Abb.31 Epidermis der MMP-13-defizienten Mäuse differenziert vollständig nach Wundschluss

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1 4 Ergebnisse Epidermale Differenzierung nach Wundschluss Nach dem Schließen der Wunde und dem Aufbau einer neuen Basalmembran wird eine neue mehrschichtige Epidermis aufgebaut. Um zu überprüfen, ob die neu gebildete Epidermis in den mmp-13-knock-out Mäusen vollständig ausdifferenzieren kann, wurden auf Gefrierschnitten von Wunden 5 und 7 Tage nach Verwundung mittels Immunfluoreszenz der frühe Differenzierungsmarker Keratin 10 und der späte Differenzierungsmarker Loricrin sichtbar gemacht (Abb.31). / -/- Tag 5 Keratin 10 Loricin Tag 5 Keratin 10 Tag 7 Tag 7 Loricin Abb.31 Epidermis der MMP-13-defizienten Mäuse differenziert vollständig nach Wundschluss Auf Parallelschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 5 und 7 Tage nach Verwundung wurde mittels Immunfluoreszenz der frühe epidermale Differenzierungsmarker Keratin 10 (grün) und der späte epidermale Differenzierungsmarker Loricrin (rot) sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. Balken entspricht 200 µm (Tag 5) bzw. 400 µm (Tag 7). 83

2 4 Ergebnisse In Wunden 5 Tage nach Verwundung konnte lediglich eine schwache Expression von Keratin 10 in einzelnen Zellen der neu gebildeten Epidermis beobachtet werden. Loricrin wurde im Stratum corneum zu diesem Zeitpunkt stark exprimiert. Nach 7 Tagen konnte eine Expression von Keratin 10 in allen suprabasalen Schichten der Epidermis beobachtet werden. Loricrin war auch zu diesem Zeitpunkt in der obersten epidermalen Schicht stark exprimiert. In diesem Expressionsverhalten gab es keinen Unterschied zwischen den Wunden von MMP-13- defizienten Mäusen und der Kontrollmäuse. Größe des Granulationsgewebes Neben dem Schließen der Wunde durch die Reepithelialisierung und der Bildung eines neuen mehrschichtigen Epithels, stellt auch der Aufbau einer neuen kollagenreichen Matrix im Wundbereich einen wichtigen Vorgang im Prozess der Wundheilung dar. Eine fibrinreiche Matrix, die zu Beginn des Heilungsprozesses aufgebaut wird und als provisorische Matrix für einwandernde Fibroblasten und inflammatorische Zellen dient, wird, nachdem die Wunde geschlossen ist, durch eine kollagenreiche Matrix ersetzt. Um zu überprüfen, ob das Fehlen der MMP-13 einen Einfluss auf den Auf- und Abbau oder auf die zelluläre Zusammensetzung des Granulationsgewebes hat, wurde die Größe des Granulationsgewebes bestimmt (Abb.32). Für die Bestimmung der Größe und der Kinetik des Auf- und Abbaus des Granulationsgewebes wurden histologisch (HE) gefärbte Gefrierschnitte von Wunden 1, 2, 3, 5, 7, 10 und 14 Tage nach Verwundung mit einer Digitalkamera fotografiert und die Fläche des Granulationsgewebes mit Hilfe der Software "Adobe Photoshop 7.0" bestimmt (siehe Material und Methoden). In der maximalen Größe und der Geschwindigkeit des Auf- und Abbaus des Granulationsgewebes konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Wunden der MMP-13- defizienten Mäuse und der Kontrollmäuse festgestellt werden. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass es in der Anzahl der eingewanderten Zellen und der Menge der neu produzierten Komponenten der extrazellulären Matrix keinen Unterschied gibt. 84

3 4 Ergebnisse / -/- A Tag 5 H&E Tag 5 H&E B Größe des Granulationsgewebes [mm 2 ] 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 / -/- 0, Tage nach Verwundung 15 Abb.32 Kinetik des Auf- und Abbaus des Granulationsgewebes (A) Beispielhafte Abbildung von histologische (HE) gefärbten Kontroll- (w/w) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 5 Tage nach Verwundung. Die schwarze Linie schließt jeweils das Granulationsgewebe ein. Balken entspricht 400 µm. (B) Zeitlicher Verlauf der Zu- und Abnahme der Größe des Granulationsgewebes. Mit Hilfe des Werkzeugs Lasso der Software Adobe Photoshop 7.0 wurde die Größe des Granulationsgewebes von Kontroll- (w/w) und mmp-13- knock-out (-/-) Wunden 1, 3, 5, 7, 10 und 14 Tage nach Verwundung auf histologisch (HE) gefärbten Gefrierschnitten bestimmt (siehe Material und Methoden). Die Kreise ( ) stellen die einzelnen Messdaten dar, die Rechtecke ( ) den Mittelwert des betreffenden Zeitpunktes. Zwischen dem Verlauf der Zu- und Abnahme des Granulationsgewebes zeigt sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollwunden und den mmp-13-knock-out Wunden. 85

4 4 Ergebnisse Aufbau einer neuen Kollagen-Matrix Um den Umbau des Granulationsgewebes von einer fibrinreichen zu einer kollagenreichen Matrix zu untersuchen, wurde auf Gefrierschnitten von Wunden 7, 10 und 14 Tage nach Verwundung mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Technik Kollagen Typ I sichtbar gemacht, das den Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix der Dermis darstellt (Abb.33). 7 Tage nach Verwundung ist lediglich im Randbereich des Granulationsgewebes, der an die unverwundete Dermis angrenzt, eine stärkere Färbung von Kollagen Typ I zu erkennen. Der zentrale Bereich des Granulationsgewebes ist nur schwach gefärbt. Nach 10 Tagen ist der / -/- Tag 7 Kol-I Tag 10 Kol-I Tag 14 Kol-I Abb.33 Aufbau einer neuen Kollagen-Matrix ist in den MMP-13-defizienten Wunden unverändert Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 7, 10 und 14 Tage nach Verwundung wurde mittels Immunfluoreszenz Kollagen Typ I (Kol-I; rot) sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. (- - -) Grenze von Epidermis und Dermis, (...) Grenze zwischen Dermis und Granulationsgewebe. Balken entspricht 400 µm. 86

5 4 Ergebnisse innere Bereich des Granulationsgewebes bereits stärker gefärbt, jedoch immer noch deutlich schwächer als der Randbereich. Nach 14 Tag ist kaum mehr ein Unterschied in der Intensität der Färbung zwischen dem inneren Bereich des Granulationsgewebes und dem Randbereich zu erkennen. Diese Beobachtungen treffen sowohl auf die Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse als auch auf die der Kontrollmäuse zu. Es besteht kein Unterschied in der Kinetik des Aufbaus einer neuen Kollagen-Matrix. Ein Unterschied in der Dichte der neu gebildeten Kollagen-Matrix konnte anhand dieser Färbung ebenfalls nicht festgestellt werden. Entzündungsreaktion nach Wundsetzung In der Größe und Kinetik des Auf- und Abbaus des Granulationsgewebes und im Aufbau einer neuen Kollagen-Matrix konnten keine Unterschiede zwischen den MMP-13-defizienten Mäusen und den Kontrollmäusen festgestellt werden. Aufgrund dieser Beobachtungen lässt sich vermuten, dass es keinen Unterschied in der Anzahl an Fibroblasten gibt, die ins Granulationsgewebe einwandern. Neben Fibroblasten wandern neutrophile Granulozyten und Makrophagen in die Wunde ein, um pathogene Organismen zu beseitigen und Wachstumsfaktoren und Zytokine, die für die Regulation der Vorgänge während der Wundheilung von großer Bedeutung sind, zu produzieren. Um die Menge an eingewanderten neutrophilen Granulozyten zu untersuchen, wurde auf Schnitten von Wunden 3 und 7 Tage nach Verwundung mittels Immunfluoreszenz das für neutrophile Granulozyten spezifische Antigen "Neutrophils" sichtbar gemacht (Abb.34A). Am Tag 3 nach der Verwundung kann eine große Anzahl an neutrophilen Granulozyten vor allem im Grenzbereich von Granulationsgewebe und Dermis beobachtet werden. Am Tag 7 wurden deutlich weniger neutrophile Granulozyten beobachtet, wobei diese sich vor allem im zentralen Bereich des Granulationsgewebes befanden. Dieser Befund trifft sowohl auf Wunden von MMP-13- defizienten Mäusen, als auch auf Wunden von Kontrollmäusen zu. Für Makrophagen konnten ähnliche Beobachtungen gemacht werden. Hierfür wurde auf Schnitten von Wunden 3 und 7 Tage nach Verwundung mittels Immunfluoreszenz das makrophagenspezifische Protein "CD68" sichtbar gemacht (Abb.34B). Auch hier konnte am Tag 3 nach der Verwundung eine große Anzahl an Makrophagen vor allem am Wundrand beobachtet werde. Am Tag 7 befanden sich die Makrophagen vor allem im zentralen Bereich des Granulationsgewebes. Zu diesem Zeitpunkt war die Anzahl der Makrophagen im Vergleich zum Tag 3 bereits wieder gesunken. Diesen Beobachtungen zufolge gibt es in der Anzahl und der Kinetik der eingewanderten inflammatorischen Zellen keinen Unterschied zwischen den Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse und der Kontrollmäuse. 87

6 4 Ergebnisse / A B -/- Tag 3 Neutro Tag 7 Neutro Tag 3 CD68 Tag 7 CD68 Abb.34 Das Einwandern von inflammatorischen Zellen ist in MMP-13-defizienten Wunden unverändert Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 3 und 7 Tage nach Verwundung wurde mittels immunhistochemischer Färbung (A) Neutrophils (Neutro; rot), ein für neutrophile Granulozyten spezifisches Antigen, und (B) CD68 (rot), ein für Makrophagen spezifisches Protein, sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. (- - -) Grenze von Epidermis und Dermis, (...) Grenze zwischen Dermis und Granulationsgewebe. Balken entspricht 400 µm. 88

7 4 Ergebnisse Bildung neuer Blutgefäße Zur Gewährleistung der Nährstoffversorgung der Zellen des Granulationsgewebes, werden neue Blutgefäße gebildet, die das Granulationsgewebe durchziehen. Um zu untersuchen, ob es einen Unterschied in der Bildung neuer Blutgefäße zwischen den Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse und der Kontrollmäuse gibt, wurde auf Schnitten von Wunden 3 und 7 Tage nach Verwundung mittels Immunfluoreszenz der Endothelzellenspezifische Marker "CD31" sichtbar gemacht (Abb.35). Am Tag 3 nach Verwundung befinden sich im Granulationsgewebe kaum neu gebildete Blutgefäße. Eine größere Anzahl an Blutgefäßen kann jedoch in der an das Granulationsgewebe direkt angrenzenden Dermis gezeigt werden. Am Tag 7 nach Verwundung ist das gesamte Granulationsgewebe mit neuen Blutgefäßen durchzogen. In Größe, Anzahl und im Zeitpunkt des Auftretens neuer Blutgefäße ist kein Unterschied zwischen den MMP-13-defizienten Wunden und den Kontrollwunden zu erkennen. / -/- Tag 3 CD31 Tag 7 CD31 Abb.35 Die Bildung neuer Blutgefäße ist in MMP-13-defizienten Wunden unverändert Auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 3 und 7 Tage nach Verwundung wurde mittels immunhistochemischer Färbung der Endothelzellen-spezifische Marker CD31 (rot) sichtbar gemacht. Zellkerne wurden mit Hoechstfarbstoff (blau) gegengefärbt. (- - -) Grenze von Epidermis und Dermis, (...) Grenze zwischen Dermis und Granulationsgewebe. Balken entspricht 400 µm. 89

8 4 Ergebnisse Die Analysen des Granulationsgewebes zeigen, dass es sowohl in der Größe, als auch in der zellulären Zusammensetzung keine signifikanten Unterschiede gibt. Die Anzahl an Fibroblasten, neutrophilen Granulozyten und Makrophage ist unverändert. Im Aufbau einer neuen Kollagen-Matrix und dem Einwachsen neuer Blutgefäße gibt es ebenso keine signifikanten Unterschiede. Der einzige Unterschied, der bezüglich des Granulationsgewebes festgestellt werden konnte, ist eine erhöhte Anzahl an Myofibroblasten, die vermutlich zu einer verstärkten Wundkontraktion führt Kompensation des Verlustes von MMP-13 Aufgrund der Substratspezifität und des Expressionsmusters der MMP-13 während der Wundheilung wurde angenommen, dass die MMP-13 in diesem Vorgang Komponenten der extrazellulären Matrix degradiert, um Zellen, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, die Migration zu ermöglichen. Der Verlust der MMP-13 führt jedoch nicht zu einem erwarteten verzögerten, sondern eher zu einem leicht beschleunigten Wundschluss. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Funktion der MMP-13 entweder eine hemmende Wirkung auf die Migration der Keratinozyten während der Reepithelialisierung hat oder eine andere MMP kompensatorisch Aufgaben der nicht vorhandenen MMP-13 in einer Art und Weise übernimmt, die zu einem beschleunigten Wundschluss führt. Ein möglicher Kandidat für eine solche Kompensation könnte die Matrix-Metelloproteinase-9 (MMP-9) sein, da sie während der Wundheilung ebenso wie die MMP-13 von Keratinozyten an der vordersten Front des migrierenden Epitheliums exprimiert wird (Madlener et al., 1998; Lund et al., 1999; Abb.36A). Auf die Lokalisation der Expression der MMP-9 während der Wundheilung der Haut hat der Verlust der MMP-13 keinen Einfluss. Dies zeigen in situ Hybridisierungen, die für MMP-9 auf MMP-13-defizienten Wunden einen Tag nach Verwundung mit der MMP-9-cDNA als Hybridisierungssonde durchgeführt wurden (Abb.36B). Daher ist es denkbar, dass die MMP- 9 in den mmp-13-knock-out Mäusen Aufgaben der MMP-13 im Prozess der Wundheilung kompensatorisch erfüllt. 90

9 4 Ergebnisse A Tag 1 mmp-13 mmp-9 Tag 1 Ep Ep D D Fp Fp / B Tag 1 -/- mmp-9 Tag 1 mmp-9 Ep Ep Fp D D Fp Gg Gg Abb.36 Expression der MMP-9 in Wunden ein Tag nach Verwundung Auf Gefrierschnitten von Wunden wurde die Expression der MMP-13 und der MMP-9 mittels in situ Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten antisense-probe für die MMP-13 bzw. die MMP-9 sichtbar gemacht. (A) zeigt die Expression der MMP-13 und der MMP-9 (Pfeil) am linken Rand von Kontrollwunden 1 Tag nach Verwundung. Beide MMPs werden von Keratinozyten an der vordersten Front des in die Wunde migrierenden Epithels exprimiert. (B) Nachweis der Expression der MMP-9 mittels in situ Hybridisierung auf Gefrierschnitten von Kontroll- (M/M) und mmp-13-knock-out (-/-) Wunden 1 Tag nach Verwundung. Der Verlust der MMP-13 verändert das Expressionsverhalten der MMP-9 nicht. (Ep) Epidermis, (D) Dermis, (Fp) Fibrinpfropf. Balken entspricht 50 µm Wundheilungsexperimente mit MMP-9-defizienten Mäusen Um zu untersuchen, wie der Verlust der MMP-9, die ein der MMP-13 ähnliches Expressionsmuster während der Wundheilung aufweist, sich auf diesen Prozess auswirkt, wurden mit MMP9-defizienten Mäusen (von Dr. B. Arnold, DKFZ, Heidelberg zur Verfügung gestellt) Wundheilungsexperimente durchgeführt. Die Durchführung der Experimente erfolgte wie bei den MMP-13-defizienten Mäusen. Histologisch (HE) gefärbte Gefrierschnitte von MMP-9-defizienten Wunden 5, 7 und 10 Tage nach Verwundung zeigen, dass der Wundschluss bei diesen Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen verlangsamt ist (Abb.37). 5 Tage nach Verwundung sind die MMP-9-defizienten 91

10 4 Ergebnisse Wunden noch weit offen. Selbst nach 7 Tagen sind diese Wunden noch nicht vollständig geschlossen. 10 Tage nach Verwundung sind die MMP-9-defizienten Wunden schließlich vollständig geschlossen. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivität der MMP-9 auf den Vorgang der Reepithelialisierung eine beschleunigende Wirkung hat. Mittels RT-PCR-Reaktionen mit Gesamt-RNA aus Wunden einen Tag nach Verwundung von MMP-9-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Expression der MMP-13 in den Wunden der MMP-9-defizienten Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen unverändert ist (Daten nicht gezeigt). / mmp-9 -/- Tag 5 H&E Tag 7 H&E Tag 10 H&E Abb.37 Verzögerter Wundschluss der MMP-9-defizienten Wunden Von Kontroll- (w/w) und mmp-9-knock-out (mmp-9 -/- ) Wunden 5, 7 und 10 Tage nach Verwundung wurden 6 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt und histologisch (HE) gefärbt. Die Pfeile zeigen die Front des migrierenden Epithels an. Balken entspricht 1 mm. 92

11 5 Diskussion 5 Diskussion Während der Wundheilung der Haut spielt der Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix eine wichtige Rolle. Der Abbau der extrazellulären Matrix ist notwendig, um Zellen, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, die Migration zu ermöglichen. Zudem muss eine neue kollagenreiche Matrix aufgebaut werden, die der geschlossenen Wunde Festigkeit verleiht. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die alle Komponenten der extrazellulären Matrix abbauen können, werden im Verlauf der Wundheilung der Haut in einem genau definierten räumlichen und zeitlichen Muster exprimiert (Madlener et al., 1998). Dies lässt vermuten, dass diese Enzymfamilie in der Wundheilung eine tragende Rolle spielt. Eine wichtige MMP scheint hierbei die Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13) zu sein. MMP- 13 wird während der Wundheilung von Keratinozyten an der vordersten Front des in die Wunde einwandernden Epithels exprimiert (Madlener et al., 1998; Lund et al., 1999; Abb.22). Dieser Befund und die Fähigkeit der MMP-13 fibrilläres Kollagen zu spalten (Knäuper et al., 1996a), deuten darauf hin, dass sie eine wichtige Funktion in der Reepithelialisierung erfüllt. Die zu späteren Zeitpunkten beobachtete MMP-13-Expression in einzelnen Fibroblasten des Granulationsgewebes lässt auf eine zusätzliche Funktion im Umbau der neu entstehenden kollagenreichen Matrix schließen (Madlener et al., 1998; Lund et al., 1999). Um die Funktion der MMP-13 in der heilenden Wunde zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine MMP-13-defiziente Maus generiert. Diese Mäuse sind lebensfähig und unterscheiden sich in Größe und Aussehen nicht von Kontrollmäusen. Die Embryonalentwicklung der Haut und ihre Homöostase in der adulten Maus, welche in dieser Arbeit insbesondere analysiert wurden, sind in den MMP-13-defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen unverändert. Die Wundheilungsexperimente, die mit dieser Mauslinie durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass sich ihre Wunden im Vergleich zu den Kontrollmäusen schneller schließen. Eine verstärkte Wundkontraktion, auf die eine erhöhte Anzahl an Myofibroblasten in den MMP-13-defizienten Wunden im Vergleich zu den Kontrollwunden hindeutet, könnte der Grund für diesen beschleunigten Wundschluss sein. In der Größe und der zellulären Zusammensetzung des Granulationsgewebes konnten hingegen keine Unterschiede zwischen mmp- 13 -/- - und Kontrollwunden festgestellt werden. Die erzielten Ergebnisse bezüglich der Funktion der MMP-13 in der Wundheilung deuten darauf hin, dass eine andere MMP die Funktionen der MMP-13 im Wundheilungsprozess kompensatorische erfüllt. 93

12 5 Diskussion 5.1 Herstellung von MMP-13-defizienten Mauslinien Um die Funktion der MMP-13 in der Embryonalentwicklung und der epidermalen Wundheilung zu untersuchen, wurde zum einen eine Mauslinie hergestellt, welche spezifisch in der Epidermis die MMP-13 nicht exprimiert (mmp-13 flox/flox /k14-cre), und zum anderen eine Mauslinie, welche in keinem Gewebe eine MMP-13-Expression aufweist (mmp-13 flox/flox /cmv-cre). Southern Blot-Anlaysen zeigten eine nicht vollständige Rekombination der gefloxten mmp-13 Allele im Falle der mmp-13 flox/flox /k14-cre Mauslinie. Das bedeutet, dass die MMP-13 in diesen Mäusen auch weiterhin zumindest in einem signifikanten prozentualen Anteil an Keratinozyten in der Epidermis exprimiert wurde. Aus diesem Grund wurde diese Mauslinie nicht für Versuche verwendet, in denen die Funktion von MMP-13 untersucht werden sollte. Gründe für eine schlechte Rekombinationseffizienz können allgemein eine für die Cre-Rekombinase schlecht zugängliche Lage des gefloxten Gens im Genom und zum anderen eine unzureichende Expression der Cre im betreffenden Gewebe sein. Im Fall des mmp-13 Gens ist eine kompakte Chromatinstruktur höchstwahrscheinlich nicht der Grund für die unvollständige Rekombination in der mmp-13 flox/flox /k14-cre Mauslinie, da in der mmp-13 flox/flox /cmv-cre Mauslinie die mmp-13 Allele vollständig rekombiniert wurden. Dies deutet auf eine unzureichende Expression der Cre-Rekombinase in der Epidermis-spezifischen mmp-13 knock-out Mauslinie als Grund für die schlechte Rekombinationseffizienz hin. Hinweise hierfür liefern auch andere Arbeiten, in welchen diese keratin 14-cre Mauslinie verwendet wurde. Hier kommt es bei der Kreuzung dieser Mauslinie mit einer durch Cre induzierbaren LacZ-Reportermauslinie zu einer mosaische Expression der Cre-Rekombinase am 15.Tag der Embryonalentwicklung (Huelsken et al., 2001). Zu diesem Zeitpunkt der Embyonalentwicklung wird Keratin 14 jedoch bereits in der gesamten Epidermis exprimiert. Auch die Verpaarung dieser keratin-14-cre Mauslinie, mit einer heterozygoten Mauslinie, in der ein Allel des β-catenin Gens bereits nicht mehr funktionsfähig ist und das andere Allel gefloxt vorliegt (β-catenin null/flox ), zeigte am Tag 15 der Embryonalentwicklung eine unvollständige Rekombination des gefloxten Allels (Huelsken et al., 2001). Dies wurde auf Gewebeschnitten von 15 Tage alten Embryonen nachgewiesen, auf denen mittels immunhistochemischer Färbung β-catenin sichtbar gemacht wurde. Zu diesem Zeitpunkt der Embryonalentwicklung wäre ein vollständiger Verlust der β-catenin-expression in der Epidermis zu erwarten gewesen. Weiterführende Southern Blot-Analysen der Epidermis dieser Mäuse 6 Wochen nach der Geburt zeigten neben einer starken Hybridisierungsbande des durch Cre rekombinierten Allels eine schwache Hybridisierungsbande des gefloxten Allels (Huelsken et al., 2001). Dies deutet darauf hin, dass das gefloxte β-catenin Allel in dieser Maus auch im adulten Stadium nicht in allen Zellen der Epidermis durch Cre rekombiniert wurde. Die Aktivität der unter der Kontrolle des keratin 14-Promotors exprimierten Cre-Rekombinase führte demnach weder 94

13 5 Diskussion in der lacz-reportermaus noch in der gefloxten β-catenin Maus zu einer vollständigen Rekombination der gefloxten Allele. Dass in der mmp-13 flox/flox -Mauslinie zwei Allele und nicht wie in der β-catenin null/flox Mauslinie nur ein Allel rekombiniert werden musste, könnte der Grund dafür sein, dass die Rekombinationseffizienz in der Epidermis der gefloxten mmp-13 Maus noch weitaus schlechter war als bei der β-catenin null/flox Maus. Demzufolge ist es wahrscheinlich, dass der Grund für die schlechte Rekombinationseffizienz eine unzureichende Expression der Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des keratin-14-promotors ist. In der mmp-13 flox/flox /cmv-cre Mauslinie hingegen konnte durch Southern Blot-Analysen gezeigt werden, dass die mmp-13 Allele vollständig rekombiniert wurden. Auch Northern Blot- Analysen von RNA aus Knochengewebe, in welchem die MMP-13 normalerweise stark exprimiert wird (Tuckermann et al., 2000), zeigten keine MMP-13-Expression in dieser Mauslinie. Dies weist ebenfalls auf eine vollständige Rekombination der gefloxten mmp-13 Allele hin und ist ein Beweis dafür, dass selbst ein zu erwartendes trunkiertes MMP-13-Transkript nicht vorhanden ist. Mit dieser MMP-13-defizienten Mauslinie, die MMP-13 in keinem Gewebe mehr exprimiert, und der mmp-13 flox/flox Mauslinie als Kontrolle wurden in dieser Arbeit alle Untersuchungen zur Funktion der MMP-13 durchgeführt. 5.2 Einfluss der MMP-13 auf die Entwicklung von Knochengewebe MMP-13 wird zum ersten Mal am Tag 14.5 der Embryonalentwicklung der Maus exprimiert (Gack et al., 1995). Dabei beschränkt sich die MMP-13-Expression auf Gebiete der Knochenbildung. Am Tag 16.5 der Embryonalentwicklung nimmt die MMP-13-Expression in Röhrenund Schädelknochen stark zu (Gack et al., 1995). Hier wird MMP-13 spezifisch in der Zone der hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Die MMP-13 degradiert sehr effizient natives Kollagen vom Typ II und X, welche die Hauptbestandteile des Knorpelgewebes sind (Birkedal- Hansen et al., 1993). Daher wurde bisher angenommen, dass die MMP-13 im Prozess der endochondralen Ossifizierung hauptsächlich diese Kollagene spaltet. Die Kollagene vom Typ II und X werden nach ihrer Degradation durch von Osteoblasten synthetisiertes Kollagen Typ I ersetzt (von der Mark, 1980). Die MMP-13 könnte demnach in der Zone der hypertrophen Chondrozyten für die Umwandlung von Knorpel- zu Knochengewebe essentiell sein. Um diese These zu analysieren wurde das Knochengewebe der MMP-13-defizienten Embryonen untersucht. Eine genaue Betrachtung des Oberschenkelknochens von 16.5 Tage alten MMP-13-defizienten Embryonen zeigte im Vergleich zu den Kontrollembryonen eine geringfügige Vergrößerung der Zone der hypertrophen Chondrozyten. In dieser Zone wird die MMP- 13 zu diesem Zeitpunkt der Embryonalentwicklung in Wildtyp-Mäusen stark exprimiert (Gack et al., 1995). Auch in der adulten Maus wird die MMP-13 in dieser Zone exprimiert (Tuckermann et al, 2000). Im Oberschenkelknochen von adulten MMP-13-defizienten Mäu- 95

14 5 Diskussion sen ist ebenso wie im embryonalen Knochen in der Wachstumszone der Anteil an hypertrophen Chondrozyten im Vergleich zu den Kontrollmäusen erhöht. Diese Beobachtung deckt sich mit Untersuchungen von Knochengewebe, welche ebenfalls an MMP-13-defizienten Mäusen vorgenommen wurden (Prof. Z. Werb, San Franzisco, USA, persönliche Kommunikation). Untersuchungen einer größeren Anzahl an Embryonen und adulter Knochen müssen noch zeigen, ob die beobachtete Vergrößerung der Zone der hypertrophen Chondrozyten signifikant ist. Einen Hinweis darauf liefern Studien, in welchen Knochengewebe von Mäusen untersucht wurde, die mit dem MMP-Hemmstoff GM6001 behandelt wurden (Ortega et al., 2003). Die Zone der hypertrophen Chondrozyten der Knochen dieser Mäuse ist ebenfalls vergrößert. In diesen Knochen ist die Vergrößerung dieser Zone jedoch viel ausgeprägter als bei den MMP-13-defizienten Knochen. Dies lässt vermuten, dass noch weitere MMPs am Prozess der endochondralen Ossifizierung beteiligt sind. Neben der MMP-13 scheinen mindestens zwei weitere MMPs an der Knochenentwicklung beteiligt zu sein. Zu Beginn der Neovaskularisierung des Knorpelgewebes werden die MMP- 9 und die MT1-MMP in Vorläuferzellen der Osteoklasten und anderen chondroklastischen Zellen unbekannten Ursprungs exprimiert (Zhou et al., 2000; Holmbeck et al., 1999). Auch in MMP-9-defizienten Mäusen ist die Zone der hypertrophen Chondrozyten vergrößert (Vu et al., 1998). Diese Vergrößerung des hypertrophen Knorpelgewebes in den MMP-9- defizienten Mäusen wird durch eine verminderte Apoptoserate der hypertrophen Chondrozyten verursacht. Dabei ist diese verminderte Apoptoserate die Folge einer gehemmten Invasion von Blutgefäßen in das hypertrophe Knorpelgewebe. Dies zeigt sich dadurch, dass nur hypertrophe Chondrozyten, die sich in der Nähe der wenigen eingewachsenen Blutgefäße befinden, in Apoptose gehen (Vu et al., 1998). Die gehemmte Invasion von Blutgefäßen wird hierbei durch eine verminderte Verfügbarkeit des Angiogenesefaktor VEGF (vascular endothelial growth factor) verursacht (Vu et al., 1998). Untersuchungen zeigen, dass MMP-9 die Verfügbarkeit von VEGF durch die Proteolyse extrazellulärer Matrix regulieren kann (Vu und Werb, 2000). Welcher Mechanismus bei den MMP-13-defizienten Mäusen für eine Vergrößerung der Zone der hypertrophen Chondrozyten verantwortlich ist, müssen weitere Untersuchungen ihrer Knochen zeigen. Möglicherweise setzt auch MMP-13 Faktoren frei, welche die Vorgänge der endochondralen Ossifizierung regulieren. Solche Faktoren könnten wie in den Knochen der MMP-9-defizienten Mäuse die Apoptoserate der hypertrophen Chondrozyten reduzieren oder die Reifung von proliferierenden Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten beeinflussen. In beiden Fällen wäre eine Vergrößerung der Zone der hypertrophen Chondrozyten die Folge. 96

15 5 Diskussion Sowohl in den MMP-9- als auch in den MMP-13-defizienten Mäusen kommt es letztendlich in adulten Mäusen zur Ausbildung funktionsfähiger Knochen. Demnach hat die Vergrößerung der Zone der hypertrophen Chondrozyten keine gravierenden Auswirkungen auf das Längenwachstum der Knochen. Dies zeigt der Größenvergleich der fünf Wochen alten MMP-13- defizienten Mäuse mit Kontrollmäusen. Eventuell wird der Verlust der MMP-13 bzw. MMP- 9 durch die Aktivität der jeweils anderen MMP kompensiert. Hinweise hierfür liefern Untersuchungen des Knochengewebes von MMP-9/MMP-13-defizienten Mäusen. Die Knochen dieser Mäuse weisen eine stark unorganisierte Wachstumszone auf (Prof. Z. Werb, San Franzisco, USA, persönliche Kommunikation). 5.3 Einfluss der MMP-13 auf die Entwicklung und Homöostase der Haut Die Untersuchungen der embryonalen und adulten Haut der mmp-13-knock-out Mäuse zeigten keine signifikanten Unterschiede in ihrem Aufbau im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Hierfür wurde die Entwicklung der adulten Haut über einen Zeitraum von einem Jahr verfolgt. Die Epidermis wurde zusätzlich durch die Analyse von Markerproteinen für die terminale Differenzierung im Detail untersucht. Während der normalen Homöostase der Haut findet ein ständiger Auf- und Abbau von Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix der Dermis statt. Wenn dieser Vorgang durch einen verringerten Abbau oder eine verstärkte Produktion von Kollagen aus dem Gleichgewicht gerät, bildet sich eine Fibrose, die durch eine Bindegewebsvermehrung gekennzeichnet ist. So entwickeln Mäuse, die ein spaltungsresistentes Kollagen Typ I exprimieren ("Col1a1 r/r "), nach einem Jahr eine ausgeprägte Fibrose in der Dermis (Liu et al., 1995). Beim Menschen ist für den Abbau von Kollagen in der Haut höchstwahrscheinlich die MMP-1 verantwortlich. Hierfür sprechen Untersuchungen, die im Serum von Patienten, welche unter systemischer Sklerose (Bindegewebsvermehrung) leiden, einen erhöhten Spiegel an Autoantikörper gegen die MMP- 1 zeigen. Hierbei korrelierte die Konzentration der MMP-1-Autoantikörper mit dem Schweregrad der Fibrosen (Sato et al., 2003). Diese Studie beweisen, dass der Verlust der Aktivität von MMP-1 durch einen fehlenden Abbau von Kollagen zur Ausbildung von Fibrosen führt. In der Maus wird der Umbau von fibrillärem Kollagen allerdings weitgehend der MMP-13 zugeschrieben. Daher konnte erwartet werden, dass sich in der Haut der MMP-13-defizienten Mäuse aufgrund eines reduzierten Kollagenabbaus eine Fibrose entwickelt. Die Untersuchungen in dieser Arbeit zeigen jedoch, dass sich die Dermis von einem Jahr alten mmp-13-knockout Mäusen in Größe und Morphologie nicht von der der Kontrollmäuse unterscheidet. Daraus 97

16 5 Diskussion lässt sich schließen, dass die MMP-13 in diesem Vorgang entweder keine essentielle Rolle spielt, oder diese Funktion der MMP-13 in den MMP-13-defizienten Mäusen von einer anderen MMP übernommen wird. Neuere Studie lassen vermuten, dass neben der MMP-13 die vor kurzem in der Maus identifizierten neuen Mitglieder der MMP-Familie, Mcol-A und Mcol-B, ebenfalls für den Umbau des fibrillären Kollagens in der Dermis der Maus verantwortlich sind (Balbin et al., 2001). Dies gilt insbesondere für die Mcol-A, da dieses Enzyme in vitro Kollagen Typ I und II spaltet (Balbin et al., 2001). Ein Sequenzvergleich der Mcol-A mit der humanen MMP-1 deutet darauf hin, dass die Mcol-A das murine Homolog zur humanen MMP-1 darstellen könnte (Balbin et al., 2001). Demnach ist es denkbar, dass Funktionen, die von der MMP-1 im Menschen ausgeführt werden, von der Mcol-A in der Maus erfüllt werden. Weitere Analysen müssen zeigen, ob Mcol-A am Kollagenumbau in der Dermis beteiligt ist. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Mcol-A lediglich die Funktionen der MMP-13 in der MMP-13-defizienten Maus kompensatorisch übernimmt. 5.4 Die Funktion der MMP-13 in der Wundheilung der Haut Für die Entwicklung und Homöostase der Haut hat der Verlust der MMP-13 keine Konsequenzen. Nach Verwundung wird in der Haut, in welcher im ruhenden Zustand MMP-13 bisher nicht nachgewiesen werden konnte, ihre Expression induziert (Madlener et al., 1998; Abb.22). Dabei wird die MMP-13 zu frühen Zeitpunkten der Wundheilung in Keratinozyten am Wundrand und zu späten Zeitpunkten in Fibroblasten des Granulationsgewebes exprimiert. Zur Analyse der Funktion der MMP-13 in der Wundheilung der Haut wurden in der vorliegenden Arbeit Wundheilungsexperimente mit MMP-13-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen durchgeführt Beschleunigter Wundschluss der MMP-13-defizienten Wunden Eine äußerliche, makroskopische Betrachtung von Wunden über einen Zeitraum von vierzehn Tagen zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Wundheilung zwischen MMP-13-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen. Eine detailliertere histologische Betrachtung dieser Wunden jedoch zeigte einen signifikant beschleunigten Wundschluss bei den MMP-13-defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Dieser Befund war unerwartet angesichts von Wundheilungsexperimenten, in welchen die Aktivität mehrerer MMPs, einschließlich MMP-13, durch Galardin, einem Inhibitor für verschiedene MMPs, unterdrückt wurde. In diesen Experimenten führt die Hemmung der MMP-Aktivität zu einer starken Verlangsamung des Wundschlusses, welcher auf eine gehemmte Migration der Keratinozyten zurückzuführen ist (Lund et al., 1999). Jedoch hemmt Galardin neben 98

17 5 Diskussion verschiedenen MMPs auch andere Enzyme wie z.b. das TACE ("TNF-α-converting enzyme") (Solorzano et al., 1997). Demnach kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch andere Enzyme bei der Behandlung mit Galardin beeinflusst wurden, deren Aktivität die Wundheilung beeinflussen. Aus den Auswirkungen der Hemmung mehrerer MMPs durch Galardin auf die Wundheilung können folglich keine Rückschlüsse auf die Aktivität einzelner MMPs gezogen werden. Aus diesem Grund ist es notwendig, die Funktion derjenigen MMPs, die während der Wundheilung exprimiert werden, einzeln zu untersuchen. Dies wurde bereits für die humane MMP-1 durchgeführt. In humanen Wunden wird die MMP-1 ebenso wie die MMP-13 in murinen Wunden, von Keratinozyten am Wundrand exprimiert (Vaalamo et al., 1996). Aufgrund dieses identischen Expressionsmusters während der Wundheilung, kann vermutet werden, dass die MMP-13 in der Maus entsprechende Funktionen wie die MMP-1 im Menschen ausübt. Untersuchungen der Wundheilung bei Mäusen, die die humane MMP-1 in Keratinozyten überexprimieren, haben einen verzögerten Wundschluss gezeigt (Di Colandrea et al., 1998). Diesem Experiment zufolge scheint die humane MMP-1 in vivo eine hemmende Wirkung auf den Vorgang des Wundschlusses zu haben. In Übereinstimmung damit steht der in der vorliegenden Arbeit gezeigte beschleunigte Wundschluss der mmp-13 knock-out Mäuse. Den Untersuchungen, die zeigen, dass die MMP-13 in vivo eine hemmende Wirkung auf die Migration der Keratinozyten und damit auf den Wundschluss hat, widersprechen jedoch Ergebnisse, die bei in vitro Untersuchungen erzielt wurden. Experimente mit menschlichen Fibrosarkomzellen (HT1080), die die MMP-13 überexprimieren, erlangen durch die konstitutive Expression der MMP-13 im Vergleich zu den Kontrollzellen eine erhöhte Invasionsfähigkeit sowohl in Kollagen Typ I-reiche Gele als auch in Matrigele, welche die Eigenschaften von Basalmembranen imitieren. Im Gegensatz zu den in vivo Daten deuteten diese in vitro Experimente auf eine beschleunigende Wirkung der MMP-13 auf die Migration von Zellen hin. Demzufolge würde man als Konsequenz des Verlustes der MMP-13 einen verlangsamten Wundschluss erwarten. Eine ähnliche Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Erkenntnissen zeigen Versuche, die mit der humanen MMP-1 durchgeführt wurden. Migrationsversuche mit HaCaT-Zellen, einer menschlichen Keratinozytenlinie, in der die Expression der humanen MMP- 1 durch den Kontakt mit Kollagen nicht induziert wird, zeigen, dass diese Zellen nur auf bereits denaturiertem Kollagen Typ I (Gelatin), jedoch nicht auf einer nativen Kollagen Typ I-Matrix migrieren können. Durch die Zugabe von EGF kann in diesen Zellen jedoch MMP-1 induziert werden, wodurch sie die Fähigkeit erlangen, auf Kollagen Typ I zu migrieren (Pilcher et al., 1997). Dies beweist, dass die Expression der humanen Kollagenase MMP-1 oder anderer MMPs, deren Expression durch EGF verstärkt wird, für die Migration von Keratinozyten auf einer kollagenreichen Matrix essentiell ist. Aufgrund dieser Experimente wäre daher eher zu 99

18 5 Diskussion erwarten gewesen, dass der Verlust der murinen Kollagenase MMP-13 zu einer gehemmten Migration von Keratinozyten auf einer kollagenreichen Matrix und damit zu einem verlangsamten Wundschluss führt. Die in vivo und die in vitro Experimente führen zu gegensätzlichen Schlussfolgerungen bezüglich der Funktion der humanen MMP-1 bzw. murinen MMP-13 bei der Migration von Keratinozyten. Dies ist ein Beleg dafür, dass es sich bei der Wundheilung um einen multifaktoriellen Vorgang handelt, in welchem neben dem direkten Abbau der extrazellulären Matrix viele andere Mechanismen einen Einfluss auf die Migration von Zellen haben können. Diese Zusammenhänge können in einfachen Monozellkulturen nicht nachvollzogen werden. Inwiefern sich aus der Dermis stammende Faktoren auf das Verhalten von Keratinozyten der Epidermis auswirken können, zeigen jedoch in vitro-studien, in welchen Keratinozyten auf in einer Kollagenmatrix eingebetteten Fibroblasten kultiviert wurden. Hier führt das von Keratinozyten produzierte IL-1 in dermalen Fibroblasten zur Expression von KGF und GM-CSF. Diese Faktoren wiederum sind an der Regulation von Proliferation und Differenzierung in den Keratinozyten der Epidermis beteiligt (Szabowski et al., 2000). Solche Faktoren, die einen Einfluss auf das Verhalten der Keratinozyten haben, könnten in vivo durch die Aktivität der MMP-13 freigesetzt werden und eine veränderte Migration der Keratinozyten bewirken. Neben der Migration der Keratinozyten können auch eine erhöhte Proliferationsrate der Keratinozyten am Wundrand und eine verstärkte Kontraktion der Wunde ein Grund für den beschleunigten Wundschluss der MMP-13-defizienten Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen sein. Proliferation der Keratinozyten am Wundrand Eine gesteigerte Proliferation der Keratinozyten am Wundrand führt zu einem beschleunigten Wundschluss. Dies zeigen Wundheilungsversuche, die an der Kornea von MMP-9-defizienten Mäusen durchgeführt wurde (Mohan et al., 2002), wobei der dafür verantwortliche Mechanismus bisher ungeklärt ist. Immunhistochemische Färbungen, die den Proliferationsmarker Ki-67 sichtbar gemacht haben, zeigen einen unveränderten Anteil an proliferierenden Keratinozyten am Wundrand der MMP-13-defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäuse. Demnach kann der beschleunigte Wundschluss bei den MMP-13-defizienten Mäusen nicht mit einer erhöhten Proliferation der Keratinozyten am Wundrand erklärt werden. Wundkontraktion Ein weiterer Mechanismus, der zu einem beschleunigten Wundschluss führen kann, ist eine verstärkte Wundkontraktion, welche die Distanz, die von den Keratinozyten während der Reepithelialisierung zurückgelegt werden muss, verringern würde. 100

19 5 Diskussion Wundheilungsexperimente, die mit Stromelysin-1-defizienten Mäusen durchgeführt wurden haben gezeigt, das die Aktivität von Stromelysin-1 (MMP-3) für eine frühe Wundkontraktion von Bedeutung ist. Im Grenzbereich zwischen Dermis und Granulationsgewebe können die Stromelysin-1-defiziente Mäuse keinen kontraktilen Ring aus Aktinfilamenten, der die Wunde zur Kontraktion befähigt, aufbauen. Dadurch können sich die Wunden in diesen Mäusen zu frühen Zeitpunkten nicht mehr kontrahieren, was zu einem verzögerten Wundschluss führt (Bullard et al., 1999). Ein solcher kontraktiler Ring aus Aktinfilamenten, der bisher nur als Mechanismus für den Wundschluss embryonaler Wunden muriner Haut beschrieben wurde (Martin und Lewis, 1992), konnte als Mechanismus für eine frühe Wundkontraktion in der adulten Maus bisher nur in der Arbeit von Mohan et al. (2002) gezeigt werden. Für eine frühe Wundkontraktion wird in anderen Arbeiten das Einwandern von Fibroblasten aus dem an die Wunde angrenzenden dermalen Gewebe, in die Wunde diskutiert (als Übersichtsartikel: Tomasek et al., 2002). Nach Verwundung werden Fibroblasten im dermalen Gewebe, das an die Wunde angrenzt, dazu angeregt, in die Wunde zu migrieren. Die durch diese Migration verursachte Zugkraft in der Wunde führt dazu, dass sich Fibroblasten im Granulationsgewebe zu so genannten Proto-Myofibroblasten differenzieren, die durch das Ausbilden von Aktin-enthaltenden Stress-Fasern gekennzeichnet sind. Diese Zellen sind in der Lage zu frühen Zeitpunkten der Wundheilung (2-4 Tage nach Verwundung) eine Kontraktion des Granulationsgewebes auszuführen. Im weiteren Verlauf der Wundheilung differenzieren diese Proto-Myofibroblasten zu Myofibroblasten. Charakteristisch für diese Myofibroblasten ist die Expression von α-aktin. Myofibroblasten können im Vergleich zu Proto-Myofibroblasten eine deutlich stärkere Kontraktion ausüben, welche zu späteren Zeitpunkten stattfindet. Da für Proto-Myofibroblasten, die für die frühe Wundkontraktion verantwortlich sind und damit eine Auswirkung auf den schnelleren Wundschluss haben könnten, keine spezifischen Markerproteine bekannt sind, wurde in dieser Arbeit die Menge an Myofibroblasten durch die Analyse ihrer α-aktin Expression bestimmt. Eine erhöhte Anzahl an α-aktin-positiven Zellen 5 und 7 Tage nach Verwundung in den MMP-13-defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen deutet darauf hin, dass schon zu früheren Zeitpunkten der Wundheilung eine erhöhte Anzahl an Proto-Myofibroblasten vorliegt, wodurch es zu einer verstärkten frühen Wundkontraktion kommen könnte. Dies könnte der Grund für den beobachteten beschleunigten Wundschluss sein. Die Col1a1 r/r -Mäuse weisen eine reduzierte Anzahl an Myofibroblasten im Granulationsgewebe auf (Beare et al., 2003). Dieser Befund wurde darauf zurückgeführt, dass die Fibroblasten im Granulationsgewebe nicht in der Lage waren, Kollagen Typ I zu spalten und somit ein Signal zur Expression von α-aktin, das ihnen die Zugkraft zur Gewebekontraktion verleiht, gefehlt 101

20 5 Diskussion hat (Pins et al., 2000). Demzufolge müsste in den MMP-13-defizienten Mäusen Kollagen Typ I vermehrt gespalten werden und dadurch eine höhere Anzahl an Fibroblasten zu Myofibroblasten differenzieren. Dies wäre nur möglich, wenn anstelle der MMP-13 eine andere Protease für den Umbau von Kollagen Typ I verantwortlich wäre oder die Funktion der MMP-13 kompensatorisch übernehmen würde. Ein möglicher Kandidat hierfür ist die Mcol-A, für welche in vitro bereits gezeigt wurde, dass sie Kollagen Typ I spaltet (Balbin et al., 2001). Jedoch ist nicht nur das Spalten von Kollagen Typ I ein Signal für die Fibroblasten sich zu Myofibroblasten zu differenzieren. Ebenso werden die aus den Fibroblasten hervorgehenden Proto-Myofibroblasten durch ED-A-Fibronektin und TGF-β1 angeregt, sich zu Myofibroblasten zu differenzieren (Tomasek et al., 2002). Ein Einfluss auf diese oder bisher unbekannte Faktoren, die die Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten beeinflussen, könnten von MMP-13 reguliert werden. Somit würde das Fehlen von MMP-13 zu einer erhöhten Anzahl an Fibroblasten führen, die zu Myofibroblasten ausdifferenzieren Untersuchungen des Granulationsgewebes Neben dem Wundschluss stellt die Reparatur des dermalen Gewebes einen wichtigen Vorgang im Prozess der Wundheilung dar. Infolge einer Verwundung der Haut bildet sich ein Fibrinpfropf, der hauptsächlich aus Thrombozyten besteht, die in ein Netz aus Fibrinfasern eingebettet sind. Nach Ausschüttung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen durch diese Thrombozyten migrieren Fibroblasten in die Wunde. Die Fibroblasten produzieren eine Vielzahl an Komponenten der extrazellulären Matrix und bauen dadurch das als provisorische Matrix dienende Granulationsgewebe auf (als Übersichtsartikel: Martin, 1997, Singer und Clark, 1999). Um die Funktion der MMP-13 im Granulationsgewebe zu untersuchen, wurden in den MMP-13- defizienten Mäusen Vorgänge, die im Zusammenhang mit der Bildung und Umstrukturierung des Granulationsgewebe stehen, analysiert. Dabei handelt es sich um die Größe des Granulationsgewebes, die Rekrutierung von inflammatorischen Zellen, die Angiogenese und den Aufbau einer neuen Kollagen-Matrix. Die Größe des Granulationsgewebes Die Größe des Granulationsgewebe ist von der Anzahl an eingewanderten Fibroblasten und der Menge der von ihnen produzierten extrazellulären Matrix abhängig. In der Größe und der Kinetik des Auf- und Abbaus des Granulationsgewebes zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Wunden der MMP-13-defizienten Mäusen und denen der Kontrollmäusen. Dies zeigt, dass die MMP-13 keinen Einfluss auf die Migration von Fibroblasten in die Wunde und die Produktion von extrazellulärer Matrix durch diese Fibroblasten hat. 102

21 5 Diskussion Dies bestätigen auch andere Studien, bei denen die Behandlung von Wunden mit dem MMP- Hemmstoff Galardin ebenso zu keiner Veränderung in der Bildung des Granulationsgewebes führt (Lund et al., 1999). Durch Galardin werden neben der MMP-13 auch MMP-2, -3, -8 und -9 gehemmt (Grobelny et al., 1992; Levy et al., 1998). Dieses Experiment ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass diese durch Galardin gehemmten MMPs bei der Migration der Fibroblasten in das Wundgebiet ebenso wie die MMP-13 keine Rolle spielen. Demnach muss also eine MMP, deren Aktivität nicht durch Galardin beeinflusst wird, an diesem Prozess beteiligt sein. Ein möglicher Kandidat ist die MT1-MMP, die ebenfalls in Fibroblasten des Granulationsgewebes exprimiert wird (Lund et al., 1999). MT1-MMP spaltet Kollagen, Fibronektin und Vitronektin, welche Bestandteile des Granulationsgewebes sind. Neben den MMPs spielt auch das Plasminogen/Plasmin-System in der Wundheilung der Haut ein wichtige Rolle (Lund et al., 1999). Der Verlust von Plasminogen führt in plasminogen knock-out Mäusen zu einem verlangsamten Wundschluss (Romer et al., 1996). Eine Beteiligung des Plasminogen/Plasmin-Systems an der Migration der Fibroblasten konnte durch die Wundheilungsversuche an diesen plasminogen knock-out Mäusen ausgeschlossen werden (Romer et al., 1996). Wunden dieser Mäuse zeigen keine Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und Größe des Granulationsgewebes. Entzündungsreaktion Neben Fibroblasten wandern auch neutrophile Granulozyten und Makrophagen in die Wunde ein. Ihre Aufgabe ist es, pathogene Organismen, die in die offene Wunde gelangen können, zu beseitigen. Außerdem produzieren sie eine Vielfalt an Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die für einen kontrollierten Ablauf der Wundheilung essentiell sind. In der Anzahl an eingewanderten neutrophilen Granulozyten und Makrophagen und der Kinetik ihres Einwanderns ins Granulationsgewebe zeigte sich kein Unterschied zwischen den Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse und der Kontrollmäuse. Demzufolge spielt die MMP-13 bei der Migration der inflammatorischen Zellen in die Wunde keine essentielle Rolle. Eine unveränderte Entzündungsreaktion zeigen auch Wundheilungsversuche an den Col1a1 r/r - Mäusen (Beare et al., 2003). Dieser Befund deutet darauf hin, dass für die Migration von inflammatorischen Zellen ins Granulationsgewebe die Spaltung von Kollagen Typ I, einem Substrat der MMP-13, keine Bedeutung hat. Allerdings erfüllen andere MMPs eine Funktion in diesem Vorgang. In Wunden von MMP-9- defizienten Mäusen wandern die inflammatorischen Zellen im Vergleich zu den Kontrollmäusen früher in das Granulationsgewebe ein (Mohan et al., 2002). Die Ursache hierfür ist wahrscheinlich eine verstärkte Anreichung des Zytokins IL-1a in den Wunden der MMP-9-defizienten Mäuse (Mohan et al., 2002). Dies beweist, dass die Entzündungsreaktion durch das Freiset- 103

22 5 Diskussion zen von Signalmolekülen durch MMPs beeinflusst wird. Dass die Entzündungsreaktion der MMP-13-defizienten Wunden im Vergleich zu den Kontrollwunden nicht verändert ist, deutet darauf hin, dass die MMP-13 während der Wundheilung keine Faktoren freisetzt, die die Entzündungsreaktion beeinflussen. Angiogenese Ein charakteristischer Bestandteil des Granulationsgewebes sind neu gebildete kleine Blutgefäße, die für die Versorgung der eingewanderten Zellen mit Sauerstoff und Nährstoffen verantwortlich sind. Prozesse, die die Angiogenese beeinflussen können, sind: (i) der Abbau extrazellulärer Matrix, (ii) das Freisetzen von Faktoren, die die Angiogenese fördern und (iii) das Generieren von Faktoren, die die Angiogenese hemmen. An all diesen Prozessen sind MMPs beteiligt (als Übersichtsartikel: Sternlicht und Werb, 2001a). Für die Neovaskularisierung einer fibrinreichen Matrix ist die Expression der MMP-14 essentiell (Hiraoka et al., 1998). Dies zeigen Versuche mit nicht invasiven MDCK-Zellen ("Madin- Darby Canine Kidney"), die durch die Transfektion mit MMP-14 die Fähigkeit zur Invasion in eine fibrinreiche Matrix erlangen. Die Aktivität mancher MMPs hat auch negative Auswirkungen auf die Angiogenese. Durch das Spalten von Plasminogen durch die MMPs -2, -3, -7, -9 und -12 entsteht Angiostatin, welches die Bildung neuer Blutgefäße hemmt (Patterson und Sang, 1997; O`Reilly et al., 1999). Ein weiterer Faktor, der die Angiogenese hemmt, ist Endostatin. Bei Endostatin handelt es sich um das C-terminale Fragment, welches durch die Spaltung von Kollagens Typ XVIII, ein Bestandteil der Basalmembran, entsteht. Neben den MMPs -3, -9, -12 und -20 wird für die MMP-13 eine Funktion bei der Entstehung von Endostatin diskutiert (Ferreras et al., 2000). In der Größe und der Anzahl an eingewanderten Blutgefäßen unterscheiden sich die Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse jedoch nicht von den Kontrollmäusen. Dies deutet darauf hin, dass die MMP-13 weder eine Funktion bei der Migration der Endothelzellen erfüllt noch an der Entstehung von Faktoren, welche einen Einfluss auf die Angiogenese während der Wundheilung haben, beteiligt ist bzw. ihre Funktion in diesen Vorgängen von einer anderen MMP übernommen wird. Aufbau einer neuen Kollagenmatrix In der Kinetik und Menge an neu synthetisiertem Kollagen Typ I unterscheiden sich die Wunden der MMP-13-defizienten Mäuse nicht von den Kontrollmäusen. Untersuchungen von MMP-13-defizienten Wunden zu späteren als den in dieser Arbeit untersuchten Zeitpunkten (30-45 Tage nach Verwundung) müssen noch zeigen, ob der Verlust der MMP-13 Konsequenzen für die Umstrukturierung der neu gebildeten Kollagen-Matrix zu einem Narbengewebe hat. Wunden von Col1a1 r/r -Mäusen zeigten allerdings keinen Defekt in der Ausbildung eines 104

23 5 Diskussion Narbengewebes (Beare et al., 2003). Dies deutet darauf hin, dass das Spalten von Kollagen Typ I für die Entstehung des Narbengewebes nicht essentiell ist. Demnach ist zu vermuten, dass auch die MMP-13, welche Kollagen Typ I spaltet, keine wichtige Funktion in diesem Prozess erfüllt. Für den Umbau von Kollagen Typ I zu einem dichten Narbengewebe könnte jedoch auch eine andere Spaltungsstelle wichtig sein, als die, die in der Col1a1 r/r -Maus mutiert wurde (Beare et al., 2003). Daher kann noch nicht ausschlossen werden, dass es aufgrund des Fehlens der MMP-13 zu einer reduzierten Spaltung von Kollagen Typ I und folglich zu einem Defekt in der Ausbildung des Narbengewebes kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch gezeigt, dass sich in der Haut der MMP-13-defizienten Mäuse selbst nach einem Jahr keine Fibrose ausbildet. Es ist demnach zu erwarten, dass sich auch das Narbengewebe der MMP-13-defizienten Wunden nicht von den Kontrollwunden unterscheidet. Aufbau einer neuen Epidermis mit darunterliegender Basalmembran Nach dem Schließen von Wunden durch eine Schicht an Keratinozyten bildet sich eine neue mehrschichtige Epidermis aus. Diese Epidermis kann in den MMP-13-defizienten Wunden vollständig ausdifferenzieren. Als Bindeglied zwischen Epidermis und Dermis bildet sich nach erfolgter Reepithelialisierung eine neue Basalmembran aus. Dass MMPs an diesem Prozess beteiligt sind zeigen Studien, in welchen in Wunden von MMP-9-defizienten Mäusen nach Wundschluss die Basalmembrankomponenten Laminin-5 verstärkt und diffus exprimiert wird (Mohan et al., 2002). Diese Beobachtung deutet drauf hin, dass die MMP-9 an der Bildung einer neuen Basalmembran beteiligt ist. Die im Vergleich zu den Kontrollmäusen unveränderte Ausbildung einer Basalmembran in den MMP-13-defizienten Wunden lässt jedoch vermuten, dass die MMP-13 im Gegensatz zur MMP-9 in diesem Vorgang keine Rolle spielt oder ihre Aufgabe kompensatorisch von einer anderen MMP, möglicherweise der MMP-9, erfüllt wird Kompensation der Funktion der MMP-13 in der Wundheilung der Haut Die Untersuchungen zur Funktion der MMP-13 in der Wundheilung haben mit Ausnahme eines leicht beschleunigten Wundschlusses keine signifikanten Unterschiede in der Ausbildung des Granulationsgewebes, der Entzündungsreaktion, der Angiogenese, im Aufbau einer neuen Kollagenmatrix und einer neuen Basalmembran gezeigt. Die dargelegten Ergebnisse bezüglich der Rolle von MMP-13 in der Wundheilung legen nahe, dass eine andere MMP Aufgaben der MMP-13 kompensatorisch übernimmt. Eine verstärkte Expression von MMPs aufgrund des Verlustes einer anderen MMP konnte bereits bei der Gebärmutterrückbildung, in der der Abbau von extrazellulärer Matrix ebenfalls ein wichtiger Bestandteil ist, gezeigt werden (Rudolph-Owen et al., 1997). Hierbei werden MMP-3 und MMP-10 in der Gebärmutter von mmp-7-knock-out Mäusen im Vergleich zu 105