie. In: Zeller WJ, zur Hausen H (Hrsg). Onkologie, ecomed Verlag, Landsberg/Lech Pp Chapt. IV [4] Veldwijk MR, Berlinghoff S, Laufs S, Wenz F*, Zeller WJ and Fruehauf S* (2004).Suicide gene therapy of sarcoma cell lines using recombinant adeno-associated virus 2 vectors. Cancer Gene Ther. 11: [5] Berlinghoff S, Veldwijk MR, Laufs S, Maser HP, Jauch A*, Wenz F*, Fruehauf S* and Zeller WJ (2004). Adeno-associated virus-2 vector-based suicide gene therapy for mesothelioma can be improved by use of elongation factor 1-alpha as promotor. Lung Cancer. In press. [6] Veldwijk MR, Berlinghoff S, Laufs S, Jauch A*, Wenz F*, Zeller WJ and Fruehauf S*. Characterisation of mesothelioma cell lines: a promising model for adeno-associated virus 2-mediated suicide gene therapy. Eur. J. Cancer. Submitted [7] Veldwijk MR, Topaly J*, Laufs S, Zeller WJ and Fruehauf S* (2002). Rapid determination of adeno-associated virus 2 vector titers using an optimized real-time quantitative polymerase chain reaction-based titration assay that meets clinical laboratory standards. Mol Ther 6: Pharmakokinetik/Pharmakodynamik R.E. Port Kooperationen mit: O. Mehls, Universitäts-Kinderklinik Heidelberg; R.W. Jelliffe, School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, USA; P.M.J. McSheehy, CRC Biomedical Magnetic Resonance Research Group, St. George s Hospital Medical School, London, UK. E120 Pharmakologie der Krebsbehandlung Gegenstand der Pharmakokinetik sind Konzentrations-Zeit- Verläufe von Arzneistoffen; Gegenstand der Pharmakodynamik ist die Abhängigkeit der Wirkung von Arzneistoffen von Dosis, Zeit und eventuell auch gemessenen Arzneistoffkonzentrationen. Die Populations-Pharmakokinetik/Pharmakodynamik konzentriert sich auf die Analyse der Variabilität von Arzneistoffkonzentrationen und Arzneistoffwirkungen [1-5]. Eine populations-pharmakodynamische Untersuchung der Wirkung von Erythropoetin bei renaler Anämie ergab, dass bei Kindern und Jugendlichen von 10 bis 20 Jahren eine gegebene absolute Dosis im Mittel immer etwa die gleiche Wirkung hat, unabhängig von Gewicht oder Alter [3]. Die Ursache für diesen grundsätzlich unerwarteten Befund könnte eine eine Bindung von Erythropoetin an Rezeptoren außerhalb des hämatogenen Systems sein, die eine physiologische Funktion in der Entwicklung haben und mit dem Heranwachsen allmählich verschwinden. Die in der Pädiatrie übliche Dosierung nach kg Körpergewicht sollte für Erythropoetin neu überdacht werden. Ein Hauptproblem bei der Behandlung solider maligner Tumoren mit Arzneistoffen ist die Erzielung ausreichend hoher Arzneistoffkonzentration im malignen Gewebe für ausreichend lange Zeit. Über die Arzneistoffkonzentrationen, die tatsächlich in menschlichen Tumoren zustandekommen, ist wenig bekannt. Die Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS) und die dynamische Magnetresonanz-Tomographie (dmrt) erlauben es, Arzneistoffkonzentrationen in Geweben nichtinvasiv zu verfolgen [6]. Untersuchungen mit 19 F-MRS in vivo an Rattentumoren ergaben, dass die Aufnahme von 5-Fluoruracil in den Tumor und der Anabolismus zu zytotoxischen Nucleotiden durch gleichzeitige Inhalation von CO 2 gesteigert werden; gleichzeitig wird jedoch auch der Rückfluss des Zytostatikums vom Tumor ins Plasma beschleunigt wird [7]. Die Studie ist ein Beispiel für das Potenzial nichtinvasiver Methoden bei pharmakokinetischen Untersuchungen in Geweben. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Port RE: Populations-Pharmakokinetik und individuelle Dosisanpassung. In: Zeller WJ, zur Hausen H (Hrsg.), Onkologie - Grundlagen, Diagnostik, Therapie, Entwicklungen (16. Ergänzungslieferung, ecomed-verlag, Landsberg 2003), pp. IV- 8.1, 1-13 [2] Gastl G*, Berdel W*, Dittrich C*, Edler L, Jaehde U*, Port R E, Mross K*, Scheulen M*, Sindermann H*: Standard Operating Procedures for Clinical Trials of the CESAR Central European Society for Anticancer Drug Research - EWIV. SOP 14: Population Pharmacokinetic Analysis. Onkologie 26 (suppl. 6), 60-66, 2003 [3] Port RE, Kiepe D*, Jelliffe RW*, Mehls O*: Recombinant Human Erythropoietin for the treatment of Renal Anemia in Children. No Justification for Bodyweight-Adjusted Dosage. Clin Pharmacokin, 43, 57-70, 2004 [4] Mueller HJ*, Grubert M*, Hilger R*, Richly H*, Port R E, Scheulen M*, Mross K*: The influence of elevated liver function parameters on the pharmacokinetics of doxorubicin and epirubicin - a population based pharmacokinetic study of CESAR- APOH. Int J Clin Pharmacol Ther 40, , 2002 [5] Mueller HJ*, Port RE, Grubert M*, Hilger RA*, Scheulen M*, Mross K*: The influence of liver metastases on the pharmacokinetics of doxorubicin - a population-based pharmacokinetic project of the CESAR-APOH. Int J Clin Pharmacol Ther 41, , 2003 [6] Port RE, Wolf W*: Noninvasive methods to study drug distribution. Inv New Drugs 21, , 2003 [7] McSheehy PMJ*, Port RE, Rodrigues LM*, Robinson SP*, Stubbs M*, van der Borns K*, Peters GJ*, Judson IR*, Leach MO*, Griffiths JR*: Investigations in vivo of the effects of carbogen breathing on 5-fluorouracil pharmacokinetics and physiology of solid rodent tumors. Neoplasia, Cancer Chemother Pharmacol, im Druck

353 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie E130 Rekombinante Antikörper Rekombinante Antikörper (E130) Leiter: Prof. Dr. Melvyn Little Postdocs Dr.rer.nat. Marike J.J.G. Stassar (-9/02) Dr.rer.nat. Björn Cochlovius (-9/02) Dr.med. Jana Schlenzka (1/02-) Dipl.Chem. Karin Hoffmann (8/02-) Doktorandin Dipl.-Biol. Alexandra Bähre Experimentelle Therapie mit rekombinanten Antikörpern 1) Screening von Antikörperbibliotheken gegen Antigene auf der Oberfläche von kolorektalen Karzinomen K. Hoffmann, M. von Knebel-Doeberitz, M. Little Unsere aus menschlichem Blut hergestellten hochkomplexen Immunglobulin-Genbanken oder synthetische humane Immunglobulin-Genbanken mit Zufallssequenzen an der Antigenbindungsstelle dienen als Repertoir für die Isolation klinisch relevanter Antikörper. Spezifische Antikörper werden mit der Phage-Display-Technologie aus der Bibliothek selektioniert. Wir haben damit die Möglichkeit, humane monoklonale Antikörper in vitro, d.h. ohne die Notwendigkeit zur Immunisierung, herzustellen. Mit dieser Technologie ist es uns gelungen, humane Antikörper gegen Antigene auf der Oberfläche von kolorektalen Karzinomen zu gewinnen. 2) Mulitivalente rekombinante Antikörper B. Cochlovius, M. Little In Zusammenarbeit mit: Dr. Gerd Moldenhauer, DKFZ Um eine höhere Avidität und eine längere in vivo Retentionszeit zu erreichen, haben wir einen tetravalenten bispezifischen Tandem Diabody konstruiert. In vivo Versuche mit dieser innovativen Form eines rekombinanten Antikörpers zeigten klarer Vorteile gegenüber den kleineren herkömmlichen bivalenten Diabodys. Wir konnten z.b. eine komplette Heilung eines menschlichen Burkitt Lymphoms in einem SCID Mausmodell erreichen [1, 6]. 3) Entwicklung von Tumorvakzinen Geeignete Tumorantigene für eine Immuntherapie wurden untersucht. Für die Entwicklung von oralen Tumorvakzine wurde die DNA eines Tumorantigens und dendritische Zellen verwendet. Die dendritischen Zellen wurden mit dem genetischen Material einer Tumorprobe transfiziert, um die effiziente Präsentation des Tumorantigens zu ermöglichen. Krebsspezifische T Zell Antworten konnten auch mit mrna-transfizierten dendritischen Zellen erzielt werden [2, 3, 5]. 4) Immunosuppression Um die Nebenwirkungen des OKT3-Antikörpers bei der Behandlung von Patienten nach einer Transplantation zu vermeiden, wurde die bindenden Domänen des Antikörpers mit den konstanten Domänen eines humanen IgM- Antikörpers fusioniert. Dieser neuartige Antikörper konnte die Aktivierung von T Lymphozyten durch seine Bindung an CD3 des T Zell-Rezeptor-Komplexes effizient inhibieren [4]. Zusatzfinanzierung: BMBF (2 Wissenschaftler), Mildred Scheel Stiftung (1 Wissenschaftler), Stipendium des Graduierten Kollegs für Biotechnologie der Univ. Heidelberg (1 Doktorandenstelle). Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kipriyanov SM*, Cochlovius B, Schafer HJ*, Moldenhauer G, Bahre A, Le Gall F*, Knackmuss S*, Little M. Synergistic antitumor effect of bispecific CD19 x CD3 and CD19 x CD16 diabodies in a preclinical model of non-hodgkin s lymphoma. J Immunol 69: (2002). [2] Kubuschok B*, Schmits R*, Hartmann F*, Cochlovius B, Breit R*, Konig J*, Pistorius G*, Schilling M*, Renner C*, Pfreundschuh M*. Use of spontaneous Epstein-Barr viruslymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum Gene Ther. 13: (2002). [3] Schmits R*, Cochlovius B, Treitz G*, Regitz E*, Ketter R*, Preuss KD*, Romeike BF*, Pfreundschuh M*. Analysis of the antibody repertoire of astrocytoma patients against antigens expressed by gliomas. Int J Cancer. 98: 73-7 (2002). [4] Choi I, Schmitt WE, Bahre A, Little M, Cochlovius B. Recombinant chimeric OKT3/IgM antibodies for immune suppression: evaluation in a human CD3 transgenic mouse model. Immunol Lett. 80: (2002). [5] Cochlovius B, Stassar MJ, Schreurs MW, Benner A, Adema GJ. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol Lett. 80: (2002). [6] Kipriyanov SM, Moldenhauer G, Braunagel M, Reusch U* Cochlovius B, Le Gall F, Kouprianova OA, Von der Lieth CW, Little M. Effect of domain order on the activity of bacterially produced bispecific single-chain Fv antibodies. J Mol Biol. 330: (2003). 353

354 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie/Onkologie (E160) Leiter: Dr. med. M. Görner (kommissarisch 3/02-8/03) Dr. med. Th. Luft, PhD (8/03 -) 354 Wissenschaftler Dr. med. Thomas Luft, PhD PD Dr. Johannes Schenkel Dr. med. Markus Munder PostDoc Dr. Svetlana Karakhanova, PhD Doktoranden Elena Rodionova (PhD-Studentin) Markus Schneider (MD Student) Gwendolyn Doschko (MD-Studentin) Technische Assistenten Michael Kirsch Michael Hess Claudia Luckner Katja Knebel (-8/03) Der Fokus der klinischen Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie und Onkologie lag in den letzten beiden Jahren auf der Untersuchung und Manipulation immunologischer Antworten nach Blutstammzell-Transplantationen (SZT). Dafür besteht zwischen unserer Arbeitsgruppe und der Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie (Prof. Dr. A.D. Ho) der Universität Heidelberg eine enge klinische und wissenschaftliche Verbindung. Autologe und allogene SZT sind seit Jahren in die Struktur der Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie der Universität Heidelberg integriert. Beide Therapieansätze stellen für einige hämatologische Erkrankungen eine Möglichkeit der Heilung bzw. der Lebensverlängerung dar. Unsere Kenntnis der kurativen Mechanismen dieser aufwendigen Therapieformen sind jedoch lückenhaft, so dass Steuerung und Optimierung des eigentlichen Heileffektes derzeit noch nicht möglich sind. Deshalb entwickelte unsere Kooperationseinheit drei Arbeitsrichtungen, welche neue therapeutische und diagnostische Ansätze für hämatologische Patienten zum Ziel haben: 1. Vakzineentwicklung 2. Monitoring immunologischer Antworten nach SZT und 3. Untersuchung von Regulationsprinzipien immunologi scher Antworten. Im Rahmen der Entwicklung neuer Vakzineprotokolle wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Goldschmidt (Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie der Universität Heidelberg) eine Vakzinestudie für Patienten mit Multiplem Myelom nach Hochdosis-Chemotherapie und autologer SZT begonnen. Diese soll randomisiert die Immunogenität Peptid-beladener Dendritischer Zellen in der Frühphase (4 Wochen nach SZT) und in der Spätphase (6 Monate nach SZT) nach autologer SZT vergleichen. Die Herstellung der Dendritischen Zellen erfolgt in Zusammenarbeit mit der Klinischen Kooperationseinheit Hautkrebs (D070, Leiter: Prof. D. Schadendorf). Erste Probeläufe mit Patienten-Leukapherisaten waren bereits im GMP-Labor der Gruppe D070 erfolgreich, die Studie soll im Jahre Patienten rekrutieren. Diese erste klinische Studie ist die logistische Voraussetzung a) für Vakzinestudien mit neuen Peptid-Antigenen und b) für Vakzinestudien nach allogener SZT. Zunächst werden Peptid-Antigene eingesetzt, welche bereits vielfach untersucht und sicher nicht toxisch sind. Wir arbeiten intensiv an der Entwicklung neuer Peptid-Antigene, die für spätere Generationen klinischer Studien zur Anwendung kommen sollen. Eine zweite Arbeitsrichtung zielt auf die Analyse immunologischer Veränderungen nach allogener SZT. Dazu sammelt unserer Arbeitsgruppe seit 2 Jahren Serum, Zellen, Proteinlysate und DNA/RNA allogen transplantierter Patienten. Bislang sind 90 Patienten in diese Studie rekrutiert, 14-tägig werden Blutproben entnommen und in verschiedenen Aufbereitungen eingefroren. 56 Patienten konnten bereits longitudinal bis über den Tag 100 nach SZT beobachtet werden. Dabei werden die klinischen Beobachtungen an diesen Patienten (Remissionen, Komplikationen) von immunologischen Untersuchungen begleitet. Ziel ist die Entwicklung neuer diagnostische Ansätze zur Vorhersage schwerer Komplikationen (z.b. einer Graft-versus-Host Disease, GvHD). Teile dieser Materialbank sind im letzten Jahr für die immunzytometrische Analyse von T-Zellpopulationen sowie für Untersuchungen der Regulation der Arginase im Verlauf nach SZT eingesetzt worden. Weitere Projekte (Quantifizierung der Aktivierung der MAPK p38 und ERK1/2) werden zur Zeit erarbeitet. Zum Dritten richtet sich unser Interesse auf basale Regulationsprinzipien immunologischer Antworten. Wir beobachteten fundamentale Unterschiede in der Regulation des Arginin-Metabolismus zwischen Maus und Mensch. Dies unterstreicht erneut die Signifikanz der Untersuchung spezifisch humaner Zellsysteme. Wir arbeiten mit einem Modell der Differenzierung humaner dendritischer Zellen und konnten beschreiben, dass diese in Abhängigkeit von Stärke und Persistenz äusserer Aktivierungsreize entweder zu migratorischen oder zu pro-inflammatorischen Zellen reifen. Die Stärke und Persistenz äusserer Reize wird transformiert in intrazelluläre Signale, deren Stärke nach 24 Stunden (Stärke der Persistenz) mit dem funktionellen Phänotyp der Zellen korreliert. Diese Arbeiten eröffnen neue Wege für die Analyse der Regulation immunologischer Reaktionen durch extra- und intrazelluläre Modulation von Stärke und Persistenz der Signale. Unsere Ergebnisse sind angesichts einer neuen Generation von Medikamenten, die auf die Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege zielen, von klinischer Relevanz.

355 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Immunogenität einer Vakzine mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen in der Früh- und Spätphase nach autologer Stammzell-TPL T. Luft, O. Christensen*, H. Goldschmidt*, D. Schadendorf #, A.D. Ho* * Medizinische Klinik und Poliklinik V; # D070, DKFZ Klinische Phase I-II Vakzinestudien mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen (DC) zeigten, dass 10-30% aller Patienten potente Immunreaktionen bis hin zu (vereinzelten) kompletten Remissionen ihrer malignen Erkrankung entwickeln können. Trotzdem profitiert die Mehrzahl der Patienten nicht von dieser aufwendigen Therpie. Diese geringe Wirksamkeit steht im Widerspruch zu zahlreichen in vitro und murinen in vivo Studien, in welchen sich DC als die potentesten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zur Induktion einer T-Zell-vermittelten Immunantwort erwiesen. Wir vermuten, dass die Diskrepanz zwischen experimenteller und klinischer Wirksamkeit verursacht wird a) durch Verwendung migratorischer DC, die nicht zur Sekretion von IL-12p70 befähigt sind, und b) durch das Fehlen eines systemischen, pro-inflammatorischen Milieus, welches normalerweise bei viralen und bakteriellen Infektionen beobachtet wird. Da Tumoren ihr Mikromilieu selbst immunsuppressiv konditionieren, ist die Umgebung des Tumors sicher nicht in der Lage, die durch eine Vakzine expandierten T-Zellen zur Reifung zu bringen. Hinweise für eine inkomplette Reifung Peptid-spezifischer CTL wurden bereits bei HIV-Patienten gefunden. Die Perforinexpression von CTL, die durch eine DC-Vakzine expandiert wurden, ist bisher nicht untersucht. Jedoch benötigen CTL für ihre terminale Reifung IL-10 oder IL- 12p70, zwei Zytokine, die von den in bisherigen Vakzinestudien verwendeten DC nicht sezerniert werden. Die Studie des vorliegenden Antrags verwendet DC, die für 6h mit CD40Ligand und IFN-γ aktiviert wurden und nach T- Zell-Kontakt zur Sekretion dieser Zytokine in der Lage sind. Andererseits verlangt eine massive Expansion Peptid-spezifischer CTL ein systemisches, pro-inflammatorisches Milieu, wofür v.a. präklinische Studien mit adoptivem Transfer von CTL Hinweise erbrachten. Die frühe Phase der lymphozytären Rekonstitution (nach autologer oder allogener) SZT scheint die Expansion zytotoxischer T-Zellen besonders zu begünstigen. Diese Expansion ist initial oligoklonal, was auf eine Antigen-spezifische Expansion der CTL hinweist. Die hier vorgelegte Studie soll die Frage beantworten, ob sich die Immunogenität einer DC-Vakzine in der Frühphase nach autologer SZT von einer Vakzine in der Spätphase unterscheidet. Studiendesign - 30 Patienten mit Multiplem Myelom (MM) im Stadium III werden mit autologen DC vakziniert. Randomisation: a) 4 Wochen oder b) 6 Monate nach Hochdosis-Chemotherapie und nachfolgender autologer SZT. - Herstellung der DC-Vakzine aus autologen Monozyten im GMP-Labor des DKFZ-Partners. - Aktivierung der DC nach unserem eigenen Protokoll: 6 h CD40L-Monomere und IFN-γ. - DC werden mit tumorassoziierten Peptiden beladen: MAGE-A2 (KVAELVHFL, ; FLWGPRALV, 271- Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie 279), LAGE-1 (SLLMWITQV, ), Influenza- Kontrollpeptid (GILGFVFTL, 58-66). - Studienendpunkte: Toxizität der Vakzine und Zahl und Funktion Peptid-spezifischer CTL im peripheren Blut. - Immunologische Evaluation nach 3 Vakzinierungszyklen (3 wöchige Zyklen) aus einem Leukapherisat: FACS-Analyse mit Tetrameren, intrazelluläre Expression von Perforin und Granzym B, Oberflächenmarker, ELISpot und ELISA. Bisher sind in zwei Probeläufen Leukapherisate von Patienten mit MM erfolgreich im GMP-Labor der Arbeitsgruppe D070 (Prof. D. Schadendorf) aufbereitet worden, die Studie soll im Jahr Patienten rekrutieren. Diese Studie ist ein erster Schritt hin zu nachfolgenden Studien mit neuen Peptidantigenen. Polymorphe HLA-DP-abgeleitete Peptide - neue Vakzineantigene für Fremdspender-Blutstammzelltransplantationen? E. Rodionova, M. Zöller #, A.D. Ho*, T. Luft * Medizinische Klinik und Poliklinik V; # D060, DKFZ Parallel zur Entwicklung klinischer Vakzinestudien nach SZT sucht unserer Gruppe nach neuen Tumor-assoziierten Antigenen. Dabei sind die HLA-DP-Allele vielversprechende Zielstrukturen, die sich bei den meisten allogenen Fremdspender-SZT zwischen Spender und Empfänger unterscheiden. Wir untersuchen die Bedeutung von HLA-A2-bindenden Peptiden der polymorphen Regionen dieser Allele als potentielle Antigene für CTL-Antworten bei Graft-versus- Leukämie (GvL) und Graft-versus-Host-Disease (GvHD) Reaktionen sowie als Antigene für zukünftige Vakzinestudien. Ähnlich den Minor Histokompatibilitätsantigenen HA-1 und HA-2 ist auch die Expression der HLA-Klasse II Moleküle im Wesentlichen auf hämatopoetische Zellen und ihre Abkömmlinge begrenzt. Auch Leukämie- und Lymphomzellen exprimieren diese Moleküle. Eine CTL-vermittelte Immunreaktion gegen Empfängerallele sollte daher nach allogener SZT eine GvL unterstützen und nur geringe Nebenwirkungen haben. Wir haben die HLA-A2-bindenden Peptide der polymorphen Regionen aller HLA-DP-Allele identifiziert und für einige dieser Peptide Bindungsfähigkeit und Immunogenität in vivo nachgewiesen. Zur Zeit arbeiten wir an der Klonierung Peptid-spezifischer CTL, um die Expression dieser Peptide an der Oberfläche von B-Lymphozyten zu untersuchen. Da die analogen Peptide der verschiedenen HLA-DP-Allele ein weites Spektrum von HLA-A2-Bindungsaffinitäten zeigen, hoffen wir, immunogene Peptide zu identifizieren, die spezifisch auf hämatopoetischen und malignen Zellen des Empfängers exprimiert werden. Diese Peptide könnten mögliche Antigene für zukünftige Vakzinestudien darstellen. Die Relevanz dieser Peptide im Kontext einer GvL bzw. GvHD-Reaktion wird anhand der Patientenproben unserer Materialbank untersucht. 355

356 356 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Stärke und Persistenz aktivierender Reize bestimmen Migration und Zytokinsekretion humaner dendritischer Zellen T. Luft* #, E. Maraskovsky, M. Schnurr, K. Knebel*, M. Kirsch*, M. Görner* #, R. Skoda*, A.D. Ho #, P. Nawroth und A. Bierhaus * E160, DKFZ; Medizinische Klinik I, Universität Heidelberg; # Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg the Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australien Die Migration dendritischer Zellen (DC) in die Lymphknoten sowie die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine wie IL- 6 und IL-12p70 sind kritische Funktionen reifer DC. Allerdings ist die Ausprägung dieser Funktionen nicht notwendig aneinander gekoppelt. Wir konnten zeigen, dass quantitative Unterschiede in identischen Signaltransduktionswegen die Differenzierung der Zellen zu migratorischen oder Zytokin-sezernierenden Zellen beeinflussen. Die Ausprägung der Fähigkeit zur Migration verlangte nur schwache und transiente CD40-Signale, hingegen hemmten starke und persistente CD40 Signale die Migration und steigerten die Sekretion von Zytokinen. Dieses Modell traf gleichermassen für die DC-Aktivierung durch intakte Pathogene (lebende E. coli) zu. Weiterhin unterschied sich die Persistenz der Signaltransduktion in CD1c + DC des peripheren Blutes (PBDC) von der unreifer monozytärer DC, was eine mögliche Erklärung für das migratorische funktionelle Profil der PBDC erlaubt. ERK1/2 und p38k mediierten synergistisch die Sekretion von Zytokinen, jedoch wurde die Ausprägung migratorischer Fähigkeiten von p38k verstärkt und von ERK1/2 gehemmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Richtung einer DC-vermittelten Immunantwort durch die Stärke und die Persistenz aktivierender Reize reguliert wird. (Manuskript eingereicht) Die Stärke der Persistenz intrazellulärer Signale bestimmt die Differenzierung dendritischer Zellen (DC) zu migratorischen oder zytokinsezernierenden Zellen - ein Regulationsmotif zellulärer Adaptivität T. Luft* #, E. Rodionova, E. Maraskovsky, M. Kirsch*, M. Hess, M. Görner, U. Klingmüller**, R. Skoda* und A.D. Ho # *DKFZ E160, ** DKFZ A150, # Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australien. Die Sekretion von Zytokinen und die Migration in periphere Lymphknoten sind zwei spezifische Charakteristika monozytärer dendritischer Zellen (MoDC), welche durch Stärke und Persistenz des Einwirkens extrazellulärer aktivierender Reize reguliert werden. MAPKinasen sind wesentliche Komponenten des intrazellulären Signaltransduktions- Netzwerkes und vermitteln Migration (p38k) und Zytokinsekretion (p38k und ERK1/2) von MoDC. Auch die Aktivität der Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipasen PC- PLC und PLD korrelieren mit einem migratorischen Phänotyp, jedoch in nicht-migratorischen Zellen ist ihre Aktivität vermindert. Wir beobachteten, dass die Persistenz dieser drei Signalwege von unterschiedlichen funktionellen Modulatoren dendritischer Zellen beeinflusst wird: Wortmannin verstärkte Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie die Phosphorylierung von p38k und ERK1/2 nach 24 Stunden, was mit erhöhter Sekretion von IL-6 und IL-12p70 korrelierte. Dagegen hemmte D609 alle MAPK und Phospholipasen mit dem Resultat einer vollständigen Reifungshemmung der MoDC. Zyklisches AMP (camp) hatte interessante modulatorische Effekte: Hemmung der MAPK p38k und ERK1/2 sowie Verstärkung der Aktivität der PC-PLC. Entsprechend sezernierten MoDC, die in Anwesenheit von camp aktiviert wurden, geringere Mengen von Zytokinen und zeigten verstärkte migratorische Aktivität. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die Modulation der Stärke der Persistenz intrazellulärer Signale ein wesentliches regulatorisches Motif zellulärer Differenzierung ist. Dieses erlaubt adaptives Verhalten dendritischer Zellen angesichts einer grossen Bandbreite verschiedenster Typen und Stärken extrazellulärer Reize bei gleichzeitiger Integration eines komplexen Netzwerkes aktivierender und hemmender Module in der Zelle selbst. (Manuskript in Vorbereitung). Arbeitsgruppe Immunregulation Wir beschäftigen uns mit immunregulatorischen Regelkreisen innerhalb des myeloischen und lymphatischen Teils des Immunsystems. Ausgehend von eigenen Untersuchungen zur Regulation des Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen (Munder et al. 1998, J. Exp. Med. 187:2103, Munder et al., J.Immunol. 1998, 160:5347; Munder et al. 1999, J.Immunol. 163:3771) sowie zur Anergisierung von T-Zellen (Munder et al 2002, J. Exp. Med. 196:1151) haben wir im letzten Jahr v.a. die entsprechenden Mechanismen im humanen Immunsystem studiert. 1. Arginin-Metabolismus in Zellen des menschlichen Immunsystems M. Munder, G. Doschko, M. Görner, C. Luckner Kooperationspartner: M. Modolell (Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg); F. Mollinedo (Universität Salamanca, Spanien); J. Calafat (Krebsforschungszentrum der Niederlande, Amsterdam); C. Gil-Lamaignere und F.-M. Müller (Kinderklinik der Universität Heidelberg); A. D. Ho (Medizinische Klinik V, Heidelberg) Die Regulation des Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen murinen Modellen für Inflammation, Autoimmunität und Tumorkontrolle. L-Arginin kann zum einen durch das induzierbare Enzym Stickstoffmonoxid-Synthase (inos) zum zytotoxischen Effektormolekül NO umgesetzt werden. In einem alternativen Stoffwechselweg wird L-Arginin durch das Enzym Arginase zu Ornithin und Harnstoff hydrolysiert. Durch Kompetition um das gemeinsame Substrat limitiert die Arginase somit die Synthese des v.a. proinflammatorisch wirkenden NO und stellt somit einen möglichen antiinflammatorischen Stoffwechselweg dar. Vom Ornithin ausgehend werden Polyamine und Prolin synthetisiert, welche essentiell für Zellproliferation bzw. Kollagensynthese sind. Die Arginase steht somit vermutlich im Zentrum von Prozessen der Geweberegeneration, Synthese von Extrazellularmatrix und Steuerung von Entzündung. In früheren Arbeiten hatten wir demonstriert, daß die Enzyme inos und Arginase in murinen Makrophagen und dendritischen Zellen durch TH1 Zytokine (inos) bzw. TH2 Zytokine (Arginase) streng dichotom induziert werden (Munder et al., J.Immunol. 1998, 160:5347). Ferner konnten wir zeigen, daß selektiv das hepatische Isoenzym der Arginase (Arginase I) in den erwähnten myeloischen Zellen reguliert wird (Munder et al.,

357 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie J.Immunol. 1999, 163:3771). Im letzten Jahr nun dehnten wir unsere Untersuchungen auch auf murine Granulozyten aus und zeigten erstmals, daß auch in dieser quantitativ bedeutsamsten Leukozytenfraktion die zytosolische Arginase I durch TH2 Zytokine induziert wird (M. Munder et al., Manuskript in Vorbereitung). Die Regulation der Arginase im humanen Immunsystem unterscheidet sich fundamental vom murinen System. Durch Auftrennung humaner Leukozyten in die einzelnen zellulären Linien wurde klar, dass das Enzym selektiv in Granulozyten (PMN) exprimiert wird (M. Munder, Manuskript in Vorbereitung). ImGegensatz zum murinen System ist es in den PMN bereits konstitutiv mit hoher Enzymaktivität vorhanden. Wir konnten ferner die subzelluläre Lokalisation aufklären und zeigen, dass die humane Granulozyten-Arginase in den azurophilen Granula exprimiert ist. Eine mögliche Funktion im Rahmen der Phagozytose und Zytotoxizität humaner Granulozyten wurde ebenfalls aufgeklärt (M. Munder, Manuskript in Vorbereitung). Neben diesen zellbiologischen Untersuchungen studierten wir an einer Kohorte von 50 Patienten nach allogener Stammzelltransplantation die Regulation der humanen PMN Arginase im Rahmen verschiedener inflammatorischer Zustände (G. Doschko, Manuskript in Vorbereitung). Augenblicklich interessieren wir uns für weitere mögliche Funktionen der humanen PMN Arginase sowie physiologische Induktoren und Suppressoren des Enzyms sowie die assoziierten intrazellulären Signaltransduktionswege. 2. Regulatorische humane CD4+CD25+ T-Zellen im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation und Graft-versus-Host Erkrankung M. Munder, S. Karakhanova, T. Luft, M. Görner, M. Schneider Kooperationspartner: L. Nicholson (Universität Bristol, England, UK); A. D. Ho (Medizinische Klinik V, Heidelberg) Zusatzfinanzierung: Amgen Die allogene Stammzelltransplantation ist für verschiedene hämatologische oder genetische Erkrankungen eine wichtige und oftmals die einzige kurative Therapieoption. Eine der wesentlichen Komplikationen der Methode besteht in der Abstoßungsreaktion der transplantierten Zellen gegenüber dem Empfänger (Graft-versus-Host Erkrankung, GvHD). Je nach Konditionierung und HLA-Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger entwickeln 25-75% der transplantierten Patienten eine GvHD, welche nicht nur zu einer wesentlichen Einschränkung an Lebensqualität führt, sondern auch mit beträchtlicher Mortalität verbunden ist. Man geht davon aus, daß die GvHD durch eine Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten des Spenders ausgelöst wird, wobei die genauen Pathomechanismen nach wie vor unklar sind. In den letzten Jahr wurde im murinen und humanen Immunsystem eine suppressorische CD4+ T-Zellpopulation charakterisiert, welche sich durch konstitutive Expression von CD25 auszeichnet. In verschiedenen murinen Krankheitsmodellen wurde gezeigt, dass ein Verlust der CD4+CD25+ T-Zellen zu Auto- oder Alloimmunität führt. Wir analysierten daher an einer Kohorte von 30 Patienten im ersten Jahr nach allogener Stammzelltransplantation engmaschig (alle 14 Tage) mittels Durchflusszytometrie das T-Zell-Kompartiment im peripheren Blut. Es zeigte sich, daß das Auftreten von GvHD mit einer Reduktion der CD4+CD25+ Suppressorzellen assoziiert ist (M. Schneider, Manuskript in Vorbereitung). In einem weiteren Pilotprojekt Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie wurde klar, dass möglicherweise auch eine Störung der Funktionalität der CD4+CD25+ Zellen mit GvHD vergesellschaftet ist (S. Karakhanova, Manuskript in Bearbeitung). Die CD4+CD25+ Zellen stellen daher möglicherweise ein potentes zelluläres Therapeutikum zur gezielten Immunsuppression bei Auto- und Alloimmunität dar. Wir begannen mit der Etablierung eines Protokolls zur optimalen ex vivo Expansion dieser physiologisch anergen T-Zellpopulation. Im Rahmen der oben skizzierten Analyse der allogen transplantierten Patienten wurde ferner eine umfangreiche Materialdatenbank aufgebaut, welche als Grundlage zukünftiger Untersuchungen zur Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation dienen wird. Transgene Tiermodelle J. Schenkel Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Angel Alonso DKFZ, Dr. Jörn Coers Univ. Basel, Schweiz, Dr. Richard Jäger Univ. Bonn, Dr. Kirsten Kabsch DKFZ, Dr. Svetlana Karakhanova DKFZ, Michaela Hipp DKFZ, Dr. Andrea Mohr Univ. Ulm, Prof. Dr. Radek Skoda Univ. Basel, Schweiz, PD Dr. Johannes Vogel Univ. Zürich, Schweiz, PD Dr. Markus A. Weigand Univ. Heidelberg, Dr. Ralf Zwacka Univ. Ulm Transgene Tiermodelle zur Hämatopoese In Kooperation mit J. Coers, S. Karakhanova und R. Skoda Zum besseren Verständnis der Rolle des hämatopoetischen Potentials von Stammzellen haben wir eine Vielzahl von transgenen Tieren entwickelt, um die während der Differenzierung aktivierten Vorgänge zu verstehen. Derzeit sind wir in Heidelberg dabei, die für diese Modelle erforderlichen Mehrfachmutanten zu etablieren. Um die Rolle des Thrombopoetinrezeptors in Mausmodellen zur essentiellen Thrombozytose zu studieren, haben wir verschiedene punktmutierte Rezeptorgene in entsprechende Mausmutanten eingefügt, die Analyse dieser Tiere ist derzeit in Arbeit. Ein anderer Ansatz versucht Veränderungen im Splicing des Rezeptorgens mit Krankheiten zu assoziieren, hierzu haben wir auch Mausmodelle etabliert, die derzeit getestet werden. Die Rolle des E2 Proteins bei der Regulation der Aktivität des humanen Papilloma Virus Typ 11 (HPV-11) In Koperation mit A. Alonso, K. Kabsch und M. Hipp Ziel dieses Vorhabens ist, den Einfluss des E2 Proteins des HPV-11 auf die Genexpression der Wirtszelle zu verstehen. Mit Hilfe eines Reportergenkonstrukts wurde bereits die Aktivität des HPV-11 untersucht (Schenkel et al., 1999; Protopapa et al., 1999). Dabei erhielten wir eine spezifische Expression sowie eine Aktivierung nach verschiedenen Stimuli, nur die Reportergenaktivität war nicht in allen zu erwartenden Zielgeweben zu finden. Das dürfte u.u. daran liegen, daß in diesem Modell weder natürliches Wirtsnoch Virusprotein vorhanden sind. Um die Rolle von HPV-11 E2 in vivo untersuchen zu können, wurde das entsprechende Gen unter Kontrolle des humanen Ubiquitin C Promotors zur Generierung transgener Tiere verwendet. Wir erhielten mehrere Foundertiere, erwartungsgemäß wurden in einer Vielzahl von Geweben in der RT-PCR ein Signal gefunden, nicht das Transgen exprimierende Gewebe wurden nicht nachgewiesen, eine Quantifizierung des Genprodukts steht noch aus. Zum immunochemischen Nachweis des Transgens HPV-11 E2 haben wir in Kaninchen Antiseren generiert, die gegen 357

358 358 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie das native bzw. das denaturierte Protein gerichtet sind. Mit diesen Antikörpern werden derzeit die Expressionsmuster des Transgenprodukts getestet. Da E2 für die Virusaktivierung essentiell ist, wollen wir in doppelt transgenen Mäusen dieses Phänomen weiter untersuchen, hierzu müssen doppelttransgene Tiere gezüchtet werden, die HPV-11 E2 und das o.g. Reportergen tragen. Studien zur Neurodegenration In Kooperation mit J. Vogel und M. Weigand Mehrere Vorhaben beschäftigen sich mit den (molekularen) Folgen verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, die im Tiermodell simuliert werden. Zentrale Rolle spielt dabei die Aktivierung des c-jun Transkriptionsfaktors, den wir mit verschiedenen transgenen Mausmodellen untersuchen. Da eine Inaktivierung von c-jun zur Letalität führt, nutzen wir konditionale Modelle sowie Tiere, deren Transgen c-jun indirekt beeinflußt. Vermutlich gibt es ein Gleichgewicht zwischen c-jun und den Proteinen, die dessen Expression und Aktivierung beeinflussen können. Kommt es hier zu Verschiebungen, so verändert sich das Ausmaß des neurodegenrativen Ereignisses [22]. Neue transgene Tiermodelle in Kooperation mit R. Jäger, A. Mohr und R. Zwacka Um den experimentellen Nachweis der Beteiligung von Caspasen an der Apoptose im Brustepithel während der verschiedenen Phasen der Brustdrüsenentwicklung, insbesondere der postlaktationalen Involution zu erbringen wurden transgene Tiere generiert, die den Breitband-Caspasen- Inhibitor p35 aus Baculovirus unter der Kontrolle des Brustdrüsenspezifischen WAP-Promoters exprimieren. Aus fünf transgenen Founderlinien zeigt eine stärkere Transgenexpression, sie dient den genannten Experimenten. Da nicht alle Apoptosetypen durch Bcl-2 unterdrückt werden können, sollen die Tiere auch mit den bereits publizierten WAPbcl-2-Transgenen verglichen werden (Jäger et al., 1997 Oncogene 15: ). Caspase-8L ist eine anti-apoptotisch wirkende Splicevariante der Caspase-8. Sie ist vor allem in haematopoetischen Stammzellen exprimiert und wirkt dort als Schutzmechanismus, der diese Zellen vor dem Zelltod bewahrt. Während der Differenzierung in der Haemtopoese schalten die Zellen auf Caspase-8 um und können so wieder über Apoptose reguliert werden. Zur Überprüfung, ob eine fehlerhafte, andauernde Expression von Caspase-8L an der Pathogenese von lymphoproliferativen Krankheiten beteiligt ist, haben wir eine transgene Maus generiert die Caspase-8L in T-Zellen überexprimiert. Um ein Tiermodell für das anaplastische Lymphom zu schaffen, wurden transgene Mäuse generiert, die das beteiligte Onkogen p80 (ein aus einer Chromosomentranslokation resultierendes Fusionsprotein aus Nucleophosmin und der ALK-Kinase) unter der Kontrolle des thymocyten-spezifischen lck-promoters tragen. Von sechs Foundertiere fielen drei durch ungewöhnliches Größenwachstum auf. Eines verstarb an multiplen Lymphomen, die beiden übrigen Tiere aus nicht geklärter Ursache (keine Tumoren). Es gelang nicht, aus den Foundertieren transgene Linien zu etablieren. Der Transkriptionfaktor TCF/LEF ist hyperaktiv in vielen Kolorektalkarzionomen. Dies liegt an häufig auftretenden Mutationen im APC - (adenomatous polyposis coli) Gen, welches normalerweise β-catenin negativ reguliert. Mutiertes APC ist dazu nicht mehr in der Lage und es kommt zur Akkumulation von β-catenin, das wiederum an TCF/LEF Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie bindet und dadurch seine Aktivität als Transkriptionsfakor erhöht. Dieser Prozess ist an der Krebsentstehung beteiligt. Um die Prozesse und mögliche Interventionsmöglichkeiten im Tiermodel untersuchen zu können haben wir eine TCF/ Lef-1 Reportermaus generiert. Publikationen (* = externer Koautor) [1] T. Luft, M. Moos, H. Goldschmidt, A.D. Ho* and M. Görner. Dissociation of putative graft-versus-hematopoiesis and graftversus-myeloma effects in patients with rapidly progressive multiple myeloma. Br J Haematol Nov;123(4): [2] Luft, T., Jefford, M., Luetjens, P., Toy, T., Hochrein, H., Masterman, KA., Maliszewski, C., Shortman, K., Cebon, J., and Maraskovsky, E. Functionally distinct DC populations induced by physiologic stimuli: Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) regulates the migratory capacity of specific DC subsets. Blood 2002, 100(4): , BMN evaluation: e** [3] Luft, T., P. Luetjens, H. Hochrein, K. Shortman, F. Masterman, M. Rizkalla, C. Maliszewski, J. Cebon, and E. Maraskovsky. Interferon-alpha (IFN-a) enhances CD40L-mediated activation of immature McDC. Int Immunol Apr 14(4): [4] Luft, T., M. Jefford, P. Luetjens, H. Hochrein, K. Masterman, C. Maliszewski, J. Cebon, and E. Maraskovsky. IL-1b enhances CD40L-mediated cytokine secretion by human Dendritic Cells (DC) - a mechanism for T cell independent DC activation. J Immunol Jan15; 168(2): [5] Luft T, Mark Rizkalla, Tsin Yee Tai, Qiyuan Chen, Roderick I. McFarlan*, Ian D. Davis, Eugene Maraskovsky and Jonathan Cebon. Exogenous peptides presented by TAP-deficient and TAP-competent cells: Intracellular loading and kinetics of presentation. J Immunol Sep 1;167(5): [8] *M. Jefford, *M. Schnurr, *T. Toy, *K.A. Masterman, *A. Shin, *T. Beecroft, *T. Yee Tai, *K. Shortman, *M. Shackleton,*I. D. Davis, *P. Parente, T. Luft, *W. Chen, *J. Cebon and *E. Maraskovsky: Functional comparison of DC generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: Differential regulation by specific classes of physiologic stimuli. Blood Sep 1;102(5): [9] M. Görner, R. Weber-Nordt, S. Höpfner, A. Benner, T. Luft, *A.D. Ho: Addition of a low fixed number of CD3+ cells to CD34- enriched allografts: Effects on engraftment, GvHD and survival after related and unrelated peripheral stem cell transplantation. J Hematother Stem Cell Res Jun;12(3): [10] Görner, M., Kordelas, P., Thalheimer, M., Luft, T., Pfeiffer, S., Ustaoglu, F., Punzel, M., Weber-Nordt, R., Moos, M., Goldschmidt, H., Ho, AD. Stable mixed chimerism after T cell-depleted allogeneic hematopoietic stem cell transplantation using conditioning with low-dose total body irradiation und fludarabin. Bone Marrow Transplant Apr, 29(7): [11] Munder, M., *E. Bettelli, *L. Monney,* J.M. Slavik, *L.B. Nicholson, and *V.K. Kuchroo. Reduced self-reactivity of an autoreactive T cell after activation with cross-reactive non-selfligand. J Exp Med : ] *Kuchroo, V.K., *A.C. Anderson, *H. Waldner, M. Munder, *E. Bettelli, and *L.B. Nicholson T cell response in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE): role of self and cross-reactive antigens in shaping, tuning, and regulating the autopathogenic T cell repertoire. Annu Rev Immunol :101. [13] Munder M, Mallo M, Eichmann K, Modolell M. Direct stimulation of macrophages by IL-12 and IL-18 - a bridge built on solid ground. Immunol Lett Jan 1; 75(2): [14] Marti, A., Ritter, P.M., Jäger, R., Lazar, H., Baltzer, A., Schenkel, J., Declerq, W., Vandenabeele, P. and Jaggi, R.: Mouse mammary gland involution is associated with cytochrome c release and caspase activation, Mech. Develop. 104 (1-2), (2001).

359 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E160 Molekulare Hämatologie/Onkologie [15] Martin-Villalba, A., Hahne, M., Kleber, S., Vogel, J., Schenkel, J. and Krammer, P.H.: Therapeutic neutralization of CD95-ligand and TNF attenuates brain damage in stroke, Cell Death Differ. 8, (2001). [16] Schenkel, J: Versuchstierkunde, Fernstudium Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2001, ISBN [17] Becker, L., von Wegerer, J., Schenkel, J., Zeilhofer, H.U., Swandulla, D., and Weiher, H.: Disease specific human GlyR alpha1 subunit causes Hyperekplexia phenotype and impaired glycine- and GABA-A receptor transmission in transgenic mice ; J. Neurosci. 22(7), (2002). [18] Zhang, W., Thomas, D., Karle, C.A., Kathöfer, S., Schenkel, J., Kreye, V.A.W., Ficker, E., Wible, B.A., and Kiehn, J.: Protein kinase A-mediated phosphorylation of HERG potassium channels in a human cell line, Chin. Med. J. (Engl) 115 (5), (2002). [19] Winter, C., Weiss, C., Martin-Villalba, A., Zimmermann, M. and Schenkel, J.: JunB and Bcl-2 overexpression results in protection against cell death of nigral neurons, Brain Res. Mol. Brain Res. 104 (2), (2002). [20] Hartenstein, B., Teurich, S., Hess, J., Schenkel, J., Schorpp- Kistner, M. and Angel, P.: Th2 Cell Specific Cytokine Expression and Allergen-Induced Airway Inflammation depend on JunB, EMBO J., 21 (23), (2002). [21] Kabsch, K., Mossadegh, N., Kohl, A., *Komposch, G., Schenkel, J., Alonso; A., and Tomakidi, P.: The HPV-16 E5 protein inhibits TRAIL- and FasL-mediated apoptosis in human keratinocyte raft cultures. Intervirology, 47 (1), (2004). [22] Schenkel, J.: Activation of the c-jun Transcription Factor following Neurodegeneration in vivo, Neuroscience Lett.361, (2004). 359

360 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E170 Molekulare Onkologie/Pädiatrie Klinische Kooperationseinheit Molekulare Onkologie/Pädiatrie (E170) Leiter: Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin (Ulm, - 12/03); stellvertretend: PD Dr. rer. nat. Ingrid Herr 360 Wissenschaftliche Mitarbeiterin Stella Okouoyo (AIP) Doktoranden Esat Ucur (DFG) Till Wenger (01 -, DFG) Diplomanden Michael Zepp (02 - ) Chengwen Zhang (03 - ) Technische Assistentin Melanie Motsch Sekretariat Rosemarie Pfüger Die Klinische Kooperationseinheit Molekulare Onkologie/ Pädiatrie arbeitet an der Umsetzung molekularer Konzepte der Apoptoseregulation in die Klinik und dabei insbesondere in die pädiatrische Onkologie. Aktuelle Forschungsschwerpunkte befassen sich mit der Regulation von Apoptosesignalwegen, die durch eine zytotoxischen Tumortherapie induziert werden. Diese Untersuchungen werden jetzt erstmalig in klinische Studien (Kompetenznetz Pädiatrische Onkologie des BMBF) zur Analyse von Chemoresistenzmechanismen eingeführt. Das Forschungsprogramm konzentriert sich auf die klinischen Implikationen grundlegender Erkenntnisse zur Regulation von Zelltod durch Rezeptor-abhängige Signalwege und mitochondriale Faktoren. Die Entwicklung des Forschungsprogramms in den vergangenen Jahren hat gezeigt, dass Erkenntnisse der Apoptoseforschung in Zellsystemen bei der Diagnose und Behandlung von Tumorerkrankungen von Bedeutung sind. Wie unsere bisherigen Studien zeigen, spielen Apoptosemechanismen weiterhin eine Rolle bei der Ischämie, lymphoproliferativen Erkrankungen, bei der HIV-Infektion, bei Autoimmunerkrankungen und schweren immunologischen Komplikationen im Rahmen allogener Knochenmarktransplantationen. Forschungsschwerpunkte: Die KKE Molekulare Onkologie/Pädiatrie besteht seit 1995 und die Projekte sind fokussiert auf den Transfer von Ergebnissen der Grundlagenforschung in die Klinik. Folgende Schwerpunkte werden seither analysiert: - Identifizierung von Schlüsselmolekülen des Apoptose Signalwegs, die über die Sensitivität oder Resistenz gegenüber einer zytotoxischen Tumortherapie bestimmen. - Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen durch neue zytostatische Stoffe (Betulinsäure, Rocaglamide) oder Transfer von Apoptosegenen. - Bedeutung von Apoptosesignalwegen bei Gehirn- und Herzinfarkt mit Fokus auf die Entwicklung therapeutischer Strategien. - Analyse von Mutationen in Apoptosegenen bezüglich ihrer Bedeutung für hämatopoietische und lymphoproliferative Erkrankungen und Tumoren. - Modulation der Apoptose in T Zellen bei Immundefizienz (HIV) und Immunsuppression. Nachfolgende sind aktuelle Projekte beschrieben, die von der Arbeitsgruppe am DKFZ momentan bearbeitet werden. Einige der oben genannten Forschungsschwerpunkte werden ausschließlich an der Universitäts Kinderklinik Ulm analysiert und sind deshalb hier nicht detailliert beschrieben. Kooperationspartner Universitäts Kinderklinik Ulm: Dr. A. Mohr, Dr. Carl, F. Classen, Eva Jacobsen Intern: Prof. Dr. P. Angel, Prof. Dr. P. Altevogt, Prof. Dr. H.-J. Gröne, Dr. K. Herzer, Prof. Dr. P. Krammer, Prof. Dr. P. Lichter, Dr. A. Martin-Villalba, Dr. J. Mattern, Dr. G. Moldenhauer, Dr. R. Ridder, PD Dr. J. Schenkel, Prof. Dr. G. Schütz, Prof. Dr. M. von Knebel-Doeberitz Universität Heidelberg: Dr. P. Büchler/Chirugie, Prof. Dr. V. Ewerbeck/Orthopädie, Dr. J. Fellenberg/Orthopädie, Prof. Dr. H. Friess/Chirugie, PD Dr. N. Gassler/Pathologie, Dr. A. Marmé/Frauenklinik, Prof. Dr. A. Kulozik/Kinderklinik Extern national: Dr. B. Baumann, Ulm; Prof. Dr. Berthold, Köln; Dr. W. Bodenmüller, Grenzach, Prof. Dr. H. Döhner, Ulm; Prof. Dr. W. Friedrich, Ulm; Prof. Dr. T. Gress, Ulm; Prof. Dr. T. Herdegen, Kiel; Prof. Dr. G. Janka-Schaub, Hamburg; Dr. I. Jeremias, München, Dr. C. Kupatt, München; Prof. Dr. W-D Ludwig, Berlin; Dr. S. Müller, Ulm; Dr. A. Schulz, Ulm; Prof. Dr. M. Weller, Tübingen; Prof. Dr. T. Wirth, Ulm, Dr. R. Zwacka, Ulm. Extern international: Prof. Dr. G. Brodeur, Philadelphia, USA; Prof. Dr. A. Fischer, Paris, Frankreich; Dr. M. L. Gougeon, Paris, Frankreich; Prof. Dr. J. Hickman, Paris, Frankreich; Dr. G. Kroemer, Villejuif, Frankreich, Prof. Dr. G. Melino, Rom, Italien; Dr. L. Di Marzio, L Aquila, Italien; Dr. G. Nunez, Ann Arbor, USA; Prof. Dr. M. Piacentini, Rom, Italien; Dr. A. Pulte, New York, USA, Prof. Dr. X. Wang, Texas, USA.

361 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie 1. Glukokortikoide in der Tumortherapie I. Herr, E. Ucur, S. Okouoyo, C. Zhang, T. Wenger und K.-M. Debatin Synthetische Glukokortikoide (GKs), wie das hoch wirksame Dexamethason, gelten als unverzichtbar in der adjuvanten Tumortherapie, weil sie gefürchtete Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen und Ödembildungen mildern und sich positiv auf das Allgemeinbefinden der Patienten auswirken. GKs wirken proapoptotisch auf lymphoide Tumorzellen und schützen gleichzeitig normales Gewebe vor zytotoxischen Nebenwirkungen. Erst durch hochdosierte GKs war eine Revolution des Therapieerfolgs bei vielen Karzinomen möglich, weil ausreichend hohe Konzentrationen an Chemotherapeutika verabreicht werden konnten. Deshalb werden GKs bei zahlreichen Tumorerkranungen vor, während und nach einer zytotoxischen Therapie angewendet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass GKs nicht nur normale Zellen, sondern auch bestimmte Karzinome vor der zytotoxischen Wirkung schützen können. In der Anwesenheit von GKs wachsen humane Zervix- und Lungenkarzinomzelllinien, in vitro und als Xenotransplantate auf Mäusen, trotz Chemotherapie- oder Radiatio schneller als ohne GKs. Dieses Prinzip läßt sich jedoch nicht generell auf solide Tumoren anwenden. Während die meisten, jedoch nicht alle der bislang in Zellkultur untersuchten Lungen-, Zervix-, Ovarial-, Pankreas- und Prostatakarzinome sowie Neuroblastome mit einer Resistenz reagierten, erwiesen sich Colonund Mammakarzinome weiterhin als sensitiv für die Induktion von Apoptose. Wir konnten Schlüsselmoleküle des Apoptosesignalwegs identifizieren, die durch GKs antiapoptotisch und differentiell reguliert werden. Die Vermutung liegt nahe, dass die durch GKs ausgelöste Resistenz sich negativ auf die Behandlung von Tumorpatienten auswirken könnte und die betroffenen Tumoren möglicherweise sogar einen Selektionsvorteil erhalten. Warum bestimmte Tumoren mit einer Resistenz auf GKs reagieren, während andere sensitiv bleiben, ist noch völlig unbekannt und Gegenstand unserer laufenden Forschungsarbeiten. Im Rahmen von Kooperationen mit Heidelberger Klinikern ist innerhalb des Comprehensive Cancer Center ein Prognosetest und eine Klinische Studie geplant. 2. Defekte in Apoptosesignalmolekülen als Ursache einer Therapieresistenz I. Herr, S. Okouoyo, E. Ucur und K.-M. Debatin Bestimmte Tumorerkrankungen lassen sich anfangs gut mit Bestrahlung oder Chemotherapie bekämpfen, sprechen mit der Zeit aber zunehmend schlechter auf die Behandlung an. Wie wir nun gezeigt haben, kann die Ursache dieser so genannten Therapieresistenz an zahlreichen gleichzeitig auftretenden Defekten des Apoptoseprogramms der malignen Zellen liegen. Bei therapieresistenten Tumorzellen ist der Selbstzerstörungsmechanismus gestört, der allen Körperzellen genetisch einprogrammiert ist. Als eine Art natürliche Notbremse dient die Apoptose dazu, geschädigte Zellen zu beseitigen, bevor sie zu malignen Zellen entarten können. Auch Krebstherapien nutzen diesen Mechanismus, indem sie Tumorzellen durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika schädigen und dadurch in den Selbstmord treiben. Da sich die molekularen Mechanismen der Therapieresistenz nicht an Patienten analysieren lassen, wurden humane Lungentumorzellen als Xenografts auf Mäusen kultiviert. An diesem Modell wurde untersucht, Klinische Kooperationseinheit E170 Molekulare Onkologie/Pädiatrie welchen Effekt eine wiederholte Chemotherapie auf die Tumorapoptose hat. Erwartungsgemäß starben zunächst viele Tumorzellen ab, doch nach mehreren Therapiezyklen wuchsen die Tumoren immer schneller. Die Krebszellen wurden also resistent, genau wie man es von Lungenkrebspatienten kannte. Um einen Anhaltspunkt für den Resistenzmechanismus zu finden, wurde die mrna Expression von mehr als tausend Genen in den Tumorzellen mithilfe eines speziellen Apoptosefilters analysiert. Es stellte sich heraus, dass resistente Tumorzellen ihre verhängnisvolle Überlebensfähigkeit nicht wie angenommen einem Defekt in einzelnen Selbstmordgenen verdanken. Vielmehr ist die lange Befehlskette, welche letztlich zum Selbstmord führt, an vielen Stellen gestört. Die Folge: Das Selbstmordprogramm stürzt gewissermaßen ab und die entscheidenden Komponenten am Ende des Signalwegs, so genannte Caspase-Moleküle, werden gehemmt. Durch die blockierten Selbstmord-Moleküle erlangt die Tumorzelle ihre fatale Unsterblichkeit und wird therapieresistent. Vermutlich gelten diese an Lungentumoren gewonnenen Erkenntnisse auch für andere Krebsformen. Deshalb zielen unsere zukünftigen Therapiestrategien nicht darauf ab, einzelne Fehler in der Signalkette des Selbstmordprogramms zu reparieren. Erfolg versprechender erscheint eine Aktivierung der blockierten Caspasen am Ende der Kette, um so die zahlreichen anderen Defekte im Selbstmordprogramm zu überbrücken. 3. Lentiviraler Gentransfer +/- RNAi I. Herr, T. Wenger, E. Zepp, M. Jacobsen und K.-M. Debatin Die Chemotherapie ist neben der Bestrahlung und Operation eine der wichtigsten Säulen in der Behandlung maligner Zellen. Allerdings sind die Nebenwirkungen groß und intakte Apoptosesignalwege sind die Voraussetzung für einen Erfolg. Eine Therapieresistenz, die häufig durch defekte Apoptosemechanismen verursacht wird, kann den Effekt der Behandlung verhindern. Die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien ist deshalb von größter klinischer Bedeutung. Wir verwenden momentan Lentiviren, um Apoptosegene in Tumoren zu aktivieren bzw. um diese durch die lentiviral vermittelte RNAi Methode zu hemmen. Um Nebenwirkungen auf normales Gewebe zu vermeiden, testen wir im Kontext der lentiviralen Vektoren Tumor- und Gewebe-spezifische Promotoren. Um die Expression des therapeutischen Gens an- und abschaltbar zu machen, klonieren wir zusätzlich Elemente des Tet-Systems in die lentiviralen Vektoren. Folgende Projekte mit lentiviralen Vektoren werden momentan bearbeitet: Expression von TRAIL mittels lentiviraler Vektoren: Der Todesligand TRAIL wurde in einen lentiviralen Vektor kloniert. Mit diesem Vektor konnte membranständiges TRAIL in Tumorzellinien überexprimiert und auf diese Weise Zell-Zell-Kontakt abhängig Apoptose induziert werden. Interessanterweise werden transduzierte Zellen, die TRAIL überexprimieren resistent gegen TRAIL-induzierte Apoptose und sterben selbst nicht ab, sondern können lediglich parakrinen Zelltod vermitteln. Die Resistenz beruht auf spezifischer Repression der Oberflächenexpression der TRAIL- Rezeptoren. CD95-L und Prävention einer Graft-versus Host Disease: Der Todesligand CD95-L wurde in einen lentiviralen Vektor kloniert und rekombinantes Virus angereichert. Mit diesem wurden humane B-Zelllinien und primäre Fibro- 361

362 362 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie blasten transduziert. Diese sind in der Lage, spezifisch alloreaktive T-Zellen zu depletieren und sollen nun für die Prävention einer Graft-versus Host Disease in einem klinischen Transplantationssetting an der Kinderklinik Ulm eingesetzt werden. Lentivirale Vektoren in der Neurologie: In Zusammenarbeit mit der AG Prof. P. Krammer soll das lentivirale System zur Überexpression anti-apoptotischer Proteine bzw. zur Hemmung pro-apoptotischer Proteine durch RNAi in primären Neuronen im Rahmen eines Modells für Querschnittlähmung und für Hirnschlag verwendet werden. Wir haben mithilfe dieser lentiviralen Vektoren Transduktionsraten von über 95% in primären Neuronen erzielt. Diese hohe Transfektionseffizienz konnte bisher mit keinem anderen Gentransfersystem bei neuronalen Zellen erreicht werden. Das lentivirale System zur Expression, bzw. das lentivirale RNAi System zur Inhibition von Apoptosegenen bietet daher einen vielversprechenden Ansatz zur therapeutischen Intervention in der Neurologie. Lentivirales RNAi System: In Zusammenarbeit mit der AG Prof. G. Schütz wurde das lentivirale RNAi System etabliert. Während Prof. Schütz diese Methode zur Herstellung von Knock-Out Mäusen verwenden möchte, wollen wir damit anti-apoptotische Gene in Tumoren hemmen und diese dadurch für eine zytotoxische Therapie sensitivieren. In Zusammenarbeit mit der AG Prof. P. Altevogt soll ebenfalls ein retrovirales RNAi System zur Hemmung des L1 Gens, das zur Resistenz von Ovarkarzinomen beiträgt, etabliert werden. Die Arbeiten sind gerade angelaufen. Desweiteren sollen Gene, die für eine Apoptoseresistenz primärer T- Zellen verantwortlich sind, in diesen Zellen mit Hilfe der Lentiviren überexprimiert oder durch die lentivirale RNAi- Technik ausgeschaltet werden. In primären T-Zellen ist das lentivirale System ebenfalls anderen bisher verwendeten Gentransfersystemen weit überlegen. Lentiviren zur Transduktion von Stammzellen: Lentiviren eigenen sich sehr gut um Stammzellen zu transduzieren, die allgemein als sehr schlecht manipulierbar gelten. In einem Kooperationsprojekt mit Prof. Friess und Dr. Büchler von der Chirugie und Prof. Ho laufen momentan Versuche an, mithilfe von Lentiviren humane gereinigte Stammzellen zu transduzieren. 4. Induktion von Apoptose in Tumorzellen durch konditional TRAIL-exprimierende T Zellen I. Herr, E. Ucur, S. Okouoyo, T. Wenger und K.-M. Debatin In einer alternativen Gentransferstudie verwenden wir ein neuartiges Werkzeug, das in der Tumortherapie eingesetzt werden kann. Konditional TRAIL (TNF-related apoptosisinducing ligand) exprimierende Jurkat Zellen wurden konstruiert, die sowohl in vitro als auch in vivo Apoptose in Tumorzellen induzieren. Die regulierte Expression von TRAIL wurde angestrebt, da dieses proapoptotische Molekül in einer Vielzahl von Tumorzellen Apoptose induziert, aber als nicht toxisch für das gesunde Gewebe beschrieben ist. Die konditionale TRAIL-Expression wurde durch die Verwendung des Tet-On Genexpressionssystems erreicht. Hierzu wurde die komplette Sequenz von TRAIL in Jurkatzellen eingeführt. Anschließend wurden TRAIL-resistente Zellklone isoliert, die nach Inkubation mit Tetrazyklin das Protein überexprimierten. Die regulierte TRAIL-Expression in den transfizierten Zellen wurde auf RNA- und auf Proteinebene detektiert. Mithilfe dieses Systems kann spezifisch parakrine Klinische Kooperationseinheit E170 Molekulare Onkologie/Pädiatrie Apoptose in Tumorzellen induziert werden, während die TRAIL-exprimierenden Zellen selbst einen Resistenzmechanismus entwickeln und überleben. In einem Mausmodell wurden Xenotransplantate lokal mit Jurkat-TRAIL-Zellen behandelt. Nach Anschalten der Expression von TRAIL durch die Beigabe von Tetrazyklin ins Trinkwasser der Mäuse kam es zu einem deutlich verzögerten Tumorwachstum. In vitro zeigten TRAIL-Killerzellen einen synergistischen Effekt in Kombination mit Chemotherapeutika. In Zukunft könnten konditional TRAIL-exprimierende Killerzellen, die zielgerichtet, z.b. mithilfe bispezifischer Antikörper, zu Tumoren gelenkt werden, konventionelle Therapien ergänzen oder teilweise ersetzen. Publikationen (DKFZ-Gruppe hervorgehoben) [1] Baumann B, Bohnenstengel F, Herr I, Debatin K-M, Proksch P and Wirth T. (2002). Rocaglamide derivates are potent inhibitors of NF-κB activation in T cells. J. Biol. Chem, 277, [2] Herr I, Ucur E, Herzer K, Okouoyo S, Ridder R, Krammer, PH, Knebel-Doeberitz M and Debatin K-M (2003). Glucocorticoid co-treatment induces apoptosis resistance towards cancer therapy in carcinomas. Cancer Research, 63, [3] Classen CF, Falk CS, Friesen C, Fulda S, Herr I and Debatin K-M (2003). Natural killer resistance of a drug-resistant leukemia cell line, mediated by upregulation of HLA class I expression. Haematologica, 88, [4] Krilleke D, Ucur E, Pulte D, Schulze-Osthoff K, Debatin K- M and Herr I (2003). Inhibition of JNK signaling diminishes early but not late cellular stress-induced apoptosis. Int. J. Cancer, 107, [5] Ucur E, Wenger T, Okouoyo S, Mattern J, Schroth A, Debatin K-M and Herr I (2003). Induction of apoptosis in experimental human B cell lymphomas by conditional TRAIL-expressing T Cells. Brit. J. Cancer, 89, [6] Okouoyo S, Ucur E, Mattern J, Debatin K-M and Herr I (2004). Rescue of death receptor and mitochondrial apoptosis signaling in resistant human NSCLC in vivo. Int. J. Cancer, 108, [7] Mohr A, Henderson G, Dudus L, Herr I, Debatin K-M, Fisher K and Zwacka RM. (2004). AAV-encoded expression of TRAIL in experimental human colorectal cancer leads to tumor regression. Gene Therapy, in press. [8] Bierbaum H, Baumann S, Herr I, Tuckermann JP, Hess J, Schorpp-Kistner M, Angel P. (2003). Early activation and induction of apoptosis in T cells is independent of c-fos. Ann NY Acad Sci, 1010, 225. [9] Debatin, K-M (2002). Zellzyklus und Apoptose. In Lehrbuch der Klinischen Onkologie. H.B. Huber, ed. (Heidelberg: Springer Verlag) [10] Debatin, K-M, Poncet, D., and Kroemer, G. (2002). Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene 21, [11] Fulda, S and Debatin, K-M (2002). Caspase activation upon therapy of cancer. In Caspases. AnonymousLanders Press. [12] Herr, I (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel Gentherapie, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press [13] Herr, I, Zwacka, R, Weiher, H (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel Chromatographie und Elektrophorese, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press [14] Herr, I, Zwacka, R, Weiher, H (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel Enzyme zur Modifikation von Nukleinsäuren, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press [15] Weiher, H, Zwacka, R, Herr, I (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel DNA/RNA Isolierung, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press [16] Weiher, H, Zwacka, R, Herr, I (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel Nukleinsäurehybridisierung, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press

363 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E170 Molekulare Onkologie/Pädiatrie [17] Zwacka, R, Herr, I, Weiher, H (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel PCR, Herausgeber: M. Wink, VCH- Verlag. in press [18] Zwacka, R, Herr, I, Weiher, H (2004). in Molekulare Biotechnologie, Kapitel DNA Sequenzierung, Herausgeber: M. Wink, VCH-Verlag. in press Patente (DKFZ-Gruppe) [19] European patent application (2002) Pharmaceutical composition containing caspase-8 and/or caspase-9 useful for overcoming glucocorticoid- and cancer therapy-induced apoptosis of tumors. Patentanmelder: DKFZ Heidelberg, Erfinder: Debatin, K-M, Herr, I [20] International patent application PCT/EP02/08927 (2002) Transfer of Caspase-8 and -9 restores apoptosis sensitivity of glucocorticoid-induced resistance of carcinomas to cancer therapy. Patentanmelder: DKFZ Heidelberg, Erfinder: Debatin, K-M, Herr, I [21] US patent application PCT/DE01/02707 (2002) Method for measuring JNK/SAPK activity by phosphorylation of transcription factors. Patentanmelder: DKFZ Heidelberg, Erfinder: Debatin, K-M, Herr, I [22] International patent application PCT/EP03/04039 (2003) Smac - peptides as anticancer therapeutics. Patentanmelder: DKFZ Heidelberg, Erfinder: Debatin, K-M, Fulda, S [23] Licence aggreement (2002) mit Calbiochem-Novabiochem Corp. über die Nutzung der Deutschen Patentanmeldung DE und der Internationalen Patentanmeldung PCT/ DE01/02707 Verfahren zur Messung der JNK/SAPK-Aktivität mittels der Bestimmung der Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren. Patentanmelder: DKFZ Heidelberg, Erfinder: Debatin, K-M, Herr, I Deutscher Krebsforschungspreis (2002) verliehen an Prof. K-M Debatin 363

364 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E180 Gastroenterologische Onkologie Klinische Kooperationseinheit Gastroenterologische-Onkologie (E180) Leiter: Prof. Dr. med. Matthias Löhr 364 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer.-nat. Ralf Jesenofsky Dr. rer.-nat. Ralf Faissner Dr. rer.-nat. Regine Brandt Dr. med. Jörg Ringel Dipl.-Biol. Ying Chen Doktoranden cand. med. Christiane Möhrcke cand. med. Katrin Wunder Gastwissenschaftler Dr. med. Vytautas Brasiunas, Kaunas, Litauen Dr. med. Milutin Bulajic, Belgrad, Jugoslawien Sander Botter B. Sc., Groningen, Niederlande Technische Assistenten Annette Funk, BTA Sarina Löffler, BTA Svetlana Sander-Naderi, MTA Sekretariat Renate Anger Die Klinische Kooperationseinheit für Molekulare Gastroenterologie/Gastroenterologische Onkologie (E180) wurde im Jahr 2003 zwischen dem DKFZ und der Fakultät für Klinische Medizin Mannheim beschlossen und befindet sich derzeit in der Gründungsphase. Sie ist hervorgegangen aus der Sektion für Molekulare Gastroenterologie an der II. Medizinischen Universitätsklinik in Mannheim, wo sie seit 2000 besteht. Der Schwerpunkt liegt in der Erforschung der molekularen Mechanismen der Karzinomentstehung von hepatopankreatobiliären Tumoren, speziell dem Pankreaskarzinom, sowie der Exploration neuer therapeutischer Modalitäten, z.b. mittels gentherapeutischer Ansätze. Die Karzinome der Gallenwege und des Pankreas zeichnen sich durch eine extrem schlechte Prognose aus. Dies kommt zustande durch die häufig zu späte Diagnose - es gibt keine Frühtests oder Marker - und die schlechten Ansprechraten auf Chemotherapie oder Bestrahlung. Lediglich die frühe Operation mit radikaler Entfernung des Tumors birgt die Chance der Heilung. Unsere Forschung fokussiert also auf frühen molekularen Markern sowie der Entwicklung neuer Behandlungsstrategien. Die Kernkompetenz der KKE liegt in der Isolation und Kultivation primärer normaler humaner Epithelzellen des Gastrointestinaltraktes sowie deren Transfektion und Transformation, der Asservierung, Aufbereitung (DNA, RNA, Proteine) und molekularen Diagnostik (PCR, DNA- Chip) klinischer Proben aus dem Gastrointestinaltrakt (Galle, Pankreassaft, endoskopische Biopsien) für Onkogene, Tumorsuppressorgene und potentielle Ko-Karzinogene sowie schließlich der klinischen Gentherapie mittels mikroverkapselter Zellen. Die Arbeitsfelder der Abteilung gliedern sich in fünf große Stränge (s. u.), denen einzelne Projekte zugeordnet sind, welche im folgenden abgehandelt werden.

365 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie 1. Gentherapie mit mikroverkapselten, CYP2B1- exprimierenden Zellen M. Löhr, G. Faulmann, J. Ringel, F.M. Hummel In Kooperation mit Dr. Robert Saller (Bavarian Nordic A/S, Kopenhagen, Dänemark), PD Dr. J. Schmidt (Chirurg. Univ. Klinik Heidelberg), PD Dr. S. Samel (Chirurg. Univ. Klinik Mannheim) Konventionelle Chemotherapie hat häufig heftige Nebenwirkungen für die Patienten, weswegen tumorbiologisch wirksame Dosen nicht gegeben werden können. Wir haben als neues Prinzip die lokalisierte, gentechnisch vermittelte Chemotherapie mit Ifosfamid (Holoxan ) entwickelt, welches durch ein Cytochrom P450 Subenzym, CYP2B1, in seine aktiven Metabolite verwandelt wird, entwickelt. Dabei werden Zellen mit diesem Gen transfiziert und anschließend mikroverkapselt. Diese verkapselten Zellen werden dann in den Tumor implantiert respektive im klinischen setting auf angiographischem Wege an den Tumor herangebracht. Es wird dann mit nierdig dosiertem Ifosfamide systemisch behandelt. Dieses Therapiesystem ist erfolgreich bereits klinisch beim Pankreaskarzinom angewandt worden. Derzeit laufen die Vorbereitungen für eine weiter klinische Studie sowie experimentelle Studien zu anderen Tumorentitäten (maligner Ascites). 2. Molekulare Diagnostik aus Pankreassaft und Galle F.M. Hummel, R. Jesenofsky, C. Möhrcke, M. Bulajic In Kooperation mit Dr. W.M. Schneider-Brachert (Univ. Regensburg), Prof. Dr. E.M. de Villiers (DKFZ, F070), Dr. H. Bartsch/Dr. J. Nair (DKFZ C010) Pankreassaft und Galle sind die einzigen biologischen Substrate, welche einen indirekten Rückschluß auf die Vorgänge in den Gangsystemen des Pankreas und der Galle zu lassen. Dieses Material wird typischerweise während einer endoskopischen Untersuchung, der ERCP, gewonnen. Anhand dieses Materials werden eine Reihe von Untersuchungen vorgenommen: Bestimmung der Mutationen im ras Onkogen und p53 Tumorsuppressorgen. Nachweis von exogeninfektiösen Erregern (H. pylori, negative strand virus) und NO-metabolite/oxidativer Stress. 3. Nachweis von Mucin RNA in peripheren mononuklearen Blutzellen ein potentieller Marker für das Pankreaskarzinom J. Ringel, R. Jesenofsky, K. Wunder In Kooperation mit Dr. Surinder Batra (Eppley Cancer Research Center, Univ. of Omaha, Nebraska, USA), Fakultät für Klinische Medizin Mannheim, Universität Heidelberg: Prof. Dr. med. St. Post, Direktor der Chirurgischen Klinik, Prof. Hochhaus, III. Medizinische Klinik und Prof. Wenz, Leiter der Abt. für Strahlentherapie. Fakultät für Klinische Medizin Heidelberg, Universität Heidelberg Arbeitsgruppe von Prof. Dr. med. M. Büchler, Direktor der Klinik für Visceral- und Transplantationschirurgie und Prof. Dr. med. H. Friess (ltd. Oberarzt). Die Diagnostik und Differentialdiagnostik des Pankreaskarzinoms ist trotz moderner Bildgebung und erster molekulargenetischer Muationsanalysen sehr schwierig. In einer Pilotstudie untersuchten wir die RNA-Expression von Mucinen in peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) von 105 Patienten mit unterschiedlichen benignen und malignen Erkrankungen hinsichtlich der Mucin mrna Expression. Mittels RT-PCR konnte überall MUC1 nachgewiesen werden. Klinische Kooperationseinheit E180 Gastroenterologische Onkologie Im Gegensatz dazu war MUC4 mrna exklusiv in den PBMCs von 18 (67%) von 27 Pankreaskarzinompatienten detektierbar, während es in allen anderen Proben nicht vorhanden war. Erste Ergebnisse weisen auf eine MUC4 Expression in CD3+ Zellen hin. Der Nachweis von MUC4-RNA in PBMCs stellt somit ein potentiell neuartiges Markersystem für das Pankreaskarzinom dar. Ziel dieses 2003 fortgeführten Projektes war es die Spezifität, Sensitivität des RNA-Nachweises von Mucinen (MUC4) sowie die Korrelation zu klinischen Parametern wie Tumorstaging, Grading sowie Therapie für das Pankreaskarinom zu analysieren sowie in einer prospektiven Studie bei Patienten mit V.a. ein Pankreastumor die diagnostische Wertigkeit des Mucinnachweises in PBMCs zu beurteilen. Dazu wurden entsprechend PBMCs von Patienten mit histologisch gesichertem Pankreaskarzinom, Patienten mit unklarem Pankreastumor, Patienten mit akuter oder chronischer Pankreatitis sowie Patienten mit verschiedenen anderen gastrointestinalen Tumoren präpariert und die entsprechenden RT-PCR Untersuchungen durchgeführt. Dabei bestätigte sich der signifikant erhöhte Nachweis von MUC4 mrna bei Pankreaskarzinompatienten. Daneben konnte auch bei einigen Patienten mit akuter und chronischer Pankreatitis MUC4 amplifiziert werden. Parallel wurden in vitro Untersuchungen hinsichtlich möglicher Regulationsmechanismen der MUC4 Expression in PBMCs durchgeführt. Dabei zeigten erste Versuche, daß bestimmte Interleukine und Zytokine eine Stimulation der MUC4 mrna in PBMCs bewirken. 4. Detektion von differentiell exprimierten Genen beim Pankreaskarzinom Y. Chen, R. Jesenofsky In Koopoperation mit Dr. J. Hoheisel (DKFZ B070). Beim Pankreaskarzinom ist der Übergang von einer normalen zur präneoplastisch und schließlich maligne veränderten Zelle durch zahlreiche genetische Veränderungen gekennzeichnet, die sowohl die Überexpression von Wachstumsfaktoren und ihren Rezeptoren als auch die Aktivierung von Protoonkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen betreffen. Das Ziel dieses Projektes war die Identifizierung von Genen, die in Pankreastumorzellen gegenüber den normalen Pankreaszellen verstärkt exprimiert werden oder umgekehrt. Dabei kam zunächst die Methode des Differential Display zum Einsatz, da bei dieser Methode im Gegensatz zu Chipbasierten Methoden auch unbekannte Gene detektiert werden können. Die allgemeine Strategie des Differential Display besteht in der Amplifikation partieller cdna-sequenzen von mrna-fraktionen mittels Reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion. Die so erhaltenen relativ kurzen Sequenzen werden anschließend auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und anhand des entstehenden Bandenmusters verglichen. Die differentielle Genexpression wurde mittels Northern Blot, reversem Slot Blot sowie TaqMan verifiziert. Die Identität der so ermittelten cdnas wurde durch Blast Recherche ermittelt. Von differentiell exprimierten Genen, für die nach dem Sequenzabgleich keine bekannten Homologien gefunden wurden, wurden daraufhin die 5 - und 3 -Enden der exprimierten mrna mittels der RACE-Technologie identifiziert. 365

366 366 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie 5. In vitro Modell der Pankreaskarzinogenese: Detektion von Genen, die differentiell während der schrittweisen Karzinogenese in bovinen Pankreasgangzellen exprimiert werden. R. Jesenofsky, R. Faissner In Zusammenarbeit mit Dr. Jörg Hoheisel und Dr. Dimitrij Zoubakov (DKFZ B070) In diesem Projekt wurde der Effekt definierter singulärer Gendefekte in dem von uns entwickelten Modell der isolierten bovinen Pankreasgangepithelzellen am Beispiel eines mutierten ras Onkogens untersucht. Im Zentrum stand dabei die Frage, welche Gene - vermittelt durch Expression des mutierten ras Onkogens - neuexprimiert bzw. angeschaltet oder herunterreguliert werden und somit zur Karzinogenese beitragen können. Die Identifizierung der differentiell exprimierten Gene erfolgte mittels der SSH (Suppression Subtractive Hybridisation), die im Gegensatz zur RDA oder DDRT-PCR bereits nach einer Selektionsrunde auch low abundant cdnas amplifizieren kann. Mittels dieser Technik wurden bisher 49 differentiell exprimierte Gene identifiziert (21 herauf-, 28 herunterreguliert in den k-ras transfizierten Zellen). Die differentielle Genexpression wurde mittels Hybridisierung auf einem cdna Array überprüft, einzelne der Gene wurden mittels semiquantitativer RT-PCR nochmals unabhängig verifiziert. Um sicherzustellen, daß die differentielle Genexpression letztendlich in einer biologisch relevanten unterschiedlichen Expression von Proteinen mündet, untersuchten wir parallel die gesamte Proteinexpression (Proteomics) der beiden Zellklone. Dazu wurden Zellextrakte der beiden Zellinien nach Optimierung der Aufarbeitung mittels 2D-Gelektrophorese analysiert. Differentiell exprimierte Proteine wurden gepickt und nach Gelverdau mittels Massenspektrometrie analysiert. Mittels dieser Methode konnten wir bislang 37 differentiell exprimierte Proteine identifizieren. Dabei ergaben sich nur geringe Korrelationen der RNA- und Proteindaten, was für ähnliche Untersuchungen bereits in der Literatur beschrieben wurde. Mit beiden Methoden konnten aber Gene bzw. Proteine identifiziert werden, deren differentielle Expression beim Pankreaskarzinom schon publiziert worden sind. Diese Techniken sollten deshalb nicht als konkurrierend sondern als sich ergänzend eingesetzt werden. Desweiteren kann man durch die Identifizierung dieser Gene und Proteine daraus schließen, dass unser in vitro Modell die in vivo Situation gut widerspiegelt. Klinische Kooperationseinheit E180 Gastroenterologische Onkologie 6. Immortalisierung humaner Pankreatischer Sternzellen R. Jesenofsky, D. Fürst Die Desmoplasie ist ein Charakteristikum des Pankreaskarzinoms. Bis zum heutigen Tag sind die molekularen Mechanismen und die Zell-Zell-Interaktionen, welche zu dieser Fibrosierung führen nicht aufgeklärt. Vor kurzem wurden pankreatische Stern-Zellen (PSC) isoliert und charakterisiert. Sie ähneln sowohl morphologisch als auch von der Expression von Markerproteinen den Sternzellen der Leber, welche eine zentrale Rolle bei der Leberfibrose einnehmen. Diese pankreatischen Sternzellen scheinen für die Entstehung der Pankreasfibrose (Desmoplasie) verantwortlich zu sein. Da humane Sternzellen nicht maligne entartet sind, haben sie nur eine finite Lebensspanne und müssen so immer wieder frisch aus humanem Pankreasgewebe isoliert werden, was einen Vergleich von Resultaten erschwert. Die Etablierung einer permanenten humanen Sternzellinie würde deshalb die Untersuchungen der Pathomechanismen, die der Fibrosierung bei der chronischen Pankreatitis zugrundeliegen, erheblich vereinfachen. Aus diesem Grund versuchen wir im Rahmen dieses Projektes eine immortale humane Pankreassternzellinie zu etablieren. Dies ist uns gelungen, womit wir ein zellbiologisches Werkzeug zur Aufklärung der molekularen Pathomechanismen der Pankreasfibrose in der Hand haben. 7. TGF1 Signalwege in der SMAD4 deletierten Tumorzellinie BxPC-3 R. Jesenofsky, B. Sander In Zusammenarbeit mit Dr. G. Molema, Univ. Gronignen, Niederlande, Prof. H. Kalthoff, Univ. Kiel und Prof. S.A. Hahn, Ruhr-Univ. Bochum. Der Transforming Growth Factorβ1 (TGFβ1) ist ein potenter Wachstumsinhibitor für normale epitheliale Zellen. Die meisten Tumorzellinien sind resistent gegenüber dieser TGFβ1- induzierten Wachstumsinhibierung, was darauf hindeutet, daß TGFβ1 eine wichtige Rolle bei der Genese dieser Tumoren spielt. TGFβ1 entfaltet seine Wirkung mittels einer Signalkaskade über die TGFβ1-Rezeptoren, SMAD-Proteine und Coaktivatoren. Dabei kommt es nach einer Aktivierung der Rezeptor-SMADs SMAD 2/3 zu einer Assoziation mit SMAD4 und dieser Komplex translociert daraufhin in den Nukleus der Zelle, wo eine Transkription der Zielgene induziert oder reprimiert wird. Verschiedene Tumorzellinien, denen notwendige Bestandteile dieses Signalweges fehlen, wie z.b. die TGFβ1-Rezeptoren oder SMAD4, sind dennoch TGFβ1-sensitiv. Deshalb ist ein von der klassischen TGFβ1- Signalkaskade unabhängiger Signaltransduktionsweg notwendig. Wir konnten für die SMAD4 deletierte Pankreastumorzellinie BxPC-3 zeigen, daß Stimulation mit TGFβ1 zu einer Akkumulation von SMAD3 im Nukleus der Zellen führt. Weiterhin resultierte diese Stimulation in einer Induktion der Expression einer vielzahl von Genen wie Wachstumsfaktoren, Zellzyklus- und ECM-Proteinen, z.b. von CTGF, WAF1, Fibronektin und Collagen type I. Dabei wurden die TGFβ1- Signale über den Ras/MAPK bzw. JNK-Signalweg übertragen, da eine Praeinkubation der Zellen mit spezifischen Inhibitoren die TGFb1-Induktion verhindert. 8. Chemoresistenz solider Tumore R. Faissner, J. Ringel, F.M. Hummel, R. Jesenofsky, T. Metzger, K. Lang In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer (DKFZ), Dr. J. Hoheisel (DKFZ B070), Prof. D. Schadendorf (DKFZ D070), Dr. R. Eils (B080). Die Unempfindlichkeit gegenüber praktisch allen gängigen Zytstatika ist eines der Hindernisse, weswegen die Prognose des Pankreaskarzinoms so schlecht ist. Wir haben im Rahmen eines Verbundprojektes begonnen, mittels der Kombination von Tanscriptomics und Proteomics in in vitro-modellen die Mechanismen auf Tumorzellebene zu untersuchen. Dazu werden RNA und Proteingemische aus sorgsam ausgewählten Zelllinien (Capan-1, Paca-44 und Panc-1), die mit unterschiedlichen Zytostatika behandelt wurden, mittels hochauflösender 2D-Gelelektrophorese und Mikro-Array-Chips analysiert.

367 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Klinische Kooperationseinheit E180 Gastroenterologische Onkologie Publikationen (vor Übernahme der Kooperationseinheit am DKFZ) [1] Kröger JC, Benz S, Hoffmeyer A, Bago Z, Bergmeister H, Günzburg WH, Karle P, Klöppel G, Losert U, Müller P, Nizze H, Obermaier R, Probst A, Renner M, Saller R, Salmons B, Schwendenwein I, von Rombs K, Wiessner R, Wagner T, Hauenstein K, Löhr M (2003): Intra-arterial Instillation of microencapsulated, Ifosfamide activating Cells in the Pig Pancreas for chemotherapeutic targeting. Pancreatology, 3: [2] Heemann U, Treichel U, Loock J, Philipp T, Gerken G, Broelsch C, Klammt S, Loehr M, Liebe S, Mitzner S, Schmidt R, Stange J (2002): Albumin dialysis in cirrhosis with superimposed acute liver injury: A prospective, controlled study. Hepatology, 36: [3] Ehrhardt D, Heller T, Nizze H, Benz S, Liebe S, Löhr M (2003): Der Wasserstrahls als Schneidewerkzeug in der gastroenterologischen Endoskopie - eine experimentelle Studie. Endoskopie heute, 4: [4] Sipos B, Moser S, Kalthoff H, Torok V, Löhr M, Klöppel G (2003): A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv 442: (2.045) [5] Lüttges J, Neumann S, Jesnowski R, Börries V, Domm S, Löhr M, Klöppel G (2003): Apoptosis in precursor lesion of ductal adenocarcinoma and its association with k-ras mutation, p53 expression and proliferative activity. Pancreas, 27: E57-E62. [6] Michl P, Barth C, Buchholz M, Lerch MM, Rolke M, Holzmann KH, Menke A, Fensterer H, Giehl K, Löhr M, Leder G, Iwamura T, Adler G, Gress TM (2003): Claudin-4 expression decreases invasiveness and metastatic potential of pancreatic cancer. Cancer Research, 63: [7] Grützmann R, Foerder M, Alldinger I, Staub E, Brümmendorf T, Roepke S, Kristiansen G, Jesnowski R, Sipos B, Löhr M, Lüttges J, Ockert D, Klöppel G, Saeger HD, Pilarsky C (2003): Gene expression profiles of microdissected pancreatic ductal adenocarcinoma. Virchows Archiv, 443: [8] Löhr M, Kröger JC, Hoffmeyer A, Freund M, Hain J, Holle A, Knöfel WT, Liebe S, Nizze H, Renner M, Saller RM, Müller P, Wagner T, Hauenstein K,, Salmons B Günzburg WH (2003): Safety, feasibility and clinical benefit of localized chemotherapy using microencapsulated cells for inoperable pancreatic carcinoma: a phase I/II trial. Cancer Therapy, 1: Übersichten & Reviews [1] Ringel J, Löhr M (2003): The MUC gene family: Their role in diagnosis and early detection of pancreatic cancer. Molecular Cancer 2: e9-e26. [2] Salmons B, Löhr M, Günzburg WH (2003): Treatment of inoperable pancreatic carcinoma using a cell-based local chemotherapy: results of a phase I/II clinical trial. Journal of Gastroenterology 38 (Suppl. XV): [3] Kuhn-Thiel A, Ringel J, Zollamnn F, Liebe S, Löhr M (2003): Pancreas Platform: a WWW-homepage for pancreatic diseases. Pancreasweb.com ( freecomm/), 01-Apr [4] Klöppel G,Lüttges J, Zamboni G, Löhr M, Longnecker D (2003): Autoimmune pancreatitis. Pancreas 27: [5] Löhr M, Friess H (2003): Das Risiko einer Operation am Pankreas. (Kommentiertes Referat) Zeitschrift für Gastroenterologie 41: [6] Löhr M, Hoheisel J (2003): DNA-chip Technologie beim Pankreaskarzinom. (Kommentiertes Referat) Zeitschrift für Gastroenterologie 41:

368 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie V230/V231 Zentrales Tierlabor Zentrales Tierlabor (ZTL, V230/V231) Leiter: Dr. med. vet. Uwe Zillmann, Fachtierarzt und Fachwissenschaftler für Versuchstierkunde (GV-SOLAS) 368 Wissenschaftliche Mitarbeiter: Dr. med. vet. Rita Sanchez-Brandelik (Stellvertretende Leiterin, in Fortbildung zur Fachtierärztin, 9/01 -) Dr. med. vet. Werner Nicklas (Mikrobiologisches Labor, V231) Ulrich Kloz und Frank van der Hoeven (Zentraler Transgen Service, V232) Technisches Personal Ausgewählte Mitarbeiter (von insgesamt 52) Klaus Meister, Desinfektor/Hygieneleiter Angelika Frenznick, Versuchstierpflegemeisterin Heidi Oberst, Versuchstierpflegerin Michael Gehring, Versuchstierpfleger Walter Henrich, Versuchstierpfleger Beate Hilscher, Versuchstierpflegerin Martin Friedel, Versuchstierpfleger Bernd Lehr, Biologielaborant (Embryotransfer) Stefan Fössel, Versuchstierpfleger Gerhard Scherhaufer, Desinfektor Stephan Pieper, Desinfektor Udo Hoesch, BTA Petra Mauter, Biologielaborantin (V 231) Andrea Erles-Kemna, Biologielaborantin (V 231) Klaus Vogel, Biologielaborant (V 231) Sekretariat Nadine Stein (Allgemeinverwaltung/Tiereinkauf) Manuela Schulz (Tierschutz/Tierschutzbeauftragte) Tierexperimente haben im DKFZ - trotz der zunehmenden Entwicklung von Ersatzmethoden - ihren festen Stellenwert. Hinweise auf die Verwendung von tierischen Zellen und Versuchstieren finden sich in über 30 % der Publikationen. Die Versuchsvorhaben sind häufig auf den Gebieten der Grundlagenforschung, Erforschung oder Erprobung von Methoden zur Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie onkologischer Erkrankungen angesiedelt. Zu den Hauptaufgaben unserer zentralen Dienstleistung gehören die Beschaffung sowie die Haltung von Versuchstieren verschiedener Spezies unter definierten Bedingungen. Eine weitere Aufgabe besteht in der Unterstützung tierexperimenteller Versuchsvorhaben, wie auch die Sanierung von Mauslinien mit unerwünschtem Hygienestatus mittels Embryotransfers. Zur Zeit (Stand: ) werden 112 genehmigte und 83 angezeigte Versuchsvorhaben unterstützt. Das ZTL hat daneben eigene wissenschaftliche Projekte oder Projektbeteiligungen, die nachfolgend oder an anderer Stelle beschrieben sind. Unsere Einrichtung wird von einem Fachtierarzt für Versuchstierkunde geleitet. Die mikrobiologische Routinekontrolle der eigenen Bestände (im Vorfeld aber auch bei Tierlieferanten) erfolgt durch das ZTL-eigene Mikrobiologische Labor unter der Leitung eines Fachtierarztes für Mikrobiologie. Eine dritte Tierarztstelle dient der Unterstützung des ZTL-Managements, der Stellvertretung, der Schulung der Tierpfleger und ermöglicht die Weiterbildung zum Fachtierarzt für Versuchstierkunde und/oder Mikrobiologie. Seit 2002 ist der Zentrale Transgen-Service (ZTS) fester Bestandteil des ZTL. Er dient der Unterstützung von Wissenschaftlern des DKFZ bei der Herstellung von genetisch veränderten Mauslinien. Der Service bietet u.a. die Mikroinjektion von DNA und von embryonalen Stammzellen (ES) in Mausembryonen an und gibt Hilfestellung beim Projektentwurf und bei der Herstellung genetisch veränderter ES-Zellen. Im Bereich der technischen Mitarbeiter finden sich u.a. Berufsbilder wie Versuchstierpfleger, Biologielaboranten, BTA und Desinfektoren. Der Hauptanteil der angestellten Versuchstierpfleger hat bereits seine Lehrzeit im ZTL absolviert. Im Gegensatz zu vielen anderen Versuchstierhaltungen erfolgt der Bezug unserer Versuchstiere von wenigen nationalen und internationalen Anbietern. Der Anteil selbstgezüchteter Tiere besteht fast ausschließlich aus transgenen Mäusen. Der Tierbestand im ZTL beträgt im Jahresdurchschnitt ca Tiere. An der Gesamtpopulation beträgt der Anteil von Mäusen ca. 98 % (da von etwa 75% transgene) und von Ratten 1,5 %. Ein wesentlich geringeres Aufkommen haben Amphibien, Hühner, Mastomys, Meerschweinchen und Kaninchen. Die Haltung der Versuchstiere erfolgt in 5 Barrieren, 3 Containereinheiten, in geringerem Maße in Isolatoren, zwangsbelüfteten Käfigregalsystemen (IVC s) [1,2] und in konventioneller Haltung. Unsere Versuchstiere besitzen einen sogenannten SPF-Status (,,spezifiziert-pathogen-frei ), sind also frei von tierartspezifischen pathogenen Viren, Bakterien und Parasiten. Zur weiteren Vermittlung versuchstierkundlicher wie tierexperimenteller Sach- und Fachkunde bietet das ZTL neben diversen Seminaren einen 40-stündigen zertifizierten Einführungskurs zum tierexperimentellen Arbeiten an (jährlich, max. je 30 Teilnehmer: Diplomanden, Doktoranden und interessierte Mitarbeiter). Inhaltlich werden dabei die Vorgaben der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Kategorie B abgedeckt. Publizierte Patente [1] Zillmann,U.; Dähmel,W.; Lehr,B.: Käfigdeckel ; 2002 [2] Zillmann,U.; Dähmel,W.; Lehr,B.: Käfig-Regalsystem mit Zwangsbelüftung ; 2002 Mikrobiologische Diagnostik (V231) Leiter: Dr. med. vet. Werner Nicklas, Fachtierarzt für Mikrobiologie und für Versuchstierkunde Mitarbeiter Andrea Erles-Kemna, Biologielaborantin (bis 5/02: 50%, seit 6/ 02: 75%) Robert LeCorre (-5/02), Biologielaborant Sonya Marchetti (6/02-), Biologielaborantin (50%) Petra Mauter, Biologielaborantin (- 5/02: 50%, 6/02-: 75%) Klaus Vogel, Biologielaborant Thorsten Waberschek (3/03-), Tierarzt, Doktorand Das Diagnostische Labor ( Mikrobiologische Diagnostik ) war in dem Berichtszeitraum eine dem Zentralen Tierlabor angegliederte Dienstleistungsgruppe mit der Aufgabenstellung, die mikrobiologische Qualität der am DKFZ gehaltenen und für Tierexperimente oder zur Gewinnung von Zellen verwendeten Versuchstiere durch regelmäßige Untersuchungen zu überprüfen. Durch die Untersuchung von Tieren, die von kommerziellen Züchtern oder von externen wissenschaftlichen Institutionen stammen, sollen die Voraussetzungen geschaffen werden, um die Einschleppung von

369 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Erregern in die Tierbestände des DKFZ zu vermeiden. Mit demselben Ziel untersuchen wir biologische Materialien (Transplantationstumoren, Zellen, etc.), die in Tierversuchen eingesetzt werden sollen. Die Vorgehensweisen sind abgestimmt auf die spezifischen Bedürfnisse des DKFZ (Tierarten, Haltungsformen, Immunstatus, wissenschaftliche Fragestellungen, usw.) und basieren auf eigenen Erfahrungen und auf internationalen Empfehlungen [1-4]. Mikrobiologische Diagnostik bei Versuchstieren und Beeinflussung von Tierversuchen durch Infektionserreger W. Nicklas Kooperationen: Prof. Angel Alonso, ATV, DKFZ; Axel Benner, Biostatistik, DKFZ; Dr. Hans-Jürgen Busse, Universität Wien, Österreich; Prof. Achim Gruber, Tierärztliche Hochschule Hannover; Dr. Martin Ryll, Tierärztliche Hochschule Hannover V230/V231 Zentrales Tierlabor Entsprechend der Aufgabe der Arbeitsgruppe lag der Schwerpunkt der Tätigkeit bei der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Versuchstieren (fast ausschließlich Ratten und Mäuse) und biologischen Materialien. Ziel der Untersuchungen ist es, in mikrobiologischer Hinsicht standardisierte Versuchstiere für Tierversuche einsetzen zu können und Beeinflussungen von Versuchsergebnissen durch Mikroorganismen zu vermeiden. Zu diesem Zweck werden in regelmäßigen Abständen sowohl aus unserer eigenen Tierhaltung als auch von externen Quellen stammende Tiere bakteriologisch, parasitologisch und serologisch (auf mehr als 15 Erreger) untersucht. Für die Mehrzahl der serologisch nachweisbaren Erreger stehen uns mindestens 2 unterschiedliche Testverfahren zur Verfügung, mit deren Hilfe das Risiko von falsch-positiven Reaktionen deutlich reduziert werden kann. Seit Jahren setzen wir auch molekularbiologische Tests für Routineuntersuchungen ein. Wir verwenden diese Tests zum Ausschluß bzw. zum Nachweis von nicht oder nur schwer kultivierbaren Mikroorganismen (Clostridium piliforme, Helicobacter sp., Pneumocystis carinii, Pasteurellaceen, Mykoplasmen) und bei bestimmten Indikationen auch für Virusnachweise [z. B. Maus Hepatitis Virus (MHV), Maus Parvovirus (MPV)]. Für die Barrierenbereiche werden Tiere aus Zuchten beschafft, die ebenfalls durch unser eigenes Labor regelmäßig kontrolliert werden. Tiere von kommerziellen Züchtern entsprechen in der Regel unseren Anforderungen, allerdings finden wir in verschiedenen Populationen auch unerwünschte Keime. Die Eingangsuntersuchungen von transgenen Tieren, die aus experimentellen Tierhaltungen stammen, erbringen häufig Nachweise von nagerrelevanten Mikroorganismen und zeigen deutlich, dass von solchen Tieren ein sehr großes Risiko der Einschleppung von Erregern ausgeht bzw. dass der häufige Austausch von gentechnisch veränderten Tieren zu einem zunehmenden Infektionsdruck führt. Wir konnten mehrmals Befall mit Würmern oder Milben und auch mit verschiedenen bakteriellen Infektionserregern nachweisen, Virusinfektionen sind seltener. Neben Untersuchungen zur Ermittlung des Infektionsstatus einer Population versuchen wir zusammen mit externen Pathologen, bei klinisch erkrankten Tieren Krankheitsursachen festzustellen. Unter unseren Bedingungen werden klinische Symptome häufiger von verschiedenen bakteriellen Infektionserregern ausgelöst. Bei immundefizienten Tieren treten häufiger Probleme auf durch Infektionen mit Pneumocystis carinii, aber auch bakterielle Infektionserreger werden oft als Ursachen für Erkrankungen oder für spontane Todesfälle gefunden. In der letzten Zeit erhalten wir nur noch wenige Transplantationstumoren oder andere biologische Materialien (z. B. ES Zellen) zur Untersuchung auf Kontamination mit nagerpathogenen Viren. Auch wenn in unserem Untersuchungsmaterial kontaminierte Proben in den letzten Jahren nur noch selten vorkamen, so muss doch von einem deutlichen Risiko ausgegangen werden, dass damit Nagerviren in die Tierhaltung eingeschleppt werden. Bakteriologische Kontrolluntersuchungen an Ratten und Mäusen zeigen, dass Pasteurellen sehr weit verbreitet sind. Um den Nachweis dieser z. T. schwer kultivierbaren Keime zu vereinfachen und um mit vertretbarem Aufwand größere Tierzahlen untersuchen zu können, haben wir für mehrere Arten serologische Tests (ELISA) mit hoher Spezifität entwickelt. Diese Tests sollen es uns besonders bei zugekauften Tieren ermöglichen, durch die Untersuchung größerer Tierzahlen die Aussagesicherheit zu erhöhen und damit das Risiko der Einschleppung dieser Mikroorganismen zu verringern. Von unserem Labor wird seit 1991 ein Ringversuch für Labors, die sich mit der mikrobiologischen Überwachung von Versuchstieren beschäftigen, organisiert. Gegenwärtig nehmen mehr als 30 Labors aus 10 europäischen Ländern teil. Im Rahmen dieses Programms werden in regelmäßigen Abständen Bakterienkulturen an die teilnehmenden Labors verschickt. Die innerhalb einer festgesetzten Frist eingehenden Befunde werden ausgewertet und später in anonymisierter Form den Teilnehmern mitgeteilt. Dieser Ringversuch dient der Selbstkontrolle der teilnehmenden Labors und soll insgesamt zur Verbesserung der mikrobiologischen Überwachung und damit letztendlich der Qualität der Versuchstiere beitragen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Nicklas, W., P. *Baneux, R. *Boot, T. *Decelle, A. A. *Deeny, M. *Fumanelli & B. *Illgen-Wilcke (2002) Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Recommendations of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Working Group on Health Monitoring of Rodent and Rabbit Colonies. Laboratory Animals 36, [2] Nicklas, W. (2002) Bedeutung der mikrobiologischen Standardisierung bei transgenen Tieren. In: Jilge, B. et al. (Eds.), Tierexperimentelle Forschung-Erkenntnisse und Möglichkeiten. GV-SOLAS, Ulm [3] *Mossmann, H., W. Nicklas & H. J. *Hedrich (2002) Management of immunocompromised and infected animals. in: S. H. E. Kaufmann and D. Kabelitz (Eds.), Methods in Microbiology, Vol. 32, Immunology of Infection, Second Edition, , Academic Press, Amsterdam [4] *Scharmann, W., H. *Meyer & W. Nicklas (2003) Ergebnis der Umfrage des Hygieneausschusses der GV-SOLAS zur Infektionsüberwachung in Versuchstierhaltungen. Der Tierschutzbeauftragte 1/03,

370 370 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie Intraoperative Tumorfluoreszenzdiagnostik mit Fluorescein-Albumin: Grundlagenentwicklung und klinische Anwendung (V230 3) P. Kremer*, E. Frei, H.H. Schrenk, U. Bauder-Wüst, H. Sinn, U. Zillmann *Neurochirurgische Universitätsklinik Heidelberg Bei der Photodynamischen Therapie wird ein lichtempfindlicher Wirkstoff (Photosensibilisator) lokal oder systemisch appliziert und vom Tumor aufgenommen. Wird der Photosensibilisator dann durch Licht geeigneter Wellenlänge angeregt, kommt es zu einer Aussendung von Fluoreszenzlicht, welches eine Abgrenzung von Tumorgewebe gegenüber Normalgewebe ermöglicht (laserinduzierte Fluoreszenzdiagnostik = LIFD). Alternativ können aber auch durch die Aktivierung photochemische Prozesse induziert werden, die dann Radikale und Singulet-Sauerstoffatome freisetzen und somit als Zellgift Tumorgewebe zerstören (photodynamische Therapie = PDT). Der Erfolg von Therapie und Diagnose hängen maßgeblich von der Eigenschaft der verwendeten Photosensibilisatoren und ihrer Anreicherung im Tumorgewebe ab. Um gerade letzteres zu verbessern, wurden verschiedene Photosensibilisatoren an das Makromolekül Albumin in einer spezifischen Weise gekoppelt. Dadurch konnte eine lang anhaltende und für das Tumor-gewebe hoch spezifische Aufnahme der Konjugate im Tumorgewebe erreicht werden. Ziel der Arbeitsgruppe war es, eine Methode zur intraoperativen Fluoreszenzdiagnostik für malige Gehirntumoren zu entwickeln und sie einer Phase I/II - Studie zuzuführen. Als Fluoreszenzdiagnostikum wurde Fluorescein verwendet, welches in einem 1 : 1 molaren Verhältnis an humanes Serumalbumin gekoppelt wurde (AFLc - HSA). In Kooperation mit dem DKFZ wurde bei C6-Gliom tragenden Ratten die intraoperative Fluoreszenzdiagnostik mit AFLc-HSA entwickelt. Dabei bestätigete sich eine selektive und lang anhaltende Aufnahme des Proteinkonju-gates in den C6 - Gliomen, welche nach Fluoreszenzanregung durch Laserlicht mit dem bloßen Auge erkennbar waren. Untersuchungen mit der konfokalen Mikroskopie wiesen eine lysosomale Aufnahme des Farbstoffkonjugates in den C6 - Tumorzellen nach [1]. Nach Abschluß der Vorbereitungen für die Durchführung einer Phase I/II - Studie und Vorliegen eines positiven Votums der hiesigen Ethikommission wurden zwischenzeitlich 16 Patien-ten mit AFLc - HSA in der Neurochirurgischen Universitätsklinik operiert (8 x Glioblastoma multiforme, 4 x Gehirnmetastasen, 2 x Oligodendrogliome WHO III, 1 x desmopl. Medulloblast-om, 1 x atyp. Angioblastom). Der Farbstoff wurde in einer Konzentration von 0,5-1,0 mg/ kg KG in einem Zeitintervall von 0,5-4 Tage vor der Operation appliziert [2]. Die Fluoreszenz wurde durch einen in der Kopfklinik installierten Argonlaser bei 488 nm ( mwatt) aktiviert und mit einen Langpaßfilter über das Operationsmikroskop beobachtet. Das Ausmaß der Resektion unter Fluoreszenzbedingungen wurde verglichen mit der Tumorausdehnung dargestellt über die Neuronavigation und der intra- oder frühen postoperativen MRT. Die intraoperative Tumor-fluoreszenz war am besten zu beobachten, wenn der Farbstoff 2-3 Tage zuvor appliziert worden war. Bei 4 Patienten war eine sehr gute Fluoreszenz während der gesamten Dauer der Operation zu beobachten (2 x Glioblastoma multiforme, 1 x Bronchialkarzinommetastase, 1 x atyp. Angio-blastom), bei 8 Patienten zeigte sich intraoperativ eine zufriedenstellende Tumorfluoreszenz (6 x V230/V231 Zentrales Tierlabor Glioblastoma multiforme, 1 x Oligodendrogliom, 1 x Gehirnmetastase unklaren Ursprungs). Bei 4 Patienten war jedoch keine Tumorfluoreszenz intraoperativ erkennbar (2 x Gehirnmetastase, 1 x desmopl. Medulloblastom, 1 x Oligodendrogliom). Vor allem in der proliferationsaktiven Tumorrandzone imponierte die Tumorfluoreszenz am deutlichsten. In 52 von 56 entnommenen fluoreszenzpositiven Proben bestätigte sich histopathologisch Tumorgewebe. Insgesamt erscheint die Tumordarstellung mit AFLc - HSA als vielversprechendes Diagnostikum, um intraoperativ eine selektive Darstellung der proliferationsaktiven Tumorrandzone zu erreichen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Kremer, P., Wunder, A., Sinn, H., Haase, T., Rheinwald, M., Zillmann, U., *Albert, F.K., *Kunze, S.: Laser-induced fluorescence detection of malignant gliomas using fluoresceinlabeled serum albumin: Experimental and preliminary clinical results. Neurol. Res. 22 (2000) [2] *Kremer, P.: Albumin als Carrier zur laserinduzierten Fluoreszenzdiagnostik und Chemotherapie maligner Tumoren. Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia Legendi für das Fach Neurochirurgie der Medizinischen Fakultät Heidelberg der Ruprecht-Karls-Universität, Photodynamische Therapie (PDT) bei drei Tumorarten (2 Mausmodellen) unter Verwendung verschiedener großmolekular gekoppelter und nicht-gekoppelter Photosensitizer (PS) (V230 4a/b) A. Kübler*,.T. Reuther*, Ch. Staff*, J. Gahlen**, U. Zillmann * Klinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie, Universität Heidelberg; ** Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg In Zusammenarbeit mit: H. Sinn, Th. Haase, DKFZ; C. Flechtenmacher, Pathologisches Institut der Universität Heidelberg In den beiden parallel laufenden Projekten wurden zwei verschiedene, teils neue Tier-Tumormodelle (trg. Mausstamm RAG II: humanes Plattenepithelkarzinom aus dem Oropharynx [1]; Nacktmaus Swiss CD1 nu/nu: Kolonkarzinom und Weichteilsarkom eingesetzt [2] [3]). Die Tumorangehraten lagen jeweils bei über 90%. Verwendung fanden photosensible an HAS- oder PEG-gekoppelte oder freie Agentien aus der 1., 2. und 3. Generation (Dr. Sinn). Im ersten Ansatz wurden nach ausreichender Tumorprogression (2-6 Wochen, cm³) PS in unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen zeitlichem Vorlauf (1-5 Tage) vor der Laserlichtbestrahlung intraperitoneal appliziert. Entgegen der Erwartung zeigten die ungekoppelten PS (Photofrin II, mthpc) einen maximalen Therapieeffekt (vollständige Tumorremission). Unter den gekoppelten PS war lediglich das m-thpcn-peg beim Plattenepithelkarzinom wirksam (zwar schnellere Remission, aber erheblich kürzere Dauer) [4, 5]. Das Projekt wurde 2001/2002 ausgesetzt. Im zweiten Ansatz erfolgten subtotale bis totale Tumorresektionen unmittelbar nach der Applikation vier verschiedener PS. Eine homogene intratumorale Anreicherung war bei allen PS gegeben. Im Tumorbett reicherte sich das NPC-mTHPC-PEG nach Photosensibilisierung am höchsten an. Die mediane, rezidivfreie Überlebenszeit der Tiere mit kolorektalem Karzinom war mit 18 Tagen (mthpc und NPCmTHPC-PEG) signifikant verlängert (Kontrolle 8 Tage) [6]. Die Ergebnisse bei den Weichteilsarkomen (mthpc: rezidiv-

371 Forschungsschwerpunkt E Innovative Krebsdiagnostik und -therapie freies Überleben 103 Tage, Kontrolle 20 Tage) bedürfen noch einer weiteren Absicherung (Dosis, Laserenergie, wiederholte Anwendung etc) und tierexperimetelle Studien. Die Hauptziele dieser Teilstudie der lokalen Tumorkontrolle und Verlängerung der rezidivfreien Überlebenszeiten der Tiere wurden erreicht. Zusammenfassend erscheint die Additive Intraoperative PDT (AIOPDT) als eine erfolgversprechende Therapiemethode zur Behandlung kolorektaler Karzinome (und Weichteilsarkome) mit dem Vorteil einer hohen Tumorselektivität, geringer Nebenwirkungen und der Möglichkeit zur repetitiven Durchführung der Methode. Vorliegende und ergänzende tierexperimentelle Ergebnisse stellen die Basis für folgende klinische Studien zur AIOPDT nach Tumorresektion dar. Publikationen: (* = externer Koautor) [1]*Reuther, T., *Kübler, A. C., *Staff, C., *Flechtenmacher, C., Haase, T., Zillmann, U.: The RAG 2 Mouse Model for Xenografted Human Oral Squamous Cell Carcinoma. Contemp. Topics in Lab. Anim. Sci. 41 (2) (2002) [2]*Gahlen, J., *Winkler, S., *Proßt, R., *Rheinwald, M., Haase, Th., *Herfarth, Ch.: Adjuvante intraoperative Photodynamische Therapie (PDT) nach Photosensibilisierung mit mthpc im CC531 Kolonkarzinom Modell der Nacktmaus. Chirurgisches Forum 29 (2001) [3]*Winkler, S., *Proßt, R., *Stern, J., *Rheinwald, M., Haase, Th., *Herfarth, Ch., *Gahlen, J.: Adjuvant intraoperative photodynamic therapy (AIOPDT) after photosensitization with mthpc in a CC531 colon carcinoma model in mice. Clinical Lasers and Diagnostics, Proceeding of SPIE Vol (2001) [4]*Reuther, T., *Kübler, A. C., Zillmann, U., Benner, A., *Staff, C., Haase, T., *Flechtenmacher, C., Sinn, H.: Comparison of the clinical efficiency of Photofrin-II-, mthpc-, mthpc-peg-and mthpcnpeg-medicated PDT in a human xenografted head and neck carcinoma. Lasers Surg. Med. 29 (2001) [5]*Kübler, A. C., *Reuther, T., *Staff, C., Haase, T., *Flechtenmacher, C., Benner, A., *Scheer, M., Zillmann, U.: Klinische Wirksamkeit von m-thpc-peg in einem neuen xenogenen Tumor-Tiermodell für humane Plattenepithelkarzinome. MundKieferGesichts-chir. 5 (2001) [6]*Winkler, S., *Proßt, R., *Pressmar, J., *Laubach, H.-H., *Rheinwald, M., Haase, Th., Sinn, H., *Gahlen, J.: Spektrometrische Untersuchungen zum Anreicherungsverhalten von ALA, mthpc und Photofrin im Kolonkarzinom Tumormodell (CC531). Lasermedizin 15 (2000) Chemotherapeutisch wirksame Verbindungen gegen Trypanosoma brucei Subspecies (V E100) U. Zillmann, M.R. Berger, S.M. Konstantinov* *Medizinische Universität Sofia, Bulgarien In Zusammenarbeit mit: H. Sinn, DKFZ; R. Brun, Protozoologische Abteilung/WHO-Drug-Screen-Center, Tropeninstitut Basel, Schweiz; R. Kaminsky, Novartis Animal Health, 1566 St. Aubin, Schweiz Die gezielte Entwicklung von Verbindungen, die gegen drei Subspecies der Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit wirksam sind, stagniert seit mehreren Jahrzehnten. Resistenzbildungen u. a. gegen Melarsoprol machen deren Entwicklung umso notwendiger. In neuerer Zeit wurden deshalb vermehrt solche Pharmaka auf eine mögliche trypanozide Wirkung untersucht, von denen bereits eine antineoplastische Wirkung bekannt war. Wir konnten an einem akuten Mausmodell (NMRI, T.b. brucei, STIB 920) eine geringe aber signifikante Wirkung von Alkylphosphocholinen auf die Überlebenszeit infizierter Mäuse nachweisen [*Konstantinov, V230/V231 Zentrales Tierlabor S. et al., Acta tropica 64 (1997) ]. Die hierbei beobachtete Wirkung war mäßig und entsprach nicht derjenigen, die bei den taxonomisch verwandten Leishmanien zur Heilung führte [A. Kuhlencord et al., Antimicrob. Agents Chemother. 36 (1992) 1630; D.T. Herwaldt, The New England Journal of Medicine. 341 (1999) 1840]. Da Trypanosomen gegenüber bestimmten Metallkomplexen (z. B. Arsen) eine hohe Empfindlichkeit zeigen, haben wir als zweite Gruppe von Pharmaka antineoplastisch wirksame Metallkomplexe untersucht. Die klinisch gebräuchlichsten Verbindungen sind Derivate von Platin, die seit mehr als 15 Jahren in der antineoplastischen Chemotherapie breit eingesetzt werden. Als Leitsubstanz dieser Gruppe haben wir cis-platin eingesetzt und seine trypanozide Wirkung in vivo nach alleiniger Gabe oder nach Kombination mit Hexadecylphosphocholin in dem gleichen, oben beschriebenen akuten Mausmodell untersucht [Berger, M. R., Zillmann, U.: Jahrestagung der DTG, Heidelberg (1997) Tagungband, P28]. Eine Monotherapie mit cis-platin (cp) war hochwirksam, da bis 50% der Tiere länger als 90 Tage überlebten und daher als,,geheilt angehen wurden konnten. Die Kombinationstherapie mit HPC und cp war demgegenüber nicht erfolgreicher als die Monotherapie mit cp. In weiteren Untersuchungen wurde die Wirkung von zytotoxischen Verbindungen untersucht, die an humanes Serumalbumin (HSA) oder hochmolekulare Zucker kovalent/ adhärent gebunden waren (Synthese: H. Sinn). Von 9 Komplexen war nur das HSA-1,4 - Diaminoanthrachinon (0.3 mg/ml; 1 ml i.p. auf 30 g Maus, Appl. ein Tag vor Infektion) prophylaktisch wirksam. Curcumin (Extrakt aus der Currystaude) zeigte in vitro an verschiedenen Tumorzelllinien und dem T.b. brucei Referenzstamm eine deutliche antiproliferative Wirkung. Diese konnte in vivo wegen der Toxizität des alkoholischen Lösungsmittels nicht bestätigt werden. Danach wurden weitere zytotoxisch wirksame Verbindungen untersucht, wie das HSA- und Glucosamin-gebundene Rivanol (Acridine Orange). In vitro entfaltete nur das ungebundene, untoxische Rivanol eine minimale inhibitorische Aktivitat. In vivo (T.b. brucei) wirkten die gebundenen Einzelkomponenten lebensverlängernd und die physikalische Mischung (1:1) bei 13/13 NMRI-Mäusen heilend (Überlebenszeit < 90 Tage). Geplant ist zukünftig, Inhibitoren von Nucleosidtransportern, wie die Flavonoide (z. B. Citrin, Rutin), allein oder an HSA gekoppelt in vitro und in vivo auf ihre trypanozide oder -statische Wirkung hin zu untersuchen [Mäser et al., J. Mol. Med., 79 (2001) ]. 371

372 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Übersicht Forschungsschwerpunkt Infektion und Krebs Sprecher: Prof. Dr. (PhD) Jean Rommelaere 372 Tumorvirologie (F010) Prof. Dr. (PhD) Jean Rommelaere! , FAX J.Rommelaere@DKFZ.de Genom-Veränderungen und Carcinogenese (F020) Prof. Dr. rer. nat. Lutz Gissmann! , FAX L.Gissmann@DKFZ.de Virale Transformationsmechanismen (F030) Prof. Dr. rer. nat. Frank Rösl! , FAX F.Roesl@DKFZ.de Pathogenitätsmechanismen (F040) Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Harald zur Hausen Prof. Dr. rer. nat. Frank Rösl! , FAX ZurHausen@DKFZ.de Zelldifferenzierung (F050) Prof. Dr. med.vet. Angel Alonso! , FAX A.Alonso@DKFZ.de Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (F060) Prof. Dr. rer. nat. Claus H. Schröder ( - 1/04)! , FAX C.Schroeder@DKFZ.de Tumorvirus-Charakterisierung (F070) Prof. Dr. (D. Sc.) Ethel-Michèle de Villiers! , FAX e.devilliers@dkfz.de Retrovirale Genexpression (F080) Prof. Dr. rer. nat. Rolf Flügel ( - 2/03)! , FAX R.M.Fluegel@DKFZ.de Der Forschungsschwerpunkt Angewandte Tumorvirologie befaßt sich mit der Rolle von Viren bei der Tumorentstehung des Menschen, dem Mechanismus der Virus-bedingten Krebsentstehung und dagegen gerichteten körpereigenen Abwehrmechanismen. In besonderer Weise werden aber auch Diagnostik und Vorbeugung gegenüber solchen Virusinfektionen sowie therapeutische Ansätze unter Verwendung von Viren als Genvektorsystemen untersucht. Im Vordergrund tumorvirologischer Untersuchungen stehen die Rollen von Papillomviren bei Genital-, Oropharyngeal- und Hautkrebserkrankungen, von Hepatitis B Viren beim Leberzellkrebs, und als deutlicher Schwerpunkt auch die Rolle von Helfer-unabhängigen und Helfer-abhängigen Parvoviren bei der Hemmung von Tumorwachstum. Darüber hinaus werden Analysen zur Kontrolle von Infektionen mit HIV-Viren und auch zur Regulation von Spumaviren durchgeführt. Von besonderem Interesse sind derzeit Bemühungen, Parvovirussysteme zu Genvektorsystemen auszubauen. Die Abteilung Tumorvirologie wird ihre laufenden Forschungsaktivitäten zum Thema biologische Antitumorstrategien fortsetzen. Zu diesen Strategien zählen (A) die therapeutische Anwendung onkotroper Viren und (B) die gezielte Blockierung zellulärer Mechanismen, mit deren Hilfe sich Tumorzellen von DNA-schädigenden Einwirkungen erholen können. Ein weiteres wichtiges Ziel unserer Forschung besteht (C) in der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die den parvoviralen Lebenszyklen zugrunde liegen, da von diesen Erkenntnissen wichtige Impulse für die verbesserte Gestaltung parvoviraler Vektoren ausgehen. (A) Natürliche und rekombinante Parvoviren werden auf ihre Anwendbarkeit als anti-tumorale Effektoren und als Vektoren für die Gentherapie untersucht. Dabei ist weiterhin Grundlagenforschung nötig, um die Tumorzellspezifität des Angriffs von autonomen Parvoviren zu erhärten. Die anwendungsbezogene Forschung beinhaltet die Optimierung gegenwärtig verfügbarer Verpackungssysteme sowie die Untersuchung möglicher Antitumorgene auf ihre Eignung zur Behandlung verschiedener Tumore. In präklinischen Studien werden Effekte und Wirkmechanismen rekombinanter Parvoviren untersucht, sowie deren Einsatz als Träger zur prophylaktischen und therapeutischen Vakzinierung gegen das Papillomavirus induzierte Zervixkarzinom. (B) Die Infektion menschlicher Tumorzellen mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) verstärkt deren Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika und vermindert in vivo die Nebenwirkungen solcher Stoffe. Es wird untersucht, inwieweit diese Eigenschaften von AAV für die Krebstherapie beim Menschen nutzbar gemacht werden können und ob AAV auch die Ausbildung einer Resistenz gegen Chemotherapeutika verhindern kann. (C) Unter Einsatz neuester Genarraytechnologien wird die Auswirkung der parvoviralen Infektion auf die Zielzelle untersucht und nach Kriterien gesucht, die eine Sensitivität bzw. Resistenz gegenüber diesen Viren bewirken. Diese Studien werden durch Untersuchungen ergänzt, die darauf abzielen, zelluläre Interaktionspartner für virale Effektoren zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren. Die Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen bearbeitet das Gebiet der Virus-induzierten Karzinogenese am Beispiel der humanen Papillomviren (HPV; Kopf- und Halstumore, Zervixkarzinom) und am Beispiel des Hepatitis-B-

373 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Virus (HBV; Leberkarzinom). Schwerpunkte sind Aspekte der Grundlagenforschung, der Diagnose und der Therapie. Im Einzelnen sind dies Untersuchungen zur Expression viraler Onkoproteine und ihrer Wechselwirkung mit Proteinen der Zelle. Näher studiert wird ein zelluläres Gen, das als Ziel chromosomaler Integration von HPV-DNA identifiziert worden war und anscheinend für einen neuen Tumorsuppressor kodiert. Arbeiten im Bereich der Diagnose gelten dem Nachweis von HPV-DNA im Tumorgewebe und von HBV-Nukleinsäuren im Serum chronisch infizierter Patienten. Im Falle von HBV ist es dabei das Fernziel, Formen der Infektion zu beschreiben, die ein besonderes Risiko zur Ausbildung von Leberkrebs vermitteln. Zur Prävention der Krebsentstehung und zur Krebstherapie werden Peptidaptamere entwickelt, die gezielt die HBV-Replikation hemmen und die HPV-Onkoproteine inaktivieren. Die Abteilung Virale Transformationsmechanismen befasst sich gegenwärtig mit folgenden Fragestellungen: Mechanismen der HPV-bedingten Karzinogenese (Apoptose, epigenetische Modifikationen der Wirtszelle nach Virusinfektion), Regulation der Transkription humanpathogener Papillomviren durch zelluläre Transkriptionsfaktoren; Entwicklung viraler Vektoren mit Papillomvirus-spezifischen Proteinkomponenten für Vakzinierungszwecke; Regulation der Zytokin/ Chemokinexpression in HPV-positiven Zellen und Makrophagen. Der Abteilung angegliedert ist die Arbeitsgruppe von Frau Priv. Doz. Dr. Ingrid Hoffmann: deren Schwerpunkt ist die Analyse des Zellzyklus. Die Projektgruppe Pathogenitätsmechanismen (Leiter: Prof. Dr. Dr. h. c. mult. Harald zur Hausen; Prof. Dr. Frank Rösl) bestand bis zum Jahr 2003 aus mehreren unabhängigen Arbeitsgruppen mit folgenden Forschungsaktivitäten: Ätiologie lymphoproliferativer Erkrankungen, onkosuppressive Eigenschaften von Parvoviren, Identifizierung neuer humanpathogener Viren sowie Etablierung innovativer Vakzinierungsstrategien mittels viraler Vektoren. Die Mitglieder der Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese bearbeiten grundlegende und anwendungsorientierte Aspekte von humanpathogenen Papillomaviren (HPV), Polyomaviren des Menschen und HIV. Es werden Mechanismen der Entstehung infektiöser Viruspartikel sowie der Wechselwirkung zwischen dem Virus und seiner Wirtszelle untersucht. Auf der Basis dieser Erkenntnisse werden Methoden zur Diagnose, Prävention und Therapie von durch diese Viren hervorgerufenen Infektionen und Erkrankungen entwickelt. Außerdem sollen die Viren selbst als Vektoren zur Entwicklung von Impfstoffen oder von gentherapeutischer Verfahren eingesetzt werden. Hauptziele der Arbeitsgruppen der Abteilung Tumorvirus- Charakterisierung sind, die Rolle von Viren bei Tumorerkrankungen zu ermitteln, neue und partiell bekannte Viren dort zu identifizieren und zu charakterisieren und deren Wechselwirkung mit Wirtsproteinen und dem Gesamtorganismus zu bestimmen. In dieser Abteilung konnten kürzlich 10 neue Papillomvirustypen, über 80 Circoviren und ein neues Adeno-assoziiertes Virus identifiziert werden. Die Wechselwirkung zwischen kutanen Papillomviren, proinflammatorischen Zytokinen, ultraviolettem Licht und dem zellulären p53 Protein in der Pathogenese von Nicht-Melanom Hautkarzinomen wurde näher analysiert. Übersicht Die Ziele des Forschungsvorhabens der Abteilung Retrovirale Genexpression beinhalten die Aufklärung der Wirkungsmechanismen der Genexpression des humanen Spumaretrovirus (HSRV), die Wechselwirkungen der retroviralen Proteine mit den Wirtszellen und den daraus resultierenden Veränderungen. Diese Untersuchungen zielen in erster Linie darauf, neue retrovirale Vektoren zu entwickeln und auf ihre biologische Sicherheit in einem Katzenmodell zu überprüfen (in Kooperation mit einer australischen Gruppe). Der molekulare Mechanismus der HSRV Integration in die chromosomale DNA der Wirtszellen steht bei diesen Untersuchungen im Mittelpunkt. Langfristig sollen neue Vektoren, die über größere Kodierungskapazitäten verfügen als herkömmliche retrovirale Systeme, für Gentransferexperimente eingesetzt werden. 373

374 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F010 Tumorvirologie 374 Abteilung Tumor Virologie (F010) Leiter: Prof. Dr. Jean Rommelaere Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Jan Cornelis Dr. Celina Cziepluch Dr. Laurent Daeffler Dr. Laurent Deleu (9/02-) Dr. Christiane Dinsart Dr. Nathalia Giese (-9/02) Dr. Jean-Claude Jauniaux PD Dr. Jürgen A. Kleinschmidt Dr. Ute Koch (2/03-) Dr. Dirk Kuck Dr. Susanne Lang (4/03-) Barbara Leuchs Dr. Jürg Nüesch Dr. Rémy Poirey Dr. Zahari Raykov (4/02-4/03) PD Dr. Anne Régnier-VigourouxDr. Nathalie Salomé Prof. Dr. Jörg R. Schlehofer Dr. Ekkehard Werner Dr. Claudia Wrzesinski (-3/03) Gastwissenschaftler Dr. Karsten Geletneky Dr. Edicio Armbruster (12/02-1/03) Sao Paulo, Brasilien Dr. Jianhong Li (8/03-) Shanghai, VR China Dr. Oliver Müller Dr. Jiong Liu (7-12/02) Wuhan, VR China Dr. Noelia Valle Benitez (6-9/03) Madrid, Spanien Dr. Zi-Ling Wang (9/03-) Peking, VR China Dr. Zahari Raykov, (9/03-) Sofia, Bulgarien Doktoranden und Doktorandinnen Anette Abschütz (4/02-) Julie Aldinger Xanthippi Apsi (-7/02) Katrin Arndt (5-10/03) Svenja Bleker (7/02-) Christian Boeke (-12/02) Virginie Daeffler (-11/03) Simin Dexler (12/03-) Marta Enderlin Andreas Hartkopf (4/03-) Tim Kayser Klaudia Kiehl (-4/03) Regina Koch (10/02-) Yan Yan König (4/02-) Bettina Kohlhoff (-4/02) Stephanie Kronenberg Lars Krüger Sylvie Lachmann (-8/03) Susanne Lang (-3/03) Tobias Lau (-8/03) Christoph Leder (-7/03) Mirjam Leuchtenberger (6/02-) Jianhong LI (5-9/02) Dessislava Nikolova (3/03-) Julia Peters Sabine Poltermann (7/02-) Julius Pochhammer Zahari Raykow (-4/02) Katharina Till Daniel Waterkamp (2/03-) Daniel Weiß Christine Wenig (5/02-6/03) Natascha Winkelhöfer (1/02-) Marc Winnefeld (7/02-) Ying Ying (10/03-) Heiko Zimmer (-3/02) Diplomanden und Diplomandinnen Anette Abschütz (-1/02) Svenja Bleker (5/01-2/02) Stephanie Bölz (9/02-2/03) Jennyfer Carrière (4-9/03) Anika Eckert (7/03-) Sabrina Hahn Florian Hahne (2-11/03) Nicolas Jauniaux (2-5/03) Svenja Leible (3-7/03) Doreen Markur (3-8/03) Stefan Mehrle (-10/02) Christophe Olinger (9/03-) Florian Sonntag (7/01-4/02) Nicole Schwinn (1-9/03) Hanna-Mari Tervo (9/03-) Lia Tesfay (-5/02) Marc Winnefeld (-7/02) Arzt im Praktikum (AIP) Marta Herrero Technisches Personal Katrin Bächle Ginette Balboni (-4/02) Matthias Ehrbar Renate Geibig (Teilzeit) Annabel Grewenig Rita Hörlein (Teilzeit) Andrea Kern (Teilzeit) Michèle Klein Regina Ly Sabine Mende (-5/02) Marcus Müller Silvia Münstermann Claudia Plotzky (Teilzeit) Petra Poberschin (Teilzeit) Kristin Schmidt (Teilzeit) Anouk Smet (-1/02) Alexandra Stroh-Dege Katja Sucker (Teilzeit) (7/03-) Zivildienstleistende Jonas Müller (6/02-5/03) Dennis Reinhard (9/03-) Alexander Rothkopf (-8/02) Sekretariat Ellen Burkard Auszubildende Nina Hensch (5/02-3/03) Anja Irsigler (-11/02) Carmen Mader Joachim Neuert (10/03-) Sabine Rauth (8-10/02) Marlene Roth (10/03) Nadja Stephan (-4/02) Maria Talamini (2/03-) Neben Viren, die Tumoren induzieren, gibt es auch Viren, die das Krebswachstum hemmen. Auf die letztere Gruppe von Viren, die zur Familie der Parvoviren gehören, konzentriert die Abteilung ihre Forschungsaktivitäten. Die antitumorelle Wirkung der Parvoviren beruht - zumindest zum Teil - auf ihrer Fähigkeit, das Absterben von Tumorzellen oder Differenzierungsvorgänge von neoplastischen Zellen zu induzieren. Darüber hinaus haben einige Vertreter dieser Viren die interessante Eigenschaft, Tumorzellen gegenüber genotoxischen Agenzien, die bei der Krebstherapie eingesetzt werden, zu sensibilisieren. Die Arbeit der Abteilung zielt zum einen darauf, die Mechanismen aufzuklären, die für die krebshemmende Wirkung der Parvoviren verantwortlich sind, und zum anderen Parvoviren für einen Einsatz in der Gentherapie von Krebs zu entwickeln. Durch ihre biologischen Eigenschaften sind die Parvoviren viel versprechende Vehikeln zur Transduktion und Expression von Genen, die in definierten Geweben, insbesondere Tumoren, therapeutisch wirksam sind. Deshalb werden in der Abteilung auf der Basis von Parvoviren Vektoren entwickelt und nach neuen Effektorgenen gesucht, die zur Gentherapie von Tumoren eingesetzt werden können.

375 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs A) Analyse und Suppression der malignen Transformation mit Hilfe von normalen und rekombinanten Parvoviren (F010-01) J. Rommelaere, J. Cornelis, C. Cziepluch, L. Daeffler, l. Deleu, C. Dinsart, N. Giese, J.-C. Jauniaux, U. Koch, J. Li, J.P.F. Nüesch, R. Poirey, A. Régnier-Vigouroux, N. Salomé, N. Valle-Benitez, E. Werner, C. Wrzesinski, Z. Raykov, A. Abschütz, X. Apsi, V. Eichwald-Daeffler, M. Enderlin, T. Kayser, S. Lachmann, S. Lang, D. Nikolova, J. Peters, N. Winkelhöfer, M. Winnefeld, H. Zimmer, S. Bölz, J. Carrière, A. Eckert, S. Hahn, F. Hahne, N. Jauniaux, S. Leible, C. Olinger, N. Schwinn, H.-M. Tervo, L. Tesfay Diese Gruppe stellt eine gemeinsame Forschungseinheit des DKFZ und INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U375) dar. In Zusammenarbeit mit: J.M. Almendral, Universität Autonoma de Madrid, Madrid, Spanien; J.L. Souciet, Louis Pasteur University, Strasbourg, Frankreich; M. Tommasino, DKFZ; L. Willems, Faculty of Agronomy, Gembloux, Belgien; S. Sozzani, Institut Mario Negri, Mailand, Italien; W. Spaan, Universität Leiden, Leiden, Niederlande; J. van Damme, Universität Leuven, Leuven, Belgien; M. Möhler, Universität Mainz; K. Geletneky, Universität Heidelberg; M. Hergenhahn, H. Spring, E. Spiess, R. Zawatzky, alle DKFZ Zurückliegende in vitro wie auch tierexperimentelle Studien haben gezeigt, dass das Wachstum etlicher humaner Tumoren stark durch die onkolytischen und onkosuppressiven Aktivitäten von Wildtyp wie auch rekombinanten Derivaten autonomer Parvoviren beeinträchtigt wird. Wichtigstes Ziel der Arbeitsgruppe ist es deshalb, die onkosuppressiven Eigenschaften von Wildtyp und rekombinanten autonomen Parvoviren einer Anwendung in der Therapie von Krebserkrankungen zuzuführen. Gegenwärtig zielt ein Teil unserer Arbeit darauf, durch genetische Veränderungen Parvoviren mit verbesserter Wirkung zu entwickeln. Ansatzpunkte hierfür ergeben sich aus der Aufklärung einiger molekularer Mechanismen, die dem Onkotropismus autonomer Parvoviren zugrunde liegen. Des Weiteren sollen aber auch grundlegende Fragestellungen bezüglich der Parvovirus-vermittelten Zytotoxizität und Immunmodulation beantwortet werden, da diese beiden Aspekte der Parvovirus-Wirts-Wechselwirkung nur unzureichend aufgeklärt sind. Triebfeder für diese Arbeiten ist die Aussicht, durch die Entdeckung neuer zellulärer Faktoren bzw. Signaltransduktions-Kaskaden, die sich als Ziele für eine nichtkonventionelle Krebstherapie mit Parvoviren oder in der Wirkung analoger Substanzen eignen könnten, neue Anti- Krebstoxine bzw. Vakzine zu entwickeln. Neben der präklinischen Evaluation rekombinanter Parvoviren sollen die meist versprechenden Vektoren für eine klinische Nutzung erprobt werden. Mit unseren klinischen Kollaborationspartnern bereiten wir darüber hinaus Phase I/II Studien vor, die darauf abzielen Tumoren wie z.b. Gliome und Pankreastumoren zu behandeln, die sehr häufig konventionellen Therapien gegenüber resistent sind, die sich aber gegenüber einer Parvovirus-bedingten Toxizität als sensitiv erwiesen haben. Abteilung F010 Tumorvirologie 1) Parvovirale Onkolyse und die Entwicklung neuer Zielmoleküle zur Krebstherapie Koordinator: J. Rommelaere a. Parvovirale Zielmoleküle modulieren Signalwege der Antitumor Immunantwort L. Daeffler, U. Koch Für den Einsatz in der Krebstherapie bieten autonome Parvoviren (PV) aufgrund ihres Onkotropismus und ihrer onkolytischen Aktivität die besten Voraussetzungen. Ein Hauptziel unseres Forschungsinteresses liegt darin, den Vorgang, der durch das autonome PV Murine Virus of Mice Prototyp (MVMp) ausgelösten Zelllyse auf viraler und zellulärer Ebene aufzuklären. Das nicht-strukturelle Phosphoprotein 1 (NS1) des MVMp hat zentrale Funktionen, die essentiell für die Virusvermehrung sind. Insbesondere reguliert NS1 sowohl die virale DNA Replikation als auch die zytotoxische Wirkung in den Wirtszellen. Es wurde gezeigt, dass NS1 in anbetracht der zytotoxischen Wirkung zytostatische Effekte hat und zur Induktion der Zelllyse erforderlich ist. Mehrere der spezifischen Eigenschaften von NS1 werden durch eine sequentielle Phosphorylierung der viralen Polypeptide mittels der Proteinkinase C Proteinfamilien koordiniert. Durch gezielte Punktmutationen im Karboxylende des NS1 Proteins wurden zwei neue Mutanten des MVMp Virus hergestellt, die zum einen erhöhte und zum anderen reduzierte toxische und lytische Aktivität aufwiesen [22]. Zusammenfassend konnten wir erstmals zeigen, dass späte Phosphorylierungen in der Karboxyldomäne des MVMp NS1 Proteins die toxischen und lytischen Aktivitäten des Virus regulieren. Die Herstellung einer replikationsfähigen hypertoxischen Mutante des MVMp Virus eröffnet neue Perspektiven in der Anwendung von Nagerparvoviren in der Krebsbekämpfung. Die hypertoxische PV Mutante könnte durch verstärkte lytische Aktivität eine erhöhte Freisetzung tumorspezifischer Antigene und anderer immunstimulierender Moleküle von infizierten Krebszellen im Vergleich zum Wildtyp Virus bewirken. In Pilotexperimenten wurden der Wildtyp MVMp PV und eine Interferon β-induzierende Mutante in einem murinen Melanommodell analysiert und in Kokulturexperimenten wurden dendritische Zellen auf Aktivierungsmarker, Expressionsprofile der Toll-like Rezeptoren und Crosspriming untersucht. b. Induktion des Zelltods mittels autonomer Parvoviren L. Deleu In den letzten Jahren konnten wir zeigen, dass autonome PV H-1 und MVMp sowohl apoptotische als auch nichtapoptotische Signalwege des Zelltods induzieren. Dies geschieht jedoch immer in Abhängigkeit der Herkunft der jeweiligen Zelle. Konventionelle Krebstherapien, die auf genotoxischen Substanzen basieren, haben meistens sich teilende Zellen als Zielgewebe oder diese Therapien nutzenlösliche zelltodinduzierende Liganden (z.b. TNFα oder TRAIL). Diese Ansätze sind jedoch oft in der Effizienz dadurch begrenzt, dass die Krebszellen entweder durch natürliche Selektion oder durch allmähliche Resistenzselektionierung gegenüber diesen Agenzien widerstandsfähig werden. Deshalb ist eine klare Herausforderung in der Krebsbekämpfung, die Vorgänge, die das Überleben der neoplastischen Zellen bewirken, zu neutralisieren. Autonome PV sind in der Lage, verschiedene Signalwege des induzierten Zelltodes zu stimulieren. Deshalb kommt ihnen 375

376 376 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs eine viel versprechende Bedeutung in der Krebstherapie zu. Wir untersuchten frühe Passagen von Zellen aus Gliomen und Astrozytomen von Krebspatienten in einer Kollaboration mit der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg (Dr. Karsten Geletneky). Diese Zellen wurden auf ihre Sensitivität gegenüber konventionellen Behandlungstherapien und PV H-1 Infektionen untersucht. Bisher konnte gezeigt werden, dass PV H-1 den Zelltod besonders effektiv in Gliomen und Astrozytomen auslöste, unabhängig von deren Resistenz oder Sensitivität gegenüber konventionellen Krebsbekämpfungsmetho-den. Ferner löste das PV H-1 auch den spezifischen Zelltod durch die Aktivierung von zellulären Proteasen aus, unabhängig von Kaspase-induzierten Signalwegen. c. Zelluläre Funktion des humanen small glutamine-rich TPR-containing Proteins (hsgt) C. Cziepluch, M. Winnefeld Das zelluläre hsgt Protein wurde auf Grund seiner Interaktion mit NS1, dem wichtigsten regulatorischen Protein des autonomen Parvovirus H-1, identifiziert [Cziepluch et al., J. Virol. 72 (1998) 4149]. Nach Infektion akkumuliert hsgt zusammen mit NS1 in so genannten APAR-bodies nukleäre Strukturen, an denen die parvovirale DNA-Replikation erfolgt [Cziepluch et al., J.Virol. 74 (2000) 4807]. Es gibt Hinweise, dass hsgt eine Rolle in der viralen Replikation oder nachfolgenden Prozessen im viralen Lebenszyklus übernimmt. Da das SGT Protein in allen bislang untersuchten Zelllinien und Geweben nachgewiesen werden konnte, und SGT-kodierende Gene in Organismen von der Hefe bis zum A C Das humane SGT Protein lokalisiert während der Anaphase in einer Mitose-relevanten Struktur (midzone). A: Die Verteilung des hsgt Proteins (rot) in humanen Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und konfokale Laser- Mikroskopie sichtbar gemacht. hsgt akkumuliert während der Anaphase in der midzone. B: Die Lokalisation von Tubulin (grün) in der selben Zelle. C: Eine Darstellung bei der die Signale aus A und B vereinigt wurden. Strukturen, die sowohl hsgt als auch Tubulin enthalten erscheinen gelb. D: In der Differential Interferenzkontrast Mikroskopie (DIC) sind die kondensierten Chromosomen gut zu erkennen. Abbildung in Zusammenarbeit mit Dr. H. Spring (DKFZ). B D Abteilung F010 Tumorvirologie Menschen gefunden wurden, geht man davon aus, dass es ein Housekeeping -Protein sein könnte. Die hier vorgestellte Untersuchung hat zum Ziel, zelluläre Prozesse zu identifizieren, an denen das hsgt Protein beteiligt ist, und die Funktion des Proteins aufzuklären. Erste Hinweise auf eine mögliche Rolle des hsgt Proteins in der Mitose ergaben Immunfluoreszenzanalysen, die zeigten, dass dieses Protein spezifisch in Mitose-relevanten Strukturen wie der Zentralspindel und dem Mittelkörper akkumuliert [Abbildung]. Der entscheidende Nachweis gelang durch Knock-down Ansätze. Es zeigte sich, dass teilungsaktive Zellen, in denen die zelluläre Menge des hsgt Proteins durch RNA Interferenz experimentell reduziert wurde, unmittelbar während der Mitose sterben [28]. Unklar ist bislang noch, welche Funktion hsgt in der Mitose hat. Da zuvor bereits Hinweise auf eine Co-Chaperon Aktivität des hsgt Proteins in der neuronalen Signaltransduktion erhalten wurden, ist nicht auszuschließen, dass dieses Protein auch in der Mitose als Co-Chaperon wirkt. Zur Aufklärung der molekularen Funktion des hsgt Proteins während der Zellteilung wird es nötig sein, Mitose-spezifische Interaktionspartner dieses Proteins zu identifizieren, eine Fragestellung, die im Fokus unserer aktuellen Forschung steht. d. Wechselwirkung zwischen parvoviralen Proteinen und der Wirtszellphysiologie J.P.F. Nüesch, J. Rommelaere Unsere Studien behandeln das Wechselspiel zwischen dem Parvovirus MVMp (minute virus of mice) und seiner Prototyp- Wirtszelle A9, eine transformierte Fibroblastenzelllinie der Maus. Dabei befassten wir uns in erster Linie mit der Regulation des grossen Nichtstrukturproteins NS1 seiner vielfältigen Funktionen und Eigenschaften, über Phosphorylierungen durch zelluläre Proteinkinasen. Dabei spielen Isoformen der PKC Familie, im Speziellen PKCλ und PKCη eine wesentliche Rolle, sind sie doch für die Aktivierung von NS1 seiner Funktionen in der viralen DNA-Replikation sowohl in zellfreien biochemischen Assays als auch in der Wirtszelle absolut notwendig [15, 17]. Dabei ist zu erwähnen, dass diese spezifischen Phosphorylierungsvorgänge gezielt das biochemische Spektrum des viralen Proteins verändern und so seine differenzierten Funktionen, wie die Initiation der Replikation, seine Eigenschaften als Transkriptionsfaktor, wie auch seine multiplen Funktionen, die den Zelltod und Lyse initiieren, beeinflussen. Die Studien über die Funktionen von NS1, die an der Replikation beteiligt sind, haben dabei maßgeblich mitgeholfen, diese Replikationsvorgänge aufzuschlüsseln [4]. In der Tat konnten wir zeigen, dass durch gezielte Mutation des viralen Proteins an PKC Phosphorylierungsstellen seine replikativen Eigenschaften von seiner zytotoxischen Wirkung getrennt werden konnten [22]. Dies bedeutet, dass Zelltod und Lyse nicht nur Nebenwirkungen der viralen Vermehrung sind, sondern spezifische virale Vorgänge darstellen, die einer optimalen Vermehrung und Verbreitung des Parasiten dienen. Da die onkolytischen Eigenschaften autonomer Parvoviren im Rahmen des Gentherapie Programms unserer INSERM-Gruppe im Vordergrund stehen, ist es uns wichtig, die molekularen Vorgänge, die nach Infektion zum Zelltod führen, im Detail aufzuschlüsseln. Dabei sind wir an der Interaktion von MVM mit zellulären Proteinkinasen interessiert. Die Abhängigkeit einer produktiven Infektion von spezifischen Phosphorylierungsvorgängen durch PKC Isoformen wies darauf hin, dass die virale Infektion auch die intrazelluläre Aktivität dieser Proteinkinasen

377 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs beeinflussen könnte. Interessanterweise konnten wir zeigen, dass beide NS1-regulierenden Kinasen PKCλ und PKCη nach MVM Infektion in der Zelle umverteilt werden [15,17]. Dies kann zu dramatischen Veranderungen der Zellphysiologie führen, und in Konsequenz zumindest eine Ursache für die Veränderungen in der Zellmorphologie (cytopathischer Effekt) sein. Deshalb steht gegenwärtig die Analyse der NS1-induzierten Zellveränderungen im Vordergrund unserer Untersuchungen. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Ab- und Umbau von Mikro- und Intermediärfilamente des Zytoskeletts durch die virale Infektion betroffen sind, wobei Mikrotubuli während der ganzen Infektionsdauer erhalten bleiben (Publikation in Vorbereitung). Hierbei scheint die Aktivität der PKCs zumindest in der Regulation von NS1 eine wesentliche Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die NS1-induzierten Zellveränderungen durch Mutationen an PKC Phosphorylierungsstellen im viralen Protein inhibiert wurden. Dabei reguliert PKCλ die Interaktion von NS1 mit CKIIα, der katalytischen Untereinheit der zellularen Caseinkinase II. Dieser NS1/CKIIα Komplex reguliert die Phosphorylierung der Tropomyosinfilamente und bewirkt damit in dramatischer Weise den Umbau des Zytoskeletts (Manuskript in Vorbereitung). Aufgrund dieser Befunde haben wir semisynthetische Toxine entwickelt, die für die transformierte A9 Zelllinie toxisch sind, von anderen Zelllinien aber toleriert werden [Patent Nüesch und Rommelaere, 2003]. Die Weiterentwicklung solcher Onkotoxine und ihre Applikation durch heterologe virale Vektorsysteme sind weitere Projekte unserer Arbeitsgruppe. Im Rahmen unserer Studien zur Biologie der Parvoviren wurden wir auch eingeladen, an einem Kompendium über Viren mitzuarbeiten [14]. Abteilung F010 Tumorvirologie Chemokin IP-10 potenziert und in einem murinen Hämangiosarkom-Modell (Kaposi-Sarkom Analog) getestet. Bereits wenige intratumorale Anwendungen dieser rekombinanten MVMp-IP10 Viren genügten, um eine signifikante Reduktion der primären Tumoren zu erzielen. Diese Studien wurden in Zusammenarbeit mit Team 2 durchgeführt [3]. Unglücklicherweise induzieren sowohl natürlich vorkommende wie rekombinante autonome Parvoviren bereits nach wenigen Applikationen eine starke Immunantwort im Wirt. Dies stellt ein generelles Problem für die systemische Anwendung solcher Agenzien dar, da sie von neutralisierenden Antikörpern abgefangen werden. Um diesem negativen Einfluss zu entgehen, haben wir neue Strategien zur Applikation von autonomen Parvoviren entwickelt. (iii) Als Modell dienten krebsbefallene Ratten. Die metastasierenden Tumoren in der Lunge wurden durch Einspritzen einer Hepatomzelllinie induziert. Zur Behandlung mit autonomen Parvoviren wurde dieselbe Zelllinie mit dem Wildtyp des Rattenvirus H-1 infiziert. Durch gezielte γ-bestrahlung der infizierten Zellen wurde zwar das Wachstum der Krebszellen gestoppt, und damit eine Verbreitung der Geschwüre verhindert, die Replikation der Parvoviren hingegen blieb erhalten. Diese in vitro infizierten Zellen dienten dann als Vehikel, um das therapeutische Parvovirus in das krebsbefallene Tier zu schleusen. Mittels intravenöser Applikation solcher Parvovirus-tragenden Vehikel konnte eine hohe Konzentration der therapeutischen Viren in der Lunge (dem Metastasen tragenden Organ) erzielt werden, was zu einer bedeutenden Reduktion (60%) der bereits existierenden Tumoren führte [27]. Gegenwärtig versuchen wir, die gewonnenen Erkenntnisse weiter auszunutzen, um in neuen Versuchsreihen eine optimale Wirkung zu erziehlen. e. Strategien zum Einsatz von parvoviralen Komponeneten in der Gentherapie Z. Raykov, J. Rommelaere Das Ziel dieses Projekt besteht darin, mittels verschiedener Strategien durch den natürlichen Onkotropismus und die onkolytische Wirkung von Parvoviren eine Verbesserung in der Krebstherapie zu erzielen. Dabei standen drei Fragestellungen im Vordergrund: (i) Gegenwärtig können autonome Parvoviren noch nicht so verändert werden, dass sie lediglich eine gewünschte Zielzelle infizieren. Zudem ist die Kapazität, Fremdgene einzuschleusen, limitiert. Um diese Restriktionen zu umgehen und die gewünschten Eigenschaften dieser Viren zu erhalten, haben wir versucht, chimäre Viren zu entwickeln. Als Modell dienten rekombinante Adenoviren, welche eine Expressionskassette aus dem parvoviralen Genom enthielten. Die toxische Wirkung der konstitutiv exprimierten Nichtstrukturproteine NS1 und NS2 bewirkte dabei, dass die Herstellung solcher chimären Viren unmöglich wurde. Durch den gezielten Einsatz spezifischer Antisense-Oligonukleotide konnten wir die Produktion der toxischen Proteine soweit einschränken, dass eine Produktion solcher Chimären ermöglicht wurde [1]. Damit konnten wir zeigen, dass einerseits die Herstellung parvoviraler Chimären möglich ist, andererseits der gezielte Einsatz von Antisense-Oligos die Produktion von rekombinanten Viren ermöglicht, welche starke Toxine exprimieren. (ii) Nichtpropagierende autonome Parvoviren allein sind nicht in der Lage, pre-existierende Tumoren vollständig zu beseitigen. Um eine erfolgreiche Therapie zu erzielen, braucht man einen Bystander-Effekt. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften autonomer Parvoviren mit dem angiostatischen 2) Parvovirus - Zielzelleninteraktionen J.-C. Jauniaux, N. Salomé Die autonom replizierenden Parvoviren MVM und H-1 Virus exprimieren vier verschiedene Proteine: die Strukturproteine VP1 und VP2, die zur Bildung des Kapsids notwendig sind, und die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Das NS1 Protein ist essentiell für die parvovirale DNA-Amplifikation und Genexpression. NS1 spielt darüber hinaus beim parvovirusvermittelten Zelltod eine wichtige Rolle (s.o.). Das NS2 Protein spielt eine entscheidende Rolle beim Aufbau des viralen Kapsids und, als mögliche Konsequenz daraus, bei der Herstellung der einzelsträngigen Parvovirus-DNA. Es gibt darüber hinaus Hinweise, dass NS2 die zytotoxische Wirkung von NS1 moduliert. Die molekularen Mechanismen, die diesen Aktivitäten zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Deren Aufklärung ist eines der Ziele unserer Arbeit. In zurückliegenden Studien haben wir nachgewiesen, dass das NS2 Protein mit dem nukleären Exportrezeptors Crm1 interagiert und über einen Crm1-abhängigen Reaktionsweg aktiv aus dem Kern infizierter Zellen transportiert wird. Um die Bedeutung dieser Interaktion für den viralen Lebenszyklus aufzuklären, wurden zwei mutierte genomische Klone hergestellt, die CRM1-Interaktions-defiziente NS2-NES(-) Proteine exprimieren. Die funktionelle Analyse dieser Klone offenbarte, dass der NS2-Crm1-Komplex weder für die Synthese der viralen Proteine (NS1, NS2, VP1 und VP2), noch für die Produktion infektiöser Virionen benötigt wird. Aber das Fehlen des nukleären Exports von NS2 und/oder die starke verringerung von NS2 im Zytoplasma der infizierten Zellen führt zur Ansammlung neu produzierter MVM-Parti- 377

378 378 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs kel im Kern, was mit einem verspäteten Erscheinen der mutierten Partikel im Kulturmedium und einer verlängerten Überlebensdauer infizierter Zellpopulationen einher geht, im Vergleich zu Kulturen, die mit Wildtyp-Virus behandelt wurden. Wir haben aus diesen Daten den Schluss gezogen, dass NS2 unbedingt notwendig für die Freisetzung neu produzierter Virionen aus dem Kern ist [5], was vermuten lässt, dass NS2 eine entscheidende Rolle bei den späten Schritten im parvoviralen Lebenszyklus zukommt. Weitere Analysen deuten darauf, dass das NS2 Protein einen Beitrag zur Erzeugung und/oder Verpackung einzelsträngiger Virus-DNA leistet. Wie NS2 in diese Prozesse eingreift, wird gerade untersucht. Zusammenfassend weisen unsere Daten darauf hin, dass NS2 eine Schlüsselrolle in molekularen Prozessen übernimmt, die essentiell für die Vermehrung und Ausbreitung infektiöser Virionen sind. Dies bedingt, dass Replikations-aktive parvovirus-basierte Konstrukte, die in der Krebsgentherapie eingesetzt werden sollen, ein intaktes NS2-kodierendes Gen enthalten müssen [26]. Ein weiteres Ziel, das unsere Gruppe verfolgt, ist die Identifizierung von Genen, die nach Infektion mit Parvoviren in verschiedenen Tumorzelllinien systematisch hoch oder herab reguliert werden. Diese Studien werden mit Hilfe der cdna Microarrays durchgeführt, die es erlauben, Veränderungen im Expressionsmuster zellulärer Gene festzustellen. Wir haben damit begonnen, die Expressionsmuster von zwei menschlichen Zelllinien, der Leukämie-Zelllinie U937 und der Hepatokarzinom-Zelllinie QGY-7703, zu vergleichen, die entweder nicht oder mit H-1 Virus infiziert wurden. Mehr als 500 Gene, deren Expression in infizierten Zellen gegenüber nicht infizierten Zellen modifiziert waren, wurden identifiziert und mittels Gene Ontology klassifiziert. Die Verbindung einiger dieser Gene zur Induktion/Repression von Apoptose oder Immunantworten wird gerade untersucht. Diese Studien sollen mit anderen Tumorzelllinien wie z.b. Darmkrebszellen oder Gliomazellen fortgesetzt werden. Wir haben auch die Genexpressionsmuster der menschlichen Leukämie-Zelllinie U937, die sehr empfindlich gegenüber einer H-1 Virusinfektion ist, mit derjenigen von Infektions-resistenten Derivaten (genannt RU 1-4) verglichen. Mit Hilfe des Affymetrix-Systems konnten über 50 Gene identifiziert werden, deren Expression zumindest in einer Variante von RU der U937 Zelllinie verändert ist. Durch eine RealTime PCR Analyse konnte die Überexpression zwei dieser Gene in resistenten Klonen bestätigt werden. Die mögliche Beteiligung dieser Genprodukte an der Resistenz der Zellen gegenüber einer Infektion mit Parvoviren wird zurzeit untersucht. 3) Natürliche und rekombinante Parvoviren in der Krebstherapie J. Cornelis, C. Dinsart Mit dem Ziel die Antitumor-Effekte natürlicher Parvoviren zu verstärken, wurden rekombinante Viren (Vektoren) hergestellt, die therapeutisch wirksame Zytokine/Chemokine oder zytotoxische Proteine exprimieren, deren Transgene unter der Kontrolle des viralen Promoters P38 stehen. Diesen Vektoren fehlen nur die Kapsidprotein-kodierenden Gene, während alle bekannten regulatorischen Elemente, die für die Replikation und Expression der viralen DNA erforderlich sind, erhalten blieben. In der Vergangenheit entstanden bei der Produktion parvoviraler Vektoren immer wildtyp-ähnliche, replikationsfähige Viren. Deshalb wurden verschiedene Strategien verfolgt, Abteilung F010 Tumorvirologie um die Verunreinigung der Vektorstocks mit solchen Viren zu minimieren. Am erfolgreichsten war der Einsatz von Split- Helfer-Konstrukten [6] sowie das sog. Cross packaging, bei dem das virale Genom mit Kapsiden verwandter Parvoviren verpackt wird [19, 24, 26]. Mit Hilfe dieser Methode konnte die Entstehung replikationsfähiger Viren verhindert werden. Es besteht die Möglichkeit, dass Tumorzellen, die insbesondere durch Apoptose sterben, von dendritischen Zellen aufgenommen werden, und dass diese im Weiteren zytotoxischen T-Lymphozyten Tumorantigene präsentieren können, so dass letztendlich Tumorimmunität erzeugt wird. Für Parvoviren konnte gezeigt werden, dass sie Antitumor- Effekte in Tieren hervorrufen, dessen Mechanismus allerdings noch unbekannt ist. Es stellte sich die Frage, ob die Immunogenität von Tumorzellen nach einer Infektion mit Parvoviren erhöht werden kann. Die Freisetzung von heat shock Proteinen (HSP) steigert bekanntermaßen die Immunität. Nach der Infektion von menschlichen Melanomzellen mit H-1 Virus wurde eine erhöhte Freisetzung von induzierbarem HSP70 aber nicht von konstitutivem HSP70 beobachtet. Diese Freisetzung war ausgeprägter und hielt länger an als nach einer konventionellen heat shock Behandlung [16], was die Vermutung nahe legt, dass induzierbares HSP bei der tumorunterdrückenden Aktivität von Parvoviren eine Rolle spielt. Wir haben rekombinante Parvoviren produziert, die in der Lage sind, immunstimulierende Moleküle freizusetzen, und ihr Antitumor-Potential in verschiedenen Tumormodellen getestet [3, 24, 26, 31]. Die Bildung und das Wachstum von Tumoren in Nacktmäusen, die durch Implantation von menschlichen Zervixkarzinomzellen entstehen, wird gehemmt, aber nicht vollständig verhindert, wenn Vektorviren, die für das monozytische, chemotaktische Protein-3 (MCP-3) kodieren, eingesetzt werden [24, 26]. Interessanterweise wird die Tumorbildung in immunkompetenten Mäusen völlig unterdrückt, wenn Maus-Melanom-Zellen implantiert werden, die MVMp-vermittelte MCP-3 exprimieren. Das deutet auf eine Beteiligung von T-Zellen an der antitumoralen Wirkung von MCP-3 hin. Der Vektor MVMp/IP-10, der das Chemokin IP-10 exprimiert, zeigt in immunkompetenten Mäusen eine drastische Hemmung des Wachstums beim primären Mäusehämangiom und seiner aggressiven Metastasen. Unter den gleichen Bedingungen war Wildtyp-MVMp weit weniger wirksam [3]. Kürzlich wurden die Effekte der Parvoviren H-1 oder MVMp in verschiedenen Glioblastom- Zelllinien, die aus Maus und Mensch stammen, getestet. Diese Zelllinien sind sehr empfindlich gegenüber Parvovirusinduzierter Zytotoxizität [30]. Glioblastome sind stark durchblutete Tumoren und deshalb prädestiniert für eine Antiangiogenese-Therapie. In Übereinstimmung damit steht, dass die kombinierte Expression von IP-10 und TNFa mittels Parvoviren eine dramatische Rückbildung von Tumoren bewirkte, die nach subkutaner Implantation von murinen Glioblastomzellen in Empfängermäuse entstehen [31]. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass rekombinante Parvoviren, die immunstimulierende Moleküle oder für Tumorzellen toxisch wirkende Agenzien exprimieren, viel versprechende Vektoren für die Krebstherapie darstellen [24, 26, 29].

379 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs 4) Gliazellen und Parvovirus-vermittelte Antitumorstrategie für Gehirntumoren A. Régnier-Vigouroux Vektoren auf der Basis von Parvoviren stellen viel versprechende Kandidaten für die Therapie von Gehirntumoren dar. Die häufigste Form von Gehirntumoren sind Gliome, die durch neoplastische Veränderung von Astrozyten entstehen. Nach geeigneter Stimulierung können Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) sehr effektiv zu Immunantworten beitragen. Von Gliomen ist bekannt, dass sie immunsuppressiv wirkende Substanzen sezernieren und die Immunkompetenz von Gliazellen negativ beeinflussen können. Daher könnte eine Vektor-vermittelte lokale Gentherapie, die gegen Gliomzellen gerichtet ist, nicht nur direkt Tumorzellen zerstören, sondern zudem helfen, die Antitumoraktivität der restlichen Gehirnzellen zu induzieren oder zu verstärken. Der Nutzen jeglicher Virus-vermittelter Antitumor-Strategie beruht jedoch nicht nur auf ihrer Effizienz sondern auch auf ihrer Spezifität bezüglich der Zielzellen. Darüber hinaus sind Viren ja keine neutralen Agenzien, denn sie können ihrerseits die Immunkompetenz von Gliazellen durch ihre Anwesenheit oder nach Infektion beeinflussen. Wir haben daher unsere Untersuchungen in Mausmodellen auf zwei wichtige Fragestellungen gerichtet: a) Spezifität und Sicherheit beim Einsatz von Parvoviren als Vektoren in der Gentherapie von Gehirntumoren b) Bewertung der Rolle der Mikroglia in der abgeborenen Abwehr von Gliomen a. Spezifität und Sicherheit beim Einsatz von Parvoviren als Vektoren in der Gentherapie von Gehirntumoren Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten, dass in primären Gliazellkulturen Astrozyten aber nicht Mikroglia mit Wildtyp und rekombinanten Parvoviren infiziert werden können, wobei jedoch keine Produktion neuer Viren erfolgte. Das bedeutet, dass in vivo ein Teil der therapeutisch eingesetzten Parvoviren durch Infektion der nicht malignen Gehirnzellen verloren ginge und darüber hinaus deren Biologie beeinflusst werden könnte. Die derzeitige Arbeit ist daher auf folgende Themen fokussiert: (i) Die Bestätigung dieser Beobachtungen in einer physiologisch-relevanten Umgebung, wie sie eine Organ-typische Kultur (=organotypic culture, OTC) von P6-Mausgehirnen darstellt. In solchen OTC wird nach Implantation mit Tumorzellen oder ohne analysiert, inwieweit Astrozyten und Mikroglia mit Parvoviren infiziert werden können. Diese Studie soll zeigen, welche Zielzellen es in dieser multizellulären Umgebung für das Virus gibt, (ii) Eine Bewertung der Parvovirus-vermittelten Zytotoxizität auf in vitro oder in OTC infizierten Gliazellen; (iii) Eine Bewertung der möglichen Rolle von IFN β bei der Resistenz von Mikroglia gegenüber einer Infektion mit Parvoviren. Dies wird in Kollaboration mit Prof. Dr. Rainer Zawatzky (ATV) -/- untersucht. Es wird dazu die Infizierbarkeit von IFN β Mikroglia in Kultur und in OTC untersucht. Die hierfür notwendigen IFN β -/- Mäusen werden von Prof. Zawatzky zur Verfügung gestellt. b. Bewertung der Rolle der Mikroglia in der angeborenen Abwehr von Gliomen Die Neutralisation von Gliomen durch Phagozytose: Vorläufigen Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass Mikroglia in Kultur in der Lage sind, apoptotische oder lebende Zellen zu phagozytieren. Mit Hilfe eines Lektin-Bindungsassay fanden wir, dass Gliomzellen auf ihrer Oberfläche mannosylierte Abteilung F010 Tumorvirologie Proteine exprimieren. Zurzeit untersuchen wir, ob der von Mikroglia exprimierte Mannose-Rezeptor [20,21] an dieser Phagozytose beteiligt ist. Zytotoxizität der Mikroglia: Von Mikroglia ist bekannt, dass sie nach Stimulation mit LPS und IFN γ eine gegen P815 Mastozytome gerichtete zytotoxische Aktivität entfalten können. Nach Behandlung von Mikroglia mit diesen Substanzen haben wir beobachtet, dass große Mengen an TNF α in Kultur oder in OTC freigesetzt werden. Darüber hinaus sind Überstände von diesen stimulierten Mikroglia toxisch für Gliomzellen. Wir versuchen nun, die toxische Substanz (TNF α, NO oder andere?), die von Mikroglia freigesetzt werden, zu identifizieren. Da gezeigt werden konnte, dass Ligandenbindung an Mannose-Rezeptoren eine toxische Aktivität der Makrophagen auslösen kann, untersuchen wir auch, ob eine Mannose-Mannose-Rezeptor Wechselwirkung zwischen Gliomen und Mikroglia zu der Mikroglia-vermittelten Toxizität und der Beseitigung der Gliome führen kann. Ein weiteres Ziel unserer Arbeit ist die Untersuchung von Parvovirus-vermittelten Effekten auf diese Antitumor-Aktivität der Mikroglia. 5) Programm der Europäischen Union zur funktionellen Analyse des Hefegenoms J.-C. Jauniaux Wir haben an dem Programm der Europäischen Union zur funktionellen Analyse des Hefegenoms (EUROFAN) teilgenommen. Im Rahmen dieses Programms haben wir in Zusammenarbeit mit Drs. J.L. Souciet und M. Tommasino die DUP240 [7] und Pmf1 [8] Genfamilien charakterisiert. Wir haben außerdem Beiträge zur Optimierung der Two-hybrid -Methode geleistet, und damit die Charakterisierung von Partnern für (i) das onkovirale G4 Protein des bovinen Leukämievirus, (ii) das akzessorische p13(ii) Protein des menschlichen T-Zell Leukämievirus Typ 1 [9] sowie für (iii) das Tax Protein des bovinen Leukämievirus [25] beigetragen. Diese Arbeit erfolgte in Kollaboration mit Dr. L. Willems. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Raykov, Z.,* Legrand, V., *Homann, H.E. and Rommelaere, J. (2002) Transient suppression of transgene expression by means of antisense oligonucleotides: a method for the production of toxin-transducing recombinant viruses. Gene Therapy 9, [2] Deleu, L., Daeffler, L., Faisst, S. and Rommelaere, J. (2002) Action oncolytique des parvovirus de rongeurs. Virologie 6, [3] Giese, N.A., Raykov, Z., De Martino, L., *Vecchi, A., *Sozzani, S., Dinsart, C., Cornelis, J.J. and Rommelaere, J. (2002) Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVM p vector transducing the IP-10 Chemokine into immunocompetent mice. Cancer Gene Therapy 9, [4] Willwand, K., *Moroianu, A., Hörlein, R., *Stremmel, W. and Rommelaere, J. (2002) Specific interaction of the nonstructural protein NS1 of minute virus of mice (MVM)with [ACCA] 2 motifs in the center of the right-end MVM DNA palindrome induces hairpinprimed viral DNA replication. Journal of General Virology 83, [5] Eichwald, V., Daeffler, L., Klein, M., Rommelaere, J. and Salomé, N. (2002) The NS2 proteins of parvovirus minute virus of mice are required for efficient nuclear egress of progeny virions in mouse cells. Journal of Virology 76, [6] *Brown, C.S., *DiSumma, F., Rommelaere, J., Dege, A.Y., Cornelis, J.J., Dinsart, C. and *Spaan, W.J.M. (2002) Production of recombinant H-1 parvovirus stocks devoid of replication-competent viruses. Human Gene Therapy 13,

380 380 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs [7] Poirey, R., *Despons, L., *Leh, V., *Lafuente, M.J., *Potier, S., *Souciet, J.L. and Jauniaux, J.C. (2002) Functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae DUP240 multigene family reveals membrane-associated proteins that are not essential for cell viability. Microbiology 148, [8] *Marchini, A., *Accardi, R., *Malanchi, I., *Schyr, E., *Oxelmark, E., *De Pinto, V., Jauniaux, J.C., *Maundrell, K. and *Tommasino, M. (2002) Schizosaccharomyces pombe Pmf1p is a mitochondrial protein and is structurally and functionally related to Mmf1p of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 19, [9] *Lefebvre, L., *Vanderplasschen, A., *Ciminale, V., *Heremans, H., *Dangoisse, O., Jauniaux, J.C., *Toussaint, JF., *Zelnik, V., *Burny, A., *Kettmann, R. and *Willems, L. (2002) Oncoviral bovine leukemia virus G4 and human T-cell leukemia virus type 1 p13 (II) accessory proteins interact with farnesyl pyrophosphate synthetase. 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Tesfay: Production and efficacy of recombinant parvoviruses to deliver the isoforms of MIP-1α chemokine in brain tumour cells. Diplom, Department of Biotechnology, Mannheim University of applied Sciences (2002)

381 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs M. Winnefeld: Subzelluläre Lokalisation und posttranslationelle Modifikation des small glutamine-rich TPR-containing protein (SGT) in mitotischen Zellen. Diplom, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Bremen (2002) S. Olijslagers: Gene therapeutic application of the Chicken Anemia Virus-derived protein Apoptin. Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg (2003) S. Lang: Rekombinante Parvoviren in der Gentherapie von Krebs: Vektorcharakterisierung und Analyse der Wirksamkeit. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) S. Lachmann: Funktionelle Bedeutung der Protein-Kinase Cη im Infektionszyklus des autonomen Parvovirus Minute Virus of Mice. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) V. Eichwald-Daeffler: La protéine non-structurale NS2 du parvovirus minute de souris (MVMp) joue un rôle clé dans la production et la libération de virions infectieux. Dissertation, Faculté des Sciences de la Vie, Université Louis Pasteur, Strasbourg (2003) S. Bölz: Characterisation of recombinant parvoviruses in comparison with their corresponding natural viruses. Diplom, Department of Biotechnology, Mannheim University of applied sciences (2003) N. Schwinn: Mögliche zytosolische Partner des Mannose- Rezeptors in Mikroglia. Diplom, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) F. Hahne: Rekombinante parvovirale Vektoren für die Expression RNAi-vermittelnder hsgt-spezifischer shrnas. Diplom, Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) B) Infektionsbiologie und Krebstherapeutische Nutzung von Parvoviren (F010-02) J.R. Schlehofer, J. Aldinger, C. Boeke, M. Ehrbar, E. Gueckel, A. Hartkopf, S. Hoecker, K. Kiehl, R. Koch, Y. König, A. Köylü, B. Kohlhoff, M. Leuchtenberger, R. Ly, D. Markur, S. Mehrle, J. Pochhammer, S. Poltermann, K. Till, D. Weiß, C. Wenig, K. Zscheppang In Zusammenarbeit mit: Jean Rommelaere, Laurent Deleu, Jan Cornelis, Brigitte Schlehofer, Evelyn Kludt, Iris Hettinger, Jürgen Wahrendorf, DKFZ; Karsten Geletneky, Neurochirurgische Universitätsklinik; Waltraut Eggert-Kruse, Universitäts-Frauenklinik; Magnus von Knebel Doeberitz, Abt. Molekulare Pathologie; Paul Schnitzler, Hygiene Institut, Abteilung Virologie, Universität Heidelberg; Marta Herrero, Neurochirurgische Universitätsklinik, Freiburg i. Br.; Volker Rohde, Urologische Universitätsklinik, Gießen; Gernot K. Beisler, Gynäkologe, Bad Wildbad-Calmbach; Keng-Ling Wallin, Karolinska Institut, Stockholm, Schweden; Theodoros Agorastos, Sophia Chrysaphi, B Universitiy Clinic OB/ GYN, Hippokrateion Hospital, Thessaloniki, Griechenland, E. Armbruster, Gynecology and Obstetrics Department, Faculty of Medicine, University of São Paulo, and Human Genetics Sections of the Butantan Institute São Paulo, Brasilien Zusatzfinanzierung: DFG (EG 71/2-1; SCHL 203/11-1) Graduiertenkolleg 793 ( Epidemiology of communicable and chronic, non-communicable diseases and their interrelationships ) 1) Infektiologie, tumorsuppressive Eigenschaften und Pathologie Adeno-assoziierter Viren (AAV) a. Biologie und klinische Bedeutung der genitalen AAV-Infektion Adeno-assoziierte Viren haben - wie andere Parvoviren auch - tumorhemmende Eigenschaften [1]. Der Infektion mit diesen Helfervirus-abhängigen Viren kann bislang kein Krankheitsbild zugeordnet werden, allerdings liegen systematische Abteilung F010 Tumorvirologie Untersuchungen zur möglichen Rolle von AAV bei chronischen Störungen oder Erkrankungen nicht vor. In Abwesenheit eines Helfervirus wird - zumindest in Zellkultur - das AAV- Genom ins zelluläre Genom in einem relativ spezifischen Locus auf Chromosom 19 integriert, wodurch AAV als Gen-Vektor geeignet ist. Zur Klärung der natürlichen AAV-Infektion wurde die persistierende/latente genitale Infektion genauer untersucht, da wir in den vorangegangenen Jahren AAV relativ häufig in menschlichem Genitalgewebe nachgewiesen hatten (Uterus- und Hodengewebe, Zervixabstriche, Sperma). Eine mögliche Bedeutung der AAV-Infektion in der Schwangerschaft wurde in Kooperation mit einem Gynäkologen und der Arbeitsgruppe Umweltepidemiologie des DKFZ in einer prospektiven Kohortenstudie (AAVIS-Studie) untersucht. In dieser Studie wurden Daten zur Anwesenheit von AAV-DNA im Fruchtwasser, zum AAV Antikörper- Status während der Schwangerschaft sowie zum klinischen Verlauf der Schwangerschaft erhoben, um einen möglichen Einfluß der AAV-Infektion auf die Schwangerschaft zu prüfen. AAV-DNA konnte in 38% der Fruchtwasserproben nachgewiesen werden. Perinatale Komplikationen (vorzeitiger Blasensprung, Gestose, Placentadysfunktion) wurden bei 41% der Frauen mit AAV-DNA-positiver Amnionflüssigkeit beobachtet, während diese Komplikationen bei AAV-DNA-negativem Fruchtwasser nur bei 26% der Schwangeren auftraten. Frühgeburten waren doppelt so häufig bei Frauen mit AAV-DNA-positivem Fruchtwasser, und AAV-DNA-positive Frauen hatten häufiger Fehlgeburten in der Anamnese. Es war keine Assoziation von AAV-DNA-Nachweis mit Blutung, vorzeitigen Wehen, Mißbildung oder Totgeburt nachweisbar. Andere Schwangerschafts-assoziierte Infektionen (Chlamydien-, Bakterien-, Virusinfektionen, Toxoplasmose) waren seltener bei positivem AAV-DNA-Nachweis als bei nichtinfiziertem Fruchtwasser. In dieser Studie bestätigte sich auch die relativ erhöhte Seroprävalenz (57%) von AAV-Antikörpern in der Frühschwangerschaft. Allerdings variierte die Antikörperprävalenz im Lauf der Schwangerschaft, sowohl individuell als auch für die Population: Zum Entbindungszeitpunkt waren Antikörper gegen AAV nur in 41% der Fälle nachweisbar. Der Nachweis von IgM-Antikörpern im Neugeborenenserum (18/262) bestätigte unsere frühere Hypothese einer inutero-infektion des Feten mit AAV. (Ob dies klinische Konsequenzen hat, konnte im Rahmen der AAVIS-Studie nicht untersucht werden.) In weiteren Studien zur AAV-Infektion in der Schwangerschaft wurden auch Trophoblasterkrankungen untersucht. Proben von Blasenmolen, Chorion-Karzinomen sowie Spontanaborten wurden auf AAV-DNA untersucht. Dabei wurde AAV-DNA in 28 von 49 Blasenmolen, in 4 von 14 Chorio-Karzinomen und in 11 von 15 Fehlgeburten detektiert [2]. Die Daten belegen die Infektion embryonaler Zellen mit AAV und unterstützen die Vermutung einer möglichen Rolle von AAV bei Schwangerschaftskomplikationen, sowie bei Fehlgeburten und Trophoblasterkrankungen. Hingegen konnte in Materialien von embryonalen Tumoren keine AAV-DNA nachgewiesen werden. Da AAV ein Helfervirus-abhängiges Parvovirus ist, wurden die Fruchtwasserproben (AAVIS-Studie, s.o.) zusätzlich auf 381

382 382 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs die Anwesenheit von DNA genitaler Helferviren (Papillomviren, Zytomegalieviren) getestet. Papillomvirus-DNA konnte in keinem Fall nachgewiesen werden (K. Zscheppang, unveröffentlicht). Das zur Familie der Herpesviren gehörende humane Zytomegalievirus (HCMV) spielt als häufigste Ursache kongenitaler Virusinfektionen im Kontext von Schwangerschaft und fetaler Entwicklung eine wesentliche Rolle. Die klinischen Konsequenzen einer fetalen HCMV-Infektion sind individuell sehr unterschiedlich und wurden bislang nur in Kohorten schwangerer Frauen untersucht, die zuvor anhand eines serologischen HCMV-Befundes als Risikoschwangerschaften eingestuft wurden. In unserer Studie wurden somit zum ersten Mal in einer nicht selektierten Kohorte schwangerer Frauen die Prävalenz der in-utero-infektion mit HCMV sowie die anti-hcmv-antikörper-prävalenzen bestimmt (C. Wenig, zur Publikation eingereicht). Die 403 Amniozenteseproben wurden mittels nested PCR auf das Vorhandensein von HCMV-DNA getestet, wobei pro Patientin jeweils zwei Aspirate vorlagen: das erste, welches auch mütterliche Zellen (darunter Muskelzellen der Bauchdeckenmuskulatur und des Uterus, Bindegewebs- und Fettzellen) enthält und normalerweise nach der Amniozentese verworfen wird, sowie das zweite Fruchtwasseraspirat aus der Amnionhöhle, welches theoretisch nur embryonale Zellen enthält. In dieser nicht selektierten Kohorte schwangerer Frauen war eine in-utero-infektion mit HCMV mit einer Prävalenz von 3% selten. Es ergaben sich somit keine Hinweise auf eine Helferfunktion von HCMV oder HPV für AAV. Schwerwiegende klinische Befunde im Zusammenhang mit einem HCMV-DNA-positivem Fruchtwasserbefund wurden nicht beobachtet. Virologisch überraschend war, dass HCMV DNA mit einer größeren Häufigkeit im ersten Fruchtwasseraspirat nachgewiesen wurde. Demnach konnte erstmalig eine Persistenz von HCMV in mütterlichen Zellen schwangerer Frauen gezeigt werden. Die Serumproben (von der Mutter zum Zeitpunkt der Amniozentese und bei der Entbindung sowie Nabelschnurblut des Neugeborenen) wurden auf HCMV-spezifische IgGund IgM-Antikörper untersucht. Hinsichtlich der serologischen Untersuchungen wurden mit einer Prävalenz der HCMV-spezifischen IgG-Antikörper von 46,6 % zum Zeitpunkt der Amniozentese die Ergebnisse vorangegangener Studien bestätigt. b. AAV-Infektion und männliche Infertilität Die Infektion des weiblichen Genitaltrakts deutet auf eine sexuelle Übertragung von AAV hin. Deshalb untersuchten wir Proben aus dem männlichen Genitalbereich auf die Anwesenheit von AAV. Virale DNA wurde in ca. einem Drittel der Ejakulatproben infertiler Männer nachgewiesen [*Rohde, V. et al. (1999). Fertil. Steril. 72, ], insbesondere bei Vorliegen eines pathologischen Spermiogramms, während AAV extrem selten bei normalem Spermienbefund detektierbar war. Auch infektiöses AAV konnte aus dem Ejakulat isoliert werden. Außerdem konnte AAV-DNA auch in Hodenbiopsien infertiler Männer (26%) nachgewiesen werden, was eine Infektion der Samenzellen während der Spermatogenese nahe legt [Erles, K. et al. (2001) Hum. Reprod. 16, ]. In Ejakulaten von Kontrollpersonen (fertile Männer) war AAV nur ganz selten detektierbar. Im Gegensatz zu AAV-DNA war DNA der AAV-Helferviren (Papillomviren, Zytomegalieviren) ebenso häufig in normalen wie in pathologischen Samenproben nachzuweisen. Abteilung F010 Tumorvirologie Diese Befunde unterstützen die Vermutung einer sexuellen Übertragung des Virus und weisen außerdem auf eine mögliche Rolle der AAV-Infektion bei der männlichen Infertilität hin [3]. In Kooperation mit der Universitäts-Frauenklinik wurden weitere Untersuchungen zur genitalen AAV-Infektion bei infertilen Paaren durchgeführt. In 23% der Ejakulate und in 17% der Zervix-Abstriche dieser Paare wurde AAV-DNA nachgewiesen. Bei 6% der Paare wurde virale DNA bei beiden Partnern detektiert. Aus 5 (18,5% von 27 untersuchten AAV-DNA-positiven) Ejakulaten konnten infektiöse AAV-Partikel angezüchtet werden. In 2 der 5 Fälle war AAV-DNA im Abstrich der Partnerinnen nachweisbar. Bei 4 Paaren, die beide eine genitale AAV-Infektion hatten (AAV- DNA-Nachweis) wurde bei zwei der Männer auch infektiöses AAV im Sperma gefunden. Damit konnte erstmals die Möglichkeit der sexuellen Übertragung (durch Sperma) von AAV direkt nachgewiesen werden. Nach ersten Analysen scheint die Anwesenheit von AAV- DNA keinen Einfluß auf die intrinsische Motilität der Spermien und keinen negativen Einfluß auf den Spermatozoen-Cervixmucus-Penetrationstest (SCMPT-Test) zu haben. AAV wird offenbar nicht durch den Cervix-Mucus-Barriere zurückgehalten, womit die Möglichkeit einer Infektion des Endometrium oder ggf. eines Ovums gegeben ist. Zur Frage der AAV-Latenz in Hodengewebe wurden Orchiektomiepräparate von Patienten, die wegen eines Prostata-Karzinoms operiert worden waren, auf AAV-DNA untersucht, die 8 von 24 Proben nachgewiesen werden konnte [4]. In ersten Untersuchungen konnte für 3 Proben eine chromosomale Integration der viralen DNA aufgezeigt werden. Die DNA aus 2 Proben wurde kloniert und die Virus-DNA-Zell-DNA - Übergänge sequenziert. Es zeigte sich, dass eine Integration in der AAVS1-Region auf Chromosom 19 vorlag [4], wie dies bisher für die Integration von AAV-DNA in Zellkultur beschrieben ist. Weitere, vorläufige Analysen zeigten, daß die AAV-DNA in offenbar als vollständiges Genom integriert vorliegt [S. Hoecker, unveröffentlicht]. Mit diesen Untersuchungen konnte somit zum ersten Mal eine Integration von AAV-DNA in menschlichem Gewebe (nach natürlicher Infektion) nachgewiesen werden. Zur Frage eines möglichen Einflusses der AAV-Infektion auf Hodenzell- bzw. Spermienreifung wurden AAV-infizierte Hodenzelllinien in vitro untersucht. In Experimenten mit Leydig- und Sertoli-Zellinien der Maus (TM3 bzw. TM4) konnte gezeigt werden, dass diese Zelltypen mit AAV infizierbar sind, und dass - in Abhängigkeit von der Infektionsmultiplizität - die Infektion zu einer Reduzierung der Zellproliferation und des Zellwachstums führt, auch nach Stimulation der Zellen mit FSH. Dagegen scheint die Testosteronproduktion von Leydig-Zellen durch AAV-Infektion gesteigert zu werden [Till et al., in Vorbereitung]. Die relativ hohe Prävalenz von AAV-DNA im Samen unfruchtbarer Männer und in Hodengewebe konnte somit weiter bestätigt werden. Das Vorkommen infektiöser Virionen im Samen belegt die Vermutung einer sexuellen Übertragung des Virus und wirft die Frage auf, ob es zu einer Übertragung auf die Eizelle kommen könnte, und ob dies mit der Entstehung einer Schwangerschaft vereinbar ist. Möglicherweise könnte eine AAV-Infektion des frühen Embryos zu Nidationsproblemen oder zu frühen Aborten führen. Hinweise auf einen solchen AAV-Effekt hatten wir in

383 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs bereits in früheren Studien. Es stellt sich somit die Frage, ob bei Befruchtungen durch Männer, die infektiöses AAV im Sperma ausscheiden, häufiger mit Fehlgeburten zu rechnen ist. Die Klärung dieser Frage ist auch bedeutsam für in-vitro-fertilisation und ICSI. Da Zytomegalieviren (HCMV) Helferviren für AAV sein können, insbesondere im Genitalbereich (s.o.), wurde die Prävalenz der genitalen HCMV-Infektion im Rahmen der Untersuchungen an infertilen Paaren (s.o.) ebenfalls getestet. 6,5% der Spermaproben und 6% der Zervixabstriche waren HCMV-DNA-positiv. In keinem Fall waren bei beiden Partnern HCMV-DNA nachweisbar. (Eine zusätzliche Infektion mit AAV (s.o.) wurde bei einem Mann und bei einer Frau nachgewiesen; dabei handelte es sich nicht um ein Paar). Von den 5 Spermaproben, in denen infektiöses AAV nachgewiesen werden konnte (s.o.), war keine HCMV-DNApositiv. Bei einem Mann mit AAV(Virion)-positiver Samenprobe lag eine gleichzeitige Infektion mit Chlamydia trachomatis vor sowie ein hoch-positiver MAR-(mixed antiglobulin reaction)-test. Serologisch wurden IgG-Antikörper gegen CMV bei 33% der Männer und bei 43% der Frauen nachgewiesen. CMV- IgM war einem Mann und bei 3 Frauen nachweisbar. In keinem dieser Fälle waren beide Partner IgM-positiv. Eine Übereinstimmung der serologischen Daten mit dem Nachweis von CMV-DNA wurde nicht gefunden: Serumantikörper wurden bei CMV-DNA-negativen ebenso wie bei CMV-DNA-positiven Personen nachgewiesen. Auch bei letzteren waren CMV-Antikörper nur in der Hälfte der Fälle im Serum nachweisbar. c. Interaktion von AAV mit Papillomviren (HPV) Wie oben erwähnt, konnte AAV-DNA sehr häufig in der cervix uteri nachgewiesen werden, d.h. in einem Epithel, das häufig die DNA von Papillomviren (HPV), u.a. die Tumorassoziierten HPV-Typen 16 und 18 enthält. Unsere früheren Daten hatten Hinweise darauf ergeben, dass die Koinfektion des Zervixepithels mit onkogenen Papillomviren und tumorhemmenden AAV auch in vivo mit der Entwicklung HPV-bedingter Läsionen interferieren kann, möglicherweise auch mit der Entstehung von Zervixkarzinomen [5]. Dies konnten wir auch mit seroepidemiologische Untersuchungen erhärten. Um die AAV-Effekte auf HPV in vivo nachzuweisen, wurde der Einfluß von AAV auf den Promotor von HPV-18 in transgenen Mäusen untersucht [6]. Diese Mäuse enthielten als Transgen ein Konstrukt, in dem die Upstream Regulatory Region (URR) von HPV-18 die Transkription des Reportergens lacz kontrolliert. Durch Infektion mit AAV oder AAV-Kapsiden konnte die Dexamethason-induzierte Aktivität des HPV-18-Promoters inhibiert werden. In einem in vitro-modell mit Zellen, die dasselbe HPV-18-lacZ-Konstrukt enthielten, konnte weiterhin gezeigt werden, daß virusfreie Proteinextrakte aus AAV-infizierten Tieren die Dexamethason-induzierte lacz-expression ebenso wie AAV inhibieren. Das legt nahe, dass AAV - zumindest in vivo - zelluläre Faktoren induziert, die die Herunterregulierung des HPV-18-Promotors vermitteln. Im Gegensatz zu Promotoren der high-risk HPV-Typen (HPV- 18, HPV-16) wurde die Aktivität der low-risk HPV-Typen (HPV-6, HPV-11) nicht durch AAV beeinflußt [6]. 2) Sensibilisierung von Tumorzellen gegenüber Chemotherapie durch AAV-Infektion In in vitro- und in vivo-experimenten hatten wir früher gezeigt, dass AAV-Infektion menschliche Tumorzelllinien ge- Abteilung F010 Tumorvirologie genüber Chemotherapeutika (Cisplatin, BCNU, Etoposid) sensibilisiert und dass Chemotherapeutika-resistente Zelllinien, die von kleinzelligen Bronchialkarzinomen abgeleitet waren, nach AAV-Infektion gegen Chemotherapie wieder empfindlich wurden [1]. Der AAV-vermittelte Sensibilisierungseffekt gegenüber Chemotherapeutika war nicht auf epitheliale Neoplasien beschränkt, sondern konnte auch die Wirksamkeit der Chemotherapie (z.b. Doxorubicin) von Rhabdomyo-, Fibro-, Osteo- und Chondrosarkomen steigern [7]. Diese Befunde konnten für die Therapie des Pankreaskarzinoms mit 5-Fluorouracil (5-FU) in in vivo-experimenten bestätigt werden [8]. Dabei zeigte sich, dass die Kombination von Chemotherapie mit AAV außerdem die Nebenwirkungen der 5-FU-Therapie unterdrücken kann. Somit konnte weiter bestätigt werden, dass AAV die Effizienz und Verträglichkeit der Chemotherapie verbessern kann. Insbesondere die Tumor- bzw. 5-FU-assoziierte Thrombozytopenie und Neutropenie fehlten in AAV-behandelten Tieren nahezu vollständig [8]. Die physiologischen Grundlagen dieser Aufhebung der Nebenwirkungen sind bislang unklar. Untersuchungen an Schnittpräparaten Formalin-fixierter Tumoren (aus dem o.a. Pankreastumormodell) zeigten eine deutliche Infiltration mit mononukleären Zellen ausschließlich in AAV-infizierten Tumoren, nicht jedoch in Präparaten von unbehandelten, bzw. nur mit 5-FU behandelten Tieren. Zudem konnte ein deutlich höherer Anteil apoptotischer Areale in zusätzlich AAV-infizierten Tumoren im Vergleich zu nur 5-FU-behandelten oder unbehandelten Tumoren nachgewiesen werden [8]. Die Befunde zum verbesserten Allgemeinzustand AAV-behandelter Tiere, die reduzierten 5-FU-assoziierten Nebenwirkungen, sowie die mononukleäre Infiltration in die AAVinfizierten Tumoren weisen auf eine Beteiligung eines oder mehrerer Zytokin-ähnlicher, chemotaktischer und/oder onkosuppressiver Faktoren hin, die durch die Virusinfektion induziert werden. Tatsächlich konnte im Serum AAV-infizierter und 5-FU-behandelter Tiere eine erhöhte Expression von MCP-1 (macrophage chemoattractant and activating factor) und Interleukin-10 nachgewiesen werden [S. Eisold, unveröffentlicht]. Dies lässt vermuten, dass AAV in vivo einen (oder mehrere) Faktor(en) induzieren könnte, und dass die beobachteten Effekte nicht direkt durch das Virus vermittelt werden. Wie oben erwähnt ergaben sich in dem Modell, in dem der Einfluß von AAV auf die Expression des Promotors onkogener Papillomviren (HPV-18) analysiert wurde (s.o.), ebenfalls Hinweise, dass die AAV-vermittelte Inhibierung des HPV-Promotors auf der Induktion eines zellulären Faktors beruhen könnte [6]. In in vitro-experimenten zum Mechanismus der Sensibilisierung von Tumorzellen gegenüber Cisplatin zeigte sich, dass AAV-Infektion die Cisplatin-induzierte Apoptose signifikant verstärken kann [9]. Die AAV-vermittelte Apoptose-Verstärkung war nicht mit einer Modifikation der Expression von CD95, dem CD95 Liganden oder anderen Todesrezeptoren vergesellschaftet: AAV-Infektion senkte das durch Cisplatin reduzierte mitochondriale Transmembranpotential weiter ab, und zwar Caspase-unabhängig. Somit scheint die Apoptose-Verstärkung durch AAV auf Mitochondrienebene zu erfolgen [9]. Basierend auf diesen Daten werden AAV-Funktionen auf ihren möglichen klinischen Nutzen zur Verbesserung der Chemotherapie und Verminderung von Nebenwirkungen 383

384 384 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs weiter intensiv geprüft. Im Gegensatz zu Studien mit anderen Viren handelt es sich beim AAV-System um ein sehr sicheres virales System, da AAV einen selektiven sensitivierenden Effekt für Krebszellen aufweisen, normale Zellen nicht beeinträchtigen, und sich - wegen der Helferabhängigkeit - nicht replizieren. 3) Präklinische Studien zur onkolytischen Gliomtherapie mit H-1 Parvoviren Bösartige Hirntumoren (maligne Gliome) haben trotz des Einsatzes der modernsten Operations- und Bestrahlungsverfahren eine extrem schlechte Prognose. In der überwiegenden Mehrzahl der Fälle verläuft die Erkrankung innerhalb von 12 bis 16 Monaten letal. Es ist daher erforderlich, alternative Therapieverfahren wie z.b. den Einsatz onkolytischer Viren wie z.b. Parvoviren zu entwickeln. Das Parvovirus H-1 ist für den Menschen apathogen und repliziert zytotoxisch selektiv in Tumorzellen. In Kooperation mit der Neurochirurgischen Universitätsklinik konnten wir für humane Gliomzellen (einschließlich aus Patientenmaterial etablierte Kurzzeitkulturen) die Möglichkeit einer lytischen (zytotoxischen) und produktiven H-1-Infektion nachweisen [10]. In ersten In-vivo-Untersuchungen konnten wir durch stereotaktische Injektion des onkolytischen Parvovirus H-1 in intrazerebralen Rattengliomen einem antitumoralen Effekt ohne pathologische Veränderungen des umgebenden Hirngewebes erzielen (K. Geletneky, unveröffentlicht). 4) Rolle von Zytomegalie- und anderen Herpesviren bei der Entstehung maligner Hirntumoren Die Ätiologie maligner Hirntumore (Gliome) ist unbekannt. Einige Studien hatten virale Faktoren vermutet, insbesondere Herpesviren, die möglicherweise nach langer Latenz zu malignen Veränderungen beitragen könnten [Howley et al., (2001). In: V.T. De Vita jr, S. Hellman, S.A. Rosenberg (eds.), Cancer: Principles of Oncology, pp Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins]. Andererseits gibt es Vermutungen, dass vorangegangene Infektionen mit Herpesviren wie Varizella-Zoster-Virus die Entstehung von Gliomen verhindern könnten [Wrensch et al., (2001) Am J Epidemiol 154:161-5]. Kürzlich wurde eine Infektion mit Zytomegalieviren (HCMV) in einem hohen Prozentsatz von Gliomen (nicht aber Meningiomen) berichtet und über die Expression von HCMV-Genprodukten in den Tumorzellen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass HCMV eine aktive Rolle bei der Pathogenese von Gliomen spielen könnte [Cobbs et al., (2002) Cancer Res., 62: ]. In Kooperation mit der Abteilung Umweltepidemiologie, der Neurochirurgischen Universitätsklinik und dem Graduiertenkolleg 793 wurde ein Projekt begonnen, um diese Hypothese mit virologisch-epidemiologischen Methoden an einer hohen Fallzahl zu überprüfen. Dabei soll neben virologischen Untersuchungen des Patientenmaterials (Tumorbiopsien: HCMV-DNA-, -RNA-, -Proteinnachweis, in-situ- Hybridisierung; Serum: Test auf Herpesvirus-Antikörper) mittels eines spezifischen Fragebogens auch andere als virologische Faktoren erfaßt werden, die zur Entstehung von Hirntumoren beitragen könnten. Abteilung F010 Tumorvirologie Publikationen (* = externer Koautor) [1] Cziepluch, C., Schlehofer, J.R. and Veldvijk, M.R. (2003). Parvoviren in der Krebs- und Gentherapie. In: Onkologie : Grundlagen-Diagnostik-Therapie-Entwicklungen. Eds.: W.J. Zeller and H. zur Hausen. Landsberg/Lech : Ecomed - Losebl.-Ausg. IV- 21.2, pp [2] Kiehl, K., Schlehofer, J.R., *Schultz, R., *Zugaib, M., *Armbruster-Moraes, E. (2002) Adeno-associated virus DNA in human gestational trophoblastic disease. Placenta 23 (5), [3] Schlehofer, J.R. (2003). Virus infections in disorders of the male reproductive system. Andrologia 35(3): [4] Mehrle, S., *Rohde, V., Schlehofer, J. R. (2004). Evidence of chromosomal integration of AAV DNA in human testis tissue. Virus Genes 28:1, [5] Schlehofer, J.R. Relationship between adeno-associated virus and human papillomavirus in cervical carcinogenesis (2003). In: Prevention of gynecological cancer. Eds.: Th. Agorastos and J.N. Bontis. University Studio Press, Thessaloniki, pp [6] Walz, C.M., *Correa-Ochoa, M.M., Müller, M., and Schlehofer, J.R. (2002). Adenoassociated virus type 2-induced inhibition of the human papillomavirus type 18 promoter in transgenic mice. Virology 293, [7] *Schwarzbach, M., Burguete, T., *Eisold, S., *Willeke, F., *Klein-Bauernschmitt, P., Schlehofer, J.R., *Herfarth, C., *Ridder, R., and von Knebel Doeberitz, M. (2002). Sensitization of sarcoma cells to doxorubicin treatment by concomitant wildtype adeno-associated virus type 2 (AAV-2) infection. Int. J. Oncology 20, [8] *Eisold, S., *Dihlmann, S., *Linnebacher, M., *Ryschich, E., *Aulmann, M., *Schmidt, J., Schlehofer, J.R., *Ridder, R., and von Knebel Doeberitz, M. (2002). Prevention of chemotherapyrelated toxic side effects by infection with adeno-associated virus type 2. Int. J Cancer 100, [9] Duverger, V., Sartorius, U., Klein-Bauernschmitt, P., Krammer, P., and Schlehofer, J.R. (2002). Enhancement of cisplatin-induced apoptosis by infection with adeno-associated virus type 2. Int. J. Cancer 97, [10] Herrero y Calle, M., Cornelis, J. J., *Herold-Mende, C., Rommelaere, J., Schlehofer, J. R. and *Geletneky, K. (2004). Parvovirus H-1 infection of human glioma cells leads to complete viral replication and efficient cell killing. Int. J. Cancer 109, Hochschulschriften K. Geletneky: Serologisch-epidemiologische Studie über den Einfluß von Parvo-und Herpesvirusinfektionen auf die Pathogenese kindlicher Leukämieerkrankungen. Dissertation, Medizinische Fakultät der Universität Heidelberg (2002) K. Kiehl: Untersuchungen zur Assoziation von gestationsbedingten Trophoblasterkrankungen und Spontanaborten mit Adeno-assoziierten Viren. Dissertation, Medizinische Fakultät der Universität Heidelberg (2003) S. Mehrle: Nachweis der Integration Adeno-assoziierter Viren in menschliches Gewebe nach natürlicher Infektion Diplom, Universität Kaiserslautern (2003) K. Zscheppang: Einfluß humaner Papillomviren auf die Schwangerschaft und Bedeutung der Parvoviren bei der Krebssuppression. Semesterarbeit, Fachhochschule Lausitz, Studiengang Biotechnologie (2003) D. Markur: Evaluation zytotoxischer Effekte von onkolytischem Parvovirus H-1 auf humane Hirntumorzellen unterschiedlicher Malignitätsgrade. Diplom, Fachhochschule Lausitz, FB Bio-, Chemie- und Verfahrenstechnik, Senftenberg (2003) Patentanmeldungen Verwendung von adenoassoziierten Viren zur Senkung der radiooder chemotherapie-induzierten Resistenz bei Krebspatienten. Deutsche Patentanmeldung ; von Knebel Doeberitz, M., Schlehofer, J.R. Klein-Bauernschmitt, P., Eisold, S., zur Hausen, H.

385 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Verwendung von Parvoviren zur Verbesserung des Allgemeinzustandes bei Tumorpatienten oder Patienten mit chronischen oder konsumierenden Erkrankungen. Deutsche Patentanmeldung ; Klein-Bauernschmitt, Eisold, Schlehofer, von Knebel-Doeberitz, zur Hausen, H. Use of Parvovirus for Brain Tumor Therapy US-Patentanmeldung 10/426,709 J. Rommelaere, J. Cornelis, C. Dinsart, K. Geletneky, M. Herrero y Calle, J.R. Schlehofer C) Adeno-assoziierte Viren: Untersuchungen zum Infektions-prozess und zur Verwendung als Gentransduktions-Vektor (F010-3) J.A. Kleinschmidt, A. Kern, S. Kronenberg, L. Krüger, D. Kuck, T. Lau, C. Leder, O. Müller, P. Poberschin, K. Schmidt, D. Waterkamp In Zusammenarbeit mit: B. Böttcher, EMBL, Heidelberg, M. Hallek, Genzentrum München, München; M. Müller, DKFZ, A. Salvetti, Hotel Dieux, Nantes, Frankreich, M. Trepel, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Freiburg; W.J. Zeller, DKFZ, U. Haberkorn, DKFZ Gentransfer-Vektoren basierend auf dem adeno-assoziierten Virus (AAV) zeigen einen breiten Wirtsbereich, infizieren sowohl proliferierende als auch ruhende Zellen, sind in der Lage, in das Wirtsgenom zu integrieren, und zeigen nach heutigem Wissensstand keine pathogenen Eigenschaften. Der Infektionsprozeß mit Hilfe dieser Vektoren ist noch weitgehend unverstanden. Insbesondere sind die Strukturen am Kapsid, welche eine unterschiedliche Suszeptibilität von primären humanen Zellen für einen AAV vermittelten Gentransfer vermitteln [1] nicht bekannt. Das Bindungsmotif am AAV-2 Kapsid mit dem die Viren, bzw. die Vektoren an den primären Rezeptor der Zielzellen - Heparansulfat Proteoglykan - binden, konnte identifiziert werden [5]. Dieses Bindungsmotif konnte nun dahingehend modifiziert werden, dass AAV-Bibliotheken angelegt wurden, die in diesem Bereich bis zu 10 6 verschiedene Bindesequenzen von 7Aminosäuren präsentieren [4]. Aus diesen Bibliotheken wurden Virus-Klone isoliert, die primäre humane Endothelzellen sehr viel effizienter infizieren als wt AAV-2. Die Technik der Herstellung und Verwendung von Virus-Bibliotheken zur Klonierung von zielgerichteten AAV-2 Vektoren stellt einen Meilenstein in der viralen Vektorentwicklung dar. Als positiver Nebeneffekt zeigte sich, dass genetische Modifikationen in dem Bereich der Rezeptorbindestelle des AAV-2 Kapsids den neutralisierenden Effekt von humanen Serum Antikörpern reduzieren [6]. Dies sollte eine systemische Applikation von AAV-2 Vektoren erleichtern. Eine zweite Domäne auf dem AAV-2 Kapsid wurde identifiziert, die die Infektiosität und Gentransduktion mit AAV-2 beeinflusst [2]. Sie zeigt eine Phospholipase-Aktivität und ist für die Infektiosität des Virus nach Eintritt in die Zelle essentiell. Die Aufklärung der molekularen Funktionen dieser Aktivität im Infektionsprozeß ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Das von uns entwickelte Helferplasmid - pdg - zur Herstellung von AAV-2 Vektoren ermöglicht eine helfervirusfreie Produktion von AAV-2 Vektoren. Dieses wurde dahingehend erweitert, dass AAV-2 Vektoren in das Kapsid eines jeden von sechs beschriebenen AAV Serotypen (AAV-1 bis AAV-6) verpackt werden können [3]. Dies erweitert das Spektrum der durch AAV transduzierbaren Zellen und ermöglicht eine Administration von Vektoren, auch wenn neutralisierende Antikörper gegen einen bestimmten Serotyp vorliegen. Die mit verschiedenen AAV Kapsiden pseudotypisierten AAV Vektoren werden gegenwärtig für Abteilung F010 Tumorvirologie den kardialen Gentransfer, sowie für eine nasale Vakzinierungsstrategie verwendet. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Rohr, UP., *Kronenwett, R., Grimm, D., Kleinschmidt, J. and *Haas, R. (2002) Primary human cells differ in their susceptibility to raav-2-mediated gene transfer and duration of reporter gene expression. Journal of Virological Methods 105, [2] *Girod, A., Wobus, C., * Zadori, Z., *Ried, M., *Tijssen, P., Kleinschmidt, J.A. and *Hallek, M. (2002) The VP1 capsid protein of the adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. Journal of General Virology 83, [3] Grimm, D., *Kay, M.A. and Kleinschmidt, J.A. (2003) Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of sertoypes 1 to 6. Molecular Therapy 7, [4] Müller, O.J., *Kaul, F., *Weitzman, M.D., *Pasqualini, R., *Arap, W., Kleinschmidt, J.A. and *Trepel, M. (2003) Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology 9, [5] Kern, A., Schmidt, K., Leder, C., Müller, O., Wobus, C.E., *Bettinger, K., *Von der Lieth, C.W., King, J.A. and Kleinschmidt, J.A. (2003) Identification of a heparin-binding motif on AAV-2 capsids. Journal of Virology 77, [6] *Huttner, N.A., *Girod, A., *Perabo, L., *Edbauer, D., Kleinschmidt, J.A., *Buning, H., and *Hallek, M. (2003) Genetic modifications of the adeno-associated virus type 2 capsid reduce the affinity and the neutrali ing effects of human serum antibodies. Gene Therapy 10, Patentanmeldungen Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV16-L1 und HPV16- L2 kodierende DNA Sequen en. Deutsche Patentanmeldung Müller, M., Leder, C., Kleinschmidt, J., Sonnenwald, U., Biemelt, S. (2002) AAV-Helferplasmide zur Helfervirus-freien Verpackung und Pseudotypisierung von AAV-Vektoren. Deutsche Patentanmeldung Kleinschmidt, J., Grimm, D. (2002) Random peptide library displayed on AAV vectors. US patent application 60/455,594. Kleinschmidt, J., Kaul, F., Müller, O., Trepel, M., Leder, C. (2003) Improved AAV vector for gene therapy. Europäische Patentanmeldung Kleinschmidt, J., Müller,O. (2003) AAV-Vektor-Verpackungsplasmide für Helfervirus-freien Herstellung pseudotypisierter AAV-Partikel über Einzeltransfektion. Deutsche Patentanmeldung Kleinschmidt, J., Grimm, D. (2003) Hochschulschriften F. Sonntag: Funktionelle Charakterisierung von kurzen basischen Sequenzen in den Kapsidproteinen des adeno-assoziierten Virus Typ 2. Diplom, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg, S. Bleker: Herstellung rekombinanter Adenoviren des Typ 5, welche die rep-und cap-gene des adeno-assoziierten Virus des Typ 2 exprimieren. Diplom, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Bremen, C. Leder: Prophylaktische und Therapeutische DNA-Immunisierung gegen das Humane Papillomvirus 16. Dissertation, Fachbereich Chemie der Universität Hannover,

386 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F020 Genom-Veränderungen und Carcinogenese Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese (F020) Leiter: Prof. Dr. Lutz Gissmann 386 Wissenschaftler Prof. Dr. rer. nat. Valerie Bosch Dr. med. Marius Cornitescu Dr. med. vet. Kerstin Dell Dr. rer. nat. Eva-Jasmin Freyschmidt Dr. rer. nat. Esther Glastetter ( - 7/03) Dr. med. Michael Pawlita Dr. rer. nat. Peter Sehr Dr. rer. nat. Sandra Sparacio ( - 4/02) Dr. rer. nat. Massimo Tommasino ( - 10/02) Gastwissenschaftler Barbara Azzimonti, Italien ( - 2/02) Rosa Angela Cardone, Italien ( - 8/02) Marco De Andrea, Italien ( - 7/02) Dr. Eva Hamsikova, Tschechien ( - 3/03) Chanjoo Kim, Südkorea Diplomanden/Doktoranden Rosita Accardi ( - 12/02) Sandra Caldeira ( - 3/02) Wen Dong ( - 12/02) Eva-Jasmin Freyschmidt ( - 7/03) Heidrun Guthörlein ( - 11/03) Annette Hoefer ( - 12/02) Denise Holtkotte Stefanie Kerzel Manuela Kluge Susanne Krueger ( - 11/03) Sonja Krüger ( - 4/02) Nicolas Jauniaux ( - 3/02) Ilaria Malanchi ( - 12/02) Kristina Michael Nina Mossadegh Peter Öhlschläger (-11/03) Cornelia Oetke (-12/02) Tanja Peiler Thorsten Pisch Regina Samorski Birgit Schäfer ( - 11/02) Thorsten Steinberg ( - 11/03) Ulrich Reidel Raeda Rizk ( - 4/03) Tim Waterboer Sonja Wiedekind Technische Assistenten Birgit Aengeneyndt Irmgard Bülow Corinna Klein Ute Koch Monika Oppenländer Tanya Pfeiffer Anuk Smet Sekretariat Madeleine Sporleder AG separat oder integrieren? Prof. Dr. Martin Löchelt (bis 1/04 F080 ) Diplomanden/Doktoranden Dipl. Biol. Patrizia Bastone ( - 3/05) Dipl. Biol. Fabian Romen (10/03 - ) Dipl. Biol. Astrid Schwantes ( - 04/02) Apothekerin Verena Geiselhart ( -1/03) Cand. Med. Roman Wirtz (4/03-3/04) Stud. Biol. Nadine Kirchner (4/03-2/04) Die Mitglieder der Abteilung bearbeiten grundlegende und anwendungsorientierte Aspekte von humanpathogenen Papillomaviren (HPV), Polyomaviren des Menschen und HIV. Dabei untersuchen wir Mechanismen der Entstehung infektiöser Viruspartikel sowie der Wechselwirkung zwischen dem Virus und seiner Wirtszelle. Auf der Basis dieser Erkenntnisse entwickeln wir Methoden zur Diagnose, Prävention und Therapie von durch diese Viren hervorgerufenen Infektionen und Erkrankungen. Außerdem benutzen wir die Viren selbst als Vektoren zur Entwicklung von Impfstoffen oder von gentherapeutischer Verfahre. Entwicklung von HPV 16-spezifischen Impfstoffen zur Verhinderung oder Behandlung von virusbedingten Tumorerkrankungen B. Aengeneyndt, K. Dell, E.-J. Freyschmidt, L. Gissmann, H. Guthöhrlein, J. Kim, C. Klein, P. Öhlschläger, P. Sehr, T. Steinberg In Zusammenarbeit mit A. Alonso, R. Kösters, N. Mücke, M. Müller, W. Osen, M. Pawlita DKFZ; I. Jochmus und J. Nieland, MediGene AG, Martinsried; A. Kaufmann und A. Schneider, Universitäts-Frauenklinik, Jena; G. Sutter, GSF München, G. Hartmann, Medizinische Klinik Innenstadt, Universität München; R. Garcea University of Colorado, Denver, USA. Impfstoffe der zweiten Generation Aufgrund der allgemein akzeptierten ursächlichen Verbindung zwischen persistierenden Infektionen mit bestimmten ( high-risk ) humanpathogenen Papillomviren (HPV) und der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom) werden seit einigen Jahren verschiedene Impfstoffe zur Verhinderung bzw. Behandlung von HPV-assoziierten Erkrankungen entwickelt. Am weitesten fortgeschritten sind dabei die von den Firmen Merck bzw. GlaxoSmithKline finanzierten Aktivitäten zur Zulassung von prophylaktischen Vakzinen gegen die am häufigsten mit Zervixkarzinomen assoziierten Papillomviren Typ 16 und 18 (HPV 16, 18). Diese Impfstoffe bestehen aus virus-like particles (VLP), die sich nach Expression des viralen Hauptstrukturproteins L1 in Bäckerhefe oder in Insektenzellen bilden. In follow-up Studien wurde gezeigt, dass die Impfung mit HPV 16 bzw. HPV 18 VLPs - als Folge der Induktion hoher Titer von neutralisierenden Antikörpern - die Infektion mit diesen HPV Typen sowie die Entstehung der dadurch bedingten fakultativen Präkanzerosen (Dysplasien) der Zervix verhindert. Der (erwartete) Effekt auf die Häufigkeit von Gebärmutterhalskrebs kann aufgrund der langen Latenzzeit erst 2-3 Jahrzehnte nach der Impfung beurteilt werden. Trotz dieser sehr ermutigenden Ansätze lässt sich vorhersagen, dass die jetzt entwickelten Impfstoffe vor allem aus Kostengründen in absehbarer Zeit gerade in Ländern der Dritten Welt mit der weltweit höchsten Inzidenz an Zervixkarzinomen nicht zum Einsatz kommen werden. Im Gegensatz zu den prophylaktischen Impfungen verliefen die bisher durchgeführten klinischen Studien zur Immuntherapie HPV-bedingter Erkrankungen weniger erfolgreich. Dazu wurden die viralen Onkoproteine E6 und E7, deren CTL-abhängige Effekte gegen HPV-induzierte Tumoren zuvor in zahlreichen Tierexperimenten gezeigt worden waren, als Antigene in unterschiedlichen Applikationsformen (z.b. in rekombinanten Vektoren oder als Minigene) eingesetzt. Bei den bisher durchgeführten Studien konnte zwar bei einem Teil der Patientinnen eine Regression der zu behandelnden Läsion beobachtet werden, jedoch ließ sich keine eindeutige Korrelation mit einer HPV-spezifischen Immunantwort nachweisen. Unser Beitrag zur Entwicklung HPV-spezifischer Impfstoffe ist das Konzept einer dualen (prophylaktisch/therapeutischen) Vakzine. Diese besteht aus chimären VLPs (CVLP), die durch Expression von HPV 16 Fusionsproteinen aus L1 und den ersten 55 Aminosäuren von E7 in Insektenzellen hergestellt werden. Eine von den Firma MediGene AG finanzierte klinische Studie zur Behandlung von Patientinnen mit HPV 16 positiven zervikalen Dysplasien erbrachte eine im

387 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F020 Genom-Veränderungen und Carcinogenese Vergleich zur Plazebogruppe erhöhte Rate an Regressionen, allerdings wieder ohne eindeutiges immunologisches Korrelat bei den betreffenden Frauen. Weiterführende klinische Untersuchungen mit HPV 16 L1/E7 CVLPs werden nach einer strategischen Entscheidung von der MediGene AG nicht durchgeführt, eine Kooperation mit anderen Firmen ist wegen der komplizierten Patentsituation nicht zu erwarten. Wir haben deshalb unsere Aktivitäten auf die folgenden Bereiche verlegt: 1) Entwicklung von HPV 16 E7-spezifischen DNA Vakzinen zur adjuvanten Behandlung von Zervixkarzinom-Patientinnen Untersuchungen zur Steigerung der Immunantwort bei DNA Immunisierung haben ergeben, dass die Expressionsstärke von unterschiedlich modifizierten HPV 16 E7 Expressionsplasmiden (verschiedene Vektoren, Veränderung der Kodons, Verknüpfung mit Kozak Sequenzen) nach Transfektion in Zellen in Kultur direkt mit der Höhe der T-Zellantwort in C57B/6 Mäusen korreliert [18]. Da HPV VLPs mit hoher Effizienz auch in Dendritische Zellen (DCs) aufgenommen werden und diese dabei aktivieren, haben wir untersucht, ob durch Assoziation von Expressionsplasmiden mit VLPs (Verpackung als Pseudovirionen oder chemische Kopplung) die Immunogenität des von dem Plasmid kodierten Antigens gesteigert werden kann. Anders als bei der Verknüpfung von HPV 16 E7 Expressionsplasmiden mit dem HSV VP22 Gen [8,9] konnte bei diesen Experimenten (auch nach Kopplung an ein zellbindendes Peptid des Strukturproteins L2) kein Effekt auf die Plasmid-vermittelte Immunantwort gemessen werden [5]. Gegenwärtig untersuchen wir die Möglichkeit der Kopplung von E7 an Fc-Sequenzen, in der Annahme, dass aufgrund des Vorliegens von entsprechenden Rezeptoren auf DCs dort eine zielgerichtete Einschleusung erreicht werden kann. Da selbst bei Tumorpatienten eine Immunisierung mit der DNA eines Onkogens ethisch nicht zu rechtfertigen ist, verfolgen wir das von uns entwickelte Konzept der rearrangierten (shuffled) E7 Gene (E7SH). Dabei werden einzelne, etwa 100 NT lange Segmente des für 97 Aminosäuren kodierenden Gens umgeordnet und zusätzlich die Sequenzen an den Übergängen zweier ursprünglich benachbarter Segmente angehängt, um keines der theoretisch möglichen T Zellepitope zu verlieren (Osen et al., Vaccine 19:4276, 2001). Bei den neu hergestellten E7SH Genen wurden gezielt diejenigen Bereiche voneinander getrennt, die für die E7-abhängige Transformation von Zellen notwendig sind (Rb-Bindungsstelle und S-S-Brücken). Außerdem wurden die Kodons in einzelnen Bereichen verändert, um die Wahrscheinlichkeit der Rekombination zum E7 Wildtyp zu verringern. Diese so modifizierten Gene haben die Fähigkeit zur Transformation von Mausfibroblasten verloren. Vor der Anwendung am Menschen müssen noch entsprechende Experimente an menschlichen Zellen durchgeführt werden. Immunisierung von C57B/6 Mäusen mit verschiedenen E7SH Genen in dem für die Verwendung am Menschen zugelassenen Expressionsvektor pth führten zur Induktion von E7-spezifischen T-Zell Antworten und zur Regression von HPV-positiven syngenen Tumoren [12]. Nach Abschluss der präklinischen Untersuchungen, Sicherung der Finanzierung und Genehmigung durch die Kommission Somatische Gentherapie der Bundesärztekammer soll an der Universitäts-Frauenklinik Jena eine klinische Studie zur adjuvanten Therapie von Zervixkarzinompatientinnen durchgeführt werden. Ein positives Votum der Ethikkommission dafür liegt bereits vor. 2) Entwicklung von HPV 16 chimären Kapsomeren Kapsomere sind die pentameren Untereinheiten der HPV Kapside, die durch Expression des N-terminal um 10 Aminosäuren verkürzten L1 als GST-Fusionsprotein in E. coli und nach Abspaltung des GST hergestellt werden können. Im Vergleich zu VLPs sind die Kapsomere stabil auch nach Präzipitation und Lagerung bei Zimmertemperatur. Durch die Etablierung eines Systems zum Nachweis der L1-spezifischen T-Zellantwort in C57B/6 Mäusen (Identifizierung eines D b -restringierten CTL Epitops) konnten wir zeigen, dass die Immunisierung mit Kapsomeren ähnlich effizient wie mit VLPs nicht nur - wie bereits bekannt - neutralisierende Antikörper induziert sondern auch zu einer CTL-abhängigen Regression von HPV 16 L1 exprimierenden syngenen Tumoren führt. Die Immunisierungsexperimente zeigten auch, dass die intranasale Applikation fast ebenso wirkungsvoll ist wie die standardmäßig durchgeführte subkutane Verimpfung der Kasomere [11] und durch Verwendung einer modifizierten Untereinheit A1 des Cholera Toxins (CTA1) als Adjuvans in ihrer Effizienz noch verstärkt werden kann. Die Modifikation von CTA besteht in dessen Kopplung an die dimerisierte Immunglobulin-Bindungsdomäne D aus S. aureus, wodurch dieses Protein (CTA1-DD) mit hoher Spezifität an Antigenpräsentierende B Zellen (und nicht mehr an die empfindlichen Zellen der Darmschleimhaut) bindet und dadurch seine toxischen Eigenschaften verliert. Da sich somit auch die Möglichkeit für einen Einsatz auch am Menschen ergibt untersuchen wir zusätzlich die Anwendung von CTA1-DD als Adjuvans bei transkutaner Immunisierung mit isolierten Proteinen oder HPV Partikeln. Nach der Etablierung der optimalen Bedingungen für die Vorbehandlung der Maushaut wurden in den ersten Experimenten viel versprechende Ergebnisse erhalten. Aufgrund der positiven Befunden mit HPV 16 L1 Pentameren wurden chimäre Kapsomere hergestellt, die aus 5 Molekülen von L1 und E7 Vollänge bestehen. Erste Experimente zeigen sowohl eine L1- wie eine E7-spezifische T-Zell Antwort [11]. Damit sind chimäre Kasomere gut geeignete Kandidaten zum Einsatz in Ländern der Dritten Welt (geringe Produktionskosten in E. coli, ungekühlte Lagerung) und bieten außerdem die Möglichkeit zur Insertion längerer heterologer Sequenzen (E7, E6). Sie erfüllen auch die von der WHO für den Einsatz in diesen Ländern geforderten Eigenschaften einer kombinierten (prophylaktischen und therapeutischen) Vakzine. In Zusammenarbeit mit Drs. R. Garcea, Denver und L. Villa, Sao Paulo planen wir die Entwicklung dieser chimären Kapsomere zur Verhinderung und Behandlung persistierender HPV 16 Infektionen (Post- Expositionsprophylaxe). Falls eine Finanzierung von nichtkommerzieller Seite erhalten werden kann sollen klinische Studien in Brasilien durchgeführt werden. Untersuchungen zur Immunogenität von CVLPs Zur Untersuchung der Immunogenität von CVLPs etablierten wir das System der in vitro Beladung von dendritischen Zellen (DC) aus Knochenmark von C57B/6 Mäusen. Die Immunogenität der Partikel wurde durch Aktivierung existierender L1- oder E7-spezifischer T Zell Klone oder durch die de novo Induktion von T-Zellen in vitro oder nach Reinokulation der beladenen DCs gemessen. Dabei konnten wir zeigen, dass L1-spezifische Antikörper die Effizienz der Immunantwort entscheidend beeinflussen, die - je nach 387

388 388 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Zusammensetzung der durch Inkubation von CVLPs mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern entstandenen Immunkomplexe (unterschiedliche stöchiometrische Verhältnisse von Antigen zu Antikörpern) - zu- oder abnimmt [4]. Außerdem zeigten sich adjuvante Effekte von unmethylierten CG Dinukleotiden (CpG Motive) bzw. (bisher nicht bekannt) von hypotonischem Stress (Behandlung der DCs mit Sorbitol) [20]. Wir untersuchen jetzt die der Sorbitol-bedingten Aktivierung zugrunde liegenden Mechanismen. Die Ergebnisse werden auch Aufschluss darüber geben, ob eine solche hypotonische Behandlung bei der ex vivo Beladung von DCs zur Tumortherapie eingesetzt werden kann. Evaluierung einer experimentellen Vakzinierungsstrategie gegen HIV. V. Bosch, M. Cornitescu, D. Holtkotte, T. Pfeiffer, T. Pisch, S. Sparacio In Zusammenarbeit mit Dr. O. T. Keppler (Universität Heidelberg) Zusatzfinanzierung: Wilhelm Sander-Stiftung (T.P.), H. W. & J. Hector Stiftung (M.C.) Wir haben erstmalig zeigen können, dass Membranfusion zwischen einzelnen retroviralen Partikeln, die jeweils virale bzw. zelluläre Fusionsrezeptoren eingebaut haben, möglich ist, und dass die so entstandenen fusionierten Strukturen infektiös sind (Virology, 271:248, 2000) und [17]. Die konzeptionelle Basis unserer Vakzinierungsstrategie betrifft nun die mögliche Induktion kreuz-neutralisierender Antikörper gegen HIV-1 durch Präparationen von solchen miteinander fusionierenden Pseudovirionen, die CD4/Korezeptor bzw. HIV-Env (Wildtyp oder Mutanten) inkorporiert haben. Durch Terminierung des Fusionsprozesses in einem intermediären Stadium (entweder chemisch oder durch die Verwendung spezifischer Env-Mutanten) sollen Env-Epitope, die im nativen Env-Glykoprotein nicht immunogen sind, exponiert und angereichert werden. Verschiedene Präparationen von Pseudovirionen sollen dann im Tiermodell (normale Mäuse, hucd4/korezeptortransgene Ratten) auf ihre Fähigkeit getestet werden, eine Immunantwort gegen HIV-Env zu induzieren. Die bisherigen Arbeiten betrafen die nähere Charakterisierung pseudoviraler Membranfusion und die Herstellung, Analyse und Optimierung von Pseudovirionen-Präparationen sowie erste Immunisierungen in nicht transgenen Mäusen. In nun laufenden Immunisierungs-Experimenten und Analysen werden entsprechende Präparationen miteinander fusionierender Pseudovirionen auf ihre Fähigkeit getestet, neutralisierende oder kreuzneutralisierende Antikörper zu induzieren. Abteilung F020 Genom-Veränderungen und Carcinogenese Rolle der cytoplasmatischen C-terminalen Domäne des HIV-Glykoproteins in der Infektion and Replikation. V. Bosch, D. Holtkotte, T. Pfeiffer Im Gegensatz zu den meisten membran-umhüllten Viren enthalten lentivirale Oberflächenproteine (Env-Proteine) sehr lange C-terminale cytoplasmatische Domänen (CT) (von über 100 Aminosäuren), die für die Virusreplikation in vivo absolut notwendig sind. Außerdem enthält die transmembranale Domäne (TMD) von Env eine konservierte geladene Aminosäure (Arginin), die normalerweise nicht in TMDs vorkommt. Bisher ist jedoch noch unbekannt, welche essentiellen Rollen durch diese Regionen vermittelt werden. Wir verfolgen verschiedene Ansätze, um einen Einblick in diese Vorgänge zu bekommen. Wir haben zeigen können, dass Mutanten-Viren mit Trunkationen in Env-CT oder mit einer ausgetauschten TMD-Region einen Zell-spezifischen Replikationsdefekt zeigen, d.h. sie können in bestimmten T- Zellen replizieren, aber in anderen nicht, obwohl dort die mutierten Glykoproteine funktionsfähig sind (induzieren Membranfusion) und in die Hülle von freigesetzten Virionen eingebaut werden. Unsere jetzigen Untersuchungen zielen zum einen darauf hin, den blockierten Schritt in der Replikation dieser Viren zu identifizieren und somit Information zur Funktion des HIV Env-CTs zu erhalten. Darüber hinaus verfolgen wir mehrere andere Ansätze, um die Effekte der Expression von Env-TMD und Env-CT auf die Zelle (Interaktionen mit zellulären Proteinen, Effekte auf zelluläre Genexpression) zu untersuchen. Antikörper Immunantwort gegen humane Papillomviren (HPV) bei HPV-Infektion und HPVassoziierten Erkrankungen M. Pawlita, L. Gissmann, A. Hoefer, S. Krüger, U. Reidel, P. Sehr, T. Waterboer In Zusammenarbeit mit J. Dillner (University of Malmö, Schweden), S. Franceschi (IARC, Lyon, Frankreich), R. Herrero (IARC, Lyon, Frankreich / Proyecto Epidemiológico Guanacaste, Costa Rican Foundation for Health Sciences, San José, Costa Rica), P. Widschwendter and R. Höpfl (Univeritäts-Frauenklinik Innsbruck, Austria), M. Lehtinen (National Public Health Institute, Helsinki, Finland), E. Davidson and P. Stern (Paterson Institute for Cancer Research, Manchester, UK), A. Kaufmann (Universitäts-Frauenklinik, Jena) Persistierende Infektion mit bestimmten Typen humaner Papillomviren (HPV) ist assoziiert mit der Entwicklung mehrerer bösartiger proliferativer Erkrankungen wie Gebärmutterhalskrebs (Zervixcarcinom) und anderen anogenitalen Krebsformen, Untergruppen von Kopf-Hals-Plattenepithelcarcinomen (HNSCC). Das Projekt basiert auf der Annahme, dass methodische Verbesserungen bei der HPV- Antikörper-Bestimmung notwendige Voraussetzung sind für eine detaillierte Analyse der Immunantwort bei HPV-Infektion und HPV-assoziierten Erkrankungen. Ziel ist serologische Marker zu definieren für Diagnostik und/oder Prognostik HPV-assoziierter Erkrankungen und zum Monitoring bei der HPV-Impfstoffentwicklung. Wir haben eine Serie von Enzym-Immunotesten (ELISA) entwickelt zur Messung von Antikörpern gegen die Proteine E1, E2, E4, E6, E7 und L1 der mucosalen HPV-Typen 16, 18 (die häufigsten HPV-Typen in Zervixcarcinomen) and 6b. Die ELISA verwenden komplette, lösliche rekombinant exprimierte HPV-Proteine als Antigen und zeichnen sich durch hohe Sensitivität und HPV-Typspezifität aus [15] und erlauben systematische seroepidemiologische Studien. In mehreren Fall-Kontrollstudien konnte eine sehr starke Assoziation von Antikörpern gegen die Onkoproteine E6 und E7 der HPV-Typen 16 und 18 mit invasiv wachsendem Gebärmutterhalskrebs [16] und HPV-positiven HNSCC [6] nachgewiesen werden. Bei Zervixcarcinom findet die Serokonversion wahrscheinlich erst bei invasivem Tumorwachstum statt, sodaß diese Antikörper für eine Diagnostik von Krebsvorstufen nicht geeignet erscheinen [7]. E6/ E7-Antikörperstatus zum Zeitpunkt der Tumordiagnose hat keinen Einfluß auf den Krankheitsverlauf [16]. Bei HNSCC

389 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs sind HPV16 E6/E7-Antikörper ein sehr starker Marker für Wildtyp-Konfiguration des p53 Tumorsuppressorproteins [22]. Bei Patienten mit HPV16-positiver intraepithelialer Neoplasie der Vulva (VIN) besteht eine starke Antikörperantwort gegen das HPV16 Capsidprotein L1, aber nicht gegen die Onkoproteine E6 und E7 oder anderen regulatorischen viralen Proteinen [1]. In mehreren experimentellen und klinischen HPV-Impfstudien mit Vaccinen, die auf unterschiedlichen Wegen Immunität gegen die Onkoproteine E6 und E7 oder das Capsidprotein L1 induzieren sollen, konnten - zum Teil nur schwache - spezifische Antikörper-Antworten nachgewiesen werden [2,3,10,11,19,21]. Funktionelle Konsequenzen von Sialinsäure- Modifikationen in Glykoproteinen M. Pawlita, C. Oetke In Zusammenarbeit mit R. Brossmer und O. Keppler (Universität Heidelberg, Heidelberg), S. Hinderlich und W. Reutter (Freie Universität, Berlin). Bei vielen biologischen Ligand-Rezeptor-Interaktionen, darunter beispielsweise eine große Zahl von Virus-Zellrezeptor- Wechselwirkungen sind Sialinsäuren in Glykoproteinen wesentlich beteiligt. Bei der Analyse der Sialinsäure-abhängigen Zellrezeptor-Bindung des B-lymphotropen Polyomavirus identifizierten und isolierten wir Zellinien, die die Expression des Schlüsselenzyms der Sialinsäure-Biosynthese, der UDP-GlcNAc-Epimerase/ManNAc-Kinase verloren haben und damit keine Sialinsäure synthetisieren können. Wir konnten jetzt zeigen, dass diese Zelllinien natürliche und synthetische Sialinsäuren mit strukturellen Modifikationen aufnehmen und in Glykokonjugate auf der Zelloberfläche inkorporieren [13]. Die molekulargenetische Analyse der Zellinien zeigte, dass somatische DNA-Hypermethylierung ursächlich für den Enzym-Expressionsdefekt ist [14]. Sialinsäure-Strukturmodifikationen, die zu erhöhter oder verminderter Zell-Bindung biologischer Liganden führen sind mit Hilfe dieser Zelllinien identifiziert worden [13]; diese Befunde erweitern die strukturellen Möglichkeiten zur pharmakologischen Beeinflussung von Sialinsäure-abhängigen Ligand-Rezeptor-Interaktionen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Davidson, E.J.*, Sehr, P., Faulkner, R.L.*, Parish, J.L.*, Gaston, K.*, Moore, R.A.*, Pawlita, M., Kitchener, H.C.*, and Stern, P.L.* (2003). Human papillomavirus type 16 E2- and L1- specific serological and T cell responses in women with vulval intraepithelial neoplasia. J. Gen. Virol. 84: [2] Davidson, E.J.*, Boswell, C.M.*, Sehr, P., Pawlita, M., Tomlinson, A.E.*, McVey, R. J.*, Dobson, J.*, Roberts, J. St.C.*, Hickling, J.*, Stern, P.L.*, and Kitchener, H.C.* (2003). Immunological and clinical responses in women with vulval intraepithelial neoplasia vaccinated with a vaccinia virus encoding HPV 16/18 oncoproteins. Cancer Res. 63: [3] Ferrara, A.*, Nonn, M.*, Sehr, P., Schreckenberger, C.*, Pawlita, M., Dürst, M.*, Schneider, A.*, and Kaufmann A.M.* (2003). Dendritic cell-based tumor vaccine for cervical cancer II: results of a clinical pilot study in 15 individual patients. J. Cancer Res. & Clin. Oncol. 129: [4] Freyschmidt, E-J (2003). Modulation der Immunogenität von HPV 16 L1/E7 chimären Virus-ähnlichen Partikeln. Dissertation Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg [5] Guthöhrlein, H (2003). HPV Strukturproteine als Vehikel zur Immunisierung. Dissertation Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg Abteilung F020 Genom-Veränderungen und Carcinogenese [6] Herrero, R.*, Castellsagué, X.*, Pawlita, M., Lissowska, J.*, Kee, F.*, Balaram, P.*, Rajkumar, T.*, Sridhar, H.*, Rose, B.*, Pintos, J.*, Fernandez, L.*, Idris, A.*, Sánchez, M.J.*, Nieto, A.*, Talamini, R.*, Tavani, A.*, Bosch, F.X.*, Reidel, U., Snijders, P.J.F.*, Meijer, C.J.L.M.*, Viscidi, R.*, Muñoz, N.*, and Franceschi, S.* for the IARC Multi-center Oral Cancer Study Group. (2003). Human papillomavirus and oral cancer: The international agency for research on cancer multicenter study. J. Natl. Cancer Inst. 95: [7] Lehtinen, M.*, Pawlita, M., Zumbach, K., Lie, K.*, Hakama, M.*, Jellum, E.*, Koskela, P.*, Luostarinen, T.*, Paavonen, J.*, Pukkala, E.*, Sigstad, E.*, Thoresen, S.*, and Dillner, J.* (2003). Evaluation of antibody response to human papillomavirus early proteins in women in whom cervical cancer developed 1 to 20 years later. Am. J. Obstet. Gynecol. 188: [8] Michel N, Osen W, Gissmann L, Schumacher TN*, Müller M (2002). Enhanced immunogenicity of HPV 16 E7 fusion proteins in DNA vaccination Virology 294:47-59 [9] Michel N, Öhlschläger P, Osen W, Freyschmidt E-J, Guthöhrlein H, Kaufmann AM, Müller M, Gissmann L (2002) T cell response against human papillomavirus (HPV) 16 E7 in mice: Comparison of Cr-release assay, intracellular IFNγ production, ELISPOT and tetramer staining. Intervirology, 45: [10] Nonn, M.*, Schinz, M.*, Zumbach, K., Pawlita, M., Schneider, A.*, Dürst, M.*, and Kaufmann, A.M.* (2003). Dendritic cell-based tumor vaccine for cervical cancer I: in vitro stimulation with recombinant protein-pulsed dendritic cells induces specific T cells to HPV16 E7 or HPV18 E7. J. Cancer Res. & Clin. Oncol. 129: [11] Öhlschläger P, Osen W, Dell K, Faath S*, Garcea RL*, Jochmus I, Müller M, Pawlita M, Schäfer K, Sehr P, Staib C*, Sutter G*, Gissmann L (2003) Human papillomavirus (HPV) type 16 L1 capsomeres induce L1-specific cytotoxic T lymphocytes and tumor regression in C57BL/6 mice. J Virol, 77: [12] Öhlschläger, P (2003) Untersuchungen zu neuartigen prophylaktischen und therapeutischen Vakzinierungs-Strategien gegen das Humane Papillomvirus Typ 16. Dissertation Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg [13] Oetke, C., Brossmer, R.*, Mantey, R. L.*, Hinderlich, S.*, Isecke, R.*, Reutter,* W., Keppler, O. T., and Pawlita, M. (2002). Versatile biosynthetic engineering of sialic acids in living cells using synthetic sialic acid analogues. J. Biol. Chem. 277: [14] Oetke, C., Hinderlich, S.*, Reutter, W.*, and Pawlita, M. (2003). Epigenetically mediated loss of UDP-GlcNAc 2-epimerase/ ManNAc kinase expression in hyposialylated cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 308: [15] Sehr, P., Müller, M., Höpfl, R.*, Widschwendter, A.*, Pawlita, M. (2002). HPV antibody detection by ELISA with capsid protein L1 fused to glutathione S-transferase. J. Virol. Methods. 106: [16] Silins, I.*, Avall-Lundqvist, E.*, Tadesse, A.*, Jansen, K.U.*, Stendahl, U.*, Lenner, P.*, Zumbach, K., Pawlita, M., Dillner, J.*, and Frankendal, B.* (2002). Evaluation of antibodies to human papillomavirus as prognostic markers in cervical cancer patients. Gynecol Oncol. 85: [17] Sparacio, S., Pfeiffer, T., Holtkotte, D., and Bosch, V. (2002). Inter-retroviral fusion mediated by human immunodeficiency virus or murine leukemia virus glycoproteins: Independance of cellular membranes and membrane vesicles. Virology, 294, [18] Steinberg, T. (2003) Herstellung von HPV 16 rekombinanten Pflanzenviren für die Produktion viraler Gene in Leguminosen/ Modulation einer HPV 16 Vakzine. Dissertation Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg [19] Davidson, E.J.*, Faulkner, R.L.*, Sehr, P., Pawlita, M., Smyth, L.J.C.*, Burt, D.J.*, Tomlinson, A.E.*, Hickling, J.*, Kitchener, H.C.*, Stern, P.L.* (2004) Effect of TA-CIN (HPV 16 L2E6E7) booster immunisation in vulval intraepithelial neoplasia patients previously vaccinated with TA-HPV (vaccinia virus encoding HPV 16/18 E6E7) Eingereicht zur Veröffentlichung. 389

390 390 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs [20] Freyschmidt, E-J, Alonso, A, Hartmann, G*, Gissmann, L (2004) Freyschmidt Activation of dendritic cells and induction of T cell responses by human papillomavirus type 16 (HPV 16) L1/E7 chimeric virus-like particles is enhanced by CpG ODN or sorbitol Eingereicht zur Veröffentlichung [21] Lucy, J.C.*, Smyth, L.J.C.*, Van Poelgeest, M.I.E.*, Davidson, E.J.*, Kwappenberg, K.M.C.*, Burt, D.*, Sehr, P., Pawlita, M., Man, S.*, Hickling, J.C.*, Fiander, A.N.*, Tristram, A.*, Kitchener, H.C.*, Offringa, R.*, Stern, P.L.* and van der Burg, S.H.* (2004). Immunological responses in women with HPV16 associated anogenital intraepithelial neoplasia (AGIN) induced by heterologous prime-boost HPV16 oncogene vaccination. Eingereicht zur Veröffentlichung. [22] Min Dai, M.*, Clifford, G.M.*, le Calvez, F.*, Castellsagué, X.*, Snijders, P.J.F.*, Pawlita, M., Herrero, R.*, Hainaut, P.*, and Franceschi, S.* for the IARC Multi-center Oral Cancer Study Group. (2004) Human Papillomavirus Type 16 and TP53 Mutation in Oral Cancer: Matched Analysis of the IARC Multi-centric Study. Cancer Res. Im Druck. Arbeitsgruppe Molekulare Biologie und Anwendung rekombinanter Foamyviren M. Löchelt, P. Bastone, F. Romen, A. Schwantes, V. Geiselhart, R. Wirtz, N. Kirchner In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Uwe Truyen, Univ. Leipzig; Profs. Mauro Bendinelli und Mauro Pistello, Univ. Pisa (Italien); Dr. Christian Weiss, Bayer AG Leverkusen; Dr. Matthias Frech, Merck AG, Darmstadt; Dr. Joachim Weikel, Tiergesundheitsdienst Bayern, München; Dr. Ingo Ortlepp, Univ. Heidelberg; Dr. Ali Saib, CNRS, Paris (Frankreich); Allison German, Bristol University (UK). Abteilung F020 Genom-Veränderungen und Carcinogenese Aufgrund der Apathogenität der bekannten Spumaretrooder Foamyviren (FV) und wegen spezieller Charakteristika ihrer Replikations-Strategie, haben diese komplexen Retroviren ein besonderes Potential als neuartige virale Vektoren für den Gentransfer und zur Expression von Impf-Antigenen. In der Arbeitsgruppe, die im Frühjahr 2003 in die Abteilung F020 Genomveränderung und Carcinogenese gewechselte, werden entsprechende Studien durchgeführt. Die Untersuchungen basieren primär auf dem felinen Foamyvirus (FFV), da im Modell der FFV-infizierten oder FFV- Vektor-transduzierten Katzen die Biologie von Foamyviren und die Anwendbarkeit und biologische Sicherheit entsprechender Vektoren experimentell untersucht werden kann. Die Kooperationen mit externen Partnern werden weiterhin genutzt, die Replikation, den Zell- und Organtropismus, sowie die Übertragung des FFV exemplarisch für die Familie der Foamyviren zu untersuchen. 1. Foamyvirus basierte Vektoren Initial wurden Replikations-kompetente FFV Vektoren konstruiert, die das heterologe Gfp Protein in Zellkulturen effizient exprimieren [2]. Während langfristiger serieller Passagierung der Vektoren wurde das heterologe Markergen eliminiert, die Vektoren weisen eine nur begrenzte genetische Stabilität auf [2]. Parallel wurde gezeigt, dass das parentale klonierte FFV Genom für vollständig Replikations-kompetente FFV Partikel kodiert: in Zellkulturen und experimentell infizierten Katzen repliziert kloniertes und nicht-kloniertes FFV mit vergleichbarer Kinetik [2, 4]. FFV- Vektoren, die neutralisierende Epitope des Katzen-Calicivirus exprimierten wurden konstruiert und für Vakzinierungs- Experimente verwendet. Die Vektoren replizierten in Katzen und induzierten eine spezifische (primär zelluläre und mukosale) Immunität in den behandelten Katzen. Die Katzen wurden zwar noch vom felinen Calicivirus infiziert, die Symptome der Infektion und die Ausscheidung des Calicivirus waren in den immunisierten Katzen jedoch signifikant reduziert [4]. Diese Studien belegen erstmals, dass Foamyviren als Vakzinevektoren in immunkompetenten Tieren erfolgreich eingesetzt werden können. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurden selbst-inaktivierende FFV Vektoren konstruiert und charakterisiert [5]: die alleinige Deletion des viralen LTR-Promoters reicht nicht aus, das Auftreten Replikations-kompetenter Revertanten zu verhindern. Deshalb werden derzeit weitere Gene der Vektoren deletiert und die entsprechenden Vektoren funktionell charakterisiert. 2. Struktur und Funktion des Foamyvirus Env Oberflächen-Glykoproteins Das Foamyvirus-Env Glykoprotein ist essentiell für die Freisetzung und Funktion viraler Vektoren. Hierfür verantwortlich ist ein bei anderen Retroviren unbekanntes N-terminales Protein, das Env Leader Protein Elp. Elp ist als Signalpeptid für die korrekte Expression und Prozessierung erforderlich und weist zudem essentielle morphogenetische Determinanten auf. Diese für die Env-Gag Wechselwirkung essentiellen Funktionen werden in weiterführenden Projekten identifiziert und charakterisiert [3]. Ein vertieftes Verständnis der für den Env-Einbau und die Morphogenese erforderlichen Prozesse kann zur Veränderung der Zellspezifität und Pseudotypisierung foamyviraler Vektoren verwendet werden. In weiteren Projekten der Arbeitsgruppe werden verschiedene Aspekte der Wechselwirkung zwischen Foamyviren und der infizierten Wirtszelle bzw. dem infizierten Organismus untersucht [1, 6-8]. In Mittelpunkt dieser und anderer erst kürzlich initiierter Projekte steht die Frage, welche zellulären Faktoren für die virale Replikation erforderlich sind und wie die Funktion(en) antiviraler zellulärer Proteine durch virale Mechanismen inaktiviert werden. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kido, K., A. Doerks, M. Löchelt, and R. M. Flügel (2002). Identification and functional characterization of an intragenic DNA binding site for the spumaretroviral trans-activator in the human p57kip2 gene. J. Biol. Chem. 277: [2] Schwantes, A., *I. Ortlepp, and M. Löchelt (2002). Construction and functional charac-terization of feline foamy virus-based retroviral vectors. Virology 301: [3] Geiselhart, V., A. Schwantes, P. Bastone, *M. Frech, and M. Löchelt (2003). Characterization of the feline foamy virus Env leader protein and the N-terminal Gag domain. Virology 310: [4] Schwantes, A., *U. Truyen, *J. Weikel, *C. Weiss, and M. Löchelt (2003). Application of chimeric feline foamy virus-based retroviral vectors for the induction of antiviral immunity in cats. J. Virol. 44: [5] Bastone, P. and M. Löchelt. (2004). Kinetics and characteristics of replication-competent revertants derived from self-inactivating foamy virus vectors. Gene Therapy. 11: [6] *Weikel, J., M. Löchelt, and *U. Truyen (2003). Demonstration of feline foamy virus in eperimentally infected cats by immunohistochemistry. J. Vet. Med. A 50: [7] Löchelt, M. (2003). Foamy virus transactivation and gene expression. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 277: [8] Bastone, P., *U. Truyen, and M. Löchelt (2004). Potential of zoonotic transmission of non-primate foamy viruses to humans. J. Vet. Med. B 50:

391 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen Abteilung Virale Transformationsmechanismen (F030) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Frank Rösl Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Anastasia Bachmann Dr. Johanna de Castro Arce (11/03-) Dr. Dr. Patrick Finzer Dr. Iris Helfrich (2/03-1/04) Dr. Elke Kehm (-7/03) Prof. Dr. Karl-Werner Knopf Dr. Martin Müller Dr. Ubaldo Soto ( - 9/03) Prof. Dr. Rainer Zawatzky Doktoranden Sabine Bolte(10/01-) Andreea Csernok (10/03 - ) Hinke Dekter (9/02-6/03) Janina Görnemann ( - 3/02) Katrin Hacke (10/03 - ) Marcel Jung (1/01 - ) Handan Karaduman (3/03-) Theresia Karl (5/03 - ) Markus Klehr Diana Maas (10/02 - ) Stephanie Mattil (- 8/02) Nico Michel (-5/02) Julia Nafz (8/03 - ) Katja Parsche (-3/02) Jan van Riggelen (1/01-) Tina Ritter (4/01 - ) Sabine Schenk (1/02-12/03) Ralf Spannagel (6/01 -) Alfonso Vega (12/02 - ) Robert Ventz (cand. med.) (-2/02) Diplomanden Monika Hann (3/01-5/02) Julia Nafz (11/02-7/03) Tim Nötzel (2-11/02) Technisches Personal Petra Galmbacher Elke Göckel-Krzikalla Nadine Seibert Anita Weyland Heribert Wurmbäck Gastwissenschaftler Vladimira Durmanová (4-8/02) Slowakei Dr. Tibor Moško (10-12/03) Slowakei Wissenschaftliche Hilfskräfte Kerstin Lowinski (9-12/02) Katalin Darvas (3-8/03) Zivildienstleistende Ole Simon (8/02-6/03) Christian Stoy (8/03-) Praktikanten Lisa Dunne (11-12/03) Astrid Karbach (8-11/03) Konrad Piuko (9-11/02 ) Silke Schmidt (10-12/03) Sekretariat Diana Steiner Spülküche Alexandra Lichtenwald Auszubildende Britta Haas Anja Irsigler Melanie Lehr Sabrina Schumacher Giesela Schmidt Nina Hensch Jessica Kientz Christina Schmitt Katalin Palfi Die Abteilung befasst sich gegenwärtig mit folgenden Themenkreisen: - Mechanismus der HPV-bedingten Karzinogenese und Regulation der Transkription humanpathogener Papillomviren (Arbeitsgruppe Frank Rösl) - die Rolle von Zytokinen Chemokinen bei der Immunabwehr HPV-positiver Zellen (Arbeitsgruppe Frank Rösl); - Herstellung Papillomvirus-spezifischer Proteinkomponenten für Vakzinierungszwecke (Arbeitsgruppe Martin Müller) (seit 2003 der Abteilung von Lutz Gissmann angeliedert) - Expressionsmuster von Zytokinen in Makrophagen (Arbeitsgruppe Rainer Zawatzky) - Entwicklung HSV-spezifischer Vektoren zur Vakzinierung gegen HPV-spezifische Onkogene (Karl-Werner Knopf) Das Zervixkarzinom stellt mit jährlich ca neuen Fällen weltweit betrachtet die zweithäufigste Tumorerkrankung bei Frauen dar. Hierbei kommt bestimmten humanpathogenen Papillomvirustypen (z. B. HPV 16/18) als sexuell übertragbare Komponente eine entscheidende ätiologische Rolle zu. Das onkogene Potential dieser Virusgruppe wird von den Proteinen E6 und E7 bestimmt, deren Expression wiederum von cis-regulatorischen Sequenzen gesteuert wird (zur Übersicht, siehe zur Hausen, 2002; Nat. Rev. Cancer 2: ). Aufgrund der langen Latenzzeit zwischen Primärinfektion und klinischer Manifestation eines Tumors ist zu postulieren, dass in phänotypisch normalen, jedoch virusinfizierten Zellen die HPV-Expression intrazellulären Kontrollmechanismen unterliegt, welche die maligne Entartung, trotz Viruspräsenz, verhindern. Diese Prozesse sind in Tumorzellen offenkundig entweder epigenetisch inaktiviert oder durch Deletion von Tumorsuppressorgenen komplett ausgefallen. Trotz ihrer Latenz treten infizierte Zellen immer noch mit Zellen des Immunsystems in spezifische Interaktion. Neben der numerischen Reduktion und homeostatischen Kontrolle der Zellmasse via Apoptose (zur Übersicht, siehe Krammer, 2000; Nature 407: ) können wachstumsinhibitorischer Zytokine gewährleisten, dass intrazelluläre Kontrollprozesse kontinuierlich aufrecht erhalten werden und so die Expression persistierender HPV Genome negativ regulieren. Für die HPV-induzierte Mehrstufen-Karzinogenese ergeben sich somit folgende Fragestellungen: 1) Welche regulatorischen Prozesse bestimmen die intrazelluläre Kontrolle persistierender HPV Infektionen und wie kommt es zur Tumorprogression? 2) Steht die oft beobachtete sukzessive Reduktion von Makrophagen, Lymphozyten und dendritischer Zellen in der Umgebung HPV-positiver Läsionen in einem kausalen Zusammenhang mit immunologischen escape Effekten, die auf eine fehlende Zell-Zell- Kommunikation mit immunologischen Effektorzellen während der Progression zurückzuführen sind? Welche Rolle spielen hierbei insbesonders wachstumsmodulatorisch bzw. chemotaktisch wirkende Botenstoffe (= Zytokine und Chemokine)? 3) Welche Tiermodelle können zur Untersuchung der viralen Latenz herangezogen werden? 4) Ist die maligne Transformation HPV-positiver Neoplasien ein irreversibler Vorgang oder gibt es Möglichkeiten zur therapeutischen Intervention trotz Onkogenexpression? 5) Wie ist die Apoptose in malignen bzw. in immortalisierten HPV-positiven Zellen reguliert und welche Funktionen haben hierbei die viralen Onkoproteine E6 und E7? 391

392 392 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Ad 1 a) Die Rolle des Transkriptonsfaktors AP-1 bei der HPV-induzierten Karzinogenese U. Soto, J. de Castro, J. van Riggelen, F. Rösl Kooperationen: Peter Angel, DKFZ, Bohdan Wasylyk, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire INSERM Straßburg, Frankreich. Anhand eines auf somatischen Zellhybriden basierenden Modellsystems konnten wir zeigen, dass der Transkriptionsfaktor AP-1 nicht nur, wie bisher angenommen, ausschließlich eine Funktion als positiv regulierender Transkriptionsfaktor bei der viralen Genexpression erfüllt, sondern auch eine wichtige Schlüsselrolle in einem intrazellulären Kontrollmechanismus einnimmt, welcher die HPV Transkription, die Expression von Zytokinen/Chemokinen sowie das Wachstum HPV-positiver Zellen in vivo bestimmt (Soto et al., 1999; Oncogene 18: ; Soto et al., 2000; Int. J. Cancer 86: ). Die Möglichkeit durch gezielte Veränderung der AP-1 Zusammensetzung ein zentrales Schlüsselprotein innerhalb der HPV-induzierten Karzinogenese von einem positiv zum einem negativ wirkenden Transkriptionsfaktor zu konvertieren, könnte sich für die Therapie persistierender Papillomvirusinfektionen als äußerst attraktiv erweisen (Rösl et al., 1997; J. Virol. 71: ). Weiterhin konnte im Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe um B. Wasylyk geklärt werden, dass c-fos, dessen Überexpression nicht-maligne HPV-positive Zellen zur Malignität konvertiert, durch ein an der Chromatinisierung beteiligtes Protein ( Net ) (zur Übersicht, siehe Buchwalter, et al., 2004; Gene, 324: 1-14) in nicht tumorigenen HPV-positiven Zellen abgeschaltet ist und nur nach Seruminduktion transkribiert wird. In malignen Zellen ist die Expression konstitutiv. Dies zeigt erstmals die Beteiligung von c-fos am Transformationsgeschehen in der Virus-induzierten Karzinogenese menschlicher Zellen auf [1]. Ad 1 b) Ektopische Expression des Retinoinsäurerezeptor β in Zervixkarzinomzellen: Suppression der AP-1 Aktivität J. de Castro Arce, U. Soto, J. van Riggelen, E. Schwarz, F. Rösl. Wie in vielen menschlichen Tumoren ist die Expression des nukleären Retinoinsäurerezeptor β (RARβ) auch in Zervixkarzinomzellen oft dysreguliert (Geisen et. al., 1997; Cancer Res. 57: ). Ein zentraler Mechanismus wie RARβ seine wachstumsinhibitorische Funktion entfaltet basiert auf dessen Fähigkeit in Anwesenheit von Retinoinsäure als Ligand den Transkriptionsfaktor AP-1 zu supprimieren (zur Übersicht, siehe Altucci and Gronemeyer, 2001; Nat. Rev Cancer 1: ). Da bisher sehr wenig über die biologische Funktion von RARβ in der Abwesenheit des Liganden als Repressor bekannt ist, wurde die korrespondierende cdna stabil in RARβ-negative HPV18-positive HeLa-Zellen eingebracht. In diesem Kontext konnten wir einen völlig neuen Mechanismus der AP-1 Inaktivierung identifizieren. Hierbei führte die konstitutive Expression non-liganded RARβ zu einer drastischen Reduktion der Bindung und Aktivität von AP-1, was mit der selektiven Degradation von c- Jun als Hauptdimerisierungspartner begleitet war. Durch Inhibition der Proteasom-vermittelten Proteolyse wird die intrazelluläre c-jun Menge wieder erhöht und die AP-1 Funktion rekonstituiert. Werden darüber hinaus HeLa RARβ Klone entweder mit TNFα behandelt oder mit einer konstitutiv aktiven cdna einer upstream MAP kinase (MEKK1 ) ) Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen transfiziert, wird c-jun re-phosphoryliert, in seiner Halbwertszeit verlängert und damit ebenfalls die AP-1 Affinität und Funktionalität wiederhergestellt. Dies zeigt, dass die AP-1 Funktion nicht irreversibel gestört ist, sondern durch Aktivierung der Jun-N-terminalen Kinase (JNK) wieder reaktiviert werden kann. Dies führt zu einem Modell, das erklärt, wie AP-1 trotz Anwesenheit eines potentiellen Repressors (RARβ) moduliert wird [2]. Ad 2a) Regulation der Chemokinexpression in malignen und nicht-malignen HPV-positiven Zellen P. Finzer, U. Soto, K. Hacke, A. Csernok, F. Rösl. Kooperationen: Barrett Rollins, Harvard University, Boston, USA Weiterhin wurde die Regulation des MCP-1 Gens ( Monozyten-Chemotaktisches-Protein ) in Zervixkarzinomzellen und davon abgeleiteten nicht-malignen somatischen Zellhybriden untersucht. MCP-1 ist ein Chemokin (=Chemotaktisches Zytokin), das an der Infiltration und Aktivierung von Zytokin-sezernierenden Makrophagen in Geweben beteiligt ist. Wie bereits früher gezeigt (Rösl et al., 1994; Journal of Virology 68: ), wird das MCP-1 Gen in Zervixkarzinomzellen nicht exprimiert und kann auch durch Zytokine wie TNF-α nicht mehr induziert werden. Anderseits sind beide Eigenschaften nach der Fusion mit normalen humanen Zellen wieder rekonstituierbar. Es ist daher zu vermuten, dass der Verlust der MCP-1 Expression bzw. eine Dysregulation von Chemokinen allgemein, einen Selektionsvorteil darstellt, wodurch sich HPV-positive Zellen einer lokalen, durch Zytokine vermittelten Wachstumskontrolle entziehen. Daher besteht ein alternativer und vielversprechender therapeutischer Ansatz darin, die Re-expression des MCP-1 Gens direkt in Tumorzellen anzustreben. Aufgrund unserer Vorversuche wurde inzwischen eine präklinischen Studie am DKFZ initiiert, wobei Adeno-Assoziierte-Viren Typ 2 (AAV-2) als Transfer-Vektoren für MCP-1 verwendet wurden. Der Gentransfer ex vivo in Zervixkarzinomzellen führte hierbei in der Tat im Versuchstier zu einer deutlichen Hemmung der Tumorbildung (Kunke et al., 2000; Cancer Gene Therapy 7: ). Damit rückte zwangsläufig die Frage in den Vordergrund, welche Regulationsmechanismen in HPV-positiven Zellen die Ursachen dafür bilden, dass MCP- 1 im Laufe der Mehr-Stufen-Karzinogenese abgeschaltet wird. Dieses Problem konnte ebenfalls abgeklärt werden: MCP-1 wird über eine 3 -regulatorische Kontrollregion reguliert wird, die in tumorigenen Zellen nicht mehr aktiv ist (Finzer et al., 2000; Oncogene 19: ). Im Rahmen einer Kooperation mit Barrett Rollins konnten wir kürzlich zeigen, dass MCP-1 schon sehr früh (d. h. bereits während der Immortalisierung durch HPV) selektiv abgeschaltet wird [3]. Ad 2b) Regulation der Interferon Expression in HPV-positiven Zellen A. Bachmann, T. Ritter, R. Zawatzky, U. Soto, F. Rösl Neben MCP-1 kann TNF-α auch Interferon-β (IFN-β) induzieren. Die Produktion von IFN-β ist die schnellste Immunantwort die vom Wirt gegen virale Infektionen aktiviert werden kann. So konnten wir aufzeigen, dass die Konversion vom prämalignen zum malignen Phänotyp auch durch die Eigenschaft gekennzeichnet ist, in geeigneter Weise IFN-β zu produzieren. Ähnlich wie im Falle von MCP-1, kann TNF-α das IFN-β Gen wiederum nur in nicht-malignen Zel-

393 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs len induzieren. IFN-β ist als immediate-early Gen für die autocrine/paracrine Synthese der sog. delayed interferon response, d. h. für die Signalamplifikation und somit für die eigentliche antivirale und inhibitorische Funktion von Interferon verantwortlich. Erwähnenswert ist weiterhin, dass sich alle Zellen, also unabhängig vom in vivo Phänotyp schützen lassen, wenn IFN-β exogen dazu gegeben wird. Dies bedeutet, dass bei der malignen Transformation nichttumorigener Zellen nur die TNF-α-vermittelte, also immediate-early IFN-β Induktion betroffen ist. Die Analyse einiger an der IFN-β Expression beteiligten Transkriptionsfaktoren ergab folgendes Bild: während in Westernblotund band-shift -Analysen c-jun/atf-2, NF-B, IRF-2 und IRF- 3 in Expression und Bindung keine signifikanten Unterschiede aufzeigten, wurde IRF-1 durch TNF-α nur in nicht-malignen Zellen induziert. Somit scheint die IRF-1 Expression als weiterer Faktor bei der Mehr-Stufenkarzinogenese verändert zu werden [4]. Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen ( Imiquimod ) als Creme topisch verabreicht, die lokal das Immunsystem reaktivert (daher die Bezeichnung Immune response modifier ). Die lokale Applikation von Imiquimod führt in der Regel zu einer kompletten Regression der Läsionen, ohne dass die generelle Immunsuppression aufgehoben wird. Ziel unseres Versuchvorhabens liegt darin, dass wir in Heidelberg eine Mastomys natalensis Tierkolonie besitzen (wurde bisher von Herrn Prof. Wayß geleitet), welche latent mit Mn-Papillomviren infiziert sind. Diese Tiere entwickeln mit zunehmendem Alter ähnliche Hautveränderungen wie dies bei immunsupprimierten Patienten zu beobachten ist. Das heißt, man hat hier ein natürlich vorkommendes Tiermodellsystem in Händen, an dem man die Wirkung dieser Stoffklasse unter definierten Bedingungen auf die Immunreaktion in der Haut untersuchen kann. Aus detaillierten Erkenntnissen über Wirkmechanismen der Tumorentstehung lassen sich im Umkehrschluß therapeutische Konzepte verbessern bzw. sogar neu entwickeln. Ad 3) Etablierung von Tiermodellen zur Virusinduzierten Hautkarzinogenese und Therapie I. Helfrich, M. Chen, R. Schmidt, J. Nafz, F. Rösl Kooperationen: H-J. Gröne, Abteilung Zelluläre und molekulare Pathologie, DKFZ, Eggert Stockfleth, Dermatologie, Charité, Berlin, G. Fürstenberger, Eicosanoide und Tumorentwicklung, DKFZ, U. Kloz, Abteilung Genomveränderung und Karzinogenese, DKFZ. In Gegensatz zur Ätiologie bestimmter Papillomaviren (PV) bei der Entstehung des Zervixkarzinoms, ist deren Rolle bei Hauttumoren noch unklar. Um die Funktion individueller Onkogene bei kutanen PVs zu verstehen, wurden transgene Mäuse als Modellsytem hergestellt, die das E6 Onkogen des Mastomys natalensis Papillomavirus (MnPV) (Tan et al., 1994; Virology 198: ) tragen, eines PV Typs, welcher in seinem natürlichem Wirt Keratoakanthome und Basalzellkarzinome induziert. Hier konnten wir erstmals zeigen, dass E6 tragende Tiere nach Applikation einer Zweistufen-Karzinogenese (= einmalige DMBA und mehrmalige TPA Behandlung) zu 100 % Hauttumore entwickeln (im Gegensatz zu nur 10% in nicht-transgenen Tieren). Dies zeigt auf, dass die Expression von MnPV E6 die Entstehung von Hauttumoren favorisiert. Während in nicht-transgenen Tieren die entstehenden Tumore stets eine Mutation des H-ras Onkogens an Codon 61 aufwiesen, war dies bei MnPV E6 transgenen Mäusen nicht der Fall. Dies zeigt auf, dass MnPV offenkündig ein aktiviertes H-ras Onkogene substituiert. [5]. In einem weiteren Schwerpunkt geht es um eine systematische molekularbiologische und immunhistochemische Analyse der Wirkungsweise sog. Immune response modifier in einem Tiermodell. Die Behandlung mit dieser Substanzklasse wird an Hauttumoren durchgeführt, welche im Kontakt einer natürlich vorkommenden Virus-Wirt- Interaktion (MnPV in Mastomys natalensis) entstanden sind. Hintergrund dieser Fragestellung sind organtransplantierte Patienten, bei denen es aufgrund einer systemischen Immunsuppression in etwa 40% der Fälle zu malignen Hautveränderungen wie aktinische Keratosen, Keratoakanthome, Plattenepithel- sowie Basalzellkarzinome kommt. Verursacht werden diese Läsionen durch die Aktivierung latenter humaner Papillomviren, wobei UV Exposition sowie chemische Karzinogene (z.b. Rauchen) als Kofaktoren wirken (zur Übersicht, siehe Ulrich et al., 2002; Der Hautarzt 53: ). Als Therapie wird eine erst seit 1998 in Deutschland zugelassene Substanz Ad 4) Die Verwendung von Histondeacetylase- Inhibitoren als mögliches Therapeutikum HPVpositiver Läsionen und Tumoren P. Finzer, H. Karaduman, F. Rösl Kooperationen: Triple Crown Inc. USA; P. H. Krammer, DKFZ. Die Modulation der Histonacetylierung ist ein integraler Bestandteil von übergeordneten regulatorischen Prozessen, welche die nukleosomale Organisation der zellulären DNA kontrollieren. Veränderungen in der Chromatinarchitektur wird durch ein Zusammenspiel von Histonacetylasen (= HAT) and -deacetylasen (= HDAC) koordiniert. Um die molekularen Effekte dieser Prozesse im Kontext der HPVinduzierten Karzinogenese näher zu untersuchen, wurde die Wirkung von HDAC Inhibitoren analysiert. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten wir zeigen, dass viruspositive Zellen, trotz weiterlaufender Expression der Onkoproteine E6/E7 in der G1 Phase arretiert werden. Dieser Effekt war begleitet von einer signifikanten Induktion der Cyclin-abhängigen Kinase Inhibitoren (CKIs) p21 und p27. Während beide CKIs ihre inhibitorische Funktion auf die Cyclin-abhängige Kinase 2 (cdk2) in Anwesenheit von E7 normalerweise nicht mehr ausüben können, zeigten unsere Experimente, dass mit derselben Kinetik wie p21 und p27 mit dem Cyclin-cdk2 Komplex assoziierten, E7 von der Bindung ausgeschlossen wird. Histon H1-Funktionsassays machten deutlich, dass der Ausschluss von E7 zeitlich exakt mit der Inaktivierung der Cyclin-abhängigen Kinase 2 (cdk2) koinzidierte. Dieser Befund hat wichtige Implikationen hinsichtlich der Reversibilität des transformierenden Potentials sog. high-risk HPV Typen. Darüber hinaus führte die Inhibition der Histondeacetylase-Aktivität zu einer Degradation von prb, während die Menge des Transkriptionsfaktors E2F unbeeinflusst blieb. Die Anwesenheit von freiem intrazellulären E2F bei gleichzeitigem G1 Arrest führt offenkundig zur klassischen Konfliktsituation wodurch Apoptose durch E2F abhängige Induktion von p73 ausgelöst wird. Somit ist es möglich mit dem Wachstum HPV-positiver Zellen zu interferieren, ohne dabei die viralen Genexpression zu unterbinden. Aufgrund der geringen Toxizität von HDAC Inhibitoren auf primäre Keratinozyten sowie die Möglichkeit das virale Transformationsprogramm komplett zu umgehen, könnte sich diese Stoffklasse für die therapeutische Anwendung als geeignet erweisen [6-8]. 393

394 394 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Ad 5) Regulation der Apoptose in HPVimmortalisierten humanen Keratinozyten, Zervixkarzinomzellen und davon abgeleiteten somatischen Zellhybriden A. Aguilar Lemarroy, A. Vega, F. Rösl In Kooperation mit P. H. Krammer, DKFZ; Ygal Haupt, Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel. Bei Untersuchungen zu Sensitivität gegenüber eines Apoptose-induzierenden Antikörpers bzw. des natürlichen Fas- Liganden (CD95-L) konnten wir festgestellen, daß HPV 16-, im Gegensatz zu HPV 18-positiven Zervixkarzinomzellinien für Apoptosesignale weitaus weniger sensitiv, in einigen Fällen sogar resistent waren. Diese Eigenschaft wird offensichtlich durch das virale Onkogen E6 reguliert. Denn in humanen Keratinozyten, welche mittels amphotroper retroviraler Vektoren separat entweder durch E6 oder E7 bzw. durch beide Onkogene immortalisiert wurden, waren nur die HPV 16 E7-positive Zellen CD95-sensitiv. Allerdings können CD95 resistente Keratinozyten durch Blockade des Proteasoms und Re-Expression von p53 wieder für die CD95- vermittelte Apoptose resensibilisiert werden. p53 kann somit als ein zentrales Schlüsselprotein in der CD95-vermittelten Apoptose HPV-positiver Zellen angesehen werden [9, 10]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] van Riggelen, J., Soto, U. De Castro Arce, J., Buchwalter, G.*, Wasylyk, B.* und Rösl, F., Loss of Net causes ERK-independent SRE-activity leading to a constitutive increase of c-fos expression in cervical carcinoma cells. submitted. [2] De-Castro Arce, J., Soto, U., van Riggelen, J., Schwarz, E., zur Hausen, H., und Rösl, F. Ectopic expression of non-liganded RARβ abrogates AP-1 activity by selective post-transcriptional down regulation of c-jun in cervical carcinoma cells. submitted. [3] Kleine-Lowinski, K., Rheinwald, J.G.*, Fichorova, R.*, Anderson, D.J.*, Basile, J.*, Münger, K.*, Daly, C.M.*, Rösl, F. und Rollins, B.J.* (2003). Selective suppression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) expression by human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins in human epithelial and epidermal cells. International Journal of Cancer 107: [4] Bachmann, A., Hanke, B., Zawatzky, R., Soto, U., van Riggelen, J., zur Hausen, H. und Rösl, F. (2002). Disturbance of TNF-α mediated interferon-β signaling in cervical carcinoma cells. Journal of Virology 76: ). [5] Helfrich, I., Chen, M., Schmidt, R., Fürstenberger, G., Kopp- Schneider, A., Trick, D., Gröne, H-J., zur Hausen, H. und Rösl, F. (2004). Increased incidence of squamous cell carcinomas in Mastomys natalensis papillomavirus E6 transgenic mice during two-stage skin carcinogenesis. Journal of Virology, 87: [6] Finzer, P., Ventz, R., Kuntzen, C., Seibert, N., Soto, U., zur Hausen, H. und Rösl, F. (2002). Growth arrest of HPV-positive cells after histone deacetylase inhibition is independent of E6/E7 oncogene expression. Virology 304: [7] Finzer, P., Stöhr, M., Seibert, N. und Rösl, F. (2003). Phenylbutyrate inhibits growth of cervical carcinoma cells independent of HPV type and copy number. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 129: [8] Finzer, P., Krueger, A., Stöhr, M., Brenner, D., Soto, U., Kuntzen, C., Krammer, P.H. und Rösl, F. (2003). HDAC-inhibitors trigger type II apoptosis in HPV-positive cells via induction of the E2F-p73 pathway. Oncogene, revised version submitted. [9] Aguilar-Lemarroy, A., Gariglio, P., Whitaker, N., Eichhorst, S., zur Hausen, H., Krammer, P.H. und Rösl, F. (2002). Restoration of p53 expression sensitizes human papillomavirus type 16 immortalized human keratinocytes to CD95-mediated apoptosis. Oncogene 21: Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen [10] Finzer, P., Aguilar-Lemarroy, A. und Rösl, F. (2002). The role of human papillomavirus oncoproteins E6 and E7 in apoptosis. Cancer Letters 188: [11] Hergenhahn, M., Soto, U., Weninger, A., Polack, A., Hsu, C.H., Cheng, A.L. und Rösl, F. (2002). The chemopreventive compound curcumin is an effective inhibitor of BZLF1 mrna induction and Epstein-Barr virus reactivation in Raji-DR-LUC cells. Molecular Carcinogenesis 33: [12] Grinstein, E.*, Wernet, P.*, Snijders, P.J.F.*, Rösl, F., Weinert, I.*, Jia, W.*, Kraft, R.*, Schewe, C.*, Schwabe, W.*, Hauptmann, S.*, Dietel, M.*, Meijer, C.J.L.M.* und Royer, H-D.* (2002). Nucleolin as Activator of Human Papillomavirus Type 18 Oncogene Transcription in Cervical Cancer. Journal of Experimental Medicine 196: [13] Baars, S., Bachmann, A., Levitzki, A.* und Rösl, F. (2003). Tyrphostin AG555 inhibits bovine papillomavirus transcription by changing the ratio between E2 transactivator/repressor function. Journal of Biological Chemistry 278: Molekulare und biochemische Charakterisierung von Interferon-induzierbaren möglichen SIRPβ Homologen aus primären Makrophagen der Maus R. Spannagel, M. Klehr und R. Zawatzky In Zusammenarbeit mit Dr. A. Cerwenka, Arbeitsgruppe Angeborene Immunität, DKFZ Gefördert durch DFG-Projekt Za98/5-1 Die Familie der SIRP (Signal-Regulatory-Proteins) Transmembranproteine wird in vielen Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimiert und reguliert ihren Aktivitätszustand. SIRPα Moleküle besitzen drei extrazelluläre Ig-Domänen und mindestens zwei intrazelluläre ITIM (Immune-Receptor- Tyrosine-based-Inhibition-Motiv). Nach Phosphorylierung binden die Tyrosinphosphatasen SHP-1 und SHP-2 an die ITIM und bewirken z.b. eine Hemmung der Aktivität von Makrophagen. Verantwortlich dafür ist u.a. die Interaktion der extrazellulären SIRPα Ig-Domänen mit CD47, einem ubiquitär exprimiertem Transmembranprotein. SIRPβ besitzen im Gegensatz zu SIRPα eine kurze intrazelluläre Domäne, verfügen jedoch über einen positiv geladenen Lys-Rest in der Transmembrandomäne. Eine Signaltransduktion ist daher nur nach Assoziierung mit einem Adaptorprotein möglich, welches über die entsprechenden intrazellulären Domänen verfügt. Im Falle des Human-SIRPβ1 konnte gezeigt werden, dass eine Interaktion mit dem Adaptormolekül DAP-12 stattfindet, die durch einen negativ geladenen Asp-Rest in dessen Transmembrandomäne stabilisiert wird und in transfizierten Zellen zur Aktivierung der Kinase Syk führt, welche an die aktivierende ITAM Sequenz von DAP-12 bindet. In unserer Arbeitsgruppe sind mehrere cdnas in primären Maus-Makrophagen identifiziert worden, die eine große strukturelle Homologie zum SIRPβ aufweisen und wahrscheinlich die noch nicht beschriebenen Maus-Homologe darstellen. Ziel des Projektes ist daher, mit Hilfe funktioneller biochemischer Analysen diese Hypothese zu untermauern. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung, dass die mrnadieser Proteine nur in Makrophagen nachweisbar sind und durch Interferone (IFN) induziert werden. Die Induktion von SIRPβ und deren anschließende Interaktion mit Adaptormolekülen wären ein neuer Wirkmechanismus, über den IFN insbesondere die Aktivität von Makrophagen beeinflussen könnten.

395 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Mechanismen der antitumoralen Wirkung von Typ I IFN R. Zawatzky, H. Wurmbaeck und A. Weyland In Kooperation mit Prof. Dr. Männel, Patholog. Institut, Universität Regensburg; Dr. Kroeger und Dr. Hauser, Abt. Genregulation und Differenzierung, GBF Brunschweig; Dr. Fournier und Prof. Dr. Schirrmacher, Abt. Zelluläre Immunologie, DKFZ Unmethylierte CpG-Dinukleotidhaltige DNA Sequenzen sind starke Immunstimulantien und induzieren in antigenpräsentierenden Zellen und Makrophagen eine breitgefächerte Zytokinantwort, die auch zur Aktivierung von Th1 Zellen führt. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Männel untersuchten wir in einem Tumormodell der Maus die antimetastatische Wirkung von CpG-ODN Injektionen. Wir konnten zeigen, dass CpG-ODN grosse Mengen IFN-α im Serum induziert und zur Aktivierung von NK-Zellen führt. Die Absiedelung von Mikrometastasen in der Lunge - ermittelt drei Tage nach Gabe von Tumorzellen - war in CpG-ODN behandelten Mäusen um mehr als 90% verringert. In syngenen TypI IFN receptor (IFNAR1) defizienten Mäusen dagegen hatte die CpG-ODN Behandlung keinen Effekt. Diese Ergebnisse belegen die Bedeutung von TypI IFN als essentieller Bestandteil der angeborenen Immunabwehr. In weiterführenden Versuchen wollen wir untersuchen, inwieweit das IFN-System auch an der Entwicklung von langlebigen tumorspezifischen Gedächtnis-T-Zellen beteiligt ist. Diese Untersuchungen sollen zum einen an Hepa1-6 Lebertumoren der Maus vorgenommen werden, die durch eine induzierbare IRF-1 Expression selbst IFN-β sezernieren. Diese Studien laufen in Kooperation mit Dr. Kroeger und Dr. Hauser an der GBF. Zum andern wollen wir in Zusammenarbeit mit Dr. Fournier und Prof. Dr. Schirrmacher die tumorspezifische Immunantwort gegen ESb Lymphome in IFNAR-defizienten und Wildtyp Mäusen vergleichen. Auch hier gilt unser besonderes Interesse der Frage, ob ein intaktes IFN-System für die Entwicklung von Memory T-Zellen essentiell ist. Molekulare und biochemische Charakterisierung des IFN-induzierten Gens IFRG28 M. Klehr, A. Weyland, H. Wurmbaeck und R. Zawatzky Die pleiotropen Wirkungen der Typ I Interferone (IFN) werden durch eine Vielzahl spezifischer Gene vermittelt, die in ihrem Promotorbereich ein oder mehrere Interferon-Stimulated-Response-Elements (ISRE) tragen. An diese ISRE binden Komplexe verschiedener Transkriptionsfaktoren, die im Zuge der Signaltransduktion nach Bindung von IFN an den aus zwei Ketten bestehenden spezifischen IFN-Rezeptor in den Zellkern gelangt sind und aktivieren die Transkription dieser Gene. Wir haben durch ein differentielles Screening eine weitere IFN-induzierbare mrna in primären Makrophagen von Mäusen identifiziert und benannten sie vorläufig 3/7. Das offene Leseraster besteht aus 747 bp und kodiert für 249 Aminosäuren. Die Struktur des entsprechenden Gens wurde entschlüsselt und die Aktivität des Promotors untersucht [3]. Die cdna wurde außerdem in verschiedenen Zellsystemen zur Expression gebracht und mit Hilfe des rekombinanten GST-Fusionsproteins wurden polyklonale und monoklonale Antikörper erzeugt. Expressionsanalysen auf mrna Ebene zeigten eine rasche Induktion durch IFN-α nach bereits einer Stunde in allen untersuchten Zellinien. Das 3/7 Gen besteht aus zwei Exons und hat eine Größe von 3.8 kb Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen vom Transkriptionsstart bis zum Polyadenylierungssignal. Die ersten 230 Nukleotide der flankierenden Sequenz am 5 Ende - berechnet vom Transkriptionsstart - besitzen drei ISRE sowie ein Gamma-Activated-Sequence (GAS) Element. Promotoranalysen mit Hilfe von Luciferase-Reporter Konstrukten zeigten, dass nach IFN-α Stimulation der transfizierten Zellen jedes der drei ISRE allein funktionell aktiv ist und inaktive Mutanten aller ISRE zu einem vollständigen Verlust jeglicher Promotoraktivität führen. Mit Hilfe der verschiedenen Antikörper wird z.zt. die Expression des Proteins nach Stimulation mit verschiedenen Zytokinen bzw. nach Virusinfektion in vivo untersucht. Mit Hilfe von Immunpräzipitationen und GST-Pull-Down Experimenten sollen mögliche Interaktionspartner des Proteins in Zellextrakten und Kulturüberständen von IFN-α behandelten Zellen identifiziert werden, um weiteren Aufschluß über die physiologischen Funktionen des Proteins bei Immunreaktionen zu erhalten. Durch eine Datenbank-unterstützte Suche stießen wir kürzlich auf eine cdna identischer Sequenz (Acc.No. AJ251364) und übernahmen für unsere cdna die neue Bezeichnung IFRG28. Publikationen ( ) (* = externer Koautor) [1] Bachmann, A., Zawatzky, R., Soto, U., van Riggelen, J., zur Hausen, H. und Rösl, F. (2002) Disturbance of tumor necrosis factor alpha-mediated beta interferon signaling in cervical carcinoma cells. J. Virol. 76: [2] Kirchhoff, S., Sebens, T., Baumann, S., Krueger, A. Zawatzky, R., Li-Weber, M., Meinl, E.*, Neipel, F.*, Fleckenstein, B.* und Krammer, P.H. (2002) Viral IFN-regulatory factors inhibit activation induced cell death via two positive regulatory IRF-regulatory factore1-dependent domains in the CD95 ligand promoter. J. Immunol. 168(3): [3] Klehr, M., Nickolaus, P. und Zawatzky, R. (2003) Molecular cloning of the mouse IFRG28 gene and functional characterization of its promoter. Immunobiology 208(1-3): 109. Abstract 34 th Annual Meeting of the German Society of Immunology Etablierung effizienter Herpesvirus-Vektoren zur Gen- und Immuntherapie K.-W. Knopf, E. Kehm, S. Schenck In Zusammenarbeit mit L. Gissmann, M. Müller, H.-W. Zentgraf, DKFZ; A. Epstein, Universität Lyon, Frankreich; R. Manservigi, P. Marconi, Universität Ferrara, Italien; T. Brocker, Universität München, und J. Rajcani, Slowakische Akademie der Wissenschaften, Bratislava, Slowakei. Bis Ende Juli 2003 partizipierte das Labor an dem von der EU geförderten EUROAMP-Projekt, dessen Ziel es ist, neue und sichere Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) Vektoren für die humane Gen- und Immuntherapie zu etablieren und zu evaluieren. Unser Labor hat sich dabei näher mit den Einsatzmöglichkeiten von HSV-1 Amplicon-Vektoren befasst. Die Amplicon- Vektoren sind aufgrund ihres breiten Wirtsspektrums, ihrer großen Transgenkapazität, der hohen Toleranz des natürlichen Wirts Mensch und der möglichen Anwendung im Zentralen Nervensystem vielversprechende Kandidaten für die Gentherapie. Der Amplicon-Vektor wird durch Replikation und Verpackung von Transgen-enthaltenden Amplicon-Plasmiden erzeugt und weist eine dem infektiösen HSV-1 Partikel identische Morphologie auf. Zwei alternative, für die Amplicon-Verpackung benötigte Helfersysteme wurden im Detail analysiert, u. zw. (i) das HSV-1 LaL- und (ii) das HSV-1 BAC(Bakterielles Artifizielles Chromosom)-System. Zur Beurteilung und Verbesserung dieser bisher bekannten Verpackungsmöglichkeiten wurde eine vergleichende Analyse der 395

396 396 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs beiden Systeme vorgenommen. Zur Erprobung wurden die L1- und E7-Gene des humanen Papillomavirus 16 (HPV-16) als Transgene gewählt. Ferner wurden durch die Konstruktion von HSV-1/HPV-Amplicon-Hybridvektoren alternative, vom klassischen Weg abweichende Anwendungsmöglichkeiten für Amplicons aufgezeigt. Die verwendeten Transgene sind mögliche Kandidaten zur Immunisierung gegen HPV-16, welches als ein wichtiger Faktor in der Entwicklung des Gebärmutterhalskrebses angesehen wird. Anhand des Modellantigens L1 von HPV-16 wurden Verpackungseffizienz, Helfervirus-Kontamination und Transgenexpression nach Verpackung mit den Helferviren HSV-1 LaL sowie mit HSV-1 BAC beurteilt. Das HSV-1 LaL System lieferte die größte Menge an verpackten Amplicons (~10 6 transducing units/ml), wies aber auch mit ~1% die höchste Helfervirus-Kontamination auf. Nur nach Verpackung mit HSV-1 BAC wurden reine Amplicon- Stammlösungen erhalten, aber mit 10-fach geringerer Partikelzahl. Die Transgenexpression, gemessen mit L1, war wesentlich stärker, wenn HSV-1 LaL-verpackte Amplicon-Präparationen zum Einsatz kamen. Dies ist möglicherweise auf die transaktivierende Wirkung viraler Proteine zurückzuführen, die über das kontaminierende HSV-1 LaL Helfervirus in der infizierten Zelle zur Verfügung stehen. Diese zusätzliche Transaktivator-Funktion fehlt den HSV-1 BAC verpackten, helferfreien Amplicon-Vektoren. Für die aus beiden Verpackungssystemen erhaltenen Amplicon-Präparationen wurde gezeigt, dass mit diesen Vektoren eine Expression des Transgens erzielt werden kann, die direkt mit der für die Infektion verwendete Viruspartikelmenge korreliert. Es gelang ferner die Produktion von HPV-16 VLPs (virus-like particles) nach Dichtegradienten-Sedimentation elektronenmikroskopisch zu dokumentieren. Ein weiterer Schwerpunkt der Forschungsanstrengungen lag in der Gestaltung alternativer HSV/HPV-Hybrid-Amplicon-Vektoren. Dazu wurden die herpesviralen Proteine VP22 (trafficking protein) und das Virushüllprotein Glykoprotein C (gc) erfolgreich mit dem E7-Protein aus HPV-16 fusioniert. Zweck der Fusion war, die Immunogenität des E7- Proteins zu verstärken. Durch die Fusion von E7 mit VP22 sollte die interzelluläre Transportfunktion des VP22-Proteins genutzt werden, um E7 auch in benachbarte Zellen zu bringen und damit in vivo eine verstärkte Immunreaktion zu induzieren. Das VP22/E7-Fusionsprotein wurde als integraler Bestandteil des Amplicon-Viruspartikels identifiziert, aber keine interzelluläre Transportbefähigung festgestellt. Die Fusion von E7 mit gc führte zur gewünschten Präsentation von E7 auf der Virushülle des Amplicon-Partikels. Die Ergebnisse der bisherigen Arbeiten können zu einer Verbesserung der bestehenden Verpackungssysteme beitragen und damit der Anwendung von Amplicon-Vektoren in der Gentherapie den Weg ebnen helfen. Die wissenschaftlich-technologische Zusammenarbeit (WTZ) mit der Slowakei, Projekt-Nr. SVK 00/006 mit dem Titel Erzeugung attenuierter Herpes simplex Virusvektoren zur humanen Gentherapie und Vakzination wurde mit Gastwissenschaftleraufenthalten im Jahre 2002 und 2003 fortgeführt. Ziel ist die Aufklärung der Rolle spezifischer Mutationen im essentiellen Hüllprotein, Glykoprotein B (gb) für die Pathogenität von Herpes simplex Virus 1(HSV-1)-Stämmen, und ferner die Etablierung einer gb-deletionsmutante, die als neuer HSV-1 Vektor des Typus Single-Cycle-Replication- Virus eingesetzt werden kann. Im Berichtszeitraum wurden zwei gb-exprimierende Zelllinien etabliert, die für die Darstellung von gb-deletionsmutanten notwendig sind. Zur Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen Zeit laufen Versuche zur Darstellung der gb-deletionsmutanten. Publikationen ( ) (* = externer Koautor) [1] Song, L.*, Chaudhuri, M.*, Chang, M.*, Wu, Z.*, Diallo, H.*, Knopf, C. W. und Parris, D.S*. (2003). Contribution of the 3 to 5 exonuclease activity of herpes simplex virus type 1 DNA polymerase to the fidelity of DNA synthesis. J. Biol. Chem. 279: Tumorvirus-spezifische Vakzinierungsstrategien In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. L. Gissmann, DKFZ; Dr. H. W. Zentgraf, DKFZ; Dr. J. Kleinschmidt, DKFZ; Prof. Dr. H. Müller, Universität Leipzig; Dr. M. Kast, Loyola University Chicago, USA; Prof. Dr. U. Sonnewald und Dr. S. Biemelt, IPK Gatersleben; Prof. Dr. H. Will, Heinrich-Pette Institut Hamburg. Weltweit können 15-20% der Tumorerkrankungen mit viralen und bakteriellen Krankheitserregern in Zusammenhang gebracht werden. Allein das Zervixkarzinom repräsentiert dabei mit jährlich einer halben Million neuer Fälle die zweithäufigste Krebsart bei Frauen. An erster Stelle der Risikofaktoren für das Zervixkarzinom steht die Infektion mit humanpathogenen Papillomviren (HPV). Ziel der Arbeitsgruppe ist es, virusspezifische Vakzinierungsstrategien zu entwickeln sowie vorhandene Strategien auf ihre Wirksamkeit zu untersuchen. Im Vordergrund stehen dabei immuntherapeutische Fragestellungen. Zur Zeit wird in mehreren unterschiedlichen Ansätzen der Entwicklung einer Papillomavirus-spezifischen Vakzine nachgegangen: Verbesserte Induktion und Nachweis von HPV 16 E7-spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten nach DNA- und Protein-basierter Vakzinierung N. Michel, M. Müller DNA Vakzinierung ist ein vielversprechender Ansatz eine humorale sowie zelluläre Immunantwort zu induzieren [1]. Zur Immuntherapie HPV 16-assoziierter Erkrankungen ist das E7 Protein von besonderer Bedeutung, da es in allen HPV 16-positiven Tumoren exprimiert wird. Leider besitzt E7 jedoch nur geringe Immunogenität, besonders wenn es in Form einer DNA Vakzine verabreicht wird. Wir konnten durch gezielte Veränderung die Immunogenität von E7, insbesondere die Fähigkeit zur Induktion einer zytolytischen Immunantwort deutlich erhöhen. Erhöhte Immunogenität von E7 wurde erzielt durch Fusion mit klassischen und nichtklassischen Proteinexportsignalen, Stabilisierung des E7 Proteins durch Fusion mit einem Trägerprotein sowie Akkumulation von E7 im endoplasmatischen Retikulum [2,3]. Unsere Beobachtungen zeigen, dass die molekularen Mechanismen, welche die E7 Immunogenität beeinflussen sehr komplex sind. Möglicherweise spielt dabei ein verstärkter Transfer von Antigen von DNA transfizierten Zellen zu professionellen antigen-präsentierenden Zellen (cross priming) eine wesentliche Rolle. Alternativ könnten die Modifikationen des E7 Proteins auch zum Verlust einer spezifischen, immunsupprimierenden Funktion von E7 geführt haben. Ein weiteres Ziel dieses Projektes war es, E7-Proteine direkt zur Induktion einer zellulären Immunantwort zu verwenden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale anti-e7 Antikörper entwickelt, die in der Lage sind Immunkomplexe mit E7 zu bilden. Zur Zeit wird untersucht, ob diese Komplexe zytolytische Immunantworten auslösen. Um die Untersuchungen zu ermöglichen, wurden insgesamt vier unterschiedliche

397 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Verfahren zur Messung einer E7-spezifischen Immunantwort in Mäusen entwickelt [4]. Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen Equine Sarkoide: Modell für die Entwicklung einer therapeutischen, Papillomavirusspezifischen Vakzine S. Bolte, S. Mattil, L. Gissmann, H. Müller, M. Müller Humane Papillomaviren können nicht in Zellkultur vermehrt werden. Dadurch wurde die Entwicklung von Vakzinen, die beispielsweise auf inaktivierten oder attenuierten Viren beruhen verhindert. Es konnte jedoch vor etwa 10 Jahren gezeigt werden, dass es bei Expression des Papillomavirus L1 Strukturproteins in verschiedenen experimentellen Systemen spontan zu der Bildung von so genannten Virusähnlichen Partikeln (VLPs) kommt. Diese Partikel ähneln strukturell und funktionell infektiösen Virionen. Sie binden an den zellulären Rezeptor für Papillomaviren und dringen sogar in Zellen ein. Da den VLPs das virale Genom fehlt, führt dies jedoch nicht zu einer Infektion der Zelle. Immunisierung mit VLPs führt zu der Bildung von Virus-neutralisierenden Antikörpern. Dadurch können Tiere und auch Menschen effizient gegen Infektionen mit Papillomaviren geschützt werden. VLPs sind daher ausgezeichnete Kandidaten für die prophylaktische Immunisierung gegen Papillomavirus-assoziierte Erkrankungen. Durch Fusion des Papillomavirus L1 Proteins mit viralen Tumorantigenen konnten wir die Einsatzmöglichkeit der VLPs erweitern. Ähnlich wie L1, führt Expression von L1 Fusionspeptiden zu der spontanen Bildung von so genannten chimären, Virus-ähnlichen Partikeln (CVLPs). CVLPs induzieren zytotoxische T-Lymphozyten die gegen die viralen Tumorantigene gerichtet sind. In einem Maus Modell konnten wir zeigen, dass die Tiere durch Vakzinierung mit CVLPs antigen-spezifisch vor dem Wachstum von Tumorzellen geschützt werden können oder sogar existierende Tumore durch Vakzinierung eliminiert werden. In Zusammenarbeit mit der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig haben wir eine klinische Studie der Phase I durchgeführt, um zu untersuchen ob CVLPs auch für die Behandlung natürlicher, Papillomavirus-assoziierter Tumoren verwendet werden können. Dabei wurden Pferde, die an Sarkoiden erkrankt waren, mit CVLPs vakziniert. Equine Sarkoide sind ein sehr häufiger Hauttumor bei Pferden und werden durch Infektion mit bovinen Papillomaviren hervorgerufen. Die Sarkoide sind äußerst therapieresistent und stellen ein ernstes Problem für Züchter und Pferdebesitzer dar. Ausgehend von unseren früheren Studien wurden BPV 1 L1/E7 CVLPs entwickelt und in ausreichenden Mengen hergestellt und gereinigt. Ziel der Studie, die zunächst 12 Sarkoidpferde umfasste, war es die Verträglichkeit der CVLP Vakzine zu untersuchen. Zusätzlich wurde die CVLP-spezifische Immunantwort gemessen sowie der Tumorstatus verfolgt. Die klinische Studie ergab, dass Tiere aller Dosisgruppen (bis zu 2,5 mg CVLPs pro Impfung) die Impfung gut vertrugen. Mit Ausnahme eines Tieres wurde bei allen Pferden eine starke anti-l1 Antikörperantwort gemessen. Anti-E7 Antikörper wurden in 5 der vakzinierten Tiere nachgewiesen. Zwei der Tiere zeigten im Beobachtungszeitraum eine deutliche Verbesserung des klinischen Status. Bei einem Tier kam es zur Abstoßung von 5 Tumoren, von denen jedoch drei wieder rezidivierten. Zwei Tiere zeigten sowohl Tumorregression als auch Wachstum neuer Tumore. Bei zwei Tieren wurde keine Veränderung der Tumore festgestellt, bei zwei Tieren verschlechterte sich der Zustand im Laufe der Studie. Vorläufige Ergebnisse aus einer weiteren Immunisierungsstudie, die noch nicht abgeschlossen ist, zeigen, dass der Therapieerfolg sehr stark vom Tumorstatus bei Eintritt in die Studie abhängt. Um auch die zelluläre Immunantwort gegen die viralen Antigene bestimmen zu können, haben wir ein System zum Nachweis von equinem Interferon gamma entwickelt. Dieses System soll, durch quantitative Kontrolle der tumorgerichteten Immunantwort eine Optimierung der Vakzine (z.b. durch Adjuvantien) ermöglichen. HPV-transgene Pflanzen für die prophylaktische Vakzinierung gegen Infektionen mit Papillomaviren S. Biemelt, U. Sonnewald, M. Müller Zervixkarzinome sind kausal mit der Infektion mit bestimmten Papillomaviren assoziiert und stellen den dritthäufigsten Tumor bei Frauen weltweit dar [5,6]. Aus diesem Grund gibt es einen Bedarf für eine prophylaktische Vakzine, um Infektionen mit Papillomaviren zu verhindern. Transgene Pflanzen, die das HPV Hauptstrukturprotein L1 exprimieren könnten eine Möglichkeit darstellen, eine prophylaktische Vakzine zu produzieren. Auch ohne Reinigung des Antigens könnten transgene Pflanzen als so genannte essbare Vakzine verwendet werden, um eine L1-spezifische Immunantwort auszulösen. In enger Zusammenarbeit in dem Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung in Gatersleben haben wir transgene Tabak und Kartoffelpflanzen entwickelt, die das HPV 16 L1 Gen unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors tragen [7]. Alle Versuche das ursprüngliche, unmodifizierte L1 Gen zu exprimieren schlugen fehl. Selbst Pflanzen, die ein für Pflanzenzellen optimiertes L1 Gen trugen, waren nicht in der Lage das L1 Protein zu produzieren. Überraschend konnte jedoch L1 in Pflanzen nachgewiesen werden, die ein L1 Gen trugen, das für die Expression in Säugetierzellen optimiert wurde. Die Translation dieses Gens konnte durch den Einsatz eines Enhancerelements, das vom Tabak Mosaik Virus stammt noch gesteigert werden. Insgesamt produzieren die Pflanzen 0,2-0,5% L1 bezogen auf den Gesamtproteingehalt (lösliche Proteine). Die transgenen Pflanzen bilden Virus-ähnliche Partikel, die vergleichbare Immunogenität zu VLPs aus Insektenzellen aufweisen. Verfütterung von rohen Kartoffelknollen an Mäuse konnte in drei von 20 Tieren eine Immunantwort direkt auslösen. In etwa der Hälfte der Tiere wurde durch die Verfütterung eine humorale Immunantwort initiiert. Zur Zeit arbeiten wir daran, die Expression von L1 in den Pflanzen weiter zu steigern, beispielsweise durch die Verwendung alternativer Vektoren. Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Proteine als Interaktionspartner des Neben- Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren J. Görnemann, T. Hofmann, H. Will, M. Müller Das Kapsid der Papillomaviren wird von zwei Strukturproteinen gebildet. Während die Funktionen des Hauptstrukturproteins L1 sehr gut charakterisiert sind, ist die Rolle des Nebenstrukturproteins L2 weniger gut definiert. Es wurde jedoch postuliert, dass L2 sowohl beim Eintritt des Virus in die Zelle als auch bei der Reifung infektiöser Partikel eine Rolle spielt. 397

398 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F030 Virale Transformationsmechanismen Mit Hilfe des yeast-two-hybrid systems haben wir mögliche zelluläre Interaktionspartner von L2 identifiziert. Wir konnten vier zelluläre Proteine identifizieren, die mit dem L2 Protein von mindestens zwei unterschiedlichen Papillomaviren interagieren [8]. Die Interaktionen der Proteine mit L2 wurden durch Ko-Immunpräzipitationen und Lokalisationsstudien bestätigt. Zwei der Proteine, das schon beschriebene PATZ und ein bislang nicht beschriebenes Proteins, welches wir als PLINP bezeichnet haben, lokalisieren in punktartigen nukleären Domänen. In diesen Domänen sind sie mit L2 kolokalisiert. Ein drittes Protein, von uns als PMSP bezeichnet, ist in L2-negativen Zellen zytoplasmatisch lokalisiert. L2 Koexpression führt dazu, dass auch PMSP in nukleäre Unterdomämen transloziert wird. Das vierte Protein (tubular-nephritis antigen related protein) interagiert mit L2 von HPV 1, 11, und HPV 16. Es zeigt zytoplasmatische und Membran-assoziierte Lokalisation. Unsere Beobachtungen lassen vermuten, dass L2 unabhängig vom HPV Typ modulierende Funktionen von Zellfunktionen ausübt, die die diskrete subzelluläre Domänen betreffen. Die L2-interagierenden zellulären Proteine könnten eine Rolle im viralen Vermehrungszyklus und bei der Etablierung viraler Persistenz spielen. 398 Publikationen (* = externer Koautor) [1] Michel, N. und Müller, M. (2003) DNA vaccines. Molecular Pharmacology, an Encyclopedic Reference [2] Michel, N., Osen, W., Gissmann, L., Schumacher, T.N.M.*, Zentgraf, H. und Müller M. (2002) Enhanced immunogenicity of HPV 16 E7 fusion proteins in DNA vaccination. Virology 294: [3] Öhlschläger, P., Osen, W., Dell, K., Faath, St.*, Garcea, R.L.*, Jochmus, I., Müller, M., Pawlita, M., Schäfer, K., Sehr, P., Staib, C.*, Sutter, G.* und Gissmann, L. (2003) human papillomavirus Type 16 L1 Capsomeres Induce L1-Specific Cytotoxic T Lymphocytes and Tumor Regression in C57BL/6 Mice. J. Virol. 77: [4] Michel, N., Öhlschläger, P., Osen, W., Freyschmidt, E.-J., Guthöhrlein, H., Kaufmann, A. M.*, Müller, M. und Gissmann, L. (2002) T Cell Response to human papillomavirus 16 E7 in Mice: Comparison of Cr Release Assay, Intracellular IFN-γ Production, ELISPOT and Tetramer Staining. Intervirology 45: [5] Walz, Ch. M., Correa-Ochoa, M.M.*, Müller, M. und Schlehofer, J. (2002) Adeno-associated virus type 2 (AAV-2)- induced inhibition of the human papillomavirus type 18 (HPV-18) promoter in transgenic mice. Virology 293: [6] Sehr, P., Müller, M., Höpfl, R.*, Widschwendter, A. und Pawlita, M. (2002) Capture ELISA with recombinant human papilloma virus capsid protein L1 fused to glutathione S-transferase. Journal of Virological Methods 106: [7] Biemelt, S.*, Sonnewald, U.*, Galmbacher, P., Willmitzer, L.* und Müller, M. (2003) Production of human papillomavirus Type 16 virus-like particles in transgenic plants. J. Virol. 77: [8] Görnemann, J., Hofmann, T.G.*, Will, H.* und Müller, M. (2002) Interaction of human papillomavirus Type 16 L2 with cellular proteins: Identification of novel nuclear body-associated proteins. Virology 303:

399 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F040 Pathogenitätsmechanismen Projektgruppe Pathogenitätsmechanismen (F040) Leiter: Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Harald zur Hausen; Prof. Dr. rer. nat. Frank Rösl Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Ursula Bantel-Schaal Dr. Angel Cid-Arregui (seit 5/03 bei F070) Dr. Claudia Hetzer-Egger ( - 12/03) Dr. Melanie Ott (- 1/04) Dr. Heike Pöpperl ( - 12/02) Dr. Frank Reuss ( - 12/02) Rainer Schmidt (seit 5/03 bei F070) Doktoranden Andres Baez (seit 5/03 bei F070) Alexander Dörr ( - 12/02) Iris Helfrich ( - 1/03 ) Martin Ploss ( - 3/02) Diplomanden Kerstin Bartscherer ( - 4/02) Christopher Previti ( - 3/02) Anja Speyerer (9/02-3/03) Oliver Speicher (4-10/03) Pedro Gois (1-6/02) Technisches Personal Bianca Berdel (seit 3/03 bei F070) Ilona Braspenning-Wesch Birgit Hub (seit 3/03 bei F070) Katrin Kählcke ( - 8/02) Kerstin Müller (seit 3/03 bei F070) Angelika Pedal ( -07/02) Gastwissenschaftler Martina Jajcinovic (3-6/02) Kroatien Arzt im Praktikum Philipp Kurz ( - 2/03) Zivildienstleistender Florian Schmidt ( - 7/02) Mitarbeiter ohne Vergütung Björn Schwer Benedikt Fritzsching (3-11/02) Sekretariat Diana Steiner Spülküche Alexandra Lichtenwald Gisela Schmidt Genetische Immunisierung gegen HPV mittels rekombinanten Virusvektoren A. Cid-Arregui, K. Müller, A. Baez Hauptinteresse unseres Projektes ist es prophylaktische und therapeutische Vakzine zu entwickeln. Insbesondere die human Papillomviren [HPV], die den Krebs des Genitalbereiches verursachen und HPV-16 und -18 schützen können. Für diesen Zweck wurden rekombinanten Adenoviren und Herpes simplex Vektoren hergestellt, die T-Zell Epitope aus den E6 und E7 Onkoproteine, sowie den L1 Kapsidprotein des Zielvirus als Fusionsprodukte mit dem Hepatitis B Oberfläche Antigen (HBsAg) Protein exprimieren. Um eine höhere Expression der Proteine zu sichern, wurden die HBsAg, L1, E6 und E7 Gene durch Kodonoptimierung geändert. Immunisierungsversuche mit Mäusen haben gezeigt, dass die o.g. Virusvektoren starke humorale und CTL Immunantworten gegen HPV bilden. Weiterer Gegenstand unserer Untersuchungen sind es die Mechanismen, die für den Transport in den Zellkern der E6 und E7 Proteine verantwortlich sind zu untersuchen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Morales-Peza, N.*, Auewarakul, P.*, Juarez, M.V.*, Garcia- Carranca, A*. und Cid-Arregui, A. (2002) In vivo tissue-specific regulation of the human papillomavirus type 18 early promoter by estrogen, progesterone and their antagonists. Virology 294: [2] Cid-Arregui, A., Juarez, V*. und zur Hausen, H. (2003) A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. J. Virol. 77: Patent Cid-Arregui, A. und zur Hausen, H. (2003) Modified HPV E6 and E7 genes and proteins useful for vaccination. PCT Patent filed No. 02/ EP ; US 10/472,724 Onkosuppressive Eigenschaften Adeno- assoziierter Parvoviren U. Bantel-Schaal, I. Braspenning-Wesch In Zusammenarbeit mit John F. Engelhardt Ph.D., Gene Therapy Center for Cystic Fibrosis and Other Genetic Diseases, Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa, Iowa City, USA. Adeno-assoziierte Parvoviren (AAVs) sind von Interesse wegen onkosuppressiver Eigenschaften und als Vektoren für die Gentherapie. Derzeit sind sechs unterschiedliche AAV Serotypen in der Literatur beschrieben. Für ihre Vermehrung brauchen AAVs einen viralen Helfer. In Abwesenheit eines Helfervirus kann AAV DNA in das Wirtszellgenom integrieren. Wir konnten zeigen, daß die Infektion primärer humaner maligner Zellen mit AAV das Wachstum solcher Zellen in der Kultur irreversibel hemmt. Im Gegensatz dazu ist eine Wachstumshemmung normaler humaner Zellen reversibel und kann wieder aufgehoben werden. Neben der Beeinflußung des Zellwachstums durch Infektion mit AAV führt auch die Integration von AAV DNA zu verändertem Wachstumsverhalten. Melanomzellen, die AAV-2 DNA integriert haben sterben häufig innerhalb weniger Passagen entweder abrupt oder aber sie stellen das Wachstum allmählich ein und differenzieren. Solche terminal differenzierenden Melanomzellen sezernieren ein Peptid mit 399

400 400 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs onkosuppressiven Eigenschaften in das Kulturmedium, das hemmend auf das Wachstum von Melanom- und Hepatomzellen wirkt, das Wachstum von Fibroblasten hingegen fördert. Die Analyse von in Melanomzellen integrierter AAV-2 DNA zeigte in Southernblots Restriktionsfragmente, die mit einer Integration weniger (möglicherweise nur 2) Kopf- Schwanz-verknüpfter viraler DNA Moleküle vereinbar ist. Das Restriktionsmuster wird unter Bedingungen der Einzelzellklonierung verändert. Die Analyse der AAV-2 DNA aus Melanomzellklonen zeigte in keinem Fall mehr das Ausgangsmuster. Stattdessen fand sich für jeden Klon ein individuelles Muster. Unsere Arbeiten befassen sich mit dem Mechanismus der Wachstumsbeeinflußung von Zellen maligner Tumoren durch AAV, mit der Charakterisierung des sezernierten Peptids, mit der Analyse der Integrationsstelle von AAV-2 DNA und der Stabilität der Integration. Im Zusammenhang mit den Vektoreigenschaften von AAV beschäftigen wir uns mit der Aufnahme von Wildtyp (wt Serotyp 5; AAV-5) und rekombinanten AAVs in verschiedenen Zelltypen [1; 2]. Für HeLa Zellen konnten wir zeigen, daß AAV-5 wt einen unüblichen Weg nimmt und im Golgi Bereich akkumuliert [2]. Die Aufnahme von AAV-5 in andere Zelltypen, vor allem in humane embryonale Fibroblasten, deren Wachstum durch die Infektion mit AAV reversibel gehemmt wird, ist Gegenstand unserer derzeitigen Arbeiten. Desweiteren haben wir im Rahmen einer Kooperation über Fragen der Replikation amphotroper Leukämierviren in normalen humanen Fibroblasten mitgewirkt [3]. Eine weitere Kooperation befasste sich mit der molekularen Analyse möglicher Tumorsuppressor Gene in Hautkrebs [4]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Yan, Z.*, Zak, R.*, Luxton, G.W.G.*, Ritchie, T.C.*, Bantel- Schaal, U. und Engelhardt, J.F.* (2002). Ubiquitination of both adeno-associated virus type 2 and 5 capsid proteins affects the transduction efficiency of recombinant vectors. J.Virol. 76: [2] Bantel-Schaal, U., Hub, B. und Kartenbeck, J. (2002). Endocytosis of adeno-associated virus type 5 leads to accumulation of virus particles in the Golgi compartment. J.Virol. 76: [3] Reuss, F.U., Berdel, B., Heber, R., und Bantel-Schaal, U. (2002). Replication of enhancer-deficient amphotropic murine leukemia virus in human fibrosarcoma but not in primary human fibroblasts. J.Med.Virol. 68: [4] Mollenhauer, J., Deichmann, M.*, Helmke, B.*, Müller, H., Kollender, G., Holsmkov, U.*, Ligtenberg, T.*, Krebs, I., Wiemann, S., Bantel-Schaal, U., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Klauck, S.M., Otto, H.F.*, Moldenhauer, G. und Poustka, A. (2003). Frequent downregulation of DMBT1 and galectin-3 in epithelial skin cancer. Int.J.Cancer 105: Die Azetylierung des HIV Transaktivators Tat induziert einen Kofaktorwechsel während der HIV Transkription K. Bartscherer, A. Dörr, C. Hetzer-Egger, B. Fritzsching, K. Kählcke, P. Kurz, M. Ott, A. Pedal, F. Schmitt, B. Schwer, A. Speyerer In Zusammenarbeit mit M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ; J. Kartenbeck, Abteilung für Zellbiologie, DKFZ; P. Henklein, Abteilung f. Biochemie, Humboldt Universität, Berlin; P. Cole, Johns Hopkins University, Baltimore, USA; E. Verdin, Gladstone Institute of Virology and Immunology, UCSF, San Francisco, USA; M.-M. Zhou, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA; V. Horejsi, Academy of the Sciences, Prag, Tschechische Republik. F040 Pathogenitätsmechanismen Der HIV-eigene Transaktivator Tat spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle der Virusreplikation. Tat bindet an die RNS Struktur TAR und ermöglicht so die effiziente Elongation der HIV Transkripte. Ergebnisse unserer früheren und jüngeren Studien zeigten, daß Tat durch die Histonazetyltransferase p300 an einem Lysin (K50) in der RNS-bindenden Region azetyliert wird [1]. Um die Bedeutung der azetylierten Tatform in der Zelle zu studieren, wurden monoklonale und polyklonale Antiseren hergestellt, welche ausschließlich die K50-azetylierte Tatform erkennen. Mikroinjektion dieser Antikörper führten zu einem kompletten Verlust der Tat-vermittelten HIV Transkription, was die Bedeutung der K50-Azetylierung für die Tatfunktion hervorhebt [2]. Außerdem wurde gezeigt, daß azetyliertes Tat zwar an TAR RNS, nicht aber an den Kofaktor CyclinT1 bindet. Wir postulieren deshalb einen Kofaktorwechsel im zellulären Tatkomplex, der durch die Azetylierung/Deazetylierung von K50 reversibel kontrolliert wird. Tatsächlich bindet Tat an den transkripitonellen Koaktivator PCAF. Die NMR Strukturanalyse der Tat/PCAF Interaktion zeigte eine direkte Bindung des azetylierten K50 in Tat mit der Azetylbindungstasche der PCAF Bromodomäne und definierte weitere kritische Interaktionspunkte zwischen Tat und PCAF [3]. Mutation dieser Residuen führte zum völligen Verlust der Tat/PCAF Bindung und der Tat/PCAF Synergie in der Zelle [4]. Damit wurde gezeigt, daß die Azetylierung von K50 eine neue Interaktionsoberfläche auf Tat generiert, welche für die transkriptionelle Aktivität des viralen Transaktivators wichtig ist. Ein neues Interessensgebiet unserer Gruppe ist das Hepatitis C Virus (HCV). Das HCV env Protein E2 bindet mit hoher Affinität an das humane Tetraspanin CD81. Unsere ersten Studien haben einen neuartigen Regulationsmechanismus für die Expression von CD81 auf der Oberfläche von B und T-Lymphozyten gezeigt. CD81 wird nach Zellaktivierung rapide internalisiert und auf Minivesikeln, sogenannten Exosomen, aus der Zelle ausgeschleußt [5]. Zirkulierende CD81+ Exosome konnten im Blut von Probanden nachgewiesen werden und könnten der Sezernierung und dem Transport von HCV Partikeln im Blutstrom dienen. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dormeyer, W., Dörr, A., Ott, M. und Schnölzer, M. (2003). Acetylation of the HIV-1 Tat protein: an in vitro study. Anal. Bioanal. Chem. 376: [2] Kaehlcke, K., Dörr, A., Hetzer-Egger, C., Kiermer, V.*, Henklein, P.*, Schnölzer, M., Loret, E.*, Cole, P.*, Verdin, E.* und Ott, M. (2003). Acetylation of Tat defines a cyclint1-independent step in HIV transactivation. Mol Cell. 12: [3] Mujtaba, S.*, He, Y.*, Zeng, L.*, Farooq, A.*, Carlson, J.E.*, Ott, M., Verdin, E.* und Zhou, M.M.* (2002). Structural basis of lysine-acetylated HIV-1 Tat recognition by PCAF bromodomain. Mol. Cell. 9: [4] Dörr, A., Kiermer, V.*, Pedal, A., Rackwitz, H.R., Henklein, P.*, Schubert, U.*, Zhou, M.M.*, Verdin, E.* und Ott, M. (2002). Transcriptional synergy between Tat and PCAF is dependent on the binding of acetylated Tat to the PCAF bromodomain. EMBO. J. 21: [5] Fritzsching, B., Schwer, B., Kartenbeck, J., Pedal, A., Horejsi, V.* und Ott, M. (2002). Release and intercellular transfer of cell surface CD81 via microparticles. J. Immunol. 169: [6] Schwer, B., North, B.J.*, Frye, R.A.*, Ott, M. und Verdin, E.* (2002). The human silent information regulator (Sir)2 homologue hsirt3 is a mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide-dependent deacetylase. J. Cell. Biol. 158:

401 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F045 Zellzykluskontrolle und Carcinogenese Zellzykluskontrolle und Carcinogenese (F045) Leiterin: PD Dr. rer. nat. Ingrid Hoffmann Doktoranden Ingo Hassepass (-5/03) Melanie Volkening Silke Warnke Alexander Mion Daniel Spengler Diplomanden Stefan Kemmler (6/02-2/03) Onur Cizmecioglu (10/03-) Technisches Personal Renate Öttl (3/02-11/03) Die Rolle von Cdc25 Phosphatasen im Zellzyklus I. Hoffmann, I Hassepass In Zusammenarbeit mit R. Voit, DKFZ Viele wichtige Übergänge im Zellzyklus werden durch Kontrollpunkte (checkpoints) reguliert. Hierzu gehören das Einleiten der DNA-Replikation am G1/S-Kontrollpunkt sowie der Übergang in die Mitose. Kontrollpunkte können durch das Auftreten von DNA-Schäden aktiviert werden. Diese Aktivierung führt nach Hemmung der Zellzyklus-Progression entweder zur Transkription von Genen, die an der DNA- Reparatur beteiligt sind oder, falls die DNA-Schäden irreparabel sind, zur Induktion der Apoptose. Die Phosphataseaktivität von Cdc25A ist essentiell für den Eintritt in die S-Phase und zwar durch die Dephosphorylierung der Kinasen Cdk2/CyclinE und auch Cdk2/CyclinA. Eine Hemmung der Cdc25A Funktion durch Mikroinjektion mit spezifischen Antikörpern gegen die Phosphatase in Zellen der G1-Phase verhindert den Übergang in die S-Phase. Des Weiteren führt eine Überexpression von Cdc25A in einem induzierbaren System zu einer verfrühten Aktivierung von CyclinE und CyclinA assoziiertem Cdk2. In unserer Arbeitsgruppe wurde die Beteiligung der Cdc25A-Phosphatase an der Kontrollpunktantwort nach UV-vermittelten DNA-Schäden untersucht [1]. Werden DNA-Schäden durch UV-Bestrahlung induziert, wird die Chk1 Kinase von der ATR-Kinase durch Phosphorylierung aktiviert. Nach erfolgter UV-Bestrahlung von Zellen wird Cdc25A rasch degradiert. Bedingt durch die Cdc25A- Degradation nahm die Phosphataseaktivität deutlich ab [2] welches zum Verlust der Cdk2/CyclinE-Aktivierung führt und damit den Zellzyklus in der G1-Phase arretiert. Durch die Methode der 2D-Phosphopeptidkartierung wurden die Serine an Positionen 75, 123 und 177 im Cdc25A Protein als Phosphorylierungsstellen der Chk1 Kinase identifiziert. In vivo wurde ebenfalls eine Phosphorylierung an Serin75 nachgewiesen. Die Substitution des Serin75 durch Alanin führte zu einer Stabilisierung nach UV-vermittelten DNA- Schäden, während das Wildtyp-Protein sowie die Serin123A bzw. Serin177A-Mutanten schnell degradiert wurden. Darüber hinaus konnte dargestellt werden, dass die kurze Halblebenszeit von Cdc25A eine Phosphorylierung an Serin75 erfordert. Die Cdc25A-S75A-Mutante bleibt in unbehandelten Zellen stabil, dagegen besitzen Cdc25A wt und die Cdc25A-S123A Mutante eine Halblebenszeit von ca. 25 Minuten. Die hohe Stabilität der Cdc25A-S75A Mutante im Vergleich zum Wildtyp hat nach UV-vermittelter DNA-Schädigung eine fortgesetzte Aktivierung des Cdk2/ CyclinE-Komplexes zur Folge. Unsere Arbeiten haben gezeigt, dass eine Phosphorylierung an Serin-75 ein Erkennungssignal für SCF darstellen könnte [1]. Interessanterweise spielt diese Phosphorylierung sowohl beim Abbau von Cdc25A in der Interphase des Zellzyklus als auch nach UV-induzierter DNA-Schädigung eine Rolle. Funktion humaner Polo-Kinasen im Centrosomenzyklus I. Hoffmann, S. Warnke, S. Kemmler, U. Hoffmann-Rohrer In Zusammenarbeit mit A. Fry, University of Leicester, England, UK und B. Lüscher, Universität Aachen Wichtige Vorgänge im Zellzyklus wie die Übergänge von der G1- in die S-Phase sowie von der G2- in die M-Phase werden durch die Familie der cyclinabhängigen Kinasen (Cdk) kontrolliert. Wie Forschungsarbeiten der letzten Jahre belegen, sind neben der bereits sehr gut charakterisierten Cdk Kinasefamilie auch die Polo-Kinasen (Plks) maßgeblich an der Zellzyklusregulation beteiligt. Benannt nach dem Polo-Gen von D. melanogaster wurde diese Familie von Proteinkinasen in vielen Eukaryonten untersucht. In humanen Zellen exisitieren vier verschiedene Vertreter: Plk 1-4. Plk1, die bislang am besten charakterisierte humane Polo-Kinase spielt eine Rolle bei der Aktivierung der Cdk, Ausbildung der Mitosespindel sowie bei der Degradation von Cyclin B am Ende der Mitose. Alle humanen Polo-Kinasen liegen bei verschiedenen Krebsarten u.a. bei Dickdarmkrebs in erhöhten Mengen vor. Die humane Plk2-Kinase wurde in unserer Arbeitsgruppe isoliert. Es handelt sich um ein 75 kda Protein, welches in verschiedenen Brust und Haut-Tumorzellinien überproduziert vorliegt. Immunpräzipitations-Experimente aus HeLa-Zellextrakten mit Hilfe spezifischer Plk2 Antikörper zeigen, dass Plk2-Kinaseaktivität in der Mitte der G1-Phase ihren Höhepunkt erreicht. In späteren Phasen des Zellzyklus hingegen wurde keine Kinaseaktivität mehr festgestellt. Mikroinjektionsexperimente unter Verwendung neutralisierender Plk2 Antikörper zeigen, dass die Aktivität wichtig ist für den Eintritt der Zelle in die S-Phase [3]. Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) Experimenten bestätigt. Die Lokalisation des Plk2 Wild-Typ-Proteins sowie der kinase-inaktiven Mutante Plk2-K111R erfolgt am Centrosom, wie nach transienten Transfektionsexperimenten in U2OS- und CHO-Zellen festgestellt wurde [3]. Auch in gereinigten Centrosomenpräparationen ist eine deutliche Anreicherung von Plk2 zu beobachten. Weitere Experimente zeigen, dass Plk2 an der Regulation der Verdopplung der Centrosomen am G1/S-Übergang beteiligt ist. Diese Resultate deuten darauf hin, dass Plk2 aufgrund seiner dualen Funktion bei der Koordinierung des Centrosomen- und Chromosomenzyklus eine Schlüsselrolle spielen könnte. Publikationen (* = externer Koauthor) [1] Hassepass, I., Voit, R., and Hoffmann, I. (2003). Phosphorylation at serine-75 is required for UV-mediated degradation of human Cdc25A phosphatase at the S-phase checkpoint. J Biol Chem. 278(32): [2] Hassepass, I. und Hoffmann, I. (2004) Assaying Cdc25 phosphatase activity. In: Checkpoint Controls and Cancer: Methods and Protocols, J. M. Walker ed. 281, [3] Warnke, S., Kemmler, S., *Hames, R.S., *Tsai, H.L., Hoffmann-Rohrer, U., Hoffmann, I. (2004). The polo-like kinase Plk2 is required for centriole duplication in mamalian cells. Curr. Biol. 14,

402 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F050 Zelldifferenzierung 402 Zelldifferenzierung (F050) Leiter: Prof. Dr. med.vet. Angel Alonso Gastwissenschaftler Dr. Ignacio G. Bravo (8/02-, Span. Kultusministerium) Dr. Kirsten Kabsch (- 6/02, DFG) Doktorandinnen Kerstin Leykauf (-12/03, DFG) Myriam Grüner (6/02-, DKFZ) Diplomand Adriano Lavecchia (6/02- ) Techniker Jürgen Fischer Michaela Hipp Das E5 Protein der menschlichen Papillomaviren. Struktur und Funktion A. Alonso, I.G. Bravo, K. Kabsch In Kooperation mit: Prof. Dr. J. Reed, DKFZ; Priv. Doz. Dr. J. Schenkel, Institut für Physiologie, Universität Heidelberg; Priv. Doz. Dr. M. Kaszkin, Institut für Pharmakologie, Universität Frankfurt; Prof. Dr. M. Dürst, Frauenklinik der Universität Jena. Betrachtet man die Genomstruktur der menschlichen Papillomaviren, so findet man eine Reihe von offenen Leserahmen zwischen den bekannten Genen E2 und L2. Über die Bedeutung dieser potentiellen Proteine ist wenig bekannt; unbekannt ist auch, ob solche Leserahmen überhaupt in vivo transkribiert werden. In den high-risk HPVs dieser Region ist nur ein offenes Leseraster enthalten, das für ein Protein mit ungefähr 80 Aminosäuren kodiert. Dieses Protein wurde E5 genannt. E5 von HPV16, 18 und 33 ist in der Lage, Zellen zu transformieren, nicht aber zu malignisieren. Darüber hinaus kooperiert E5 mit E7 und verstärkt damit die Transformationseigenschaften des E7 Proteins. E5 kann nicht als ein Onkogen betrachtet werden, kann aber die Eigenschaften der HPV-infizierten Zellen so verändern, dass es zu einer Instabilisierung dieser Zellen kommt. Diese Destabilisierung ist die Basis für die spätere Einwirkung der E6 und E7 Onkogene. HPV16-E5 ist ein stark hydrophobes Protein, 83 Aminosäuren lang und vorwiegend in Endosomen, Golgi und ER lokalisiert. Die hohe Hydrophobizität hat bis heute die Produktion von Antikörpern erschwert, so dass Experimente entweder mit Epitop-gebundenen E5 Proteinen oder mit in vitro synthetisierten Peptidfragmenten durchgeführt werden müssen. In einer ersten Reihe von Experimenten haben wir versucht, das HPV16 E5 Protein in ausreichender Menge für zirkuläre Dichroismus Analysen zu produzieren. Obwohl E5-transfizierte Zellen eine starke Synthese des E5 Proteins aufwiesen, war es nicht möglich, das Protein in Lösung zu bringen. Eine Alternative zur Synthese in eukaryotischen Zellen ist eine in vitro Synthese des Proteins als Peptidteil. Peptide, die eine der drei hydrophoben Domänen des Proteins enthalten, wurden synthetisiert und in TFA gelöst. Durch Zugabe von Wasser wurde die Hydrophobizität des Mediums verringert, um eine CD-Analyse der Peptide unter Membranähnlichen Bedingungen durchzuführen. Die Analysen ergaben, dass die erste und die dritte Domäne des Proteins in der Lage waren miteinander zu interagieren und dass diese Interaktion zu einer Stabilisierung der sekundären Struktur der Peptide führte. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die erste Domäne eine starke alpha-helix aufweist, was schlüssig ist mit der Idee, dass diese Domäne die wirkliche TM Region des Proteins enthält [1]. Zwei wichtige Funktionen des Proteins sind in den letzten Jahren identifiziert worden: i) Rolle von E5 bei der Ligandbedingten Apoptose. ii) Down-Regulation der MHC Klasse I Moleküle an der Plasmamembran. Unsere Experimente haben eine aktive Rolle des HPV16 E5 Proteins bei der Inhibition der Ligand-bedingten Apoptose in menschlichen Keratinozyten nachgewiesen. Zellen, die HPV16 E5 unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimieren, und Vektor-transfizierte Zellen wurden verwendet, um die Rolle von E5 bei der Apoptose zu untersuchen. Die Expression des viralen Proteins resultierte in einer starken Reduktion der TRAIL- und FasL-bedingten Apoptose in menschlichen Zellen. Interessanterweise beruhte diese Reduktion auf zwei verschiedenen Mechanismen. In TRAIL-behandelten Zellen verhinderte E5 die DISC- Formation und damit die Weiterleitung eines Apoptosesignals. In FasL-behandelten Zellen beruhte die Wirkung von E5 auf der verminderten Anzahl von Fas Rezeptoren an der Zelloberfläche. Interessanterweise wurde eine ähnliche Protektion gegenüber TRAIL Ligand auch in Mausfibroblasten beobachtet, die konstitutiv HPV16 E5 exprimieren. Es handelt sich also nicht um einen Zelltyp-spezifischen Ef- Abb. 1: Lokalisation des HPV2a Proteins in transfizierten Zellen. CHO Zellen wurden mit GFP-E5 (HPV16) DNA transfiziert und nach 48 Stunden mit Paraformaldehyd fixiert. Immunofluoreszenz wurde mit Antikörper gegen den cis-golgi Marker GM130 (a) oder den trans-golgi Marker 58K (b) durchgeführt. HPV16 E5 lokalisiert vorwiegend im trans-golgi (gelbe Farbe).

403 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs fekt und kann deshalb als Reaktionsmechanismus des Virus auf die Apotoseversuche der Zelle verstanden werden [2]. Eine wichtige Beobachtung war, dass die Expression von E5 die Zellen gegen Stressfaktoren sensibilisiert, möglicherweise durch eine Veränderung der Membranfluidität, die durch die Inkorporation des viralen Proteins in die Membran verursacht wird [3]. Ein weiterer Effekt des E5 Proteins ist eine Verringerung der Expression von MHC KlasseI Molekülen an der Membran. In Zellen, die transient mit HPV2a E5 transfiziert worden waren, konnten wir beweisen, dass der Gehalt an Membrangebundenen MHC Klasse I stark reduziert war. Interessanterweise war die Gesamtmenge an MHCs in E5-exprimierenden und Kontrolltransfektanten gleich, so dass wahrscheinlich ein defekter Transport des Komplexes an die Membran für den Effekt verantwortlich war [4]. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass E5 nicht in der Lage ist, Zellen zu transformieren oder malignisieren, sondern eher zu entstabilisieren. Diese Entstabilisierung wird zum einen durch die Verhinderung der Apoptose infizierter Zellen erreicht, zum anderen durch eine verringerte Membranexpression der MHC Moleküle und, dadurch bedingt, eine reduzierte immunologische Antwort auf die Präsenz des viralen Proteins. Transaktivierung der EGF Rezeptoren A. Alonso, I.G. Bravo, X. Mao, K. Leykauf, A. LaVecchia In Kooperation mit Prof. Dr. J. Kartenbeck, Prof. Dr. W.D. Lehmann, DKFZ. F050 Zelldifferenzierung Neben der Ligand-abhängigen Aktivierung der EGF-Rezeptoren wurde in den letzten Zeiten eine Ligand-unabhängige Aktivierung beschrieben. Diese Aktivierung erfolgt in menschlichen Keratinozyten durch externe Einflüsse und Stress- Bedingungen, wie UV-Licht, Zytokine oder Hyperosmolarität. Die Mechanismen, die dieser sogenannten Rezeptor trans-aktivierung zugrunde liegen, sind bis heute nicht geklärt. Ob diese trans-aktivierung durch indirekte Einwirkung von Wachstumsfaktoren zustande kommt, ist bis heute unbekannt. Sicher ist aber, dass auch Wachstumsfaktoren-unabhängige Aktivierungsprozesse in der Zelle häufig zu finden sind. In einer Reihe von Untersuchungen konnten wir beobachten, dass osmotischer Schock bei menschlichen Keratinozyten zu einer starken Aktivierung der EGF-Rezeptoren führt [5]. Die Analyse der Mechanismen dieser Aktivierung zeigte, dass die Tyrosinphosphorylierung durch eine Inaktivierung der EGFR-spezifischen Phosphatase erfolgt. Dadurch wird die Herunterregulation der Kinaseaktivität verhindert und die Aktivierung der down-stream Kinasekaskaden-Wege nicht abgeschaltet. Unsere Ergebnisse haben bewiesen, dass dieser Effekt durch Stresskinase p38 vermittelt wird. Gleichzeitig mit der Aktivierung der Stresskinase ist eine starke Desorganisation des Zytoskeletts zu beobachten. Diese Desorganisation ist parallel zu einer Inhibition der EGFRspezifischen Phosphatasen, die möglicherweise mit dem Aktin-Zytoskelett assoziiert sind. Dieser Effekt ist wahrscheinlich durch eine Stress-bedingte Aktivierung von Abb. 2: Ligand-freie Aktivierung der EGF Rezeptoren in menschlichen Keratinozyten. Menschliche Keratinozyten wurden mit 600 mm Sorbitol behandelt, nach 15 Minuten wurden die Signalkaskaden analysiert. Zentraler Punkt der Aktivierung ist die Stresskinase p38. Diese Kinase ist in der Lage, die proteolytische Spaltung der in der Plasmamembran eingebetteten HB-EGF zu induzieren. HB-EGF stimuliert dann die Tyrosinkinase Aktivität der EGF Rezeptoren. Ein alternativer Weg führt über eine Aktivierung von MAPKAP-K2 durch p38 und eine dadurch bedingte Abnahme der Aktin-gebundenen, EGFR-spezifischen Phosphatase Aktivität. Obwohl der erste Effekt von Sorbitol unbekannt ist, deuten experimentelle Ergebnisse darauf hin, dass dieser Effekt durch Veränderungen in der Phospholipidzusammensetzung der Membran vermittelt wird. 403

404 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F050 Zelldifferenzierung MAPKAP-K2 und Hsp27 vermittelt und die Behandlung der Zellen mit Stresskinase p38 Inhibitoren führt zu einer Inhibition der EGFR Aktivierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Stresskinase p38 wahrscheinlich oberhalb des Rezeptors liegt. Der unmittelbare Effekt einer solchen Aktivierung ist ein Einschalten einer Reihe von Signalkanälen, die zu einer Proliferation der Keratinozyten führt. Ein wichtiger Punkt bei der Analyse solcher Kinasekaskaden ist die Identifizierung der ersten Signale und die Antwort auf die Frage, ob die verschiedenen Signale ein gleiches Phosphorylierungsmuster hervorrufen. Um diese Frage zu beantworten, wurden eine Reihe von Experimenten durchgeführt mit dem Ziel, die Analytik des Systems zu verfeinern. EGF Rezeptoren in aktiviertem Zustand wurden isoliert und eine Methode wurde entwickelt, um die Phosphorylierungsmuster des Rezeptors zu analysieren. Die Methode, die auf einer Analyse von Peptidfragmenten im MALDI-TOF Verfahren beruht, wurde mittels Ligand-spezifischer Aktivierung der EGFR getestet und für die weiteren Analysen verwendet [4]. Unsere Experimente ergaben, dass Stress in Keratinozyten zu einer verstärkten Synthese von Arachidonsäure (AA) führte (Abb. 2). Diese Zunahme wird durch eine Aktivierung der Phospholipase A2, die schnell nach Stress-Behandlung phosphoryliert wird, ermittelt. Diese Phosphorylierung ist abhängig von der Aktivierung der MAP Kinasen erk1/2, aber nicht der Stresskinase p38. Ein Gesamtbild kann dadurch entwickelt werden, dass osmotischer Stress bei Keratinozyten zu einer verstärkten Aktivierung von p38 führt. Diese Aktivierung mündet in einer Phosphorylierung des EGF-Rezeptors, die die entsprechende Signalkette (ras-raferk1/2) einschaltet. Endergebnis ist eine Phosphorylierung der PLA2 und die Abgabe von AA in das Kulturmedium [4]. 404 Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kabsch, K., and Alonso, A The human papillomavirus type 16 E5 protein impairs TRAIL- and FasL-mediated apoptosis in human keratinocytes by different mechanisms. J. Virol. 76, [2] Kabsch, K., and Alonso, A The human papilomavirus type 16 (HPV16) E5 protein sensitizes human keratinocytes for apoptosis. Oncogene 21, [3] Cartin, W., and Alonso, A The human papillomavirus type 2a (HPV2a) E5 protein localizes to the Golgi apparatus and modulates signal transduction. Virology 314, [4] Alonso, A., and Reed, J Modelling of the Human Papillomavirus Type 16 E5 Protein. Biochim. Biophys. Acta, 1601, [5] Cheng, H., Kartenbeck, J., Kabsch, K., X. Mao, M. Marques, and Alonso, A Stress kinase p38 mediates EGFR transactivation by hyperosmolar concentrations of sorbitol. J. Cell. Physiol. 192, [6] Rodriguez, I., *Kazskin, M., Marqués, M. M., Kabsch, K., Mao, X., and Alonso, A Hyperosmotic stress induces activation of cytosolic phospholipase A2 in HaCaT cells by an epidermal growth factor receptor-mediated process. Cell. Signal.14, [7] Salek, M., Alonso, A., Pipkorn, R., and Lehman, W. D Analysis of protein tyrosine phosphorylation by nanoelectrospray ionization high-resolution tandem mass spectrometry and tyrosine-targeted product ion scanning. Anal. Chem. 75,

405 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F060 Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (F060) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Claus H. Schröder ( - 1/04) Wissenschaftler/Wissenschaftlerinnen Dr. Farideh Fathinejad (- 7/03) Dr. Holger Friesel (-1/04) Dr. Hans Jörg Hacker (-1/04) Dr. Thomas Schutz Prof. Dr. Elisabeth Schwarz Diplomanden/Diplomandinnen Mieun Lee (10/01-7/02) Franziska Lehmann (5/01-2/02) Christina Mensger (4/02-12/02) Ole Pless (8/01-4/02) Technische Assistentinnen Claudia Lohrey Maria Mildenberger Anja Reimann Gastwissenschaftler/Gatswissenschaftlerinnen Dr. Zhizheng Fang, China (3-09/02) Romina Montani, Buenos Aires, Argentinien (11-12/02, 9-10/03) Sekretariat Angela Cozzolino Cascone (- 7/02) Marie Leroy-Schell Angelika Schmidt-Zitouni (7/02 -) Die Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen bearbeitet das Gebiet der Virus-induzierten Karzinogenese am Beispiel der humanen Papillomviren (HPV; Kopf- und Halstumoren, Zervixkarzinom) und am Beispiel des Hepatitis- B-Virus (HBV; Leberkarzinom). Schwerpunkte sind (1) die Expression viraler Onkoproteine und ihrer Wechselwirkung mit Proteinen der Zelle, (2) die Integration viraler DNA in das Wirtszellgenom und die daraus resultierende Möglichkeit der Insertionsmutagenese krebsrelevanter zellulärer Regulatorgene sowie (3) die Entwicklung neuer Infektions- und Progressionsmarker und antiviraler Therapien. Näher studiert wird das zelluläre Gen APM-1, das als Ziel chromosomaler Integration von HPV-DNA identifiziert worden war und anscheinend für einen neuen Tumorsuppressor kodiert. Arbeiten im Bereich der Diagnose gelten dem Nachweis von HPV-DNA im Tumorgewebe und von HBV-Nukleinsäuren im Serum chronisch infizierter Patienten. Im Falle von HBV ist es dabei das Fernziel, Formen der Infektion zu beschreiben, die ein besonderes Risiko zur Ausbildung von Leberkrebs vermitteln. Zur Prävention der Krebsentstehung werden Ansätze für die gezielte Hemmung der HBV-Replikation mit Hilfe nicht nukleosidischer Inhibitoren entwickelt. Chronische Hepatitis-B-Virus-Infektion C.H. Schröder, R. Breitkreutz, Z. Fang, H. Friesel, H.J. Hacker, M. Lee, M. Mildenberger, A. Reimann, W. Zhang Kooperation mit: Dr. rer. nat. C. T. Bock, Institut für Pathologie, Molekulare Pathologie, Molekulare Viruspathogenese, Tübingen; Dr. K. Deres, Bayer AG, Virologie, Wuppertal; Dr. S.V. Chiplunkar, Advanced Centre for Treatment, Research and Education in Cancer, Immunology Division, Navi Mumbai, Indien; Prof. Dr. Q. Su, Department of Pathology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi an, Volksrepublik China; Dr. med. M. Tokus, Medizinische Klinik, Innere Medizin II, Gastroenterologie, Hepatologie und Infektionskrankheiten, Mannheim. Gegenstand der Untersuchungen zur chronischen Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV), die, wenn unbehandelt, mit einem hohen Risiko der Lebertumorentwicklung verbunden ist [1], waren neue diagnostische Marker oder Markerkombinationen und die Erarbeitung von Grundlagen für neue Formen von Anti-HBV-Therapien. Ein Schwerpunkt der Untersuchungen war differentiell polyadenylierte HBV- RNA (Volllänge und verkürzt) im Serum. Als Progressionsmarker hat sie das Potential, die HBV Diagnose zu erweitern und dadurch Stadien der chronischen Infektion besser zu charakterisieren. Es wird davon ausgegangen, dass eine verfeinerte Diagnose die Auswahl von Therapiestrategien und das Verfolgen des Therapieverlaufs bedeutend erleichtern [2]. Neue Angriffspunkte für die gezielte Anti- HBV-Therapie wurden entwickelt und Wirkmechanismen beschrieben. Zirkulierende HBV-Nucleinsäuren Im Blut zirkulierende HBV-RNA wurde als ein neuer Marker für die HBV-Serologie vorgeschlagen [3, 4]. Volllänge-Transkripte korrelierten mit den Markern der replikativen Infektion HBeAg and HBV-DNA. Sie waren außerdem mit erhöhten Spiegeln der Serum-Alanin-Aminotransferase assoziiert. Dagegen wurden verkürzte Transkripte sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit von HBeAg and HBV DNA nachgewiesen und es gab keine Korrelation mit den Serum-Transaminase-Spiegeln. Interessanterweise wurde mit zunehmendem Alter bzw. Dauer der chronischen HBV-Infektion ein Abfall der Volllängen-RNA beobachtet, während die Spiegel der verkürzten Form auf Anfangsniveau persistierten. Auftreten spezieller Muster zirkulierender HBV- Nucleinsäuren bei Behandlung mit dem Nucleosidanalog Lamivudine Im Vordergrund stand die Frage, ob Lamivudin neben dem in vielen Laboratorien beobachteteten raschen Abfall der HBV-DNA-Spiegel im Serum zusätzlich auch zu einem Auftreten arretierter Replikationsintermediate führt. Dazu wurden aus dem Serum zweier mit HBV chronisch infizierter und mit Lamivudin behandelter Patienten die Nucleinsäuren isoliert. Es wurden drei Sequenzbereiche des HBV-Genoms, die während der Replikation aufeinanderfolgend gebildet werden, mittels PCR-Analysen quantitativ erfasst: X, C, and X-preC. Zusätzlich wurde virale RNA auf Polyadenylierung geprüft. Bei Behandlungsbeginn wurden für alle drei Sequenzbereiche, wie erwartet, identische Kopiezahlen ermittelt. Mit Dauer der Lamivudin-Behandlung kam es zu einem Abfall der Kopiezahlen, der für spät synthetisierte Sequenzen (C 405

406 406 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs und X-preC) weit stärker war als für früh synthetisierte (X). Die Kopiezahl polyadenylierter viraler RNA wurde durch die Lamivudinbehandlung nur gerinfügig beeinflusst. Folgende Schlüsse lassen sich ziehen: 1. Die tatsächlichen Viruspartikel-Zahlen während der Lamivudintherapie werden akurat nur über die Bestimmung früh sythetisierter Sequenzbereiche erfasst. 2. Lamivudin bewirkt eine Akkumulation von partikel-assoziierten HBV-DNA-RNA Hybridmolekülen (arretierte Replikationsintermediate). 3. In Partikeln verpackte HBV-RNA ist nicht polyadenyliert [5]. Das Hepatitis-B-Virus Core-Protein, ein neuer Ansatzpunkt für die gezielte antivirale Therapie Gegenwärtig sind für die Therapie der HBV-Infektion nur Interferone und nukleosidische Inhibitoren der HBV-Polymerase zugelassen. Der Wert dieser Therapien wird eingeschränkt durch die unerwünschten Nebenwirkungen der Interferone und der Entwicklung von HBV-Polymerasemutanten. In Zusammenarbeit mit der Bayer AG wurden nichtnukleosidische Inhibitoren der Nucleocapsid-Reifung beschrieben, die in-vitro anti-virale Aktivität zeigten. Die zur Klasse der Heteroarylpyrimidine (HAP) zählenden Inhibitoren besitzen offenbar einen hochspezifischen antiviralen Wirkmechanismus: Interaktion mit dem HBV-Core-Protein, die damit verbundene Blockade der Kapsidbildung und die damit verbundene deutliche Reduktion der Stabilität des Core- Proteins [6, 7]. Publikationen (*= externer Koautor) [1] Bannasch, P. and Schröder, C.: Pathogenesis of primary liver tumours. In: Pathology of the Liver,R. N. M. Max Sween, P. P. Anthony, P. J. Scheuer, T.A.D. Burt, B. C. Portman (eds.), Churchill Livingstone, New York, Edinburgh, London, Melbourne 2002, pp [2] Schröder, C.H.: Studying the progression of chronic infection with the hepatitis B virus has a bearing on diagnosis and therapy: a more personal look at research that benefitted from the communication with collegues in China. JFMMU 24, (2003) [3] *Reinhold, U., Schröder, C.H. Diagnostische Bedeutung frei zirkulierender Nukleinsäuren. Deutsches Ärzteblatt 99, A (2002) [4] Zhang, W., Hacker, H.J., Mildenberger, M., Su, Q., Schröder, C.H.: Detection of HBV RNA in Serum of Patients. In Methods in Molecular Medicine, 95: Hepatitis B and D Protocols, 1, eds Hamatake, R.K., Lau, Y.N. Humana Press Inc., Totowa, NJ 2004, pp (2004) [5] Zhang, W., Hacker, H.J.,* Tokus, M., *Bock, T., Schröder, C.H.: Patterns of circulating hepatitis B virus serum nucleic acids during lamivudine therapy.journal of Medical Virology 71, (2003) [6] *Deres, K., Schröder, C.H., *Paessens, A., *Goldmann, S., Hacker, H.J., et al., 2003 Inhibition of Hepatitis B Virus replication by drug-induced depletion of nucleocapsids. Science 299, (2003) [7] Hacker, H.J., *Deres, K., Mildenberger, M., Schröder, C.H.: Antivirals interacting with hepatitis B virus core protein and core mutations may misdirect capsid assembly in a similar fashion. Biochemical Pharmacology 66, (2003) Abteilung F060 Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen Molekulare Aspekte der Papillomvirus-assoziierten Tumorentstehung: Integration der viralen DNA und Veränderungen zellulärer Gene E. Schwarz, C. Lohrey, O. Pless, F. Lehmann, C. Mensger, F. Fathinejad In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Kumiko Eiguchi, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentinien; Prof. Dr. Matthias Dürst, Gynäkologische Molekularbiologie, Frauenklinik der Universität Jena; Dr. Markus Hoffmann, HNO-Uniklinik, Kiel; Dr. Franz X. Bosch, HNO-Uniklinik, Heidelberg; Dr. Irmgard Schwarte- Waldhoff, Medizinische Klinik, Ruhr-Universität, Bochum. Zusatzfinanzierung: HGF-Strategiefonds Viral regulatory factors, WTZ-Projekt mit Argentinien Die Krebsentstehung ist ein in mehreren Stufen ablaufender komplexer Prozess, der durch genomische Instabilität sowie durch Mutationen von Proto-Onkogenen und Tumorsuppressorgenen verursacht wird. Bei einigen Tumorarten, insbesondere beim Zervixkarzinom (Gebärmutterhalskrebs), spielen Infektionen mit humanpathogenen Papillomviren (HPV) wie HPV16 und HPV18 und die dadurch bedingte Expression der viralen Onkogene E6 und E7 eine entscheidende Rolle. Ein wichtiger Schritt in der Kanzerogenese ist die Integration der Papillomvirus-DNA in das Genom der Wirtszelle. Unseren Arbeiten liegt die Hypothese zugrunde, dass die Integration der Papillomvirus-DNA bei einigen Karzinomen nicht nur die deregulierte Überexpression der viralen Onkogene, sondern auch eine Mutation essentieller zellulärer Regulatorgene bewirkt (Insertionsmutagenese). Dabei sollte es sich vorrangig um Tumorsuppressorgene handeln, die durch die Integration inaktiviert werden. Unsere Arbeiten sind darauf ausgerichtet, durch HPV-Integration veränderte zelluläre Gene zu identifizieren und ihre Funktionen in normalen Zellen sowie ihre Rolle in der Tumorentstehung zu entschlüsseln. HPV-Integration und APM-1-Gen. Die Integration der Papillomvirus-DNA erfolgt in unterschiedliche Genomregionen; deshalb ist der Integrationsort für jeden Tumor ein hoch spezifisches Merkmal. Die viralen Onkogene E6 und E7 werden über viral-zelluläre Hybridtranskripte exprimiert, deren 3 -zelluläre Sequenzen vom jeweiligen Integrationsort abstammen und für dessen Identifizierung benutzt werden können. Die Vermutung einer Mutagenese zellulärer Tumorsuppressorgene durch Integration von Papillomvirus-DNA haben wir zunächst am Beispiel der Zervixkarzinom-Zelllinie ME180 untersucht. Grund für die Auswahl dieser Linie war der Befund, dass in ME180-Zellen das durch integrierte Papillomvirus-DNA mutierte Chromosom in zweifacher Kopie vorliegt, während das normale Chromosom verloren gegangen ist. In ME180-Zellen haben wir in der HPV-Integrationsregion und als Teil der viral-zellulären Fusionstranskripte das vorher unbekannte Gen APM-1 entdeckt, das für ein BTB-Zinkfingerprotein mit wachtumsinhibierenden Eigenschaften kodiert [1]. Die Bezeichnung APM leitet sich ab von Affected by Papillomavirus DNA integration in ME180 cells. Das Gen liegt auf Chromosom 18 in der Region q21. Genexpressionsanalysen haben gezeigt, dass das APM-1- Gen in normalen Geweben exprimiert wird, dass aber bei ungefähr einem Drittel der untersuchten Karzinom-Zelllinien unterschiedlicher Herkunft (Gebärmutterhals, Darm, Lunge, Blase, Pankreas) und bei einem Teil der primären Zervixkarzinome keine oder nur eine sehr schwache APM-1-Expression nachweisbar ist. Die Transkription des APM-1-Gens wird von mindestens drei, sehr weit voneinander entfernt liegen-

407 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs den Promotoren reguliert. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Expression des APM-1-Gens einer sehr komplexen Regulation zu unterliegen scheint, die in Tumoren gestört sein kann. Dabei spielt die CpG-Hypermethylierung in den Promotorregionen eine wichtige Rolle zu spielen [2; Manuskript in Vorbereitung]. Über die Zinkfingerregion bindet das APM- 1-Protein an spezifische DNA-Sequenzen und wird in den Kern transportiert [3, 4], während es über die aminoterminale BTB-Domäne homomere Proteinkomplexe bilden kann [4]. Mit Zwei-Hybrid-Analysen versuchen wir derzeit, andere Proteininteraktionspartner zu identifieren. Damit wollen wir einen Zugang zu den noch unbekannten Funktionen des APM-1-Proteins erhalten. Da das Gen in Mäusen hochkonserviert vorliegt, kann weiterhin über die Herstellung von APM-1-knock-out-Mäusen eine funktionelle Gencharakterisierung vorgenommen werden. Analysen der durch integrierte Papillomvirus-DNA veränderten Genombereiche werden auch für andere Zelllinien und Primärtumoren durchgeführt. Als Seitenaspekt ergab sich dabei, dass der PCR-Nachweis von HPV-Integraten als hochspezifischer Test für den Ursprung von Zelllinien eingesetzt werden kann [5, 6]. HPV16 in Kopf-Hals-Karzinomen. HPV-Infektionen spielen auch bei der Entstehung von Kopf- Hals-Tumoren, besonders im Oropharynx-Bereich, eine Rolle. In solchen Tumoren liegt hauptsächlich HPV16 vor. Interessanterweise konnte bei einigen der HPV16-DNA-positiven Tumoren keine Expression der Onkogene E6 und E7 festgestellt werden [7]. In diesen Tumoren lagen meist Mutationen im p53-gen vor. Ähnlich wie bei Zervixkarzinomen enthalten Kopf-Hals-Karzinome die HPV-DNA häufig integriert ins Wirtszellgenom [7]. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, auch in dieser Tumorgruppe nach Fällen mit Insertionsmutagenese zellulärer Gene zu suchen und neu entdeckte Gene in ihrer Struktur, Expression, Funktion und Krebsrelevanz zu charakterisieren. Von HPV16 existieren verschiedene Genotypvarianten mit verändertem E6-Onkogen, die im Zusammenspiel mit genetischen Faktoren der infizierten Personen ein unterschiedliches Krebsrisiko bedingen. Sequenzanalysen der HPV16 E6- und E7-Gene in einer Gruppe von Kopf- Hals-Tumoren zeigten, dass zwei HPV16-Varianten besonders häufig auftraten [8]. Abteilung F060 Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen Publikationen (*= externer Koautor): [1] Reuter, S., Bartelmann, M., Vogt, M., Geisen, C., Napierski, I., Kahn, T., Delius, H., Lichter, P., Weitz, S., Korn, B., and Schwarz, E. (1998) APM-1, a novel human gene, identified by aberrant cotranscription with papillomavirus oncogenes in a cervical carcinoma cell line, encodes a BTB/POZ-zinc finger protein with growth inhibitory activity. EMBO J., 17, [2] Lehmann, F. Methylierungsstatus der Promotorregionen p2 und a31 des krebsassoziierten humanen APM-1-Gens. Diplomarbeit, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg (2002). [3] Pless, Ole. Intrazelluläre Lokalisierung des APM-1-Proteins. Diplomarbeit, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg (2002). [4] Mensger, C. Intrazelluläre Lokalisation und homomere Protein-Interaktionen des Zinkfingerproteins APM-1. Diplomarbeit, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg (2002). [5] *Seufferlein, T., *Seckl, M.J., Schwarz, E., *Beil, M., *von Wichert, G., *Baust, H., *Lührs, H., *Schmid, R.M., and *Adler, G. (2002) Mechanisms of nordihydroguaiaretic acid-induced growth inhibition and apoptosis in human cancer cells. British J. Cancer, 86, [6]*Baldus SE, Schwarz E, *Schmidt D, *Baar A, *Landsberg S, *Hahn SA, *Dienes HP, *Schmiegel WH, *Schwarte-Waldhoff I. Smad4 deficiency in primary cervical squamous cell carcinomas and in cervical cancer cell lines including HeLa. Submitted. [7] *Wiest, T., Schwarz, E., *Enders, C., *Flechtenmacher, C., and *Bosch, F.X. (2002) Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed prb cell cycle control. Oncogene, 21, [8] *Hoffmann M, Lohrey, C, Kahn T, Schwarz E (2004) Human papillomavirus type 16 E6 and E7 genotypes in head-and-neck carcinomas. Oral Oncology, 40,

408 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F065 Molekulare Therapie virusassoziierter Tumore Molekulare Therapie virusassoziierter Tumore (F065) Leiter: Prof. Dr. Felix Hoppe-Seyler (Tel , hoppe-seyler@dkfz.de) 408 Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Karin Butz Dr. Irena Crnkovic-Mertens Dr. Claudia Denk (- 2/03) Dr. Tutik Ristriani-Fournel (3/02-) Dr. Markus Vogt (3/03 -) Doktoranden Britta Klevenz (- 3/02) Christina Mensger (5/02-) Evangelia Tomai Diplomand Christian Rausch (- 7/02) Technische Assistentin Julia Semzow Angela Ullmann Übergeordnetes Ziel unserer Arbeiten ist es, molekulare Grundlagen der Krebsentstehung aufzuklären und die gewonnen Erkenntnisse in innovative Therapiestrategien umzusetzen. Hier liegt ein besonderes Gewicht auf der Entwicklung neuer molekularer Inhibitoren mit therapeutischem Potential. Die inhaltlichen Schwerpunkte der Arbeiten umfassen: 1) die Entwicklung neuartiger peptidischer Wirkstoffe und Nukleinsäuren zur gezielten intrazellulären Hemmung viraler und zellulärer Pathogenitätsfaktoren: Peptid-Aptamere und sirna. 2) Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch virale und zelluläre Faktoren mit dem Ziel der Modulation der Apoptose-Resistenz von Tumorzellen 3) Analyse der Interaktion viraler und zellulärer Onkoproteine mit Tumorsuppressorproteinen (z. B. p53, prb) I. Hemmung des HPV E6-Onkogens durch Peptid- Aptamere und sirna: Apoptotische Elimination von Zervixkarzinomzellen F. Hoppe-Seyler In Zusammenarbeit mit Dr. Pierre Colas, Aptanomics, Lyon, Frankreich; Prof. Bernd Groner, Georg-Speyer-Haus, Frankfurt; Prof. Martin Scheffner, Institut für Biochemie, Universität Köln; PD Dr. Holger Sültmann, DKFZ; Prof. Fritz von Weizsäcker, Medizinische Universitätsklinik, Freiburg; Prof. Hanswalter Zentgraf, DKFZ. Zusatzfinanzierung: Die Untersuchungen wurden durch die Deutsche Krebshilfe und die Wilhelm-Sander-Stiftung unterstützt. Humane Papillomviren (HPVs) sind beim Menschen kausal an der Entstehung von Karzinomen beteiligt. Von besonderer Bedeutung ist ihre Rolle als Verursacher des Gebärmutterhalskrebses (Zervixkarzinom). Die onkogene Wirkung von HPVs beruht dabei auf den Aktivitäten der viralen E6- und E7-Proteine, die in den HPV-positiven Zervixkarzinomen regelmäßig exprimiert werden. Ein Hauptziel der Arbeitsgruppe ist es, die molekularen Mechanismen der Krebsentstehung durch HPVs zu verstehen und damit eine Basis für innovative Therapieansätze zu schaffen. Peptid-Aptamere stellen eine neue Klasse von Molekülen für die intrazelluläre Hemmung von Zielproteinen dar [1-3, 6-8]. Die Hemmung von E6 mittels Peptid-Aptameren induzierte den apoptotischen Zelltod HPV-positiver Tumorzellen [Butz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: , 2000]. Dies weist darauf hin, daß E6 anti-apoptotisch wirkt und seine molekulare Hemmung eine vielversprechende neue Strategie zur Behandlung HPV-positiver Dysplasien und Karzinome darstellt [9]. In der Tat konnte mit der kürzlich entwickelten sirna-technologie (RNA-Interferenz) gezeigt werden, daß ein selektiver Angriff auf das E6-Onkogen spezifisch HPV-positive Tumorzellen abtötete [4]. Gegenwärtige Arbeiten der Gruppe konzentrieren sich darauf, die molekularen Grundlagen der Apoptose-Induktion aufzuklären sowie das therapeutische Potential von peptidischen Hemmstoffen und sirnas gegen HPV E6 in eine Anwendungsperspektive weiterzuentwickeln. II. Hemmung der Kapsidbildung des Hepatitis B Virus durch Peptid-Aptamere: Blockade der viralen Replikation Chronische Infektionen mit dem Hepatitis B Virus (HBV) stellen weltweit eine große medizinische Herausforderung dar und sind mit ernsten klinischen Folgen assoziiert (Leberversagen, Leberzirrhose, Leberkrebs). Es gelang in Vorarbeiten Peptid-Aptamere zu generieren, die über die Interferenz mit der HBV Kapsidbildung die Replikation des Virus blockierten [Butz et al., Oncogene 20: , 2001]. In weiterführenden Arbeiten wurden nun Peptid-Aptamere generiert, die mit der Kapsid-Bildung des Duck Hepatitis B Virus (DHBV) interferieren und dessen Replikation hemmen. Das dem HBV eng verwandte DHBV wird experimentell als in vivo System zur Evaluierung viraler Hemmstoffe eingesetzt und soll zur Analyse des therapeutischen Potential der Aptamere benutzt werden.

409 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs F065 Molekulare Therapie virusassoziierter Tumore III. Hemmung des zellulären Apoptose-Inhibitors Livin/ML-IAP durch sirna und Peptide: Sensibilisierung von Tumorzellen gegenüber proapoptischen Agentien (z. B. Chemotherapeutika) Das anti-apoptotische Livin-Protein (alternativ auch als ML- IAP bzw. KIAP bezeichnet) gehört zur Familie der Inhibitor of Apoptosis (IAP) -Proteine. Livin wird in bestimmten Tumorformen (z. B. malignes Melanom) exprimiert, nicht aber in den meisten Normalgeweben. Daher könnte Livin ein Tumorzell-spezifisches therapeutisches Ziel darstellen. In der Tat konnte mittels der sirna-technologie gezeigt werden, daß eine Hemmung von Livin zu einer Resensibilisierung von Livin-exprimierenden Tumorzellen gegenüber pro-apoptotischen Stimuli (z. B. Chemotherapeutika) führte [5]. Derzeitige Studien zielen darauf ab, die anti-apoptotische Livin- Funktion biochemisch aufzuklären und das therapeutische Potential Livin-inhibierender Moleküle fortzuentwickeln. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Klevenz, B., K. Butz and F. Hoppe-Seyler Peptide aptamers: exchange of the thioredoxin-a scaffold by alternative platform proteins and its influence on target protein binding. Cell. Mol. Life Sci. 59: [2] Rausch, C Generation and characterization of peptide aptamers against the inhibitor of apoptosis protein livin. Diplomarbeit, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg [3] Klevenz, B Struktur-/Funktionsanalyse des Papillomavirus E6-Proteins mittel Peptid-Aptameren - Ein Modellsystem für tierpathogene Papillomviren. Dissertation, Fachbereich Veterinärmedizin, Universität Giessen [4] Butz, K., T. Ristriani, A. Hengstermann*, C. Denk, M. Scheffner* and F. Hoppe-Seyler sirna-targeting of the Viral E6 Oncogene Efficiently Kills Human Papillomavirus-Positive Cancer Cells. Oncogene 22: [5] Crnkovic-Mertens, I., F. Hoppe-Seyler, and K. Butz Induction of apoptosis in tumor cells by sirna-mediated silencing of the Livin/ML-IAP/KIAP gene.oncogene 22: [6] Bürger*, C, K. Nagel-Wolfrum*, C. Kunz*, I. Wittig*, K. Butz, F. Hoppe-Seyler and B. Groner* Sequence-specific peptide aptamers, which interact with the intracellular domain of the epidermal growth factor receptor, interfer with Stat3 activation and inhibit the growth of tumor cells. J. Biol. Chem. 278: [7] Hoppe-Seyler, F. und K. Butz Peptide aptamers: specific inhibitors of protein function.current Molecular Medicine, im Druck. [8] Hoppe-Seyler, F. Novel therapeutic perspectives: the targeted inhibition of genes and proteins Current Molecular Medicine, im Druck [9] Europäisches Patent , U.S.-Patent (2003) Peptide zur Inhibierung von HPV E6-Proteinen 409

410 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Abteilung F070 Tumorvirus-Charakterisierung Abteilung Tumorvirus-Charakterisierung (F070) Leiterin: Prof. Dr. Ethel-Michele de Villiers 410 Wissenschaftliche Assistenten Dr Hajo Delius (-5/02) Dr Fritz Klimek (-7/02) Dr Walee Chamulitrat (-1/03) Dr Jianwei Fei (1/02-) Dr Harald Hohmann (7/02-) Dr Markus Kellner (3/03-) Dr Angel Cid-Arregui (5/03-) Rainer Schmidt (5/03-) Gastwissenschaftler Dr Kiyofumi Egawa (Kumamoto Japan 8/02-10/02) Zahir Abbas Hilmi (Khartoum Sudan 4/03-10/03) Doktoranden Angelika Michel Ilija Jelcic Quan-Chiang Wei (-12/02) Warangkana Chunglok (-1/03) Martin Dietrich Technische Assistenten Bianca Berdel (1/03-) Romana Cop Imke Grewe Karin Gunst Birgit Hub (5/03-) Kerstin Müller (5/03-) Christine Nitsch (4/03-) Helene Rahn Elsbeth Schneider Sabine Serick (7/02-) Claudia Siegmann (4/03-) Sonja Stephan Corinna Whitley Die Abteilung Tumorvirus-Charakterisierung analysiert die Rolle von Viren in der Krebsentstehung. Hauptziele sind - die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Papillomviren und TT-Viren - die Verbreitung von Papillomviren bei Plattenepithelkarzinomen und Basaliomen der Haut - die funktionelle Analyse von kutanen Papillomviren und deren Wechselwirkung mit menschlichen Zellen, und - die Rolle von neuen TT-Viren in der Pathogenese von Krebs. Kooperationen: Dr Nancy Kiviat, University of Wahington, Seattle, USA; Drs Ola Forslund und Joakim Dillner, Malmö, Schweden; Dr Ruta Mulherkar, Mumbai, Indien; Dr Charles Buck, Seattle, USA; Prof. Dr. M. Löhr, Universitätsklinik Mannheim; PD Dr H. Scherübl, Universität Berlin, zahlreiche Universitätskliniken des In- und Auslands, wie auch regionale Krankenhäuser. Identifizierung und Charakterisierung von - neuen Papillomvirus Typen: Wir konnten während der Berichtsperiode 90 neue Papillomvirus Typen identifizieren, die sowohl aus Biopsien der Haut, wie auch aus der Speiseröhre stammten. Die Gesamtgenome von 4 neuen Papillomvirus Typen wurden kloniert und charakterisiert (Manuskript in Vorbereitung). Ein neues Klassifikationssystem für die Familie der Papillomviren (Papillomaviridae) wurde erarbeitet und von der ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) akzeptiert (Manuskript im Druck). Als Referenzzentrum für Papillomviren haben wir 7 neue Papillomvirus Typen, die in anderen Laboratorien kloniert wurden, komplett sequenziert und als neuen Papillomvirus Typen bestätigt. Weiterhin wurde klonierte Papillomvirus DNA in zahlreiche Laboratorien weltweit verschickt. - neue TT-Viren: Wir konnten ein großes Spektrum neuer TT-Viren sowohl in Tumoren der Bauchspeicheldrüse und des Dickdarms, wie auch in embryonalen Tumoren bei Kindern identifizieren. Aus der Milz eines Hodgkin Patienten wurden Gesamtgenome von 24 unterschiedlichen TT-Viren isoliert und charakterisiert. Ein neues Klassifikationssystem für die Familie der TT-Viren (Anelloviridae) wurde erarbeitet (Manuskript im Druck). Verbreitung von Papillomviren bei Plattenepithelkarzinomen und Basaliomen der Haut: Zwei epidemiologische Studien zur Aufklärung der Prävalenz bestimmter HPV-Typen bei Plattenepithelkarzinomen und Basaliomen der Haut wurden weitergeführt. Biopsien stammen zum einen aus den Vereinigten Staaten und zum anderen aus dem europäischen Umfeld. Degenerierte und Consensus Primer wurden in der Amplifikation von DNA über die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Entstehende Produkte wurden kloniert und sequenziert. Vorläufige Ergebnisse liegen bereits vor. Funktionelle Analysen von kutanen Papillomvirus Infektionen: Arbeiten zur Aufklärung des Mechanismus der Wechselwirkung zwischen UV-Bestrahlung, häufig vorkommenden p53 Mutationen und HPV-Genomen in der Entstehung maligner Hauttumoren werden fortgesetzt. Eine Wechselwirkung zwischen Proteinen der p53 Familie, Np63α und TAp63α mit Proteinen des AP-1 Komplexes für die Aktivierung des Papillomvirus-Promotors wurde aufgezeigt. Diese Promotoraktivität wird durch ein bestimmtes mutiertes p53 Protein vollständig unterdrückt (Manuskript eingereicht). Rolle von neuen TT-Viren bei der Pathogenese von Krebs: Die Gesamt-Genome 24 neuer TTV-Genotypen aus der Milz eines Hodgkin Patienten wurden sequenziert und charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass eine Gruppe von 8 Genotypen sich in einem Abschnitt von ca 250 Basenpaaren bis zu 30% in der Aminosäure Sequenz unterscheidet, obwohl die restlichen Genomsequenzen nur um 2% voneinander variieren. Diese hypervariable Region könnte von großer

411 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Bedeutung für die Persistenz und für das Entkommen von der Immunabwehr für diese Viren sein. Die Sequenzen einer zweiten Gruppe von 6 Isolaten waren in der genannten Region identisch miteinander, unterschieden sich aber darin, dass Punktmutationen im ORF1 zur Entstehung von neuen offenen Leserastern führen, die wiederum in der Entstehung von unterschiedlichen Proteinen resultieren sollten. Die Funktionen dieser neu-entstandenen Proteine werden weiter untersucht (Manuskript im Druck). Kombinations-Immunisierung gegen HPV 16 E7 und HBs Antigen: Chimäre Konstrukte zwischen Hepatitis B Oberflächenantigen (s-antigen) und dem HPV 16 Papillomvirus-Onkogen E7 wurden hergestellt und über Adeno- oder Herpes simplex Vektorsysteme auf ihre Expression in Gewebekultursystemen und auf ihre Immunogenität im Maussystem analysiert. Dabei zeigte sich, dass gegen beide Antigene effektiv Antikörperbildung, aber auch zell-vermittelte Immunreaktionen induziert werden können. Diese Versuche lassen erwarten, dass entsprechende Kombinationsimpfstoffe nach klinischer Prüfung auch beim Menschen sinnvoll eingesetzt werden können (Manuskript zum Druck eingereicht). Abteilung F070 Tumorvirus-Charakterisierung [12] Fei J-W, Wei Q-X, Angel P, de Villiers E-M. Differential enhancement of a cutaneous HPV promoter by p63, Jun and mutant p53. (eingereicht) [13] Forslund O*, Antonsson A*, Higgins G*, Ly H*, Delius H, Hunziker A, de Villiers E-M. (2003) Nucleotide sequence and phylogenetic classification of candidate human papilloma virus type 92. Virology 312: [14] Jelcic I, Hotz-Wagenblatt A, Hunziker A, zur Hausen H, de Villiers E-M. (2004) Isolation of multiple genomes from a Hodgkin tumor: Genome reorganization within one TTV group and diversity in the hypervariable region of another group. (J Virol 78, im Druck) Buchbeiträge: [1] de Villiers E-M. (2004) Papillomviren. In: Die Infektiologie. D Adam, HW Doerr, H Link und H Lode (Hrsg) Springer Verlag pp [2] de Villiers E-M, Bernard H-U*, Delius H, Broker T*, zur Hausen H. Papillomaviruses. In: Virus Taxonomy. 8 th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Eds. A. Ball, CM Fauquet, et al., (im Druck) Publikationen (* = externer Koautor) [1] Alpsoy E*, Ciftcioglu MA*, Keser I*, de Villiers E-M, Zouboulis CC*. (2002) Epidermodysplasia verruciformis associated with neurofibromatosis type 1: coincidental association or model for understanding the underlying mechanism of the disease? Br J Dermatol 146: [2] Assaf C*, Steinhoff M*, Petrov I*, Geilen CC*, de Villiers E- M, Schultz-Ehrenburg U*, Orfanos CE*. (2004) Verrucous carcinoma of the axilla: case report and review. J Cutan Pathol. 31: [3] Caldeira S, Zehbe I, Accardi R*, Malanchi I*, Dong W, Giarre M*, de Villiers E-M, Filotico R*, Boukamp P, Tommasino M. (2003) The E6 and E7 proteins of the cutaneous human papillomavirus type 38 display transforming properties. J Virol 77: [4] Cid-Arregui A, Juárez V*, zur Hausen H. (2003) A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and its application to DNA immunization studies. J Virol 77: [5] Chamulitrat W, Schmidt R, Chunglok W, Kohl A*, Tomakidi P*. (2003) Epithelium and fibroblast-like phenotypes derived from HPV 16 E6/E7-immortalized human gingival keratinocates following chronic ethanol treatment. Eur J Cell Biol 82: [6] Chamulitrat W, Schmidt R, Tomakidi P*, Stremmel W*, Chunglok W, Kawahara T*, Rokutan K*. (2003) Association of gp91phox homolog Nox1 with anchorage-independent growth and MAP kinase-activation of transformed human keratinocytes. Oncogene 22: [7] de Villiers E-M. (2003) Relationship between steroid hormone contraceptives and HPV, cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma. Int J Cancer 103: [8] de Villiers E-M, Fauquet C*,Broker T*, Bernard H-U*, zur Hausen H. (2004) Classification of Papillomaviruses. Virology 324: [9] de Villiers E-M, Gunst K, Stein H*, Scherübl H*. (2004) Esophageal squamous cell cancer in patients with head and neck cancer: Prevalence of human papillomavirus DNA sequences. Int J Cancer ( /ijc.11685) 109: [10] de Villiers E-M, Sandstrom RE*, zur Hausen H, Buck CE*. Presence of papillomavirus sequences and absence of herpesvirus sequences in condylomatous lesions of the mamillae and in invasive carcinoma of the breast. (eingereicht) [11] de Villiers E-M, Schmidt R, Delius H, zur Hausen H. (2002) Heterogeneity of TT virus-like sequences isolated from human tumour biopsies. J Mol Med 80:

412 412 Forschungsschwerpunkt F Infektion und Krebs Retrovirale Genexpression (F080) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Rolf Flügel ( - 2/03) Gastwissenschaftler Dr. Kenji Kido, Japan (5/00-5/02) Doktoranden Dipl. Biol. Astrid Schwantes ( - 4/02) Apothekerin Verena Geiselhart ( - 1/03) Technischer Mitarbeiter Helmut Bannert Wirkungsmechanismen der Genexpression des humanen Spumaretrovirus (HSRV) R.M. Flügel In Zusammenarbeit mit: Mordechai Aboud, Ben-Gurion-University of the Negev at Beer-Sheva, Israel; Dr. Yoshihori Nakatani, Dana-Farber-Cancer Institute, Harvard University, Boston, MA, USA; Dr. Vasily Ogryzko, Institut Andre Lwoff, Villejuif, Frankreich. Zusatzfinanzierung: Fond der Chemischen Industrie, BEO. Die Ziele des Forschungsvorhabens sind die Aufklärung der Wirkungsmechanismen der Genexpression des humanen Spumaretrovirus (HSRV), die die Wechselwirkungen der viralen Proteine mit den Wirtszellen und deren Veränderungen beinhalten. Das HSRV ist ein komplexes und replikationskompetentes Retrovirus, das außer den drei charakteristischen Genen gag, pol und env wie das humane Immundefizienzvirus HIV-1 mehrere zusätzliche Gene besitzt, die bel Gene genannt werden, siehe Abb. 1. Humane Spumaviren sind aus Patienten mit verschiedenen Krankheitsbildern isoliert worden. Bei diesen Patienten handelte es sich einerseits um tumorartige Erkrankungen wie Karzinome und Leukämien, andrerseits um eine Enzephalopathie und Krankheiten der Schilddrüsen. Daneben ist ein immunsuppressiver Effekt des Spumavirus bekannt. Auffällig ist der zytopathische Effekt der Spumaviren in Zellkulturen und in definierten Hirnregionen HSRV-transgener Mäuse, der durch Ausbildung von ballonartigen Synzytien verursacht wird. Eine wesentliche Aufgabe ist, die Funktionen der neuartigen Bel Gene zu untersuchen und die induzierten, zellulären Partnermoleküle zu identifizieren. Die entscheidende Frage ist molekular zu verstehen, wie die apparente Apathogenität von HSRV-Infektionen,die zur Aktivierung zellulärer Onkogene führt, in diesem Phänotyp resultiert. Eine weitere Zielrichtung ist die Entwicklung eines retroviralen Vektorsystems das für Gentransfer-Experimente gentherapeutisch eingesetzt werden soll. Ein essentielles und wichtiges Resultat der Abteilung war die Identifizierung eines regulatorischen Elements der viralen Transkription, des internen Promotors des HSRV, siehe kurzer gebogener Pfeil in Abb. 1. Die Bedeutung des internen HSRV Promotors liegt darin, daß dieser unter den bisher bekannten Retroviren neuartige Promotor eine Bel 1-abhängige Transkriptionseinheit früh nach der Infektion kontrolliert und damit einen Einblick in die Regulation retroviraler Genexpression liefert. Das Prinzip, das zwei natürlich vorkommende Promotoren (der am 5' Ende liegende sog. LTR, Abb. 1, langer Pfeil, und der interne Promotor) in ein und demselben Retrovirusgenom die Genexpression steuern, wird genauer untersucht. Unsere Analysen zeigten, daß der Transaktivator Bel 1 essentiell für die Genexpression und Infektiösität des HSRV ist und direkt an die Zielpromotoren zellulärer und viraler Gene bindet [1]. Abteilung F080 Retrovirale Genexpression Um langfristig Einblicke in die in vivo Funktionen der viralen Genprodukte zu erhalten, wurde das feline Spumaretrovirus (FFV) kloniert, sequenziert und charakterisiert. Der interne Promotor des FFV wurde molekular identifiziert.[2]. Überraschenderweise hat die FFV Proteasedomäne ein aktives Zentrum, das von der des HSRV und der aller bekanten Retroviren verschieden ist [3]. Es wurde die Induktion zellulärer Gene nach HSRV Infektion untersucht unter Verwendung eines cdna Mikroarray-Systems. Eine Anzahl bekannter Transkriptionsfaktoren und zellulärer Wachstumsfaktoren wurden aktiviert und identifiziert. Es gelang es zu zeigen, daß diese spezifische Induktion durch den HSRV transkriptionellen Transaktivator Bel 1 verursacht wird. Besonders stark wurde der Inhibitor der Cyklin-abhängigen Proteinkinase (p57kip2) sowie der Insulinwachstumsfaktor 2 (IGF-II) induziert. Wir zeigten, dass die spezifische, durch Bel 1-vermittelte Aktivierung von p57kip2 auf einer intragenischen DNA Zielsequenz beruht [1]. Darüberhinaus gelang es, die Bel 1- vermittelte Transaktivierung des internen HSRV Promotors durch den zellulären Transkriptionsfaktor NFI in vivo zu reprimieren [4]. Dieses Resultat führte dazu, die direkten zellulären Koaktivatoren von Bel 1 zu identifizieren [5]. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Kido, K., Doerks, A., Löchelt, M., Flügel, R. M.: Identification and functional characterization of an intragenic binding site for the spumaretroviral trans-activator in the human p57kip2 gene. J. Biol. Chem. 277 (2002) [2] Bodem, J., *Kang Y., Flügel, R. M.: Comparative functional characterization of the feline foamy virus transactivator reveals its species specificity. Virology 318 (2004) [3] Kido, K., Bannert, H., *Gronostajski, R. G., Flügel, R. M.: Bel1-mediated transactivation of the spumaretroviral internal promoter is repressed by nuclear factor I. J. Biol. Chem. 278 (2003) [4] Flügel, R. M., Pfrepper, K.-I.: Foamy virus Gag and Pol proteolytic processing. Current Topics in Microbiol. Immunol. 248, (2003) [5] Bannert, H., Muranyi, W., Ogryzko, V., Nakatani, Y., Flügel, R. M.: Cellular coactivators physically and functionally interact with the foamy viral trans-activator. BMC Molecular Biology 5 (2004) Art. No. 16. [6] *Wain-Hobson, S., *Aboud, M., Flügel, R. M.: The hidden faces and many roots of retrovirus evolution. Virus Genes28 (2004) in press. Genom Organisation des humanen Spumaretrovirus. Kurze gebogene Pfeile markieren die Transaktivierung durch Bel1, das die Genexpression vom internen Promotor (rechtwinkligerr Pfeil oberhalb von Bel1). Kritische Schwellenwerte des Bel1 Proteins transaktivieren den 5' LTR Promotor (rechtwinkliger Pfeil) und exprimiert dadurch die Gene gag, pol, and env. Senkrechte Pfeile markieren proteolytische Spaltstellen durch die HSRV Protease (PR); aufwärts gerichtete Pfeile die Spaltstellen, die durch zelluläre Proteasen geschnitten werden.