Ansteckende Blutarmut der Einhufer

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1 Amtliche Methodensammlung Ansteckende Blutarmut der Einhufer 1. Charakterisierung der Infektion 2. Untersuchungsmaterial 3. Untersuchungsgang Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

2 1. Charakterisierung der Infektion 1.1 Erreger Die Infektiöse Anämie der Einhufer, auch bezeichnet als Equine infektiöse Anämie (EIA) oder Ansteckende Blutarmut der Einhufer (ABE), ist eine systemische Viruserkrankung der Pferde, Ponys, Esel, Maultiere und Zebras. EIAV, ein Lentivirus aus der Familie der Retroviren, verursacht eine persistierende Infektion und vermehrt sich in Monozyten und Makrophagen. Der Erreger besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom positiver Polarität. Die Glykoproteine der Virushüllmembran zeigen eine kontinuierliche, langsame Veränderung der immunitätsinduzierenden Strukturen (Antigendrift). Das Hauptstrukturprotein p26 des Virusinnenkörpers ist hingegen konserviert und wird daher für die serologische Diagnose der EIA-Infektion herangezogen. Die Krankheit ist in Deutschland anzeigepflichtig und wird durch die Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer (4. Oktober 2010 (BGBl. I S. 1326) reglementiert, die eine Tötung positiver Tiere sowie Sperrung und Untersuchung der betroffenen Bestände und der Kontaktbetriebe vorschreibt. Immunprophylaxe oder Therapie sind nicht verfügbar. Eine Gefährdung des Menschen durch EIA liegt nicht vor. Vorkommen EIA ist weltweit verbreitet und tritt regional gehäuft in Nord- und Südamerika, Afrika, Asien, Australien sowie Süd- und Osteuropa auf. Sie kommt in nord- und mitteleuropäischen Länder nur sporadisch vor. Das Virus ist in Deutschland nicht heimisch, jedoch kommt es immer wieder zu vereinzelten EIA-Ausbrüchen. Epidemiologie Die Übertragung erfolgt in erster Linie mechanisch durch große blutsaugende Insekten wie Pferdebremsen und Wadenstecher (Tabanus, Stomoxys). Diese können bei einer Unterbrechung der Blutmahlzeit virushaltiges Blut an ihren Mundwerkzeugen auf ein benachbartes Tier übertragen. Das EIA-Virus bleibt nur für kurze Zeit infektiös (ca. 30 Minuten), daher kommt eine Übertragung durch Insektenvektoren über größere räumliche Distanzen hinweg nicht vor. EIA-Infektionen treten saisonal gehäuft in den vektorreichen Jahreszeiten (Sommer und Herbst) auf. Infizierte Tiere scheiden Virus mit Körpersekreten wie Speichel, Milch und Sperma aus. Eine Virusübertragung durch Exkrete erfordert einen sehr engen Kontakt der Tiere. Intrauterine Infektionen sind ebenfalls beschrieben. EIAV kann darüber hinaus durch infizierte biologische Produkte wie Blut oder Blutzubereitungen übertragen werden. Eine etwaige Verschleppung durch Injektionskanülen, tierärztliche Instrumente oder Pflegezubehör ist durch Verwendung von Einwegmaterial bzw. durch geeignete Desinfektions- und Hygienemaßnahmen auszuschließen. 2 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

3 1.2 Klinische Symptomatik Infektionen mit Lentiviren, zu denen das EIAV gehört, sind dadurch charakterisiert, dass sie zu persistierenden Infektionen führen. Spezifische Antikörper sind zwei bis drei Wochen (in Ausnahmefällen bis zu 90 Tage) nach der Infektion nachweisbar. Aufgrund der stetigen Veränderung der Antigeneigenschaften des Virus führt die induzierte Immunantwort nicht zur Eliminierung des Erregers. Infizierte Tiere bleiben lebenslang Virusträger und stellen potentielle Infektionsquellen dar. Die Erkrankung zeigt sich in akuter oder chronischer Form mit jeweils vereinzelt tödlichem Verlauf. Die akute Verlaufsform äußert sich in Fieber, Apathie, Schwäche, Ataxie, Ikterus, Tachykardie, Arrhythmie sowie petechialen Blutungen auf Schleimhäuten und Lidbindehäuten sowie insbesondere auf der Zungenunterseite. Die chronische Verlaufsform ist hingegen durch Krankheitsschübe mit rekurrierenden Fieberanfällen, Konditionsverlust, Anämie sowie Ödembildung an Unterbauch und Extremitäten gekennzeichnet. Eine Anämie (Blutarmut) entsteht nach Infektion mit EIAV vorrangig durch immunpathologische Auflösung der roten Blutkörperchen, aber auch durch eine Störung ihrer Neubildung. Pathologische Veränderungen haben im akuten Stadium eher degenerativen (Lebernekrosen, fokale Blutungen) und im chronischen Stadium eher lymphoproliferativen Charakter (Hepatosplenomegalie, Hämosiderose, Lymphadenopathie). In 30 bis 90 % der Fälle treten keine Krankheitssymptome auf, die Tiere bleiben gesund erscheinende Virusträger, sogenannte asymptomatische Carrier. 1.3 Differentialdiagnose Fieber, geringgradiger Ikterus und Nachhandschwäche werden auch bei Babesiose, Ehrlichiose und Leptospirose beobachtet. Ödembildung kann auch im Rahmen von Nephrosen, Nephritiden, Herz-, Kreislaufinsuffizienz und starkem Wurmbefall auftreten. Die immunvermittelte hämolytische Anämie (IMHA) kommt bei Pferden zwar selten vor, ist in Deutschland aber die häufigste Ursache einer hämolytischen Anämie. Akute Infektionsverläufe können dem klinischen Bild der Equinen Viralen Arteritis (EVA) ähneln. Eitrige Herdinfektionen können zu ähnlichen klinischen Befunden führen, wie sie bei dem chronischen Verlauf der EIAV-Infektion zu beobachten sind. 1.4 Diagnostische Indikation Gemäß Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer 1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung Veterinäruntersuchungseinrichtungen der Länder Abklärungsuntersuchungen: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems: Nationales Referenzlabor für EIA am Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, Greifswald-Insel Riems, Tel Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

4 1.6 Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer (Einhufer-Blutarmut- Verordnung) in der letzten Fassung vom 4. Oktober 2010 (BGBl. I S. 1326) 2. Untersuchungsmaterial 2.1 Untersuchungsmaterial für die hämatologische Untersuchung gerinnungsgehemmte Blutprobe (EDTA, Heparin, Citrat) 2.2 Untersuchungsmaterial für den Antikörpernachweis Nativblutprobe, Serum; Plasma ist nicht für alle serologischen Tests geeignet 2.3 Untersuchungsmaterial für den Erregernachweis gerinnungsgehemmte Blutprobe (EDTA [Anzucht!], Heparin, Citrat) Organmaterial (Leber, Milz, Niere) 3. Untersuchungsgang Der Agargel-Immunodiffusionstest (AGID, Coggins-Test) ist der Test der Wahl für die Diagnosestellung. Der EIAV-Antikörper-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) beruht auf einem enzymatischen Nachweis der Antikörper und muss bei einer positiven Reaktion durch den AGID bestätigt werden. Der direkte Nachweis des Virus ist üblicherweise nicht notwendig, da ein serologisch positives Tier das Virus lebenslang beherbergt und es potentiell weiterverbreiten kann. Der Nachweis von viralem Erbmaterial aus Blut und Organmaterial ist mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) möglich. Die Untersuchungen erfolgen nach dem O.I.E. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (2013, Part 2, Section 2.5, Chapter 2.5.4; Stand 2013). Weiterführende Ergänzungen können der AVID-Methodensammlung entnommen werden ( 3.1 Indirekter Erregernachweis Der indirekte Erregererregernachweis (Nachweis von EIAV-spezifischen Antikörpern) ist das Mittel der Wahl zur Diagnose der Infektion, die im empfänglichen Tier lebenslang persistiert. Von Pferden, die sich möglicherweise in einer frühen Infektionsphase befinden, sollte nach 1 bis 2 Wochen erneut eine Blutprobe untersucht werden. Um für Fohlen eine Aussage treffen zu können, muss der Antikörperstatus der Mutterstute bekannt sein. Falls im Blut der Stute Antikörper gegen EIAV nachgewiesen werden, kann der serologi- 4 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

5 sche Befund des Fohlens erst nach dem sechsten Lebensmonat beurteilt werden, da erst nach dieser Periode passiv übertragene maternale Antikörper abgebaut sind. 3.2 Nachweis EIAV spezifischer Antikörper im Agargel-Immunodiffusionstest (AGID, Coggins-Test) In den ersten zwei bis drei Wochen nach der Infektion fällt der Test üblicherweise negativ aus. In Ausnahmefällen können bis zum Auftreten nachweisbarer Antikörper bis zu 90 Tage vergehen. Präzipitierende Antikörper aus dem Testserum diffundieren in einem Agargel gegen ein ebenfalls diffundierendes Antigen (Kapsid/Core p26). Eine entstehende Präzipitationslinie ist dann als positiver Befund zu bewerten, wenn diese Bande mit der Präzipitationsbande des positiven Kontrollserums kommuniziert. Kommerzielle Testkits beinhalten rekombinantes EIAV-Antigen und positives Kontrollserum. Vorbereitung der AGID-Platten 2 g NaOH 9 g H 3 BO 3 1 l destilliertes Wasser zugeben ph auf 8,6±0,1 einstellen Im Puffer eine 1 %-Lösung von Noble-Agar herstellen: Agarlösung in Intervallen von 30 sec für insgesamt 3 min oder solange, bis der Agar gelöst ist, im Mikrowellenherd behandeln. Der erhitzte und vollständig gelöste Agar wird in einer Schichtdicke von etwa 5 mm (z. B. 5 ml Agar pro 3,5 cm-petrischale bzw. 15 ml in eine Petrischale ( 10 cm)) ausgegossen. Platten 1 h bis 12 h bei Raumtemperatur abkühlen lassen, maximal 3 Wochen bei 2 bis 8 C lagern. Rosettenartig 6 periphere und 1 zentrale Vertiefung unmittelbar vor Gebrauch aus dem 2 bis 8 C kalten Agarplatten ausstanzen (siehe Gebrauchsinformation). Agarpfropfen und Flüssigkeit entfernen. Achtung: Ablösen des verbliebenen Agars von der Unterfläche vermeiden! Folgende Stanze hat sich besonders bewährt: Durchmesser der Stanzlöcher 5 mm Abstand der einzelnen Löcher voneinander 3 mm. Durchführung des AGID In das zentrale Loch wird das EIAV-Testantigen pipettiert und in die peripheren Löcher werden alternierend ca. 50 μl Referenzserum (Positivkontrollen) und Feldseren einfüllen. Löcher randvoll plan befüllen. Die beschickte AGID-Platte wird zunächst ca. 15 Minuten nicht bewegt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer bebrütet. Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

6 Ablesung gegen dunklen Hintergrund am 1. und 2. Tag nach Testansatz; Abschließende Beurteilung von negativen Proben frühestens nach 48 Stunden. 3.3 Nachweis EIAV spezifischer Antikörper im Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kommerzielle double sandwich sowie blocking ELISA-Tests sind zum Nachweis von Antikörpern gegen p26 (Kapsid) verfügbar. Aufgrund ihrer höheren Sensitivität und der schnellen Durchführung stellen sie eine sinnvolle Ergänzung zum Agargelimmunodiffusionstest dar, insbesondere bei der Routineuntersuchung größerer Probenzahlen. Ein positives ELISA-Testergebnis muss im AGID verifiziert werden, da in den ELISA- Tests vereinzelt falsch positive Reaktionen auftreten können. Aktuell sind sowohl AGID-Testsysteme als auch ELISA-Tests unterschiedlicher Hersteller in Deutschland zugelassen (siehe Anhang). Zu abklärenden Untersuchungen bei unklaren, schwachen oder unspezifischen Reaktionen können Proben jederzeit dem NRL übermittelt werden Erregernachweis Da das Virus im infizierten Tier persistiert, ist ein positiver serologischer Befund ausreichend für die Diagnosestellung der EIAV-Infektion. 3.4 Virusisolierung Die Virusisolierung ist zeitaufwändig, und die Durchführung ist nicht routinemäßig erfolgreich. EIAV kann in primären Makrophagen- und Leukozytenkulturen angezüchtet werden, in Pferdehaut- und Nierenzelllinien vermehrt sich das Virus deutlich schlechter und die Anzucht misslingt häufig. 3.5 Nachweis von EIAV-Genom mittels Reverser Transkriptase-/ Polymerasekettenreaktion (RT-/PCR) Eine nested Polymerase-Kettenreaktion (n-pcr) kann zum Genomnachweis eingesetzt werden (Nagarajan et al. 2001, J. Virol. Methods, 94, ). Der Nachweis viraler RNA erfolgt aus zellfreiem Material (Plasma, Serum), der Nachweis von integrierter proviraler DNA aus Blutzellen oder Organmaterial. Da die Viruslast sehr niedrig sein kann und die Sequenzen der zirkulierenden EIAV-Stämme auch im gag-bereich (p26) variieren können, ist lediglich ein positiver PCR-Befund als aussagekräftig zu bewerten. Es werden mit Hilfe des TRIZOL-Reagents (Invitrogen) oder eines Säulchen-RNA-Isolierungs-Kits aufgereinigte RNA eingesetzt; zellfreie Proben z. B. QIAamp viral RNA, zellhaltige Proben z. B. RNeasy Mini Qiagen. 6 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

7 Für die DNA-Extraktion hat sich z. B. das High Pure PCR Template Kit von Roche bewährt (Gewebe 1:10 in Lysispuffer verdünnen, homogenisieren z. B. Tissue Lyser, Qiagen). Die genauen Aufreinigungsprotokolle für die unterschiedlichen Materialien finden sich in den entsprechenden Herstelleranweisungen. Es sind 1 bis 5 µl nach der Aufreinigung gewonnene DNA- oder RNA-Suspension in der EIAV- PCR einzusetzen. Wird keine Carrier-RNA eingesetzt, kann eine genaue Messung mittels Photometrie erfolgen (100 bis 500 ng Gesamt-DNA/500 bis 2000 ng Gesamt-RNA). Zur Überprüfung der erfolgreichen Nukleinsäure-Extraktion und Amplifikation wird der Assay mit einem internen Kontrollsystem, z. B. basierend auf dem beta-aktin-gen, gekoppelt. Die Ergebnisse der spezifischen (RT-)PCR gelten nur als valide, wenn die Amplifikationsreaktion in der beta-aktin-pcr erfolgreich ist. Die Amplifikationskontrolle kann selbstverständlich auch über sämtliche etablierte (Real-time) Systeme zum Nachweis von House-Keeper-Sequenzen erfolgen. Um einen Hinweis auf vorkommende Kreuzkontaminationen während der Nukleinsäure-Isolierung zu erhalten, wird bei jeder Extraktion mindestens eine Isolierungskontrolle mitgeführt. Hierbei wird negatives Probenmaterial (z. B. Serum oder Organe) zusammen mit den Feldproben aufgearbeitet. Die Extraktionskontrolle dient somit auch als positive Kontrolle für das beta-aktin-detektionssystem. Werden parallel mehr als 7 Feldproben aufgearbeitet, sollte mehr als eine Extraktionskontrolle mitgeführt werden RT-PCR zum Nachweis von gag (p26) spezifischen Genomabschnitten von EIAV (RT-PCR-Protokoll nach Nagarajan et al./ OIE-Referenztest) Detektion viraler RNA aus Viruspartikeln in zellfreien Matrices wie Serum, Plasma Extraktion z. B. mit dem QIAamp viral RNA kit (Qiagen) mit Carrier-RNA Reaktionsansatz z. B.: SuperScript III One Step RT-PCR Kit oder Systeme mit vergleichbarer Effizienz 2x Puffer Primer EIAf Primer EIAr 12,5 µl 1,0 µl 1,0 µl (enthält 12,5 mm MgCl 2 ) kein weiterer Zusatz von Magnesium (100 pmol/µl Stammlösung) (100 pmol/µl Stammlösung) Endkonzentration je 0,5-1,0µM Enzym Template 0,5 µl 3,0 µl H 2 O ad 25 µl [2 µl bei innerer EIAV gag-pcr und innerer nested RT-PCR] Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

8 PCR-Zyklus 55 C 30 min (RT-Reaktion) 94 C 15 min 40x: 94 C 30 sec 55 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 7 min 12 C halten äußere Primer EIAV gag (p26) P1_f 613: GTA ATT GGG CGC TAA GTC TAG P2_r 1222: CCT CTA ATA AAT CTT GCT GTC Produktgröße: 610 bp 2 µl in den Reaktionsansatz für die innere PCR überführen innere Primer EIAV gag (p26) P3_f 914: GGC TGG AAA CAG AAA CTT TA P5_r 1173: CCA GTG GAG CAT TCG GTA A Produktgröße: 260 bp PCR-Zyklus 95 C 15 min 40x: 94 C 30 sec 55 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 7 min 12 C halten PCR zum Nachweis von integrierten proviralen gag (p26) spezifischen Genomabschnitten von EIAV (PCR-Protokoll nach Nagarajan et al./ OIE-Referenztest) Gesamt-DNA, welche in das zelluläre Genom integrierte provirale DNA enthalten kann, wird mit Hilfe z. B. des Puregene-Kits (Fa. Biozym), DNA Mini Kits (Qiagen) oder des High Pure PCR Template Kits (Roche) isoliert und aufgereinigt. Qualität und Quantität der DNA können im Agarosegel abgeschätzt bzw. im Photometer überprüft werden. Anderenfalls können 1 bis 5 µl (3µl) direkt nach der Aufreinigung gewonnene DNA-Suspension in die EIAV-PCR eingesetzt werden. z. B. Quantitect Multiplex No Rox oder vergleichbare Systeme 2 x Reaktionspuffer Primer f Primer rev A.dest. Template H 2 O 12,5 µl 1,0 µl 1,0 µl 7,5 µl 5 µl ad 25 µl (100 pmol/µl Stammlösung) (100 pmol/µl Stammlösung [2 µl bei innerer EIAV gag-pcr und innerer nested RT-PCR] 8 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

9 Auswertung Die Auswertung erfolgt i. d. R. mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese mit Ethidiumbromid-Färbung. Eine Auswertung erfolgt dann durch den Vergleich der Größe etwaiger Amplifikate mit Positiv-Kontrollen und einem mitgeführten Molekulargewichtsmarker. Extraktions- und Inhibitorkontrolle auf endogenes Pferde-β-Aktin-Gen haktin_f: ATG TGC AAG GCC GGC TTC G haktin_r: TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC Produktgröße: etwa 580 bp PCR-Kits und -Bedingungen wie bei äußerer EIAV (RT-) PCR. Nagarajan MM, Simard C. Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction. J Virol Methods. 2001; 94(1-2): Es können natürlich auch vergleichbare etablierte Real-time Systeme eingesetzt werden wie z. B. im Kapitel Bovines Herpesvirus Typ 1 beschrieben. 3.6 Nachweis von EIAV mittels Tierversuch Virus-Übertragungsversuche mit dem Blut verdächtiger Pferde können in Ausnahmefällen durchgeführt werden. 1 bis 25 ml Vollblut eines infizierten Tieres, in Einzelfällen bis zu 250 ml, werden benötigt, um nach intravenöser Inokulation eine Infektion in einem Empfängertier zu etablieren (Beobachtungszeitraum 45 Tage). Anhang: Zugelassene Testkits AGID Idexx, VMRD, ID Vet ELISA Idexx, ID Vet Testreagenzien werden nach Herstellerangaben gelagert. Referenzseren werden in Aliquots bei -20 C gelagert, um wiederholtes Frieren-Tauen zu vermeiden. Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

10 Literatur Carpenter, S. und Alexandersen, S., (1992). Pathogenesis of equine infectious anemia infection. Seminars in Virology 3, Cheevers, W.P., McGuire, T.C., (1985). Equine infectious anemia virus: immunopathogenesis and persistence. Rev Infect Dis. 7, Coggins, L. und Norcross, N.L., (1970). Immunodiffusion reaction in equine infectious anemia. Cornell Vet. 60, dos Reis, J.K., Melo, L.M., Rezende, M.R., Leite, R.C., (1994). Use of an ELISA test in the eradication of an equine infectious anaemia focus. Trop Anim Health Prod. 26, Frenzel, B., Irmer, S., Kaaden, O.R., Walzel, L., (1981). Vergleichende Untersuchungen zur serologischen Diagnose der infektiösen Anämie der Einhufer. [Comparative investigations on the serological diagnosis of the equine infectious anemia.] Dtsch Tierärztl Wochenschr. 88, Nagarajan, M.M., Simard, C., (2001). Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction. J Virol Methods. 94, Pare, J., Simard, C., (2004). Comparison of commercial enzyme-linked immunosorbent assays and agar gel immunodiffusion tests for the serodiagnosis of equine infectious anemia. Can J Vet Res. 68, Spyrou, V., Papanastassopoulou, M., Psychas, V., Billinis, Ch., Koumbati, M., Vlemmas, J., Koptopoulo,s G., (2003). Equine infectious anemia in mules: virus isolation and pathogenicity studies. Vet Microbiol. 95, Überarbeitet nach Prof. Dr. O.-R. Kaaden Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer 10, D Greifswald Insel Riems, 10 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand