Protein-NMR. Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

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1 Protein-NMR Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

2 Themenübersicht Termin 1 am : Biochemie von Proteinen (Aufbau, Struktur, gentechn. Herstellung) Termin 2 am : NMR-Experimente I (Labeling,1D/2D/3D-Exp. für Zuordnung und räuml. Erfassung) Termin 3 am : NMR-Experimente II (CS und NOE-basierte Strukturberechnung, prakt. Übung ) Termin 4 am : Spezielle NMR-Strategien (>4D Experimente, spez. Labeling-Strategien, RDCs)

3 Wdh: Visualisierung von 3D-Spektren

4 Wdh: Visualisierung von 3D-Spektren Strips

5 Wdh: Die sequentielle Zuordnung als erster Schritt auf dem Weg zur Struktur

6 Oft sind mehrere Exp. notwendig um eine eindeutige Zuordnung treffen zu können

7 Die wichtigsten Zuordnungsexperimente (und ihre Nomenklatur!)

8 Einfache Informationen aus einer NMR-Pulssequenz (hier 3D-HNCO) NMR Pulseq. Sehen unheimlich kompliziert aus, liefern aber auch dem Anfänger wichtige Informationen (-> Magnetisierungsstart, -ende, Anzahl unterschiedlicher Kanäle, Entkopplungen)

9 Vom 3D zum 4D-Experiment -> liefert für jedes NH zwei CO-Shifts -> liefert für jedes NH zwei Ca-Shifts Warum dann nicht gleich für jedes NH zwei CO und zwei Ca-Shifts? -> Erweiterung des 3D-Experimentes um eine weitere Dimension

10 Vom 3D zum 4D-Experiment -> für jedes NH zwei CO und zwei Ca-Shifts

11 Vor- und Nachteile nd-experimenten Vorteil: Eindeutigkeit : Bei großen Molekülen mit hoher Wahrscheinlichkeit an Überschneidungen in den chemischen Verschiebungen erlaubt durch das Hinzufügen einer weiteren Dimension eine (hoffentlich) eine eindeutige Zuordnung. ( höhere Auflösung, Auflösung = Möglichkeit der Unterscheidung von eng benachbarten Punkten!) Nachteil: Enorm längere Messzeit (Faktor >6)! (Daher kommt hier meist NUS zum Einsatz) Insensitiver als 3D Experiment durch längeren Magnetisierungsweg vor der Detektion Visualisierung und räuml. Vorstellung etwas schwieriger (aus einem 4D- Datensatz kann man unterschiedliche 3D-Würfel extrahieren, Tafelbild) Fazit: 4D Exp. nimmt man nur wenn es das System wirklich erfordert. Sehr häufig benötigt man solche Exp. bei sog. Intrinsingly disordered proteins (IDPs)

12 Bsp: Sukzessive Erhöhung der Auflösung durch Hinzufügen einer Dimension Zum Nachlesen für später: Aus: Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy, S.271

13 IDPs: Spektrale Überlappung durch engen 1 H N -Bereich Konrat R. NMR contributions to structural dynamics studies of intrinsically disordered proteins. Journal of Magnetic Resonance. 2014;241(100):74-85.

14 IDPs: NCO anstelle NH hat hier oft eine höhere Dispersion

15 Oftmals wird daher bei IDPs auch direkt 13C detektiert, obwohl insensitiver Fingerprint -Spektrum Fingerprint -Spektrum bei IDPs

16 Bei IDPs liefert das CON Experiment oft eine bessere Auflösung und Ausbeute Quelle: NMR of Biomolecules, Wiley-Blackwell, 2012

17 IDPs:...und es kommen 4D und 5D Experimente zum Einsatz Konrat R. NMR contributions to structural dynamics studies of intrinsically disordered proteins. Journal of Magnetic Resonance. 2014;241(100):74-85.

18 Probleme bei der Strukturaufklärung großer Proteine Schnelle Relaxation bei großen Molekülen (breitere Linien, niedrigere Sensitivität) Spektrale Überlappung der Signale durch hohe Anzahl an 1 H / 13 C Löslichkeitsprobleme (und dadurch niedrigere Konzentration)

19 T 1 +T 2 als Parameter der Relaxation

20 T 2 bestimmt die Länge des FIDs, T 1 die Zeit bis zum Equilibrium

21 Durch Deuterierung kann ein großes System deutlich vereinfacht werden Vollständige Protonierung Vollständige Perdeuterierung (Nur austauschbare Protonen aus Backbone und Seitenkette) Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual reviewof biophysics and biomolecular structure 27.1 (1998):

22 Dipol-Dipol-Interaktion als Hauptgrund der T 2 -Relaxation Für 600 MHz, inkl. CSA Durch Austausch von Protonen durch 2 H kann die T2-Zeit signifikant vergrößert werden und ermöglicht bei großen Molekülen überhaupt erst einmal die erfolgreiche Aufnahme von Daten! Quelle: EMBO NMR Course 2005; Nietlispach : The use of deuteration for the structural study of larger proteins

23 Einfluß der Perdeuterierung auf die Linienbreite (hier 1 H- 15 N HSQC) Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual reviewof biophysics and biomolecular structure 27.1 (1998):

24 Einfluß der Perdeuterierung auf die Linienbreite (hier im HNCA Exp.) Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual reviewof biophysics and biomolecular structure 27.1 (1998):

25 Die 3 J Kopplung verrät einiges über die lokale Struktur (vgl. Kaplus Gleichung) Die 3 J Kopplung zwischen H N und H alpha reagiert sehr empfindlich auf Winkeländerungen und wird daher bevorzugt gemessen und für die Strukturberechnung als zusätzlicher Restraint benutzt.

26 Kopplung in partiell ausgerichteten Proteinen: Residual Dipolar Coupling (RDC) Alignment Medien: PEG Bicelle Pf1 Phage Polyacrylamid Gel ( stretched ) (Isotrope) Kopplung -> J Kopplung von partiell ausgerichteten Molekülen -> J + D Dipolare Kopplung -> D = (J) (J+D) (2 Datensätze Aufnehmen: normales Medium (Puffer, LSM) und in Align. Medium)

27 Kopplung in partiell ausgerichteten Proteinen: Residual Dipolar Coupling (RDC)

28 Spezielle Labeling Strategien (hier: CH3-(IVL) labeling)

29 Spezielle Labeling Strategien (hier: CH3-labeling) V. Tugarinov and L.E. Kay (2003) J. Am. Chem. Soc

30 Spez. Labeling Strategien + spezielle Experimente (hier: Methyl-NH Korrelation) Ile,Leu-(HM)CM(CGCBCA)NH Val-(HM)CM(CBCA)NH V. Tugarinov and L.E. Kay (2003) J. Am. Chem. Soc

31 Spez. Labeling Strategien + spezielle Experimente (hier: Methyl-NH Korrelation) V. Tugarinov and L.E. Kay (2003) J. Am. Chem. Soc Um den positiven Effekt der Perdeuterierung auf die Relaxationseigenschaften vollständig zu nutzen und die Kopplung zum Deuterium zu unterdrücken, gibt es nun oft eine 2 H Entkopplung in den Experimenten.

32 Spez. Labeling Strategien + spezielle Experimente (hier: Methyl-CO Korrelation) Ile,Leu-HMCM- (CGCBCA)CO Protonendetektion ist bei großen Proteinen im Gegensatz zu (kleineren) IDPs unumgänglich. Daher verwendet man out-and-back Expiemente Zur Detektion von quartären Kohlenstoffen (hier CO).

33 Spez. Labeling Strategien + spezielle Experimente (hier: Methyl-CO/NH Korrelation)

34 Spezielle Labeling Strategien (hier: Spez. Labeling von Ala) Das Hauptproblem bei der Markierung (1H/13C/15N oder auch 2H/CH3/15N) von bestimmten Aminosäuren, ist das Scrambling, also die Umwandlung von einer Aminosäure in eine andere. Hier ist oft biochemisches Wissen über Stoffwechselwege notwendig um die verschiedenen Scramblingmuster zu verstehen. Ayala, Isabel, et al. "An efficient protocol for the complete incorporation of methylprotonatedalaninein perdeuteratedprotein." Journal of biomolecular NMR 43.2 (2009):

35 Spezielle Labeling Strategien (hier: Spez. Unlabeling von Aminosäuren) Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging proteinbased on systematic unlabeling of amino acids to complement incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013):

36 Analyse des NH-Scramblings in E. coli BL21(DE3) Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging proteinbased on systematic unlabeling of amino acids to complement incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013):

37 Analyse des NH/CO-Scramblings in E. coli BL21(DE3) Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging proteinbased on systematic unlabeling of amino acids to complement incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013):

38 Beispiel für metabolischen Stoffwechselwege in E. coli BL21(DE3) Figure S9 (A) Metabolic pathways involving the (inter)conversion of Thr, Gly, Ser, Cys and Trp respectively. Glycine (1) can be interconverted into serine by the bacterial enzyme SHMT (Serine hydroxymethyltransferase; EC ). Serine (2) in turn can be utilized to produce both cysteine (3) and trypthophan (4). Whereas the first reaction is catalyzed by the cysteine synthase complex consisting of CSA and CSB (Cysteine synthase A and B, respectively; EC ), the latter one is catalyzed by TRPA/B (Tryptophan synthase alpha and beta chain, respectively; EC ). Threonine (0) can be cleaved to Glycine by the bacterial enzyme lsl-ta (Low specificity L-threonine aldolase; EC ). Please note that all enzymes, except lsl-ta, catalyze the respective conversion inboth directions. Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging protein based on systematic unlabeling of amino acids to complement incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013):

39 Zusammenfassung IDPs: NCO bessere Auflösung, oft direkte 13 C Detektion, 4D & 5D Spektren, NUS große Moleküle: Schnelle Relaxation -> Perdeuterierung oder partielle Deuterierung, Experimente mit 2 H Entkopplung, ILV-Labeling, Spezielle Methyl- Experimente, Methyl-Methyl-NOEs, zusätzliche Informationen aus RDCs Spezifische 13C/15N-Markierung von Aminosäuren: Problem des Scramblings, teuer, evtl. zellfreie Synthese notwendig Unlabeling von Aminosäuren: ebenfalls Scrambling, kostengünstiger, kann zur Zuordnung benutzt werden, funktioniert nicht mit allen