Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) Dr. Felix Focke

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1 Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)

2 Warum überhaupt Gewürze? Die Vielseitigkeit der Gewürz-Matrices lässt eine Anpassung der entwickelten Methoden an andere Fragestellungen in der Lebensmittelanalytik erwarten. Aktuelle Methode der Wahl für die Differenzierung von Gewürzen: Mikroskopie Molekularbiologische Methoden können von nicht speziell geschultem Personal angewendet werden. Seite 2

3 Was sind das für Methoden? Nachweis von Organismen über ihre DNA. Ähnliche Methoden werden z.b. in der Forensik genutzt. Jeder Organismus enthält seine (spezifische) DNA. Lebensmittel stammen (fast immer) aus Organismen. Etablierte Methode: PCR (Polymerasekettenreaktion) Spezifische DNA-Abschnitte werden kopiert und somit nachgewiesen DNA Menge Exponentielle Phase Zyklus Endpunkt Seite 3

4 Mittels PCR können wenige ppm nachgewiesen werden: 500 g Backmischung 125 g Rucola 2 mg Senf 0,1 mg Kreuzkraut Seite 4

5 Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) Im Jahre 2000 von Notomi et al. zuerst beschrieben. Kaum Methoden zu Lebensmittelzutaten (-kontaminanten). Isothermale Methode zur Amplifikation von DNA. Reaktion ohne Thermocycler / außerhalb eines Labors. Größerer Substratumsatz im Vergleich zur PCR. Detektion mit bloßem Auge / außerhalb eines Labors. Seite 5

6 Entwicklung, Optimierung und Validierung: DNA-Isolierung - Einheitliche Methode zur Isolierung der DNA aus allen betrachteten Gewürzen Endpunkt PCR - als Gewürz-Nachweis Real-time PCR - zur quantitativen Bestimmung Endpunkt LAMP - als Gewürz-Nachweis? Real-time LAMP - zur quantitativen Bestimmung? - Charakterisierung der LAMP - Ermittlung des Leistungspotentials Seite 6

7 Ergebnis: LAMP als Gewürz-Nachweis (Beispiel: Schwarzer Senf) M [bp] negativ S. alba B. nigra C. carvi (Agarosegel, 2 %, Ethidiumbromidfärbung) Seite 7

8 Quantitative Bestimmung mittels real-time-lamp? (Beispiel: Kümmel) Endpunkt LAMP: Reaktionsansatz ergänzt um SYBR Green I. Reaktionsbedingungen optimiert. Fluoreszenz-Messung im real-time-cycler. rel. Fluoreszenz Zeit [min] Seite 8

9 rel. Fluoreszenz rel. Fluoreszenz Zeit [min] Zyklus real-time LAMP real-time PCR Seite 9

10 Messgröße: PCR: C t -Wert (Schwellenwert-Zyklus). LAMP: T t -Wert (Schwellenwert-Zeit) rel. Fluoreszenz X Zeit [min] Seite 10

11 Korrelation zwischen T t -Wert und DNA-Gehalt: rel. Fluoreszenz Gehalt an Kümmel in einer Backmischung Zeit [min] Seite 11

12 Die Vorteile der LAMP gegenüber der PCR? Ein Nachweis der Gewürze ist mittels LAMP genauso wie mit der konventionellen PCR möglich. Mit Hilfe der real-time LAMP können Gewürzgehalte quantitativ erfasst werden. Die Leistungsgrenzen der LAMP liegen in ähnlichen Bereichen wie die der PCR. Wo sind die Vorteile der LAMP? Seite 12

13 Vor-Ort-Analysen mittels LAMP? Die Amplifikation kann mit Hilfe einer konstanten Wärmequelle (ohne Thermocycler) durchgeführt werden. Welche Möglichkeiten der Detektion bieten sich neben Agarosegelelektrophorese und real-time Analysen? UV UV Calcein Calcein Mg 2+ LAMP Mg dntps 2+ Mn 2+ Mg 2+ Mg 2 P 2 O 7 Mn 2 P 2 O 7 Mg 2+ Mg 2+ Mg 2+ dntps Mg 2+ Seite 13

14 Detektion mit Calcein (Beispiel: weißer und schwarzer Senf) Calcein + weißes Licht Calcein + weißes Licht + UV-Licht Calcein + UV-Licht weißes Licht ohne Calcein Seite 14

15 Zusammenfassung - LAMP Die LAMP ermöglicht einen qualitativen Nachweis und eine quantitative Bestimmung von Gewürzen in Lebensmittelmatrices. Durch isothermale Reaktionsprotokolle und Detektionsverfahren mit dem bloßen Auge ermöglicht die LAMP eine Analytik vor Ort. Fazit:Die LAMP stellt für die Lebensmittelanalytik eine leistungsfähige Methode mit großem Potential in der Vor-Ort- Analytik als Alternative zur PCR dar. Seite 15

16 Zusammenfassung - Überblick Methoden zur DNA-Isolierungaus Gewürzen. Anwendbarkeit der Methoden auf andere Lebensmittelmatrices (z.b. Kaffee) [1]. MDA-basierte Präamplifikation zur Verbesserung des DNA/Inhibitor- Verhältnisses für schwierige Matrices(z.B. Nelke, Piment) [1]. PCR-Nachweisefür 18 Gewürze. Erweiterung der Methode z.b. für die Artendifferenzierung von Kaffee [1]. Real-time PCRfür die quantitative Bestimmungvon allergenen Gewürzen (z.b. Senf und Sellerie). Erweiterung der Methode auf eine aktuelle Fragestellung (Kreuzkraut in Rucolasalat) [2]. LAMP-Methoden als Alternative zur PCR [3]. [1] Focke et al. (2011) DNA-based identification of spices: DNA isolation, whole genome amplification and polymerase chain reaction [2] Focke et al. (2011) Determination of plant contaminants in food using real-time-pcr [3] Focke et al. (in prep.) Development of Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Methods as a Tool for Food Analysis Seite 16

17 ...für die Aufmerksamkeit!...für die Unterstützung Danke... Prof. Dr. Markus Fischer Dr. Ilka Haase Philipp Brüning... meinen Diplomanden Christian Schoefinius Johanna Schiller Dominique Tressat Sonja Schüssler Qi Chen Malte Oetting Annika Sötje Sandra Lorenz für die tollen Arbeiten! Seite 17

18 ... den Sponsoren: Danke... Seite 18