Extended-Spectrum Beta-Lactamasen (ESBL) und Carbapenemasen
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1 Bad Honnef-Symposium 2009 Antibiotikaresistenz- Mechanismen der Entstehung, Ausprägung und Ausbreitung Extended-Spectrum Beta-Lactamasen (ESBL) und Carbapenemasen Dr. Yvonne Pfeifer 06./
2 Gramnegative, nosokomiale Erreger als Beta-Lactamase-Bildner Escherichia coli Klebsiella ssp. Enterobacter ssp. Citrobacter ssp. Morganella ssp. Providencia ssp. Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Harnwegsinfektionen, Urosepsis Wundinfektionen, Bakteriämie, Sepsis Infektion der Atemwege/ Nosokomiale Pneumonie Resistenzen: Beta-Lactam-Antibiotika Aminobenzylpenicilline (Ampicillin) Cephalosporine (Cefoxitin, Ceftriaxon, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefepim) Monobactame (Aztreonam) Carbapeneme (Ertapenem, Imipenem, Meropenem) Sulfomamide (Sulfamethoxazol/Trimethoprim) Aminoglycoside (Amikacin, Gentamicin,) Chinolone (Ciprofloxacin, Ofloxacin) 6-Aminopenicilliansäure
3 Einteilung der β-lactamasen nach Ambler (DNA-Sequenz basiert) Serine-β-lactamases Metallo-βlactamases Ambler classes A C D B General designation ESBL AmpC OXA Metallo-β-lactamases Important examples Preferential occurrence Important phenotypica l resistance traits TEM-1, TEM-2 SHV-1 TEM-type ESBL SHV-type ESBL CTX-M penicillins, cefotaxime, ceftazidime, cefpodoxime, KPC GES SME Enterobacteriaceae penicillins cephalosporins, imipenem, meropenem, ertapenem AmpC enzymes: CMY MOX ACC DHA Enterobacteriaceae penicillins cefoxitin cefotaxime ceftazidime cefpodoxime OXA-type ESBL oxacillin, cefotaxime, ceftazidime, cefpodoxime OXA-type carbapenemases Enterobacteriaceae, A. baumannii penicillins, cephalosporins imipenem, meropenem, ertapenem carbapenemases VIM IMP A. baumannii P. aeruginosa penicillins, several cephalosporins, imipenem, meropenem, ertapenem
4 Diagnostik: Phänotypische Resistenzbestimmung ESBL ESBL Fähigkeit zur Hydrolyse von 3. Generation Cephalosporinen Hemmbarkeit durch ß-Lactamase Inhibitoren (z.b. Sulbactam) Bestätigungstests Mikrobouillonverdünnungstest für den ESBL-Nachweis (A) CTX CAZ CPD CTX/SUL CAZ/SUL CPD/SUL (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 128 WK 128 WK 128 WK 128 WK 128 WK 128 WK ESBL-positiv: (B) 64 0, , , , , ,008 MHK Ceftazidim o. Cefotaxim 2 μg/ml (C) 32 0, , , , , ,016 (D) 16 0, , , , , ,032 MHK Cefpodoxim 8 μg/ml (E) 8 0, , , , , ,063 (F) (G) 4 2 0,125 0, ,125 0, ,125 0, ,125 0, ,125 0, ,125 0,25 Quotient aus MHK Cephalosporin und MHK Cephalosporin. + Inhibitor 8 (H) 1 0,5 1 0,5 1 0,5 1 0,5 1 0,5 1 0,5
5 Beta-Lactamase-Typ und Phänotypische Resistenz Antibiotika Hemmbarkeit β-lactamase AP CPD CTX CAZ FOX ETP SUL, CLV, EDTA TEM ESBL R R V R S S SUL, CLV SHV ESBL R R V R S S SUL, CLV CTX-M-ESBL R R R V S S SUL, CLV K1 (K. oxytoca) R R V S S S - AmpC R R R R R S - MBL R R R R R R EDTA AP, Ampicillin; CPD, Cefpodoxim; CTX, Cefotaxim; CAZ, Ceftazidim; FOX, Cefoxitin; SUL, Sulbactam; CLV, Clavulansäure; ETP, Ertapenem; R, Resistent; V, variabel; S, sensitiv Veränderung des Phänotyps durch Kombination von verschiedenen Beta-Lactamasen und weiteren Resistenzmechanismen Molekulare Diagnostik (Resistenz-Genotyp) erforderlich
6 Verbreitung der Resistenz gegen Cephalosporine und gegen Carbapeneme Klonale Ausbreitung resistenter Stämme Mobilisierung chromosomaler Vorläufer-Gene (z.b. CTX-M) über, Integrons, Transposons und Integration in Resistenzplasmide Horizontaler Gentransfer - Übertragung von konjugativen Plasmiden innerhalb der Spezies oder in andere Spezies A B Ausbreitung von Resistenz- Plasmiden zwischen verschiedenen Isolaten A Donor B Rezipient Akkumulation von verschiedenen Resistenzgenen auf mehreren MGEs (Transposons) hintereinander möglich: multi-drug resistance regions (MDR) Multiresistente Erreger (MRE)
7 Molekulare Nachweismethoden PCR-Amplifikation und Sequenzierung der bla-gene ESBL-Multiplex-PCR M MP CTX-M-Multiplex-PCR M MP AmpC-Multiplex-PCR M MP bla TEM bla SHV bla CTX-M CTX-M-14 spez. CTX-M-9-type CTX-M-2-type CTX-M-1-type MOX A.h. EBC E.cl. ACC H.a. DHA M.m. CMY C.f. Universalprimer erfassen nahezu alle Genvarianten eines Beta-Lactamase Types Gesamt-Gen Sequenzierung nötig für epidemiologische Untersuchungen Oligonukleotid-Microarray zur Beta-Lactamase Identifikation 1,00 schnell sensitiv spezifisch teuer! rel. intensity (RI) 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 S163 S163.2 S180 S182 S194 S194.2 S202 S216 S235 S235.2 S236 S236.2 S237 S241 S241.2 S258 S261 S264 S271 S272 S276 S241: agc Ser A G C T
8 Molekulare Epidemiologie Die Frage nach der Verwandtschaft: Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Makrorestriktionsanalyse (PFGE) Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST) ESBL Inc-group CTX-M-15 FII CTX-M-15 FII CTX-M-15 FII CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-15; TEM-1 FII CTX-M-65; TEM-1 CTX-M-15 I1 CTX-M-15; TEM-1 FII PCR-Nachweis der Plasmid-Inkompatiblitätsgruppen und Analyse der genetic environment : ΔISEcp1 IS Δmph(A) Δmrx IR-R IR-RIR-R IR-L tnpa hypa bla CTX-M hypb ΔORF2
9 Resistenz-Übertragbarkeit Konjugationsexperiment: Übertragung der Resistenzplasmide in einen sensitiven Rezipienten A bla ESBL B A Donor: Resistenz gegen Ampicillin B Rezipient: Resistenz gegen Natriumazid Plasmidisolation S S S 1 2 M 1 2 M bp bp bp 7200 bp 6000 bp 5550 bp 5100 bp 3900 bp 3000 bp 2700 bp 2100 bp 1 K. pneumoniae CTX-M-9, CMY-4, VIM-1 2 E. coli K CMY-4, VIM bp 6000 bp 5550 bp 5100 bp 3900 bp 3000 bp 2700 bp 2100 bp Southern Hybridisierung 3 E. coli 335/07 CTX-M-14 + TEM SHV-12 4 E. coli K 335/07 CTX-M-14
10 Verbreitung der Cephalosporin-Resistenz bei Enterobakterien EARSS - European Antimicrobial Resistance Surveillance System No data* < 1% 1-5% 5-10% 10 E. - 25% coli und K. pneumoniae mit ESBL-Phänotyp Resistenzstudie der PEG (Paul-Ehrlich-Gesellschaft e.v.) 25-50% > ESBL Rate in % E. coli K. pneumoniae Proportion of invasive isolates of Escherichia coli with resistance to third generation cephalosporins in 2006 ( on 28th Feb 2009) *These countries did not report any data or reported less than 10 isolates
11 Antibiotika-Resistenz-Surveillance in Deutschland Cephalosporin- und Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae Untersuchung zu Vorkommen und Verbreitung von ESBL-Typen nosokomialer Enterobacteriaceae in Deutschland Erkennen von Resistenz-Trends (Frühwarnfunktion) Molekulare Diagnostik und deren Weiterentwicklung ARS-ESBL-Projekt 2008 Molekulare Untersuchung von ESBL Isolaten aus mehr als 100 beteiligten Kliniken in ganz Deutschland: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca (Proteus mirabilis) n = 1 n = 1 n = 1 n = 1 Isolate mit ESBL-Phänotyp aus Blutkultur, Wundabstrichen, Trachealsekret
12 Deutschland: ESBL in nosokomialen E. coli Antibiotikaresistenz-Surveillance (ARS): ESBL-Projekt no. of strains n = 49 no. of strains n = 154 no. of hospitals n = 29 no. of hospitals n = 150 TEM type n = 7 TEM type n = 6 SHV type n = 2 SHV type n = 3 CTX-M type n = 40 (81 %) CTX-M type n = 143 (93 %) CTX-M-1 n = 10 CTX-M-1 n = 50 CTX-M-2 n = 2 CTX-M-2 n = 4 CTX-M-3 n = 7 CTX-M-3 n = 1 CTX-M-9 n = 7 CTX-M-9 n = 2 CTX-M-14 n = 2 CTX-M-14 n = 10 CTX-M-15 n = 11 (27,5%) CTX-M-15 n = 76 (53 %) ca % aller ESBL Isolate resistent gegen Sulfonamide und Fluorchinolone
13 Untersuchung von Ausbruchs- Isolaten 23 E. coli aus der Neonatologie/ Neointensivstation mit ESBL-Verdacht CTX-M-15 als häufigste ESBL-Variante Klonale Verbreitung innerhalb der Station KLUC-1 CTX-M-10 CTX-M-3 CTX-M-28 CTX-M-15 CTX-M-22 CTX-M-23 CTX-M-1 CTX-M-21 CTX-M-17 CTX-M-24 CTX-M-14 CTX-M-9 CTX-M-16 CTX-M-6 CTX-M-7 CTX-M-4 CTX-M-2 CTX-M-20 KLUA-Enzyme KLUG-1 CTX-M-8 CTX-M-25 CTX-M-26 [AAK08976] [AAF65843] [BAB40925] [AJ549244] [AAL02127] [AAL86924] [AAL99990] [P28565] [CAD08929] [AAM33515] [AAN38836] [AAF72530] [AAF05311] [AAK32961] [CAA06311] [CAA06312] [CAA74573] [P74841] [CAC95175] [CAB59824] [AF501233] [AAF04388] [AAM70498] [AY157676] KLUC-1 Gruppe CTX-M-1 Gruppe > 97 % Sequenz-Identität CTX-M-9 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität CTX-M-2 Gruppe > 94 % Sequenz-Identität CTX-M-8 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität CTX-M-25 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität RKI-Nr. Herkunft bla-gen (ESBL-MP-PCR) 165/07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind CTX-M-2 170/07 Kind CTX-M-2 171/07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind CTX-M /07 Kind CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Kind TEM-1 + CTX-M /07 Mutter TEM-1 + CTX-M-1 184/07 Personal TEM-1 + CTX-M-15 20/08 (1) Mutter TEM-1 + CTX-M-15 20/08 (2) Mutter TEM-1 + CTX-M-15 21/08 Personal TEM-1 + CTX-M-15
14 Plasmid-Transfer zwischen verschieden Spezies ESBL-Screening von Patienten einer Klinik: Gleichzeitige Besiedlung mit E. coli und Klebsiella pneumoniae Spezies Beta-Lactamase Spezies Beta-Lactamase E. coli TEM-1 + CTX-M-3 K. p. SHV-11 + CTX-M-3 E. coli TEM-1 + CTX-M-15 K. p. TEM-1 + SHV-32 + CTX-M-15 E. coli TEM-1 + CTX-M-1 K. p. TEM-1+ CTX-M-1 Konjugation, Plasmidisolation: E.c. Konj. M K.p. Konj bp E. c. TEM-1 + CTX-M-1 Konj. TEM-1 K.p. TEM-1 + CTX-M-1 Konj. CTX-M-1 M = Plasmidstandard V517 E. coli
15 ESBL in Salmonella spp. 16 humane Isolate Salmonella enterica serovar Typhimurium, Lysotyp DT193 aus fünf Bundesländern Gastroenteritis,Harnwegsinfektion S Xba-I-Makrorestriktionsanalyse (PFGE) S S 1 = 6/07 CTX-M-1 + TEM-1 2 = 7/07 CTX-M-1 + TEM-1 3 = 8/07 CTX-M-1 + TEM-1 4 = 9/07 CTX-M-1 + TEM-1 5 = 10/07 CTX-M-1 + TEM-1 6 = 11/07 CTX-M-1 + TEM-1 7 = 12/07 CTX-M-1 + TEM-1 Bayern Bayern Niedersachsen Thüringen Thüringen Sachsen-Anhalt Bayern Nachweis des Stammes in Isolaten aus Schweinekot S = S. enterica Braenderup universal marker Erstmaliger Nachweis von importiertem Salmonella Typhi mit CTX-M-15 ESBL und übertragbarer Chinolonresistenz (Qnr-Determinanten) Leichte Übertragbarkeit der Resistenzplasmide Salmonella ein mögliches ESBL- Reservoir?
16 Ambler-Klasse C: AmpC-β-Lactamasen Chromosomal-kodierte AmpC-β-Lactamasen Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen Konstitutive o. induzierbare highlevel Expression des Wildtyp ampc Gens in E. cloacae, Citrobacter freundii High-level Expression durch Mutationen im E. coli ampc Promoter CMY ACC ACT FOX LAT MOX 6 Gen-Familien abgeleitet von verschiedenen Ursprungsspezies High-level Expression z.b. in E. coli ; K. pneumoniae Cephalosporinresistenz Cefoxitin-Markerresistenz Klonale Verbreitung, Konvergente Evolution Cephalosporinresistenz Cefoxitin-Markerresistenz Verbreitung durch horizontalen Gentransfer
17 Y. Pfeifer, Epidem. Bull. 28/2007 Cephalosporin-Resistenz in E. coli ESBL-Bildung: TEM, SHV, CTX-M (Kombination TEM-1 + CTX-M häufig) Resistenz gegen 3. Gen Cephalosporine, hemmbar durch Inhibitoren Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen: CMY-type Enzyme am häufigsten Resistenz gegen Cefoxitin + 3.Gen Cephalosporine, nicht hemmbar High-Level Expression der Spezies-eigenen AmpC-β-Lactamase durch Mutationen der chromosomalen ampc Promoter Region box box -1 WT AmpC* TCCTGACAGTTGTCACGCTGATTGGTGTCGTTACAATCTAACGCATCGCCAATGTAAATCCGGCCCGCC 108/04 --T A T / A---A T / I T WT AmpC* TATGGCGGGCCGTTTTGTATGGAAACCAGACCCTATGTTCAAAACGACGCTCTGCGCCTTATTAAT 108/ T / D T A / T
18 Carbapenemresistenz und Carbapenemasen Das noch sehr seltene Auftreten (in Deutschland unter 1% der Isolate) muss sehr ernst genommen werden; die Erreger sind resistent gegen fast alle verfügbaren Antibiotika; die damit verbundenen Infektionen enden oft tödlich! Beispiel: Klasse A Carbapenemasen weltweite Ausbreitung des Gens für die Carbapenemase KPC-2 EARSS-Report on 28th Feb 2009 KPC-2 in K. pneumoniae 1998 USA 2004 China 2005 Kolumbien 2005 Frankreich 2005 Israel 2008 Griechenland 2008 Deutschland C. Wendt, Epidem. Bull. 22/2008
19 Ambler Klasse D: OXA-β-Lactamasen und Carbapenemresistenz Multiresistente Acinetobacter baumannii und Enterobacteriaceae Ausbrüche in einer Klinik 2007: Carbapenemase-bildende A. baumannii mit schwerem Infektionsverlauf PCR-Nachweis der Gene bla OXA-23 und bla OXA-58 A. baumannii Einzelisolate von oft zuvor im Ausland hospitalisierten Patienten: Übertragbare Carbapenemresistenz: OXA-23; OXA-24; OXA-48; OXA-58 Klonale Verbreitung: Überexpression der chromosomalen OXA-51-like Beta-Lactamase: TGTACAGAG ISAbal AAGTCTTATGAACATT. 7 bases bla OXA-51-like Turton et al., FEMS Microbiol. Lett. 2006; 258: 72-77
20 Ambler Klasse B: Metallo-β-Lactamasen Mobilisierung der Gene bla VIM und bla IMP aus Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa und Transfer in Enterobacteriaceae Carbapenemresistenz und Multiresistenz in Enterobacteriaceae durch Kombination der Beta-Lactamase-Bildung mit anderen Resistenzmechanismen: Carbapenem-Resistenz und Porin-Verlust OMP outer mebrane protein (OmpA-Trimer) 1, 2bp-Deletion STOP in ompk-35 2, 384 bp-deletion in ompk-36 3, 600 bp-deletion in ompk-36 Antibiotika K.p. 5 K.p. 54 K.p. 149 Imipenem Imipenem/EDTA Meropenem bla TEM bla SHV bla CTX-M bla ampc bla VIM qnr-gen - qnr-b - Porin OmpK Porin OmpK
21 Metallo-β-Lactamasen und Multiresistenz Antibiotika Ampicillin Mezlocillin K.p. 62 > 16 K.o. 57 > 16 Auftreten multiresistenter K. pneumoniae (n = 4) in zwei Kliniken mit Resistenzen gegenüber allen verfügbaren Antibiotika außer Colistin und Tigecyclin MSU Cefotiam Cefotaxim Ceftazidim Cefoxitin Gentamicin > 8 > 16 > 8 > 8 > 16 2 bla CMY-4 und bla VIM-1 auf einem Plasmid lokalisiert und übertragbar multiresistentetranskonjuganten Auftreten multiresistenter K. oxytoca (n = 5) in zwei Kliniken mit bla VIM-1 und übertragbarer Chinolonresistenz Kanamycin Beta-Lactamase Gen (bla) Amikacin 2 K.p. 62 K.o. 57 Streptomycin > 64 > 64 Nalidixinsäure bla TEM - - Oxytetrazyclin > 8 > 8 bla SHV 1 - Chloramphenicol Ciprofloxacin Sulfameracin SXT Colistin Imipenem > 64 > 512 > 128 0, > 512 > 128 0,5 64 bla CTX-M 9 - bla ampc CMY-4 - bla VIM 1 1 qnr-gen - qnr-b Porin OmpK35 - a - b Imipenem+EDTA Meropenem Porin OmpK b a, IS1-Transposase in ompk-35; b, bp-deletionen Y. Pfeifer, Epidemiol. Bull. 14/2008
22 Zusammenfassung Cephalosporinresistenz in Enterobacteriaceae: ESBL (CTX-M) AmpC Überexpression AmpC Plasmid-vermittelt (CMY) Enterobacteriaceae Enterobacter spp., E. coli E. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp. Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae und Nonfermentern: KPC E. coli, Klebsiella spp. OXA Plasmid-vermittelt OXA Überexpression Metallo-β-Lactamasen (VIM, IMP) E. coli, Klebsiella spp., A. baumannii, P. aeruginosa A. baumannii E. coli, Klebsiella spp. Enterobacter spp., A. baumannii, P. aeruginosa Auftreten multiresistenter Enterobacteriaceae, insbesondere Klebsiella spp., wobei die therapeutischen Möglichkeiten nahezu erschöpft sind Risiko Horizontaler Gentransfer: Übertragung von Multiresistenz- Plasmiden innerhalb der Spezies und in andere Spezies
23 Danke Prof. Dr. Wolfgang Witte Sibylle M.-Bertling Angela Danschke Dr. Guido Werner Dr. Birgit Strommenger Dr. Rita Prager Dr. W. Rabsch Dr. Anne-Marie Fahr Herzlichen Dank an alle Einsender!
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