Polkörperdiagnostik für monogene Erkrankungen als deutsche Alternative zur Präimplantationsdiagnostik
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- Ute Kaufer
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1 Polkörperdiagnostik für monogene Erkrankungen als deutsche Alternative zur Präimplantationsdiagnostik A. Hehr, C. Gross, M. Bals-Pratsch, B. Paulmann, D. Tomi, B. Seifert, U. Hehr, E. Schwinger Einleitung Für Anlageträgerinnen einer monogenen Erkrankung ist die Polkörperdiagnostik (PKD) in Deutschland derzeit eine Alternative zur Pränataldiagnostik mit evtl. Schwangerschaftsabbruch. Die PKD ist praktisch die früheste Form der Präimplantationsdiagnostik (PID). Voraussetzung ist eine In-vitro-Fertilisation (IVF) mit intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI). Ziel der PID und auch PKD für monogene Erkrankungen ist die Auswahl solcher Embryonen für den Transfer, die die in der Familie nachgewiesene entsprechende Erkrankung nicht entwickeln werden. Die PKD wurde kurz nach der PID erstmalig 1991 durch Verlinsky et al. [1] beschrieben. Aufgrund länderspezifischer gesetzlicher Regelungen sind die methodischen Möglichkeiten der Präimplantationsdiagnostik in den einzelnen Ländern heute unterschiedlich. So ist in Deutschland, Österreich, der Schweiz und seit 2004 auch in Italien [2] die Diagnostik von Embryonen mittels PID verboten. In Deutschland ist der besondere Schutz humaner Embryonen seit 1991 durch das Embryonenschutzgesetz [3] geregelt. Die Polkörperdiagnostik jedoch ermöglicht eine genetische Diagnostik der Eizelle, da der im Gesetz definierte embryonale Status erst mit der Auflösung der Kernmembranen (»Verschmelzung der Vorkerne«) beginnt. In einer kürzlich erfolgten Umfrage [2] wurde von 2 deutschen Zentren der Einsatz der Polkörperdiagnostik für monogene Erkrankungen gemeldet (Regensburg, Lübeck). Das 1. gesunde Kind in Deutschland nach PKD für eine monogene Erkrankung an dem Zentrum in Regensburg wurde im August 2004 geboren, nur kurze Zeit später dann das 2. gesunde Kind nach PKD an der Universität Lübeck. Nach eigenen Informationen sind einige weitere deutsche Zentren an der Etablierung entsprechender Diagnostiksysteme interessiert bzw. arbeiten an der Etablierung. Im Folgenden werden die Methode der PKD für monogene Erkrankungen und der aktuelle Stand der Entwicklung in Deutschland dargestellt. Methoden International besitzt die PKD, abgesehen von der Arbeitsgruppe Verlinsky (Chicago), im Vergleich zur Präimplantationsdiagnostik an Embryonen (PID) kaum Bedeutung, da sie bei gleichen methodischen Erfordernissen nur eine indirekte Aussage zum genetischen Status der Eizelle erlaubt. Zusätzlich sind die Indikationen für die PKD im Vergleich zur PID eingeschränkt, da der paternale Anteil des Erbguts nicht mit berücksichtigt werden kann. So können z. B. autosomal-dominant paternal vererbte Erkrankungen mit der PKD nicht abgeklärt werden. Für autosomal-rezessiv vererbte Erkrankungen ist die Zahl der zu verwerfenden Vorkernstadien im Vergleich zur PID erhöht. Felberbaum.indd :34:16
2 98 Kapitel Polkörperdiagnostik für monogene Erkrankungen Der zeitliche Rahmen bei der PID erlaubt zudem falls erforderlich eine Wiederholung der Blastomerenbiopsie und auch eine Wiederholung der Analyse. Im Vergleich zur Polkörperdiagnostik greift die Biopsie von ein oder 2 Blastomeren allerdings direkt in die Entwicklung des Embryos ein, wenngleich bisherige Studien keine Unterschiede bzgl. der Implantationsrate von Embryonen nach Polkörper- oder Blastomerenbiopsie nachweisen konnten [4]. Aus genetischer Sicht ist die Polkörperdiagnostik im Gegensatz zur PID ein indirektes Diagnoseverfahren. Aus den in den beiden Polkörpern aufgefundenen Allelen wird auf das in der Eizelle verbliebene Allel zurückgerechnet. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, dass die Polkörper für die Implantation und Entwicklung des Embryos keine Bedeutung haben, sodass sich die Polkörperentnahme nicht negativ auf die weitere Entwicklung der Vorkernstadien auswirken sollte. Für die genetische Diagnose einer maximalen Anzahl an Vorkernstadien sollten der 1. und 2. Polkörper sequenziell untersucht werden. Mit der Untersuchung des 1. Polkörpers kann bereits eine Diagnose für die Vorkernstadien ohne cross-over in der entsprechenden Region gestellt werden. Erst die Einbeziehung der Diagnose des 2. Polkörpers erlaubt jedoch auch eine genetische Beurteilung der Vorkernstadien, welche im 1. Polkörper bzgl. der untersuchten Marker heterozygot waren [5]. Aufgrund der Vorgaben durch das Embryonenschutzgesetz steht für die PKD ein zeitlicher Rahmen von ca. 22 h zwischen ICSI und Vorkernverschmelzung zur Verfügung. Damit ergibt sich für die Analyse des 2. Polkörpers ein Zeitfenster von ca. h, was bei der Auswahl und Etablierung eines entsprechenden Testsystems beachtet werden muss. Andernfalls wäre eine Kryokonservierung der Vorkernstadien bis zum Abschluss der Analyse notwendig. Dieses könnte jedoch zu einer deutlich niedrigeren Schwangerschaftsrate nach Polkörperbiopsie auf Grund eines»laserfensters«in der Zona pellucida führen. Aufgrund des engen Zeitfensters für die PKD in Deutschland haben sich für eine sequenzielle Untersuchung von 1. und 2. Polkörper deshalb Testsysteme bewährt, die mittels Einschritt-Multiplex-PCR unter Einbeziehung polymorpher Marker eine Überprüfung der Allelseggregation allein (indirekte Diagnostik) oder in Kombination mit einem Nachweis der Mutation (direkte Diagnostik) ermöglichen. Zweistufige Systeme, die nach einer unspezifischen»whole genome amplification«eine 2. spezifische PCR mit einer größeren Ausgangsmenge an DNA ermöglichen, werden dagegen aufgrund des erhöhten Zeitaufwands lediglich eine Analyse des 1. Polkörpers im vorgegebenen zeitlichen Rahmen erlauben. Zeitlicher Ablauf einer PKD Voraussetzung für die PKD ist ein interdisziplinäres Betreuungskonzept für das ratsuchende Paar, das die vielschichtigen Aspekte vor, während und nach erfolgter PKD auf hohem Versorgungsniveau abdeckt. Dies beginnt mit einer ausführlichen interdisziplinären Beratung im Zentrum, die nochmals die humangenetischen Aspekte einschließlich formalem und empirischem Wiederholungsrisiko, die grundsätzlichen Möglichkeiten der Familienplanung und den konkreten Ablauf der Polkörperdiagnostik mit ihren Möglichkeiten und Grenzen umfasst, aber auch die Beratung durch einen erfahrenen Reproduktionsmediziner mit Erhebung und Besprechung der reproduktionsmedizinischen Befunde des Paares sowie objektiven Informationen zur Durchführung und den Erfolgschancen einer PKD nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI). Eine weitere Voraussetzung für die PKD ist weiterhin eine erfolgreich durchgeführte molekulargenetische Diagnostik der jeweiligen Erkrankung in der Familie, bei der die familienspezifische(n) Mutation(en) eindeutig identifiziert wurde(n). Nach eingehender humangenetischer Beratung und Aufklärung sowie reproduktionsmedizinischer Untersuchung wird für die familienspezifische Mutation sowie 2 bis 3 flankierende polymorphe Marker ein Fluoreszenz-Multiplex-PCR-Testsystem etabliert. Aufgrund der durch das Humangenomprojekt jetzt zur Verfügung stehenden Daten sollten alle benötigten Sequenzen zur Verfügung stehen. Probleme können sich aber jederzeit durch homologe Gene/Pseudogene mit sehr ähnlichen Sequenzen, Regionen mit erhöhter Rekombinationsfrequenz oder ähnliche sequenzspezifische Felberbaum.indd :34:16
3 Gegenwärtiger nationaler Stand 99 Eigenschaften der jeweiligen Region ergeben. Die eigentliche Etablierung der Testsysteme erfolgt an Einzelzellen von Kontrollpersonen und Einzelzellen der Ratsuchenden, gewonnen aus EDTA-Blut bzw. Fibroblastenkulturen. Dieser sehr aufwändige Prozess nimmt einige Monate in Anspruch und umfasst neben der eigentlichen Etablierung auch eine Validierungsphase, in der u. a. die zu erwartende»allel-drop-out-rate«des individuellen Testsystems bestimmt wird. Ein einmal etablierter Test kann dann u. U. auch für andere Familien einsetzbar sein, wenn die identische Mutation vorliegt und die Ratsuchende für die flankierenden polymorphen Marker informativ ist, d. h. wenn sie jeweils 2 eindeutig identifizierbare Allele aufweist. Der enge zeitliche Rahmen von nur 22 h und die Tatsache, dass neben den Polkörpern kein weiteres Untersuchungsmaterial gewonnen oder eine Wiederholung des Testansatzes durchgeführt werden kann, erfordern die permanente Anwesenheit von qualifiziertem Personal von der Entnahme des 1. Polkörpers über Nacht bis zum anderen Morgen, um den Zeitrahmen einhalten und bei evtl. auftretenden Problemen zeitnah reagieren zu können. Nach Auswertung der Analysenergebnisse wird am nächsten Morgen für die untersuchten Eizellen ein genetischer Befund mit einer Empfehlung der für den Transfer geeigneten Embryonen erstellt und an die reproduktionsmedizinische Einrichtung weitergegeben. Diese wählt dann ihrerseits aufgrund der genetischen Empfehlung und nach Beurteilung des Entwicklungszustands die Vorkernstadien für den Transfer aus. Fehlerquellen und Fehlerraten Die Polkörperdiagnostik ist eine indirekte Diagnostik, die basierend auf der analysierten genetischen Information des 1. und 2. Polkörpers und unter Annahme des korrekten Ablaufs der meiotischen Teilung eine Aussage zur genetischen Information der selbst nicht untersuchten Eizelle erlaubt. Ebenso wie bei der PID ist bei der PKD das Auftreten methodisch bedingter Fehler möglich. Aufgrund der vergleichsweise geringen internationalen Fallzahlen bzgl. der PKD liegen valide Statistiken zur Rate der Fehldiagnosen an ausreichend großen Kohorten bisher nicht vor. In der bisher größten Studie der Gruppe aus Chicago wird nach PKD für 100 Kinder eine Fehlerrate von ca. 2% berichtet. Mögliche Fehlerquellen sind v. a. das Nichterkennen eines Allel drop out (ADO) oder die Interpretation eines eigentlich homozygoten 1. Polkörpers als heterozygot infolge einer Kontamination. Beide Situationen können in einer Fehldiagnose für die zugehörige Eizelle resultieren. In der Literatur wurden Allel-drop-out- Raten für Einzelzellen im Bereich von 5,9 33,3% für verschieden PCR-Produkte publiziert. Eine Kombination mehrerer Marker in einem Multiplexsystem erlaubt es, derartige ADO-Ereignisse eher zu erkennen und die daraus resultierenden Ergebnisse dementsprechend zu interpretieren [6, 7]. Neben diesen methodisch bedingten Fehlern sind Maßnahmen zu ergreifen, um Kontaminationen der PCR-Ansätze mit DNA oder Zellen anderer Personen, insbesondere aber mit Zellen der Mutter (Granulosazellen etc.) zu vermeiden. Kontaminationen mit mütterlicher DNA oder Zellen stellen bei der PKD im Vergleich zur PID ein vergleichsweise deutlich höheres Risiko dar, da in Embryonalzellen grundsätzlich immer nur ein maternales Allel gemeinsam mit einem paternalen Allel vorliegt, während im Polkörper nur mütterliche Allele vorhanden sind. Gegenwärtiger nationaler Stand Gegenwärtig wird die PKD für monogene Erkrankungen entsprechend einer aktuellen Erhebung [2] in Deutschland in 2 Zentren aktiv betrieben (Regensburg und Lübeck). Zwischen beiden Zentren besteht eine enge Kooperation. Die bisherigen Ergebnisse der an unseren beiden PKD-Zentren durchgeführten Zyklen sind in Tabelle.1 aufgeführt: Bisher erfolgt über das Deutsche IVF-Register (DIR) trotz sehr intensiver Bemühungen von Seiten unseres Regensburger Zentrums keine systematische Registrierung von PKD-Zyklen für monogene Erkrankungen. Daten über evtl. einzelne Zyklen an weiteren Zentren liegen uns nicht vor. Die Aufnahme und prospektive Verfolgung dieser Zyklen über das DIR wären in Hinblick auf die Ko- Felberbaum.indd :34:16
4 100 Kapitel Polkörperdiagnostik für monogene Erkrankungen Tabelle.1 Ergebnisse der PKD-Zentren Regensburg und Lübeck Anzahl Zystische Fibrose (CF) Chorea Huntington (HD) Norrie- Erkrankung Myotone Dystrophie Incontinentia pigmenti Mukopolysaccharidose Hämophilie A Patienten Punktionszyklen Zyklen mit Embryotransfer Klinische Schwangerschaften c b Geborene Kinder 4a Klinische Schwangerschaft/Punktion Klinische Schwangerschaft/Paar Baby-take-home- Rate/Punktion Baby-take-home- Rate/Paar 4/9 0/7 1/4 0/1 1/1 1/1 0/1 4/5 0/2 1/1 0/1 1/1 1/1 0/1 3/9 0/7 1/4 0/1 0/1 1/1 0/1 3/5 0/2 1/1 0/1 0/1 1/1 0/1 a Einmal monozygote Gemini, b eine biochemische Schwangerschaft, c 2 biochemische Schwangerschaften. ordination dieses Untersuchungsverfahrens, aber auch zur Qualitätssicherung, sehr wünschenswert. Zusammenfassung Auch im engen zeitlichen Rahmen des deutschen Embryonenschutzgesetzes ist vor dem Beginn der embryonalen Existenz eine PKD für weibliche Anlageträgerinnen einer monogenen Erkrankung möglich. Der technische Aufwand ist ebenso wie die methodisch bedingte Fehlerrate nach aktuellem Kenntnisstand etwa mit der PID vergleichbar. Besondere Probleme ergeben sich momentan in Deutschland durch die strengen zeitlichen Vorgaben aufgrund des deutschen Embryonenschutzgesetzes. Das enge Zeitfenster von 22 h stellt für die ausführenden genetischen Laboratorien eine besondere Herausforderung dar, sodass sicherlich auf absehbare Zeit die Kapazitäten für Anfragen bzgl. schwerwiegender Erkrankungen nicht ausreichen werden und eine enge Zusammenarbeit zwischen den beteiligten Zentren zur Koordination der Aktivitäten auf diesem Gebiet im Interesse der ratsuchenden Paare dringend notwendig ist. Weiterhin ist zu beachten, dass bei der PKD im Gegensatz zur PID keine Überprüfung oder Wiederholung der Diagnostik vor dem Transfer möglich ist (bei PID kann ggf. eine weitere Zelle entnommen und analysiert werden). Aufgrund der nur indirekten Diagnosemöglichkeit bei gleichzeitig eingeschränktem Indikationsspektrum wird heute in den meisten höher entwickelten Ländern mit entsprechend liberaler Gesetzeslage praktisch nur (noch) die PID eingesetzt. Die Schwangerschaftsraten nach PID für monogene Erkrankungen liegt derzeit international unter 20%/Punktionszyklus. Bei noch geringen deutschen Fallzahlen ergeben sich derzeit keine Nachteile in Hinblick auf die Schwangerschaftsrate im Vergleich zu Zyklen ohne Felberbaum.indd :34:16
5 101 Literatur PKD. So haben beispielsweise nach CF-Diagnostik am Regensburger Zentrum 3 von 4 Paaren gesunde Kinder bekommen (einmal Zwillinge). In größeren Kohorten ist zu prüfen, ob die Entnahme und Analyse der Polkörper für die PKD auf die weitere Entwicklung des Embryos möglicherweise nicht sogar einen geringeren Einfluss haben könnten als die Störung der Integrität des sich entwickelnden Embryos durch die Entnahme und Analyse von Blastomeren für die PID. Schließlich werden die anfallenden Kosten für die genetische Untersuchung der Polkörper und die Maßnahmen der assistierten Reproduktion seitens der gesetzlichen Krankenkassen derzeit nicht übernommen. Dies wird von vielen Paaren im Vergleich zur vollständigen Kostenübernahme für die konventionelle Pränataldiagnostik und den ggf. nachfolgenden Schwangerschaftsabbruch als ungerechtfertigte Benachteiligung empfunden. Eine Aufnahme in den Leistungskatalog der gesetzlichen Krankenkassen bei strenger Indikationsstellung und Qualitätskontrolle wäre sehr zu begrüßen. Zusammenfassend stellt die Polkörperdiagnostik heute auch unter den strengen Rahmenbedingungen des deutschen Embryonenschutzgesetzes für einen Teil der Familien mit hohem Risiko für eine spezifische monogene Erkrankung bei den prospektiven Nachkommen eine realistische Alternative im Rahmen der Familienplanung dar. Die PKD stellt nicht nur erhebliche methodische Anforderungen, sondern erfordert auch eine enge und intensive interdisziplinäre Betreuung der Paare einschließlich einer umfassenden Beratung vor Behandlungsbeginn, während der gesamten Phase der»kinderwunschbehandlung«mit PKD und auch in der nachfolgenden Schwangerschaft, die weit über die Betreuung normaler Kinderwunschpaare hinausgeht. 3. Gesetz zum Schutz von Embryonen (Embryonenschutzgesetz EschG) (1990) BGBI.I Magli MC, Gianaroli L, Ferraretti AP, Toschi M, Esposito F, Fasolino MC (2004) The combination of polar body and embryo biopsy does not affect embryo viability. Hum Reprod 19(5): Strom CM, Ginsberg N, Rechitsky S, Cieslak J, Ivakhenko V, Wolf G, Lifchez A, Moise J, Valle J,Kaplan B, White M, Barton J, Kuliev A, Verlinsky Y (1998) Three births after preimplantation genetic diagnosis for cystic fibrosis with sequential first and second polar body analysis. Am J Obstet Gynecol 178(6) Fasouliotis SJ, Schenker JG (1998) Preimplantation genetic diagnosis principles and ethics. Hum Reprod 13(8): Rechlitsky S, Strom C, Verlinsky O, Amet T, Ivakhnenko V, Kukharenko V, Kuliev A, Verlinsky Y (1998) Allele Dropout in Polar Bodies and Blastomeres. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 15(5): Literatur 1. Verlinsky Y, Ginsberg N, Lifchez A, Valle J, Moise J, Strom CM (1990) Analysis of the first polar body: preconception genetic diagnosis. Hum Reprod 5 (7): Buchholz T, Vogt U, Clement-Sengewald A (2006) Polkörperdiagnostik in Deutschland Erfahrungen und neue Entwicklungen. J Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, in press Felberbaum.indd :34:16
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