Parasitologische Untersuchungsmethoden

Transkript

1 Institut für Parasitologie Justus-Liebig-Universität Gießen Schubertstraße Gießen Parasitologische Untersuchungsmethoden Dieses Skript ist als kursbegleitende Unterlage für Studierende der Veterinärmedizin an der Justus-Liebig-Universität Gießen bestimmt. Zusammengestellt von D. Wolf & C. Bauer C. Bauer - Inst. f. Parasitologie JLU Gießen November 2016

2 Mikroskopische Diagnostik 1. Allgemeines 1.1. Aufbau eines Durchlichtmikroskops Informatives zu Aufbau und Funktion eines Mikroskops siehe z.b. folgende Webseite: Einstellen von Helligkeit und Kontrast Die Lichtstärke (Helligkeit) wird am Lichtregulator eingestellt. Der Kontrast des Präparats wird durch Öffnen/Schließen der Aperturblende reguliert: Aperturblende offen (linke Hebelstellung) wenig Kontrast für gefärbte Präparate (Blutausstrich, gefärbtes Gewebspräparat). Aperturblende geschlossen (rechte Hebelstellung) viel Kontrast für ungefärbte Präparate (aus Flotations- oder KOH-Verfahren etc.).

3 Mikroskopische Diagnostik 1.3. Vergrößerung Okular (meist 10 x) x Objektiv (2,5 x oder 4 x; 10 x; 40 x; 100 x) Verwendung: 25/40fach ( Lupenvergößerung ) Lungenwurm-, Strongylidenlarven. 100fach Routineuntersuchung (Helmintheneier, Kokzidienoozysten). 400fach Größe abschätzen (siehe 2.), Details; Karbolfuchsin-gefärbter Ausstrich fach (stets mit Immersionsöl) Protozoen in Blutausstrich/Gewebspunktat Mikroskopische Untersuchung eines Präparats Den ganzen Bereich unter dem Deckglas mit o.g. Vergrößerung mäanderförmig durchmustern. Deckglas Objektträger

4 Mikroskopische Diagnostik 2. Mikroskopische Beurteilung von Gebilden aus Kot Helmintheneier und Protozoenstadien in Kotproben nach dem Schema G-F-S-I beschreiben und diagnostizieren: Größe Form Schale Inhalt Größenklasse sehr klein (5 µm) klein (10-50 µm) mittelgroß ( µm) groß ( µm) Beispiele Cryptosporidium-Oozysten Giardia-Zysten; Toxoplasma-, Eimeria-Oozysten Strongyliden-, Askariden-, Trichuris-Eier Fasciola-, Pansenegel-, Nematodirus-Eier Abschätzen der Größe Bei Verwendung der 400fachen Vergrößerung (Okular 10 x, Objektiv 40 x) beträgt der Durchmesser des Blickfelds 400 µm. Bei 400facher Vergrößerung die Größe abschätzen: Wie oft passt das Gebilde längs ins Blickfeld hinein? Beispiel: Gebilde passt ca. 5mal ins Blickfeld. 400 : 5 Größe (Länge) ca. 80 µm. Form rund eiförmig/oval längsoval/elliptisch - zitronenförmig polygonal. symmetrisch asymmetrisch. Schale dick dünn; ununterbrochen - unterbrochen (Deckel, Polpfropf, Mikropyle); glatt rauh; farblos/grau farbig (.z.b. gelblich, braun, rötlich). Inhalt Helminthenei: Eizelle Furchungskugeln Nematodenlarve Onkosphäre Mirazidium. Protozoenstadien: unsporuliert (Sporont) sporuliert (2 oder 4 Sporozysten mit Sporozoiten); Trophozoit.

5 3. Makroskopische und mikroskopische Untersuchung von Gebilden aus Kot oder Haarkleid Zweck Identifikation von Gebilden, die mit dem Kot ausgeschieden (z.b. Proglottiden) oder im Haarkleid (z.b. Milben, Haarlinge) gefunden wurden. Prinzip Einfache makroskopische und/oder mikroskopische Untersuchung. Durchführung 1. Gebilde mit bloßem Auge und/oder unter dem Auflichtmikroskop mit Lupenvergrößerung untersuchen. 2. Falls notwendig, Gebilde in einen Wassertropfen auf Objektträger legen und Deckglas auflegen. Anschließend unter dem Durchlichtmikroskop mit facher Vergrößerung untersuchen.

6 4. Flotationsverfahren Zweck Anreicherungsverfahren für Nematodeneier und Kokzidienoozysten. Prinzip Parasitenstadien mit geringem spezifischen Gewicht flotieren in Lösungen mit höherem spezifischen Gewicht. Durchführung 1. INFEKTIONSGEFAHR! Schutzhandschuhe anziehen. 2. Kotprobe (ca. 1 gehäufter Esslöffel) mit etwas gesättigter Kochsalz-Lösung (spezifisches Gewicht = 1,2) in einem Becher zu einer Suspension verrühren. 3. Suspension durch Teesieb in einen anderen Becher gießen; Siebrückstand mit gesättigter Kochsalz-Lösung (mit Druck) auswaschen bis Becher etwa zur Hälfte gefüllt ist. 4. Ca. 30 min stehen lassen. 5. Von der Oberfläche der Suspension mit Drahtöse 2-3 Tropfen abnehmen (Öse nicht eintauchen!), diese auf Objektträger verbringen und Deckglas auflegen. 6. Gesamtes Deckglas mit 100facher Vergrößerung bei geschlossener Aperturblende (siehe 1.2.) durchmustern; verdächtige Gebilde mit 400facher Vergrößerung untersuchen und dabei Größe abschätzen (siehe 2.1.).

7 5. Sedimentationsverfahren (nach Benedek) Zweck Anreicherungsverfahren für Trematodeneier (Fasciola-, Paramphistomum-Eier) u.a. Prinzip Parasitenstadien mit hohem spezifischen Gewicht sedimentieren in Wasser schneller als Kotpartikel. Durchführung 1. INFEKTIONSGEFAHR! Handschuhe anziehen. 2. Kotprobe (ca. 1 gehäufter Esslöffel) mit etwas Wasser in einem Becher zu einer Suspension verrühren. 3. Suspension durch Teesieb in einen anderen Becher gießen, Siebrückstand mit 4. Wasser auswaschen bis Becher gefüllt ist. 5. Genau 3 min (Uhr!) zur Sedimentation stehen lassen, danach Überstand abgießen. 3 min 6. Becher erneut mit Wasser auffüllen und stehen lassen. 7. Schritte 5 und 6 eventuell noch einmal wiederholen bis die Flüssigkeit wässrigklar ist. 8. Sediment in Petrischale überführen und mit Lupenvergrößerung durchmustern.

8 6. Trichterauswanderverfahren (nach Baermann) Zweck Anreicherungsverfahren für Lungenwurm-/Strongylidenlarven. Prinzip Nematodenlarven wandern aus dem Kot ins Wasser aus und sedimentieren aufgrund ihrer Schwimmunfähigkeit. Durchführung 1. Kotprobe (1-2 gehäufte Esslöffel) in Gaze einhüllen und auf einem dünnmaschigen Sieb in einen mit Wasser gefüllten Baermann-Trichter hängen. 2. Mindestens 12 h (über Nacht) bei Raumtemperatur stehen lassen. 3. Danach Schlauchklemme vorsichtig öffnen und die ersten 2-3 Tropfen auf einem Objektträger auffangen und Deckglas auflegen. 4. Gesamtes Deckglas mit Lupenvergrößerung durchmustern.

9 7. Karbolfuchsin-gefärbter Kotausstrich (nach Heine) Zweck Direktnachweis (keine Anreicherung!) von Cryptosporidium-Oozysten. Prinzip Cryptosporidium-Oozysten (ca. 5 µm!) färben sich kaum oder nur langsam an und heben sich vom rot-violetten Hintergrund als runde, weißlich-funkelnde Strukturen (bei starker Oozystenausscheidung: Sternenhimmel ) ab. Durchführung 1. INFEKTIONSGEFAHR! Schutzhandschuhe anziehen. 2. Eine sehr geringe Kotmenge (1 kleiner Tropfen = kleiner als Stecknadelkopf) auf einen entfetteten Objektträger geben. 3. Mit Pasteurpipette gleichgroße Menge Ziehl-Neelsen-Karbolfuchsin-Farblösung (Merck no ), hinzugeben, mit Kot verrühren und ausstreichen....

10 Präparat liegen lassen bis Oberfläche getrocknet ist ( stumpfes Aussehen ). 5. Einen Tropfen Immersionsöl direkt auf den getrockneten (!) Kotausstrich geben. 6. Deckglas direkt auf (!) Öltropfen auflegen. 7. Gesamtes Deckglas mit 400facher Vergößerung (nicht 1.000fach) bei geöffneter Aperturblende (siehe 1.2.) durchmustern.

11 8. Kalilauge-Verfahren Zweck Anreicherungsverfahren für Räudemilben. Prinzip Durch Kalilauge (10 %) werden Schuppen und Hautteile aufgelöst, dagegen bleibt der Chitinpanzer von Arthropoden erhalten. Durchführung 1. Hautgeschabsel in feuerfestes (!) Reagenzglas (Duran -Glas) geben. 2. VERÄTZUNGSGEFAHR! Schutzbrille aufsetzen, Schutzhandschuhe anziehen! 3. Mit 10%iger Kalilauge vorsichtig kurz aufkochen (Siedeverzug!) min sedimentieren lassen. 5. Überstand dekantieren, Sediment mit Pasteurpipette auf Objektträger überführen und Deckglas auflegen. 6. Gesamtes Decklgas mit 100facher Vergrößerung bei geschlossener Aperturblende (siehe 1.2.) durchmustern.

12 Literaturhinweise 9. Literaturhinweise Informationen über weitere in der Parasitologie gebräuchliche Untersuchungsmethoden sowie über die Morphologie parasitärer Gebilde sind u.a. in folgenden Büchern zu finden: Deplazes, Eckert, Samson-Himmelstjerna & Deplazes (2013): Lehrbuch der Parasitologie für die Veterinärmedizin. Enke Stuttgart, 3. Auflage, S Bauer (2006): Untersuchungsmethoden. In: Schnieder (Hrsg.): Veterinärmedizinische Parasitologie. Parey Stuttgart, 6. Auflage, S Schmäschke (2014): Die koproskopische Diagnostik von Endoparasiten in der Veterinärmedizin. Schlütersche Hannover, S Von der ESCCAP-Homepage ( kann u.a. folgendes Informationsblatt kostenlos abgerufen werden: ESCCAP-Diagnostik-Leitfaden Helminthen Hund und Katze.