Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf das Darm-assoziierte Immunsystem des Schweins

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1 Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf das Darm-assoziierte Immunsystem des Schweins INAUGURAL DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Swantje Duncker aus Kiel Hannover 2005

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves Prof. Dr. Stephan C. Bischoff 1. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-J. Schuberth Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2005 Gefördert durch ein Stipendium der FIRMA ARDEYPHARM GmbH, Herdecke, Deutschland und den Sonderforschungsbereich SFB 621 Pathobiologie der Intestinalen Mukosa der DEUTSCHEN FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT (DFG)

3 meinen Eltern und meinem Großvater in Liebe und tiefer Bewunderung in liebevollem Gedenken an meine Großmutter

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis VERZEICHNISS DER ABKÜRZUNGEN 1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT Physiologische Mikroorganismen des Darms Darmmikroorganismen beim Schwein Intestinale Barriere Probiotika Definition Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung Wirkungsmechanismen Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen Wirkungen auf den Wirt Escherichia coli Nissle Wirkmechanismen und therapeutische Anwendung von EcN Escherichia coli Stamm Abbotstown Wirkmechanismen und klinische Bedeutung Das darmassoziierte Immunsystem Anatomischer und histologischer Aufbau des Darms beim Schwein Immunzellen des Darms Zellen des angeborenen Immunsystems Zellen des adaptiven Immunsystems des Schweins Aufbau des darmassoziierten Immunsystems Intraepitheliale Lymphozyten Lamina propria Lymphozyten Interleukin-2 Rezeptor (CD25) als Aktivierungsmarker Antimikrobielle Peptide Ziel der Arbeit MATERIAL UND METHODE...36

6 2.1 Haltung der Versuchstiere Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Infektionsversuche mit und ohne EcN Versuchsdurchführung Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Infektionsversuche mit und ohne EcN Tötung der Tiere Probengewinnung Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen Probenentnahme für die Polymerase-Ketten-Reaktion Probenentnahme für histologische und immunhistologische Analysen Infektionsversuche mit und ohne EcN Plasmagewinnung für Plasma-IgA-Bestimmung Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen Probenentnahme für luminale IgA-Bestimmung Probenentnahme für histologische Untersuchungen Probenbearbeitung und Lagerung Einbettung in Paraffin und Anfertigung von Gewebeschnitten Mikrobiologische Untersuchungen Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Infektionsversuche mit und ohne EcN Bestimmung von luminalen und Plasma-IgA Infektionsversuche mit und ohne EcN Auswertung Histologische Untersuchung Entparaffinierung Hämalaun-Eosin Färbung Toluidinblaufärbung Immunhistologische Methoden Markierte Streptavidin-Biotin Methode Verwendete Antikörper...53

7 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen Darstellung von CD8 Oberflächenantigen Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA Gegenfärbung mit Hämalaun Auswertung RNA-Isolierung, reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion RNA-Isolierung und reverse Transkription PCR Verwendete Primer und PCR-Protokolle Auswertung Statistik ERGEBNISSE Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Gewicht Mikrobiologische Untersuchung Histologische Untersuchung Eosinophile Granulozyten Neutrophile Granulozyten Basophile Granulozyten Mastzellen Immunhistologische Untersuchung T-Helfer-Zellen (CD4+) CD8+ Zellen Aktivierungsmarker (CD25) IgA-produzierende Plasmazellen mrna-expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden Infektionsversuche mit und ohne EcN Klinik Allgemeine mikrobiologische Untersuchung Wassergehalt im Kot Luminale und Plasma-IgA-Bestimmung...96

8 Histologie DISKUSSION Konzeptionelle Überlegungen Konventionell gehaltene Schweine Infektionsversuch mit und ohne EcN Neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von EcN ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG I Futterzusammensetzung des verwendeten Grundfutters E. coli Nissle 1917-Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen Infektionsversuche mit und ohne EcN ANHANG II Bakterienstämme Material und Geräte Pharmaka und Substanzen Lösungen und Protokolle Kits ANHANG III Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Gewicht Anzahl eosinophiler Granulozyten Anzahl neutrophiler Granulozyten Anzahl an Mastzellen Anteil CD4+ Zellen Anzahl CD8+ Zellen Anzahl CD25+ Zellen...173

9 Anteil IgA+ Zellen Infektionsversuche mit und ohne EcN Gewicht ERKLÄRUNG DANKSAGUNG

10 Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen eingetragenes Wahrenzeichen Abb. Abbildung AEC 3-Amino-9-ethylcarbazol Akt-Kinase Protein Kinase B AMG Arzneimittelgesetz Aqua dest. Aqua destilata B.cer. var. toyoi Bacillus cereus Varietas toyoi bzw. beziehungsweise CD cluster of differentiation (zelluläre Differenzierungsantigene) CED chronisch entzündliche Darmerkrankung CTMC connective tissue mast cell (Bindegewebsmastzellen) DC dendritic cell (dendritische Zelle) DNA desoxy ribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) E. coli Escherichia coli EcN Escherichia coli Nissle 1917 ECP eosinophilic cationic protein (Eosinophiles Kationisches Protein) EPEC enteropathogene Escherichia coli EPX Eosines Protein X et al. et alii (und andere) ETEC enterotoxische Escherichia coli Fa. Firma FMG Futtermittelgesetz GALT gut associated lymphoid tissue (darmassoziiertes lymphoides Gewebe) HE Hämalaun Eosin HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) IEL intraepitheliale Lymphozyten IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin

11 Verzeichnis der Abkürzungen IL-2R Interleukin-2 Rezeptor IκB inhibitor of kappa B (Hemmstoff von kappa B) KBE koloniebildende Einheiten LCC Laktobazillen LGG Lactobacillus rhamnosus GG LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz LP Lamina propria LPL Lamina propria Lymphozyten LPS Lipopolysaccharid LSAB-Methode labeled streptavidin biotin (gekennzeichnete Streptavidin-Biotin) Methode LT Lymphotoxin mak monoklonaler Antikörper pak polyklonaler Antikörper MALT mucosa associated lymphoid tissue (mukosaassoziiertes lymphoides Gewebe) MAP-Kinase Mitogen-aktivierte Protein-Kinase MBP major basic protein MC mast cell (Mastzelle) MCP membrane cofactor protein MHC major histocompatibility complex MIP-1 macrophage inflammatory protein (Makrophagen Entzündungsprotein) MMC mucosal mast cell (mukosale Mastzellen) mrna messenger ribo nucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure) NaCl Natriumchlorid NfE N-freie Extraktstoffe NFκB Nucleus Faktor Kappa B PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PGE-2 Prostaglandin E-2 PP Peyer sche Platten RT Raumtemperatur s.c. subcutan SAB Saccharomyces boulardii SCF stem cell factor (Stammzellfaktor)

12 Verzeichnis der Abkürzungen SCFA SD siga ST1p TBS TCR TGF Th -Zelle TNF u.ä. WHO z.b. z.t. short chain fatty acids (kurzkettige Fettsäuren) standard deviation (Standardabweichung) sekretorisches IgA Shigatoxin 1p Tris buffered saline (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) T-cell receptor (T-Zellrezeptor) tumor growth factor (Tumorwachstumsfaktor) T-Helfer-Zelle Tumornekrosefaktor und ähnliches World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation) zum Beispiel zum Teil Chemische Elemente werden entsprechend der internationalen Literatur abgekürzt.

13 Einleitung und Literaturübersicht 1 Einleitung und Literaturübersicht Die ersten Lebewesen, die die Evolution hervorgebracht hat, gehörten zur Gruppe der Mikroorganismen. Noch heute sind verschiedene Formen von Mikroorganismen an der Besiedlung nahezu jedes Lebensraumes unseres Planeten beteiligt. Häufig haben sich im Laufe der Evolution Symbiosen zwischen Mikroorganismen und höher entwickelten Lebewesen als äußerst erfolgreich erwiesen. Eine derartige Symbiose sind auch die Säugetiere mit den ihren Darm besiedelnden Mikroorganismen eingegangen. Die Anzahl der physiologischerweise den Magendarmtrakt besiedelnden Mikroorganismen übersteigt dabei die Zahl der Körperzellen des Wirts um ein Vielfaches. (BRY et al. 1996). Es wird üblicherweise angenommen, dass zwischen 400 und 500 verschiedene Spezies an der Besiedlung des Intestinaltraktes beteiligt sind (SIMON und GORBACH 1982). Nachdem ihre Aufgabe lange Zeit nur auf Seiten der Nährstoffversorgung und Fermentation gesehen wurde, rückten in den letzten Jahren auch immer häufiger immunmodulatorische Wirkungen der Darmmikroorganismen in den Blickpunkt der Forschung (BOURLIOUX et al. 2003). Auf dieser Grundlage erlebte die Erforschung einer Gruppe von Mikroorganismen eine Renaissance, deren positive Wirkung auf die Gesundheit des Menschen schon Anfang des letzten Jahrhunderts von METCHNIKOFF (1907) und in den 20er Jahren des vergangenen Jahrhunderts von NISSLE (1916) untersucht wurde. LILLY et al. (1965) prägten für diese Gruppe von Mikroorganismen den Begriff Probiotika. Das Wissen um die genaue Wirkungsweise dieser speziellen Mikroorganismen im Ökosystem Darm und den Einfluss auf den Wirtsorganismus ist aber nach wie vor unzureichend. Dies ist insofern besonders bedauerlich, als Probiotika inzwischen nicht nur in Form von Futtermittel- bzw. Nahrungsmittelzusatzstoffen eine Rolle spielen, sondern einzelne Spezies auch als Medikamente zum Einsatz kommen. Vor allem in der Humanmedizin werden diese Spezies zur Therapie von gastrointestinalen Erkrankungen genutzt und haben sich den pharmakologischen Therapien als ebenbürtig erwiesen (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999, GAON et al. 2003, ALLEN et al. 2004). Allerdings scheint die Zahl der Befürworter derartiger Therapieansätze ebenso groß wie die ihrer Gegner. Anstoß der Diskussion um den Einsatz von Probiotika bildet immer wieder das Fehlen befriedigender Erklärung für die Wirkung der verwendeten Keime. In der Veterinärmedizin intensiviert der Einsatz von Probiotika als Ersatz für antimikrobielle 1

14 Einleitung und Literaturübersicht Leistungsförderer in der Nutztierhaltung die Diskussion um die Wirkungsweise dieser speziellen Mikroorganismen zusätzlich. Eine Aufklärung von probiotischen Wirkmechanismen ist demnach nicht nur in Bezug auf erweiterte und gezieltere therapeutische Anwendungen wünschenswert, sondern könnte auch helfen die prophylaktische Anwendung probiotischer Keime sowohl beim Menschen als auch beim Tier auszuweiten und zu verbessern. 1.1 Physiologische Mikroorganismen des Darms Um Effekte von Probiotika auf die Mikroökologie des Darms und damit auf den Wirt einordnen und die Erkenntnisse zu Wirkungsmechanismen bewerten zu können, soll zunächst kurz auf die physiologischen Mikroorganismen des Darms und ihre Bedeutung für den Wirt eingegangen werden. Sowohl umgangssprachlich als auch in vielen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung wird von der sogenannten normalen Darmflora gesprochen. Damit sind in der Regel die Mikroorganismen gemeint, die bei einem gesunden Individuum im Magen-Darm-Trakt vorkommen. Es handelt sich dabei sowohl um residente wie auch um transiente Keime. Die Ansammlung intestinaler Mikroorganismen ist in hohem Maße individuellen Schwankungen unterworfen. Die Speziesverteilung hängt von vielen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht, der Ernährung, sowie den Umwelt- und Hygieneverhältnissen ab. Auch eine genetische Komponente wird diskutiert. So zeigt die Zusammensetzung der Darmmikroorganismen bei eineiigen Zwillingen eine größere Übereinstimmung als bei zweieigen Zwillingen (VAN DE MERWE et al. 1983). Ein Normalzustand, der für alle Individuen einer Spezies gilt, ist demnach nur schwer vorstellbar, weshalb im Folgenden von physiologischer Besiedlung gesprochen werden soll. Die Verwendung des Wortes Mikroorganismen trägt der Tatsache Rechnung, dass eine Vielzahl verschiedener Organismen aus verschiedenen Gattungen an der Besiedlung des Säugerdarms beteiligt sind (ROBINSON et al. 1984, BLEDAY et al. 1993, TANNOCK 2001, FANARO et al. 2003). Die Anzahl der Mikroorganismen nimmt im Verlauf des Gastrointestinaltrakts von oral nach aboral stetig zu und beläuft sich bei Nutztieren wie dem Schwein auf einer Gesamtzahl von KBE im Darm. Im Vergleich zwischen den Darmabschnitten ist sie im Dickdarm mit KBE/g Ingesta am höchsten (GEDEK 1987). Die Gesamtheit der physiologischen Mikroorganismen setzt sich aus 2

15 Einleitung und Literaturübersicht Spezies zusammen, wobei die Angaben zu diesen Zahlen in der Literatur stark differieren (FULLER et al. 1978, ROBINSON et al. 1984, TANNOCK 2001). Neueste präliminäre Ergebnisse für den Menschen lassen allerdings eine sehr viel geringere Zahl von um die 100 Spezies mit einer extremen Diversität zwischen einzelnen Wirten vermuten (ABBOTT 2004). Jedes Individuum scheint somit eine ihm eigene physiologische Darmbesiedlung zu besitzen. Sowohl bei Säugetieren als auch beim Menschen gehören die meisten Darmbakterien dem Genus Lactobacillus, Bifidobacteria und Bacteroides an (25 bzw. 30%) (FULLER et al. 1978, ROBINSON et al. 1984, SALMINEN et al. 1998). Als primäre Aufgabe der gastrointestinalen, mikrobiologischen Mitbewohner wird der Abbau von für den Wirt nicht oder nur schwer verdaulicher Kohlenhydrate (Cellulose, Hemizellulose, Oligosaccharide und Pektine) angesehen. Sowohl beim Menschen als auch beim Schwein erfolgt der mikrobielle Abbau in erster Linie im Kolon. Die Produktion kurzkettiger Fettsäuren, besonders von Butyrat, sichert dabei die Energieversorgung der Enterotzyten ( SAVAGE 1977a, b, COATES 1980, FULLER 1989, GUARNER und MALAGELADA 2003,). Allerdings ist die Fermentation von Kohlenhydraten nicht auf den Dickdarm beschränkt. Insbesondere Hemizellulosen und Pektine werden zu einem nicht unerheblichen Anteil auch schon im Dünndarm mikrobiell verstoffwechselt (DROCHNER 1993). Andere Untersuchungen belegen eine beträchtliche Fermentation der Ingesta im terminalen Ileum (HOUDIJK 1998). Neben der Fermentationsleistung synthetisieren einige Darmmikroorganismen B-Vitamine und Vitamin K (SALMINEN et al. 1998). Außerdem sorgen sie für eine Stimulation und Regulation des intestinalen Immunsystems, unterstützen die orale Toleranz gegenüber Nahrungsantigenen und helfen, die Besiedlung des Darms mit pathogenen Mikroorganismen zu vermeiden (TLASKALOVA-HOGENOVA et al. 2004), indem beispielsweise die Anheftung pathogener Mikroorganismen durch von Kommensalen besetzte Anheftungsstellen erschwert wird. Des Weiteren bietet die Wechselwirkung (crosstalk) zwischen den physiologischen Darmbewohnern und der Mukosa des Wirts einen zusätzlichen Schutz (UMESAKI et al. 1997). Alle genannten Eigenschaften unterstützen das intestinale Epithel maßgeblich in seiner Funktion als intestinale Barriere. 3

16 Einleitung und Literaturübersicht Darmmikroorganismen beim Schwein Die mikrobielle Besiedlung des Schweinedarms beginnt unter der Geburt und setzt sich durch den nachfolgenden Kontakt mit der Sau und der Umgebung fort. Die Zusammensetzung der Bakterienspezies hängt dabei zu gleichen Teilen von der Besiedlung des Muttertieres zum Zeitpunkt der Geburt und den in der unmittelbaren Umwelt vorherrschenden Keimen ab (SMITH 1965, SCHULZE und BATHKE 1977, SCHULZE et al. 1980). Anders als menschliche Säuglinge, die zumindest in den Industrieländern meist in eine keimarme Umgebung hineingeboren werden, sind die Haussäugetiere sofort nach ihrer Geburt mit einer großen Menge an Keimen konfrontiert. Beim Schwein kommt es schon zwei Stunden nach der Geburt zur Besiedlung des Darms mit koliformen Keimen. Bereits nach 48 Stunden sind Laktobazillen und Clostridien vorhanden und es können strikte Anaerobier, wie z.b. Bacteroides Spezies nachgewiesen werden (DUCLUZEAU 1985, SWORDS et al. 1993). Die Bakteriendichte im Koloninhalt stabilisiert sich ausgehend von Sterilität bei der Geburt nach 12 Stunden auf koloniebildende Einheiten pro Gramm. Durch die veränderte Fütterung in Zusammenhang mit dem Absetzen erhöht sich der Anteil der Bacteroides Spezies als dominierenden Anaerobiern (SWORDS et al. 1993). Im Darm gesunder abgesetzter Schweine (Läufer) überwiegen jedoch die Laktobazillenspezies. Insbesondere Lactobacillus acidophilus, macht den größten Teil der bakteriellen Besiedlung aus. Außerdem sind im gesamten Magen-Darm-Trakt Streptokokken (Streptococcus bovis, Streptococcus fecalis und Streptococcus faecium) nachweisbar. Die größte Dichte findet sich im Ileum und im Dickdarm (GÄRTNER et al. 1973, KENWORTHY 1973). Im Vergleich zum menschlichen Darm, bei dem mit bis zu 90 % der Gesamtbakterienzahl Bacteroides-Spezies und Bifidobakterien vorherrschen (HAENEL 1969), finden sich diese beim Schwein nur zu einem geringen Anteil von ca. 1% (SCHULZE und BATHKE 1977). E. coli-spezies tragen sowohl beim Schwein als auch beim Mensch mit 1-5% zur anzüchtbaren Stuhlflora bei ( SEELIGER und WERNER 1965, HAENEL 1969). Neben den Bakterien beherbergt der Darm auch Hefen. SCHULZE und BATHKE (1977) konnten Hefen nur in geringen Mengen aus dem Magen und Dünndarm von Schweinen aber nicht aus dem Dickdarm isolieren. 4

17 Einleitung und Literaturübersicht Intestinale Barriere Bei allen Säugetieren stellt der Darm die größte Fläche des Körpers dar, an der sich der Organismus mit der Außenwelt auseinandersetzen muss. Um pathogenen und potentiell schädlichen Einflüssen entgegenzuwirken, haben sich im Laufe der Evolution verschiedene Schutzmechanismen entwickelt. Die Gesamtheit dieser Schutzfunktionen im Darm wird als intestinale Barriere bezeichnet. Sie besteht aus den luminalen und epithelialen physiologischen Darmmikroorganismen dem Epithel mit der Mukusschicht und Teilen des darmassoziierten Immunsystems (GALT). B A C D Abb. 1 Intestinale Barriere A =luminale und adhärente, kommensale Mikroorganismen des Darms, B = Mukusschicht, C = Epithelzellschicht, D = GALT Die außerordentliche Bedeutung der kommensalen Mikroorganismen für die intestinale Barriere wird deutlich, wenn keimfrei aufgezogene Tiere, deren Darm keine Mikroorganismen enthält, mit pathogenen Keimen konfrontiert werden. Es genügt dann schon eine geringe Konzentration von Pathogenen, um letale Infektionen zu verursachen. Dabei handelt es sich um Konzentrationen, bei denen konventionell gehaltene Tiere mit intakter Darmbesiedlung nicht oder nur sehr schwach erkranken (NARDI et al. 1989). 5

18 Einleitung und Literaturübersicht 1.2 Probiotika Definition Der Begriff Probiotika wurde 1965 eingeführt (LILLY und STILLWELL 1965). Er ist abgeleitet aus den griechischen Worten pro und bios und bedeutet soviel wie für das Leben. Damit wurde er dem Begriff antibiotisch gegenüber gestellt. LILLY und SPELLWELL (1965) verwendeten den Begriff zur Beschreibung von Substanzen, die von einem Mikroorganismus sezerniert werden und das Wachstum eines anderen stimulieren. Nach und nach setzte sich eine mehr und mehr generalisierte Verwendung des Begriffs durch. PARKER (1974) war der erste, der den Begriff Probiotika in der Weise verwendete, wie er heute benutzt wird. Neben den auf das Wachstum positiv wirkenden Substanzen schloss diese Definition auch Mikroorganismen mit positivem Einfluss auf den Wirt ein. Dabei waren nicht nur Wirkungen in bezug auf die Wachstumsförderung sondern auch die generelle Beeinflussung der intestinalen Flora wichtig. In dem Bestreben, Probiotika zu den in der Definition von Parker eingeschlossenen Antibiotika klarer abzugrenzen, betonten verschiedene Untersucher in den folgenden Jahren die Notwendigkeit der Verwendung lebender Mikroorganismen ( PARKER 1974, HAVENAAR und HUIS IN 'T VELD 1992). Es stand aber immer noch der direkte Einfluss auf die intestinale Mikroflora des Wirtes im Vordergrund (HAVENAAR und HUIS IN 'T VELD 1992). Andere Untersucher vertraten eine generalisiertere Auffassung, in der die Wirkung von Probiotika auf die Gesundheit des Wirtes und die Ernährung berücksichtigt wurde (SALMINEN 1996, SCHAAFSMA 1996). Diese Definition schloss demnach fermentierte Milchprodukte mit ein. SCHRENZENMEIR et al. (2001) kritisierten in diesem Zusammenhang die Verwendung des Begriffs Ernährung. Des Weiteren erschien ihnen die Beschränkung auf Milchprodukte ungenau, weil andere fermentierte Produkte, wie z. B. Sauerkraut und Salami, nicht mit einbezogen wurden. Sie veränderten daraufhin die Definition zur heute noch gültigen und von der WHO anerkannten Version von Probiotika als: Eine Präparation eines Produktes oder ein Produkt, das lebende, definierte Mikroorganismen in ausreichender Zahl enthält, die die Mikroflora (durch Implantation oder Kolonisation) in einem Bereich des Wirtskörpers verändern und dadurch fördernde Gesundheitseffekte auf den Wirt haben. (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001) Diese Definition trägt dem Umstand Rechnung, dass neben Mikroorganismen auch deren 6

19 Einleitung und Literaturübersicht Präparationen, etwa in Form von Medikamenten, verwendet werden. Es wird auf die Wichtigkeit einer ausreichenden Anzahl an Organismen hingewiesen. Die fehlende Beschränkung von Einflüssen auf die inhärente Mikroflora trägt der prophylaktischen Anwendung Rechnung, die heute einen Großteil des probiotischen Einsatzes ausmacht. Zuletzt bezieht sich die aktuelle Definition nicht nur auf den Bereich des Magen-Darm-Trakts, sondern auf den gesamten Gastrointestinaltrakt und andere Körperkompartimente, die eine mikrobiologische Flora beherbergen, wie zum Beispiel die Haut oder der weibliche Genitaltrakt. Probiotika werden von alters her zur Verbesserung der Gesundheit von Mensch und Tier eingesetzt. Schon 76 vor Christus empfahl der römische Historiker Plinius die Anwendung von fermentierten Milchprodukten bei Gastroenteritis (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001). Ende des 19. und Anfang des 20. Jahrhunderts beschäftigten sich immer wieder Wissenschaftler mit der gesundheitsfördernden Wirkung bestimmter Bakterienspezies. Neben prophylaktischen Veränderungen der Zusammensetzung von inhärenten Mikroorganismen (CARRE 1887, MECHNIKOFF 1907, TISSIER 1984) wurde auch die direkte therapeutische Bekämpfung pathogener Bakterien diskutiert (NISSLE 1916). Heute werden Probiotika sowohl in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft als auch in der Humanmedizin und Humanernährung eingesetzt Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft Man unterscheidet zwischen dem Einsatz von probiotischen Keimen in der Fütterung (1) und dem prophylaktischen und therapeutischen Einsatz in der Medizin (2). (1) Der größte Teil der beim Tier verwendeten Probiotika wird in der Nutztierfütterung eingesetzt und unterliegt damit dem Futtermittelgesetz (FMG). Auf diesen Bereich soll hier wegen seiner großen Bedeutung für die Veterinärmedizin und die Landwirtschaft kurz eingegangen werden, obwohl sich die im Folgenden vorgestellten Untersuchungen mit einem Keim beschäftigen, der als Medikament verwendet wird. Nach dem weitgehenden Verbot antibiotischer Leistungsförderer wurde in der Intensivtierhaltung nach neuen Wegen gesucht, diese zu ersetzen, wobei sich Probiotika als Alternative erwiesen. In 7

20 Einleitung und Literaturübersicht der Europäischen Union sind derzeit 21 Probiotikapräparationen als Futterzusatzstoffe für die verschiedenen Nutztierspezies (Schwein, Wiederkäuer, Geflügel und Fische) zugelassen (Europäische Union 2003). Sie enthalten als Mono- oder Kombinationspräparate Keime der Bakteriengattungen Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus und Streptococcus, sowie der Hefe Saccharomyces. Besonders im Schweinefutter finden sich inzwischen immer häufiger Probiotika. Als deren positive Wirkung wird bei Monogastriern wie dem Schwein nicht primär eine Leistungssteigerung durch höhere Mastleistung und bessere Futterverwertung angenommen, sondern die Aufgabe der Probiotika scheint vielmehr in der Aufrechterhaltung einer physiologischen mikrobiellen Darmbesiedlung zu liegen. Diese soll dann sekundär zu einer verbesserten Leistung zur Folge haben (Europäische Union 2000). So führte die Fütterung von Bifidobacterium pseudolongum und Lactobacillus acidophilus an neugeborene Ferkel von der Geburt, über das Absetzen hinaus bis zum 56. Lebenstag zu einer schnelleren Gewichtszunahme, und Bifidobacterium pseudolongum verbesserte zusätzlich die Futterverwertung. Des weiteren senken bestimmte Bifidobakterienspezies die Mortalitätsrate von Saugferkeln bis zum 28. Lebenstag um 20 % (ABE et al. 1995). Für mit Bacillus cereus substituierte Ferkel ist ebenfalls eine Verbesserung der Gewichtszunahme beschrieben (KIRCHGESSNER et al. 1993). Es wundert nicht, dass Probiotika auf dieser Grundlage heute insbesondere im Ferkelstarterfutter zu finden sind. Die Auswirkungen probiotischer Mikroorganismen auf ältere Schweine sind hingegen widersprüchlich. Während ROSEN (1992) kaum Auswirkungen auf die Leistung (<1%) von erwachsenen Tieren festgestellt hat, konnten eine neuere Feldstudie nach Fütterung eines Präparates mit Bacillus lichiniformis Sporen und Bacillus cereus Sporen zeigt, dass sowohl die mittlere tägliche Gewichtszunahme als auch die Futterverwertung bei Mast- und Endmastschweinen deutlich verbessert sind. Dabei ist die tägliche Gewichtszunahme bei wachsenden Mastschweinen bis zu 7,2% höher als bei Kontrolltieren ohne Probiotika. Die Futterverwertung ist mit einer 9,5%igen Erhöhung in der Mast und 5,5%igen Erhöhung in der Endmast besser als die bei Einsatz von antibiotischen Leistungsförderern als rentable angesehenen 5% (ALEXOPOULOS et al. 2004). ALEXOPOULOS et al. (2004) konnten außerdem zeigen, dass die Schlachtkörper der mit Bacillussporen gefütterten Tier in höhere Güteklassen eingeteilt wurden. 8

21 Einleitung und Literaturübersicht (2) Die therapeutische Anwendung von Probiotika in der Veterinärmedizin ist eher gering im Vergleich zur prophylaktischen Anwendung in der Fütterung und der therapeutischen Anwendung in der Humanmedizin. Als Medikamente zugelassene Probiotika unterliegen, anders als die Futtermittelzusatzstoffe, dem Arzneimittelgesetz (AMG) und damit den strengen Richtlinien der Arzneimittelzulassung. Sie werden zur Behandlung von Gastroenteritiden insbesondere bei Jungtieren eingesetzt. Allerdings erfolgt die Verwendung weniger zur Monotherapie als zur Prophylaxe, Substitution- oder Regenerationstherapie (KAHRS 1986, FOX 1988, IBEN und LEIBETSEDER 1989). Beispielsweise wird, um Salmonella typhimurium Infektionen vorzubeugen, ein Gemisch aus Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecium und Salmonellen-Antikörper bei Puten eingesetzt (PROMSOPONE et al. 1998) Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung Probiotika werden traditionsgemäß beim Menschen schon sehr viel länger eingesetzt als beim Tier. Im Zuge der Antibiotikaentdeckung Ende des 19. Jahrhunderts gerieten die Anwendungsmöglichkeiten zum Teil wieder in Vergessenheit, und es wurde nur noch von wenigen Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geforscht. Nicht zuletzt durch das vermehrte Auftreten von Antibiotikaresistenzen in den letzten Jahren, der Häufung von Allergien, sowie der erhöhten Sensibilisierung der Bevölkerung für gesunde Ernährung und durch die wachsende Akzeptanz ganzheitlicher Heilmethoden, erfreuen sich Probiotika wieder wachsender Beliebtheit. Ähnlich wie beim Tier werden probiotische Mikroorganismen beim Menschen häufiger in der Ernährung (1), in Form von Lebensmitteln oder Lebensmittelzusatzstoffen, als in der Therapie (2) von Erkrankungen eingesetzt. Sie unterliegen in diesen Fällen dem Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz (LMBG). Inzwischen beläuft sich der Markt probiotischer Lebensmittel auf einen weltweiten Umsatz von sechs Mil. US$ (ABBOTT 2004). Die Hersteller versprechen dabei eine positive Wirkung auf die Gesundheit und das Immunsystem. (1) Die Verwendung von Nahrungsmitteln mit apathogenen Bakterien, besonders in Form fermentierter Milchprodukte, hat nicht nur in Europa eine lange Tradition. Dem Verzehr von Joghurt oder Sauermilch, bei denen die Beimpfung mit Bakterien ursprünglich nur zur Konservierung erfolgte, wurde mit der Zeit auch mehr und mehr ein gesundheitsfördernder Effekt 9

22 Einleitung und Literaturübersicht nachgesagt. Um diesen noch zu erweitern, setzt man seit dem letzten Jahrhundert diesen Lebensmitteln neben den klassischen Fermentationskulturen vielfach auch probiotische Keime zu. Es handelt sich dabei hauptsächlich um Bakterien der Gattungen Bifidobacterium und Lactobacillus. Leider gibt es kaum evidenzbasierte Studien über den Nutzen von probiotischen Lebensmitteln für die Gesundheit des Verbrauchers. (2) Anders als in der Veterinärmedizin hat die Verwendung probiotischer Keime als Therapeutikum in der Humanmedizin in den letzen Jahren zugenommen. Die Anwendungen sind dabei vielfältig. Allerdings liegen nicht für alle Bereiche gesicherte, prospektive, klinische Studien vor. Gesicherte Untersuchungen gibt es zu infektiösen Diarrhöen bei Kleinkindern (MCFARLAND et al. 1995, VANDERHOOF et al. 1999, SZAJEWSKA et al. 2001, SURAWICZ 2003), der Remmissionserhaltung von Colitis ulcerosa (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999), der Behandlung von Pouchitis (GIONCHETTI et al. 2003) und der Allergievorsorge bei Säuglingen (MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al. 2003). Behandlungserfolge bei akuten Diarrhöen werden durch Probiotika, insbesondere Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Saccharomyces boulardii (SAB), hauptsächlich bei Säuglingen und Kleinkindern erzielt, also in einem Alter, in dem die Darmbarriere noch nicht voll entwickelt ist. Auslöser dieser Diarrhöen sind häufig Rotavirus- und Antibiotika-induzierte Clostridium difficile Infektionen. Prophylaktisch verringern Laktobazillen das Auftreten von Gastroenteritiden durch Rotaviren um 14,5% (SZAJEWSKA et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass nicht etwa die Infektionsrate verringert wird, sondern seltener Krankheitssymptome auftreten (SZAJEWSKA et al. 2001, ROSENFELDT et al. 2002a, 2002b). Die Prävention von antibiotikaassoziierten Diarrhöen wird durch LGG um 18 % reduziert (VANDERHOOF et al. 1999). Ähnliche Ergebnisse werden mit SAB erzielt. Die positiven Effekte zeigen sich bei Einsatz von SAB besonders in der Substitutionstherapie mit zusätzlicher Antibiotikagabe (MCFARLAND et al. 1995, SURAWICZ et al. 2000, SURAWICZ 2003). Bei Erwachsenen sind die Ergebnisse zur positiven Wirkung von Probiotika gegen Durchfällen uneinheitlich. Allerdings senkt die Gabe von SAB die Diarrhöerate bei enteral ernährten Intensivpatienten (BLEICHNER et al. 1997). Die Modulation der mechanischen und immunologischen Darmbarriere durch Probiotika 10

23 Einleitung und Literaturübersicht prädestiniert sie geradezu für den Einsatz bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED). Obwohl man noch kaum etwas über die Wirkungsmechanismen weiß, existieren insbesondere für die Remmissionserhaltung bei Colitis ulcerosa Studien, die dem probiotischen E. coli Stamm Nissle 1917 (EcN) die gleiche Wirksamkeit wie dem standardmäßig verwendeten Mesalazin bescheinigen (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999, KRUIS et al. 2001). Eine andere Studie zeigt Evidenzen, dass auch ein Gemisch aus verschiedenen Laktobazillen- und Bakteroidesspezies (VSL#3) einen positiven Effekt bei der Remmissionserhaltung der Colitis ulcerosa hat (VENTURI et al. 1999). Bei der Remissionserhaltung und Therapie des Morbus Crohn sind die Ergebnisse zur Wirksamkeit von Probiotika widersprüchlich (GUPTA et al. 2000, PRANTERA et al. 2002). Es gibt allerdings Anzeichen, dass Kinder mit mäßig ausgeprägtem Morbus Crohn von der Behandlung mit LGG profitieren (GUPTA et al. 2000). Patienten mit therapierefraktärer Colitis ulcerosa oder Kolonkarzinom wird nach Proktokolektomie ein Pouch angelegt. Eine der häufigsten Komplikationen ist dabei eine rezidivierende Entzündung. Patienten mit chronischer Pouchitis werden unter Anwendung von VSL#3 erfolgreich in Remission gehalten (GIONCHETTI et al. 2000, MIMURA et al. 2004). Außerdem konnte, wenn auch bisher nur für kleine Fallzahlen, gezeigt werden, dass VSL#3 die Inzidenz einer akuten Pouchitis post operationem verringert (GIONCHETTI et al. 2003). Von Allergien sind insbesondere in den Industrieländern große Anteile der Bevölkerung betroffen, und die Inzidenz ist in den letzten Jahren deutlich steigend (KAY 2001a, 2001b). Besonders Kinder und Kleinkinder leiden immer häufiger an verschiedenen Formen allergischer Reaktionen. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere Laktobazillen vor Allergien schützen können. So konnte gezeigt werden, dass LGG und Lactobacillus reuteri klinische Symptome und Laborparameter bei Kindern mit atopischer Dermatitis verbessern (MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al. 2003). Wenn Mütter ante partum und die Säuglinge postnatal bzw. stillenden Mütter mit LGG behandelt wurden, konnte das Auftreten atopischer Ekzeme bei Kindern mit hohem familiärem Allergierisiko halbiert werden (KALLIOMAKI et al. 2001, KALLIOMAKI et al. 2003). Die Prävention von Allergien oder rezidivierenden Infektionen konnte von anderen Untersuchern auch für die Behandlung mit einem apathogenen E. coli bestätigt werden (LODINOVA- ZADNIKOVA et al. 2003). Anzumerken ist, dass die allergieprophylaktische Wirkung nur eintritt, 11

24 Einleitung und Literaturübersicht wenn die Behandlung mit Probiotika in einem Alter erfolgt, in dem sich ein Gleichgewicht in der Darmbesiedlung noch nicht eingestellt hat. Werden die Probiotika erst an Teenager oder beim jungen Erwachsenen gegeben, lässt sich keine positive Wirkung mehr beobachten (HELIN et al. 2002). Außerdem ist die Verwendung lebender Bakterien von entscheidender Bedeutung, da oben genannte Effekte nur mit lebenden, nicht aber mit hitze-inaktivierten Bakterien erzielt werden können (KIRJAVAINEN et al. 2003). Neben den Haupteinsatzbereichen der Probiotika in der Behandlung von Gastroenteritiden und Allergien gibt es auch erste Hinweise auf die Wirksamkeit beim Reizdarmsyndrom vom Diarrhöe- Typ (KIM et al. 2003). Eine positive Beeinflussung der Laktoseintoleranz (SALTZMAN et al. 1999) und der Stahlenenteritis (URBANCSEK et al. 2001) konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Für die Tumorprävention bei kolorektalen Karzinomen und die Cholesterinsenkung sind die Daten widersprüchlich (DE ROOS und KATAN 2000, HIRAYAMA und RAFTER 2000) Wirkungsmechanismen Die in der Literatur beschriebenen Verwendungsweisen von Probiotika legen die Vermutung nahe, dass nur einige wenige Mikroorganismen bei bestimmten Erkrankungen wirksam sind. Ob sich diese Sichtweise auf Dauer wird halten lassen, ist noch unklar, da es für die entsprechenden Studien häufig keine Vergleichsuntersuchungen mit anderen probiotischen Mikroorganismen gibt. Ein allgemein gültiges probiotisches Wirkprinzip erscheint aber schon auf Grund der Unterschiede zwischen den verwendeten probiotischen Spezies als unwahrscheinlich. Wie die vielen unterschiedlichen Ansätze in der Erforschung probiotischer Effekte deutlich machen, ist vielmehr davon auszugehen, dass verschiedene Mechanismen als Grundlage probiotischer Wirksamkeit in Frage kommen. Die Erklärungsversuche für die Effekte von Probiotika fokussieren sich auf zwei Möglichkeiten. Bei der einen handelt es sich um die Wechselwirkung und Beeinflussung der inhärenten Darmmikroorganismen durch Probiotika, bei der zweiten um den Einfluss, den Probiotika auf ihren Wirt, insbesondere auf die Epithelbarriere und das darmassoziierte Immunsystem ausüben. 12

25 Einleitung und Literaturübersicht Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen Das Wechselspiel zwischen pathogenen und fakultativ pathogenen Bakterien auf der einen Seite und physiologischen Darmmikroorganismen und Probiotika auf der anderen Seite wurde am intensivsten bei LGG und SAB untersucht. Die physiologischen Mikroorganismen stellen den am weitesten luminal gelegenen Teil der Darmbarriere dar. Sie schaffen im Normalfall ein stabiles Mikromilieu im Darm, das potentielle Pathogene abwehrt. Unterschiedliche Probiotika können auf verschiedene Weise in dieses Gleichgewicht eingreifen und es positiv beeinflussen. Bifidobacterium bifidum verringert bei Säuglingen den ph-wert im Stuhl und verschlechtert damit die Lebensbedingungen für Pathogene (LANGHENDRIES et al. 1995). Ähnliche Ergebnisse liegen auch für Versuche mit Bifidobacterium longum bei Erwachsenen vor (BENNO und MITSUOKA 1992). Für die Hefe Saccharomyces boulardii ließ sich ein Einfluss auf den Gehalt und die molaren Anteile der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im Dickdarm nachweisen. Wird Clindamycin, ein Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es häufig Antibiotika-assoziierte Diarrhöen auslöst, in einem in vitro Simulationsmodell des Kolonstoffwechsels eingesetzt, sinkt die Gesamt-SCFA- Produktion. Bei gleichzeitiger Gabe von SAB verändert sich die Gesamt-SCFA-Produktion im Vergleich zu Kontrollbedingungen ohne Clindamycin jedoch nicht. Ein Clindamycin-bedingtes Absinken der Butyratkonzentration wird durch SAB allerdings nicht kompensiert (BREVES et al. 2000a). SCFA, insbesondere Butyrat, sind wichtig für die Ernährung und damit die Integrität der Kolonozyten, sowie eine funktionierende Wasser- und Natriumretention aus dem Darmlumen (ROEDIGER 1980). Zusätzlich konnten BREVES et al. (2000) zeigen, dass die Anwesenheit von SAB ein Clindamycin-abhängiges Absinken der mikrobiellen Proteinsynthese verhindert. Laktobazillen sind in der Lage, die Aktivität verschiedener Enzyme im Kot zu verändern. Sie verringern beispielsweise die Aktivität von β-glukuronidase, Nitroreduktase und Glykocholathydrogenase und verändern dadurch wiederum das intestinale Milieu zu Ungunsten von Pathogenen (LING et al. 1994). Bifidobakterien können in vitro unter Neutralisierung freier Radikale Eisen an ihre Zellmembran binden (KOT und BEZKOROVAINY 1999). Sie sind damit in der Lage, das Redoxpotential im Darm zu erniedrigen und gleichzeitig eine Verknappung des für die meisten Pathogene wichtigen 13

26 Einleitung und Literaturübersicht Wachstumsfaktors Eisen zu fördern. Diese Fähigkeit zur Bindung freier Radikale wurde auch bei einigen Laktobazillenstämmen nachgewiesen (STECCHINI et al. 2001). Neben Veränderungen der chemischen Bedingungen im Darmlumen treten Probiotika auch in direkte Wechselwirkung mit anderen Mikroorganismen ihrer Umgebung. Von Laktobazillen weiß man, dass sie in vitro an die gleichen Mannoserezeptoren binden, die auch von pathogenen Stämmen der Spezies E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Pseudomonas und Vibrio cholerae benötigt werden, um sich im Darm zu etablieren (ADLERBERTH et al. 1996). Auch Bifidobakterien adhärieren in vitro an Epithelzellen (BERNET et al. 1993, PEREZ et al. 1998). Wenn Laktobazillen mit Pathogenen um die Bindung an Rezeptoren im Gastrointestinaltrakt konkurrieren, würde demnach eine Erhöhung der Laktobazillenkonzentration den Konkurrenzdruck verstärken. Bei einigen wenigen Lactobazillenstämmen konnte auch in vivo eine Adhäsion nachgewiesen werden ( TANNOCK et al. 1988, NEMCOVA et al. 1997). Bifidobakterien scheinen jedoch nach der bisherigen Datenlage im Darm nicht zu adhärieren (BOUHNIK et al. 1992). Allerdings konnte ein von Bifidobakterien produziertes Protein nachgewiesen werden, das die Anheftung von E. coli verhindert, was eine direkte Konkurrenz der Bakterien um Rezeptoren überflüssig machen würde (FUJIWARA et al. 1997). Zusätzlich sezernieren LGG und probiotische Bifidobakterien auch noch andere Substanzen, die in der Lage sind, durch pathogene Mikroorganismen produzierte Toxine z.b. Aflatoxin B und E. coli Endotoxin, zu binden und somit zu inaktivieren (HASKARD et al. 2000, OATLEY et al. 2000) Wirkungen auf den Wirt Epithel Probiotika Der erste vom Wirt gebildete Anteil der intestinalen Barriere ist die Muzinschicht, die von den Epithelzellen als Schutzfaktor sezerniert wird. Es hat sich gezeigt, dass Probiotika die Bildung und Zusammensetzung der Muzinschicht sowie die Anzahl der muzinproduzierenden Becherzellen beeinflussen können. Von LGG und Lactobacillus plantarum weiß man, dass sie in vitro die mrna-expression von MUC2 und MUC3 induzieren (MACK et al. 1999). MUC2 und MUC3 sind die dominierenden Muzine im Dünn- und Dickdarm des Menschen (CHANG et al. 1994). Es handelt sich hierbei um hochmolekulare Glykoproteine, die von Epithelzellen und Becherzellen zum Schutz vor bakterieller und viraler Anheftung und zur 14

27 Einleitung und Literaturübersicht Bindung proinflammatorischer Moleküle sezerniert werden. Im entzündeten Darm lässt sich dementsprechend auch eine erhöhte Produktion von Muzinen nachweisen. Bei CED-Patienten hingegen ist die Zahl an Becherzellen und damit auch die Menge an sezerniertem Muzin deutlich verringert (MACK et al. 1992), wodurch die Schutzfunktion gegenüber dem Epithel beeinträchtigt ist. Der Verlust dieses Epithelschutzfaktors wird als ein Grund für die Aufrechterhaltung der Entzündung durch die Darmflora bei CED angesehen. SAB und Bacillus cereus Varietas toyoi (B. cer. var. toyoi) führen zu einer Erhöhung der Anzahl von Becherzellen im Dickdarm (BAUM et al. 2002). Es ist also nicht unwahrscheinlich, dass auch weitere probiotische Keime in der Lage sind, durch eine erhöhte Muzinproduktion die Symptome intestinaler Entzündung zu verringern. Neben dem Einfluss auf die Muzinproduktion wirken Probiotika auch direkt auf die Epithelzellen. LGG führt bei der Ratte zu einer erhöhten Mitoserate im Dünndarmepithel und damit zu einer größeren Anzahl an Epithelzellen in den Zotten (BANASAZ et al. 2002). Auch bezüglich der Regeneration des Epithels wurden mit LGG gute Erfolge erzielt. So konnte gezeigt werden, dass LGG durch Blockierung der pro-apoptotischen p38 MAP-Kinase und Produktion eines Akt-Kinaseaktivierenden, und somit anti-apoptotisch wirkenden Faktors, bei Mäusen die zytokininduzierte Apoptose intestinaler Epithelzellen in vitro verhindern kann (YAN und POLK 2002). In einem Milchallergiemodell mit neugeborenen Ratten verringert LGG die Permeabilität des Darmepithels für Antigene. Damit werden die Art und Qualität der Antigenpräsentation gegenüber dem intestinalen Immunsystem durch Veränderung von Dosis und Größe der Antigene beeinflusst. Dies bedingt eine tolerogene Wirkung von LGG (ISOLAURI et al. 1993, GARCIA-LAFUENTE et al. 2001). Eine weitere Möglichkeit zur Beeinflussung des Darmepithels bietet sich für Probiotika durch Veränderung der elektro- und transportphysiologischen Eigenschaften. Prophylaktisch verabreichte Laktobazillen normalisieren einen durch enteropathogene E. coli Bakterien (EPEC) erhöhten Kurzschlussstrom in Epithelzellen einer Kolonzelllinie (CaCo2) (MICHAIL und ABERNATHY 2002). VSL#3 (ein Nahrungsergänzungsmittel für den Menschen mit probiotischen Spezies der Gattungen Lactobacillus, Streptococcus und Bifidobacterium) führt im Tierversuch am Kolonepithel von Mäusen eines Kolitismodells (IL-10 knock-out) im Vergleich mit unbehandelten Tieren ebenfalls zu einer Normalisierung des Kurzschlussstroms. Die campabhängige Chloridsekretion erreicht unter VSL#3-Behandlung Werte, die denen genetisch 15

28 Einleitung und Literaturübersicht unveränderter Tiere entsprechen. Die parazelluläre Wasserleitfähigkeit des Epithels wird unter VSL#3-Gabe sogar unter die Normalwerte genetisch unveränderter Kontrollen gesenkt (MADSEN et al. 2001). In In-vitro-Experimenten wurde von MADSEN et al. (2001) außerdem gezeigt, dass ein von VSL#3-Bakterien produzierter Faktor für die positiven Effekte auf die Epithelpermeabilität verantwortlich ist. Auch epitheliale Transportvorgänge werden durch Probiotika beeinflusst. So stimulieren SAB und B. cer. var. toyoi die Natrium-abhängige Glukoseaufnahme im Jejunum des Schweins (BREVES et al. 2000b). Damit fördern sie nicht nur die Nährstoffversorgung des Wirts, sondern sorgen auch für einen beschleunigten Abtransport von Glukose aus dem Darmlumen und verringern so die Triebkraft für den luminalen Flüssigkeitsaustritt aus dem Gewebe. Ein interessanter Wirkungsansatz lässt sich aus Versuchen mit apathogenen Salmonellen ableiten. In In-vitro-Versuchen mit intestinalen Epithelzellen (T 84) und apathogenen Salmonellen ergab sich eine Hemmung der IL-8 Produktion, unabhängig davon, ob die Zellen unter proinflammatorischen Stimuli standen oder nicht (NEISH et al. 2000). Eine nähere Untersuchung der Mechanismen durch NEISH et al (2000) zeigte eine verringerte Freisetzung des NFκB-Regulators IκB-α nach erfolgter Phosphorylierung und damit eine verminderte Translokation des Transkriptionsfaktors NFκB in den Zellkern. Dies führte zu einer verminderten Transkription proinflammatorischer Zytokine wie IL-8. Von Epithelzellen gebildetes IL-8 spielt eine wichtige Rolle am Beginn und bei der Aufrechterhaltung intestinaler Entzündungen von CED-Patienten (BANKS et al. 2003). Hinweise darauf, dass auch Probiotika über IL-8 das Entzündungsgeschehen im Darm beeinflussen, ergaben die Untersuchungen von JIJON et al. (2004). Sie konnten zeigen, dass VSL#3-DNA unter Induktion mit TNF-α die mrna-expression von IL-8 in HT-29 Zellen zwar erhöht, die Sekretion von IL-8 aber verringert. EcN hingegen induziert, im Gegensatz zu LGG, die IL-8 mrna-expression in intestinalen Epithelzelllinien (LAMMERS et al. 2002). Ob dadurch auch die Sekretion von IL-8 erhöht wird, ist allerdings noch nicht bekannt. Neben dem Einfluss auf IL-8 senkt VSL#3 auch die Produktion des proinflammatorischen Zytokins INF-γ im Darm von IL-10 knock-out Mäusen (JIJON et al. 2004). Die weitaus größte Zahl der genannten Mechanismen ist an die Lebensfähigkeit probiotischer Bakterien gekoppelt. 16

29 Einleitung und Literaturübersicht Immunsystem Probiotika Probiotika beeinflussen sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem. Ein Effekt auf das angeborene Immunsystem zeigt sich insbesondere in einer Beeinflussung der Phagozytose von Makrophagen und Granulozyten. Die orale Gabe verschiedener Laktobazillenstämme fördert die Phagozytoseaktivität von murinen Makrophagen (PERDIGON et al. 1986, PERDIGON et al. 1988). Von Untersuchungen beim Menschen weiß man, dass LGG die Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Blut erhöht (SCHIFFRIN et al. 1995). Werden Makrophagen, die zuvor mit zellfreien Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium longum Extrakten behandelt worden sind, in vitro mit pathogenen Salmonellen infiziert, ist ihre Phagozytose gesteigert (HATCHER und LAMBRECHT 1993). Interessanterweise wird eine bei allergischen Patienten häufig pathologisch erhöhte Phagozytoseaktivität nach Behandlung mit LGG herunterreguliert, wohingegen gesunde Probanden eine Hochregulation erkennen lassen (PELTO et al. 1998). Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die Wirkung eines Probiotikums nicht nur vom Probiotikum selbst, sondern auch von der immunologischen Ausgangssituation des Organismus abhängt. Die Wirkung von Probiotika auf die adaptive humorale Immunantwort wurde besonders im Zusammenhang mit Infektionskrankheiten und anhand von Vakzinationsstudien untersucht. Dabei erhöhen Bifidobakterien und LGG bei Mäusen als Antwort auf Choleratoxingabe die lokale Sekretion von spezifischem IgA im Darm (YASUI et al. 1992). Bei Säuglingen wurde im Darm nach Behandlung mit Bifidobakterien und LGG eine erhöhte IgA Konzentration gegen Rotaviren beobachtet (MAJAMAA et al. 1995). In diesem Zusammenhang zeigte sich nicht nur eine erhöhte lokale IgA-Konzentration, sondern auch eine erhöhte Konzentration von antigenspezifischem IgA im Serum (KAILA et al. 1992). Im Milchallergie-Modell mit Labornagern werden unter der Behandlung mit Bifidobakterien bzw. LGG erhöhte Konzentrationen an β-lactoglobulinspezifischen Antikörpern nachgewiesen (ISOLAURI et al. 1993, TAKAHASHI et al. 1998). Diese Ergebnisse gehen konform mit einer verbesserten Symptomatik der Milch-assoziierten, atopischen Dermatitis bei Kindern mit Milchallergie (MAJAMAA und ISOLAURI 1997). Probiotika können demnach die spezifische Abwehr durch vermehrte Bildung sekretorischer IgA-Antikörper verbessern, ein Mechanismus, den man sich auch bei der Vakzinierung von Kindern zunutze macht (ISOLAURI et al. 1995, FANG et al. 2000). Einige Probiotika sind außerdem in der Lage, Antigene zu degradieren. LGG beispielsweise 17

30 Einleitung und Literaturübersicht verändert Milchkasein derart, dass es bei in vitro Versuchen mit PBMC von Milchallergikern keine Immunreaktion mehr auslöst (SUTAS et al. 1996a, 1996b). Neben Einflüssen auf die angeborene und adaptiv-humorale Immunantwort gibt es auch zahlreiche Hinweise auf eine Beeinflussung adaptiver zellulärer Immunvorgänge durch Probiotika. Experimente haben gezeigt, dass besonders einige Laktobazillenstämme die adaptive, zelluläre Immunantwort in Richtung einer T-Helferzell-1-Antwort (Th1-Antwort) modulieren können. In vitro stimulieren sie dendritische Zellen (DC), PBMC und Monozyten zur Produktion von IFN-γ und IL-12 und fördern so die Bildung von Th1-Zellen (HALLER et al. 2000a, CHRISTENSEN et al. 2002). Andere Arbeiten zeigten, dass sich verschiedene Probiotika unterschiedlich auf die Differenzierung von DCs auswirken können, was je nach verwendetem Probiotikum zu einer Favorisierung verschiedener Th-Zellantworten führen kann (CHRISTENSEN et al. 2002). Einflüsse auf das Zytokinprofil lassen sich in vivo bei Experimenten an IL-10 knock-out Mäusen bestätigen. Im Darm dieser Tiere normalisiert das Probiotikagemisch VSL#3 die pathologisch erhöhte TNF-α und IFN-γ Sekretion. Außerdem wird unter inflammatorischer Stimulation durch Lipopolysaccharid (LPS) sowohl bei Knock-out-Mäusen als auch bei genetisch unveränderten Tieren eine überschießende TNF-α und IFN-γ Sekretion im Darm verhindert. Klinisch kommt es bei IL-10 knock-out- Mäusen zu einer deutlichen Verbesserung der Kolitissymptomatik (MADSEN et al. 2001). Eine andere In-vivo-Studie an Mäusen zeigt, dass nach Gabe von Laktobazillen die Konzentration an IL-10 produzierenden Zellen im Darm steigt. Dies gilt allerdings nicht für alle getesteten Laktobazillenstämme gleichermaßen. IL-10 ist ein Zytokin, dem antitolerogene und inflammationsregulatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. (MAASSEN et al. 2000). Der Einfluss von Probiotika auf die adaptive zelluläre Immunität stellt sich in der Literatur als sehr vielseitig dar und zeigt verschiedene Möglichkeiten für Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen auf. Interessanterweise haben neue Untersuchungen gezeigt, das Probiotika sogar nach subkutaner Applikation Entzündungssymptome bei IL-10 knock-out Mäusen sowie im Kollagen-induzierten Arthritismodell der Maus verbessern und in der Milz die Produktion von immunmodulatorisch wirkendem TGF-β stimulieren (SHEIL et al. 2004). 18