Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung

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1 Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung Alexandra Maas

2 Inhaltsverzeichnis Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung 1. Theoretische Grundlagen Aufbau der Membran von RBCs Hämostase Aggregations-Kaskade in RBCs Adhäsion der RBCs Untersuchung der Regulation der Exposition von PS in RBCs Zusammenfassung Literaturverzeichnis

3 1. Theoretische Grundlagen Die Hauptaufgabe der roten Blutzellen (engl.: red blood cells, RBCs), die in der Medizin als Erythrozyten bezeichnet werden, liegt im Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid innerhalb des Organismus. Für die Bindung des Sauerstoffs bzw. des Kohlendioxids ist das in den roten Blutzellen enthaltene Hämoglobin verantwortlich, welches auf Grund der Anwesenheit von Protoporphyrin IX (Häm) die reversible Bindung dieser Stoffe ermöglicht. Die Vorläufer der roten Blutzellen werden im roten Knochenmark gebildet und verlieren im Laufe ihrer Entwicklung, der Erythropoese, ihren Zellkern, wodurch die roten Blutzellen ihre charakteristische bikonkave Form erhalten. Im Durchschnitt beträgt die Lebensdauer von roten Blutzellen 100 bis 120 Tage, bevor sie vor allem in der Leber oder in der Milz abgebaut werden Aufbau der Membran von RBCs Die Membran der roten Blutzellen ist eine Lipiddoppelschicht und setzt sich aus Proteinen, Lipiden und Kohlenhydraten zusammen. Die Membranlipide lassen sich dabei in drei Klassen einteilen: Phospholipide, Glycosphingolipide und neutrale Lipide, wobei letztere hauptsächlich durch Cholesterol repräsentiert werden. Die am häufigsten auftretenden Membranlipide sind die Phospholipide, die in die beiden Klassen Sphingomyelin und Glycerophospholipide unterteilt werden können. Die Glycerophospholipide lassen sich erneut unterteilen in Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylserin (PS). Zu den Glycerophospholipiden gehören des Weiteren Phosphatidsäure und Phosphatidylinositol (PI), die aber deutlich seltener in die Zellmembran eingebaut werden. Die Lipiddoppelschicht der roten Blutzellen zeigt eine ungleichmäßige Verteilung der Phospholipide zwischen beiden Lipidreihen. Unter physiologischen Bedingungen befinden sich Sphingomyelin und Phosphatidylcholin hauptsächlich in der Membranaußenseite, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin hingegen hauptsächlich in der Membraninnenseite (Abbildung 1). Diese asymmetrische Verteilung ist essentiell für die normale Funktion der Membran und wird durch verschiedene Proteine gewährleistet. 3

4 Abbildung 1: Verteilung der Phospholipide zwischen innerer und äußerer Lipidreihe in verschiedenen Organismen (Nguyen, 2010). Zu den Proteinen, die für die asymmetrische Verteilung der Lipide verantwortlich sind, gehörten die Flippasen, die Floppasen und die Scramblasen. Die ersten beiden katalysieren den Übergang von bestimmten Lipiden von einer Membranseite zur anderen unter ATP-Verbrauch, wobei die Flippasen den Transport zur cytoplasmatischen Seite und die Floppasen den umgekehrten Transport zur exoplasmatischen Seite katalysieren. Bei den Scramblasen hingegen handelt es sich um unspezifische Translokasen, die eine gleichmäßige Verteilung der Lipide in der Membran bewirken. Die Scramblasen wirken somit den Flippasen und Floppasen entgegen (Munk, Abröll, & Kurth, 2008). 4

5 1.2. Hämostase Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung Der Begriff Hämostase fasst alle Prozesse zusammen, die für die Beendigung einer Blutung verantwortlich sind. Dabei werden zwei nacheinander ablaufende Prozesse unterschieden (Behrends, Bischofberger, & Deutzmann, 2012): 1. Primäre Hämostase (Blutungsstillung) Durch eine Verletzung der Endothelwand kommt es zur Freilegung von subendothelialem Kollegen und zur Freisetzung des sog. von-willebrand-faktor (vwf). Dieser bindet gleichzeitig an das freigelegte Kollagen, als auch an einen bestimmten Glykoproteinkomplex auf der Thrombozytenoberfläche. Das Kollagen bindet zusätzlich noch direkt an den Glykoproteinkomplex und diese beiden Interaktionen führen zum Anhaften der Thrombozyten an die Gefäßwand. Des Weiteren kommt es durch die Bindung des vwf an den Glykoproteinkomplex und durch das in geringe Mengen gebildete Thrombin zur Aktivierung der Thrombozyten. Diese Aktivierung führt durch die Auslösung verschiedener Mechanismen zur Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und somit zur Ausbildung eines Thrombozytenpfropfs, der als weißer Thrombus bezeichnet wird. Zusätzlich werden bestimmte Stoffe (Serotonin, Thrombaxan A 2 ) von den Thrombozyten freigesetzt, die eine Vasokonstriktion bewirken. 2. Sekundäre Hämostase (Blutgerinnung) Die sekundäre Hämostase hat den stabilen Wundverschluss durch Ausbildung eines Fibrinnetzes zum Ziel. Dabei werden drei verschiedene Phasen durchlaufen. In der ersten Phase, der Aktivierungsphase, kommt es zur Bildung von Thrombin. Danach wird in der Koagulationsphase ausgehend von Fibrinogen das Fibrinnetz gebildet und daran anschließend erfolgt die Kontraktion des Fibrinnetzes unter Beteiligung der Thrombozyten, wodurch sich die Wundränder einander annähern (Retraktionsphase). Durch die anschließende Einlagerung von Blutzellen (u.a. rote Blutzellen) entsteht der sog. rote Thrombus, der die Wunde stabil verschließt. 5

6 2. Aggregations-Kaskade in RBCs Lange Zeit wurde angenommen, dass die roten Blutzellen nur passiv an dem Prozess der Thrombusbildung beteiligt sind, da davon ausgegangen wurde, dass diese einfach nur im Fibrinnetz gefangen bleiben. Auf Grund von neuen Erkenntnissen, zum Beispiel über den Zusammenhang zwischen reduzierten Hämatokrit-Werten und längeren Blutungszeiten, wurde jedoch auf eine aktive Teilnahme der roten Blutzellen an diesem Prozess geschlossen. In Bezug auf die aktive Beteiligung der roten Blutzellen bei der Thrombusbildung wurde von Kaestner und Bernhardt eine Signalkaskade zur Aggregation der roten Blutzellen vorgeschlagen, die auf der Aufnahme von Ca 2+ über einen nicht-selektiven Kationen-Kanal beruht (Abbildung 2). Abbildung 2: Vorgeschlagene Signalkaskade zur Aggregation der roten Blutzellen nach Stimulation (Nguyen, 2010). Das Modell besagt, dass die Aktivierung von Thrombozyten, die zum Beispiel durch eine Verletzung ausgelöst wird, zur Freisetzung von Lysophosphatidylsäure (LPA) und Prostaglandin E 2 führt. Diese Substanzen aktivieren einen nicht-selektiven, spannungsabhängigen Kationen-Kanal (NSVDC), durch den Ca 2+ in das Innere der roten Blutzellen einströmen kann. Der schnelle Anstieg der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration führt dann zur Aktivierung des Gardos-Kanals und der Scramblase, sowie zur Inhibierung der Flippase. 6

7 Der Gardos-Kanal gehört zur Gruppe der Ca 2+ -aktivierten K + -Kanäle und der Einstrom von Ca 2+ bewirkt einen Efflux von K + und Cl - und führt schließlich zum osmotisch bedingten Wasserausstrom und somit zum Schrumpfen der Zelle. Die Aktivierung der Scramblase und der Flippase haben eine Umverteilung der Phospholipide in der Zellmembran zur Folge, wodurch es zur Exposition von Phosphatidylserin kommt, welches unter physiologischen Bedingungen fast ausschließlich auf der cytosolischen Membranseite auftritt. Diese führt schließlich zur Adhäsion und Aggregation der roten Blutzellen. 3. Adhäsion der RBCs Die vorgeschlagenen Interaktionen, die zur Adhäsion der roten Blutzellen durch die Exposition von Phosphatidylserin führen, sind in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3: Vorgeschlagenes Modell zur Adhäsion der RBCs durch Exposition von Phosphatidylserin (Nguyen, 2010). Eine Möglichkeit besteht darin, dass das von den aktivierten roten Blutzellen oder von Mikrovesikeln exponierte Phosphatidylserin von den Phosphatidylserin-bindenden Rezeptoren oder der CD36-Rezeptoren, die sich auf der Oberfläche der Zelle befinden, 7

8 gebunden wird. Dies führt entweder zur Adhäsion der roten Blutzellen an die Endothelzellen oder zum Aneinanderheften der Blutzellen untereinander. Eine weitere Interaktion tritt in Anwesenheit von Calcium-Ionen auf. Dabei kommt es zur Ausbildung einer Brückenstruktur zwischen zwei Phosphatidylserinen, wodurch die Blutzellen aneinander adhärieren können. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie konnte diese Adhäsion zwischen zwei roten Blutzellen nachgewiesen werden. Das grundlegende Prinzip, das zur Bestimmung der Adhäsionskräfte zwischen zwei Zellen verwendet wird, ist in Abbildung 4 dargestellt. Bei dieser Methode wird zunächst eine Zelle am Cantilever und eine andere Zelle an einer Oberfläche angeheftet. Anschließend werden die Zellen miteinander in Kontakt gebracht und dann wieder voneinander gelöst. Die entsprechende Adhäsionskraft, die zwischen beiden Zellen wirkt, wird durch die Auslenkung des Cantilevers ermittelt. Abbildung 4: Prinzip der Kraftmessung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (Steffen et al., 2011). Zur Ermittlung der Adhäsionskräfte zwischen roten Blutzellen wurde der Versuch einmal mit unbehandelten roten Blutzellen durchgeführt und zusätzlich mit roten Blutzellen, die zuvor mit 2,5 μm LPA behandelt wurden. Entsprechende Beispiele für die erhaltenen Kraft-Distanz-Kurven von den unbehandelten Kontrollzellen und den Zellen nach LPA-Behandlung sind der Abbildung 5 zu entnehmen. 8

9 Abbildung 5: Beispiel einer Kraft-Distanz-Kurve von unbehandelten Zellen (grün) und von Zellen, die zuvor mit LPA behandelt wurden (rot) (Steffen et al., 2011). In den Kontrollmessungen mit den unbehandelten Zellen konnten nur sehr schwache Interaktionen zwischen den roten Blutzellen nachgewiesen werden (Abbildung 5, grüne Linie). Die durchschnittliche Kraft, der zur Trennung der beiden Zellen voneinander benötigt wurde, lag bei 28,8 ± 8,9 pn. Nach der Behandlung mit LPA konnten deutlich stärke Adhäsionskräfte zwischen den roten Blutzellen beobachtet werden (Abbildung 5, rote Linie). Bei diesen Zellen lag die durchschnittliche Kraft, die zur Trennung benötigt wurde bei 100 ± 8,4 pn und somit deutlich über dem Wert, der für die Kontrollzellen ermittelt wurde (Steffen et al., 2011). Demnach zeigten roten Blutzellen nach entsprechender Stimulation ein deutlich stärkeres Adhäsionsverhalten als unbehandelte rote Blutzellen. 9

10 4. Untersuchung der Regulation der Exposition von PS in RBCs Die Exposition von Phosphatidylserin hat nachweislich bedeutende physiologische Konsequenzen. Neben der verstärkten Zell-Zell-Interaktion, dient die Phosphatidylserin- Exposition auch als Signal für die Einleitung der Eryptose und für die Entfernung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen. Die Exposition von Phosphatidylserin auf Thrombozyten spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung. Das exponierte Phosphatidylserin ermöglicht die Anlagerung von Gerinnungsfaktoren, wie zum Beispiel von Prothrombinase oder dem Tenasekomplex. Auf Grund von unterschiedlichen Ergebnissen in Bezug auf den Mechanismus, der die Exposition von Phosphatidylserin auslöst, wurde der Zusammenhang zwischen erhöhter intrazellulärer Calcium-Konzentration und der Phosphatidylserin-Exposition noch mal genauer untersucht (Nguyen et al., 2011). Es besteht ein nachweislicher Zusammenhang zwischen einer erhöhten intrazellulären Calcium-Konzentration und bestimmten Prozessen, die für die Exposition von Phosphatidylserin von Bedeutung sind. Dazu zählt die Aktivierung der Scramblase und die Inhibierung der Flippase, als auch die Aktivierung des Gardos-Kanals. Die Aktivierung des Gardos-Kanals führt zum Verlust von KCl und Wasser, was zur Folge hat, dass die Zelle schrumpft. Des Weiteren bewirkt die erhöhte intrazelluläre Calcium-Konzentration die Aktivierung der Proteinkinase Cα und der Ca 2+ -Pumpe. Zusätzlich wird die Calcium-abhängige Protease Calpain aktiviert, die zum Abbau des Zytoskeletts und zur Bildung von Membranbläschen und Mikrovesikeln führt. Um den Zusammenhang zwischen der intrazellulären Calcium-Konzentration und der Exposition von Phosphatidylserin zu untersuchen, wurden die roten Blutzellen mit drei unterschiedlichen Substanzen behandelt. Die Substanz LPA wird von aktivierten Thrombozyten freigesetzt und führt zu einem Anstieg der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration, indem ein nicht-selektiver Kationen-Kanal aktiviert wird. Der Calcium-Ionophor A23187 hingegen wirkt als Carrier und transportiert die Ca 2+ -Ionen durch die Membran und bewirkt auf diese Weise einen erhöhten Ca 2+ -Gehalt im Inneren der roten Blutzellen. Die Substanz PMA dient der Aktvierung verschiedener Isoformen der Proteinkinase C, die auch bei der Exposition von Phosphatidylserin auf der Zellmembran eine wichtige Rolle spielen. 10

11 Um die intrazellulären Ca 2+ -Konzentration zu ermitteln wurden die Zellen mit dem calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM behandelt und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert. Der Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM ist auf Grund seiner Acetoxyacetylester-(AM)-Gruppe in der Lage, die Lipiddoppelschicht zu überqueren. Im Zytoplasma werden die AM-Gruppen durch unspezifische Esterasen gespalten, wodurch das Fluo-4 an die freien Ca 2+ -Ionen binden kann. Diese Bindung führt dann zu einer deutlichen Erhöhung der Emission des Fluoreszenzfarbstoffs (Halle, 2005). Nach der Behandlung der roten Blutzellen mit den verschiedenen Substanzen zeigten sich über einen Zeitraum von 30 Minuten unterschiedliche Verläufe der Fluoreszenzintensitäten (Abbildung 6). Abbildung 6: Fluo-4 AM Fluoreszenzintensitäten der RBCs in Bezug auf den Ca 2+ -Gehalt nach Behandlung mit LPA, A23187 und PMA (Nguyen et al., 2011). Die Zugabe von LPA bewirkte einen schnellen Anstieg der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration, die über 30 Minuten relativ konstant blieb. Bei der Behandlung mit dem Ionophor A23187 konnte am Ende der Untersuchung eine gleiche Ca 2+ -Konzentration, wie bei LPA-Behandlung nachgewiesen werden, jedoch zeigte sich zu Beginn eine verzögerte Ca 2+ -Aufnahme. Diese Verzögerung kann dadurch erklärt werden, dass sich der Ionophor zuerst in die Membran 11

12 einlagert, bevor er als Ionophor wirkt. Im Vergleich zu LPA und A23187 zeigte PMA eine deutlich verringerte Aufnahme von Ca 2+. Durch die Behandlung mit PMA konnte nur ungefähr die Hälfte der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration erreicht werden, die nach 30 Minuten bei LPA und A23187 ermittelt wurde. Ähnliche Ergebnisse konnten bei der Analyse der Zellen mittels der Durchflusszytometrie nachgewiesen werden (Abbildung 7, schwarze Balken). Abbildung 7: Mittels Durchflussanalyse ermittelter prozentualer Anteil an RBCs mit erhöhter intrazellulärer Ca 2+ Konzentration (Nguyen, 2010). Nahezu alle Zellen, die zuvor mit dem Ionophor A23187 behandelt wurden zeigten eine deutlich erhöhte intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration (99,2 %). Auch nach der Zugabe von LPA könnten bei 80 % der Zellen eine verstärkte intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration nachgewiesen werden. Bei PMA hingegen zeigte sich dies nur für ca. 40 % der Zellen (Nguyen et al., 2011). Zusätzlich zu der Ca 2+ -Konzentration wurde mittels der Durchflusszytometrie des Weiteren die Phosphatidylserin-Exposition untersucht (Abbildung 8). Die Analyse der Exposition von Phosphatidylserin erfolgte mit Hilfe von Annexin V-FITC, welches an das Phospholipid bindet und somit den Nachweis ermöglicht. 12

13 Abbildung 8: Mittels Durchflussanalyse ermittelter prozentualer Anteil an RBCs mit signifikanter PS-Exposition. (links) in Anwesenheit von extrazellulärem Ca 2+, (rechts) in Abwesenheit von extrazellulärem Ca 2+ (Nguyen et al., 2011). Die Analyse zeigte, dass ca. 35 % der Zellen nach Behandlung mit LPA und nur ca. 20 % der Zellen nach Behandlung mit A23187 eine Exposition von Phosphatidylserin aufwiesen. Die stärkste Phosphatidylserin-Exposition konnte nach Stimulation der Zellen mit PMA beobachtet werden (80 %). Zusätzlich wurde der gleiche Versuch ohne extrazelluläres Ca 2+ durchgeführt. Dabei konnte lediglich für die Zellen, die zuvor mit PMA behandelt wurden, eine Phosphatidylserin-Exposition nachgewiesen werden (50 %). Durch Zugabe von LPA und A23187 konnte keine Exposition detektiert werden. Die aus der Analyse der Phosphatidyserin-Exposition gewonnenen Ergebnisse können nicht mit den Ergebnissen zur Untersuchung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration zur Deckung gebracht werden. Dieser fehlende Zusammenhang zwischen intrazellulärer Ca 2+ -Konzentration und der Exposition von Phosphatidylserin konnte auch mittels der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bestätigt werden (Abbildung 9). Bei dieser Untersuchung zeigte sich, dass bei manchen Zellen zwar eine erhöhte Ca 2+ -Konzentration nachgewiesen werden konnte, aber diese Zellen kein Phosphatidylserin auf ihrer Zellmembran exponierten. Auch der umgekehrte Zustand konnte beobachtet werden. In diesem Fall erfolgte eine Exposition 13

14 von Phosphatidylserin, aber für diese Zellen könnte kein erhöhter intrazellulärer Ca 2+ -Gehalt detektiert werden (Nguyen et al., 2011). Abbildung 9: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie von Fluo-4 AM und Annexin V-alexa 568 markierten RBCs nach der Behandlung mit LPA, A23187 und PMA (Nguyen et al., 2011). Basierend auf den Ergebnissen, die bei diesen Untersuchungen erhalten wurden, wurden drei verschiedene Mechanismen vorgeschlagen, die für die Exposition von Phosphatidylserin in roten Blutzellen verantwortlich sind. Dazu gehört zum einem die Aktivierung der Scramblase und die Inhibierung der Flippase durch eine erhöhte intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration. Die Calcium-Aufnahme kann dabei über verschiedene Wege erfolgen. Durch Stimulation mit LPA wird zum Beispiel der nicht-selektive Kationen-Kanal (NSVDC-Kanal) aktiviert, wohingegen PMA dazu führt, dass der ω-agatoxin-tk-sensitive, Cav2.1-like (P/Q-type)-Ca 2+ -Kanal geöffnet wird (Andrews, Yang, & Low, 2002). Der zweite 14

15 Mechanismus der zur Exposition von Phosphatidylserin führt, beruht auf einer direkten Aktivierung der Proteinkinase Cα. Dieser Zusammenhang konnte deutlich bei der Untersuchung der roten Blutzellen nach Behandlung mit PMA beobachtet werden. Durch Untersuchungen von roten Blutzellen aus Schafen, denen das Enzym Scramblase fehlt, konnte ein weiterer Mechanismus identifiziert werden. Hierbei kommt es vermutlich zur Einlagerung von LPA in die Membran was einen Lipid-Flop von Phosphatidylserin von der Membraninnenseite zur Membranaußenseite bewirkt. 5. Zusammenfassung Durch die Exposition von Phosphatidylserin auf der Zellmembran kommt es zur Adhäsion der roten Blutzellen an die Endothelzellen oder zum Aneinanderheften der roten Blutzellen untereinander. Die Mechanismen, die dieser Exposition zu Grunde liegen sind sehr komplex und noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte aber nachgewiesen werden, dass die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration und die Proteinkinase C dabei von großer Bedeutung sind. Des Weiteren konnte in zusätzlichen Versuchen gezeigt werden, dass auch weitere Faktoren, wie zum Beispiel die K + -Konzentration, das Zellvolumen, aber auch die Ca 2+ -Pumpe ebenfalls einen Einfluss auf die Phosphatidylserin-Exposition ausüben. Auch wenn die grundlegenden Prozesse noch nicht vollständig aufgeklärt sind, bieten diese neue Erkenntnisse, die zur Adhäsion von roten Blutzellen führen, neue Möglichkeiten, die sowohl in Bezug auf die Therapie, als auch zur Prävention der Thrombusbildung verwendet werden können. 15

16 6. Literaturverzeichnis Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung Andrews, D. a, Yang, L., & Low, P. S. (2002). Phorbol ester stimulates a protein kinase C- mediated agatoxin-tk-sensitive calcium permeability pathway in human red blood cells. Blood, 100(9), doi: /blood.v Behrends, J., Bischofberger, J., & Deutzmann, R. (2012). Duale Reihe Physiologie (p. 848). Georg Thieme Verlag. Retrieved from Halle, A. (2005). Streptococcus pneumoniae induziert Apoptose in zerebralen Endothelzellen : Die Rolle bakterieller Toxine. Munk, Abröll, & Kurth. (2008). Biochemie - Zellbiologie (pp ). Georg Thieme Verlag KG. Nguyen, D. B. (2010). Phosphatidylserine exposure in red blood cells : A suggestion for the active role of red blood cells in blood clot formation. Nguyen, D. B., Wagner-britz, L., Maia, S., Steffen, P., Wagner, C., Kaestner, L., & Bernhardt, I. (2011). Cellular Physiology Biochemistry and Biochemistr y Regulation of Phosphatidylserine Exposure in Red Blood Cells, Steffen, P., Jung, A., Nguyen, D. B., Müller, T., Bernhardt, I., Kaestner, L., & Wagner, C. (2011). Stimulation of human red blood cells leads to Ca2+-mediated intercellular adhesion. Cell calcium, 50(1), doi: /j.ceca