5.1. Gewinnung von Sequenzen für die Konstruktion von Primern und TaqMan-Sonden zur Quantifizierung mittels Real-Time PCR

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1 5. Ergebnisse 5.1. Gewinnung von Sequenzen für die Konstruktion von Primern und TaqMan-Sonden zur Quantifizierung mittels Real-Time PCR Datenbanksuche Mit der Vorgabe einer chromosomalen Sequenz mit einem konstanten Bereich und variablen Domänen an beiden Seiten wurde die Suche gestartet. Die Datenbanksuche erfolgte in der GenBank ; der Zugang war über NCBI (The National Center of Biotechnology Information, möglich. Zum Sequenzvergleich und zur Homologiesuche wurde BLAST und die Software GCG (Wisconsin Package Version 10.2, Genetics Computer Group, Madison, Wisc.) verwendet. Eine Publikation [21] enthielt einen Hinweis, nach dem Housekeeping-Gene wie β-actin oder Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase bereits in der Real-Time PCR Verwendung fanden. Infolgedessen wurde eine Homologiesuche zwischen verschiedenen Tieren bei beiden Genen gestartet. Bei Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase erhielt man weniger Homologien zwischen den einzelnen Spezies, und bereits publizierte Sequenzen waren nur partiell vorhanden. Publizierte Sequenzen gab es vom humanen β-actin (Ac.Nr.:M10277) und vom Huhn (Ac.Nr.:X00182). Aus diesem Grund wurde nach Homologien im β-actin des Menschen zu Säugetieren und Vögeln gesucht. Da das humane β-actin die meisten Sequenzähnlichkeiten zu Schaf (Ac.Nr.:U39357; Ovis aries), Schwein (Ac.Nr.:U07786; Sus scrofa) und Rind (Ac.Nr.:K00622; Bos taurus), aber auch zu Vögeln wie Gans (Ac.Nr.:M26111; Anser anser) oder Huhn (Ac.Nr.:L08165; Gallus gallus) zeigte, wurde dieses Gen gewählt. Die Wahl fiel auf Grund der hohen Homologien auf den Bereich von Exon II bis Exon III. Das dazwischenliegende Intron III sollte zur Differenzierung der einzelnen Spezies herangezogen werden. Das Exon II liegt beim Menschen bei bp, das Exon III zwischen 2029 und 2476bp Amplifikation des Introns III Die Differenzierung und Quantifizierung über Real-Time PCR zielt darauf ab, daß ein System Verwendung findet, das sowohl Homologien als auch klare Unterschiede zwischen den einzelnen Spezies aufweist. In den Exonsequenzen soll die TaqMan-Sonde konstruiert werden und die Intronsequenzen zur Erstellung von spezifischen Primern herangezogen werden. Da von den zu untersuchenden Tierarten nur das β-actin des Huhnes komplett mit Intron- und Exonsequenzen publiziert ist, mußten die restlichen Introns sequenziert werden. Aus diesem Grund wurden Primer anhand der vorliegenden Sequenzdaten konstruiert. Der Forward-Primer wurde an das 3 Ende des Exon II (bactin-f) gesetzt, während der Reverse- Primer direkt an das 5 Ende des Exon III (bactin-r) plaziert wurde. 36

2 PCR mit bactin-f und bactin-r Zur Amplifikation des Intron III wurde DNA aus Rind (Bt), Schwein (Ss), Schaf (Oa), Pferd (Ec), Huhn (Gg), Truthahn (Mg) und Strauß (Str) isoliert. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt, und in die PCR 2ng/µl pro Reaktion eingesetzt. Die Hybridierungstemperatur der Primer betrug 58 C, und die MgCl 2 -Konzentration lag bei 2mM pro Reaktion. 100bp Bt Ss Oa Gg Mg Ec Str Abb. 5-1.: Agarosegel der PCR zur Amplifikation des Intron III mit bactin-f und bactin-r (die NTC ist hier nicht dargestellt) 10µl des Standards und der PCR-Produkte wurden aufgetragen Starke Banden zeigten sich bei 100bp. Beim Huhn wurde eine Bande bei etwa erwartet, da die Länge des Intron III mit 523bp (siehe Ac.Nr.:X00182) publiziert ist. Aus diesem Befund wurde geschlossen, daß es sich möglicherweise um ein Pseudogen ohne Introns (processed pseudogene) handeln könnte. Das Intron III des Menschen besitzt 440bp. Diese Tatsache zeigt, daß zwischen den Intronlängen der Vögel und der Säugetiere ein Längenunterschied bestehen könnte Primerkonstruktion Um die Amplifikation der Pseudogene zu vermeiden, wurden degenerierte Primer konstruiert, die einige Basen in das Intron reichten. Es wurden an Stelle von definierten Nukleotiden Primergemische mit gleichen Anteilen von A, C, G und T an dieser Position (N) verwendet. Als weitere Möglichkeit wurden Primergemische mit gleichen Anteilen an Purinbasen (R) oder Pyrimidinbasen (Y) an der gewünschten Nukleotidstelle synthetisiert. Weiters wurden die Positionen dieser Nukleotide variiert und somit einige neue Primer konstruiert Touchdown-PCR Da die mehrmalige Variation der Hybridisierungstemperatur mit keiner Primerkombination ein Ergebnis brachte, wurde eine Touchdown-PCR von 60 C-50 C gewählt. Als Primer dienten hier diejenigen, die entweder R oder Y am 3 Ende (F-Primer) bzw. 5 Ende (R-Primer) eingebaut hatten. Diese Primer wurden auch unterschiedlich miteinander kombiniert. Es erfolgte die Amplifikation der DNA von Rind, Huhn, Schwein und Schaf bei 2mM MgCl 2 - Konzentration. 37

3 A B C 100bp Bt Gg Ss Oa NTC Bt Gg Ss Oa Bt Gg Abb. 5-2.: Agarosegel der Touchdown-PCR zur Amplifikation des Intron III von Rind, Huhn, Schwein und Schaf mit mehreren Primerkombinationen (A-C) Primerkombination D brachte keine Produkte 10µl des Standards und der PCR-Produkte wurden aufgetragen Neben einer Vielzahl von unspezifischen und zu kleinen Produkten zeigten sich deutliche Banden bei etwa von Rind, Schwein und Schaf. Dieses Ergebnis ließ auf die gelungene Amplifikation des Intron III dieser Tierarten schließen. Die DNA der anderen Tiere Strauß, Truthahn und Pferd wurden unter Verwendung der gleichen Methode und der erprobten Primerkombinationen amplifiziert. A B C D D 100bp Ec Str Mg Ec Str Mg Ec Str Mg NTC Ec 100bp Str Mg Ec NTC Abb. 5-3.: Agarosegele der PCR des Intron III von Pferd, Strauß und Truthahn mit mehreren Primerkombinationen (A-D); 10µl des Standards und der PCR-Produkte wurden aufgetragen Durch die starke Variation der Hybridisierungstemperatur bei der Touchdown-PCR kann das Auftreten von einer Vielzahl an unspezifischen PCR-Produkten nicht vermieden werden. Die Amplifikation der DNA des Pferdes ließ eine Bande bei etwa erkennen und die des Truthahns eine Bande bei etwa 600bp. Dieser Befund unterstützte die Überlegung, daß zwischen den Intronlängen von Vögeln und Säugetieren ein Unterschied bestehen könnte. Die PCR-Produkte (weiße Pfeile) wurden aus den Agarosegelen ausgeschnitten und mit Hilfe der Kits GenElute Agarose Spin Columns oder QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt. 38

4 PCR zur Amplifikation des Intron III der Vögel Da es nicht möglich war, bei der Amplifikation der DNA von Strauß und Huhn die gesuchten PCR-Produkte zu erhalten, wurden huhnspezifische Primer konstruiert. Die PCR erfolgte bei 58 C und variierter MgCl 2 -Konzentration von 1,5mM bis 2,5mM. Es wurden 10µl des Standards und der PCR-Produkte aufgetragen. 100bp Gg Gg Gg Str Str Str NTC 1,5 2 2,5 1,5 2 2,5 Abb. 5-4.: Agarosegel der PCR zur Amplifikation des Intron III von Huhn und Strauß bei variierter MgCl 2 -Konzentration Es war deutlich zu erkennen, daß bei der Amplifikation der Huhn-DNA bei erhöhter MgCl 2 - Konzentration ein spezifischeres Produkt erhalten wurde, während bei der Amplifikation der Strauß-DNA die einzelne Bande bei niedrigerer MgCl 2 -Konzentration zu finden war. Beide Banden jedoch wiesen wie auch schon die Bande bei der Amplifikation der Truthahn-DNA eine Größe von etwa bp auf. Sie wurden ausgeschnitten und aufgereinigt Amplifikation der eluierten PCR-Produkte Um die Reinheit der eluierten PCR-Produkte zu überprüfen und sie für die Sequenzierung zu vermehren, wurden sie nochmals mit neuen Primern amplifiziert. Bei der Konstruktion dieser Primer wurde die sogenannte GT-AG -Regel verwendet, die besagt, daß am Beginn (5 Ende) jedes Introns ein GT und am 3 Ende ein AG steht. Mit diesen Primern wurden alle eluierten PCR-Produkte in je vier Parallelansätzen bei 56 C amplifiziert. Die PCR zur Vermehrung des Intron III des Huhns wurde bei 2,5mM MgCl 2 -Konzentration, die PCR der DNA des Straußes bei 1,5mM MgCl 2 -Konzentration durchgeführt. Der gesamte PCR-Ansatz (25µl) versehen mit 1/5 Stoplösung wurde auf das Agarosegel aufgetragen. 100bp 100bp Ss Ec Mg II Mg Bt Oa Gg Str NTC Abb. 5-5.: Agarosegele der PCR der PCR-Produkte des Intron III aus vorangegangenen Amplifikationen zur Erhöhung der Produktausbeute 39

5 Die größten Banden pro Spezies wurden ausgeschnitten und aus den Agarosegelen eluiert. Die vier Parallelansätze pro Tier wurden zu einer Probe vereinigt. Die zweite Amplifikation des Intron III des Truthahns (Mg II) kam daher, daß aus einer vorangegangenen PCR (Daten nicht abgebildet) eine Bande resultierte, die ebenfalls etwa maß, sich jedoch in dieser Amplifikation als Falschpositiv erwiesen hat. Durch den Tüpfel-Test mit Ethidiumbromidlösung wurden die Konzentrationen der amplifizierten DNA abgeschätzt und die PCR-Produkte sequenziert Sequenzen des Intron III Die Sequenzierung wurde mittels dem Forward-Primer durchgeführt. Die Qualität der PCR- Produkte beeinflußt das Sequenzieren sehr stark. Meistens beginnt die Auflistung der Sequenz etwa 20-30bp stromaufwärts vom Forward-Primer. Durch Vergleich mit den vorhandenen Sequenzdaten des Exons III ließ sich die Länge des Introns III ziemlich genau abschätzen. Tab. 5-1.: Längen des Intron III Spezies Intronlänge (bp) Rind (Bos taurus) 440 Schwein (Sus scrofa) 445 Schaf (Ovis aries) 440 Pferd (Equus caballus) 385 Huhn (Gallus gallus) 520 Truthahn (Meleagris gallopavo) 520 Strauß (Struthio camelus) 530 Die genauen Sequenzdaten befinden sich im Anhang Konstruktion der allgemeinen Sonde und speziesspezifischer Primer Da man den Reverse-Primer genau an das 5 Ende des Exon III mit zwei überhängenden Basen in das Intron gesetzt hatte, war es zur Vervollständigung der Intronsequenzen notwendig, den Übergang von Intron III ins Exon III zu sequenzieren. Weiters sollte die Sonde sehr nahe an diesen Übergang gesetzt werden. Für diesen Vorgang ist die Richtigkeit der Sequenz unerläßlich. Anhand der Introndaten wurden Primer konstruiert. Ein ziemlich homologer Bereich in diesen Sequenzen wurde in einer Entfernung von 150bp vom 5 Ende des Intron III gefunden und auf Grund dieser Homologien ein Forward-Primer spezifisch für Vögel und einer spezifisch für Säugetiere gesetzt. Für alle Spezies gemeinsam konnte ein Reverse-Primer geschaffen werden, da sich dieser im Exon III befindet. Dieser Reverse-Primer wurde 42bp stromaufwärts des 5 Ende des Exon III konstruiert PCR zur Amplifikation des Intron /Exon-Übergangs Die PCR erfolgte bei 60 C und 2mM MgCl 2 mit der DNA von Rind, Schwein, Schaf, Pferd, Huhn, Strauß und Truthahn. Es wurde 1ng/µl DNA pro Reaktion eingesetzt. 40

6 100bp Bt Oa Ss Ec Gg Str Mg NTC Abb. 5-6.: Agarosegel der PCR zur Amplifikation des Intron/Exon- Übergangs 10µl des. und der PCR- Produkte wurden aufgetragen Auf Grund der Intronlängen erwartete man sich bei den Säugetieren eine Amplikonlänge von ~ 300bp, bei den Vögeln ~ 400bp. Zur Vermehrung der PCR-Produkte wurden pro Spezies vier Parallelansätze durchgeführt und ebenfalls bei 60 C amplifiziert. Die entstehenden Banden wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, aus der Agarose eluiert und forward sequenziert Amplifikation des Intron/Exon-Übergangs von Ente und Gans Im Laufe der Arbeit kam die Überlegung auf, sich im Vergleich zu den Hühnervögeln und den Laufvögeln die Sequenzen des β-actins der Wasservögel am Beispiel Gans und Ente anzusehen. Da es sich etwas schwierig gestaltete, passendes Gewebe zur Isolation von DNA zu bekommen und die Arbeit schon fortgeschritten war, wurden diese beiden Spezies erst an diesem Punkt in den Prozeß eingeschleust. Es wurde nicht das gesamte Intron III sequenziert. Das Augenmerk wurde auf den Bereich des Intron III/Exon III Übergangs gerichtet, um spezifische Primer für die Quantifizierung mittels Real-Time PCR konstruieren zu können. Die PCR erfolgte mit dem für Vögel spezifischen Forward-Primer im Intron und dem allgemeinen Reverse-Primer 41bp vom 5 Ende des Exon III gelegen bei 60 C und 2mM MgCl 2 -Konzentration. Als Positivkontrolle wurde die DNA des Huhns mitamplifiziert. Das Gelphoto zeigt vier Parallelansätze dieser PCR. Es wurde der gesamte PCR-Ansatz (25µl) versetzt mit 1/5 Stoplösung aufgetragen. 100bp Anser anser Anas sp. Gg NTC Abb. 5-7.: Agaraosegel der PCR zur Amplifikation des Intron/Exon-Übergangs von Gans (Anser anser) und Ente (Anas sp.); 10µl Standard wurden aufgetragen 41

7 Da die PCR-Produkte die gewünschte Größe zeigten, wurden die Banden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, die Produkte einer Spezies vereint, aus der Agarose eluiert und mittels Forward-Primer sequenziert Sondenkonstruktion Anhand der Sequenzen des Intron III/Exon III-Übergangs wurde mittels der Software Primer Express eine 16bp lange Sonde konstruiert. Sie liegt in einer Entfernung von 10bp zum 5 Ende des Exon III. Dieser Bereich wurde auf Grund des hohen Homologiegrades zwischen den einzelnen Spezies gewählt Konstruktion von sequenzspezifischen Primern Anhand der vorliegenden Sequenzdaten wurde versucht, möglichst speziesspezifische Forward-Primer zu schaffen. Als Reverse-Primer sollte weiterhin der im Exon III gelegene Primer dienen, der auch zum Sequenzieren verwendet wurde. Es wurde vor allem auf die Sequenzunterschiede der einzelnen Tierarten im 3 Ende der Forward-Primer geachtet. Im folgenden Ausschnitt aus der Homologiesuche der Sequenzen sind spezifische Primer, die Sonde und eine mögliche Consensussequenz, die die Konstruktion des gemeinsamen Reverse- Primers möglich machte, gezeigt. Zur Spezifitätserhöhung wurde im Bereich des 3 Endes der Forward-Primer ein Nukleotidaustausch gesetzt, der in einer Fehlpaarung resultierte (Base ist unterstrichen). (+) steht für Nukleotide, die mit der Consensussequenz übereinstimmen. (.) kennzeichnet Sequenzlücken (gaps). Bei den Wasservögeln wurde als Vergleich ein gemeinsamer Forward-Primer zusätzlich zu den spezifischen Primern für Gans und Ente konstruiert. 42

8 Real-Time PCR zur Überprüfung der spezifischen Primer Um die Spezifität der Forward- Primer und damit auch den Grad der Differenzierung zwischen den einzelnen Spezies zu überprüfen, wurde in einer Real-Time PCR jede DNA einer Tierart mit jedem Forward-Primer über 45 Zyklen amplifiziert. Als Reverse-Primer diente der im Exon III liegende Primer (bactin-r). Als Beispiele sind hier die Ergebnisse der Real-Time PCR mit den spezifischen Primern für Schwein und Rind dargestellt. Gg NTC Ec Str Oa Ss Mg Bt Abb. 5-8.: Bildschirmansicht des Amplification Plots der Real-Time PCR mit dem spezifischen Primer für Rind und der DNA aller Tierarten (10ng/µl): Rind (Bt), Schaf (Oa), Schwein (Ss), Huhn (Gg), Pferd (Ec), Strauß (Str), Truthahn (Mg) NTC Oa Bt Gg Ec Str Mg Ss Abb. 5-9.: Bildschirmansicht des Amplification Plots der Real-Time PCR mit dem spezifischen Primer für Schwein und der DNA aller Tierarten (10ng/µl). Rind (Bt), Schaf (Oa), Schwein (Ss), Huhn (Gg), Pferd (Ec), Strauß (Str), Truthahn (Mg) 43

9 In diesen beiden Bildern wurden die Ct-Werte gegen die Position der Probe auf der Mikrotiterplatte aufgetragen. Wie immer bei der Durchführung einer Real-Time PCR wurden Doppelbestimmungen gemacht. Die NTC lag in beiden Fällen bei Ct=45, was für die Reinheit des Mastermixes sprach. Man kann erkennen, daß in beiden Fällen die für den Primer spezifische DNA einen Ct-Wert bei 25 lieferte. Tab. 5-2.: Auflistung der Ct-Werte der spezifischen Primer mit der DNA von allen Spezies; als Reverse-Primer dient bactin-r; die Konzentration der Primer betrug 300nM/300nM Forward-Primer Bt Oa Ss Ec Gg Mg Ans.a A.sp St.c NTC bactin-bt-f bactin-oa-f bactin-ss-f bactin-gg-f bactin-ec-f bactin-str-f bactin-mg-f bactin-ente-f batin-gans-f bactin-wasser Die Differenzierung zwischen den einzelnen Tierarten in Bezug auf Rind bzw. Schwein war trotz des Unterschiedes von 10 und mehr Ct-Werten nicht sehr zufriedenstellend, da somit keine Aussage getätigt werden konnte. Um ein eindeutiges Ergebnis zu erzielen, sollten die Primer für die einzelnen Tierarten so spezifisch sein, daß die Amplifikation mit einer anderen Spezies kein oder ein vernachlässigbares Signal liefert. Ist dies nicht der Fall, kann die wahre Konzentration einer Tierart in einer Mischung nicht bestimmt werden. Die einzige eindeutige Aussage ließ sich über die Differenzierung von Huhn mit dem spezifischen Primer für Rind treffen. Der Ct-Wert lag bei 45, was auf so gut wie keine PCR- Produkte schließen ließ. Vor allem für die Differenzierung zwischen Schaf, Rind und Schwein war der Unterschied der Ct-Werte zu gering. 44