4 Ergebnisse / -/- Tag 1. Tag 2. Tag 3. Tag 5. Tag 7. Tag 10. Tag 14

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1 4.3.4 Mikroskopische Analyse der Wundheilung Bei der oberflächlichen Betrachtung der Wunden lässt sich kein signifikanter Unterschied feststellen. Allerdings kann ein eventuell mikroskopischer Unterschied im Prozess der Wundheilung bei dieser Betrachtungsweise nicht erkannt werden, da der Blick auf die Wunde meist durch den darüber liegenden Schorf verdeckt wird. / Tag Abb.24 Übersichtsdarstellung des Wundheilungsprozesses Von Kontroll- (w/w) und mmp-13-knock-out () Wunden 1, 2, 3, 5, 7, 10 und 14 Tage nach Verwundung wurden 6 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt und histologisch (HE) gefärbt. Balken entspricht 1 mm. 72

2 Für eine detaillierte Betrachtung der Wundenheilung wurden von den Wunden zu verschiedenen Zeitpunkten 6 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt und histologisch (HE) gefärbt (Abb. 24). Anhand dieser Wundschnitte wurden (i) die Reepithelialisierung, die zum Wundschluss führt, (ii) die Größe und zelluläre Zusammensetzung des Granulationsgewebes, (iii) die Entzündungsreaktion, also das Einwandern von inflammatorischen Zellen in die Wunde, und (iv) die Bildung neuer Blutgefäße untersucht. Für die Analyse der einzelnen Teilaspekte wurden mittels immunhistochemischer Färbung und Immunfluoreszenz spezifische Markerproteine auf den Gefrierschnitten der Wunden nachgewiesen. Wundschluss Nach Verwundung der Haut beginnen sich Keratinozyten am Wundrand zu teilen und zwischen Fibrinpfropf und Matrix in die Wunde einzuwandern (Abb.25). ie Keratinozyten migrieren so lange, bis die offenliegende Wundefläche vollständig mit einer neuen Lage an Keratinozyten bedeckt ist. ieser Prozess wird als Reepithelialisierung bezeichnet. Tag 5 Gg Gg Gg Gg Abb.25 Prozess der Reepithelialisierung Gefrierschnitte von Kontrollwunden 1, 2, 3 und 5 Tage nach Verwundung wurden histologisch (HE) gefärbt. er Pfeil mit der weißen Spitze markiert den ursprünglichen Wundrand, der Pfeil mit der schwarzen Spitze die Front des bereits eingewanderten ithels. Nach 5 Tagen ist die Reepithelialisierung beendet. () idermis, () ermis, () Fibrinpfropf, (Gg) Granulationsgewebe. Balken entsprechen 50 µm (), 100 µm (), 200 µm () und 400 µm (Tag 5). Histologisch (HE) gefärbte Gefrierschnitte von Wunden 3 Tage nach Verwundung zeigen, dass zu diesem Zeitpunkt ein größerer Anteil der MMP-13-defizienten Wunden als der Kontrollwunden bereits geschlossen ist (Abb.26A). Um den zeitlichen Verlauf dieses beschleunigten Wundschlusses statistisch zu erfassen, wurde der Abstand der Wundränder von Wunden 1, 2, 3, 5 und 7 Tage nach Verwundung gemessen (Abb. 26C). a auf den histologisch gefärbten Wundschnitten die genaue Grenze der Wundränder nicht immer eindeutig bestimmt werden konnte, wurde das idermis-spezifische Protein Involucrin und damit die idermis mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht (Abb.26B). 73

3 A / H&E H&E B Involucrin Involucrin C 4 / Abstand der Wundränder [mm] Tage nach Verwundung Abb.26 Beschleunigter Wundschluss der MMP-13-defizienten Wunden (A) Histologisch (HE) gefärbte Gefrierschnitte von Kontroll- (w/w) und MMP-13-defizienten () Wunden 3 Tage nach Verwundung. ie Pfeile in der w/w Wunde markieren die vorderste Front des migrierenden ithels. ie Wunde ist bereits geschlossen. Balken entspricht 200 µm. (B) In Parallelschnitten von (A) wurde mittels Immunfluoreszenz der idermis-spezifische Marker Involucrin (rot) sichtbar gemacht. ie Pfeile zeigen in der w/w Wunde die vorderste Front der in die Wunde wandernden Keratinozyten an. ie Wunde ist bereits geschlossen. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. Balken entspricht 200 µm. (C) Zeitlicher Verlauf des Wundschlusses. Mit Hilfe des Messwerkzeugs der Software Adobe Photoshop 7.0 wurde der Abstand der Wundränder von Wunden 1, 2, 3, 5 und 7 Tage nach Verwundung auf histologisch (HE) gefärbten Gefrierschnitten oder Gefrierschnitten, auf denen mittels Immunfluoreszenz das Protein Involucrin sichtbar gemacht wurde, ausgemessen. ie Kreise ( ) stellen die einzelnen Messdaten dar, die Rechtecke ( ) den Median des betreffenden Zeitpunktes. 74

4 er in Abbildung 26C dargestellte zeitliche Verlauf des Wundschlusses zeigt, dass bereits ein Tag nach Wundsetzung die istanz zwischen den Wundrändern der MMP-13-defizienten Mäuse um ca. 0,5 mm geringer ist als die der Kontrollmäuse. Im weiteren Verlauf der Wundheilung bleibt dieser Unterschied in der istanz der Wundränder konstant. 3 Tage nach Verwundung sind die Hälfte der Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse bereits geschlossen, wohingegen über die Hälfte der Kontrollwunden noch deutlich offen sind. Am Tag 5 sind die Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse geschlossen, während die der Kontrollmäuse noch offen sind. Am sind alle Wunden geschlossen, sowohl die der MMP-13-defizienten Mäuse als auch die der Kontrollmäuse. er Wundschluss ist in den MMP-13-defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen beschleunigt, wobei sich der Unterschied in der istanz zwischen den Wundrändern schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt () bemerkbar macht. Anteil an proliferierenden Keratinozyten am Wundrand Gründe für den beschleunigten Wundschluss bei den MMP-13-defizienten Mäusen können (i) eine verstärkte Proliferation der Keratinozyten am Wundrand, (ii) eine verstärkte Wundkontraktion, die die istanz, die die Keratinozyten bei der Migration zu überwinden haben, verringern würde oder (iii) eine beschleunigte Migration der Keratinozyten durch die Wunde sein. Zu Beginn der Wundheilung fangen Keratinozyten am Wundrand an, in die Wunde einzuwandern. Erst nachdem die Keratinozyten am Wundrand ein Stück weit in die Wunde eingewandert sind, beginnen Keratinozyten, die sich kurz hinter dem Wundrand befinden, sich verstärkt zu teilen, um Nachschub für die in die Wunde eingewanderten Keratinozyten zu liefern (als Übersichtsartikel: Martin, 1997, Singer und Clark, 1999). Immunhistochemische Färbungen, die den Proliferationsmarker Ki-67 auf Gefrierschnitten von Wunden 1, 2, 3 und 5 Tage nach Verwundung sichtbar machen, haben gezeigt, dass die Proliferation der Keratinozyten am Wundrand 2 Tage nach Verwundung am stärksten ist (aten nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurde zu diesem Zeitpunkt der Anteil an proliferierenden Keratinozyten am Wundrand der Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse und Kontrollmäuse bestimmt (Abb.27). iese Analyse ließ jedoch keinen Unterschied im Anteil an proliferierenden Keratinozyten zwischen MMP-13-defizienten Wunden und Kontrollwunden erkennen (Abb.27A). Für die statistische Auswertung wurde der Anteil an Ki-67-positiven Keratinozyten im hyperplastischen Bereich der Wundränder ausgezählt (Abb.27B). ie Auswertung ergab ebenso keinen signifikanten Unterschied zwischen den MMP-13-defizienten Mäusen und den Kontrollmäusen. 75

5 / A Ki-67 Ki-67 B 100 Ki-67 positive Zellen [%] / Abb.27 Anteil proliferierender Keratinozyten an den Wundrändern (A) Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (w/w) und mmp-13-knock-out () Wunden 2 Tage nach Verwundung wurde mittels immunhistochemischer Färbung der Proliferationsmarker Ki-67 (braun) sichtbar gemacht. Auf den Übersichtsaufnahmen ist jeweils der linke Rand einer Wunde zu sehen. ie kleinen Bildausschnitte zeigen einen Teil der idermis in höherer Vergrößerung. ie Zellkerne wurde mit Hämatoxylin (blau) gegengefärbt. () idermis, () ermis, () Fibrinpropf. Balken in der Übersichtsaufnahme entspricht 200 µm, Balken in der etailaufnahme entspricht 50 µm. (B) Im hyperplastischen Bereich des Wundrandes wurde der Anteil an Ki-67-positiven Keratinozyten ausgezählt. ie Balken zeigen die Mittelwerte von jeweils 6 Wunden pro Genotyp an. Wundkontraktion Nach Verwundung werden Fibroblasten im dermalen Gewebe, das an die Wunde angrenzt, dazu angeregt, in die Wunde zu migrieren. ie durch diese Migration verursachte Zugkraft in der Wunde führt dazu, dass sich Fibroblasten im Granulationsgewebe zu so genannten Proto- Myofibroblasten differenzieren, die durch das Ausbilden von Aktin-enthaltenden Stress-Fa- 76

6 sern gekennzeichnet sind. iese Zellen sind in der Lage zu frühen Zeitpunkten der Wundheilung (2-4 Tage nach Verwundung) eine Kontraktion des Granulationsgewebes auszuführen. urch E-A-Fibronektin (einer Splicevariante von Fibronektin), das von den Proto-Myofibroblasten selbst produziert wird, und TGF-β1, das von Thrombozyten und Makrophagen stammt, differenzieren die Proto-Myofibroblasten zu Myofibroblasten. Charakteristisch für Myofibroblasten ist die Expression von α-aktin ( α-smooth muscle actin = α-sma ), einer Aktin-Isoform, die typisch für glatte Muskelzellen in Gefäßen ist. Hinzu kommt die Ausbildung von einer weitaus größeren Anzahl an Stress-Fasern. adurch können Myofibroblasten im Vergleich zu Proto- Myofibroblasten eine deutlich stärkere Kontraktion ausüben. iese Kontraktion findet zu einem Zeitpunkt statt (5-7 Tage nach Verwundung), an dem die Reepithelialisierung der Wunde bereits abgeschlossen ist (als Übersichtsartikel: Tomasek et al., 2002). a für die Proto-Myofibroblasten, die für die frühe Wundkontraktion verantwortlich sind und damit eine Auswirkung auf den schnelleren Wundschluss haben könnten, keine spezifischen Markerproteine bekannt sind, wurde die Menge an Myofibroblasten durch die Analyse ihrer α-aktin Expression bestimmt. Aus der Menge an Myofibroblasten zu späteren Zeitpunkten der Wundheilung können dann Rückschlüsse auf die Anzahl der Proto-Myofibroblasten zu früheren Zeitpunkten gezogen werden. Hierfür wurde mittels Immunfluoreszenz α-sma auf Gefrierschnitten von Wunden 3, 5, 7 und 10 Tage nach Verwundung sichtbar gemacht. Wunden 3 und 10 Tage nach Verwundung zeigen keine α-sma-färbung (aten nicht gezeigt). Auf Schnitten von Wunden 5 und 7 Tage nach Verwundung kann eine Expression von α-sma im oberen Bereich des Granulationsgewebes beobachtet werden, der an die neu gebildete idermis anschließt (Abb.28). abei zeigen die Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse eine stärkere α-sma-färbung als die Kontrollwunden, was auf eine höhere Anzahl an Myofibroblasten in diesen Wunden hindeutet. ies wiederum lässt darauf schließen, dass in den Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse während der frühen Wundkontraktion eine höhere Anzahl an Proto-Myofibroblasten vorhanden ist. iese vermutlich erhöhte Anzahl an Proto-Myofibroblasten könnte in den MMP-13-defizienten Wunden zu einer verstärkten Wundkontraktion führen, die die istanz zwischen den Wundrändern, die die Keratinozyten während der Reepithelialisierung zurücklegen müssen, verringern würde. iese verringerte Wundfläche könnte der Grund für den beschleunigten Wundschluss sein, der in den MMP-13-defizienten Wunden beobachtet wurde. 77

7 4 Ergebnisse / Tag 5 α-sma Tag 5 α-sma α-sma α-sma Abb.28 Erhöhter Anteil an α-sma-positiven Zellen in mmp-13-knock-out Wunden Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out () Wunden 5 und 7 Tage nach Verwundung wurde mittels immunhistochemischer Färbung α-sma (braun), ein Marker für Myofibroblasten, sichtbar gemacht. ie kleinen Bildausschnitte zeigen etailaufnahmen von α-sma-positiven Zellen aus dem Granulationgewebe. Balken in der Übersichtsaufnahme entspricht 400 µm, Balken in der etailaufnahme entspricht 20 µm. Migration der Keratinozyten Eine weiterer Grund für den beschleunigten Wundschluss kann eine verstärkte Migration der an der Reepithelialisierung beteiligten Keratinozyten sein. Es wird vermutet, dass die Ausbildung eines Netzwerks aus Aktinfilamenten im basalen Bereich von Keratinozyten, die in die Wunde einwandern, eine Funktion während der Migration dieser Zellen erfüllt (Anderson, 1977). Zur Analyse dieses Aktinnetzwerks wurden auf Gefrierschnitten von Wunden 1 und 2 Tage nach Verwundung Aktinfilamente durch die Bindung von Phalloidin, an das das Fluorochrom Alexa 488 gekoppelt war, sichtbar gemacht (Abb.29). Bei Phalloidin handelt es sich um ein Peptid des Pilzes "Amanita Phalloides", das spezifische an F-Aktin bindet. In der Lokalisation und Menge der Aktinfilamente in den Keratinozyten am Wundrand konnte kein Unterschied zwischen MMP-13-defizienten Wunden und Kontrollwunden festgestellt werden. 78

8 4 Ergebnisse Aktin Aktin Abb.29 Aktin-Expression in Keratinozyten am Wundrand ist in den MMP-13-defizienten Mäusen unverändert Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out () Wunden 1 und 2 Tage nach Verwundung wurde mittels Phalloidin-Färbung Aktin (grün) sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. ie kleinen Abbildungen zeigen jeweils den linken Wundrand in der Übersicht. (- - -) markriert die Grenze zwischen idermis und ermis. Balken in den etailaufnahmen entsprechen 200 µm, Balken in den kleinen Übersichtsaufnahmen entsprechen 50 µm. Charakteristisch für migrierende Keratinozyten ist ebenso die Expression der Basalmembrankomponente Laminin-5 (Nguyen et al., 2000). Während Keratinozyten in die Wunde einwandern geben sie Laminin-5 ab, das sich stimulierend auf ihre Migration auswirkt. Eine veränderte Expression dieses Proteins während der Wundheilung in den mmp-13-knock-out Mäusen könnte ein Hinweis auf ein verändertes Migrationsverhalten der Keratinozyten in den Wunden dieser Mäuse sein. Zur Analyse der Expression von Laminin-5 in den Wunden der MMP-13defizienten Mäuse wurde auf Gefrierschnitten von Wunden 1, 2, 3, 7 und 14 Tage nach Verwundung Laminin-5 mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht (Abb.30A). In den Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse konnte im Vergleich zu den Kontrollmäusen keine veränderte Expression dieses Proteins festgestellt werden. 79

9 4 Ergebnisse A α6 L-5 α6 L-5 α6 L-5 α6 4 L-5 4 α6 L-5 B Abb.30 ie Expression von Komponenten der Basalmembran ist in mmp-13-knock-out Mäusen während der Wundheilung unverändert Auf Parallelschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out () Wunden 1, 2, 3, 7 und 14 Tage nach Verwundung wurden die Basalmembrankomponenten (A) Laminin-5 (L-5; grün), (B) α6-integrin (α6; rot), (C) Laminin (Ln; grün), () Perlecan (Plc; rot) und (E) Nidogen (Ng; grün) mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. Balken entspricht 500 µm. Um zu überprüfen, ob in der Expression weiterer Komponenten der Basalmembran oder im Aufbau einer neuen Basalmembran nach Wundschluss ein Unterschied zwischen den MMP13-defizienten Mäusen und den Kontrollmäusen besteht, wurden die Basalmembrankomponenten α6-integrin, Laminin (alle Isoformen), Perlecan und Nidogen ebenfalls mittels Immunfluoreszenz auf Parallelschnitten von Wunden 1, 2, 3, 7 und 14 Tage nach Verwundung 80

10 4 Ergebnisse C Plc Ln Plc Ln Plc Ln Plc 4 Ln 4 Plc Ln Abb.30 ie Expression von Komponenten der Basalmembran ist in mmp-13-knock-out Mäusen während der Wundheilung unverändert Auf Parallelschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out () Wunden 1, 2, 3, 7 und 14 Tage nach Verwundung wurden die Basalmembrankomponenten (A) Laminin-5 (L-5; grün), (B) α6-integrin (α6; rot), (C) Laminin (Ln; grün), () Perlecan (Plc; rot) und (E) Nidogen (Ng; grün) mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. Balken entspricht 500 µm. sichtbar gemacht (Abb.30B-). Auch die Expression dieser Komponenten der Basalmembran zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den MMP-13-defizienten Wunden und Kontrollwunden. emzufolge ist der Aufbau der Basalmembran in den MMP-13-defizienten Mäusen nicht verändert. 81

11 4 Ergebnisse E Ng Ng Ng Ng 4 Ng Abb.30 ie Expression von Komponenten der Basalmembran ist in mmp-13-knock-out Mäusen während der Wundheilung unverändert Auf Parallelschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out () Wunden 1, 2, 3, 7 und 14 Tage nach Verwundung wurden die Basalmembrankomponenten (A) Laminin-5 (L-5; grün), (B) α6-integrin (α6; rot), (C) Laminin (Ln; grün), () Perlecan (Plc; rot) und (E) Nidogen (Ng; grün) mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. Balken entspricht 500 µm. ie Expression von Aktin und Laminin-5 von Keratinozyten am Wundrand der MMP-13defizienten Mäuse gibt keinen Hinweis auf ein verändertes Migrationsverhalten dieser Zellen. Eine verstärkte Migration der Keratinozyten kann jedoch noch nicht ausgeschlossen werden, da an diesem Prozess viele weitere Faktoren beteiligt sind. Näheren Aufschluss über eine möglicherweise veränderte Migration der Keratinozyten würden in vitro-migrationsversuche an isolierten Keratinozyten der mmp-13-knock-out Mäuse geben. 82