4. Materialien und Methoden

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1 4. Materialien und Methoden 4.1. DNA- Isolierung Einleitung Die Isolierung und Reinigung von DNA spielt in den meisten molekularbiologischen Techniken eine wichtige Rolle. Man kann die Isolationstechniken grundsätzlich in zwei Kategorien einteilen. Bei der ersten Methode steht die Extraktion von rekombinanter DNA, wie zum Beispiel Plasmiden oder Bakteriophagen aus ihrer Wirtszelle im Vordergrund. Diese Technik liefert die Basis zu jedem Klonierungsexperiment. Die zweite Methode inkludiert die Isolierung von chromosomaler oder genomischer DNA aus Pro- oder Eukaryonten. Diese Technik hat viele Experimente wie die Untersuchung komplexer Genome oder die Erstellung von DNA-Bibliotheken vieler verschiedener Spezies erleichtert Durchführung In dieser Arbeit wurde DNA aus Fleisch von folgenden Tieren isoliert: Tab. 4-1.: Verwendete Spezies zur DNA-Isolierung Rind (Bos taurus) Leber und Muskelgewebe Schwein (Sus scrofa) Leber und Muskelgewebe Schaf (Ovis aries) Leber und Muskelgewebe Pferd (Equus caballus) Leber und Muskelgewebe Huhn (Gallus gallus) Muskelgewebe Truthahn (Meleagris gallopavo) Muskelgewebe Strauß (Struthio camelus) Muskelgewebe Hausgans (Anser anser) Muskelgewebe Ente (Anas sp.) Muskelgewebe Die DNA- Isolierung erfolgte mit dem Wizard DNA-Clean-up System von Promega. Einwaage von 100 bzw. 200mg Fleisch in 1,5ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße Zugabe von 860µl Extraktionspuffer (TNE) 100µl Guanidiniumhydrochlorid (5M) 40µl Proteinase K (20mg/ml) Inkubation über Nacht im Thermomixer bei 60 C und 450 rpm (100mg Einwaage) bzw. 900 rpm (200mg Einwaage) am darauffolgenden Tag die Proben auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen 22

2 Zentrifugation 10min bei RT und rpm 500µl des Überstandes mit 5µl RNase-A (10mg/ml) versetzen und 10min bei 60 C inkubieren Bei diesem Schritt wird versucht, alle RNAs zu zerstören, die die anschließende Weiterverarbeitung der DNA stören könnten. 1ml Wizard DNA Clean-up Resin zufügen und vorsichtig mischen Säulchen und Aufsatz zusammenstecken und an die Vakuumpumpe anschließen Proben auf die Säulchen auftragen und mittels Vakuum absaugen Durch das Zugeben von Wizard DNA Clean-up Resin bindet die DNA an dieses Harz. Nachwaschen mit 2ml 80% Isopropanol Trocknen der Membranen für 5 min bei RT Die Elution erfolgt mit je 50µl 1xTE (70 C) 1min inkubieren 1min bei RT und rpm zentrifugieren Anschließend kann die DNA über eine relativ lange Zeit bei 20 C stabil gelagert werden oder direkt in PCR oder andere Experimente eingesetzt werden. Meistens wird vor dem Weiterverarbeiten eine Konzentrationsbestimmung der DNA gemacht. Bei Isolierung von DNA aus homogenisierten Wurstproben, wurde nach der Inkubation über Nacht jede Probe mit dem gleichen Volumen an Chloroform ausgeschüttelt und anschließend für 10min bei RT und rpm zentrifugiert. Der Überstand wird abgehoben und laut Vorschrift weiterverarbeitet DNA-Konzentrationsbestimmung Um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse aus PCR und Real-Time PCR zu erhalten, ist es sinnvoll, die Konzentration der isolierten DNA vorher zu bestimmen. Dies kann auf unterschiedliche Art passieren. In dieser Arbeit wurde von zwei Methoden Gebrauch gemacht Photometrische Konzentrationsbestimmung Die Messung erfolgt in Quarzküvetten. Das Meßvolumen beträgt 100µl verdünnte DNA- Lösung. Wasser dient als Referenz. Die in 1xTE ph 8 aufgenommene DNA wird mit Wasser 1:20 verdünnt, indem man 5µl DNA-Lösung zu 95µl vorgelegtes Wasser gibt und bei 280nm und 260nm vermißt. Das Verhältnis OD 260/280nm sollte zwischen 1,7 und 1,9 liegen, um auf das Vorhandensein von reiner DNA schließen zu können. 23

3 Quantifizierung von dsdna mit PicoGreen Quantitation Reagent and Kits Das PicoGreen dsdna Quantitation Reagent ist ein hochsensitiver Fluoreszenzfarbstoff, um doppelsträngige DNA in Lösung zu quantifizieren. Der Nachweis und die Quantifizierung von geringen DNA-Mengen ist für eine Vielzahl von molekularbiologischen Methoden wichtig. Diese Methoden inkludieren Standardtechniken wie cdna-synthese zur Erstellung von Bibliotheken oder diagnostische Nachweisverfahren. Dieses Versuchprotokoll wurde speziell dafür entwickelt, den Einfluß von RNA oder einzelsträngiger DNA auf das Meßergebnis zu minimieren. Das PicoGreen dsdna Quantitation Reagent wird 1:200 in 1xTE ph 7,5 verdünnt und unter Lichtabschluß auf Eis aufbewahrt. Der PicoGreen Lambda-DNA Standard (100µg/ml) wird ebenfalls in 1xTE ph 7,5 auf folgende Konzentrationen verdünnt: 1000ng/ml 750 ng/ml 500 ng/ml 250 ng/ml 100 ng/ml 50 ng/ml Zusätzlich wurde eine weitere Lambda-DNA (λ DNA Hind III Marker; 500µg/ml) als Standard in den gleichen Konzentrationsabstufungen verwendet. Um verschiedene DNA-Standards zu vergleichen und auch die Reproduzierbarkeit zu überprüfen, wurde auch ein Standard aus Lachssperma-DNA hergestellt (siehe unten) und in den gleichen Konzentrationen wie auch die Lambda-Standards in die Messung eingesetzt. Die DNA-Proben werden laut den photometrisch vermessenen Konzentrationen auf 400ng/ml mit 1xTE ph 7,5 verdünnt. Die Messung erfolgt in Mikrotiterplatten mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. Es werden jeweils 100µl pro Probe vorgelegt, wobei bei den Standards Doppelbestimmungen durchgeführt werden. Da der Farbstoff lichtempfindlich ist und nicht länger als 5 Minuten mit der Probe inkubiert werden soll, gibt man kurz vor der Messung je 100µl in jedes Reaktionsgefäß zu. Weiters werden mindestens 4 NTCs aus 1x TE bereitet. Vor der Messung wird die Mikrotiterplatte mit einem Optical Adhesive Cover abgedeckt. Der Plate Read erfolgt als Post-PCR-Read bei 5, 10 und 25 ms ohne den Referenzfarbstoff Rox. Anschließend werden über die Rn-Werte anhand der Standardkurven die Konzentrationen der einzelnen DNA-Proben berechnet. Herstellung eines Standards zur Quantifizierung mit PicoGreen Quantitation Reagent Kit aus Lachs-Sperma-DNA Lyophilisierte Lachs-Sperma-DNA wird eingewogen und mit 1xTE ph 7,5 auf eine Konzentration von 500µg/ml gebracht. Anschließend wird die Lösung mit dem gleichen Volumen an Chloroform:Phenol:Isoamylalkohol ausgeschüttelt und für 15 Sekunden bei RT und rpm (Biofuge Heraeus) zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit einer Pasteurpipette abgezogen und nochmals mit Chloroform:Phenol:Isoamylalkohol 49,5:49,5:1 ausgeschüttelt. Nach nochmaliger Zentrifugation für 15 Sekunden bei RT und rpm wird die wässrige Phase abgezogen und mit dem gleichen Volumen Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Phase enthält die DNA. Sie wird wieder abgezogen und anschließend photometrisch vermessen. 24

4 4.3. Durchführung einer PCR Die PCR-Ansätze werden in einer sterilen Werkbank pipettiert, um Kontaminationen durch Fremd-DNA vorzubeugen. Die Reaktionen selber finden in einem Thermocycler statt, der den Temperaturwechsel, der für das Funktionieren der PCR notwendig ist, gewährleistet. Da es bei der Bereitung jedes einzelnen Ansatzes durch die sehr kleinen Volumina zu Ungenauigkeiten kommen kann, wird ein Mastermix bereitet. Dieser enthält alle Reaktionskomponenten, die in jeden Ansatz in gleicher Konzentration eingesetzt werden sollen. Er ist abhängig von der Anzahl der Reaktionen und enthält zusätzlich 5-10% Reserve, um Pipettierungenauigkeiten auszugleichen. Ein Mastermix wird wie folgt pipettiert. Die Angaben beziehen sich auf einen 25µl- Ansatz und stellen damit die Reagenzien für eine Reaktion dar. 15,4µl Wasser 2,5µl 10x PCR Gold Buffer (ohne MgCl 2 ) 2µl dntp (2,5mM) 1µl Forward-Primer (5µM) 1µl Reverse-Primer (5µM) 2µl MgCl 2 (25mM) 0,1µl Ampli Taq Gold TM Polymerase (5U/µl) Der dntp-mix wird aus gleichen Teilen an 10mM datp, 10mM dctp, 10mM dgtp und 20mM dutp bereitet. Der Mastermix zu je 24 µl wird auf die vorbereiteten PCR-Reaktionsgefäße (Reaction tubes, Micro Amp, PE) aufgeteilt und je 1µl Template-DNA zugemischt. Anschließend werden die Ansätze verschlossen (Caps, Micro Amp, PE). Die Reaktionsgefäße werden in den Thermocycler gestellt. Das gewählte Temperaturprofil sieht folgendermaßen aus: Tab. 4-2.: Temperaturprofil einer PCR konst. T 3-Temperaturzyklus konst. T konst. T 5 min 95 C 30 s 95 C 30 s AT 1 min 30 s 72 C 7 min 72 C 4 C Zuerst erfolgt die Denaturierung der Ausgangs-DNA, anschließend die Aktivierung der hitzestabilen AmpliTaq Gold Polymerase und dann das Hybridisieren der Primer an die beiden komplementären DNA-Stränge. Dies geschieht bei der sogenannten Annealing Temperatur (AT), die von Primer zu Primer verschieden sind. In den meisten Fällen bewegen sich diese Werte zwischen 52 C und 62 C. Nach der Zyklusphase wird durch die konstante Temperatur bei 72 C sichergestellt, daß die Polymerase die Amplifikation vervollständigen kann. Anschließender Temperaturabfall auf 4 C inaktiviert die Polymerase. Durch die niedrige Temperatur wird jegliche weitere Reaktion in den PCR-Ansätzen verhindert. Die Anzahl der Zyklen bewegt sich zwischen 30 und 45 und ist abhängig von der Startkopienzahl. Meistens werden die Reaktionen mit 45 Zyklen gemacht, da eine möglichst große Ausbeute des PCR-Produkts im Vordergrund steht und das mögliche Aufscheinen von unspezifischen Produkten in Kauf genommen wird. 25

5 4.4. Optimierung einer PCR Die Optimierung einer PCR ist in vielen Fällen notwendig, um die höchste Produktausbeute zu erhalten. Sie umfaßt die Variation der Primerkonzentration, der MgCl 2 - Konzentration, eventuell der Zyklenzahl und der Hybridisierungs-Temperatur der Primer. Primerkonzentration: Die optimale Primerkonzentration muß zumeist experimentell ermittelt werden. Als Ausgangskonzentration wird 0,2µM Forward- bzw. Reverse-Primer verwendet. Zu geringe Primerkonzentrationen können zu wenig oder gar keine PCR-Produkte ergeben, während zu hohe Konzentrationen in der Amplifikation unspezifischer Produkte münden kann. MgCl 2 - Konzentration: Die optimale Konzentration muß meistens ebenfalls durch Experimente erhoben werden, aber als Ausgangswert wird 2mM MgCl 2 verwendet. Zu hohe oder zu niedrige MgCl 2 Konzentrationen können oft Schuld daran sein, daß es zu keinem erkennbaren Produkt kommt oder nur undefinierbare Banden erscheinen. Der Arbeitsbereich der MgCl 2 - Konzentration liegt zwischen 1,5mM und 2,5mM MgCl 2. Die Zykluszahl: Um spezifische PCR-Produkte zu erhalten, die eine Sequenzierung zulassen, wird eine Reaktion mit 45 Zyklen empfohlen. Generell hängt die Zyklenzahl von der Ausgangskopienzahl ab. Hybridisierungs-Temperatur (Annealing): Höhere Temperaturen ergeben meistens höhere Spezifität und bessere Produktausbeute. Durch die Software Primer Express ist es zwar möglich, die Schmelztemperatur abzuschätzen, doch die Hybridisierungstemperatur der Primer muß erst experimentell erprobt werden. Als Richtlinie kann man annehmen, daß sie um etwa 5 C unter der errechneten Schmelztemperatur liegt. Erhält man auch nach mehreren Variationen der Hybridisierungstemperatur keine eindeutigen PCR-Produkte, so kann eine sogenannte Touchdown-PCR Abhilfe schaffen. Bei der Touchdown-PCR kann man einen bestimmten Temperaturbereich wählen, in dem die Temperatur pro Zyklus um 0,5 C gesenkt wird. Tab. 4-3.: Temperaturprofil einer Touchdown-PCR konst.t 3-Temperaturzyklus I 3-Temperaturzyklus II konst.t 10min 95 C 15 s 95 C 30 s * 1min 30 s 72 C 15 s 95 C 30 s AT 1min 30 s 72 C 4 C *... Die Hybridisierungstemperatur wird pro Zyklus (I) um 0,5 C gesenkt. Das Charakteristikum der Touchdown-PCR liegt darin, daß sie aus zwei Temperaturzyklen besteht. Der ersten Phase bei konstanter Temperatur folgt ein Zyklus, der bei der höchsten gewählten Hybridisierungstemperatur der Primer (*) beginnt und dann pro Zyklus die Temperatur um 0,5 C senkt. Die Anzahl der Zyklen wird so gewählt, daß man den gewünschten Temperaturbereich abdeckt. Bsp.: 20 Zyklen von 62 bis 52 C. 26

6 Anschließend folgen noch 30 Zyklen auf der zuletzt erreichten Hybridisierungstemperatur (AT), um die Extension zu vervollständigen und damit die Ausbeute an spezifischen Produkten zu erhöhen. Am Schluß steht wieder der Temperaturabfall auf 4 C. Die Auswertungen der Polymerase-Kettenreaktionen erfolgen mittels Agarosegelelektrophorese Agarosegelelektrophorese Ein zweiprozentiges Gel wird für den Nachweis der PCR-Produkte verwendet. Es wird dabei die nötige Menge an Agarose eingewogen und mit dem entsprechenden Volumen an 1xTAE versetzt, in der Mikrowelle aufgeschmolzen und mit Ethidiumbromid versehen. Ist die Agarose handwarm abgekühlt, kann man das Gel in einer geeigneten Kammer gießen. Sobald das Gel auspolymerisiert ist, entfernt man den Kamm, überschichtet mit 1xTAE- Puffer und kann die Proben, versehen mit Stoplösung, auftragen. Um einen Größen- und auch Konzentrationsvergleich anstellen zu können, wird immer ein Molekulargewichtsstandard mitaufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 5-10 V/cm durchgeführt. Anschließend wird das Gel unter UV-Licht fotographiert und ausgewertet DNA-Extraktion aus Agarosegelen Hat man ein spezifisches PCR-Produkt erhalten, so kann es aus dem Agarosegel extrahiert werden, um weiterverarbeitet zu werden (Sequenzierung). Dazu wird der gesamte PCR-Ansatz auf das Agarosegel aufgetragen und die gewünschten PCR-Produkte unter UV-Licht so nahe wie möglich an der Bande aus dem Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten. Zur DNA-Extraktion werden zwei Kits verwendet GenELUTE TM Agarose Spin Column-Kit Die GenElute -Agarose-Säulchen werden auf Eppendorf Reaktionsgefäße gesteckt und mit je 100µl 1x TE 5 Sekunden bei RT und rpm in der Biofuge pico von Heraeus zentrifugiert. Das Zentrifugat wird verworfen. Anschließend wird das Agarosegelstück auf die Membran im Säulchen aufgebracht. Das Säulchen wird auf ein neues Eppendorf Reaktionsgefäß gesteckt. Dann wird für 10 Minuten bei rpm (Biofuge pico) zentrifugiert. Die DNA befindet sich im Elektrophoresepuffer. Das Säulchen stellt einen Filter dar, der den Durchtritt der DNA zuläßt, aber die Agarose bei der Zentrifugation zurückhält. Man kann nun die Konzentration bestimmen und die DNA anschließend weiterverarbeiten. 27

7 QIAquick Gel Extraction Kit Die ausgeschnittene Bande wird in einem Eppendorf Reaktionsgefäß abgewogen. Puffer QG wird zugegeben und für 10 Minuten bei 50 C inkubiert. Sobald das Agarosestück aufgeschmolzen ist, wird Isopropanol zugesetzt und die Lösung auf ein QIAquick Säulchen aufgetragen. Anschließend wird 1 Minute bei RT und rpm (Biofuge pico, Heraeus) zentrifugiert, das Zentrifugat verworfen und Puffer QG zum Entfernen möglicher restlicher Agarose zugesetzt. Es folgt eine nochmalige Zentrifugation für 1 Minute bei RT und rpm (Biofuge pico, Heraeus). Anschließend wird mit Puffer PE gewaschen, 1 Minute bei RT und rpm zentrifugiert und das Säulchen auf ein frisches Eppendorf Reaktionsgefäß aufgesetzt. Die DNA wird mit Wasser eluiert. Das Prinzip dieses Kits liegt in der Bindung der DNA an die Matrix in der Membran des Säulchens und in der abschließenden Eluierung. Nun kann die Konzentration der eluierten PCR-Produkte bestimmt werden. Detaillierte Protokolle sind im Anhang zu finden Tüpfeln von PCR-Produkten Um die Konzentrationen von DNA und im speziellen von PCR-Produkten abschätzen zu können, verwendet man den Tüpfel-Test mit Ethidiumbromid. Diese Methode stellt eine rasche und relativ simple Variante der DNA-Konzentrationsmessung dar. Dabei wird Ethidiumbromid (10mg/ml) mit Wasser 1: verdünnt. Diese Lösung kann man bei 4 C im Dunkeln einige Wochen gut lagern. Als Standard wird λ DNA Hind III Marker (Konz.: 500µg/ml) in 1xTE in den Konzentrationen 100 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl und 6,25 ng/µl verwendet. Auf dem UV-Schirm auf einer Plastikfolie werden anschließend pro Probe je 10 µl Ethidiumbromid-Lösung und 2 µl DNA-Lösung pipettiert und gut gemischt. Ein Blindwert in Form von Ethidiumbromid-Lösung ohne Zusatz von DNA wird erstellt, um den Hintergrund zu bestimmen. Anschließend erfolgt die Auswertung im UV-Licht. Durch den Vergleich der Intensitäten der Standards mit den einzelnen Proben kann die Konzentration der DNA abgeschätzt werden. Die so ermittelten Konzentration werden in der DNA-Sequenzierung verwendet. 28

8 4.8. Durchführung einer Real-Time PCR Die Ansätze werden in der sterilen Werkbank bereitet, um mögliche Kontaminationen aus der Umgebung zu verhindern. Die Reaktionen erfolgen in Mikrotiterplatten. Man bereitet einen Mastermix aus folgenden Komponenten. Die Angaben beziehen sich auf einen 50µl-Ansatz und sind damit für eine Doppelreaktion á 25µl geeignet. 16µl Wasser 5µl TaqMan Buffer A 11µl Magnesiumchlorid (25mM) 1,5µl datp (10mM) 1,5µl dctp (10mM) 1,5µl dgtp (10mM) 1,5µl dutp (20mM) 3µl Forward-Primer (5µM) 3µl Reverse-Primer (5µM) 1µl Sonde (5µM) 0,25µl Ampli Taq Gold TM Polymerase (5U/µl) Trotz der Tatsache, daß die Ampli Taq Gold TM Polymerase bei Raumtemperatur inaktiv ist, wird auf Eis gearbeitet oder zumindestens die Reagenzien werden auf Eis gehalten. Der Mastermix zu je 45µl wird auf vorbereitete Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5ml) aufgeteilt. Anschließend wird jeder Ansatz mit 5µl der entsprechenden DNA versetzt, vorsichtig gemischt und in die Mikrotiterplatte pipettiert. Um Meßungenauigkeiten zu bestimmen, werden Doppelbestimmungen durchgeführt, indem der 50µl-Ansatz mit zugesetzter DNA zu je 25µl aufteilt wird. Die Platte wird mit Optical Caps MicroAmp oder mit einer Folie der Optical Adhesive Covers verschlossen. Bei Verwendung der Optical Caps MicroAmp, die jeweils eine senkrechte Reihe der Platte verschließen können, ist besonders darauf zu achten, daß sie möglichst fest und waagrecht auf die Platte gedrückt werden. Abb. 4-1.: Verschließen einer Mikrotiterplatte mit den Optical Caps MicroAmp 29

9 Die Folie hingegen bietet den Vorteil, daß man sie wesentlich schneller auf die Platte aufbringen kann, jedoch sollte sie nur verwendet werden, wenn die ganze Platte befüllt ist. Nur teilweise verwendete Platten können nach Bestrahlung mit UV-Licht für etwa 30 Minuten wiederverwendet werden. Beim Aufbringen der Folie ist zu beachten, daß sie alle Seitenränder der Platte dicht verschließt. Das Abdeckpapier wird von der Folie abgezogen und mit dem Applikator auf die Mikrotiterplatte aufgebracht und glattgestrichen. Anschließend wird die Platte in den ABI PRISM 7700 Sequence Detection System gestellt und das Programm in der entsprechenden Software (Sequence Detection System 1.3.6) gestartet. Werden die Optical Adhesive Covers verwendet, muß vor dem Programmstart noch das sogenannte Compression Pad auf die Mikrotiterplatte gelegt werden. Dieses stellt sicher, daß der Heizdeckel des Thermocyclers direkt mit der Oberfläche der Mikrotiterplatte in Kontakt steht. Compression Pad Abb. 4-2.: Mikrotiterplatte im Heizblock des ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Vor dem Starten des ABI PRISM 7700 Sequence Detection System werden einige Voreinstellungen getätigt. Das Volumen der Probe beträgt 25µl. Die Real-Time PCR wird mit 45 Zyklen gestartet, wobei ein Zyklus aus 15 Sekunden bei 95 C und anschließend 1 Minute bei 60 C besteht. Vor der Zyklusphase ist noch ein konstanter Temperaturschritt für 10 Minuten bei 95 C eingebaut. Abb. 4-3.: Temperaturprofil einer Real-Time PCR 30

10 Da keine Uracil-N-Glycosylase zu den Ansätzen zugesetzt wird, kann der erste voreingestellte Schritt für 2 Minuten bei 50 C gelöscht werden. Die Fluoreszenzdaten werden nur während der eigentlichen PCR gesammelt und aufgezeichnet. Die Laufzeit einer Real-Time PCR beträgt somit 2 Stunden und 7 Minuten Optimierung der Real-Time PCR In dieser Arbeit wird vor allem Augenmerk auf die Variation von Primerkonzentrationen gerichtet. Weiters ist es sinnvoll wie bei einer PCR die Konzentrationen an MgCl 2 oder auch die Hybridisierungstemperatur, aber auch die Sondenkonzentration zu verändern. Ein anderer Optimierungsschritt ist die Variation der eingesetzten Template-DNA- Konzentration. Es wird diejenige Konzentration gesucht, die einerseits die bestmögliche Differenzierung zwischen verschiedenen Spezies zuläßt, und andererseits auch aussagekräftige Ct-Werte liefert, sodaß der spezifische Nachweis dieser DNA möglich wird. Die Variation der Primerkonzentrationen verfolgt zwei Ziele: Primermatrix: Soll die optimale Primerkonzentration ermittelt werden, können unterschiedliche Primerkonzentrationen kombiniert werden. Man deckt dadurch den Bereich von 50nM/50nM für Forward- und Reverse-Primer bis zu 900nm/900nM ab. Tab. 4-4.: Pipettierschema einer Primermatrix 50nM/50nM 17µl Wasser 300nM/50nM 14,5µl Wasser 2,5µl Forward-Primer 900nM/50nM 8,5µl Wasser 8,5µl Forward-Primer 50nM/300nM 14,5µl Wasser 2,5µl Reverse-Primer 300nM/300nM 12µl Wasser 2,5µl Forward-Primer 2,5µl Reverse-Primer 900nM/300nM 6µl Wasser 8,5µl Forward-Primer 2,5µl Reverse-Primer 50nM/900nM 8,5µl Wasser 8,5µl Reverse-Primer 300nM/900nM 6µl Wasser 2,5µl Forward-Primer 8,5µl Reverse-Primer 900nM/900nM 8,5µl Forward-Primer 8,5µl Reverse-Primer Der Mastermix für eine Primermatrix setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen. Die Angaben beziehen sich auf 26 Reaktionen à 25µl. Es werden Doppelbestimmungen gemacht und 8 NTCs. 31

11 40,4µl Wasser 65µl TaqMan Buffer A 143µl MgCl 2 (25mM) 19,5µl datp (10mM) 19,5µl dctp (10mM) 19,5µl dgtp (10mM) 19,5µl dutp (20mM) 6,5µl Forward-Primer (5µM) 6,5µl Reverse-Primer (5µM) 13µl Sonde (5µM) 2,5µl Ampli Taq Gold TM Polymerase (5U/µl) Da sich bereits im Mastermix die Primerkonzentration von 50nM für beide Primer befinden, muß in der Primermatrix nur noch entsprechend der angegebenen Konzentrationen Forward- bzw. Reverse-Primer den Reaktionen zugesetzt werden. Die restliche Durchführung erfolgt analog der beschriebenen Arbeitsschritte der Real- Time PCR. Es wird jene Primerkombination gesucht, die den niedrigsten Ct-Wert und so den besten Nachweis der DNA liefert. Die zweite Möglichkeit, eine optimale Primerkonzentration zu finden, bezieht sich auf die Differenzierung zwischen DNAs verschiedener Spezies. Man sucht hier diejenige Primerkonzentration und kombination, bei der der Unterschied zwischen zwei Ct- Werten verschiedener DNAs am größten ist und somit eine signifikante Differenzierung möglich macht. Es werden Primerkonzentrationen von 50nM/50nM, 300nM/300nM und 900nM/900nM erprobt Quantitative Real-Time PCR Das 16S rrna-system Erstellung von Standardkurven Aus Rind- und Schweine-DNA werden in folgenden Konzentrationsabstufungen Standardkurven erstellt: 10ng/µl 1ng/µl 0,1ng/µl 0,01ng/µl 1 pg/µl 0,1pg/µl Dabei wird zweimal DNA aus Rind- und Schweinefleisch zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert und photometrisch vermessen. Die Stammlösung wird auf 100ng/µl verdünnt. 32

12 Aus diesen verschiedenen Isolationen, die zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wurden, werden insgesamt vier Standardkurven hergestellt- jeweils aus Rind-DNA I und II und aus Schwein-DNA I und II. Dies geschieht, um die Reproduzierbarkeit der DNA-Isolationstechnik zu überprüfen Probenvorbereitung DNA wird aus drei Wurstproben isoliert und photometrisch vermessen. Zu der DNA aus der Wurstprobe, die laut Packungsbeschreibung kein Rindfleisch enthält, wird soviel Rinder- DNA zugemischt, daß ihr Anteil 1% beträgt. Um den Nachweis des Rinderanteils in dieser Probe zu überprüfen, wird reine Schweine- DNA ebenfalls mit 1% Rind versehen Quantifizierung Bei Durchführung der Real-Time PCR werden von jeder Probe jeweils vier Ansätze gemacht, wobei jede Probe mit einer Konzentration von 10ng/µl in die Real-Time PCR eingesetzt wird. Bei den Standards reichen Doppelbestimmungen aus. Bei der Quantifizierung mit der 16S rrna-region wird ein universeller Primer (unimit-f und R) und ein für Rind spezifischer Primer (BtMIT-F und R) verwendet. Um statistisch signifikant arbeiten zu können, wird die Quantifizierung mit allen vier Standardreihen, allen unbekannten Proben und den NTCs je sechs Mal mit dem universellen und je sechs Mal mit dem spezifischen Primer durchgeführt. Die Auswertung erfolgt über die Standardkurven Das β-actinsystem Erstellung von Standardkurven DNA wird aus Rind- und Schweinefleisch isoliert und photometrisch vermessen. Anhand dieser Konzentrationswerte wurden Ausgangslösungen von 100ng/µl hergestellt. Aus Rinderund Schweine-DNA wird je eine Standardkurve aus folgenden Konzentrationen erstellt: 100ng/µl 10ng/µl 1ng/µl 0,1ng/µl 0,01ng/µl 1 pg/µl 0,1pg/µl Probenvorbereitung Es wird aus 13 Wurstproben DNA isoliert und die Konzentration photometrisch bestimmt. Der Rinderanteil dieser Proben ist schon in etwa bekannt, da sie bereits mit dem 16S rrna- System quantifiziert worden sind. 33

13 Um eine Nachweisgrenze für das β-actinsystem zu erstellen, werden folgende DNA- Mischungen aus Rinder- (Bt) und Schweine- (Ss) DNA zubereitet: Bt + 1% Ss Bt + 3% Ss Bt + 5% Ss Bt + 7% Ss Bt +10% Ss Bt + 30% Ss Ss + 1% Bt Ss + 3% Bt Ss + 5% Bt Ss + 7% Bt Ss + 10% Bt Die Mischung Rind mit 30% Schwein wurde gewählt, da sich in vielen Wurstsorten ein größerer Anteil an Rindfleisch befindet. Die DNA-Mischungen aus Rind und Schwein werden wie die zu quantifizierenden Wurstproben in einer Konzentration von 10ng/µl in die Real-Time PCR eingesetzt Quantifizierung Die Quantifizierung erfolgt in dem β-actinsystem über zwei spezifische und einen universellen Primer. Ein Primer ist spezifisch für Rind (bactin-bt-f6) und einer spezifisch für Schwein (bactin-ss-f7), während der universelle Primer (MAM-Act-F) generell an Säugetiersequenzen des β-actins hybridisieren kann. Um signifikante Ergebnisse zu erzielen, wird die Quantifizierung aller Proben mit jedem der drei Primer sechs Mal wiederholt. Die Auswertung erfolgt anhand der Standardkurven, die über den Logarithmus der Konzentration und die Ct-Werte die Quantifizierung möglich machen. Abb. 4-4.: Standardkurve zur Quantifizierung mittels Real-Time PCR 34

14 Das D-Loop-System Anhand des D-Loop-Systems wird versucht, eine Differenzierungsmethode von Tieren gegen Pflanzen und Fische zu schaffen. Da sich diese Arbeit aber primär mit der Differenzierung und Quantifizierung von Tierarten auseinandersetzt, wurden nur wenige Vorversuche mit diesem mitochondrialen System durchgeführt. DNA wird jeweils aus den Pflanzen Hirse, Mais, Soja, Gerste, Buchweizen, Hafer und Sonnenblumen und aus den Fischen Makrele, Saibling, Karpfen und Forelle, Hering und Lachs isoliert. In einer 1:100-Verdünnung werden die DNAs in die Real-Time PCR eingesetzt. Als Vergleichsprimer werden die universellen des 16S rrna-system (unimit-f und R) verwendet. Es werden die Ergebnisse der Real-Time PCR mit den D-Loop-Primern (Dloop F1 und R1) und den 16S rrna-primern nebeneinandergestellt. 35