3. Grundlagen Thematische Grundlagen Einleitung

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1 3. Grundlagen 3.1. Thematische Grundlagen Einleitung In der heutigen Zeit wird der Lebensmittelqualität und ihrer Kontrolle ein immer wichtigerer Stellenwert zugeordnet. Gerade in Zeiten von BSE und anderen Fleischskandalen wird der Ruf nach Nachweisverfahren laut, um Falschdeklarationen und Importverbotverstöße aufzeigen zu können. Es wird versucht molekularbiologische Methoden zu entwickeln, die die Unterscheidung einzelner Tierarten zulassen. Diese Differenzierung verläuft über den Nachweis von artspezifischer DNA in Fleisch- und Wurstprodukten. Im Vordergrund steht die Unterscheidung von Rind und Schwein. In dieser Arbeit wird das Augenmerk auf drei Systeme gerichtet. In zwei Fällen wurden mitochondriale Gene, und im dritten System ein chromosomales Gen verwendet. Die Nachweissysteme werden als Real-Time PCRs aufgebaut. Bei dieser Methode verwendet man zusätzlich zu den Primern der PCR Sonden, die zur Sequenz homolog sind und über ein Fluoreszenzsignal neben der qualitativen auch eine quantitative Aussage über die eingesetzte DNA zulassen. Spezifische Primer und Sonden für die einzelnen Systeme werden erstellt und so verschiedene DNA-Proben vermessen. Bei Primern und Sonden handelt es sich um Oligonukleotide, die sequenzspezifisch an ihre homologen Stellen in der gewünschten DNA- Sequenz binden. Die Quantifizierung erfolgt anhand von Standardkurven aus Rinder- bzw. Schweine-DNA. Bisher wurden die Identifizierung und Differenzierung von Spezies vor allem über Proteine vorgenommen. Hierbei handelt es sich um die Kapillarelektrophorese, isoelektrische Fokussierung oder ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay). Mittels Sodiumdodecylsulfat-Kapillarelektrophorese (CE-SDS) können aus Fleisch Proteinprofile erstellt werden. Anhand dieser CE-SDS-Profile kann eine sehr genaue Differenzierung zwischen einzelnen Spezies vorgenommen werden. [29] Mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung auf einem dünnen Trägermaterial und anschließender Silberfärbung kann eine Differenzierung von sterilisiertem Fleisch verschiedener Tierarten möglich gemacht werden. [30] Der Proteinnachweis über ELISA wird vor allem in nicht verarbeiteten Lebensmitteln angewandt. In verarbeiteten Lebensmitteln werden Proteine meist stark denaturiert und können so mit dieser Methode schlecht detektiert werden. Die Anwendbarkeit des ELISAs hängt von der Art der Antikörper ab, da diese auch gegen teilweise denaturierte Proteine produziert werden können. Eine wesentlich sensitivere Differenzierung und Charakterisierung von Spezies läßt die Methodik über den DNA-Nachweis zu. Damit werden kleinste DNA-Mengen auch in stark verarbeiteten Produkten detektierbar. Dies stellt den großen Vorteil dieser Methode gegenüber dem Proteinnachweis dar. Eine relativ rasche Methode zum Nachweis von DNA ist die Detektion von Satelliten-DNA. Diese DNA ist spezifisch für verschiedene Tierarten und läßt so eine genaue Charakterisierung zu. [31] In letzter Zeit erfolgt der wohl gebräuchlichste Nachweis von DNA über die Methode der PCR (polymerase chain reaction). Bereits 1993 wurde ein semiquantitativer Nachweis von 3

2 Schwein und Soja in Fleischprodukten über ein PCR-System entwickelt. Die Primer der PCR werden anhand der speziesspezifischen Sequenzen des Wachstumshormons und des Lektingens von Soja konstruiert. [33] Eine weitere Anwendung der PCR stellt die Verbindung mit dem Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) dar. In dieser Methode wird an die PCR eine Analyse mit Restriktionsendonukleasen angeschlossen. Als Zielsequenz wird das mitochondriale Cytochrom b gewählt. Bei RFLP werden individuelle Unterschiede in der Nukleotidsequenz, die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen betreffen können, genützt. [32] Die Real-Time PCR stellt als neue und rasche Methode eine Alternative zu den bisherigen Testverfahren dar, da eine große Probenanzahl (96 Proben) in kurzer Zeit (ca. 3 Stunden) bearbeitet werden kann Die mitochondrialen Systeme Bei den mitochondrialen Systemen wird einerseits die 16S rrna und andererseits die D- Loop-Region als Sequenz der Wahl verwendet. Bei der 16S rrna handelt es sich um einen Teil der ribosomalen RNA aus den Mitochondrien. Die Ribosomen bestehen aus zwei Untereinheiten, die die Bildung von Proteinen möglich machen. Ihre Bestandteile werden durch Angabe der sogenannten Svedberg-Einheiten (S) charakterisiert. Eine Svedbergeinheit gibt an, mit welcher Geschwindigkeit Partikel einer bestimmten Art im Schwerefeld der Ultrazentrifuge sedimentieren. Die Größe der Ribosomen betragen bei Eukaryonten 80S und bei Prokaryonten 70S. Die Ribosomen der Mitochondrien gehören jedoch dem 70S-Typ an, was in der Endosymbiontenhypothese Ausdruck findet. Sie besagt, daß sich die Mitochondrien von farblosen aeroben Bakterien herleiten. Diese Theorie zeichnet demnach frühe Schritte in der Evolution nach. Bei Zunahme des Sauerstoffgehalts in der Atmosphäre begannen Eukaryonten, die bis dahin ihren Energiebedarf über anaerobe Stoffwechselwege wie die Glykolyse deckten, die sauerstoffverwertenden Bakterien einzufangen und mit ihnen in Symbiose zu leben. Somit konnten sie sich die Tatsache, daß bei aeroben Stoffwechselvorgängen wesentlich mehr Energie entsteht als bei anaeroben, zunutze machen. Es gibt neben der Zuordnung der mitochondrialen Ribosomen zum 70S-Typ noch einige weitere Beweise für die Endosymbiontentheorie. [2] Der Ribosomenaufbau gleicht dem in Bakterien. Die beiden Untereinheiten der Ribosomen werden als 50S und 30S charakterisiert. Sie enthalten aber im Unterschied zu den bakteriellen Ribosomen wahrscheinlich nur je ein rrna-molekül. Die 30S- Einheit enthält die 16S rrna und Proteine.[3] Bei der D-Loop-Region (D= displacement, Verdrängung) handelt es sich um eine einzigartige DNA-Struktur, die bis jetzt nur im Mitochondrium gefunden wurde. In vielen mitochondrialen DNA-Molekülen vor allem von Vertebraten befindet sich an dieser Stelle ein Dreistrang-DNA-Abschnitt, wo ein DNA-Stück aus etwa 700 Basen an den L- Strang gebunden ist und den komplementären H-Strang verdrängt. Um die Stränge des miochondrialen ringförmigen Genoms besser unterscheiden zu können, wurde für die beiden komplementären Stränge die Bezeichnungen H und L gewählt, welche sich von den unterschiedlichen Auftriebsdichten im CsCl-Gleichgewichtsgradienten ableiten, durch den man den schweren (H, heavy) vom leichten (L, light) Strang trennen kann. [2] 4

3 Das β-actinsystem Die Sequenzregionen im Exon II/Intron III-Bereich des β-actin wurde als chromosomales Gen zur Tierartendifferenzierung gewählt. Beim β-actin handelt es sich um ein sogenanntes housekeeping gene. Solche Gene sind für die Aufrechterhaltung der Grundfunktionen der Zelle notwendig. Aus diesem Grund werden sie wahrscheinlich auch in allen Zellen im Normalzustand exprimiert. [4] Diese Tatsache macht die Differenzierung über das β-actin als Referenzgen möglich. Es handelt sich dabei um ein single copy Gen, von dem es allerdings im Menschen und im Rind (Bos taurus, Ac.Nr.: U02295) auch Pseudogene gibt. Dies wurde durch Southern Blot Experimente gezeigt. Ein weiterer Beweis für das Vorhandensein eines einzelnen Gens für das β-actin besteht darin, daß die mrna ident zu den cdnas aus humanen Fibroblasten- Bibliotheken und humanen Epidermiszell-Bibliotheken ist. [5] Pseudogene sind Gene, die aus Exons und Introns aufgebaut sind, aber durch die Unterbrechung der Leseraster durch Stop-Codons sowie durch andere Mutationen wie Deletionen oder Insertionen funktionslos sind. Es handelt sich dabei vermutlich um evolutionäre Überreste. Es sind zwei Arten von Pseudogenen bekannt. Bei der ersten Gruppe geht man davon aus, daß das Pseudogen durch Kopie eines Stammgens entstanden ist, funktionslos blieb und sich dadurch im Lauf der Zeit Mutationen ansammeln konnten. Das könnte ein Hinweis auf einen DNA-Abschnitt sein, der nicht dem Selektionsdruck der Evolution unterworfen ist. Die zweite und weitaus größere Gruppe von Pseudogenen ist vermutlich durch die reverse Transkription von mrna entstanden. Diese Aussage wird durch folgende Beobachtungen begründet. Die Sequenzen der Pseudogene stimmen mit den Exonsequenzen des echten Gens überein, jedoch sind beim Pseudogen keine Introns zu finden. Am 3 Ende des Pseudogens ist oft eine Folge von Adeninresten zu finden. Solche Poly-A- Schwänze werden erst nach der Transkription an das 3 Ende der mrna geheftet. An beiden Seiten des Pseudogens tauchen repetititve Sequenzen auf, die jedoch nur typisch sind für die integrierten Produkte revers transkribierter RNAs. Im Laufe der Entwicklung hat eine reverse Transkription der mrna stattgefunden. Möglicherweise passierte das durch das Infizieren von Keimzellen mit einem Retrovirus. Die enstandene cdna (copy-dna) wird in das Genom integriert. Diese Pseudogene bezeichnet man auch als processed pseudogenes, da das processing für den Weg vom primären Transkriptionsprodukt zur fertigen mrna steht. Das beinhaltet das Entfernen von Intronsequenzen und das Anbinden des Poly-A-Schwanzes. Beim Menschen ist das β-actin am Chromosom 7p22 lokalisiert; Pseudogene befinden sich auf den Chromosomen 6, 15 und 18. [6] Der Mensch besitzt vermutlich um die 20 Pseudogene des β-actin. [5] Als Beispiele seien hier die beiden Pseudogene HβAc-ψ1 und HβAc-ψ2 angeführt. HβAc-ψ1 wird durch eine 230-bp Region charakterisiert, in der die Sequenzabfolge 5 -GAAA-3 mehr als 40 mal wiederholt wird. Das zweite bekannte humane Pseudogen HβAc-ψ2 besitzt einige Mutationen, ausgelöst durch verfrühte Stopcodons und Leserasterverschiebungen. Es handelt sich um prozessierte Pseudogene. [7] β-actin ist in vielen Organismen hochkonserviert. Das bedeutet, daß sich die Exons der unterschiedlichen Spezies weitgehend gleichen (Mensch vs. Ratte: >90% Homologie; Mensch vs. Huhn: >85% Homologie) [8], sie sich aber in den Introns deutlich unterscheiden. Vergleicht man die Sequenzen und Lage der Introns einiger Genfamilien (z.b.: Globin oder Ovalbumin) in Vertebraten, so zeigt sich, daß sich zwar die Intronsequenz im Laufe der 5

4 Evolution stark geändert hat, aber die Lage im Verhältnis zu den kodierenden Sequenzen höher konserviert ist. Bei der Aktinfamilie zeigt sich jedoch eine durch die Evolution wesentlich veränderte Genstruktur, die sich durch viele Organismen zieht. Die Zahl und die Position der Introns variieren. [9] 1978 wurde publiziert, daß sich Rind, Maus und Ratte in ihrer Aminosäuresequenz komplett gleichen. [10]. β-actin der Ratte besitzt 5 kleine Introns in der kodierenden Region und ein großes Intron am 5 Ende der nichttranslatierten Region. [9] Den gleichen Aufbau findet man beim β-actin des Menschen. Hier wurde das große Intron sechs Nukleotide stromaufwärts vom ATG Initiationscodon gefunden. Die restlichen Introns in der kodierenden Region befinden sich bei den Aminosäurecodons 41/42, 121/122, 267 und 327/328. Während in den Exons hohe Homologien herrschen, findet man in den Introns nur 40-60% Homologie zwischen Mensch und Ratte bzw. Mensch und Huhn. Eine Ausnahme bildet hier das Intron III. Die humane Sequenz des Intron III zeigt hohe Homologien zur Rattensequenz. Daraus schloß man, daß die Sequenz des Intron III vielleicht eine Rolle in der Expression und Regulation des β-actins spielt. [8] Die Intronlängen von Mensch, Ratte und Huhn gleichen sich annähernd. Das Intron III ist beim Menschen 441 bp, bei der Ratte 464 bp und beim Huhn 524 bp lang. [5] Differenzierung und Quantifizierung Um eine Differenzierung einzelner Spezies vornehmen zu können, werden Sequenzunterschiede in der ausgewählten DNA-Region verwendet. Im Falle des β- Actinsystems sind in der Datenbank nur mrna-sequenzen vorhanden. Da die Exonsequenzen, die in der mrna aufscheinen, im β-actin sehr homolog sind, wurden die Intronsequenzen zur Differenzierung verwendet. Zur Sequenzierung des Introns wurden Primer am 3 Ende des Exon II und am 5 Ende des Exon III konstruiert. Weiters wurden Primer geschaffen, die einige Basen in das Intron reichen, um die Amplifikation dieser Sequenz zu erreichen. Eine Erleichterung in der Primerkonstruktion stellt die sogenannte GT-AG-Regel dar. Sie besagt, daß jedes Intron am 5 Ende ein GT (Guanin-Thymin), am 3 Ende ein AG (Adenin- Cytosin) trägt. [11] Diese Basen stellen Spleißsignale dar und sind aus diesem Grund in jedem Intron gleich. Im Spleißvorgang werden die Introns aus der transkribierten RNA geschnitten und es entsteht die aus Exons bestehende mrna. Diese homologen Basen machte man sich bei der Konstruktion der Primer zunutze. Diese Primer lassen die Amplifikation des Intron III zu. Anhand dieser Intronsequenzen wurden für die Real-Time PCR spezifische Primer konstruiert, die eine Differenzierung verschiedener Arten ermöglichten. Die weitgehend gemeinsame Exonstruktur der einzelnen Spezies macht die Konstruktion einer gemeinsamen Sonde möglich, was neben einer Kostenreduktion auch eine Erleichterung der Versuchsdurchführung mit sich bringt. Der Vorteil der mitochondrialen Systeme liegt darin, daß durch die Anzahl von mehreren Mitochondrien pro Zelle und einigen DNA-Kopien pro Mitochondrium eine hohe Kopienzahl vorliegt, während bei chromosomalen Genen mit einer wesentlich geringeren Anzahl zu rechnen ist. Das β-actin als single-copy Gen ist nur im diploiden Zustand in der Zelle vorhanden. Die Differenzierung über mitochondriale Systeme wird sensitiver, da es nicht möglich ist, soviel chromosomale DNA in die Reaktion einzusetzen, um auf die gleiche Kopienzahl zu kommen. 6

5 Im Rahmen dieser Arbeit geht es in weiterer Folge darum, die Nachweissysteme in ihrer Spezifität und Effizienz zu vergleichen, wobei das mitochondriale System im Bereich der 16S rrna und das β-actin-system in den Vordergrund gestellt werden Technische Grundlagen PCR- die Polymerase Ketten-Reaktion Prinzip In April 1983, Kary Mullis took a drive on a moonlit California mountain road and changed the course of molecular biology. During that drive, he conceived the Polymerase Chain Reaction (PCR). [aus Roche Molecular Biochemicals, PCR Application Manual, 2 nd edition] Die PCR ist heutzutage so weit verbreitet, daß das molekularbiologische Leben ohne diese Methode kaum mehr vorstellbar ist. Sie spielt eine große Rolle in der medizinischen Diagnostik oder bei der Herstellung eines Fingerabdrucks vor allem von Organismen, deren Sequenzen noch größtenteils unbekannt sind. Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um eine In-Vitro-Methode, die es möglich macht, definierte DNA-Sequenzen enzymatisch zu synthetisieren. Diese Reaktion benötigt 2 Oligonukleotidprimer, die an die gegenläufigen DNA-Stränge hybridisieren und auf beiden Seiten der gewünschten Sequenz (Target-Sequenz) liegen. Die Verlängerung der Primer wird durch eine hitzestabile DNA-Polymerase katalysiert. Durch sich wiederholende Zyklen kann das gewünschte DNA-Fragment exponentiell vermehrt werden. Diese Zyklen enthalten die Denaturierung der Ausgangs-DNA (Template- DNA), das Hybridisieren der Primer an die Sequenz und die Elongation der Primer durch die Polymerase. Die Enden des nun neu synthetisierten Fragments bestehen aus den 5 Enden der Primer. Erst die zyklischen Temperaturänderungen machen die PCR möglich, da die hohe Temperatur von mindestens 94 oder 95 C gewählt werden muß, um die DNA zu denaturieren. Um das Hybridisieren der Primer an die Template-DNA zu ermöglichen, muß die Temperatur um bis zu 30 oder 40 C gesenkt werden. Ein anschließender Temperaturanstieg läßt die Verlängerung der Primer zu. Der Beginn des nächsten Zyklus bei 95 C läßt die gerade synthetisierten DNA-Stränge wieder denaturieren, sodaß sich die Primer bei Absenken der Temperatur wieder an ihre komplementäre Sequenz anlagern können. Da das in einem Zyklus synthetisierte Fragment bereits die Template-DNA des nächsten Zyklus ist, verdoppelt sich die Zahl der DNA-Kopien in jedem Zyklus. Aus diesem Grund erhält man nach 20 Zyklen ungefähr eine Million Kopien der gewünschten Sequenz. 7

6 Primer Zielsequenz dctp dgtp datp dutp/dttp Taq DNA Polymerase Primer 95 C DNA-Stränge trennen sich Abkühlen auf C Primer binden an die komplementären Stränge Abb. 3-1.: Prinzip der PCR Kopienzahl der Ausgangs-DNA verdoppelt sich mit jedem Zyklus Zyklen 72 C Taq DNA Polymerase verlängert die Primer Durchführung und Reaktionskomponenten Um eine PCR erfolgreich und reproduzierbar zu gestalten, sind viele kritische Faktoren zu beachten. Es kann jede chemische oder physikalische Komponente der PCR dazu beitragen, die Spezifität oder Effizienz zu erhöhen. Folgende Faktoren spielen eine große Rolle: a) Arbeitsplatz und Verhalten Falsch Positive: Kontamination mit Fremd-DNA kann in der Amplifikation der falschen DNA resultieren. Besonders sorgsam sollte man beim Pipettieren sein, um auch die Kontamination des Arbeitsplatzes und etwaige Aerosolbildung zu vermeiden. Vor allem durch diese Aerosolbildung kann es zur Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben kommen. Auch Produkte aus früheren Amplifikationen können zur Kontamination führen. Aus diesem Grund ist ein Arbeitsplatz, der mit einer sterilen Werkbank ausgestattet ist, zu empfehlen. Um Verunreinungen der Reaktionsgefäße zu vermeiden, sollte man DNase- und RNasefreie Pipettenspitzen und Reaktionsröhrchen verwenden. Das Tragen von Handschuhen, Arbeiten mit neuen oder sterilisierten Glaswaren, Plastikwaren und Pipetten tragen zum Gelingen einer PCR viel bei. Bei den Reagenzien sollte man ein eigenes Set von Lösungen besitzen, das nur für die PCR verwendet wird. Diese Lösungen sollten in kleinen aliquoten Teilen aufbewahrt 8

7 werden, um bei einer möglichen Kontamination nicht den gesamten Lösungsbestand zu verlieren. Als Kontrolle wird immer eine sogenannte NTC eine no template control mitverarbeitet. Diese NTC enthält alle Komponenten der PCR außer der zu amplifizierenden DNA. Eine Positivkontrolle soll wenn möglich- immer mitgeführt werden. Dies ist eine Reaktion, die bereits in einer vorangegangenen PCR das gewünschte Produkt geliefert hat. b) PCR-Komponenten Die Template-DNA Viel RNA in der DNA-Probe kann mit Mg 2+ -Ionen Chelate bilden und so die Empfindlichkeit reduzieren. Verunreinigte Proben können Polymeraseinhibitoren beinhalten. Sinnvoll lassen sich 1-10ng bakterielle DNA, bis zu 500ng humane DNA und 0,1-1ng Plasmid-DNA mittels PCR verarbeiten. Die Primer Die optimale Länge beträgt zwischen 18 und 24 Basen. Primer sollten keine Sekundärstrukturen beinhalten. Der G/C -Gehalt (Guanin-Cytosin) sollte sich zwischen 40 und 60% bewegen. Optimal wäre eine Ausgeglichenheit zwischen G/C- und A/T-reichen (Guanin-Cytosin bzw. Adenin-Thymin) Domänen. Primer sollten am 3 - Ende nicht komplementär zueinander sein, da sich sonst leicht Primer-Dimere bilden können. Die Schmelztemperatur (T m ) ist zwischen 55 C und 65 C als optimal anzunehmen (die maximale Spezifität erreicht man von C). Bei der Schmelztemperatur sind 50% der Primer an die Zielsequenz gebunden. Um sicherzustellen, daß an alle Zielsequenzmoleküle Primer binden, setzt man einen Überschuß an Primern in die Reaktion ein und die eigentliche Reaktionstemperatur- die Hybridisierungs-Temperatur (Annealing) - um etwa 5 C unter den T m -Wert. Je tiefer die Temperatur, desto mehr Primer binden an die Zielsequenz, aber desto mehr unspezifische Bindungen oder Primerdimerbildung treten auf. Die Konzentration der Primer bewegt sich zwischen 0,1 und 0,6µM pro Reaktion. Die MgCl 2 Konzentration Mg 2+ bildet mit dntps (Desoxynukleotidtriphosphat) lösliche Komplexe, die dadurch für die Polymerase erst als Substrat erkennbar werden. Die optimale MgCl 2 Konzentration variiert von 1mM zu 5mM pro Reaktion. Mg 2+ hat einen Einfluß auf die Enzymaktivität und erhöht die Schmelztemperatur von doppelsträngiger DNA. Die Desoxynukleotidtriphosphate die dntps Um die Fehlerrate der Polymerase möglichst gering zu halten, sollte man immer ausgewogene Lösungen aller vier Komponenten verwenden. 9

8 Um Kreuzkontaminationen vorzubeugen, wird vielfach dutp statt dttp verwendet. Durch Zusatz des Enzyms Uracil-N-Glykosylase werden PCR-Produkte aus vorangegangenen Reaktionen, die Uracil eingebaut haben und die aktuelle Reaktion stören könnten, abgebaut, während die Template-DNA nicht angegriffen wird. Dieses Enzym spaltet das Uracil vom Phosphodiester-Rückgrat der DNA ab, die das Uracil eingebaut hat. Anschließend an diese enzymatische Reaktion wird die Uracil-N-Glykosylase thermisch inaktiviert. Die Endkonzentration an dntps sollte zwischen 50 und 500µM pro Reaktion liegen c) Die Reaktionsbedingungen: Die Reaktion bei einem ph von zeigt die besten Resultate. In manchen Fällen kann das Zugeben von folgenden Reagentien die Spezifität oder Effizienz erhöhen: Rinder Serumalbumin (BSA), Detergentien, Gelatine oder Glycerol Um die Evaporation während der PCR zu vermeiden, wurde häufig eine Schicht Paraffinöl auf das Reaktionsgemisch aufgebracht. Heute sind meistens Thermocycler mit beheizbaren Deckeln in Verwendung. Die Taq Polymerase kann 60 Basen in der Sekunde bei 72 C synthetisieren. d) Das Thermocycler Profil Die Ausgangs-DNA wird komplett denaturiert bei C für 2 Minuten. Anschließend können die Primer an die beiden Stränge hybridisieren, sobald das Reaktionsgemisch abgekühlt ist. Längere Denaturierung, die bei einer höheren Temperatur stattfindet, wird benötigt, wenn man GC-reiche Ausgangs-DNA vorliegen hat. Die Hybridisierungs-Temperatur der Primer darf nicht zu hoch sein, da sonst kein Annealing erfolgen kann. Ist sie jedoch zu nieder, können sich Primer-Dimere bilden. Sie sollte etwa 5 C unter der Schmelztemperatur (T m ) der Primer liegen. In einer optimalen Reaktion können weniger als 10 DNA-Moleküle in weniger als 40 Zyklen zu einem Produkt amplifiziert werden, das auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel gut zu erkennen ist. Nach dem letzten Zyklus setzt eine konstante Temperaturphase bei 72 C für 5-15 Minuten ein, die eine Vervollständigung der Extension und das Hybridisieren von einzelsträngigen Komplementärprodukten gewährleistet. e) Die Taq DNA Polymerase Die Taq Polymerase wurde ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus BM isoliert. Heute wird sie als rekombinantes Enzym von Escherichia coli produziert, welches hochrein und frei von unspezifischen Endo- und Exonukleasen ist. Die Taq DNA- Polymerase besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 95 kd. Dieses Enzym besitzt eine hohe 5-3 -DNA-Polymeraseaktivität, aber keine Exonukleaseaktivität. Das ph-optimum liegt bei ca. 9 und das Temperaturoptimum bei 75 C. 10

9 Die Real-Time PCR Einleitung Trotz der wesentlichen Erleichterung der täglichen Laborarbeit durch die PCR bedeutet der spezifische und reproduzierbare Nachweis von PCR-Produkten immer noch einen hohen Zeitund Arbeitsaufwand. Southern-Dot-Blotting oder Restriktionsanalysen [12,13] erfordern neben aufwendigen Arbeitsschritten eine lange Arbeitszeit und bringen hohe Reagenzienkosten sowie die Gefahr der Kreuzkontaminationen mit sich. Um das Automatisierungsniveau der PCR zu erhöhen, versuchte man, einen neuen Assay zu entwickeln, mit dem die Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produktes in ein und demselben Reaktionsgefäß möglich wird gelang es, einen 5 Nuclease Assay unter Ausnützung der 5`Exonukleaseaktitvität der Taq Polymerase zur Detektion der sequenzspezifischen PCR-Produkte zu entwickeln.[14] Jedoch auch bei diesem Assay war eine aufwendige Detektion nach der PCR mittels 32 P- markierten Sonden notwendig wurden dann fluorogene Sonden entwickelt, deren Abbau ohne aufwendige Post-PCR-Schritte detektierbar wurde.[15] Dieser TaqMan PCR Assay basiert auf dem 5 Nuclease-Assay und verwendet ebenfalls die 5 3 Exonukleaseaktivität der AmpliTaq Gold DNA Polymerase. AmpliTaq Gold ist eine modifizierte Form der rekombinanten Taq DNA Polymerase. Sie wird inaktiv geliefert und durch eine 9-12 minütige Inkubation bei 95 C irreversibel aktiviert. Da diese Polymerase in ihren Eigenschaften und Leistungen der herkömmlichen Taq Polymerase gleicht, können alte PCR-Protokolle übertragen werden. Ein weiterer Vorteil der AmpliTaq Gold besteht in der Möglichkeit, daß man komplette Mastermixe ohne Gefahr von Primerdimerbildung bereiten kann, was die Automatisierung erleichtert. Die Lagerung solcher Mastermixe über mehrere Tage bei 4 C ist möglich. Die Dauer der Extension ist von der Länge des zu generierenden PCR-Produkts abhängig. Die Extensionsrate der AmpliTaq Gold beträgt zwischen 2000 und 4000 Basen pro Minute bei Temperaturen von 70 C bis 80 C. Daumen Finger Oligonukleotid 5 Nuklease Abb. 3-2.: Struktur der Taq DNA Polymerase 11

10 Prinzip Die fluorogene Sonde besteht aus einem Oligonukleotid, dessen 5 Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff und dessen 3 Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert ist. Weiters ist das 3 Ende mit einem Phosphatrest blockiert. Wenn die Sonde bei der spezifischen Wellenlänge von 488nm zur Fluoreszenz angeregt wird, so wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes auf Grund der räumlichen Nähe zum Quencher durch einen Energie-Transfer unterdrückt. Die Sonde und die Primer hybridisieren an die DNA. In der Extensionsphase beginnt die Polymerase beim Auftreffen auf die Sonde, diese zu verdrängen. Durch die entstehende Y- förmige Sekundärstruktur wird die 5 3 Exonukleaseaktivität der Polymerase aktiviert und die Sonde geschnitten. Bei dieser Sondenhydrolyse wird die räumliche Nähe zwischen Reporter und Quencher und damit auch der Energie-Transfer unterbrochen. Die Fluoreszenz des Reporters steigt mit jedem Zyklus an. Das dabei gebildete Signal ist strikt sequenzspezifisch, da nicht hundertprozentig bindende Sondenmoleküle verdrängt werden, noch bevor die Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase aktiviert wird. Die Veränderungen der Fluoreszenzen der verschiedenen Farbstoffe werden mit Hilfe des ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Zyklus für Zyklus erfaßt. Polymerisierung Sonde Verdrängung durch die Polymerase Sonde Spaltung der Sonde Polymerisierung vollständig Abb. 3-3.: Prinzip der Real-Time PCR Der Aufbau der Sonde Der molekulare chemische Aufbau der Sonden ist recht kompliziert. Der fluoreszierende Reporterfarbstoff ist kovalent an das 5 Ende der Sonde gebunden. Meistens wird FAM (6- Carboxy-Fluorescein; Emission bei 518nm) als Reporter verwendet. Es gibt auch andere 12

11 Reporterfarbstoffe wie TET (Tetrachloro-6-Carboxy-fluorescein; Emission bei 538nm) oder HEX (Hexachloro-6-carboxy-fluorescein; Emission: 556nm), die jedoch in dieser Arbeit keine Verwendung finden. Alle diese Farbstoffe erfahren ihre Anregung bei 488nm. Dem Reporter steht der Quencher-Farbstoff TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin; Emission bei 582 nm) gegenüber. TAMRA wird über ein Linker-Arm-modifiziertes Nukleotid (LAN) an das 3 Ende der Sonde gebunden. Die Sonde wird noch chemisch phosphoryliert, um eine Extension des 3 Endes während der PCR zu vermeiden. Abb.3-4.: Chemische Struktur einer TaqMan- Sonde Das Quenching Quenching steht für das Stillegen bzw. Unterdrücken der Fluoreszenz des Reporters, solange er an die Sonde und damit an den Quencher gebunden ist. Wie schon oben beschrieben, kommt es durch die räumliche Nähe von Reporter- und Quencher-Fluorophor zu einem Energietransfer. Deshalb ging man zuerst davon aus, daß es ratsam wäre, den Quencher möglichst nahe an den Reporter zu plazieren, um einen genügend großen Energietransfer zu erhalten. Nachfolgende Untersuchungen haben aber gezeigt, daß der Quencher direkt an das 3 Ende der Sonde geknüpft werden kann. [16] Dieser Sondenaufbau ist vorteilhafter gegenüber einem internen Plazieren des Quenchers, da bei einem internen Quencher die Sondenhydrolyse nur dann nachweisbar wird, wenn die Hydrolyse auch tatsächlich zwischen den beiden Farbstoffen erfolgt. Bei einem internen Quencher erfolgt der erste Schnitt endonukleolytisch. Es kann jedoch nicht vorhergesagt werden, an welcher Position innerhalb der Sonde dieser erfolgt, was ein großes Problem bei der Reaktionsoptimierung darstellt. Wird der Quencher aber am 3 Ende plaziert, so ist stets gewährleistet, daß der erste endonukleolytische Schnitt auch wirklich detektiert wird. So kann man die Bildung des PCR-Produkts in vollem Umfang nachweisen. Ein weiterer Vorteil des 3 Quenchers ist eine verbesserte Hybridisierungseffizienz der Sonde. TAMRA wird postsynthetisch über LAN an die Sonde gekoppelt. 13

12 Bei dem Linker-Arm-Nukleotid handelt es sich um ein Thymidin mit einem C 6 -Linker Arm, der an die 4 Position des Thymin-Ringes geknüpft ist. Diese Tatsache verschlechtert aber die Basenpaarungseigenschaften des Thymins, weshalb eine schlechtere Hybridisierungseffizienz zu erwarten ist. Diese möglichen Probleme sind bei einem 3 Quencher am geringsten. Ein weiterer wichtiger Punkt beim Sonden Design ist der Abstand zwischen den Fluorophoren. Je größer der Abstand zwischen Quencher und Reporter ist, desto stärkeren Einfluß hat die Mg 2+ Ionenkonzentration auf das Quenching. [16] Es wird vermutet, daß die Sonden auf Grund elektrostatischer Abstoßung der negativen Ladungen der Phosphatreste des Moleküls in einer Mg 2+ armen Umgebung eine gestreckte Form einnehmen. Durch Bindung von Mg 2+ können diese Abstoßungskräfte neutralisiert werden. Dadurch kann sich die Sonde wieder falten, und das 5 und 3 Ende gelangen wieder in räumliche Nähe zueinander und ein Quenching wird möglich. Die Sondenflexibilität wird außerdem von Sekundärstrukturen oder einer möglichen Selbstkomplementarität durch Hairpins oder dergleichen beeinflußt. Andere Faktoren haben neben der Sondenflexibilität ebenfalls großen Einfluß auf das Quenching. Ein G sollte am 5 Ende der Sonde vermieden werden, da es trotz Sondenhydrolyse noch in der Lage sein kann, den daran gebundenen Reporter in einem bestimmten Ausmaß zu quenchen. Weiters ist noch die Reinheit der Sonde von großer Bedeutung. Jedes Molekül, das einen Reporter, aber keinen Quencher besitzt, kann eine Kontaminationsstelle darstellen. Die Anwesenheit von Sonden ohne Quencher kann die Anfangsintensität der Reporterfluoreszenz steigern und macht eine Unterscheidung zur Reporterfluoreszenz, die durch die Spaltung entsteht, schwierig. Aus diesem Grund ist der Reporter am 5 Ende mit einem Phosphoramitid markiert, sodaß jede mögliche nicht komplette Sequenz, die während der Oligonukleotidsynthese entsteht, nicht mit einem Reporter markiert werden kann Die Konstruktion von Primern und Sonden Die Voraussetzung einer Sondenhydrolyse durch die 5 3 Exonukleaseaktivität der AmpliTaq Gold Polymerase ist eine stabile, sequenzspezifische Bindung der Sonde an die Zielsequenz. Ein Fluoreszenzsignal kann nur dann entstehen, wenn es zu einer Amplifikation der Zielsequenz kommt. Durch die Sondenhybridisierung innerhalb der PCR erreicht dieser Assay das Spezifitätsniveau gebräuchlicher Hybridisierungstechniken, jedoch ohne Post-PCR- Schritte. Um eine stabile und vollständige Hybridisierung zu erreichen, sollten folgende Faktoren berücksichtigt werden: Der GC-Gehalt der Sonde sollte ca. 50% betragen (20% als untere, 80% als obere Grenze) Mehr als drei Nukleotide in Folge sollen vermieden werden (vor allem Poly-G-Bereiche) Keine Komplementarität zu den PCR-Primern Die Schmelztemperatur (T m ) der Sonde sollte um 5-10 C über dem der PCR-Primer liegen Das Sonden-Template-Hybrid kommt nicht zur Extension wie das Primer-Template- Hybrid und wird deshalb auch nicht von der AmpliTaq Gold Polymerase stabilisiert. Um trotzdem eine genügende Stabilität zu erreichen, wird der T m der Sonde ein wenig erhöht. Die optimale Sondenlänge beträgt zwischen 24 und 30 Nukleotide. Die obere Grenze scheint bei 35 Nukleotiden zu liegen, da längere Sonden durch die Ausbildung von Sekundärstrukturen bei der Hybridisierung Probleme bereiten, die Kontrolle der Hybridisierungstemperatur durch ihre Höhe kaum noch möglich ist und die Kosten für 14

13 längere Sonden unverhältnismäßig hoch sind. Weiters kann die Spaltung der Sonde beeinträchtigt oder die PCR inhibiert werden. Die Bestimmung der Schmelztemperatur (T m ) erfolgt nach der Nearest Neighbour- Methode, da diese Formel derzeit die genaueste Berechnung der T m zuläßt. [17] Diese Formel liegt auch dem Programm Primer Express zu Grunde, das auch in dieser Arbeit dazu benutzt wurde, Primer und Sonden zu konstruieren. Mit der Software Primer Express lassen sich PCR-Primerpaare durch ein vom Benutzer definiertes Screening finden. Die ausgewählten Primer werden weiteren Tests unterzogen, sodaß letztendlich möglichst optimale Primerpaare daraus resultieren. Das Verfahren sucht zuerst die Forward- Primer, dann die möglichen Reverse- Primer und testet zuletzt die möglichen Kombinationen, um optimale Primerpaare zu finden. In diesen Tests werden die Primer zum Beispiel auf das Vorhandensein von G- oder C-Resten, den prozentuellen Gesamtanteil an GC, auf die Tm, auf eine mögliche Wiederholung von gleichen Basen, auf die Bildung von Primerdimeren, auf Sekundärstrukturen wie Schleifenbildungen (loops oder hairpins) oder auf eine mögliche Sequenzähnlichkeit mit anderen Regionen der Target-Sequenz getestet. Bei der Plazierung der Sonde ist darauf zu achten, daß aus Stabilitätsgründen jener Strang ausgewählt wird, der mehr Cytosin- als Guaninreste innerhalb der Sondensequenz enthält. Das 5 Ende der Sonde sollte möglichst nahe dem 3 Ende des Forward-Primers liegen. Diese beiden Sequenzen dürfen direkt aneinander grenzen, sich aber nicht überlappen. Der ideale Abstand dürfte bei <50 bis maximal 60 Basen sein. Ein 72 C-Extensionsschritt sollte vermieden werden; besser ist eine 2-Schritt-PCR mit kombiniertem Hybridisierungs- und Extensionsschritt (> 55 C) bei einer Temperatur unter der Schmelztemperatur der Sonde. Höhere Magnesiumchloridkonzentrationen werden erforderlich, um die Anbindung der Sonde zu stabilisieren und die Anwendung höherer Temperaturen beim kombinierten Hybridisierungs/Extensionsschritt zu ermöglichen. Die Sonde wird in einer Konzentration von 5pM eingesetzt. Die optimale Sondenkonzentration ist vom Fluoreszenzhintergrund sowie der Primerkonzentration abhängig Die Optimierung der Real-Time PCR Die Zahl der PCR-Zyklen, die für ein ausreichendes Signal benötigt werden, hängt von der Menge der zu Beginn der PCR eingesetzten Matrizen-Moleküle ab. In vielen Fällen erhält man auch bessere Signale bei Erhöhung der MgCl 2 Konzentration. Es kommt hierbei zu einer Zunahme der unspezifischen Produkte, die jedoch durch die Sonden-abhängige Detektion kein Problem darstellen. Es werden vor allem auch deshalb bessere Signale gemessen, da bei höherer MgCl2-Konzentration die Sonde stabiler anbindet und somit ein höheres Reportersignal entsteht. Neben einer Reihe von Parametern, die oben schon erwähnt wurden, hat auch die Temperaturführung eine signifikante Auswirkung auf die Signalintensität. 15

14 Wird ein anderes Enzym als die AmpliTaq Gold Polymerase verwendet, so sollte eine einleitende Denaturierung von mindestens 1 Minute bei C erfolgen, um sicherzustellen, daß die Strangtrennung auch effizient verläuft. Besitzt die DNA-Matrize einen hohen G/C- Gehalt, so kann man in den ersten PCR-Zyklen eine Denaturierungstemperatur von 95 C oder 96 C wählen, um die DNA vollständig zu denaturieren. Weiters werden bei G/C-reichen Sequenzen höhere Annealing-Temperaturen ( 65 C) verwendet. Man kann auch PCR-Additive wie Glycerin oder Formamid zusetzen, wovon aber in dieser Arbeit kein Gebrauch gemacht worden ist. Soll vor Kreuzkontaminationen geschützt werden, so wird statt dttp dutp verwendet. Zur Spaltung der PCR-Produkte aus vorangegangenen Reaktionen setzt man zu den PCR- Ansätzen Uracil N-Glykosylase (AmpErase UNG). [18] In diesem Fall ist der PCR ein 2- minütiger Inkubationsschritt bei 50 C vorzuschalten, gefolgt von einer 10-minütigen Phase bei 95 C. Dieser Schritt ist notwendig, um mögliche Kontaminationen zu zerstören und die Uracil N-Glykosylase zu inaktivieren. Dabei wird die Ausgangs-DNA meistens ausreichend denaturiert und die AmpliTaq Gold Polymerase aktiviert. Da die AmpliTaq Gold Polymerase bei einmaliger vorhergehender Aktivierung schon bei Temperaturen über 55 C eine signifikante Aktivität zeigt, können das Binden an den Matrizenstrang und die Extension zu einem gemeinsamen Schritt zusammengefaßt werden, was auf eine separate Extension bei 72 C verzichten läßt. Da die Extension unter 72 C durchgeführt wird, kann die Sondenhydrolyse effizienter verlaufen. Als Ergebnis kann man oft einen Anstieg des sequenzspezifischen Fluoreszenzsignals sehen. Die Primerkonzentrationen bewegen sich zwischen 0,2 und 0,5 µm. Man erhält die optimale Primerkonzentration empirisch durch eine Primermatrix. Hierbei wird der Bereich von 0,05 bis 0,9µM ermittelt. Durch diese Methode können die Unterschiede im Hybridisierungsverhalten der beiden Primer bei den gewählten Reaktionsbedingungen kompensiert werden. Dabei werden verschiedene, auch asymmetrische Konzentrationskombinationen der beiden Primer ausgetestet. Durch die Anwendung asymetrischer Primerkonzentrationen wird eine Veränderung der programmierten Hybridisierungstemperatur um ± 2 C simuliert. Somit wird für jeden Primer ein Temperaturbereich von 4 C überprüft Das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Durch das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (7700 SDS) wird es möglich, die Real-Time PCR Zyklus für Zyklus und online zu verfolgen. Das 7700 SDS hat einen eingebauten Thermocycler, der dem GeneAmp PCR System 9600 entspricht. Um eine Real- Time PCR, d.h. eine Echtzeitanalyse, mit bis zu 96 Proben (Fassungsvermögen einer Mikrotiterplatte) durchzuführen, wurde ein optischer Heizdeckel entwickelt. Über jeder Thermocyclerposition befindet sich eine Linse, die den Lichtstrahl in das jeweilige Reaktionsgefäß weiterleitet. 16

15 Abb. 3-5.: Das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Das Prinzip Die Fluoreszenzanregung erfolgt durch einen Argonlaser (488nm), dessen Strahl über einen dichroiden Spiegel auf einen Multiplexer gelenkt wird. Dieser Multiplexer ist über 96 Lichtleiter mit dem optischen Heizdeckel des Thermocyclers verbunden. Die Lichtleiter enden jeweils über einer der 96 Linsen. Durch den Multiplexer wird der Laserstrahl auf die einzelnen Positionen verteilt. Der Strahl dringt fokussiert durch die Linse in das geschlossene Reaktionsgefäß ein und regt dort die Fluoreszenzemission an, die den Cycler über den selben optischen Leiter wieder verläßt. Die Fluoreszenz wird vom dichroiden Spiegel reflektiert, da sie eine andere Wellenlänge besitzt als der Laserstrahl. Anschließend wird sie über eine Linse erneut fokussiert, auf einen Spektrographen umgeleitet und mittels einer CCD (chargecoupled-device) Kamera in ein digitales Signal umgewandelt. Die CCD-Kamera teilt das Spektrum von 500 bis 660nm in 32 Datenpunkte ein. Ein kompletter Plattenscan dauert 7 Sekunden. So werden für jede Probe alle 7 Sekunden die Emissionsdaten von 500 bis 660 nm gesammelt. Dichroider Spiegel Multiplexer Laser Linse Linse Mikrotiterplatte Spektrograph CCD-Kamera Abb. 3-6.: Graphische Darstellung des Strahlengangs im ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Durch die Analyse im geschlossenen Reaktionsgefäß kann die Gefahr einer Kreuzkontamination wesentlich reduziert werden. Weiters wird die Arbeitszeit durch den 7700 SDS deutlich verringert, da Post-PCR-Schritte wie Gelelektrophoresen entfallen. Die Real-Time-PCR läßt eine sehr hohe mit anderen Methoden nicht erreichbare Präzision zu. 17

16 Man benötigt jedoch spezielle Reaktionsgefäße- MicroAmp Optical Tubes, die keine störende Autofluoreszenz besitzen. Die Außenseite dieser Tubes ist aufgerauht, um eine bessere Reflexion zu erzielen. Zum Verschließen verwendet man die Kunststoffkappen (MicroAmp Optical Caps), die speziell geschliffene optische Deckel aufweisen, damit der Laserstrahl optimal in das Reaktionsgefäß weitergeleitet wird. Die Reaktionen erfolgen in Mikrotiterplatten (MicroAmp Optical 96-Well Plate), die speziell für die Fluoreszenzanalyse entwickelt wurden. Abb. 3-7.: Schema einer Mikrotiterplatte im ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Diese Mikrotiterplatten kann man auch mit einer Klebefolie (Optical Adhesive Covers) verschließen. Sie wurden dazu entwickelt, die gesamte Platte rasch und ohne große Manipulation der Proben abzudecken. Diese Klebefolie schafft einen sehr kleinen Fluoreszenzhintergrund. Um die optische Auflösung zu erhöhen, wird die verschlossene Platte anschließend mit dem Compression Pad abgedeckt. Dieses Kompressions-Kissen stellt den gleichmäßigen Kontakt zwischen Heizdeckel und Mikrotiterplatte sicher. Die Auswertung Bei der Auswertung der Real-Time PCR liefert der SDS 7700 einige Daten und Werte, die die Quantifizierung möglich machen. Das Signal der Real-Time PCR entspricht der Veränderung in der Fluoreszenzemission des Reporterfarbstoffes auf Grund der Hydrolyse der sequenzspezifischen Sonde. Der passive Referenzfarbstoff ROX (6-Carboxy-x-rhodamin) soll störende Abweichungen der Fluoreszenz ausgleichen. Dieser Referenzfarbstoff wird zur Standardisierung der Ergebnisse herangezogen. Rn-Wert Das Reportersignal (Rn-Wert) entspricht dem Quotienten aus der Emissionsintensität des Reporterfarbstoffes und der Emissionsintensität des passiven Referenzfarbstoffes. Damit können unspezifische Einflüsse wie Konzentrationsänderungen auf Grund von Voluminaschwankungen (durch eventuelle Pipettierfehler) ausgeglichen werden. Rn + Werte zeigen die relative Fluoreszenz in den Proben, während die Rn - Werte die Fluoreszenz der NTCs (no template control) zeigen. Die NTC ist der komplette PCR-Ansatz allerdings ohne Template-DNA. 18

17 Rn-Wert Das Hintergrundsignal, das in den ersten paar PCR-Zyklen entsteht, wird vom jeweiligen Rn- Wert abgezogen. Dadurch können Schwankungen, die nicht auf dem PCR-abhängigen Nuklease-Verdau basieren, ausgeglichen werden. Ct-Wert Der sogenannte Treshold Cycle (Ct-Wert) drückt die Zyklenzahl aus, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der Reporterfluoreszenz über der Grundlinie zu beobachten ist. Man kann als allgemeine Regel definieren, daß in einem PCR-System mit hundertprozentiger Effizienz der Ct-Wert mit jeder Verdopplung der Startkopienzahl um einen Zyklus abnimmt. Abb. 3-8.: Einfluß der Sartkopienzahl auf den Ct-Wert Der Ct-Wert ist von der Ausgangskopienzahl der Template-DNA, von der Effizienz der DNA-Amplifikation und des PCR-Systems und der Hydrolyse der TaqMan-Sonde abhängig. Das effizienteste PCR-System hat den niedrigsten Ct-Wert. Die Darstellung des normalisierten Reporters (Rn-Wert) gegen die Zykluszahl besitzt während der PCR drei verschiedene Stufen. Zuerst erscheinen die Rn-Werte als flache Linie, da das Fluoreszenzsignal unter der detektierbaren Schwelle verläuft. In der zweiten Stufe kann das Signal detektiert werden, da es stetig proportional zum Anstieg der PCR-Produkte zunimmt. Erreicht die Template-Konzentration 10-8 M nimmt das Fluoreszenzsignal zu. Im dritten Schritt erreicht das Signal einen nahezu linearen Bereich und endet bei einem Plateau von ca M. Abb. 3-9.: Die 3 Phasen der Real-Time PCR 19

18 Sondenvariationen Zusätzlich zur üblichen TaqMan-Sonde gibt es noch Alternativen, die für bestimmte Arbeitsbereiche Vorteile bieten. In dieser Arbeit wurde eine MGB-TaqMan-Sonde verwendet. MGB steht für minor groove binder. Das bedeutet, daß sich eine Sonde, die mit einem minor groove binder verbunden ist, in die kleine Furche der DNA binden kann. Abb : Chemische Struktur des MGB (minor groove binder) Eine MGB-TaqMan-Sonde besitzt einen nichtfluoreszierenden Quencher am 3 Ende. Aus diesem Grund kann das Sequence Detection System die Reporterfluoreszenz genauer messen. Ebenfalls befindet sich am 3 Ende ein minor groove binder, der die Schmelztemperatur (T m ) von Sonden erhöht [19] und somit das Verwenden von kürzeren Sonden zuläßt. Am 5 Ende trägt diese Sonde den Reporter FAM. Wie auch bei TaqMan- Sonden soll auch bei der Konstruktion von MGB-TaqMan- Sonden darauf geachtet werden, daß sich kein Guaninrest am 5 Ende befindet. Weiters soll die Sonde aus Stabilitätsgründen nicht kürzer als 13 Nukleotide sein. Als Alternative zu TaqMan-Sonden gibt es noch den sogenannten Molecular Beacon. Dabei handelt es sich um eine Schleifenstruktur, der Reporter und Quencher in sterische Nachbarschaft zueinander bringt. Weiters sind noch Lightcycler Hybridisation Probes zu finden, bei dem sowohl Donor als auch Akzeptor auf verschiedenen Oligonukleotiden nebeneinander an die Zielsequenz binden müssen. Ebenfalls am Markt ist der sogenannte dark-quencher, der selbst keine Fluoreszenz aussendet Zusammenfassung Eine erfolgreiche Real-Time PCR benötigt folgende Parameter: Die Primer müssen an die DNA hybridisieren und müssen verlängert werden Die Sonde hybridisiert an die Zielsequenz Die Sonde wird gespalten, was ein Fluoreszenzsignal auslöst Die Primerverlängerung wird vervollständigt. Die Vorteile der Real-Time PCR bestehen vor allem in der Erhöhung der Genauigkeit und Sensitivität. Die Möglichkeit, mit dieser Methode genauer quantifizieren zu können, wird durch den Ct-Wert gegeben, der während der exponentiellen Phase der Reaktion erstellt wird. 20

19 Weiters ist eine relativ einfache Versuchsentwicklung möglich und Kreuzkontaminationen werden reduziert. Der wesentlich kürzere Zeitaufwand gegenüber einer üblichen PCR ist ein weiterer Vorteil. Probenvorbereitung und Real-Time PCR benötigen nur 3-4 Stunden. Als Alternative zur Real-Time PCR kann kompetitive PCR zur Quantifizierung angewandt werden, doch ist vor allem die Optimierung dieser Methode zeit- und auch kostenaufwändig. Ebenso können dadurch nur eine wesentlich kleinere Anzahl an Proben bearbeitet werden. Als Nachteil der Real-Time PCR können die momentan noch hohen Hardware-Kosten und die teuren Reaktionskomponenten genannt werden, die jedoch durch immer stärker werdende Konkurrenz vermutlich weiter sinken werden Die Quantifizierung mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detection System Bei der Quantifizierung mit dem TaqMan PCR Assay werden DNA-Standards aus verschiedenen Spezies hergestellt, deren DNAs auch in den zu untersuchenden Proben zu finden sind. Es wird dabei ein allgemeines einem spezifischen System gegenübergestellt. Dem Standard werden bestimmte Konzentrationen zugeordnet, wobei die unbekannten Proben relativ zum Standard mit dem jeweiligen System bestimmt werden. Durch diese relative Quantifizierung ist es nicht notwendig, den Standards eine absolute Konzentration zuzuordnen, sondern es genügt die exakte Angabe der Verdünnungsstufe. Anhand der Standardwerte werden Kurven erstellt, aus denen über die Ct-Werte die entsprechende Konzentration berechnet wird. In jedem Zyklus während der exponentiellen Phase in der PCR ist die Produktausbeute proportional zur anfänglichen DNA-Kopienzahl. Der 7700 SDS ermittelt die Anfangskopienzahl der Template-DNA, indem er die Änderung des Fluoreszenzsignals von Zyklus zu Zyklus, das aus der Amplifikation der Zielsequenz während der PCR resultiert, analysiert. Je weniger Zyklen man benötigt, um eine detektierbares Fluoreszenzsignal zu erhalten, desto größer ist die Ausgangskopienzahl. Als theoretische Nachweisgrenze ist 1 Kopie im Reaktionsgemisch zu nennen; praktisch sind zwischen 10 und 20 Kopien nachweisbar. Die Grenze der Quantifizierbarkeit liegt bei Kopien. Der nicht zu vermeidende Fehler beträgt zwischen 30 und 50%. Dieser setzt sich aus dem statistischen Fehler zusammen (20-30%) und dem Fehler aus der manuellen Probenvorbereitung. Diese Fehler sind durch die mögliche Detektion im Ultraspurenbereich (100 Kopien g 0,01 fg) tolerierbar. Die Hauptprobleme der Quantifizierung liegen in folgenden drei Punkten: Die Isolierung der DNA ist durch das Vorhandensein unterschiedlicher Matrices schwierig. Bei der Untersuchung verschiedener Lebensmittel liegen immer andere Bedingungen vor, die die Isolationsmethode beeinflussen. Die Reinheit der DNA stellt ein weiteres Problem dar. Vor allem bei Pflanzen-DNAs gestaltet es sich sehr schwierig, Hemmstoffe wie Polysaccharide bei der Isolation zu entfernen. Die genaue Bestimmung der DNA-Menge ist trotz der Verwendung unterschiedlicher Methoden (Photometer und PicoGreen Quantitation Kit) problematisch. [20] Zusammenfassend kann man die Real-Time PCR als Methode der Wahl zur Quantifizierung und vor allem Differenzierung der Gegenwart und Zukunft bezeichnen, da sie eine sehr spezifische und rasche Variante der bisherigen Nachweisverfahren darstellt. 21