Gruppenpräparat im Organisch-Chemischen Praktikum II WS 2006/07. Versuch

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1 Gruppenpräparat im Organisch-Chemischen Praktikum II WS 2006/07 Versuch Patricia Stadtmüller Frank Güthlein Julian Mager Sabin Suraru Martin Schmid Prisca Eckert

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 2 2. Theoretische Grundlagen Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC) 4 3. Durchführung 4 4. Experimental-Teil Darstellung von (S)-3-Hydroxybutansäureethylester Derivatisierung mit (S)-Phenylethylsiocyanat Aktivierung von Raney-Nickel Synthese von rac-3-hydroxybutansäureethylester 6 5. Auswertung und Diskussion der Spektren Gaschromatographien HPLC-Spektren NMR-Spektren Perspektiven Gesamtdiskussion Literatur 12 1

3 1. Einleitung Aus wirtschaftlicher Perspektive haben Hefen eine große Bedeutung, vor allem zur Herstellung von Nahrungs- und Genussmitteln. Aber auch in der präparativen organischen Chemie kann man Hefen zur Synthese nutzen, da diese häufig einen hohen Grad an Stereoselektivität aufweisen. Im Rahmen des organisch-chemischen Praktikums war es Aufgabe unserer Gruppe die Reduktion von Acetessigsäureethylester mittels Hefekulturen näher zu untersuchen. In der Literatur 1 wurde über eine derartige Synthese berichtet, wobei das (S) - Enantiomer zu 93% erhalten wurde. Um dieses Verhältnis zu bestimmen, wurde eine Derivatisierung mit (S) Phenylethylisocyanat durchgeführt. Die erfolgreiche Umsetzung wurde NMRspektroskopisch belegt und die dabei entstandenen Diastereomere mittels GC und HPLC untersucht. OH O O O (R) Hefe, Zucker OEt ca. 7% OEt H 2 O, 145h, RT OH O (S) OEt ca. 93% Me OCN (S) Toluol, N 2 48h, 90 C O Me O O N H (S) EtO (S) 2

4 2. Theoretische Grundlagen Grundsätzlich wird bei allen chromatographischen Untersuchungen die zu untersuchende Substanz mit Hilfe eines Laufmittels (mobile Phase) über eine stationäre Phase geleitet. Die mobile Phase ist flüssig oder gasförmig, die stationäre ist meist fest, kann aber auch flüssig sein. Aufgrund der unterschiedlichen Polarität der Komponenten des zu trennenden Gemisches absorbieren diese verschieden stark an der stationären Phase. Dementsprechend variiert ihre Laufgeschwindigkeit und man erreicht eine gute Auftrennung am Ende der Säule. Der Vorteil dieser Methode ist, dass ein Gemisch aufgetrennt und analysiert werden kann, ohne dass die einzelnen Substanzen dabei verändert oder zerstört werden. Der Grad der Auftrennung lässt sich durch geeignete Wahl der mobilen Phase variieren. Die Auftrennung von sehr kleinen Produktmengen, bei der vor allem die Analyse und weniger die Weiterverarbeitung im Vordergrund steht, lässt sich sehr gut mittels Gaschromatographie (GC) oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high pressure liquid chromatography, HPLC) realisieren. 2.1 Gaschromatographie (GC) Bei der GC wird die zu untersuchende Probe in den gasförmigen Zustand gebracht. Wichtig ist, dass sie sich dabei nicht zersetzt. Bild 1 zeigt den schematischen Aufbau eines Gaschromatographen. Bild1: Schematischer Aufbau eines Gaschromatographen Die zu untersuchende Probe wird nach der Injektion verdampft und mit Hilfe eines inerten Trägergases (Helium, Wasserstoff oder Stickstoff) über eine heiße Säule geleitet. Ein Detektor misst am Ende der Säule die Veränderung der Wärmeleitfähigkeit oder Flammenionisation und errechnet daraus ein Spektrum. 3

5 Dieses kann am Computer ausgewertet werden. Die Laufzeit lässt qualitative Aussagen zu, während man über die Integration der erhaltenen Peaks Aussagen über die Menge und Mengenverteilung machen kann. Als stationäre Phase werden aufgerollte Kapillarsäulen zum Beispiel aus Kieselgel verwendet. Da diese beim Gaschromatographen aus finanziellen Gründen nicht beliebig oft ausgetauscht werden kann, muss sie sorgfältig ausgesucht und behandelt werden. Aufgrund dieser Tatsache kann man bei einer GC meistens nur wenige Parameter verändern, da normalerweise nur eine einzige Säule pro Gaschromatograph zur Verfügung steht. Im Labor werden normalerweise nur die Heizrate, die Start- und die Endtemperatur verändert. Allgemein lassen sich fast alle chromatographischen Arbeitsgeräte mit einer Vielzahl an Analysatoren koppeln. Eine interessante Möglichkeit ergibt sich durch die Kopplung der GC mit einem Massenspektrometer (MS). Bei der GC-MS werden die einzelnen Substanzen am Ende der Säule massenspektrometrisch untersucht, so dass dadurch eindeutige Aussagen über die Substanzen, die die einzelnen Peaks darstellen gemacht werden können Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC) Der Aufbau der HPLC entspricht im Wesentlichen dem der GC. Hier ist die mobile Phase jedoch flüssig. Dadurch wird eine einfache Variation des Laufmittels oder des Laufmittelgemisches möglich. Statt der Temperatur kann bei der HPLC der Druck verändert werden. Die qualitative und quantitative Analyse entspricht der der GC. Allerdings gibt es eine größere Auswahl an Detektoren, zum Beispiel der UV/VIS-, der IR-, der Refraktometer- und der Polarimeterdetektor. Theoretisch ist auch bei der HPLC eine Kopplung mit MS möglich. 3. Durchführung Zunächst wurde nach der Anleitung (S)-3-Hydroxybutansäureethylester dargestellt und anschließend eine Derivatisierung mit (S)-Phenylethylisocyanat durchgeführt. Das erhaltene Produkt wurde mittels GC- und dann mittels HPLC-Messungen untersucht. Zum Vergleich wurde mit Raney-Nickel ein racemisches Gemisch an 3- Hydroxybutansäureethylester hergestellt und derivatisiert. Anschließend wurde nach 4

6 der ersten Vorschrift ein großer Ansatz an Produkt synthetisiert, so weit wie möglich aufgereinigt, und von diesem zur Überprüfung der Reinheit und der qualitativen Analyse ein NMR-Spektrum aufgenommen. 4. Experimentalteil 4.1 Darstellung von (S)-3-Hydroxybutansäureethylester Die Optimierung der Synthese von (S)-3-Hydroxybutansäureethylester mit Hilfe von Hefe war bereits Thema des OPII-Gruppenpräparats von H. Bürckstümmer, Y. Hemberger und J. Köhler im SS2006. Die dabei durchgeführten Versuche zeigten, dass eine Reduzierung der Ansatzgröße zum Teil zu drastischen Ausbeuteverlusten führte. Zur Herstellung von (S)-3-Hydroxybutansäureethylester wurde die hier optimierte Versuchsanleitung übernommen, mit der Ausnahme, dass die gesamte Umsetzung bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Die Synthese wurde in einem 3L-Rundkolben mit großem Rührfisch durchgeführt. Es wurden 300g Haushaltszucker in 1.6 L Wasser aufgelöst und 200 g Backhefe zugegeben. Nach einer Stunde wurden 20 g (0.15 mol) frisch destillierter Acetessigsäureethylester zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren wurde ein Liter Zuckerlösung (200 g Zucker in 1 L Wasser) und nach einer Stunde weitere 20 g (0.15 mol) des Acetessigsäureethylesters zur Reaktionsmischung gegeben. Diese wurde weitere 120 Stunden in einem Wasserbad gerührt. Nach wiederholter Zugabe von 200 g Zucker wurde über Nacht weitergerührt. Eine DC-Kontrolle (Petrolether: Diethylether 1:1, KMnO 4 ) wies auf die vollständige Umsetzung des Acetessigsäureethylester hin. Zur Aufreinigung des Produkts wurden 80 g Celite zugegeben und die Hefe abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Kochsalz gesättigt und fünfmal mit Diethylether extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt. Destillation des Rückstands ergab g eines farblosen Öls (58 C, 7 hpa, 14.2 mmol, 48%). 3 Charakterisierung: 1. Fraktion: m = g n 20 D = C 2. Fraktion: m = g n 20 D = C (60 hpa) 5

7 IR-Spektrum: Acetessigester: υ(c=o) = 1710cm -1, υ(cooet) = 1730cm -1 Hydroxybutansäureethylester: υ(oh) = 3450 cm -1 (breit), υ(cooet) = 1730cm -1, Sowohl der Siedepunkt als auch der Brechungsindex stimmen mit den Werten überein, die im Gruppenpräparat 2006 erhalten wurden. 4.2 Derivatisierung mit (S)-Phenylethylisocyanat 10 μl (77 μmol) (S)-3-Hydroxybutansäureethylester wurden in 5 ml absolutiertem Toluol unter Stickstoffatmosphäre mit 10 μl (71 μmol) (S)-Phenylethylisocyanat versetzt und 48 Stunden auf 90 C erhitzt. Das erhaltene Produkt wurde GC- bzw. HPLC analytisch untersucht. Die Synthese wurde mit einem großen Ansatz wiederholt. Hierbei wurden 2.7 ml (21 mmol) (S)-3-Hydroxybutansäureethylester und 3.0 ml (3,13g, 21 mmol) (S)- Phenylethylisocyanat in 500 ml Toluol verwendet Aktivierung von Raney-Nickel In einem 1L-Dreihalskolben wurden 600 ml einer 10%igen Natriumhydroxid-Lösung vorgelegt und über einen Zeitraum von 70 Minuten 40.0g (682 mmol) einer Nickel- Aluminium Legierung (50%) hinzugegeben. Es wurde noch 30 Minuten lang weiter gerührt und anschließend die Lösung abdekantiert. Der Rückstand wurde fünfmal mit je 200 ml Wasser und fünfmal mit je 50 ml Ethanol so gewaschen, dass der Feststoff ständig von Flüssigkeit bedeckt war. Bis zur weiteren Verwendung wurde das auf diese Weise aktivierte Raney-Nickel unter Ethanol aufbewahrt Synthese von rac-3-hydroxybutansäureethylester O O OEt Raney-Nickel EtOH, ΔT, 5h OH O OEt rac Es wurden 4.00g (3.93 ml, 30.7 mmol) Acetessigester zu einer Suspension von 20g Raney-Nickel in 100 ml Ethanol hinzugegeben und 5 Stunden lang unter Rückfluss 6

8 erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Suspension filtriert und der Rückstand noch dreimal mit je 50 ml Ethanol gewaschen. Von den vereinigten Filtraten wurde im Vakuum das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand fraktionierend destilliert. Destillation des Rückstands ergab 3.35g g eines farblosen Öls (25.3 mmol, 82%; Lit: 96%) 6 Charakterisierung: 1. Fraktion: m = 0.27 g n 20 D = nicht ermittelt C 2. Fraktion: m = 3.35 g n 20 D = C (60 hpa) IR-Spektrum: Acetessigester: υ(c=o) = 1710cm -1, υ(cooet) = 1730cm -1 Hydroxybutansäureethylester: υ(oh) = 3450 cm -1 (breit), υ(cooet) = 1730cm -1, 5. Auswertung und Diskussion der Spektren 5.1 Gaschromatographien Die Ausarbeitung einer Analytik mittels Gaschromatographie war die eigentliche Aufgabe des Gruppenpräparats. Nach Aufnahme des Übersichtsspektrums wurde versucht, durch Messungen der Einzelsubstanzen mit Hilfe des Ausschlussverfahrens die Substanzen den im Übersichtsspektrum enthaltenen Peaks zuzuordnen. Substanz Retentionszeit Derivat - (S)-3-Hydroxybutansäureethylester 2.92 min Toluol 2.54 min (S)-Phenylethylisocyanat 3.58 min Die Ausarbeitung einer GC-Analytik gestaltete sich im Praktikum auf Grund der gegebenen technischen Limitationen schwierig, da sich die in der Literatur vorgegebenen Bedingungen nicht realisieren ließen (Trägergas, Säule). Zudem ließ die Auflösung des Ausgabegeräts zu wünschen übrig. Die aufgenommenen Spektren 7

9 sind wenig aussagekräftig, insbesondere der eigentlich zu untersuchenden Substanz lässt sich auf keinem der aufgenommenen Spektren eindeutig ein Peak zuordnen. Auf Grund dieser Umstände erfolgte die weitere Analyse des Reaktionsgemischs mittels HPLC. 5.2 HPLC-Spektren Als Alternativmöglichkeit zur Gaschromatographie stand HPLC zur Verfügung. Hier konnten auf Grund der gegebenen Variationsmöglichkeiten in der Wahl des Eluenten, der größeren Auflösung des Ausgabegeräts und der schnelleren Durchführbarkeit deutlichbessere Ergebnisse erhalten werden. Um das Produkt zu identifizieren wurden vier Messreihen durchgeführt. 1. Messreihe Alle Spektren der 1. Messreihe wurden mit einem Laufmittel von 100 % frisch destilliertem Methanol durchgeführt. Zuerst wurde ein Spektrum des Derivats in Toluol angefertigt (Spektrum 1). Im Folgenden wurde, wie auch bei den gaschromatographischen Untersuchungen versucht, durch Einzelmessungen (Spektrum 2-4) und Abgleich der Retentionszeiten die einzelnen Substanzen zu identifizieren und den ensprechenden Peaks zuzuordnen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Substanz Retentionszeit Derivat - (S)-3-Hydroxybutansäureethylester 3.47 min Toluol min (S)-Phenylethylisocyanat 2.33 min Da die Retentionszeiten der einzelnen Substanzen sehr nah beieinander lagen, kann man den vorliegenden Daten der ersten Messreihe nur wenig Aussagekraft zuordnen. Vor allem konnte kein Peak dem gewünschten Produkt eindeutig zugeordnet werden. Im Gegensatz zur Gaschromatographie, bei der eine Änderung des Eluenten nur umständlich möglich ist, bot HPLC hier eine einfache und schnelle Möglichkeit, durch Variation des Laufmittels eine bessere Trennleistung zu erzielen. 8

10 2. Messreihe Im Verlauf der zweiten Messreihe wurde ein Laufmittelgemisch von 60 % frisch destilliertem Methanol und 40 % HPLC-Wasser verwendet. Die Vorgehensweise deckt sich mit dem der ersten Messreihe. Substanz Retentionszeit Derivat 8.38 (S)-3-Hydroxybutansäureethylester 1.83 Toluol 10 (S)-Phenylethylisocyanat Hier konnte man im Übersichtsspektrum (Spektrum 1) deutlich einen Peak erkennen, der in keinem der Vergleichsspektren auftauchte (Substanz 012). Bei diesem Peak handelte es mit großer Wahrscheinlichkeit um das synthetisierte Derivat. Auffällig war, dass (S)-Phenylethylisocyanat einen Doppelpeak lieferte. Dieser Sachverhalt konnte auch im Rahmen der weiteren Untersuchungen nicht eindeutig geklärt werden, und es wird angenommen, dass es sich dabei um ein Zersetzungsprodukt des enantiomerenreinen Reagenzes auf der Säule handelt. Um die Reinheit von (S)- Phenylethylisocyanat sicherzustellen, wurde diese Substanz NMR-spektroskopisch untersucht. 3. Messreihe Da das in der zweiten Messreihe verwendete Laufmittelgemisch gute Ergebnisse lieferte, wurde auch in der dritten Messreihe damit gearbeitet. Diese Messreihe zielte darauf ab, die Ergebnisse aus der zweiten Messreihe zu bestätigen, und die eigentliche Aufgabe, nämlich die Bestimmung des Diastereomerenverhältnises zu lösen. Dazu wurden die Messungen mit einem aufgereinigten, größeren Ansatz der Substanz durchgeführt, der nur noch wenig Toluol enthielt. Substanz Retentionszeit Derivat 7.57 (S)-3-Hydroxybutansäureethylester 1.97 Toluol 10 (S)-Phenylethylisocyanat 3.38 Die Ergebnisse der zweiten Messreihe konnten größtenteils bestätigt werden, die Schwankungen der Retentionszeiten liegen im Toleranzbereich. Schön zu sehen ist, dass es sich beim Produkt eindeutig um zwei Substanzen mit unterschiedlichen 9

11 physikalischen Eigenschaften handelt. Leider konnten die beiden Peaks auf Grund der Überlagerung nicht getrennt voneinander integriert werden. 4. Messreihe Um die Ergebnisse der dritten Messreihe zu untermauern, wurde der Alkohol mit Hilfe von Raney-Nickel racemisch hergestellt und dann mit (S)-Phenylethylisocyanat umgesetzt. Wie erwartet fanden sich an der entsprechenden Stelle zwei annähernd gleich große Peaks, wodurch die Retentionszeiten aus der dritten Messreihe untermauert werden konnten. Substanz Derivat Retentionszeit min 5.3 NMR-Spektren Da zum gewünschten Produkt keine Vergleichsretentionszeiten auf der verwendeten Säule in der Literatur bekannt sind, musste zusätzlich zur HPLC noch eine qualitative Analyse der erhaltenen Substanz durchgeführt werden. Die NMR-Spektroskopie bietet ein einfaches, schnelles und trotzdem genaues Verfahren zur Analyse von unbekannten Substanzen, sowie zur Überprüfung ihrer Reinheit (S) Phenylethylisocyanat 1 H-NMR (250,13 MHz, gemessen in CDCl 3 ) δ=1,57 (d,3h) δ=4.78 (q,1h) δ=7.4 (s,5h) Von (S) Phenylethylisocyanat wurde zur Überprüfung der Reinheit ein NMR- Spektrum gemessen (s. HPLC Teil 3.3). Das Spektrum beweist, dass die Substanz sauber und frei von Verunreinigungen ist. 10

12 5.3.2 Derivat 1 H-NMR (250,13 MHz, gemessen in CDCl 3 ) O B O N H E Ph H A G F CO 2 D C δ= (m,6h) Protonen A,B δ= (d,3h) Protonen C δ= (m, 2H) Protonen F (diasterotop) δ= (m,2h) Protonen D δ=4.80 (m,1h) * δ= (m,1h) Proton E δ= (m,1h) Proton G δ= (m,5h) Protonen H * Dieses Signal konnte keinem Proton zugeordnet werden, entweder handelt es sich um eine Verunreinigung oder es gehört zu dem anderen entstandenen Diastereomer. Ansonsten erscheint das Produkt im Spektrum diastereomerenrein, mit einer leichten Verunreinigung durch Toluol, wobei natürlich berücksichtigt werden muss, dass in der Produktverteilung ein Diastereomer stark überwiegt. Es ist nicht ausgeschlossen, dass unter diesen Peaks die Signale des anderen Diastereomers liegen. Das Spektrum kann dahingehend gedeutet werden, dass der größte Teil von Reagenz und Edukt zum Produkt umgesetzt werden konnte. Eine Bestimmung des Diastereomerenverhältnisses ist aber anhand dieses Spektrums nicht möglich. 11

13 5.4 Perspektiven Der nächste logische Schritt zur weiteren Untersuchung wäre die Untersuchung der Substanz mittels GC-MS gewesen, was im Rahmen des Praktikums leider nicht mehr möglich war. Ein anderer angedachter Ansatz war die Trennung des reduzierten Zwischenprodukts mit chiraler Säule und anschließender Derivatisierung und HPLC- Analyse. Auch dieser Weg konnte aus Zeitmangel nicht mehr verfolgt werden. Eine weitere Verbesserung könnte auch mit Acetonitril als Laufmittel erreicht werden. Die Aufspaltung könnte hier noch besser werden. Durch die Ermittlung der Retentionszeiten auf der zur Verfügung stehenden Säule können die Substanzen jetzt ohne Schwierigkeiten mittels HPLC-Untersuchung charakterisiert werden. 6. Gesamtdiskussion Die ursprüngliche Aufgabe, das Bestimmen des Diastereomerenverhältnisses mittels GC-Analytik ließ sich mit der im Praktikum vorhandenen Ausrüstung nicht erfolgreich durchführen, weswegen die Analyse mittels HPLC durchgeführt wurde. Trotz einiger Unstimmigkeiten, die in der vorgegebenen Zeit nicht komplett ausgeräumt werden konnten konnte mittels HPLC-Analyse eine Retentionszeit für die im Praktikum vorhandene Säule ermittelt werden. Zudem wurde das Produkt mit Hilfe von NMR erstmals eindeutig charakterisiert, so dass eine Vergleichssubstanz für zukünftige Analysen zur Verfügung steht. 7. Literatur 1 D. Seebach, M. A. Sutter, R. H. Weber, M. F. Züger, Org. Synth, Col Vol. 1990, B.Kolb, Gaschromatographie in Bildern, 2. Aufl., Wiley-VCH, Org. Synth. Coll. Vol , Org. Synth. Coll. Vol , X. A. Dominguez, I. C. Lopez, R. Franco, J. Org. Chem. 1961, 26, R. Monzingo, C.Spencer, K. Folkers, J. Am. Chem. Soc. 1944, 66,