Mikrofluidisches Trennverfahren für die chipintegrierte Blutdiagnostik

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1 Mikrofluidisches Trennverfahren für die chipintegrierte Blutdiagnostik Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Angewandte Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Christoph Blattert Freiburg i.br., Oktober 2005

2 Dekan: Prof. Dr. Jan Korvink Referent: Prof. Dr. Wolfgang Menz Korreferent: Prof. Dr. Roland Zengerle Tag der Disputation: 10. März 2006

3 Vorwort Der Mensch hat dreierlei Wege, klug zu handeln: erstens durch Nachdenken - das ist der edelste, zweitens durch Nachahmen - das ist der leichteste, und drittens durch Erfahrung - das ist der bitterste. Konfuzius Diese Arbeit entstand im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projekts µtbc am Lehrstuhl für Prozesstechnologie des Instituts für Mikrosystemtechnik (IMTEK) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. In dieser Arbeit steckt im wahren Sinne des Wortes eine Menge (Herz-)Blut, welche für 12 Blutspenden oder für einen kompletten Blutaustausch bei einem erwachsenen Menschen ausreichen würde. Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Prof. Dr. Wolfgang Menz, für die Überlassung des Themas sowie seine ausdauernde Unterstützung und Motivation bei der Durchführung dieser Arbeit. Seine Hilfsbereitschaft und Förderung sowie die Diskussionen mit ihm haben einen erheblichen Anteil zum Gelingen der Arbeit beigetragen. Prof. Dr. Roland Zengerle danke ich für die bereitwillige Übernahme des Korreferats und interessante Diskussionen und Hinweise. Prof. Dr. Holger Reinecke danke ich herzlich für seine hilfreichen Anmerkungen und Ratschläge in der Schlussphase dieser Arbeit. Ein ganz besonderer Dank gilt Dr. Andreas Schoth für die unzähligen fachlichen Diskussionen und seine immerwährende Motivation und Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Dr. Claas Müller danke ich für viele wertvolle Diskussionen, Ratschläge und Korrekturen bei der Fertigstellung der Arbeit. III

4 Ein ganz großer Dank gilt auch meinen µtbc-projektmitstreitern am Lehrstuhl, Reinhold Jurischka und Isam Tahhan. Insbesondere Reinhold Jurischka hat mich bei der Fertigung von Testchips und den Blutexperimenten aufopferungsvoll unterstützt. Des Weiteren bedanke ich mich bei Jasmin Niemasz, Viktoria Reitenbach, Thomas Birke, Uwe Herberth, Jochen Hoffmann, Fabian Trenkle und Fabian Zimmer, welche als Hilfswissenschaftler im Projekt µtbc zu dieser Arbeit beigetragen haben. Ein großer Dank gilt auch den Technikern am Lehrstuhl für Prozesstechnologie, Kay Steffen für die Unterstützung bei sämtlichen chemischen Fragestellungen und der Durchführung der galvanischen Abscheidungen, Ulrich Stumm für unzählige, fachmännische Blutabnahmen sowie Michael Wölfle für die Durchführung der Fräsarbeiten und die Sicherstellung der Serotoninversorgung aus dem Milchkännle. Danken möchte ich auch meinen übrigen, nicht namentlich erwähnten Kollegen und ehemaligen Kollegen am Lehrstuhl für Prozesstechnologie für das hervorragende Arbeitsklima, die entspannte Arbeitsatmosphäre und die immerwährende Hilfsbereitschaft. Dank gilt auch den Mitarbeitern der mechanischen Werkstatt und des Reinraumservicecenters für die spontane und unbürokratische Hilfe bei kleinen und großen Problemen. Ein weiterer Dank geht an die Projektpartner von µtbc, insbesondere Dr.Dr. Steffen Bassus und Thomas Scholz von der Deutschen Klinik für Diagnostik, Wiesbaden, von denen ich viel über Blut lernen durfte und für die Durchführung von Blutexperimenten. Dank gilt natürlich auch dem Initiator von µtbc, Dr. Paul Kerth, für seine stetige Hilfsbereitschaft, Unterstützung und Motivation. Dr. Wolfgang Köster von der Abteilung klinische Chemie des Universitätsklinikums Freiburg danke ich besonders für die Ermöglichung der Bestimmung der Blutzellenkonzentrationen im Zentrallabor des Universitätsklinikums. Prof. Dr. Herbert Oertel und Dr. Stefan Meyer vom Lehrstuhl und Institut für Strömungslehre der Universität Karlsruhe danke ich für die hilfreichen Diskussionen und Simulationen am Anfang dieser Arbeit. Hans-Jürgen Blankenagel danke ich herzlich für das kritische Überlesen und die Korrektur dieser Arbeit aus der Sicht eines Biologen. Nicht zuletzt gebührt meinen Eltern, Monika und Robert Blattert, ein besonderer Dank für ihre Geduld und bereitwillige Unterstützung sowohl während meiner Studienals auch Promotionszeit. IV

5 Inhaltsverzeichnis Einleitung 1 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc Mikrotechnische Systeme für die Blutdiagnostik Ausgangslage und Entwicklungsziele von µtbc Blutseparationstechnik Blutbestandteile Rheologische Eigenschaften von Blut Verfahren zur Blutauftrennung Neues Konzept für die Blutauftrennung Motivation Konzept des Mikrokrümmers Auftrennmechanismen des Mikrokrümmers Eigenschaften des Mikrokrümmers Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Anforderungen an das Fertigungsverfahren Betrachtete Fertigungsverfahren Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit UV-LIGA Bewertung der Fertigungsverfahren Durchführung der Messungen Messmedium Messaufbau Ablauf der Messungen Fehlerquellen V

6 Inhaltsverzeichnis 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Auswertung der Trenneffizienz Einfluss des Hämatokritwertes Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal Einfluss der Flussraten in Plasma- und Zellkanal Optimierung des Mikrokrümmers durch parallele Plasmakanäle Diskussion der Messergebnisse Zusammenfassung und Ausblick 101 Publikationen 105 Nomenklatur 109 Abbildungsverzeichnis 115 Tabellenverzeichnis 117 Literaturverzeichnis 119 VI

7 Einleitung Zu den Anwendern medizinisch-diagnostischer Analysegeräte sollen zunehmend die Patienten selbst gehören. Das Ziel der Produktentwicklungen im Bereich der medizinischen Diagnostik müssen daher einfache, kostengünstige, patientenfreundliche und vor allem patientennah gestaltete Geräte sein. Diese sollten einfach zu bedienen und handlich sein. Lab-on-a-chip-Systeme besitzen die Voraussetzungen für den Einsatz in diesen Produkten. Eine Lösung dieses Problems könnte folgendermaßen aussehen: Ein möglichst kleines und kompaktes Analyseelement, zum Beispiel in Form eines Teststreifens zur Glukosemessung im Blut, enthält alle für die Durchführung eines Tests notwendigen Reagenzien. Die Probenflüssigkeit wird in Kontakt mit dem Analyseelement gebracht. Nach kurzer Zeit weist man durch eine physikalische oder chemische Veränderung am Analyseelement das analytische Resultat mit Hilfe eines Auswertegerätes nach. Die zeitnahe Messung physiologischer Parameter erlaubt eine schnelle therapeutische Entscheidung. Mit diesen Systemen können meist mehrere wichtige Messgrößen gleichzeitig bestimmt werden, was zur Erhöhung der diagnostischen Aussagekraft führt. Die Nutzung etablierter Herstellungsprozesse der Mikrosystemtechnik begünstigt die Integration und Massenfertigung solcher Analysesysteme. Schlüsselstrukturen für die technologische Forschung und Entwicklung im Bereich Diagnostik sind integrierte Mikrofluidiken als funktionsentscheidende Komponenten der diagnostischen Geräte. Durch die Miniaturisierung der Analytprozessierung erreicht man eine Reduktion von Transportzeiten, Transportvolumina und Totvolumina, einen geringeren Probenbedarf und Reagenzienverbrauch. Dadurch werden Energie- sowie Zeitaufwand und damit Kosten reduziert. Liegt die Größe der funktionstragenden Komponenten in diagnostischen Geräten im Mikro- oder Nanometerbereich, können insbesondere Phänomene der Mikrowelt genutzt und neue Prozesse und Verfahrensweisen entwickelt werden, die sich durchaus auch an Vorgängen in der Natur orientieren. Beispiele hierfür sind Mikronadeln als 1

8 Einleitung weitgehend schmerzfreie Stechhilfen ähnlich dem Prinzip eines Moskitostiches oder Separierungstechniken via Kapillarstrukturen [Roc02]. Ein konzeptioneller Weg der Miniaturisierung nutzt aus der Makrowelt bekannte Prozesse. Es wird versucht, die benötigten Strukturen unter Beibehaltung der grundlegenden Gestaltung und Funktionsweise der Vorrichtung einfach zu verkleinern. Ein eleganterer Weg als die Imitation der aus der Makrowelt bekannten Prozesse ist das Ausnutzen von Phänomenen, welche für die Natur und damit die Mikrowelt charakteristisch sind. In der Mikrowelt dominieren andere physikalische Effekte wie Oberflächen-, Kapillar- und Adsorptionskräfte gegenüber Effekten der Makrowelt wie beispielsweise Volumenkräfte. Es ist ein schnellerer Wärmetransport möglich, das Fließverhalten von Flüssigkeiten ist aufgrund der kleinen Reynoldszahlen laminar. Turbulenz spielt bei Mischvorgängen keine Rolle. Effizientes Mischen ist aber im Mikrobereich im Gegensatz zum Makrobereich durch Diffusion möglich. Elektrochemische Doppelschichten ermöglichen durch Ladungsverschiebungen den Transport von Flüssigkeiten ohne Steuerungsventile. Ziel miniaturisierter Analysesysteme ist die Integration komplexer Aufgaben in eine einfache, in wenigen Fertigungsschritten herstellbare Vorrichtung. Mikrofluidische Analysegeräte zeichnen sich daher durch einfache Kapillarstrukturen aus, die einen gezielten Stofftransport ermöglichen. In diesen wird versucht, die Schritte Gewinnung, Aufnahme und Transport einer Flüssigkeitsprobe zu einer Detektionseinheit in einer integrierten und miniaturisierten Vorrichtung zu vereinen. Eine der Standardmethoden in der konventionellen Labordiagnostik bei Blutuntersuchungen stellt immer noch das Zentrifugieren dar. Dies ist ein zeitintensiver Prozess, die Durchlaufzeiten sind lang. Bei Blutuntersuchungen werden die meisten klinischchemischen Untersuchungen an zellfreien Blutflüssigkeiten, Blutplasma oder -serum durchgeführt, da die Blutzellen oder deren Inhaltsstoffe zu einer Verfälschung oder Beeinträchtigung der Messergebnisse führen können. Für die Abtrennung werden bisher Filtrations- oder Zentrifugationstechniken eingesetzt. Ungefähr 75 % aller Proben müssen zentrifugiert werden, d.h. es entfällt ein Großteil der Analysenzeiten und Kosten (bis zu 24 %) in medizinischen Laboren auf diesen Arbeitsschritt [Roc02]. Der große, mit hohen Kosten verbundene apparative Aufwand in der konventionellen Labordiagnostik führt zu einer Zentralisierung solcher Einrichtungen. Die Arbeit besteht im wesentlichen aus vielen und damit teueren Handarbeitsschritten, zum Beispiel: Zentrifugieren, Mischen mit anderen Reagenzien, Trennen von Phasen, Verdünnen. Anstrengungen zur Automatisierung in diesem Bereich zielten bisher im We- 2

9 sentlichen auf die Reduktion der manuellen Arbeitsschritte aber nicht auf neuartige Analysemethoden. Diese Arbeit setzt an diesem Punkt an. Das Ziel ist die Entwicklung eines biochipintegrierbaren, mikrofluidischen Trennverfahrens für die Blutdiagnostik. Durch Integration der Trennmodule in miniaturisierte, mikrofluidische Analysesysteme lassen sich apparativ aufwändige Trennverfahren wie das Zentrifugieren oder Störungen in Separationsvorgängen, zum Beispiel Verstopfungen bei der Filtration, vermeiden und damit Zeit, Energie und Kosten sparen. Das neu entwickelte mikrofluidische Trennverfahren für Blutzellen und Blutplasma, der Mikrokrümmer, besteht aus einer simplen Mikrokanalanordnung. Der Auftrennmechanismus basiert auf rein physikalischen und hydrodynamischen Mechanismen ohne integrierte Aktorelemente. Die Arbeit beginnt mit einer kurzen Übersicht über Systeme für die patientennahe Blutdiagnostik und einer Beschreibung des Projekts µtbc, in dessen Rahmen das Trennverfahren entwickelt wurde (Kapitel 1). Von elementarer Bedeutung für ein neuartiges Trennverfahren sind selbstverständlich auch die physikalischen und rheologischen Eigenschaften von Blut sowie der Stand der Technik bei der Blutauftrennung, insbesondere auch im Hinblick auf eine anzustrebende Miniaturisierung (Kapitel 2). Das Konzept des neu entwickelten Blutauftrennverfahrens, das des Mikrokrümmers, wird in Kapitel 3 erläutert und Vorschläge für die Dimensionierung einer solchen Auftrennstruktur mit mehreren Parametern theoretisch abgeschätzt. Prototypen des Mikrokrümmers wurden mit verschiedenen mikrotechnischen Herstellungsprozessen realisiert (Kapitel 4). Zur Validierung der Konzepts wurde schließlich eine messtechnische Charakterisierung und Optimierung von unterschiedlichen Mikrokrümmerstrukturen durchgeführt (Kapitel 5). Abschließend werden die Ergebnisse der Arbeit zusammengefasst und ein Ausblick auf Erweiterungsmöglichkeiten für den Mikrokrümmer gegeben. 3

10 Einleitung 4

11 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc 1.1 Mikrotechnische Systeme für die Blutdiagnostik Ist die miniaturisierte Schnelldiagnostik immer noch eine Vision? Der Arzt entnimmt seinem Patienten nur wenige Mikroliter Blut anstatt in einem Teströhrchen mehrerer Milliliter, welche in einem externen Labor analysiert werden müssen. Der Arzt bestimmt mit wenigen Mikrolitern Blut in einem kompakten Mikroanalysesystem innerhalb von wenigen Minuten wichtige Blutparameter selbst und teilt anschließend dem Patienten die Ergebnisse der Diagnose mit. Oder zur gleichen Zeit nutzt ein Pharmaunternehmen ein ähnliches, aber hoch parallelisiertes Gerät, um ein neues Arzneimittel auf Wechselwirkungen mit anderen Substanzen zu testen. Dies sind die Visionen der Lab-on-a-chip-Technologie, die Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechnologien kombiniert. Der Vorteil der patientennahen Schnelldiagnostik liegt darin, dass die Ergebnisse der Untersuchungen früher vorliegen. Dies erlaubt kürzere Reaktionszeiten, Therapiemonitoring, Therapiekontrolle und ein Therapie- Feedback. Die Behandlungskosten von Patienten können gesenkt werden, da die Diagnosen früher gestellt werden und damit vielfach Maßnahmen infolge verspäteter Diagnosen entfallen. Das Potential dieser neuen Technologie scheint jedoch noch nicht ausgeschöpft zu sein. Bisher zumindest haben sich noch keine preiswerten Systeme im Bereich der patientennahen Diagnostik am Markt durchgesetzt. Ein Grund hierfür liegt darin, dass die Systeme meist unter der Prämisse der technischen Möglichkeiten entwickelt wurden, anstatt sich an den Bedürfnissen des Marktes zu orientieren, zum Beispiel der Kompatibilität zu standardisierten Mikrotiterplattenformaten. Bisher werden von Firmen, welche mit mikrofluidischen Analysesystemen erfolgreich am Markt sind, hauptsächlich nur Nischenmärkte in der Bioanalytik bedient [Sei03, Ste04]. Im Bereich der patientennahen Blutdiagnostik gab es in den vergangen Jahren mehrere Systeme, welche jedoch keine große Marktdurchdringung aufgrund mangelnder Miniaturisierung oder Bedienerfreundlichkeit erreicht haben, zum Beispiel Abaxis EPOC 5

12 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc 2000 [SOL + 92]. Von Roche gibt es einige sogenannte Lab-on-a-Strip -Systeme (Reflotron, Cardiac Reader) bei denen Blutparamter mit Teststreifen in Tischgeräten analysiert werden [Eff04, Roc05]. Nur für Blutzuckermessungen gibt es von diversen Herstellern einige handlich kompakte, vom Patienten selbst bedienbare Geräte. Der Grund hierfür liegt im großen Marktpotential für Glukosemessungen, da Diabetes eine der großen Volkskrankheiten in den Industrieländern darstellt [Eff04]. Im Bereich der Messung weitere Blutparameter hat sich bisher bei den tragbaren Handgeräten nur das i-stat System am Markt etablieren können [i-s05]. 1.2 Ausgangslage und Entwicklungsziele von µtbc Das zunehmende Durchschnittsalter der Bevölkerung in den großen Industrieländern, die Polymorbidität sowie Mehrfacharzneimitteltherapien erfordern als wichtigste Faktoren bei der Entwicklung neuer Diagnosesysteme eine individualisierte Früherkennung, therapiebegleitende Prävention, transparente Qualitätskontrolle mit telemedizinischer Vernetzbarkeit und Kosteneinsparungen bei Behandlungs- oder Folgekosten. Ziel des Projektes µtbc (Mikro-Tele-BioChip) ist die Entwicklung eines kostengünstigen Gesamtsystems zur präventiven, kostenreduzierenden Diagnostik. Diese soll auf den Patienten und sein individuelles Risikoprofil zugeschnitten sein und mit geringstem Aufwand des Anwenders zuverlässige Ergebnisse unmittelbar an die medizinischen Entscheidungsträger übermitteln können. Der Chip und das dazugehörige Gerät sollen innerhalb weniger Minuten nach Auftrag einer Vollblut-, Kapillarblut- oder Plasmaprobe quantitativ die Konzentration kleinster Zielmoleküle mit hoher Sensitivität nachweisen können. Er kann somit therapeutisch und diagnostisch eingesetzt werden. Das Projekt µtbc wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) während 32 Monaten öffentlich gefördert. Die Gesamtprojektkosten belaufen sich auf 2,9 Mio. Euro. Es ist interdisziplinär angelegt. Seine besondere Herausforderung liegt in der Entwicklung eines vollständig integrierten und miniaturisierten Messsystems für eine einfache und kostengünstige Kapillarblutanalyse. Als Ergebnis des Projekts soll ein tragbares Analysegerät entstehen, welches quantitative Messergebnisse aus geringsten Konzentrationen biologischer Zielanalyten mit hoher Präzision nachweist. Zentrale Funktionseinheiten des Analysegeräts sollen ein mikrofluidisches Separations- /Detektionsmodul, welches geringste Blutmengen in Blutplasma und -zellen auftrennt, 6

13 1.2 Ausgangslage und Entwicklungsziele von µtbc und eine Messeinheit auf Grundlage einer miniaturisierten Laser-induzierten Fluoreszenzanalyse (LIF) Technologie bilden. Die erforderlichen Kalibriereinrichtungen und eine Datenfernübertragungseinrichtung zur Übertragung der Messdaten an ein Zentrallabor, an eine Notfallaufnahme oder den behandelnden Arzt sollen ebenfalls in das Gerät integriert werden. Die zwei großen Einsatzbereiche für dieses Analysegerät liegen im Bereich der: 1. Arzneimittelsicherheit präklinische Forschung: funktionale Proteomik Wirkstoffanalyse, Toxikologie Erstellen von Metabolitenprofilen Analyse der therapeutischen Effizienz eines Wirkstoffs klinische Forschung: Wirkstoffvalidierung Validierung von Darreichungsformen Selektion von Risikogruppen Nebenwirkungsprofil Dosisoptimierung 2. Patientennahe (Point-of-Care-) Diagnostik therapiebegleitende Patientenselbstkontrolle: Bestimmte Therapeutika haben u.a. Auswirkungen auf vitale Organe des Patienten, wie z.b. Herz, Niere, Leber oder Immunsystem. Eine Kontrolle dieser sog. Vitalparameter ist unter Umständen für eine optimale Therapieeinstellung wichtig oder sogar unentbehrlich. Point-of-Care-Diagnostik: In der Notfallmedizin werden für eine schnelle therapeutische und klinische Entscheidung die unmittelbare Ergebnisverfügbarkeit einer zunehmenden Anzahl von Molekülen und biochemischen Parametern gefordert. Das µtbc-system ist vor allem auf den Gebieten Herz-/Kreislauf, Endokrinologie und Infektologie relevant. 7

14 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc Das Projekt µtbc ist interdisziplinär ausgelegt und wird von der Preventor µtbc GmbH, Pfungstadt, koordiniert. Die Arbeitspakete umfassen die Entwicklung eines kombinierten mikrofluidischen Separations-/Detektionsmoduls auf einem Polymerchip, welches in einer Blut/Plasma- Trenneinheit BLISC (Blood Liquid Separation Chip) innerhalb von wenigen Minuten das Kapillarblut in Blutplasma sowie Blutzellen auftrennt und das Blutplasma in einem Reservoir für nachfolgende Messungen sammelt. Die Entwicklung, Dimensionierung und Prototypenfertigung des BLISC wird vom Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Lehrstuhl für Prozesstechnologie, durchgeführt. Für den Nachweis von Peptiden, Proteinen oder Zellen direkt auf dem Chip aus dem gewonnenen Blutplasma wird ein geeigneter Immunoassay-Tests durch die Preventor µtbc GmbH in Kooperation mit dem CNRS Strassbourg/ F und dem Institut für Physikalische und Theoretische Chemie der Universität Potsdam entwickelt. Dabei sollen neuartige chemische Stoffe eingesetzt werden, welche die unspezifischen Bindungen der biologischen Matrixmoleküle an die Chipoberfläche verhindern. Die Moleküle treten in Wechselwirkung mit laserkompatiblen Markersubstanzen und ermöglichen somit einen Simultannachweis unterschiedlicher Zielanalyten auf demselben Chip. Für die Analyse wird ein kostengünstiges miniaturisiertes, tragbares Messsystem auf der Basis der laserinduzierten Fluoreszenzanalyse (LIF) von der Optimare GmbH, Wilhelmshaven, entwickelt. Die Messwerte sollen mittels einer verschlüsselten, drahtlosen, anwendergesteuerten Datenübertragung (Bluetooth, GSM, WLAN) an einen Empfänger weitergeleitet werden. Am Ende des Projekts soll das µtbc-systems an der Deutschen Klinik für Diagnostik, Wiesbaden, klinisch validiert und zertifiziert werden. Die entscheidenden Vorteile des µtbc-messsystems liegen in der Verwendung von Kapillarblut, und damit das Wegfallen einer aufwendigen und teueren Probenaufbereitung der kostengünstigen, dezentralen und quantitativen Schnelldiagnostik der miniaturisierten Anregungs- und Detektionstechnik, welche ein tragbares Messsystem ermöglicht der volldigitalen Datenübertragung für einen Zeitgewinn in der Notfallmedizin sowie für verbesserte, beschleunigte Arbeitsabläufe und Logistik in der Therapie 8

15 1.2 Ausgangslage und Entwicklungsziele von µtbc dem präventiven Entscheidungsinstrumentarium für Ärzte durch eine Individualisierbarkeit durch gezielte Multiparameteranalyse und selektierte, optimale sowie kosteneffiziente Therapiealternativen des Arztes dem gesellschaftlichen und epidemiologischen Nutzen durch eine schnelle Früherkennung von zum Beispiel Grippeepidemien und als Impfstatusnachweis Die Ablaufschritte einer Messung mit dem µtbc-system sind in Abbildung 1.1 schematisch dargestellt. Kapillarblutentnahme Blutauftrennung und Nachweisreaktion Immunoassay (FRET) Fluoreszenzreader Abbildung 1.1: Ablaufschritte einer Messung mit dem µtbc System. Das Kapillarblut wird entnommen, indem die Fingerbeere mit einer Stechhilfe punktiert wird. Ein Blutstropfen (20 50 µl) wird mit einer mit Pufferlösung präparierten Spritze kapillar aufgenommen und in den BLISC appliziert. Dort findet die Auftrennung von Blutplasma und Blutzellen statt. Das Blutplasma fließt in eine auf dem Chip mikrofluidisch integrierte Messkammer. Der Nachweis des Zielanalyten im Blutplasma erfolgt durch einen kompetitiven, homogenen Immunoassay, bei dem der Zielanalyt mit einem Referenzanalyten bei der 9

16 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc Bindung an den Antikörper in Konkurrenz tritt. Das Prinzip beruht darauf, dass ein spezifischer Antikörper (vergleichbar mit einem Schloss) mit einem Antigen (dem dazu passenden Schlüssel) zu einen Antigen-Antikörper-Komplex (Schlüssel-Schloss- Kombination) bindet. Die Anzahl der gebundenen Komplexe kann durch die Verwendung von mit Farbstoff markierten Antigenenen über Fluoreszenzsignalmessungen bestimmt werden. In der Messkammer wird eine definierte Fläche mit für die nachzuweisenden Antigene spezifischen, markierten Antikörpern durch Adsorption an der Trägeroberfläche beschichtet. Um eine unspezifische Bindung der Antigene an die nicht mit Antikörpern belegte Trägeroberfläche zu verhindern, wird diese dort mit einem nicht interferierenden Protein (z.b. Albumin oder BSA) beschichtet. Anschließend wird das Blutplasma mit dem darin enthaltenen Zielmolekül (Antigen) und einem Referenzmolekül (markiertes Antigen) über die Trägeroberfläche gespült. Es kommt zu einer kompetitiven spezifischen Bindung von Zielmolekül und Referenzmolekül an die Antikörper. Abhängig von der Konzentration binden mehr oder weniger Zielmoleküle. Durch die kompetitive Bindung an Antikörper wird eine Quantifizierung der Konzentration des Zielmoleküls bei bekannter Konzentration des Referenzmoleküls möglich. Bei der Detektion kommt das Prinzip des TR-FRET (Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer) zum Einsatz (Abbildung 1.2). markiertes Referenz-Antigen (Akzeptor) Ziel-Antigen markierter Antikörper (Donor) strahlungsloser Energietransfer Abbildung 1.2: Prinzip eines kompetitiven FRET-Assays. 10

17 1.2 Ausgangslage und Entwicklungsziele von µtbc Der Antikörper ist mit dem Donorfarbstoff markiert. Die Anregung des Donors erfolgt durch eine Lichtquelle (Laser, Xenon-Blitzlampe, Diodenlaser). Bei der Bindung von markiertem Antikörper und markiertem Antigen erfolgt die strahlungsfreie Übertragung von Photonenenergie von einem angeregten Fluorophor (Donor) auf ein anderes Fluorophor (Akzeptor). Das Referenzmolekül (Antigen) ist mit dem Akzeptorfarbstoff markiert. Die Fluoreszenzintensität des Akzeptorfarbstoffes wird zeitverzögert, quantitativ mit einem Fluoreszenzreader gemessen und ausgewertet. Das Ergebnis kann anschließend drahtlos übertragen werden. Beim homogenen Immunoassay erfolgt kein Spülschritt nach der Bindung von Antikörper und Antigen. Um eine hohe Auflösung beim Messsignal zu erhalten, ist es wichtig, dass nur ein geringes Hintergrundrauschen während der Messung vorliegt. Das Rauschen wird insbesondere durch Verunreinigungen im Blutplasma, wie beispielsweise nicht herausgefilterte Blutzellen, verursacht. Daraus ergibt sich die Anforderung an den BLISC, analytisches Blutplasma mit einer Reinheit von über 90 % zu gewinnen. 11

18 1 Patientennahe Diagnostik mit µtbc 12

19 2 Blutseparationstechnik 2.1 Blutbestandteile Für das Auftrennen von Blut sind selbstverständlich dessen Bestandteile und rheologische Eigenschaften von elementarer Bedeutung. Die besondere physiologische Bedeutung des Blutes liegt darin, dass es über das Gefäßsystem mit allen Geweben des Körpers in Verbindung steht. Die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff, die Entsorgung der Stoffwechselprodukte sowie die Kommunikation zwischen Zellsystemen durch chemische Botenstoffe werden durch die Zirkulation des Blutes gewährleistet. Eine der häufigsten diagnostischen Maßnahmen in der Medizin ist deshalb die Untersuchung der Blutparameter. Damit können selbst Funktionsstörungen von Geweben diagnostiziert werden, die normalerweise einer direkten Analyse nur schwer zugänglich sind. Das Blut erfüllt als Transportmedium des Kreislaufsystems eine Vielzahl von Funktionen. Das Volumen und die Zusammensetzung des Blutes werden durch den Körper sehr präzise reguliert. Bei bestimmten Krankheiten können sich aber auch typische Veränderungen zeigen. Daher kann eine Blutuntersuchung für die Diagnose von Krankheiten sehr aufschlussreich sein [GPW99]. Das Blut besteht aus einem zellulären Anteil, den Hämozyten, und einer blassgelben Flüssigkeit, dem Blutplasma. Normalerweise hat es eine Dichte von 1,057±0,007 g/cm 3 und eine Viskosität zwischen und Pa s. Die Viskosität des Blutes ist abhängig von der Schergeschwindigkeit. Damit ist Blut eine nicht-newtonsche Flüssigkeit. Mit Hämozyten werden die drei Blutzellentypen, Erythrozyten (auch rote Blutkörperchen, Anteil über 94 %), Leukozyten (auch weiße Blutkörperchen, Anteil < 0.15 %) und Thrombozyten (auch Blutplättchen, circa 5 % der Hämozyten), bezeichnet (Abbildung 2.1). 13

20 2 Blutseparationstechnik Abbildung 2.1: REM-Aufnahme unterschiedlicher Hämozyten (links: Erythrozyt, Mitte: Thrombozyt, rechts: Leukozyt). Quelle: Electron Microscopy Facility, The National Cancer Institute at Frederick, Der Gewichtsanteil des Blutes beim Menschen entspricht ungefähr 8 ± 1 % seines Körpergewichts. Beim erwachsenen Menschen beträgt das Blutvolumen pro Kilogramm Körpergewicht im Durchschnitt 70 ml bei einem Mann, beziehungsweise 65 ml bei einer Frau. Es existiert eine deutliche Altersabhängigkeit, beim Neugeborenen ist das Blutvolumen pro Kilogramm Körpergewicht mit bis über 100 ml/kg deutlich größer als beim Erwachsenen, bei sehr alten Menschen können Werte von nur 50 ml/kg vorkommen. Der relative zelluläre Volumenanteil des Blutes wird als Hämatokritwert (HKT ) bezeichnet. Er beträgt im Normalfall durchschnittlich 45 % beim Mann, beziehungsweise 42 % bei der Frau. Üblicherweise wird der Hämatokritwert durch den Anteil der Erythrozyten als Hauptbestandteil der Hämozyten bestimmt. Die Dichte ρ des Blutplasmas ist mit ρ = 1,035 g/cm 3 geringer als die der Blutzellen (siehe Tabelle 2.1). Damit lässt sich der Hämatokritwert durch Zentrifugieren einer aus einer Vene gewonnenen Blutprobe bestimmen [GPW99, Sch00]. Erythrozyten Die Erythrozyten sind kernlose Zellen, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Die mechanischen Eigenschaften der Zellmembran sind gekennzeichnet durch eine sehr geringe Biegesteifigkeit bei niedriger Dehnbarkeit. Formänderungen durch äußere Kräfte sind daher leicht möglich, solange diese die Membran nicht auf Dehnung beanspruchen. Durch die Verformung können sich die Erythrozyten in englumigen 14

21 2.1 Blutbestandteile Tabelle 2.1: Wichtigste physikalische Eigenschaften der Hämozyten im physiologisch normalen Bereich, in Klammern stehen die typisch verwendeten Werte [Maz92, Sch00]. Dichte Charakteristische Länge Konzentration g/cm 3 µm Anzahl Zellen / µl Blut Erythrozyten 1,098 1, (8) 4,2 5, (4, ) (1,098) 1,84 2,84 (1,9)Dicke 4,6 6, (5, ) Leukozyten 1,055 1, (10) (9000) Thrombozyten 1,04 1, (3) 2, ( ) (1,05) 0,9 1,3 Dicke 1, ( ) Kapillargefäßen der Strömung anpassen. Ohne äußere Krafteinwirkung besitzen Erythrozyten eine bikonkave Scheibenform. Ihr Durchmesser beträgt 6 9 µm, ihre Dicke etwa 2 µm, das mittlere Zellvolumen liegt bei etwa µm 3. Die Abmessungen variieren innerhalb der Zellpopulation erheblich. Im Gefäßsystem kommt die bikonkave Idealform der Erythrozyten praktisch nicht vor. Erythrozyten bestehen aus einer elastischen Zellmembran, die sich aus der Membran und einem submembranären Zytoskelett zusammensetzt. Das Erythrozytenzytoplasma enthält unter anderem Hämoglobinmoleküle, welche für den Sauerstofftransport im Blut wichtig sind. Das Zytoplasma verhält sich wie eine newtonsche Flüssigkeit. Die Viskosität des Zytoplasmas liegt, abhängig vom Hämoglobingehalt ( g/l), zwischen und Pa s. Die Materialeigenschaften der Membranhülle und die flüssige Füllung ermöglichen eine Vielzahl von Deformationen der Erythrozyten. Die Gesamtoberfläche und das Gesamtvolumen der Zellen bleiben konstant. Aufgrund dieser Deformierbarkeit ist es für Erythrozyten möglich, selbst durch Verengungen mit einem Durchmesser von kleiner als 3 µm zu gelangen [Gae82, GPW99, Sch00, PP00, WH00]. Leukozyten Zu den Leukozyten gehören drei morphologisch und funktionell unterschiedliche Zelltypen (Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten), die sich wiederum in weitere Untergruppen aufteilen. Ohne die Einwirkung äußerer Kräfte besitzen die Leukozyten eine Kugelform mit einem Durchmesser von 6 10 µm. Die faltige Oberflächenstruktur der Leukozyten erlaubt es auch ihnen, sich so weit zu deformieren, dass sie 15

22 2 Blutseparationstechnik durch Kapillaren mit Durchmesser kleiner ihrem Ruhedurchmesser gelangen können. Die Leukozyten sind ebenfalls mit Zytoplasma gefüllt. Ihre Membran besitzt im Vergleich zu den Erythrozyten eine um einige Größenordnungen höhere Steifigkeit. Dies bewirkt bei den Leukozyten einen höheren Widerstand gegenüber kurzzeitig einwirkenden Verformungskräften als bei den Erythrozyten. Die Leukozyten beeinflussen infolge ihres relativ geringen Anteils im Blut die makrorheologischen Eigenschaften nur wenig [GPW99, Sch00, PP00, WH00, SÖS89]. Thrombozyten Die Thrombozyten besitzen in der nicht aktivierten Normalform eine runde oder ovale Scheibenform mit einer glatten Oberfläche. Ihr Durchmesser beträgt 2 4 µm, ihre Dicke ungefähr 1 µm. Im aktivierten Zustand haben sie eine Kugelform mit tentakelförmigen Ausstülpungen an der Oberfläche (Abbildung 2.1). Der rheologische Einfluss der Thrombozyten ist aufgrund ihres kleinen relativen Anteils am Gesamtblut ebenfalls gering [GPW99, Sch00, PP00, SÖS89]. Blutplasma Entfernt man mittels Zentrifugieren oder anderer Separationstechniken die Hämozyten aus dem Blut, erhält man Blutplasma. Das Blutplasma besteht zu circa 92 % gew beziehungsweise 94,8 % vol aus Wasser und 7 % gew Proteinen (Albumin, Globuline, Fibrinogen). Den Rest von circa 1 % gew bilden Kohlenhydrate, Lipide und Elektrolyte. Aufgrund des hohen Wasseranteils zeigt das Blutplasma newtonsches Fließverhalten. Es besitzt eine Dichte von 1,035 ± 0,005 g/cm 3 und eine Viskosität von 1, Pa s. Entfernt man aus dem Blutplasma das Fibrinogen, indem man vor dem Zentrifugieren das Blut koagulieren lässt, erhält man das sogenannte Blutserum. Dieses besitzt eine Dichte von 1,018 g/cm 3 und die gleiche Viskosität wie das Blutplasma [GPW99, Sch00, PP00]. 2.2 Rheologische Eigenschaften von Blut Makrorheologie des Blutes Rheologisch kann Blut als eine Suspension von Blutzellen in Blutplasma als Suspensionsmedium betrachtet werden. 16

23 2.2 Rheologische Eigenschaften von Blut Das Fließverhalten einer Suspension wird durch die Anzahl, Größe, Form und Verformbarkeit der suspendierten Partikel bestimmt. Die Viskosität der Suspension µ s ist größer als die des Suspensionsmediums µ 0. Der Betrag hängt nach der Einsteinschen Gleichung (2.1) vom prozentualen Partikelanteil C (C < 0,05) sowie einem Formfaktor φ (φ = 2,5 für kugelförmige Teilchen) ab [Maz92]: 1 µ s = µ 0 ( 1 C φ ) (2.1) Blut ist ein nicht-newtonsches Fluid. Die rheologischen Eigenschaften werden durch die zellulären Bestandteile des Blutes sowie deren Verteilung und Wechselwirkung im Blutkreislauf bestimmt. Blut besitzt ein viskoelastisches, thixotropes Fließverhalten. Die Viskoelastizität entsteht durch die Eigenschaften der Erythrozyten (elastische Membran, viskose Flüssigkeitsfüllung). Eine größere Schergeschwindigkeit bewirkt eine stärkere Deformation der Erythrozyten. Die Viskosität steigt von 0,004 Pa s auf 0,1 Pa s während die Schergeschwindigkeit von 1000 s 1 auf 0,01 s 1 abnimmt [SÖS89]. Neben der Höhe der jeweiligen Scherspannung bestimmt der Hämatokritwert des Blutes seine Viskosität (Gleichung 2.1). Bei ansteigendem Hämatokritwert nimmt die Viskosität zu. Bei einer Schergeschwindigkeit von 1000 s 1 steigt die Viskosität von 0,002 Pa s bei einem Hämatokritwert von 10 % auf 0,06 Pa s bei einem Hämatokritwert von 50 % [SÖS89]. Aufgrund ihrer hohen Konzentration bestimmen die Erythrozyten die rheologischen Eigenschaften des Blutes. Im Bereich geringer Scherspannungen lagern sich die Zellen zu lockeren Aggregaten zusammen und bilden ein Aggregatnetzwerk. Dieses wird auch als Geldrollenbildung oder Rouleaux bezeichnet. Eine Verschiebung von Flüssigkeitsschichten wird unmöglich, da das Netzwerk Scherspannungen unterhalb der Fließscherspannung elastisch widerstehen kann. Die Aggregatbildung wird durch großmolekulare Proteine im Blutplasma (Fibrinogen, α 2 -Makroglobulin) und durch die Verformbarkeit und Orientierung der suspendierten Erythrozyten verursacht. Diese Aggregation ist ein reversibler Vorgang. Steigt die Scherrate an, führt dies zum Aufbrechen der Zellaggregate und damit zu einer Erniedrigung der Viskosität. Die anderen Blutzelltypen, Leukozyten und Thrombozyten, besitzen nur einen kleinen Volumenanteil am Blut. Die Leukozytenmembran ist jedoch wesentlich steifer als die der Erythrozyten. Die Leukozyten tragen dadurch erheblich zum mikrovaskulären Flusswiderstand bei. Die Thrombozyten sind wesentlich kleiner als die Erythrozyten. Sie leisten keinen signifikanten Beitrag zum Flusswiderstand [Gae82, PSG96]. 17

24 2 Blutseparationstechnik Mikrorheologie des Blutes Im Mikrobereich zeigt Blut einige interessante rheologische Effekte. Es kann dort nicht mehr als Kontinuum betrachtet werden. In den letzten 80 Jahren wurden intensive Forschungsarbeiten über die Mikrorheologie von Blut in vivo, in vitro und auch mit theoretischen Modellierungsansätzen durchgeführt. Einen Überblick über diese Arbeiten bietet der Übersichtsartikel von Pries et al. [PSG96]. Bei Kapillardurchmessern von weniger als 300 µm werden die rheologischen Eigenschaften durch die in diesen Dimensionen nicht mehr zu vernachlässigende Größe der Erythrozyten beeinflusst. Hydrodynamische und mechanische Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Blutplasma sowie den Wänden der Kapillaren führen zur Ausbildung einer zellverarmten Randzone, der so genannten Plasmarandschicht, und zu einer Konzentration der Erythrozyten im zentralen Bereich. Dieser Effekt wird als Axialmigration bezeichnet. Daraus ergibt sich in Kapillaren eine Reduktion des Hämatokritwertes bei fließendem Blut (Fahraeus Effekt) und ein geringerer Flusswiderstand des Blutes als der aus der makroskopischen Viskosität des Blutes berechnete (Fahraeus-Lindquist Effekt). Die Viskosität des Blutes nimmt mit abnehmenden Kapillardurchmesser ab. Das Viskositätsminimum liegt bei einem Durchmesser von 7 µm. Bei Durchmessern < 3,5 µm steigt die Viskosität über den Wert an, welcher makroskopisch erwartet wird [PSG96]. An Kapillarverzweigungen tritt als weiterer mikrorheologischer Effekt eine Phasenseparation von Blutplasma und Blutzellen auf, das sogenannte Plasma Skimming. Beschrieben wurde es zum ersten Mal 1921 vom dänischen Physiologen August Krogh. Dieser beobachtete bei arteriellen Verzweigungen in Froschhäuten, dass unterschiedliche Flussraten, herbeigeführt beispielsweise durch teilweisen Verschluss eines Kapillargefäßes, zu einer geringeren Blutzellenkonzentration im Gefäß mit der geringeren Flussrate führen. Krogh erklärte diesen Effekt durch ein Abschälen der zellarmen Plasmarandschicht an Kapillarverzweigungen [Kro21]. Plasma Skimming und Axialmigration In zahlreichen in vitro und in vivo Experimenten seit 1921 wurden Faktoren bestimmt, welche Einfluss auf die Phasenseparation an Kapillarverzweigungen ausüben. Unterschiedliche Flusswiderstände in den Kapillarabschnitten nach der Verzweigung beeinflussen hauptsächlich das Plasma Skimming. Je größer die Differenz der Widerstände und damit der Flussraten ist, zum Beispiel durch unterschiedliche Kapillarquerschnitte 18

25 2.3 Verfahren zur Blutauftrennung oder -längen, desto größer ist die Differenz der Blutzellenkonzentrationen in den Kapillarabschnitten nach der Verzweigung [Kro21, BH64, BH65, SZ68, FRCC85, PWSS87, PLCG89, CW91]. Auch die absoluten Kapillardurchmesser haben einen Einfluss. Bei kleineren Durchmessern ist der Plasma Skimming -Effekt ausgeprägter [FRCC85]. Zudem beeinflussen der Hämatokritwert sowie die radiale Zellverteilung vor der Verzweigung das Plasma Skimming. Niedrigere Hämatokritwerte führen zu größeren Unterschieden der Blutzellenkonzentrationen [BH64, BH65, YF78, FRCC85, DO96]. Wird der Zelldurchmesser im Vergleich zum Durchmesser des Plasmakanals groß, kommt es zur vermehrten Wechselwirkung der Zellen mit den Kapillarwänden und anderen Zellen. Dies führt zu einer sterischen Separation der Zellen, dem so genannten Cell Screening [DO96]. Bei größeren Kapillardurchmessern wird das Plasma Skimming durch die radiale Verteilung der Zellen beeinflusst. Die Trägheit der Zellen gegenüber Scherkräften im laminaren Strömungsfeld führt zu einer Axialmigration der Zellen in eine Gleichgewichtsposition im Zentrum der Kapillare [FHJ94]. An der Kapillarwand bildet sich eine zellverarmte Plasmarandschicht aus. Modelle für das Plasma Skimming basieren zumeist auf dem Konzept einer teilenden Strömungslinie in zweidimensionalen, beziehungsweise einer teilenden Strömungsfläche in dreidimensionalen Betrachtungen. Die teilende Strömungslinie oder -fläche wird dabei in einem laminaren Strömungsfeld so definiert, dass sie die Grenzlinie oder -fläche zwischen den Strömungsanteilen bildet, welche nach der Kapillarverzweigung in unterschiedliche Zweige fließen. Die Zellen verteilen sich, entsprechend ihrer Lage inner- oder außerhalb der teilenden Strömungsfläche, auf die unterschiedlichen Kapillarzweige [PK83, RS84, FRCC85, YAW91, EP94, DEP97, DJP98]. 2.3 Verfahren zur Blutauftrennung Zentrifugieren In der konventionellen Labormedizin werden überwiegend Zentrifugationsverfahren eingesetzt, um das Blutplasma von den zellulären Bestandteilen des Blutes zu separieren [SMN90]. Durch die Rotation der Zentrifuge entsteht ein Zentrifugalkraftfeld. In diesem Kraftfeld besitzen Blutzellen und das sie umgebende Blutplasma unterschiedliche Sedimentationsgeschwindigkeiten aufgrund ihrer unterschiedlichen spezifischen 19

26 2 Blutseparationstechnik Dichte. Eine zerstörungsfreie, vollständige Abtrennung der Zellen erhält man typischerweise nach 15-minütigem Zentrifugieren bei 1500 U/min[Roc02]. Für eine direkte Miniaturisierung sind Zentrifugen jedoch wenig geeignet. Zum einen ist der apparative Aufwand für ein chipintegrierbares Blutseparationssystem in Form eines Einwegbauteiles zu hoch und das ganze System nicht robust genug. Zum anderen ist der Wirkungsgrad einer solchen Miniaturzentrifuge aufgrund kleiner Radien und damit niedriger Bahngeschwindigkeiten schlecht. Anwendung findet das Zentrifugieren in der Mikrotechnologie bei CD-artigen Analysesystemen. Dort werden Kunststoffscheiben im CD-Format mit mikrofluidischen Strukturen versehen. Der Antrieb und die Auswertung basieren auf den Komponenten eines CD-Players. Sie sind Massenartikel und somit relativ günstig. Die Flüssigkeit wird durch die bei der Rotation entstehende Zentrifugalkraft in den mikrofluidischen Strukturen bewegt [MLD + 01, BHZD04, Gyr05, Tec05]. Einer Miniaturisierung dieser Systeme sind insbesondere im Hinblick auf mobile Anwendungen Grenzen gesetzt. Filter Weitere in der konventionellen Labordiagnostik eingesetzte Separationsverfahren beruhen auf diversen Filtertechnologien. Diesen Verfahren ist die Nutzung der sterischen Separation gemeinsam. Die zu separierenden Zellen werden mechanisch zurückgehalten, da die Poren des Filtermediums kleiner als die Durchmesser der Zellen sind. Um auf diese Weise Erythrozyten zuverlässig abzutrennen, muss der Porendurchmesser des Filtermediums, aufgrund der Deformierbarkeit der Erythrozyten, weniger als 1 µm betragen [SMN90]. Die Filtermedien bestehen aus Glasfaservliesen [MS74, VBBW84, YSK00], hydrophilen Polymermembranen [Spe04, Pal05] sowie in Silizium oder Glas geätzten Strukturen, welche die Form eines Dammes [BOFY96, BO99], Kammes [WPB + 94, WKC + 98], Lochsiebes [HTR99] oder von Säulen [YHS + 04, YGJ + 04] besitzen. Die eingesetzten Filtertechnologien sind im eigentlichen Sinne mikrotechnische Separationsverfahren, da sie aus Mikrostrukturen gebildet werden. Der Nachteil dieser Verfahren besteht im Risiko der Verstopfung der sehr feinen Poren durch mechanischen Verschluss sowie durch Adhäsion von zellulärem Material oder Proteinen an den Porenwänden. Der teilweise oder vollständige Verschluss erhöht den fluidischen Widerstand der Filtereinheit. Die Filterkapazität wird herabgesetzt. Eine Vergrößerung 20

27 2.3 Verfahren zur Blutauftrennung der Filterkapazität kann nur durch eine Vergrößerung der Filterfläche und damit verbundenen höheren Totvolumina erreicht werden. Die Relation zwischen aufgebrachtem Probenvolumen und gewonnenem Plasmavolumen wird ungünstiger. Die monolithische Integration eines Filters in ein chipintegrierbares Separationssystem stellt zudem hohe Anforderungen an die Mikro-Fertigungstechnologie. Insbesondere die reproduzierbare Fertigung von Strukturen < 1 µm in Polymertechnologie erfordert bezüglich der Fertigungstoleranzen einen aufwendigen Herstellungsprozess. Filter aus Polymermembranen liefern, abhängig vom Hämatokritwert, eine Plasmaausbeute von bis zu 33 % des aufgebrachten Blutvolumens bei einer Separationszeit von 60 s pro cm 2 Membranfläche [Spe04]. Das gewonnene Blutplasma muss allerdings noch aus dem Filtermaterial herausgeleitet werden, zum Beispiel durch weitere Membranen oder Faservliese [Pal05]. Diffusion Bei diesem Verfahren beruht die Auftrennung auf größenabhängigen Diffusionsgeschwindigkeiten von Partikeln in Flüssigkeiten [BY96, WY99]. Dieses Verfahren kann nur sinnvoll in Mikrodimensionen eingesetzt werden, da die Effektivität der Diffusion mit kurzen Diffusionswegen steigt. Es werden die laminaren Strömungsverhältnisse in Mikrokanälen ausgenutzt. Zwei unterschiedliche Flüssigkeiten, eine davon mit Partikeln beladen, fließen parallel in einem Kanal ohne sich zu durchmischen. Während die beiden Flüssigkeitsströme parallel nebeneinander fließen, kommt es zu einem Ausgleich der Teilchenzahldichten durch Diffusion. Durch eine entsprechende Wahl der Länge der Diffusionsstrecke steuert man die Separation von Teilchen mit unterschiedlichen Größen. Eine Schwierigkeit bei diesem Verfahren besteht darin, die beiden unterschiedlichen Flüssigkeitsströme so zu steuern und die Anordnung der Kanäle so zu wählen, dass eine effektive Separation eintritt. Je nach Größe der Teilchen und den Kanaldimensionen kann ein diffusionsbasiertes Verfahren langsam werden, da die Diffusionskonstanten und damit auch die Diffusionszeiten größenabhängig sind. weitere Trennverfahren Innerhalb der letzten Jahre wurden weitere interessante mikrotechnische Verfahren zur Trennung von Blutplasma und -zellen vorgestellt: 21

28 2 Blutseparationstechnik Durch die Anwendung von Ultraschallwellen transversal zur Flussrichtung einer Suspension in einem Mikrokanal kann man bei bestimmten Frequenzen erreichen, dass sich die Zellen entlang der Wellenknoten konzentrieren. Durch geeignete Aufteilung der Strömung werden die Zellen separiert [OKUY00, HC01, LK04]. Setzt man einen Blutstropfen in Kapillaren Druckpulsen durch Ultraschallwellen parallel zur Flussrichtung aus, kommt es zur Zellverarmung an der Fließfront. Die Zellen erreichen aufgrund von Reibungs- und Scherkräften sowie ihrer Trägheit nicht die gleiche Geschwindigkeit wie die sie umgebende Flüssigkeit. Somit werden sie am Ende des Tropfens akkumuliert [JPA03, HA05]. Dielektrophorese(DEP): Bei diesem Verfahren wird ausgenutzt, dass auf elektrisch polarisierbare Partikel durch ein elektrisches Wechselfeld eine Kraft ausgeübt wird. Kombiniert man das elektrische Feld mit dem laminaren, parabolischen Strömungsfeld, kann man Zellen entsprechend ihrer Lage in der Strömung unterschiedlich schnell fortbewegen und durch geeignete Aufteilung der Strömung separieren [YHW + 99, IHU + 01, KNS + 04, TI05]. Eine magnetische Separation von Blutzellen, basierend auf para- oder diamagnetischen Eigenschaften der Zellen. Die Separation erfolgt ähnlich dem DEP- Verfahren durch die Lage der Zellen in einem laminaren Strömungsfeld. Die paraoder diamagnetischen Eigenschaften der Zellen hängen vom Sauerstoffgehalt des Blutes ab. Erythrozyten und Leukozyten sind diamagnetisch in sauerstoffangereichertem Blut [TKM00]. Ordnung, Führung oder Ablenkung von Blutzellen in optischen Gittern: Durch die Überlagerung monochromatischer Laserstrahlen werden optische Gitter erzeugt. Die Wechselwirkung des optischen Gitters mit den Zellen hängt von der Polarisierbarkeit der Zellen ab. Durchfließen Zellen in einem Strömungsfeld ein optisch erzeugtes Gitter, werden sie aufgrund ihrer Polarisierbarkeit in diesem unterschiedlich abgelenkt und anschließend separiert [MSD03]. Diese Verfahren haben jedoch bisher noch nicht den Durchbruch in kommerziellen Analysesystemen geschafft, da ihr Aufbau und Betrieb durch die Kombination von fluidischen Elementen sowie elektrischen, mechanischen oder optischen Aktoren komplex und für ein Einwegsystem zu aufwendig und teuer wird. 22

29 2.3 Verfahren zur Blutauftrennung Parallel zu dieser Arbeit wurden von Roche [Roc02, EOF03, Eff04] und einer koreanischen Arbeitsgruppe [PCC + 05] die Verwendung des Plasma Skimming -Effekts zur Separation von Blutplasma und Blutzellen vorgestellt. Der gravierende Nachteil bei diesen beiden Verfahren ist der geringe Plasmafluss von einigen Nanolitern pro Minute. 23

30 2 Blutseparationstechnik 24

31 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung 3.1 Motivation Klinisch-chemische Untersuchungen werden überwiegend mit zellfreien Blutflüssigkeiten, Blutplasma oder Blutserum durchgeführt, da die Blutzellen oder ihre Inhaltsstoffe die Messergebnisse verfälschen. Für die Abtrennung der Zellen in der Labordiagnostik werden bisher Filtrations- und Zentrifugationstechniken eingesetzt. Kompakte und miniaturisierte Analysesysteme für die patientennahe Blutdiagnostik benötigen aber chipintegrierbare, mikrofluidische Verfahren für die Separation von Blutplasma und Blutzellen. Wie im vorherigen Abschnitt 2.3 beschriebenen wurde, besitzen die bisher verfügbaren mikrotechnischen Verfahren für die Auftrennung von Blutplasma und Blutzellen noch viele Nachteile, welche ihre Verwendung einschränken. Sie sind komplex hybrid aufgebaut. Insbesondere Filter haben große Totvolumina und die Kanalquerschnitte sind kleiner als der Durchmesser der Zellen. Sie bergen somit eine Verstopfungsgefahr und führen durch einen hohen fluidischen Widerstand zu niedrigen Plasmaflussraten. Die Zielsetzung dieser Arbeit besteht darin, ein neues, mikrofluidisches Trennverfahren für die chipintegrierte Blutdiagnostik und die Verwendung im µtbc-system zu entwickeln. Bei diesem Verfahren sollen die zuvor genannten Nachteile vermieden sowie die Anforderungen für den Einsatz im µtbc-system erfüllt werden: Monolithische Integration in ein mikrofluidisches Separations-/Detektionsmodul. Kostengünstige Fertigung, vorzugsweise in Polymeren, für die Verwendung als Einwegprodukt zur Vermeidung von Kontamination oder Reinigung. Gewinnung von Blutplasmamengen von 2 20 µl aus kapillarem Vollblut innerhalb weniger Minuten. Robuste Eigenschaften, das heißt, langzeitstabile Materialeigenschaften sowie Verzicht auf integrierte Aktorelemente wie Pumpen und Ventile. 25

32 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Es wird ein mikrotechnisches Trennverfahren gesucht, das auf einer einfach aufgebauten und fertigbaren Mikrostruktur basiert. Es sollte geringe Totvolumina aufweisen und Blutplasmamengen von einigen Mikrolitern pro Minute liefern können. Um ein Verstopfen zu verhindern, sollten die kleinsten Abmessungen der Mikrostrukturen um ungefähr eine Größenordnung über dem Durchmesser der Blutzellen liegen. Die Zentrifugalkraft besitzt das Potential für die Anwendung als Trennverfahren in der Mikrotechnik. Kleine Radien führen zu großen Kräften. Ein Zentrifugalkraftfeld kann beispielsweise dadurch erzeugt werden, dass man ein Fluid durch einen gekrümmten Kanal strömen lässt. Hung et al. [HHB79, HHB80] untersuchten den Blutfluss in gekrümmten und geraden Kapillaren in unterschiedlichen Konfigurationen, um den Einfluss von Zentrifugalkraft und Schwerkraft zu vergleichen. Der Hintergrund ihrer Arbeiten war allerdings nicht die Nutzung dieser Effekte zur Auftrennung von Blut. Sie untersuchten systematisch den Einfluss von Parametern wie Hämatokritwert, Reynolds-Zahl und Krümmung auf das Geschwindigkeitsprofil der Erythrozyten in Kapillaren. Als Ergebnisse dieser Arbeiten zeigte sich, dass die Zone mit der maximalen Geschwindigkeit der Erythrozyten sich durch die Krümmung zur Außenwand der Kapillare hin verlagert. Diese Asymmetrie des Geschwindigkeitsprofils ist bei größerem Krümmungswinkel und höherem Hämatokritwert ausgeprägter. Die Breite der Plasmarandschicht nimmt unmittelbar nach der Krümmung zu. Der Fließwiderstand einer Kapillare erhöht sich um 10 % durch eine 90 -Krümmung. Ein weiteres Trennverfahren mit dem Potential zur mikrotechnischen Umsetzung stellt der Plasma Skimming Effekt dar. Dieser resultiert aus unterschiedlichen Flussraten in sich verzweigenden Kapillaren (siehe Abschnitt 2.2). Unterscheiden sich die Flussraten signifikant voneinander, folgen die Zellen dem Zweig mit der höheren Flussrate. Als signifikant wird ein Verhältnis der Flussraten in Zell- und Plasmakanal von 0,25 bis 0,5 erachtet [YF78]. Das neue Verfahren soll durch eine entsprechende Dimensionierung der Mikrokanäle und Flussgeschwindigkeiten eine größere Ausbeute an Blutplasma liefern als die in Abschnitt 2.3 beschrieben Verfahren, welche ebenfalls den Plasma Skimming Effekt nutzen. Der Plasma Skimming Effekt wurde zuerst von Krogh 1921 beschrieben [Kro21]. Weitere Arbeitsgruppen untersuchten diesen Effekt vor dem Hintergrund der physiologischen Auswirkungen der Phasentrennung. 26

33 3.2 Konzept des Mikrokrümmers Bugliarello et al. [BH64, BH65] untersuchten den Einfluss der radialen Partikelverteilung und derer Geschwindigkeitsverteilung auf die Phasentrennung von Suspensionen an Kapillarverzweigungen anhand eines makroskopischen Modells mit Kunststoffkugeln. Weitere wichtige Arbeiten zum Einfluss von unterschiedlichen Flussraten in den Kapillarzweigen stammen von Zweifach et al. [SZ68] an in vivo Modellen und von Fung et al. [Fun73, YF78] an in vitro Modellen. Carr et al. [FRCC85, CW91] und Ditchfield et al. [DO96] untersuchten schwerpunktmäßig den Einfluss des Kapillardurchmessers auf die Phasentrennung, insbesondere das Verhältnis von Partikeldurchmesser im Vergleich zum Kapillardurchmesser. Die oben genannten Arbeiten zeigen, dass die Partikelkonzentrationen in den Kapillarzweigen insbesondere vom Verhältnis der Flussraten abhängig ist. Im Zweig mit der geringeren Flussrate ist die Partikelkonzentration niedriger. Diese Verringerung der Partikelkonzentration ist für niedrigere Hämatokritwerte ausgeprägter. Die Phasentrennung wird durch ein größeres Verhältnis von Partikeldurchmesser zu Kapillardurchmesser verstärkt. Der Winkel zwischen den Kapillarzweigen und der Radius des Übergangs von der Hauptkapillare in den Kapillarzweig (20 µm im Vergleich zu 1 µm) üben keinen signifikanten Einfluss auf die Phasentrennung aus. Die Trennung ist im Wesentlichen davon unabhängig in welcher Richtung die Abflusskanäle vom Zuflusskanal abzweigen. Die Erythrozyten folgen zum großen Teil dem Kapillarzweig mit der größeren Strömungsgeschwindigkeit. 3.2 Konzept des Mikrokrümmers Aus den vorher genannten Anforderungen wurde das Konzept des Mikrokrümmers zur Blut/Plasma-Separation entwickelt. Ein Modell mit den wesentlichen Elementen eines Mikrokrümmers ist in Abbildung 3.1 dargestellt. Die Mikrokrümmerstruktur besteht aus drei Reservoiren, einem Zuführ-, einem Zell- und einem Plasmareservoir. Die drei Reservoire sind durch Mikrokanäle verbunden. Der Zuführkanal besitzt einen gekrümmten Kanalabschnitt. Nach der Krümmung verzweigt sich die Mikrokanalstruktur in Zell- und Plasmakanal, die in die jeweiligen Reservoire münden. Die Mikrokrümmerstruktur soll zwei Mechanismen zur Auftrennung von Vollblut in Blutzellen und Blutplasma nutzen. Erstens soll im gekrümmten Kanalabschnitt die Zentrifugalkraft wirken. Zweitens soll durch eine Kapillarverzweigung mit unterschiedlichen Volumenströmen der Plasma Skimming -Effekt ausgenutzt werden. Der Mikrokrümmer stellt das erste Verfahren dar, welches diese beiden Mechanismen kombiniert 27

34 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Zellreservoir Krümmerbogen Zellkanal Plasmareservoir Zuführkanal Plasmakanal Zuführreservoir Abbildung 3.1: Mikrokrümmerstruktur mit ihren wesentlichen Elementen. und zur Auftrennung von Blutplasma und -zellen benutzt. Die Idee ist, dass das Blut über das Zuführreservoir in den Mikrokrümmer gelangt. Im geraden Abschnitt des Zuführkanals kann sich die laminare Strömung vollständig mit einem zellangereicherten Strömungskern entwickeln. Beim Durchströmen der anschließenden Krümmung wirkt in diesem Bereich zusätzlich die Zentrifugalkraft auf das Fluid. Der zellangereicherte Kern wird zur Krümmeraußenseite abgelenkt, an der Innenseite sammelt sich das Blutplasma an. An der folgenden Verzweigung des Mikrokanals in Zell- und Plasmakanal mit unterschiedlichen hydraulischen Widerständen wird der Plasma Skimming Effekt ausgenutzt. Der Plasmakanal ist dadurch gekennzeichnet, dass er einen höheren hydraulischen Widerstand als der Zellkanal aufweist. Somit strömt das Fluid im Zellkanal mit einer höheren Geschwindigkeit als im Plasmakanal. Dies führt dazu, dass die Zellen bevorzugt dem Zellkanal folgen. Im Zellreservoir befindet sich anschließend eine Flüssigkeit mit einer höheren Konzentration an Blutzellen wie die des zugegebenen Blutes. Im Plasmareservoir dagegen erhält man eine Flüssigkeit, welche eine geringere Konzentration an Blutzellen als das ursprünglich zugegebene Blut besitzt. 28

35 3.3 Auftrennmechanismen des Mikrokrümmers 3.3 Auftrennmechanismen des Mikrokrümmers Axialmigration und Zentrifugalkraft Die Scherspannung im parabolischen Strömungsfeld einer laminaren Rohrströmung ist an den Kapillarwänden am größten und nimmt zum Zentrum der Kapillare hin stetig ab. Die Scherkräfte im Strömungsfeld sowie die Wandreibung führen zu einer Rotationsbewegung der Blutzellen (Abbildung 3.2). Kugelförmige, mit einer Winkelgeschwindigkeit ω rotierende Körper erfahren in einer Strömung mit der Strömungsgeschwindigkeit v eine Querkraft F M senkrecht zur Bewegungsrichtung und zur Rotationsachse. ρ ist die Dichte des Fluids, r der Radius des Körpers: F M = 2 ρ v ω r 3. (3.1) Dieser Effekt wird als Magnus-Effekt bezeichnet [GGV89]. ω Geschwindigkeit v F M Scherspannung τ F M ω Zelle Abbildung 3.2: Die Scherspannung in einer laminaren Rohrströmung führt zu einer Rotationsbewegung der Blutzellen. Diese erfahren aufgrund ihrer Rotation mit der Winkelgeschwindigkeit ω eine Querkraft F M senkrecht zur Bewegungsrichtung. Dies führt zur Axialmigration der Blutzellen. Diese Kraft führt zu einer Entmischung von Blutzellen und Blutplasma. Die Zellen führen eine Axialmigration in eine Gleichgewichtsposition im Zentrum der Kapillare durch, während sich an der Wand eine zellverarmte Plasmarandschicht ausbildet. Strömt eine Flüssigkeit durch ein gekrümmtes Rohr, wird das Strömungsprofil durch die Einwirkung der Zentrifugalkraft verändert. In den außen fließenden Strömungs- 29

36 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung schichten des Rohres wird durch die Zentrifugalkraft der hydrostatische Druck stärker erhöht als in den innen fließenden. Nach dem Bernoullischen Prinzip bleibt die Energiedichte jeder Stromlinie erhalten. Beim parabolischen Strömungsprofil einer laminaren Strömung führt dies dazu, dass die schneller fließenden zentralen Schichten der Strömung durch die Zentrifugalkraft zur Bogenaußenseite, die langsameren Randschichten zur Innenseite hin abgedrängt werden. Dieser Vorgang stellt eine Überlagerung der Hauptströmung mit einer senkrecht dazu gerichteten Sekundärströmung dar. In der Sekundärströmung fließen die Randschichten zur Innenseite, die Schichten im Kern zur Außenseite der Krümmung. Durch die Richtung der Sekundärströmung wird der Ort der größten Geschwindigkeit zur Außenseite der Krümmung verlagert. Aufgrund der im Vergleich zum parabolischen Profil höheren Schergrade an der Außenseite der Krümmung ist bei stationärer laminarer Strömung der Strömungswiderstand in gekrümmten Rohren größer als in geraden. Zentrifugalkraft Verbreiterung der Plasmarandschicht Strömungskern Geschwindigkeitsvektoren Abbildung 3.3: Die Wirkung der Zentrifugalkraft im Krümmerbereich auf den Strömungskern mit dem hohen Zellanteil führt zu einer Verbreiterung der Plasmarandschicht auf der Krümmerinnenseite. In Abbildung 3.3 ist der Verlauf einer partikelbehafteten Strömung im Mikrokrümmer schematisch dargestellt. Beim Mikrokrümmer bildet sich durch die Axialmigration ein zellangereicherter Kern in der Strömung. Im Bereich der Krümmung wird die 30

37 3.3 Auftrennmechanismen des Mikrokrümmers Kernströmung durch die Zentrifugalkraft zur Krümmeraußenseite hin abgelenkt. Auf der Krümmerinnenseite strömt das Blutplasma zusammen und führt dort zu einer Verbreiterung der zellarmen Randschicht. Plasma Skimming Effekt Im Folgenden wird eine qualitative Erklärung für den Mechanismus des Plasma Skimming gegeben. Die Einflussgrößen sind in Abbildung 3.4 dargestellt. Mit Zuführkanal wird der zu einer Verzweigung hinführende Abschnitt einer Kapillare, mit Zellkanal der von der Verzweigung wegführende Abschnitt mit der höheren Flussrate Q CC und mit Plasmakanal der wegführende Abschnitt mit der niedrigeren Flussrate Q P C bezeichnet. Q FC F M Q CC ω Q CC Q PC Q PC Abbildung 3.4: Mechanismus des Plasma Skimming : Die unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten an einer Kapillarverzweigung (Q F C : Flussrate im Zuführkanal, Q CC : Flussrate im Zellkanal, Q P C : Flussrate im Plasmakanal, Flussrichtung von links nach rechts) verursachen eine Rotation der Blutzelle mit der Winkelgeschwindigkeit ω. Es entsteht eine Querkraft F M, durch welche die Zelle einen Impuls in Richtung des Kapillarzweigs mit der höheren Flussrate erhält (Magnus-Effekt). Erreicht nun eine Zelle die Kapillarverzweigung, folgt sie dem Zweig mit der höheren Flussrate (Zellkanal) aufgrund der wirkenden Kräfte. Die höhere Strömungsgeschwindigkeit an der Oberseite der Zelle verursacht Scherkräfte, welche zu einer Dreh- und Rollbewegung der Zelle führen. Es entsteht eine Querkraft auf die Zelle, welche senkrecht zur Bewegungsrichtung und zur Rotationsachse wirkt (Magnus-Effekt, Gleichung 31

38 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung A Schnitt AB Q FC Plasmarandschicht teilende Strömungsfläche Q CC Q CC Q PC Q PC B Abbildung 3.5: Radiale Verteilung der Zellen in der laminaren Rohrströmung und Konzept der teilenden Strömungsfläche. 3.1). Die Zelle erhält einen Impuls in Richtung des Kapillarzweigs mit der höheren Flussrate und folgt diesem Zweig. Bei größeren Kapillardurchmessern wird das Plasma Skimming zunehmend auch durch die radiale Verteilung der Zellen beeinflusst. Der Anteil der Zellen, welcher in die unterschiedlichen Kapillarzweige fließt, wird durch die Lage der teilenden Strömungsfläche bestimmt. Die teilende Strömungsfläche definiert die Grenzfläche zwischen den Strömungsanteilen, welche nach der Kapillarverzweigung in unterschiedliche Zweige fließen (Abbildung 3.5). Ziel ist es, die Volumenströme in den Kapillarzweigen so einzustellen und eine entsprechend breite Plasmarandschicht zu erzeugen, dass möglichst wenige Blutzellen in den Kapillarzweig mit der niedrigeren Flussrate (Plasmakanal) gelangen. Beim Mikrokrümmer werden die unterschiedliche Volumenströme durch eine entsprechende Dimensionierung des Zell- und des Plasmakanals reguliert. Gemäß dem Gesetz von Hagen-Poiseuille ist die Flussrate Q in einem Kanal proportional zur vierten Potenz des Kanaldurchmessers d und invers proportional zur Kanallänge l, p ist die Druckdifferenz zwischen Einlass und Auslass, k eine Proportionalitätskonstante [Maz92]: Q = k p d4 l. (3.2) 32

39 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Die Zentrifugalkraft führt zu einer Verbreiterung der Plasmarandschicht auf der Krümmerinnenseite. Damit wird dort die Effizienz des Plasma Skimming erhöht. 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Prinzipiell lassen sich die Eigenschaften mikrofluidischer Strukturen unter Verwendung von Computational Fluid Dynamics(CFD)-Werkzeugen simulieren. Blut ist eine komplexe Suspension von polydispersen, flexiblen, chemisch und elektrostatisch aktiven Zellen, welche in einem Elektrolyten bestehend aus Wasser, Proteinen und anderen organischen Substanzen suspendiert sind. Die bezüglich des Volumens dominierenden Anteile des Blutes sind das Blutplasma und die Erythrozyten. Für die rheologische Modellierung von Blut genügt es meist, sich auf diese beiden Komponenten zu beschränken. Blut kann als homogene Flüssigkeit betrachtet werden, falls der Durchmesser der blutführenden Gefäße ungefähr zwei Größenordnungen mehr als die Zellgröße beträgt. Blut verhält sich wie eine nichtlinear viskoelastische Flüssigkeit. Es ist thixotrop, das heißt, es ändert seine Viskoelastizität in Abhängigkeit der einwirkenden Scherspannung. Die Modelle für das viskose Verhalten von Blut werden meist anhand experimentell bestimmter Daten abgeleitet. Für die Modellierung von Blut sind prinzipiell mehrere Ansätze denkbar. Zum einen kann man Blut als ein Zweiphasengemisch von Flüssigkeiten (Blutplasma und mit Flüssigkeit gefüllte, deformierbare Erythrozyten) darstellen. Zum anderen ist die Betrachtung von Blut als eine Suspension mit einer flüssigen Phase (Blutplasma) und einer festen Phase (Erythrozyten) möglich. Neuere Modelle beschreiben die Bestandteile des Bluts durch diskrete Partikel unterschiedlicher Größe, wobei die Eigenschaften von Blut aus Partikel-Partikel-Wechselwirkungen abgeleitet werden [DBY02]. In kommerziellen Software-Paketen für die CFD-Simulation wie FIDAP von Fluent oder ACE+ von CFDRC werden in den Modellen für partikelbehaftete Strömungen die Partikel nur als punktförmige Massen ohne räumliche Ausdehnung betrachtet [Flu98, ESI05]. Aufgrund dieser eingeschränkten Modellverfügbarkeit stellt sich die exakte mikroskopische Simulation von Blut als Suspension als schwierig heraus. Zwar lassen sich fluidische Parameter wie die Flussraten in den unterschiedlichen Kanälen sehr gut abbilden, Probleme treten jedoch bei der Simulation der partikelbehafteten Strömung mit einem Partikelanteil von 10 bis 50 % auf. 33

40 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Tabelle 3.1: Abmessungen einer Modell-Mikrokrümmerstruktur. Kenngröße Abmessung Kanallänge l Zuführ-, Zell-, Plasmakanal 1 mm Kanalbreite w Zuführ-, Zellkanal 50 µm Kanalbreite w Plasmakanal 25 µm Kanaltiefe h Zuführ-, Zell-, Plasmakanal 100 µm Bogenwinkel α des Krümmers 90 Krümmerradius r 500 µm Winkel zwischen Plasma- und Zellkanal β 45 Effekte wie das Plasma Skimming oder die Axialmigration, welche auf den Eigenschaften und der Form der Zellen sowie der Wechselwirkung der Zellen mit dem umgebenden Blutplasma beruhen, sind nicht durch die Simulation abbildbar. Nur der Einfluss der Zentrifugalkraft auf die Strömungsbahnen der Partikel lässt sich einfach abbilden. Ein sinnvoller Einsatz der Simulation hätte einer deutlichen Erweiterung der vorhandenen CFD-Software bedurft und damit den Rahmen dieser Arbeit sowie des Projekts µtbc überschritten. Alternativ zur Simulation werden in diesem Abschnitt zur Dimensionierung einer Mikrokrümmerstruktur physikalische Eigenschaften, wie Fluidgeschwindigkeit, Zentrifugalkraft, Kennzahlen der Strömung, Sedimentationsgeschwindigkeit im Krümmer, sowie deren Auswirkungen auf die Bluttraumatisierung und den Auftrenngrad abgeschätzt. Die Zentrifugalkraft und der Plasma Skimming -Effekt und damit der davon abhängende Auftrenngrad lassen sich durch geometrische Variationen der Mikrokrümmerstruktur beeinflussen. Die Zentrifugalkraft skaliert linear mit Größen wie dem Bogenwinkel des Krümmers oder dem Krümmerradius bei gleichen Winkelgeschwindigkeiten. Der Plasma Skimming -Effekt hängt vom Verhältnis der Volumenströme in Plasma- und Zellkanal ab. Die Kenngrößen der Mikrokrümmerstruktur sind in Abbildung 3.6 und Tabelle 3.1 dargestellt. Die Dimensionierung der Mikrokrümmerstruktur in Tabelle 3.1 orientiert sich dabei im Wesentlichen an der Möglichkeit der Fertigung mit den im folgenden Kapitel beschriebenen Prototypenfertigungsverfahren. 34

41 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers α r β l CC w CC l PC l FC w PC h w FC Abbildung 3.6: Kenngrößen einer Mikrokrümmerstruktur. Fluidgeschwindigkeit Der Mikrokrümmer soll konzeptionell ohne integrierte Aktoren wie Pumpen oder Ventile funktionsfähig sein. Um das Blut durch den Mikrokrümmer mit einer für die Trennung ausreichenden Geschwindigkeit strömen zu lassen, muss ein externes Druckpotential aufgebaut werden. Möglichkeiten hierfür sind die Kapillarkraft oder das Anlegen eines äußeren statischen Drucks. Dies kann beispielsweise durch eine Kolbenspritze geschehen. Als Abschätzung für ein einfach aufzubringendes Druckpotential für die Fortbewegung der Flüssigkeit im Mikrokrümmer dient der Druck, welcher durch Drücken mit einer menschlichen Fingerspitze auf eine ebene Fläche erzeugt werden kann. Leichtes Drücken mit einem Finger erzeugt eine Kraft F von ungefähr 10 N. Nimmt man als Fläche A, auf die der Druck aufgebracht wird, circa 1 cm 2 an, erhält man einen Anfangsdruck p in : p in = F A = Pa. (3.3) Den durch die Kapillarkraft in einem Kanal entstehenden Druckgradienten p c erhält 35

42 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung man aus der Oberflächenspannung der Phasengrenzfläche flüssig-gasförmig σ gl, dem Kontaktwinkel der Flüssigkeit mit der Oberfläche des Kanals Θ sowie die Breite w und Höhe h des Kanals [KLKL02]: p c = 2 σ gl cos(θ) ( w + h w h ). (3.4) Die Oberflächenspannung σ gl von standardisiertem Blutplasma gegen Luft sowie der Kontaktwinkel von Blutplasma gegen eine mit einer dünnen Goldschicht hydrophilisieten TOPAS-Oberfläche wurden mit einem SCA 15 der Firma Dataphysics nach der Methode des hängenden Tropfens und des auf einer Oberfläche sitzenden Tropfens bestimmt [Dat05]. Aus den Messungen erhält man für die Oberflächenspannung σ gl = 65,5 ± 0, N/m (Literaturwert: σ = 56, N/m [Len85]) und für den Kontaktwinkel Θ = 50 ± 4. Bei einem Kanal mit einem Querschnitt von 50 µm 100 µm ergibt sich durch Einsetzen dieser Werte in Gleichung 3.4 als Abschätzung für den Kapillardruck p c = 2, Pa. Der Kapillardruck p c ist circa zwei Größenordnungen niedriger als der durch leichtes Drücken mit Fingerkraft erzeugte Druck p in. Das Druckpotential wird bei der Mikrokrümmerstruktur zwischen dem Zuführreservoir und Zell-, beziehungsweise Plasmareservoir, welche beide auf Atmosphärendruckpotential liegen, angelegt. Für die mittlere Geschwindigkeit v eines Fluids mit Viskosität µ in einem kreisförmigen Rohr mit Durchmesser d und Länge l gilt bei laminarer Strömung [Nie00]: v = p d2 32 µ l. (3.5) Bei Strömungen in Rohren mit nicht kreisförmigem Querschnitt werden die unterschiedlichen Querschnittsformen durch den hydraulischen Durchmesser d h näherungsweise berechnet. Dieser ergibt sich aus der Querschnittsfläche A und dem benetzten Umfang U des Rohres [ZB00]: d h = 4 A U. (3.6) Für einen rechteckigen Kanalquerschnitt mit Kanalbreite w und -höhe h gilt: d h = 2 h (1 + h/w). (3.7) 36

43 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Aus Gleichung 3.7 erhält man durch Einsetzen der Werte aus Tabelle 3.1 für den Modell-Krümmer einen hydraulischen Durchmesser von d h = 67 µm. Durch Einsetzen von d h sowie der Länge l, über die der Druck p in abfällt, in Gleichung 3.5 erhält man für den Betrag der mittleren Geschwindigkeit im Mikrokrümmer: v = p in d 2 h 32 µ l g = Pa ( m) Pa s 2, = 0,99 m/s. (3.8) m Die Gesamtlänge des Mikrokrümmers l g = 2,825 mm berechnet sich aus der Addition der Längen des Zuführ- und des Zellkanals (1 mm + 1 mm) sowie der mittleren Länge des Krümmerbogens (0,5 π 0,525 mm = 0,825 mm). Als Viskosität des Fluids wird µ = Pa s angenommen (siehe Abschnitt 2.1). Zentrifugalkraft Der Betrag der maximalen Geschwindigkeit v max bei einer laminaren Rohrströmung ist doppelt so groß wie die mittlere Geschwindigkeit v: v max = 2 v = p in d 2 h 16 µ l g = Pa ( m) Pa s 2, = 1,99 m/s. (3.9) m Für die Zentrifugalkraft F z auf ein Teilchen mit der Masse m gilt: F z = a z m. (3.10) Der Betrag der Zentrifugalbeschleunigung a z ergibt sich aus der Winkelgeschwindigkeit ω, beziehungsweise der Bahngeschwindigkeit v des Teilchens, sowie dem Abstand vom Rotationszentrum r: a z = ω 2 r = v2 r. (3.11) Für ein Teilchen ergibt sich im Strömungskern des Mikrokrümmers eine maximale Zentrifugalbeschleunigung von: a z = v2 max r = (1,99m/s) m = 7515 m/s2. (3.12) 37

44 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Dies entspricht in Einheiten der Erdbeschleunigung g ausgedrückt 766 g. Zur Steigerung der Sedimentation erzeugen konventionelle Zentrifugen Beschleunigungen zwischen 500 und g [AM03]. Reynolds- und Dean-Zahl Diese Abschätzung dient zur Validierung der Annahme, dass sich die Mikrokrümmerstruktur im Bereich laminarer Flussverhältnisse befindet. Bei niedrigen mittleren Strömungsgeschwindigkeiten v strömt das Fluid in einem Rohr laminar, das heißt, die Fluidschichten vermischen sich nicht. Wird bei steigender Strömungsgeschwindigkeit ein Grenzwert v crit überschritten, wird die Strömung turbulent und die Fluidschichten verwirbeln. Der Übergang zwischen laminarer und turbulenter Strömung hängt nicht nur von der Strömungsgeschwindigkeit v sondern auch von der so genannten charakteristischen Länge L sowie der dynamischen Viskosität µ und Dichte ρ des Fluids ab. Die Kombination dieser Größen ergibt die dimensionslose Reynolds-Zahl Re. Anschaulich beschreibt sie das Verhältnis zwischen Trägheitseinfluss (kinetische Energie ρ v 2 ) und Viskositätseinfluss (Reibungsarbeit µ v/l) [Nie00]: Re = ρ v L µ. (3.13) Für die Berechnung der Reynolds-Zahl verwendet man als charakteristische Länge L typischerweise den hydraulischen Durchmesser eines Mikrokanals. In der Mikrofluidik kann der Übergang von laminarer zu turbulenter Rohrströmung schon bei wesentlich kleineren Reynolds-Zahlen als im makroskopischen Bereich stattfinden. Der Übergangsbereich ist schmaler. Wesentliche Einflussgrößen sind der hydraulische Durchmesser sowie das Verhältnis von Kanalhöhe zu Kanalbreite [Oer01, XNP + 01, PPW94]. Um in der Mikrofluidik Aussagen zum Übergang von laminarer zu turbulenter Strömung treffen zu können, führt man das Konzept einer Übergangs- Reynolds-Zahl Re crit ein [GBJ93]. Aus dem Vergleich der Reynolds-Zahl mit der Übergangs-Reynolds-Zahl ergeben sich zwei Arten von Fließverhalten im Mikrokanal. Für Re Re crit dominieren viskositätsbedingte Reibungskräfte, der Fluss ist laminar. Für Re Re crit dominieren Trägheitskräfte, der Fluss ist turbulent. Die Berechnung von Re crit hängt von den Kanaldimensionen (Kanallänge l und hydraulischer Durchmesser d h ) ab. 38

45 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Tabelle 3.2: Berechnung von Re crit für unterschiedliche l/d h - Verhältnisse [GBJ93]. Bezeichnung Definition Re crit spaltartige Öffnung l/d h < 0,5 15 kurzer Kanal 2 < l/d h < l/d h langer Kanal l/d h > Der Mikrokrümmer besitzt eine Kanallänge l g = 2,825 mm und einen hydraulischen Durchmesser d h = 67 µm. Der Quotient aus beiden Werten ist l g /d h = 42. Als Übergangs-Reynolds-Zahl erhält man laut Tabelle 3.2 Re crit = 30 l g /d h = Nach Gleichung 3.13 erhält man für die Reynolds-Zahl beim Mikrokrümmer durch Einsetzen der Werte aus 2.1 und Gleichung 3.8: Re = ρ d h v µ = 1057 kg/m m 0,99 m/s kg/m s = 14. (3.14) Es gilt Re Re crit. Im Falle des Mikrokrümmers dominieren Energieverluste aufgrund der Viskosität. Die Strömung darf als laminar betrachtet werden. Ein weiterer Parameter, der sich aus der Reynolds-Zahl ergibt, ist die Einlaufstrecke L e, nach welcher sich die laminare Strömung vollständig entwickelt hat [Maz92]. Diese beträgt für den Mikrokrümmer: L e = 0,06 Re d h = 0, µm = 56 µm. (3.15) In mikrofluidischen, passiven Mischern mit gekrümmten Kanalanordnungen, so genannten Dean-Mischern, wird der Mischvorgang durch die induzierte Sekundärströmung verstärkt [YTY + 04, JDH + 04]. Dies würde der vorher beschriebenen Auftrennung im Zentrifugalkraftfeld entgegenwirken. Der Fluss in gekrümmten Kanälen wird neben der Reynolds-Zahl durch die ebenfalls dimensionslose Dean-Zahl K charakterisiert. Diese wird mit der Reynolds-Zahl Re, dem hydraulischen Durchmesser des Kanals d h sowie dem Radius der Krümmung r wie folgt definiert: K = Re dh r. (3.16) Einsetzen des Wertes der Reynolds-Zahl im Mikrokrümmer (Gleichung 3.14) sowie 39

46 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung des hydraulischen Durchmessers und des Krümmerradius in Gleichung 3.16 ergibt für die Dean-Zahl im Mikrokrümmer den folgenden Wert: K = µm 525 µm = 5. (3.17) Dieser Wert der Dean-Zahl im Mikrokrümmer ist deutlich kleiner als der von Jiang et al. [JDH + 04] bestimmte Wert von K > 140, bei welchem eine erhöhte Mischeffizienz durch einen chaotischen Strömungsverlauf in gekrümmten Mikrokanälen einsetzt. Ein Ergebnis der Arbeit von Yamaguchi et al. [YTY + 04] ist, dass schon Werte von K < 20 zur Bildung einer Sekundärströmung in der Krümmung führen. Weitere experimentelle Untersuchungen zeigen, dass im Bereich kleiner Reynolds-Zahlen (Re = 6) der Mischeffekt gering ist. Erst ab Re > 70 übt die Sekundärströmung einen signifikanten Einfluss auf das Mischen aus [LSS + 00, SSA04]. Für den Mikrokrümmer bedeutet dies, dass durch die Sekundärströmung das Plasma auf der Krümmerinnenseite angereichert wird. Eine unerwünschte Durchmischung der Blutzellen und des Blutplasmas durch die Sekundärströmung im Krümmerbogen findet aufgrund der zu kleinen Reynolds- und Dean-Zahl nicht statt. Bluttraumatisierung Bei Kontakt mit einer fremden Oberfläche, die nicht aus Endothel, der inneren Schicht eines Blutgefäßes, besteht, zeigt Blut die gleiche Reaktion wie bei einer Gefäßverletzung. Der Thrombenbildungsmechanismus setzt ein, die Blutgerinnung wird aktiviert. Eine weitere Form von Bluttraumata stellt die Hämolyse dar. Als Hämolyse wird eine Zerstörung der Erythrozyten bezeichnet. Dabei wird mit dem Zytoplasma auch Hämoglobin freigesetzt. Es wird zwischen einer werkstoffinduzierten und strömungsbedingten Hämolyse unterschieden. Als Untersuchungsparameter für den Grat der Hämolyse dient die Hämoglobinkonzentration im Blutplasma [Gla01]. Einflussfaktoren für die strömungsbedingte Hämolyse sind die Expositionszeiten (Belastungs- und Kontaktzeit des Blutes mit fremden Oberflächen) sowie die Belastungshöhe in Form der Schergeschwindigkeit und Scherspannung. Hohe Scherbeanspruchungen und längere Belastungszeiten verstärken die Hämolyse. Bei einer Belastungszeit t b = 400 ms und ab einer Schergeschwindigkeit γ = s 1 nimmt die Hämolyse deutlich zu [KKM + 01, KPM + 01]. 40

47 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Die Schergeschwindigkeit γ ist ein Maß für die Geschwindigkeitsänderung über eine Strecke x: Die Scherspannung τ ist definiert als: γ = v x. (3.18) τ = µ γ. (3.19) Die Belastungszeit t b einer Blutzelle, die sich mit einer mittleren Geschwindigkeit v = 0,99 m/s durch den Mikrokrümmer mit der Kanallänge l g bewegt, beträgt: t b = l g v = 2,825 mm 0,99 m/s = 3 ms, (3.20) die maximale Schergeschwindigkeit γ max zwischen Strömungskern und Wand: γ max = v x = 1,99 m/s m = s 1. (3.21) Sowohl die Belastungszeit als auch die maximale Schwergeschwindigkeit im Mikrokrümmer liegen unterhalb der kritischen Werte, welche zu einer strömungsbedingten Hämolyse führen. Sedimentationsgeschwindigkeit Die Sedimentationsgeschwindigkeit v s beim Sedimentationsprozess in einem Gravitationsfeld mit der Beschleunigung g ist für verdünnte Fluide und bei kleinen Reynoldszahlen nach dem Stokeschen Gesetz eine Funktion von der Partikelgröße d, dem Dichteunterschied zwischen Partikel (spezifische Dichte ρ) und umgebenden Fluid (spezifische Dichte ρ 0 ) sowie der Viskosität des Fluids µ 0 : v s = d2 (ρ ρ 0 ) g 18 µ 0. (3.22) Beim Zentrifugieren ist der Einfluss der Gravitationsbeschleunigung g vernachlässigbar und wird durch die Zentrifugalbeschleunigung a z ersetzt. 41

48 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Gleichung 3.4 gilt jedoch nur für Zellkonzentrationen c p < 10%. c p wird als Volumenanteil der Zellen relativ zum gesamten Plasmavolumen definiert und entspricht somit dem Hämatokritwert HKT : c p = HKT. (3.23) Bei höheren Partikelkonzentrationen kommt es zu einer Behinderung der Sedimentation durch eine Erhöhung der Viskosität des Fluids. Für Hämatokritwerte HKT > 10 % muss zu Gleichung 3.4 noch ein vom Hämatokritwert abhängiger Korrekturfaktor f HKT hinzugefügt werden. Bei wachsendem Hämatokritwert sinkt die Sedimentationsgeschwindigkeit [WH88]: f HKT = (1 HKT ) 4. (3.24) Für den Betrag der Sedimentationsgeschwindigkeit v s der Zellen im Blut ergibt sich somit: v s = d2 (ρ ρ 0 ) a z 18 µ 0 f HKT. (3.25) Die Abhängigkeit der Sedimentationsgeschwindigkeit vom Hämatokritwert für die zuvor berechnete maximale und mittlere Zentrifugalbeschleunigung a z im Mikrokrümmer ist in Abbildung 3.7 dargestellt. 42

49 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers 1.6 Sedimentationsgeschwindigkeit v s (mm/s) a z = 7515 m/s 2 a z = 1867 m/s Hämatokritwert (%) Abbildung 3.7: Sedimentationsgeschwindigkeit in Abhängigkeit vom Hämatokritwert bei der maximalen Zentrifugalbeschleunigung von 7515 m/s 2 und einer mittleren Beschleunigung von 1867 m/s 2. Statische Sedimentationsgeschwindigkeiten bei für Zentrifugen typischen Einsatzgebieten liegen zwischen 10 6 und 10 1 mm/s [AM03]. Eine kugelförmige Zelle mit einem Durchmesser d = 10 µm und einer Geschwindigkeit von 0,99 m/s im Strömungskern benötigt circa 1 ms zum Durchqueren des Krümmerbogens. Dabei wandert sie unter dem Einfluss der Zentrifugalkraft bei einem Hämatokritwert HKT = 50 % circa 0,1 µm nach außen. Die Zentrifugalkraft würde alleine nicht ausreichen, um eine Auftrennung von Blutzellen und Blutplasma im Mikrokrümmer zu erreichen. Durch ein Kippen der Zentrifugenröhrchen erhöht sich die Kontaktfläche zwischen den Phasen beim Zentrifugieren. Die Phasentrennung wird dadurch beschleunigt. Dieses ist der sogenannte Boycott-Effekt [Boy20]. Um eine größer Kontaktfläche im Mikrokrümmer zu erzeugen, wird ein Aspektverhältnis 1 1 gewählt. Für die Zentrifugalkraft F z ergibt sich bei einer mittleren Zentrifugalbeschleunigung von a z = 2000 m/s 2 für ein kugelförmiges Teilchen mit Durchmesser d = 10 µm und Dichte ρ = 1,098 g/cm 3 : 1 Aspektverhältnis: Verhältnis von Strukturhöhe zu Strukturbreite 43

50 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung F z = m a z = ρ 1 3 π d3 a z = 1098 kg/m π ( m ) m/s 2 2, N. (3.26) Durch den Magnus-Effekt ergibt sich ebenfalls eine Sedimentation der Zellen zum Zentrum des Mikrokanals hin (Axialmigration). Die Querkraft F M durch den Magnus- Effekt, welche auf ein rotierendes, kugelförmiges Teilchen mit Durchmesser d wirkt, kann mit der Bernoullischen Gleichung berechnet werden. A bezeichnet die angeströmte Fläche, welche im Falle einer Kugel näherungsweise der Hälfte der Kugeloberfläche entspricht. p ist die Druckdifferenz, welche durch unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten auf der Oberseite v o und Unterseite v u der Kugel bei einem parabolischen Strömungsprofil entsteht. ρ 0 ist die Dichte des Fluids (Blutplasma: ρ 0 = 1,035 g/cm 3 ). F M = A p = 1 2 π d2 1 ( 2 ρ 0 (v o ) 2 (v u ) 2). (3.27) Da der Druck nicht auf die gesamte Querschnittsfläche der Kugel gleichmäßig wirkt, ist diese Abschätzung der resultierenden Kraft etwas zu hoch. Zudem stellt natürlich auch die Annahme einer Kugelform für die Blutzellen eine Näherung dar. Die Geschwindigkeitsänderung dv über den Partikeldurchmesser d eines kugelförmigen Teilchens mit einem Durchmesser von 10 µm beträgt: dv = v o v u = v x d = s m 0,08 m/s. (3.28) Für diese Abschätzung wird näherungsweise angenommen, dass der Geschwindigkeitsgradient v x von der Kanalmitte des Mikrokanals zum Kanalrand konstant sei. Der Gradient entspricht der maximalen Schergeschwindigkeit γ max zwischen Strömungskern und Wand (Gleichung 3.21). Durch Einsetzen der Werte in Gleichung 3.27 und mit v o = v + dv/2, v u = v dv/2 ergibt sich: F M = A p = 1 4 π d2 ρ 0 ((v o ) 2 (v u ) 2) = 1, N. (3.29) Die Kraft aufgrund des Magnus-Effekts liegt ungefähr eine Größenordnung höher als der Einfluss der Zentrifugalkraft. Das auf dem Magnus-Effekt beruhende Plasma- Skimming stellt also den dominierenden Separationsmechanismus dar. 44

51 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers Aus der Kraft lässt sich Beschleunigung auf die Blutzellen mit Dichte ρ und Volumen V durch den Magnus-Effekt a M berechnen: a M = F M ρ V = 1, N 1098 kg/m 3 π/3 ( ) 3 m m/s2. (3.30) Mit Gleichung 3.25 ergibt sich bei einem Hämatokritwert HKT = 50 % eine Sedimentationsgeschwindigkeit aufgrund des Magnus-Effekts von: v s = d2 (ρ ρ 0 ) a M 18 µ 0 f HKT = m/s. (3.31) Der Magnus-Effekt wirkt auf der Strecke des Zuführkanals (1 mm) und des Krümmerbogens ( 0,8 mm). Zum Durchlaufen dieser Strecke benötigt eine kugelförmige Zelle mit einem Durchmesser d = 10 µm und einer Geschwindigkeit von 0,99 m/s im Strömungskern circa 2 ms. Sie wandert dabei ungefähr 2 µm in Richtung des Kanalzentrums aufgrund des Magnus-Effekts. Auftrenngrad In der Literatur wurden die dem Plasma Skimming zugrunde liegenden physikalischen Effekte bisher überwiegend auf der Basis von experimentellen Untersuchungen des kapillaren Blutflusses und darauf basierenden theoretischen Überlegungen qualitativ beschrieben [CL00]. Die Phasenseparation lässt sich aufgrund der zahlreichen Einflussgrößen sowie der vielfach nichtlinearen Abhängigkeit des Blutflusses von diesen Einflussgrößen nur unzureichend theoretisch in einer geschlossenen Form erfassen. Die Größe der auf eine Zelle einwirkenden Kräfte, Zentrifugalkraft und Magnus-Effekt, können jedoch grob abgeschätzt und daraus die Dicke der Plasmarandschicht berechnet werden. Der Volumenfluss Q durch einen Mikrokanal ist proportional zu Kanalbreite w und -höhe h: Q w h. (3.32) Derjenige Teil des Volumens, welcher in den Plasmakanal fließt, wird durch die teilende Strömungsfläche begrenzt. Dieser Volumenfluss Q P C ist proportional zum Flussratenverhältnis von Plasma- zu Zellkanal, R Q. 45

52 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung R Q = ( dhp C d hcc ) 4 lcc l P C. (3.33) Setzt man die Werte für die Modellkrümmerstruktur ein (Tabelle 3.1), erhält man für das Flussratenverhältnis R Q : R Q = (0,6) 4 = 0,1296. (3.34) Die Volumenflussrate im Zuführkanal berechnet sich aus der Strömungsgeschwindigkeit v und dem Kanalquerschnitt: Q F C = v w F C h. (3.35) Aus Gründen der Volumenerhaltung gelten folgende Beziehungen, wobei Q P C Q CC die Volumenflüsse in Plasma- und Zellkanal bezeichnen: und Q F C = Q CC + Q P C, (3.36) Q P C = R Q Q F C = R Q v w h, (3.37) Q CC = (1 R Q ) Q F C = (1 R Q ) v w h. (3.38) Ein zentrale Rolle beim Konzept der Axialmigration mit teilenden Strömungsflächen zur Abschätzung des Plasma Skimming -Effekts besitzt die Plasmarandschichtdicke d P. Sie ist setzt sich aus einem Beitrag aufgrund des Magnus-Effekts sowie der Zentrifugalkraft zusammen. Dieser Beitrag entspricht der jeweiligen Sedimentationsstrecke. Für die Zentrifugalkraft sind dies d PZ 0,1 µm, für den Magnus-Effekts d PM 2 µm. Die Dicke der Plasmarandschicht d P am Ende des Krümmerbogens beträgt bei der Modell-Mikrokrümmerstruktur: d P = d PM + d Pz 2 µm + 0,1 µm 2,1 µm. (3.39) Bei niedrigeren Zellkonzentrationen steigt die Sinkgeschwindigkeit an. Die Wirkung des Magnus-Effekts und der Zentrifugalkraft wird größer, die Zellen unterliegen einer stärkeren Axialmigration und die Dicke der Plasmarandschicht nimmt zu. 46

53 3.4 Eigenschaften des Mikrokrümmers teilende Strömungsfläche F z h d P w. (1- R Q ) w w. R Q d P Abbildung 3.8: Kanalquerschnitt einer Mikrokrümmerstruktur im Bereich des Bogens mit den Blutzellen im Kern der Strömung und der zellfreien Plasmarandschicht. Der Auftrenngrad beziehungsweise die Trenneffizienz η wird durch die Zellkonzentrationen im Zuführ- (c F C ) und Plasmakanal (c P C ) definiert: η = c F C c P C c F C = 1 c P C c F C. (3.40) Die Konzentration der Zellen im Zuführkanal ist gemäß Abbildung 3.8 proportional zu: c F C (w 2 d P ) (h 2 d P ) w h, (3.41) die Zellkonzentration im Plasmakanal zu: c P C (w R Q d P ) (h 2 d P ) w R Q h. (3.42) Dabei wurde folgende Beziehung Q P C = R Q Q F C R Q w h, (3.43) angewendet. 47

54 3 Neues Konzept für die Blutauftrennung Durch Einsetzen der Gleichungen 3.41 und 3.42 in Gleichung 3.40 erhält man für die Trenneffizienz mit den Randbedingungen w R Q d P, R Q > 0 und w 2 d P : η = 1 (w R Q d P ) R Q (w 2 d P ). (3.44) Abbildung 3.9 zeigt die Trenneffizienz in Abhängigkeit vom Flussratenverhältnis von Plasma- zu Zellkanal, R Q bei unterschiedlichen Plasmarandschichtdicken d P. Mit steigendem Flussratenverhältnis nimmt die Trenneffizienz stetig ab. Bei größeren Plasmarandschichtdicken verläuft diese Abnahme steiler. 1 d P = 20 µm 0.8 d P = 10 µm Trenneffizienz η d P = 2 µm d P = 5 µm Flussratenverhältnis R Q Abbildung 3.9: Trenneffizienz η in Abhängigkeit vom Flussratenverhältnis von Plasmazu Zellkanal R Q bei unterschiedlichen Plasmarandschichtdicken d P (2 µm, 5 µm, 10 µm und 20 µm). 48

55 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen 4.1 Anforderungen an das Fertigungsverfahren In der Entwicklungsphase wird das Layout von mikrofluidischen Strukturen für die Optimierung des Designs häufig geändert. Für neue Layoutvarianten werden neue Werkzeuge benötigt. Das Fertigungsverfahren muss flexibel sein und schnelle Designzyklen ermöglichen. Dies erlaubt eine effiziente Designvalidierung und damit niedrige Produktentwicklungskosten sowie kürzere Entwicklungszeiten. Zudem ist es aus Kostengründen wünschenswert, schon frühzeitig in der Entwicklung seriennahe Prototypen herstellen zu können. Zur Fertigung dieser Prototypen werden häufig sogenannte Rapid-Prototyping-Verfahren eingesetzt. Als Rapid-Prototyping- Verfahren bezeichnet man die subtraktive oder additive, schichtweise Herstellung direkt aus CAD Daten. Für eine weitgehend seriennahe Fertigung mit höheren qualitativen Anforderungen an die Prototypen werden über das sogenannte Rapid-Tooling Werkzeuge hergestellt, die eine Abformung der Bauteile in dem für die Serienfertigung vorgesehenen Werkstoff erlauben. Damit stehen zum Beispiel die spezifischen Materialeigenschaften eines Polymers schon in der Entwicklungsphase einer mikrofluidischen Struktur zur Verfügung. Schon während der Produktentwicklung können Eigenschaften wie Verzug, Festigkeit oder Langzeiteigenschaften geprüft werden [MMM99]. Im Projekt µtbc wird das Separations-/Detektionsmodul aus TOPAS 5013 (Ticona, Kelsterbach) gefertigt. TOPAS 5013 ist ein Cycloolefin-Copolymer (COC), welches aufgrund der folgenden Eigenschaften gerne für medizintechnische Anwendungen eingesetzt wird [Tic00]: chemische Resistenz gegen wässrige Medien und polare organische Lösungsmittel, Säuren und Laugen hervorragende Wasserdampfsperrwirkung und geringe Wasseraufnahme Biokompatibilität gemäß ISO

56 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen temperaturstabil bis 130 C sterilisierbar optische Eigenschaften (Transparenz im sichtbaren und nahen Infrarot-Wellenlängenbereich) geringe Eigenfluoreszenz In der Blut/Plasma-Trenneinheit des µtbc-systems sollen auf einem Chip direkt über Fluoreszenzmessungen markierte Antigene detektiert werden. Die Bodenflächen der mikrofluidischen Struktur müssen hierfür optisch transparent sein. Dies bedeutet, dass die mittlere Oberflächenrauheit R a < 25 nm sein sollte. Für die Herstellung von Mikrokrümmer-Prototypen in TOPAS 5013 sind zwei Fertigungsverfahren, für welche die Infrastruktur am IMTEK vorhanden ist, evaluiert worden: 1. Das Fräsen aus der Klasse der Rapid-Prototyping-Verfahren. 2. UV-LIGA aus der Klasse der indirekten Rapid-Tooling-Verfahren. Auf die Durchführung und die Ergebnisse wird in Abschnitt 4.2 genauer eingegangen. 4.2 Betrachtete Fertigungsverfahren Fräsen Ein oft genutztes Herstellungsverfahren für das Rapid-Prototyping in Polymeren ist das Fräsen. Mit diesem Verfahren ist es möglich, direkt mikrofluidische Strukturen in einem Polymer zu generieren. Um optische Oberflächen mit Fräsen zu erhalten, werden üblicherweise Diamantfräswerkzeuge eingesetzt [Wöl04]. Diese besitzen einen minimalen Durchmesser von 300 µm. In dieser Arbeit wird untersucht in wie weit sich Hartmetallfräswerkzeuge, welche mit Durchmessern bis zu 100 µm erhältlich sind, für die Herstellung von Mikrokrümmerstrukturen eignen. Am Lehrstuhl für Prozesstechnologie steht eine Ultrapräzisionsfräsmaschine (UPM) des Fraunhofer IPT zur Verfügung. Weitere Fräsversuche sind in Kooperation mit der Firma Kern Micro- und Feinwerktechnik, Murnau, durchgeführt worden. 50

57 4.2 Betrachtete Fertigungsverfahren Tabelle 4.1: Übersicht Fräsparameter UPM für die Herstellung von Mikrokrümmerstrukturen. Bearbeitungsschritt 1. Reservoire 2. Mikrokanalstruktur Fräser 1,5 mm Hartmetallfräser 100 µm Hartmetallfräser Drehgeschwindigkeit Spindel 4000 U/min U/min Vorschubgeschwindigkeit 30 mm/min 3 mm/min Zustelltiefe 100 µm 10 µm Als Halbzeuge werden 20 mm 20 mm große Plättchen aus TOPAS 5013 mit einer Dicke von 2 mm verwendet. Die Bearbeitung auf der UPM erfolgt in zwei Schritten. Zuerst werden die Reservoire gefräst, anschließend die Mikrokanalstruktur (Tabelle 4.1). Die Anforderungen an die Präzision bei der Fertigung der Reservoire sind geringer, ihr Anteil am zu zerspanenden Volumen größer. Durch eine Bearbeitung der Reservoire mit einem Fräser mit einem größeren Durchmesser kann die Bearbeitungszeit für eine Mikrokrümmerstruktur deutlich verringert werden. Ergebnisse von gefrästen Mikrokanälen sind in Abbildung 4.1 dargestellt. Auf dem Boden der Mikrokanalstruktur sind deutlich kreisförmige Spuren, hervorgerufen durch die Bewegung des Fräsers, zu erkennen. Bei der linken Struktur ist der nach rechts oben abzweigende Plasmakanal mit dem gleichen Schaftfräser (Durchmesser: 100 µm) hergestellt worden wie der Zuführ- und der Zellkanal, bei der rechten Struktur mit einem durch die Firma Kern Micro- und Feinwerktechnik selbst geschliffenen Stichel (Durchmesser: 50 µm, Spitzenwinkel 50 ). Die Tiefe der Mikrokanalstrukturen beträgt jeweils 100 µm. Bei den gefrästen Mikrokanalstrukturen ergeben sich einige Probleme. An den Kanalrändern bildete sich ein Grat. Dieser ist nicht vollständig entfernbar, so dass keine formschlüssige Verbindung mit dem Deckel und Dichtigkeit für die Messungen gewährleistet werden kann. An den spitzwinkligen Ecken zwischen Plasma- und Zellkanal wird häufig der Kunststoff zerstört. Die kleinsten, auf dem Markt kommerziell verfügbaren Schaftfräser von akzeptabler Qualität hatten zum Zeitpunkt der Durchführung der Versuche einen Durchmesser von 100 µm. Das bedeutete, dass die minimale Kanalbreite 100 µm beträgt. Mit einem Stichel sind zwar schmalere Kanalstrukturen durch die Firma Kern Micro- und Feinwerktechnik hergestellt worden, bedingt durch die Schneidenform des Stichels haben diese Kanäle jedoch einen V-förmigen Querschnitt. 51

58 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Abbildung 4.1: Gefräste Mikrokrümmerstrukturen, links auf der UPM mit einem Schaftfräser, rechts bei der Firma Kern Micro- und Feinwerktechnik mit einem Schaftfräser (Zuführ- und Zellkanal) und einem Stichel (Plasmakanal), Breite des Zuführkanals jeweils ca. 100 µm. UV-LIGA UV-LIGA wird als zweites Verfahren für die Herstellung von Prototypen untersucht. UV-Liga stellt bezüglich der fertigbaren Geometrien ein sehr flexibles Verfahren für die Herstellung von Mikrostrukturen dar. Die UV-LIGA verwendet Standardbelichtungssysteme aus der UV-Lithographie im Gegensatz zum klassischen LIGA Verfahren, welches Synchrotronstrahlung nutzt und durch die hohen Kosten des Verfahrens nur bedingt für eine kostengünstige Prototypenfertigung nutzbar ist. Als Primärform für die galvanische Abformung wird ein hochaufbauender SU-8 Photolack verwendet. SU-8 ist ein chemisch verstärkter, auf der Basis von epoxidiertem Novolak aufgebauter Negativlack. Abhängig von Viskosität und Beschichtungsparametern können Schichtdicken zwischen 5 und 500 µm eingestellt werden. Das Aspektverhältnis für Linienstrukturen beträgt 10:1, für isolierte Linien sogar bis zu 18:1 [MGR00]. Eine Übersicht über die Prozessschritte des UV-LIGA-Verfahrens ist in Abbildung 4.2 dargestellt. Die Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit dem UV-LIGA-Verfahren wird detailliert in Abschnitt 4.3 beschrieben. 52

59 4.3 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit UV-LIGA 1. Lithographie UV-Licht Maske SU-8 Metallsubstrat Entwickeln der belichteten Struktur SU-8 Primärform Metallsubstrat 2. Galvanoformung Ni-Abscheidung Metallsubstrat Entfernen des SU-8 Photolacks Ni-Struktur Metallsubstrat 3. Abormung (Heißprägen) F Abformwerkzeug Entformen Polymer-Chip strukturierter Polymer-Chip Abbildung 4.2: Prozessschritte für die Fertigung von Mikrokrümmerchips mittels UV-LIGA. 4.3 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit UV-LIGA Substrat Um einen stabilen Formeinsatz zu erhalten, wird eine mehrere Millimeter dicke Metallscheibe als Träger für eine Mikrostruktur benötigt. Beim herkömmlichen UV-LIGA- Verfahren wird ein Silzium-Wafer mit einer dünnen Metallschicht als Startschicht für die Galvanik verwendet. Durch galvanisches Aufwachsen der Mikrostruktur und Überwachsen der Photolackschicht werden Mikrostruktur und Träger erzeugt [MMP05]. Typische Abscheideraten bei der galvanischen Abscheidung liegen bei µm/h. Daraus folgt, dass dieser Prozessschritt für eine mehrere Millimeter dicke Trägerschicht bis zu einigen Tagen dauert und in der Regel den größten Anteil an der Prozesszeit besitzt. Um diesen Prozessschritt entscheidend zu verkürzen, werden in dieser Arbeit 2 mm dicke Metallscheiben in Form eines 4 -Silizium-Wafers als Substrat verwendet. Dieses Substratformat wird gewählt, um die vorhandene 4 -Prozesslinie für Silizium-Wafer im Reinraum des IMTEK nutzen zu können. 53

60 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Durch die Verwendung eines Metallsubstrats als Träger muss bei dem in dieser Arbeit entwickelten Prozess nur noch die eigentliche Mikrostruktur mit einer Höhe von 100 µm galvanisch abgeschieden werden. Die Prozesszeit verringert sich somit deutlich. Gleichzeitig ergeben sich dadurch aber auch hohe Anforderungen an die Galvanik bezüglich Oberflächenrauheit, Homogenität der Abscheidung sowie Haftfestigkeit auf dem Substrat. Für die Herstellung der Substrate werden zwei Verfahren verwendet. Zum einen werden von Messing-Stangenmaterial Scheiben mit einer Dicke von 2,5 mm mittels Drahterosion abgetrennt. Eine spiegelnde Oberfläche auf den Messingscheiben wird anschließend durch Drehbearbeitung auf der UPM hergestellt. Dieses Verfahren ist allerdings sehr zeitaufwendig und damit teuer. Als weiteres Verfahren werden aus 2 mm dickem, poliertem Messingblech mittels Wasserstrahlschneidens Scheiben in Form eines 100 mm-silizium Wafers geschnitten. Die mittlere Oberflächenrauheit R a beträgt weniger als 15 nm. Bei diesen Substraten ist ein manuelles Entgraten nach dem Schneiden notwendig. Die Kosten für diese Substrate sind deutlich geringer als für einen entsprechenden 4 -Silizium-Wafer. SU-8 Photolithographie Der SU-8 Photolack sowie weiteren Chemikalien für die Photolithographie werden von micro resist technology, Berlin, bezogen: Photolack: NANO TMSU , MicroChem Corp Entwickler: SU-8 Developer, MicroChem Corp. Entfernen des Photolacks: Microchem Remover PG, MicroChem Corp. Haftvermittler: Microchem Omnicoat, MicroChem Corp. Entfernen des Haftvermittlers: Microposit MF 319 Developer, Shipley Company Die Messing-Wafer werden vor der Prozessierung einer intensiven Reinigungsprozedur unterzogen (Tabelle 4.2). Die Prozessschritte und -parameter der SU-8 Photolithographie für eine Schichtdicke von 80 µm sind detailliert in Tabelle 4.3 aufgeführt. Sie folgen im Wesentlichen den Prozessierungsempfehlungen des Herstellers [Mic02]. Abweichend zu diesen werden 54

61 4.3 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit UV-LIGA Tabelle 4.2: Schritte und Parameter für die Reinigung der Messing-Wafer. Schritt Prozedur Parameter 1 elektrochemische Reinigung C, Stromdichte (alkalischer Reiniger) > 10 A/dm 2, kathodisch 2 verdünnte Schwefelsäure (10 %) 10 s 3 Spülen mit Aceton 1 min 4 Spülen mit Isopropanol 1 min 5 Spülen mit DI-Wasser 1 min 6 Trockenschleudern längere Ruhephasen für den Photolack nach dem Soft Bake, Belichten und Post Exposure Bake eingeführt. Dies führt zu einer Reduktion von Spannungen im Lack. Der Soft Bake wird mit einer Temperatur von 100 C gestartet. Dadurch verringert sich die Viskosität des Lacks. Er zerfließt zu einer glatten Oberfläche und eingeschlossene Luftblasen können leichter entweichen. Die Temperaturen der Ofenprozesse werden in Rampen gefahren, um möglichst keine zusätzlichen Spannungen in der SU-8 Schicht zu induzieren. Die Belichtungsdosis mit 324 mj/cm 2 wird niedriger als vom Hersteller empfohlen gewählt und in vier Intervallen appliziert. Dadurch ergeben sich bei den Photolackstrukturen Seitenkanten mit einem Hinterschnitt von ungefähr 5. Diese erleichtern das Entfernen der Lackprimärform nach der Galvanoformung. Als Masken werden hochauflösende Folienmasken, welche normalerweise zur Leiterplattenherstellung eingesetzt werden, mit einer Auflösung von 8000 dpi (ca. 5 µm Pixelgröße) verwendet. Diese Masken sind preisgünstig und können relativ einfach mit einem entsprechenden Plotter ausgedruckt werden. Galvanoformung Unmittelbar vor der galvanischen Abscheidung wird der mit Photolack strukturierte Messing-Wafer einige Sekunden in verdünnte Schwefelsäure (10 %) getaucht. Dadurch werden Metalloxidschichten entfernt und die Oberfläche aufgeraut, um eine gute Haftung der Galvanik zu gewährleisten. Für die Galvanoformung wird ein kommerziell verfügbares Glanznickelbad SLOTO- NIK 50 von Schlötter Galvanotechnik, Geislingen, eingesetzt [Sch04]. Die wichtigsten 55

62 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Tabelle 4.3: Prozessschritte für die Herstellung einer SU-8 Primärform. Schritt Prozess Parameter 1 Reinigen Messingwafer siehe Tabelle Dehydration Bake (Konvektionsofen) C 3 Dispensieren Haftvermittler 4 ml Omnicoat für einen100 mmwafer 4 Aufschleudern Haftvermittler U/min 5 Dispensieren Photolack 4 ml SU für einen100 mmwafer 6 Aufschleudern Photolack U/min 7 Soft Bake (Konvektionsofen) C, C 8 Ruhephase Photolackschicht 1 RT 9 UV-Belichtung (365 nm) mw/cm 2 10 Ruhephase Photolackschicht 15 RT 11 Post Exposure Bake (Heizplatte) 1 65 C, C 12 Ruhephase Photolackschicht 24 RT 13 Entwickeln (SU-8 Entwickler) 4 min bei leichtem Bewegen des Wafers 14 Spülen/ Trocknen Isopropanol, DI-Wasser/ Trockenblasen N 2 15 Entfernen Omincoat 30 s MF Spülen/ Trocknen DI-Wasser/ Trockenblasen N 2 17 O 2 - Plasma Reinigung W Daten der Zusammensetzung des Galvanikbades sowie Prozessbedingungen sind in Tabelle 4.4 zusammengefasst. Eine Nickel-Abscheiderate von 0,4 µm/min wird durch eine niedrige Stromdichte von 1 A/dm 2 erreicht. Der Elektrolyt wird mit einer Heizung auf einer konstanten Temperatur von 50 C gehalten und mit einer Pumpe kontinuierlich umgewälzt. Die Konzentration der Additive und ein konstanter ph-wert müssen sorgfältig eingehalten werden, um eine spannungsfreie und glänzende Nickelabscheidung zu gewährleisten. Die mit diesen Parametern abgeschiedene Dicke der Nickelschicht beträgt 75 µm. Eine Abscheidung dauert ungefähr 3 Stunden. Aufgrund der verhältnismäßig kurzen Zeit für die Galvanikabscheidung kann auf einen Hardbake bei der Photolackschicht verzichtet werden. Die Dicke der Nickelschicht liegt 5 µm unter der Photolackdicke. Ein Überwachsen des Lacks wird verhindert. Dies und der nicht notwendige Hardbake erleichterten das Entfernen der Photolackprimärform. Die Härte der Nickelschicht ist mit einem Mikrohärtetest nach Vickers (MHT-10 Mikrohärtetester von Anton Paar, Graz/AT) bestimmt worden. Sie beträgt 700 HV und ist damit relativ hart. Eine mittlere Oberflächenrauheit R a 20 nm der galva- 56

63 4.3 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen mit UV-LIGA Tabelle 4.4: Zusammensetzung und Prozessdaten des SLOTONIK Glanznickel-Elektrolyten. Nickel: 75 g/l Additiv SLOTONIK 11: 5 ml/l Additiv BFL: 30 ml/l Additiv SLOTONIK 51: 1 ml/l Additiv Slotonik M: 5 ml/l Stromdichte bei der Abscheidung: 1 bis 2 A/dm 2 Elektrolyttemperatur: 50 C ph-wert des Elektrolyten: 4,0 4,5 nisch abgeschiedenen Nickelschicht wurde mit einem KLA-Tencor P11 Profilometer bestimmt. Die Galvanoform weist, entsprechend der Primärform, einen Wandwinkel von ungefähr 85 auf. Diese Entformschräge reduziert beim Abformen die Entformkräfte. Die SU-8 Primärform wird während vier Stunden bei 70 C in einem mit MicroChem Remover PG gefüllten Ultraschallbad entfernt. Die Messing-Wafer werden anschließend durch Sägen mit einer Wafersäge oder Drahterodieren zu 20 mm 20 mm großen Formeinsätzen für ein Abformwerkzeug vereinzelt (Abbildung 4.3). Abbildung 4.3: Mit UV-LIGA gefertigter Nickel/Messing-Formeinsatz (20 mm 20 mm) für das Heißprägen. 57

64 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Abformen durch Heißprägen Als Halbzeuge für das Heißprägen werden 20 mm 20 mm 2 mm große Plättchen aus TOPAS 5013 verwendet. Für das Abformen wird eine Heißprägemaschine auf Basis einer Hydraulikpresse MB VC von Schmidt Maschinentechnik, Bretten, eingesetzt. Sie besitzt ein verfahrbares, beheizbares unteres Querhaupt, auf welches Prägewerkzeug und Polymerhalbzeug positioniert werden, und ein stationäres, beheizbares oberes Querhaupt. Während des Prägens wird in der Probenkammer der Maschine ein Druck von 10 2 mbar erzeugt. Dies verhindert Lufteinschlüsse in kleinen Kavitäten während des Prägeprozesses. Der Prägeprozesse wird kraftgesteuert geführt. Er besteht aus drei Phasen: 1. Aufheizen des Polymers über die Glasübergangstemperatur T G des Polymers. T G von TOPAS 5013 liegt bei 136 C [Tic00]. 2. Prägen der Mikrostruktur durch das Zusammenfahren der Querhaupte mit der Prägekraft. 3. Nachprägen mit einer geringeren Kraft während des Abkühlens, um das Schwinden des Polymers in der Prägeform zu kompensieren. Anschließend werden die Querhaupte auseinander gefahren und die Probenkammer belüftet. Der Verlauf der Parameter Kraft, Temperatur und Weg für das Prägen einer 75 µm tiefen Mikrostruktur ist graphisch in Abbildung 4.4 über der Prozesszeit dargestellt. Das Ergebnis, eine in TOPAS abgeformte Mikrokrümmerstruktur wird in Abbildung 4.5 gezeigt. Die Zykluszeit für einen vollständigen Durchlauf eines UV-LIGA-Prozesses beträgt ungefähr 15 Stunden reine Prozesszeit. Rechnet man noch die Ruhephasen und Pausenzeiten zwischen den einzelnen Prozessen dazu, lässt sich innerhalb von wenigen Tagen ein neues Strukturdesign in eine abgeformte Polymerstruktur umsetzen. 4.4 Bewertung der Fertigungsverfahren Die UPM bietet eine schnelle und günstige Möglichkeit zur Herstellung von Mikrostrukturen in Polymeren. Deshalb sind die ersten Mikrokrümmerstrukturen mit diesem Verfahren hergestellt worden. 58

65 4.4 Bewertung der Fertigungsverfahren Kraft (kn) Weg (mm) Temperatur ( C) 0,00-0,02-0,04-0,06-0, Aufheizen 2. Prägen 3. Nachprägen Prozesszeit (min) Abbildung 4.4: Graphische Darstellung der drei Phasen des Heißprägeprozesses und der Verlauf der Parameter (Weg, Kraft und Temperatur). Zuführkanal Zuführreservoir Plasmareservoir Zellreservoir Plasmakanal Zellkanal Abbildung 4.5: In TOPAS abgeformte Mikrokrümmerstruktur (Chipgröße 20 mm x 20 mm, links) und Detailansicht des Krümmerbereichs (rechts). Die Breite des Zuführkanals beträgt 50 µm, die des Plasmakanals 30 µm und die des Zellkanals 100 µm. 59

66 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen Die Qualität der bearbeiteten Strukturen hängt vom Fräswerkzeug ab. Hartmetallfräser sind inzwischen bis zu einem Durchmesser von 25 µm kommerziell erhältlich. Damit lassen sich jedoch keine optischen Oberflächen in Polymeren herstellen. Dies ist nur mit Diamantfräswerkzeugen möglich [Wöl04]. Für diese liegen die kleinsten erhältlichen Durchmesser bei 300 µm. Es ist also nicht möglich, im Rapid-Prototyping mit der UPM Mikrokanalstrukturen mit Kanalbreiten zwischen 20 und 100 µm direkt mit Oberflächenqualitäten zu fertigen, wie sie für den BLISC benötigt werden. Aufgrund des nicht beliebig kleinen Durchmessers eines Fräsers unterliegen die fräsbaren Geometrien Einschränkungen, insbesondere bei Ecken und spitzen Winkeln. Das Problem der Geometrieeinschänkung besteht auch bei der Herstellung von Abformwerkzeugen durch Fräsen. Die Herstellung von Mikrostrukturen in Polymeren mit UV-LIGA ist im Vergleich zum Fräsen vom Fertigungsprozess her aufwendiger und teurer. Kostenvorteile entstehen aber, wenn ein Prägewerkzeug zur Replikation gleicher Strukturen mehrfach abgeformt wird oder das Werkzeug so ausgelegt wird, dass mehrere verschiedene Strukturen parallel prozessiert werden können. Das in dieser Arbeit entwickelte UV-LIGA Verfahren mit Metallsubstraten stellt ein flexibles, günstiges und schnelles Fertigungsverfahren für Mikrostrukturen dar. Es ermöglicht durch viele Redesignzyklen, welche insbesondere in der Entwicklungsphase benötigt werden, eine effiziente Designvalidierung. Außerdem ermöglicht dieses Verfahren die Strukturierung von Polymeren, welche in einer späteren Fertigung relevant sind. Dadurch stehen die spezifischen Material- und Oberflächeneigenschaften des Zielmaterials schon frühzeitig in der Entwicklungsphase zur Verfügung. Dies bedeutet niedrigere Produktentwicklungskosten und kürzere Entwicklungszeiten. Bei der Verwendung von Metallsubstraten kann auf das zeitaufwendige Abscheiden einer Trägerschicht und eine abschließende Nachbearbeitung dieser Metallflächen verzichtet werden. In diesem Fall werden an die Galvanik hohe Anforderungen bezüglich der Oberflächenrauheit und der Homogenität der Abscheidung gestellt. Beides wird durch eine hohe Leitfähigkeit des Metallsubstrats und eine geringe Stromdichte bei der galvanischen Abscheidung erreicht. Eine hohe Haftfestigkeit der Galvanik auf dem Substrat muss aufgrund der großen Kräfte beim Entformen gewährleistet sein. Die Messingoberfläche lässt sich einfach durch kurzes Eintauchen in verdünnte Schwefelsäure vor der galvanischen Abscheidung aufrauen und ermöglicht so eine gute Haftung der Galvanikschicht. Folienmasken sind in der UV-LIGA eine schnelle und günstige Methode zum Testen 60

67 4.4 Bewertung der Fertigungsverfahren diverser Designs, die begrenzte Auflösung von 8000 dpi erzeugt jedoch keine scharfen, optisch dichten Strukturkanten. Daraus resultieren Abweichungen von ± 5 µm zum vorgegebenen Maskenmaß und raue Seitenwände der Photolack-Primärform, welche wiederum bei der Galvanoformung abgeformt werden. Eine Verbesserung der Qualität der photolithographischen Strukturen konnte durch die Verwendung von Chrom-Glasmasken erreicht werden. Diese besitzen eine Auflösung von besser 1 µm und haben optisch dichte Strukturkanten. Sie sind aber in der Anschaffung wesentlich teurer. Das Resultat einer galvanisch erzeugten Metallform, bei welcher die Photolithographie mit einer Folienmaske durchgeführt wurde, im Vergleich zu einer Chrom-Glasmaske ist in Abbildung 4.6 dargestellt. Während die Oberseiten bei beiden Strukturen eine vergleichbar geringe Rauheit besitzen, sind die Seitenwände bei der Folienmaske deutlich rauer. Dies führt bei der Abformung zu höheren Entformkräften und zu einem erhöhten Werkzeugverschleiß. Durch eine zusätzliche galvanische Beschichtung des Werkzeuges mit einer dünnen Chrom- oder Nickelschicht lassen sich die Entformkräfte reduzieren und die Standzeit der Werkzeuge erhöhen. Abbildung 4.6: REM-Aufnahmen (500-fache Vergrößerung) von galvanisch erzeugten Metallformen für die Abformung von Mikrokanälen, bei welchem die Photolithographie mit einer Folienmaske (links) und mit einer Chrom-Glasmaske (rechts) durchgeführt wurde. 61

68 4 Fertigung von Mikrokrümmerstrukturen 62

69 5 Durchführung der Messungen 5.1 Messmedium Die Verwendung von Blut als Messmedium ist unter hygienischen Aspekten nicht unkritisch. Humane Blutproben gelten unter arbeitsschutztechnischen Gesichtspunkten als potentiell infektiös. Es besteht zum Beispiel das Risiko einer Infektion mit Hepatitis B oder C und HIV. Bei der Arbeit mit Humanblut müssen Schutzhandschuhe und ein Schutzkittel getragen werden. Kontaminierte Flächen müssen mit Alkohol (70 %) wischdesinfiziert werden. Kanülen müssen in speziellen Kanülenabwurfbehältern entsorgt werden [Pie03]. Als Ersatzflüssigkeit für Blut sind Versuche mit folgenden Suspensionen durchgeführt worden: Wasser mit sphärischen, monodispersen Polystyrolpartikeln (Durchmesser 9,61 µm, Dichte 1,05 g/cm 3 )[Mic03]. Wasser mit sphärischen Hohlglaskugeln aus Borsilikatglas (mittlerer Durchmesser 10 µm, Dichte ca. 1,1 g/cm 3 )[Dan03]. Diese Suspensionen weisen ein ähnliches Verhältnis der spezifischen Dichte von Feststoff zu Flüssigkeit und der Partikelgröße wie Blut auf. Das Problem bei beiden Modellflüssigkeiten besteht darin, dass schon nach kurzer Zeit der Übergang vom Zuführreservoir zum Zuführkanal verstopft. Für eine Reinigung muss der Messaufbau komplett zerlegt werden. Tierisches Blut von Schweinen, Rindern oder Pferden könnte als Ersatzflüssigkeit eingesetzt werden. Es existieren jedoch deutliche Unterschiede zwischen den Eigenschaften des Blutes bei Säugetieren. Während Pferdeblut sehr stark zur Aggregation neigt, wird dieser Zustand bei Rinderblut unter keinen Fließbedingungen erreicht. Die Eigenschaften des Humanbluts liegen in der Mitte dieses Spektrums. 63

70 5 Durchführung der Messungen Zum Erhalt möglichst realer Versuchsbedingungen wird deshalb für die Experimente Humanblut eingesetzt. Durch die Verwendung von Eigenblut des Experimentators wird das Infektionsrisiko minimiert. Zur Gewährung reproduzierbarer Versuchbedingungen werden die Versuche mit frisch gewonnenem, venösem Blut durchgeführt. Auch bei diesem Vorgehen unterliegen zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnene Blutproben eines Probanden physiologischen Schwankungen und sind somit nicht identisch. Die Entnahme des Blutes erfolgt fachgemäß durch Punktion einer Armvene des Probanden mit einem Butterfly -Blutentnahmesystem von Becton Dickinson, Heidelberg, in Monovetten-Röhrchen von Sarstedt, Nümbrecht, welche EDTA als Gerinnungshemmer enthielten. Ein Teil der Versuche wird mit verdünnten Blutproben durchgeführt. Die Verdünnung erfolgt mit physiologischer Kochsalzlösung von Braun, Melsungen. Die Messungen werden innerhalb von vier Stunden nach Entnahme des Blutes abgeschlossen. 5.2 Messaufbau Für die Durchführung der Messungen wurde ein Messaufbau erstellt. Dieser ist schematisch in Abbildung 5.1 dargestellt. Die wesentlichen Elemente sind eine Spritzenpumpe, ein Mikrofluidik-Modul und ein Mikroskop. Als Spritzenpumpe werden zwei unterschiedliche Geräte verwendet, auf deren Vorund Nachteile in 5.3 eingegangen wird: Hamilton Microlab 540B mit Hamilton Glasspritze 100 µl Braun Perfusor V mit Braun Injekt Einmalspritzen Das Mikrofluidik Modul besteht aus zwei transparenten Plexiglasplatten, zwischen welchen der BLISC mittels vier Schrauben formschlüssig geklemmt wird. In die Bodenplatte der Klemmhalterung ist eine Vertiefung gefräst, welche den BLISC fixiert. Die fluidische Kontaktierung von Zuführ-, Zell- und Plasmareservoir auf dem BLISC erfolgt über Bohrungen und dem Schlauchverbindungssystem MINSTAC System von LEE in der Deckelplatte (Abbildung 5.2). Über einen Schlauch mit einem spritzenseitigen Luer-Anschluss gelangt das Blut zum Mikrofluidik Modul. Über zwei weitere Schläuche werden die aufgetrennten Proben 64

71 5.3 Ablauf der Messungen Mikroskop Mikrofluidik-Modul Spritzenpumpe aufgetrennte Proben Abbildung 5.1: Schematische Darstellung des Messaufbaus. aus Zell- und Plasmareservoir in unterschiedliche Auffanggefäße abgeführt. Über den Anschluss des Zuführkanals wird ein kurzes Schlauchstück als Sicherung geschoben, um ein Abrutschen des Schlauches bei der Beaufschlagung mit Druck zu verhindern. Das Mikrofluidik-Modul kann in unterschiedlichen Positionen unter dem Mikroskop platziert werden. Dies ermöglicht beispielsweise die Beobachtung des Trennvorgangs im Krümmerbereich während der Messung. Als Mikroskop wird ein Stereomikroskop, Stemi 2000 C, von Carl Zeiss mit einem Adapter für eine Digital- oder Videokamera verwendet. Damit können Messungen mit Filmsequenzen oder Bildern dokumentiert werden. 5.3 Ablauf der Messungen Die Messungen sind abhängig von der verwendeten Spritzenpumpe mit unterschiedlichen Parametern durchgeführt worden. Mit der Hamilton Spritzenpumpe werden zyklisch 100 µl-volumina durch das Mikrofluidik-Modul gepumpt. Zwischen den Pumpschritten wird die Glasspritze jeweils wieder aus den als Reservoir dienenden Monovetten befüllt. 65

72 5 Durchführung der Messungen Plasmareservoir Zellreservoir Zuführreservoir mit Schlauchsicherung Klemmhalterung Modulhalterung BLISC Abbildung 5.2: Mikrofluidik-Modul bestehend aus fluidischen Anschlüssen, Klemmhalterung und eingebautem BLISC. Für die Perfusor Spritzenpumpe werden 10 ml oder 20 ml Einmalspritzen verwendet. Diese werden vor der Messung vollständig befüllt. Das Blut wird während der Messung kontinuierlich in das Mikrofluidik-Modul gepumpt. Die zellulären Bestandteile werden während länger dauernder Messungen im Abstand von ungefähr 5 min aufgeschüttelt, um eine Sedimentation in der Spritze zu verhindern. Das Blut tritt über das Zuführreservoir in die Mikrokrümmerstruktur ein und über Zell- und Plasmareservoir wieder aus. Zur Bestimmung der Auftrennung werden die Zellkonzentrationen von Blutproben aus dem Zuführreservoir sowie aus Zell- und Plasmareservoir verglichen. Die Blutproben wurden im Zentrallabor des Universitätsklinikums Freiburg oder im Fachbereich Hämostaseologie der DKD, Wiesbaden, analysiert. Versuche, die Zellen unter dem Mikroskop mit Hilfe einer Zählkammer nach Bürker zu zählen, haben eine zu große Streuung bei den Ergebnissen ergeben und sind deshalb nicht weiter verfolgt worden. Für zuverlässige Blutanalysen am Universitätsklinikum Freiburg ist eine Mindestmenge von 1 ml Flüssigkeit notwendig. Die Proben müssen dort in 4 ml Monovetten in entsprechenden Laborumschlägen abgegeben werden, damit sie im Routine-Laborbetrieb verarbeitet werden können. Um zu verhindern, dass die Blutproben mit zuviel Gerinnungshemmer versetzt werden, wurde das EDTA vor der Befüllung aus den 4 ml Monovetten entfernt. Die Blutanalysen an der DKD können schon mit einem geringeren Flüssigkeitsvolumen 66

73 5.3 Ablauf der Messungen von 300 µl durchgeführt werden. Deshalb wurde an der DKD ein identischer Messplatz eingerichtet, so dass dort parallel Mikrokrümmerstrukturen vermessen werden können. Bei jeder Messung werden Proben aus Zell- und Plasmakanal entnommen und auf Hämolyse durch Zentrifugieren kontrolliert. Zeigt der Plasmaüberstand nach dem Zentrifugieren eine leichte bis starke Rotfärbung, verursacht durch das freigesetzte Hämoglobin lysierter Erythrozyten, so ist diese Probe hämolytisch und die Messung wird nicht ausgewertet. Proben mit klarem Plasmaüberstand werden als nicht hämolytisch betrachtet (Abbildung 5.3). Die Gefahr von Hämolyse nimmt bei verdünntem Blut ab. Abbildung 5.3: Reaktionsgefäße mit unterschiedlichen Blutproben. Beispiel einer Probe ohne Hämolyse (C8, links), mit beginnender Hämolyse (C4, Mitte) und hämolytische Probe (C2, rechts). Ein Problem entsteht durch die Verwendung von Glasspritzen bei der Hamilton- Spritzenpumpe. Hier ist vielfach die Bildung von Zellkoagulationen beobachtet worden (Abbildung 5.4). Untersuchungen an der DKD haben gezeigt, dass durch die Glassoberfläche die Gerinnung aktiviert wird. Aufgrund dieser Ergebnisse werden die weiteren Messungen nur noch mit Kunststoffspritzen durchgeführt. 67

74 5 Durchführung der Messungen Abbildung 5.4: Koagulation von Blutzellen im Bereich der Plasmakanäle durch Gerinnungsaktivierung. 5.4 Fehlerquellen Die Trenneffizienz wird aus den Blutzellenkonzentrationen im Zuführreservoir und im Plasmareservoir berechnet. Die Größe des Messfehlers bei der Bestimmung der Trenneffizienz wird durch mehrere Fehlerquellen bestimmt. Zum einen ergibt sich ein Messfehler bei der Zellkonzentrationsbestimmung bedingt durch das Messgerät. Zum anderen trägt das Messverfahren durch die Bedienung und den Messaufbau zum gesamten Messfehler bei. Der Einfluss der beiden Fehlerquellen, Messgerät und Messverfahren, wurden durch eine Wiederholung gleichartiger Messungen untersucht und anschließend abgeschätzt. Ein Fehler, welcher bei der Verdünnung der Blutlösungen entsteht, wird nicht berücksichtigt, da die Messungen in einer Serie jeweils mit der gleichen Ausgangslösung durchgeführt wurden. Fehler durch das Messgerät: Zur Bestimmung des Messfehlers bedingt durch das Messgerät wurden Teile derselben Probe aus verdünntem Blut (HKT = 9 %) im Zentrallabor des Universitätsklinikums 68

75 5.4 Fehlerquellen zehnmal zum Analysieren gegeben. Die Auflösung der Zellkonzentrationen bei den Blutanalysen, wie sie vom Zentrallabor ausgewiesen wird, beträgt 0, Zellen / µl für Erythrozyten und 0, Zellen / µl für Leukozyten. Aus diesen zehn Messungen wurde der arithmetische Mittelwert der Konzentration der Erythrozyten c und die Standardabweichung s für Erythrozyten und Leukozyten bestimmt (Tabelle 5.1). Tabelle 5.1: Ermittlung des Messgerätefehlers. Messung c RBC /10 6 Zellen/µl 0,94 0,93 0,94 0,95 0,93 0,94 0,95 0,95 0,97 0,94 c W BC /10 3 Zellen/µl 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,1 1,1 1,3 Mit der Standardabweichung s wird der Fehler bei der Zellkonzentrationsbestimmung durch das Messgerät c d geschätzt. Für die Erythrozyten ergibt sich: c RBC = 0, Zellen / µl, c drbc = s RBC = 0, Zellen / µl, und für die Leukozyten: c W BC = 1, Zellen / µl, c dw BC = s W BC = 0, Zellen / µl. Der Fehler bei der Konzentrationsbestimmung der Blutzellen aufgrund dieser Abschätzung liegt innerhalb der Spezifikationen aus der Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, welcher das Universitätsklinikum Freiburg als zertifiziertes Labor genügen muss [Arb03]. Gemäß dieser Richtlinie darf die systematische Messabweichung bei der Konzentrationsbestimmung der Erythrozyten maximal ± 3 % und bei der Konzentrationsbestimmung der Leukozyten ± 5 % betragen. An der DKD werden die Messungen mit einem Sysmex KX21 Hämatolgie-Analysator durchgeführt. Gemäß den Gerätespezifikationen beträgt die systematische Messabweichung für Erythrozyten maximal ± 2 % und für Leukozyten ± 3,5 % [GMHH98]. Fehler durch das Messverfahren: Ein weiterer Fehler bei Messungen entsteht durch das Messverfahren bedingt durch die Montage des Chips und den Versuchsaufbau. Zur Abschätzung dieses Fehlers wurden 69

76 5 Durchführung der Messungen fünf Proben mit verdünntem Blut nach dem Durchlaufen der Messapparatur verglichen. Vor jeder dieser Messungen wurde der Versuchsaufbau demontiert, gereinigt und anschließend wieder zusammengebaut. Dieser Versuch wurde zusätzlich noch mit drei Vollblutproben durchgeführt. Aus den Messwerten wurde der arithmetische Mittelwert der Zellkonzentration c von Erythrozyten und Leukozyten berechnet sowie die Hälfte der Spannweite zwischen maximalem und minimalem Messwert δ. Tabelle 5.2: Fehler durch das Messverfahren bei verdünntem Blut (HKT = 7 %). Messung c δ c RBC /10 6 Zellen/µl 0,62 0,66 0,7 0,59 0,58 0,63 0,06 c W BC /10 3 Zellen/µl 0,7 0,6 0,7 0,7 0,6 0,7 0,1 Tabelle 5.3: Fehler durch das Messverfahren bei Vollblut. Messung c δ c RBC /10 6 Zellen/µl 3,86 3,89 3,50 3,75 0,20 c W BC /10 3 Zellen/µl 2,9 2,7 2,3 2,6 0,3 Aufgrund der niedrigen Stichprobenzahl wird mit δ der durch das Messverfahren verursachte Fehler bei der Zellkonzentrationsbestimmung c m geschätzt. Er beträgt bei verdünntem Blut (Hkt = 7 %, Tabelle 5.2) für Erythrozyten: c mrbc = δ RBC = 0, Zellen / µl, und für Leukozyten: c mw BC = δ W BC = 0, Zellen / µl. Bei Vollblut liegt dieser Fehler etwas höher (Tabelle 5.3). Er beträgt für Erythrozyten: c mrbc = δ RBC = 0, Zellen / µl, und für Leukozyten: c mw BC = δ W BC = 0, Zellen / µl. Fehler bei der Bestimmung der Trenneffizienz Die Trenneffizienz η wird durch die Zellkonzentrationen im Zuführreservoir c F C und im Plasmareservoir c P C (Gleichung 3.40) definiert: 70

77 5.4 Fehlerquellen η = c F C c P C c F C. (5.1) Der Fehler der Trenneffizienz wird nach dem Gaußschen Fehlerfortpflanzungsgesetz berechnet: η = ( ) η 2 ( ) η 2 c F C + c P C, (5.2) c F C c P C = (cp C c 2 F C ) 2 ( ) 1 2 c F C + c P C. (5.3) c F C Der Fehler der Zellkonzentration im Zuführkanal c F C wird nur durch das Messgerät beeinflusst, da diese Probe vor dem Durchlaufen der Messaufbaus entnommen wird. Daraus ergibt sich für diesen Fehler bei den Erythrozyten: c RBCF C = c drbc = 0, Zellen/µl, (5.4) und bei den Leukozyten: c W BCF C = c drbc = 0, Zellen/µl. (5.5) Der Fehler der Zellkonzentrationsbestimmung im Plasmareservoir c P C setzt sich aus dem Fehler des Messgeräts c d und dem Fehler des Messverfahrens c m zusammen, da die Messprobe nach dem Durchlaufen des Messaufbaus entnommen wird: c P C = c 2 d + c2 m. (5.6) Daraus ergibt sich als Fehler für die Konzentrationsbestimmung der Erythrozyten im Plasmareservoir bei verdünntem Blut: c RBCP C = (0, ) 2 + (0, ) 2 Zellen/µl = 0, Zellen/µl, (5.7) und für die Leukozyten: 71

78 5 Durchführung der Messungen c W BCP C = (0, ) 2 + (0, ) 2 Zellen/µl = 0, Zellen/µl. (5.8) Für Vollblut ergibt sich bei den Erythrozyten: c RBCP C = (0, ) 2 + (0, ) 2 Zellen/µl = 0, Zellen/µl, (5.9) und bei den Leukozyten: c W BCP C = (0, ) 2 + (0, ) 2 Zellen/µl = 0, Zellen/µl. (5.10) 72

79 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen 6.1 Auswertung der Trenneffizienz In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Messungen zur Charakterisierung der Eigenschaften des Mikrokrümmers und die Verifizierung der Aussagen aus den Modellen in Kapitel 3 dargestellt. Prototypen des Mikrokrümmers für diese Messungen wurden mit dem in Kapitel 4 beschriebenen Verfahren gefertigt. Durch die Variation von unterschiedlichen Parametern wie Krümmergeometrie, Hämatokritwert (Anteil der Blutzellen am Gesamtvolumen) sowie Zuführgeschwindigkeit wird der Einfluss dieser Parameter auf die Trenneffizienz untersucht. Die Resultate werden zu einer Optimierung der Krümmerstruktur verwendet. In einer Messreihe wird jeweils ein Parameter variiert, während die übrigen konstant gehalten werden. Als Blutparameter für die Vergleiche dienen die Erythrozyten(RBC)- und Leukozyten(WBC)-Konzentrationen im Zuführ- und im Plasmareservoir bei jeder Messung. Die Ergebnisse stellen eine repräsentative Auswahl aller Messungen dar. Es wird jeweils angegeben, ob die Messungen mit verdünntem Blut oder Vollblut durchgeführt worden sind. Die Trenneffizienz η für einen bestimmten Zelltyp wird durch die Blutzellenkonzentration im Zuführreservoir c F C und Plasmareservoir c P C definiert: η = c F C c P C c F C. (6.1) Der Fehler der Trenneffizienz wird nach dem Gaußschen Fehlerfortpflanzungsgesetz berechnet: η = ( ) η 2 ( ) η 2 c F C + c P C. (6.2) c F C c P C 73

80 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Die Fehler der Zellkonzentrationsbestimmungen im Zuführreservoir c F C und im Plasmareservoir c P C setzen sich aus unterschiedlichen Fehlerquellen zusammen, auf die in Abschnitt 5.4 näher eingegangen wurde. Der Fehler der Konzentrationsbestimmung im Zuführreservoir c F C ist durch den Fehler des Messgeräts c d bestimmt, während sich der Fehler der Konzentrationsbestimmung im Plasmareservoir c F C aus dem Fehler des Messgeräts c d und dem Fehler des Messverfahrens c m zusammensetzt. Diese beiden Fehler ergeben den Fehler bei der Berechnung der Trenneffizienz (Abschnitt 5.4). Die Fehlerbalken an den Messwerten geben den nach Gleichung 6.2 berechneten Fehler wieder. Zu jeder Messung werden als Parameter die geometrischen Kenngrößen für die verwendeten Mikrokrümmerstrukturen (Tabelle 6.1) angegeben. Tabelle 6.1: Geometrische Kenngrößen einer Mikrokrümmerstruktur und die dafür verwendeten Standardwerte, welche ohne zusätzliche Angabe bei den Messungen verwendet wurden. Kenngröße Formelzeichen Standardwert Länge Zuführkanal l F C 3 mm Länge Zellkanal l CC 3 mm Länge Plasmakanal l P C 3 mm Krümmerradius r 0.5 mm Krümmerbogenwinkel α 90 Winkel zwischen Zell- und Plasmakanal β 45 Lage Abzweigung des Plasmakanals Ende Krümmerbogen Aus der Volumenflussrate Q des Blutes durch die Mikrokrümmerstruktur und den Kenngrößen werden die die mittlere Zuführgeschwindigkeit des Bluts v F C = Q w F C h, (6.3) sowie das Flussratenverhältnis von Plasma- zu Zellkanal R Q (Gleichung 3.33) berechnet. Außerdem werden jeweils die Erythrozyten- und Leukozytenkonzentration im Zuführreservoir c F C und Plasmareservoir c P C sowie deren Fehler ( c F C, c P C ) angegeben. 74

81 6.2 Einfluss des Hämatokritwertes 6.2 Einfluss des Hämatokritwertes Wie in Abschnitt 3.4 dargestellt, wird die Sedimentationsgeschwindigkeit durch den Hämatokritwert beeinflusst. Bei geringeren Blutzellkonzentrationen und damit kleineren Hämatokritwerten erhöht sich die Sedimentationsgeschwindigkeit. Zudem wird die Axialmigration und damit auch der Plasma Skimming -Effekt bei niedrigeren Hämatokritwerten verstärkt. Diese Effekte sollten zu einer Erhöhung der Trenneffizienz bei niedrigeren Hämatokritwerten führen. Der Einfluss des Hämatokritwertes wurde mit Chip bestimmt. Die geometrischen Kenngrößen dieses Chips sind in Tabelle 6.2 aufgeführt. Tabelle 6.2: Kenngrößen von Chip Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q µm µm µm µm µl/s m/s ,6 2,93 0,05 Die Ergebnisse der Blutzellenkonzentrationsmessungen sind in Tabelle 6.3 aufgeführt. Ein Hämatokritwert von 48 % entspricht in dieser Messung Vollblut. Ein Hämatokritwert von HKT = 5 % entspricht dabei einer Blutverdünnung von 1:10, HKT = 10 % einer Verdünnung von 1:5 und HKT = 17 % einer Verdünnung von 1:3. In Abbildung 6.1 sind die mit den Werten aus Tabelle 6.3 berechneten Trenneffizienzen für Leukozyten und Erythrozyten in Abhängigkeit vom Hämatokritwert dargestellt. 75

82 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Tabelle 6.3: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Hämatokritwerte. RBC HKT c F C c F C c P C c P C % 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 5 0,55 0,01 0,06 0, ,09 0,01 0,28 0, ,87 0,01 0,64 0, ,51 0,01 3,36 0,20 WBC HKT c F C c F C c P C c P C % 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 5 0,4 0,1 0,1 0,1 10 0,8 0,1 0,1 0,1 17 1,5 0,1 0,2 0,2 48 4,4 0,1 1,8 0,3 Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Chip: η WBC η RBC 0, Hämatokritwert (%) Abbildung 6.1: Einfluss der Blutzellenkonzentration (Hämatokritwert) auf die Trenneffizienz. Die Trenneffizienz steigt bei den Erythrozyten von ungefähr 40 % für Vollblut bis bei- 76

83 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz nahe 90 % für einen Hämatokritwert von 5 %. Bei den Leukozyten erfolgt ein Anstieg von ungefähr 60 % auf 90 %. Tendenziell liegt die Trenneffizienz für die Leukozyten höher. Die Ergebnisse bestätigen das nach Abschnitt 3.3 und 3.4 erwartete Verhalten. Die Trenneffizienz wächst mit abnehmendem Hämatokritwert an, da die Sedimentationsgeschwindigkeit ansteigt. Die Messwerte für die Erythrozyten zeigen qualitativ den aus Abbildung 3.7 erwarteten Verlauf. Bei den Leukozyten ergibt sich schon ab einem Hämatokritwert von 20 % eine Sättigung bezüglich der Trenneffizienz. Bedingt durch ihre Kugelform und geringeren elastischen Eigenschaften werden die Leukozyten stärker von den Strömungskräften beeinflusst. 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Die Zentrifugalkraft als Separationsmechanismus wirkt ausschließlich im Bereich des Krümmerbogens. Geometrievariationen des Bogens sollten daher die Wirkung der Zentrifugalkraft und daraus resultierend die Trenneffizienz beeinflussen. Eine Übersicht der variierten Geometrieparameter gibt Abbildung 6.2. FC 30 α r Lage Abzweigung PC β PC CC Abbildung 6.2: Übersicht der variierten Geometrieparameter einer Mikrokrümmerstruktur: Krümmerbogenwinkel α, Krümmerradius r, Winkel zwischen Plasma- und Zellkanal β sowie die Lage der Abzweigung des Plasmakanals (30, 60 und 90 ). 77

84 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Krümmerbogenwinkel Bei den Chips in Tabelle 6.4 wurde der Krümmerbogenwinkel α in vier Stufen zwischen 0 und 135 variiert. Die Versuche wurden mit verdünntem Blut mit einem Hämatokrit von 7,5 % durchgeführt. In Tabelle 6.5 sind die zugehörigen Blutzellenkonzentrationen aufgeführt. Tabelle 6.4: Kenngrößen der Chips , -5, -3 und -6. Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q α µm µm µm µm µl/s m/s ,3 0,92 0, ,3 0,99 0, ,3 0,87 0, ,3 0,96 0, Tabelle 6.5: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Krümmerbogenwinkel. RBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl ,88 0,01 0,86 0, ,88 0,01 0,83 0, ,88 0,01 0,83 0, ,88 0,01 0,80 0,06 WBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl ,9 0,1 0,9 0, ,9 0,1 0,8 0, ,9 0,1 0,9 0, ,9 0,1 0,7 0,1 Abbildung 6.3 zeigt die Trenneffizienz in Abhängigkeit des Krümmerbogenwinkels α. Für die Erythrozyten steigt die Trenneffizienz stetig von 2 % bei einem Winkel von 0 auf 10 % bei 135 an. Bei den Leukozyten ist der Anstieg der Trenneffizienz größer (bis auf ungefähr 20 % bei 135, abgesehen von einem Ausreißer bei einem Winkel von 90 ). 78

85 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Trenneffizienz η 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 η WBC η RBC 04/ / / / ,1-0, Krümmerbogenwinkel α Abbildung 6.3: Einfluss des Krümmerbogenwinkels α auf die Trenneffizienz. Durch einen größeren Krümmerbogenwinkel wird die von den Zellen durchlaufene Strecke im Krümmerbogen und damit die Strecke, in welcher die Zentrifugalkraft auf die Partikel wirkt, länger. Die Kraft selbst bleibt konstant. Dieses Verhalten wird durch die Messungen wiedergegeben. Die Trenneffizienz steigt wenig aber kontinuierlich mit größeren Winkeln bei den Erythrozyten an. Sieht man vom Messwert bei 90 ab, steigt die Trenneffizienz für die Leukozyten ebenfalls mit größeren Winkeln an. Der Anstieg ist bedingt durch die Morphologie der Leukozyten höher. Krümmerradius Als weitere geometrische Größe wurde der Krümmerradius variiert. Vier Chips, welche sich im Krümmerradius unterscheiden, wurden untersucht. Die Kenngrößen dieser Chips sind in Tabelle 6.6 aufgeführt, die Ergebnisse der Zellkonzentrationsmessungen in Tabelle 6.7. Diese Versuche wurden mit verdünntem Blut (HKT = 8 %) durchgeführt. 79

86 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Tabelle 6.6: Kenngrößen der Chips , -3, -4 und -1. Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q r µm µm µm µm µl/s m/s mm ,6 3,20 0,48 0, ,6 2,90 0,41 0, ,6 3,15 0,40 1, ,6 3,39 0,37 2,0 Tabelle 6.7: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Krümmerradien. RBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl ,97 0,01 0,80 0, ,94 0,01 0,78 0, ,95 0,01 0,74 0, ,94 0,01 0,81 0,06 WBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl ,0 0,1 0,8 0, ,1 0,1 0,6 0, ,0 0,1 0,7 0, ,3 0,1 1,1 0,1 In Abbildung 6.4 ist die Trenneffizienz in Abhängigkeit vom Krümmerradius dargestellt. Die Trenneffizienz für die Erythrozyten variiert über den untersuchten Radiusbereich zwischen 14 und 22 %. Das Maximum liegt bei einem Radius von 1 mm, das Minimum bei 2 mm. Bei den Leukozyten ist die Variationsbreite mit einer Trenneffizienz von 10 bis 45 % größer. Das Maximum der Trenneffizienz liegt hier bei einem Radius von 0,5 mm, das Minimum ebenfalls bei 2 mm. Bei der Variation des Krümmerradius treten zwei gegenläufige Effekte auf. Bei gleicher Fluidgeschwindigkeit nehmen die Zentrifugalkraft und damit die Trenneffizienz mit größeren Krümmerradien ab. Sie ist proportional zu 1/r. Andererseits nimmt die Strecke, welche die Zellen im 90 Krümmerbogen durchlau- 80

87 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 04/ / / η WBC η RBC 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Krümmerradius r (mm) 04/ Abbildung 6.4: Einfluss des Krümmerradius auf die Trenneffizienz. fen, proportional mit r zu. Die Zellen sind länger der Zentrifugalkraft ausgesetzt. Die beiden Effekte heben sich gegenseitig auf. Dies erklärt den Verlauf der Ergebnisse der Messungen. Bei den Erythrozyten sind die Unterschiede bezüglich der Trenneffizienz über den betrachteten Radiusbereich gering. Bei den Leukozyten nimmt die Trenneffizienz bis zu einem Krümmerradius von 0,5 mm zu, anschließend wieder kontinuierlich ab. Winkel zwischen Plasma- und Zellkanal Der Winkel β zwischen Plasma- und Zellkanal wurde bei den Chips in Tabelle 6.8 in vier Stufen zwischen 30 und 90 variiert. Tabelle 6.8: Kenngrößen der Chips , -6, -4 und -2. Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q β µm µm µm µm µl/s m/s ,3 1,55 1, ,3 1,40 0, ,3 1,46 1, ,3 1,39 0,

88 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Die Zellkonzentrationsmessungen der mit verdünntem Blut (HKT = 9 %) durchgeführten Versuche sind in Tabelle 6.9 aufgeführt. Tabelle 6.9: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Winkel zwischen Plasma- und Zellkanal. RBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl ,07 0,01 0,92 0, ,07 0,01 0,93 0, ,07 0,01 0,89 0, ,07 0,01 1,00 0,06 WBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl ,2 0,1 0,8 0, ,2 0,1 1,0 0, ,2 0,1 0,8 0, ,2 0,1 1,1 0,1 Abbildung 6.5 stellt die Abhängigkeit der Trenneffizienz vom Winkel β zwischen Plasma- und Zellkanal dar. Die Trenneffizienz für die Erythrozyten variiert über den Messbereich zwischen 7 und 17 %. Bei den Leukozyten ist die Variation größer (8 bis 33 %). Bei diesen Messungen ist kein Trend erkennbar. 82

89 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 η WBC η RBC 04/ / / / Winkel β zwischen PC und CC Abbildung 6.5: Einfluss des Winkels β zwischen Plasma(PC)- und Zellkanal(CC) auf die Trenneffizienz. Diese Ergebnisse bestätigen die in Abschnitt 3.1 erwähnten Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen, dass die Trennung im Wesentlichen davon unabhängig ist, in welchem Winkel der Plasmakanal vom Zuführkanal abzweigt. Lage des Plasmakanals In diesen Versuchen wurde die Lage der Abzweigung des Plasmakanals bei drei Chips durch unterschiedliche Positionierung (30, 60 und 90 ) im Bereich des Krümmerbogens variiert. Bei den anderen untersuchten Chips zweigte der Plasmakanal jeweils am Ende des Krümmerbogens ab. Die Kenngrößen der drei Chips sind in Tabelle 6.10 aufgeführt, die Ergebnisse der Zellkonzentrationsmessungen in Tabelle Diese Versuche wurden ebenfalls mit verdünntem Blut (HKT = 9 %) durchgeführt. Der Winkel zwischen Plasma- und Zellkanal beträgt bei diesen Chips β = 90. In Abbildung 6.6 ist die Trenneffizienz in Abhängigkeit von der Lage des Plasmakanals im Krümmerbogen dargestellt. Bei den Erythrozyten steigt die Trenneffizienz stetig von 37 % bei einem Winkel von 30 auf 53 % bei 90 an. Bei den Leukozyten findet 83

90 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Tabelle 6.10: Kenngrößen der Chips , -7 und -2. Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q Lage PC µm µm µm µm µl/s m/s ,6 2,32 0, ,6 2,32 0, ,6 2,32 0,09 90 Tabelle 6.11: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Lagen des Startpunkts des Plasmakanals im Krümmerbogen. RBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl ,08 0,01 0,68 0, ,09 0,01 0,60 0, ,06 0,01 0,50 0,06 WBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl ,0 0,1 0,8 0, ,1 0,1 0,3 0, ,1 0,1 0,2 0,1 ebenfalls ein kontinuierlicher Anstieg der Trenneffizienz bei größeren Winkeln von 20 % auf 80 % statt. 84

91 6.3 Einfluss der Krümmergeometrie auf die Trenneffizienz Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 04/ / / Lage PC im Krümmerbogen η WBC η RBC Abbildung 6.6: Einfluss der Lage des Startpunkts des Plasmakanals (PC) bei unterschiedlichen Winkeln im Krümmerbogen auf die Trenneffizienz. Mit zunehmendem Winkel wirkt die Zentrifugalkraft länger auf die Zellen ein. Die Trenneffizienz wird gesteigert. Wie bei der Variation des Krümmerwinkels ergibt sich für die Erythrozyten der erwartete lineare Anstieg der Trenneffizienz. Abgesehen vom ersten Messwert verläuft die Trenneffizienz für die Leukozyten auf einem höheren Niveau parallel zu den Erythrozyten. Der ersten Messwert der Leukozyten (30 ) ist im Vergleich zu den Erythrozyten untypischerweise deutlich niedriger. Zusätzlich nimmt bei den Chips in Tabelle 6.10 die Kanalbreite vom Ende des Zuführkanals bis zum Anfang des Zellkanals kontinuierlich von 57 µm auf über 80 µm zu. Der Vorteil einer kontinuierlichen Verbreiterung des Krümmerbogens besteht darin, dass durch den engeren Zuführkanal die Flüssigkeit mit einer höheren Geschwindigkeit in den Krümmerbogen strömen kann. Der breitere Zellkanal führt zu einem kleineren Verhältnis der Flussraten in Plasma- und Zellkanal, auf dessen Einfluss in Abschnitt 6.5 eingegangen wird. 85

92 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen 6.4 Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal Die Zentrifugalkraft skaliert linear mit den im vorherigen Abschnitt untersuchten geometrischen Variationen der Krümmerform. In den Experimenten dieses Abschnitts wurde die Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal variiert. Gemäß Abschnitt 3.4 skaliert die Zentrifugalkraft quadratisch mit der Strömungsgeschwindigkeit. Die Versuche wurden mit Chip durchgeführt (Tabelle 6.12). Tabelle 6.12: Kenngrößen von Chip Chip w F C w CC w P C h R Q µm µm µm µm ,06 Es wurden Versuche bei drei verschiedenen Geschwindigkeiten mit verdünntem Blut (HKT = 8 %) durchgeführt. Die Ergebnisse der Zellkonzentrationsmessungen sind in Tabelle 6.13 aufgeführt. Tabelle 6.13: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten im Zuführkanal, Chip: RBC Q v F C c F C c F C c P C c P C µl/s m/s 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 5,3 1,24 0,93 0,01 0,72 0,06 10,6 2,49 0,93 0,01 0,62 0,06 26,4 6,19 0,93 0,01 0,11 0,06 WBC Q v F C c F C c F C c P C c P C µl/s m/s 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 5,3 1,24 0,9 0,1 0,5 0,1 10,6 2,49 0,9 0,1 0,2 0,1 26,4 6,19 0,9 0,1 0,1 0,1 Abbildung 6.7 zeigt die Trenneffizienz in Abhängigkeit von der mittleren Zuführgeschwindigkeit. Die Trenneffizienz für die Erythrozyten steigt stetig von 23 % bei einer Geschwindigkeit von ungefähr 1 m/s deutlich bis auf 88 % bei ungefähr 6 m/s an. Die Trenneffizienz bei den Leukozyten steigt ebenfalls stetig von 44 % auf 96 % an. Eine höhere Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal führt zu einer Erhöhung der Zentri- 86

93 6.5 Einfluss der Flussraten in Plasma- und Zellkanal fugalkraft sowie des Magnus-Effekts und damit zu einer Erhöhung der Trenneffizienz. Gleichzeitig muss aber auch beachtet werden, dass eine höhere Geschwindigkeit zu einer höheren mechanischen Belastung der Zellen führt. Dies erhöht die Hämolyserate. Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Chip : η WBC η RBC 0, mittlere Zuführgeschwindigkeit (m/s) Abbildung 6.7: Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal auf die Trenneffizienz. 6.5 Einfluss der Flussraten in Plasma- und Zellkanal Diese Versuche charakterisieren den Plasma Skimming -Effekt als weiteren Trennmechanismus. Dieser Effekt hängt, wie in Abschnitt 3.3 dargestellt, vom Verhältnis der Flussraten in Plasma- und Zellkanal ab. In Tabelle 6.14 sind die Kenngrößen von vier Chips aufgeführt, welche sich insbesondere im Flussratenverhältnis R Q unterscheiden. Die dazugehörigen Blutzellenmessungen befinden sich in Tabelle Diese Messungen wurden mit Vollblut durchgeführt. In Abbildung 6.8 wird die Trenneffizienz in Abhängigkeit des Verhältnisses der Flussraten im Plasma- und Zellkanal dargestellt. Die Trenneffizienz für die Erythrozyten nimmt zu größeren Flussratenverhältnissen hin von ungefähr 60 % bis auf 10 % ab. Für die Leukozyten erfolgt eine Abnahme von 75 % auf 50 %. Die Ergebnisse zeigen den entscheidenden Einfluss des Flussratenverhältnisses auf die Trenneffizienz und damit die Wirkung des Plasma Skimming -Effekts. Eine hohe 87

94 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen Tabelle 6.14: Kenngrößen der Chips , , und Chip w F C w CC w P C h Q v F C R Q µm µm µm µm µl/s m/s ,5 2,57 0, ,6 2,93 0, ,22 0, ,5 1,97 0,59 Tabelle 6.15: Blutzellenkonzentrationen vor und nach der Trennung für unterschiedliche Verhältnisse der Flussraten in Plasma- und Zellkanal. RBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl 10 6 / µl ,51 0,01 2,36 0, ,51 0,01 3,36 0, ,26 0,01 4,30 0, ,66 0,01 5,18 0,20 WBC Chip c F C c F C c P C c P C 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl 10 3 / µl ,1 0,1 1,3 0, ,4 0,1 1,8 0, ,7 0,1 3,1 0, ,9 0,1 3,0 0,3 Trenneffizienz lässt sich durch eine große Flussratendifferenz zwischen Plasma- und Zellkanal und somit durch eine entsprechende Gestaltung der hydraulischen Widerstände in diesen Kanälen erreichen. Der in Abschnitt 3.4 erwartete Zusammenhang zwischen Trenneffizienz und Flussratenverhältnis wird durch die Messungen qualitativ bestätigt. Der Vergleich der Messkurve mit Abbildung 3.9 lässt auf eine Plasmarandschichtdicke von wenigen Mikrometern schließen. Die Steigerung der Trenneffizienz durch einen hohen hydraulischen Widerstand des Plasmakanals geschieht aber zu Ungunsten der Plasmaausbeute im Plasmareservoir. Diese sinkt mit wachsendem Widerstand. 88

95 6.6 Optimierung des Mikrokrümmers durch parallele Plasmakanäle Trenneffizienz η 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, η WBC η RBC 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Verhältnis Flussrate PC zu Flussrate CC Abbildung 6.8: Einfluss des Verhältnisses der Flussraten im Plasma- und Zellkanal auf die Trenneffizienz. 6.6 Optimierung des Mikrokrümmers durch parallele Plasmakanäle Wie die vorangegangenen Messungen gezeigt haben, bedingt eine hohe Trenneffizienz einen hohen hydraulischen Widerstand des Plasmakanals. Um dabei ein Absinken der Plasmaausbeute zu verhindern, wurden Krümmergeometrien mit einer parallelen Anordnung mehrerer Plasmakanäle realisiert. Jeder einzelne Plasmakanal besitzt einen hohen hydraulischen Widerstand. Durch die parallele Anordnung von n Plasmakanälen erhält man die n-fache Plasmaausbeute, da das Verhältnis R Q der Flussraten von Plasma- zu Zellkanal bei gleicher Kanallänge aller Kanäle proportional zu n (n = 1, 2, 3,...) ist: ( ) wp C (h + w CC ) 4 R Q = n. (6.4) (h + w P C ) w CC Die Versuche wurden mit Polymerchips mit n = 6 Plasmakanälen (Abbildung 6.9) durchgeführt. Außerdem wurde in den folgenden Messungen untersucht, ob die in den vorherigen Abschnitten für die Blutauftrennung dominanten Effekte, Flussraten- 89

96 6 Ergebnisse und Diskussion der Trenneffizienzmessungen verhältnis von Plasma- zu Zellkanal, Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal und Hämatokritwert, auch bei den mehrfach Plasmakanalgeometrien einen signifikanten Einfluss auf die Trenneffizienz besitzen. Abbildung 6.9: REM-Aufnahme (20-fache Vergrößerung) eines Polymerchips mit sechs parallelen Plasmakanälen. Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal auf die Blutauftrennung Zunächst wurde der Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit im Zuführkanal untersucht. Tabelle 6.16 enthält die Kenngrößen des Chips mit 6 parallelen Plasmakanälen. Das Flussratenverhältnis R Q wurde nach Gleichung 6.4 berechnet. Danach beträgt die Ausbeute im Plasmakanal 26 % vom gesamten Flüssigkeitsvolumen. Tabelle 6.16: Kenngrößen von Chip Chip w F C w CC w P C h R Q µm µm µm µm ,26 In Tabelle 6.17 sind die Ergebnisse der Blutzellenkonzentrationsmessungen für vier 90