Block 3 Vom Molekül zur Zelle Biochemie Seminar & Praktika

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1 Block 3 Vom Molekül zur Zelle Biochemie Seminar & Praktika Ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Georg Weitzer Zentrum für Medizinische Biochemie georg.weitzer@univie.ac.at Medizinische Chemie 1 Informationen zur Lehrveranstaltung: /organisatorische-informationen Praktikumsskriptum: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) Literatur dazu: Zellbiologie, Bruce Alberts, Wiley - Verlag Chemie ergänzend z.b. Chemie erleben (Abschnitt Analytische Chemie ), Facultas - UniversitätsTaschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Sie finden die Folien für diese Lehrveranstaltung unter Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 1

2 Biochemisches Praktikum / Seminar Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum. 2 Praktika zu je 4 akadedmischen Stunden, 3 Seminare zu je 2 akademischen Stunden Benötigte Materialien: 1. Arbeitsheft für Seminare und Praktikums-Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt. Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter bestätigt. 2. Arbeitsmantel Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 1: Notwendige Voraussetzungen, Allgemeines Verhalten im Labor. Verfassen des Protokolls. Hinwies auf Fehlerquellen, zufällige und systematische Fehler und Streuung; Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags. Vergabe der Referat Themen. PRAKTIKUM 1: Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren; Pipettierübung; Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen; Gelfiltration: Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe. 2

3 Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 2: Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums; Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus der Vorlesung. Gr. 30 Fr :30 pünktlich! PRAKTIKUM 2: Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (K M -Wert) der Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (= Enzymmenge), Statistische Auswertung der Ergebnisse der Gruppe SEMINAR 3: Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden. Gr. 30 Do :30 pünktlich! Presentation title / topic OR Presenter's name Organisational unit 5 Biochemisches Praktikum / Seminar Ort der Lehrveranstaltungen: PRAKTIKUM 1: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3, Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre. PRAKTIKUM 2: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1, Haupteingang, 1. Stock. Pünktlichstes Erscheinen! Art der Leistungsüberprüfung: LV mit permanenten Prüfungscharakter = = Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat Anwesenheitsblatt: 3

4 SEMINAR 1: Wozu Experimente und Labordiagnostik? Neben Blickdiagnose und Anamnese sind chemische du biochemische Parameter von entscheidender Bedeutung für Diagnose und Therapie Molecular precision medicine Voraussetzungen: Allgemeines Verhalten im Labor Führung von Protokollen Erkennen von Fehlerquellen zufällige und systematische Fehler, Streuung der analytischen Daten Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags 7 Arbeiten im Labor - Forschungslabor GSP (good scientific practice) Garantie der Reproduzierbarkeit Strikte Vermeidung von Plagiarismus Strikte Vermeidung von Fabrification Protokollbuch Nachvollziehbarkeit garantieren IPR (intellectual property right) Patente beachten 10 Jahre aufbewahren 8 4

5 Arbeiten im Labor - Sicherheit Hausverstand!!! Sauberkeit am Arbeitsplatz, Zusammenräumen nach Experiment Allgemeine Chemikalien (nach Gebrauch schließen, nichts zurückgießen) geeignete Schutzkleidung Handschuhe Arbeitsmäntel Schutzbrillen nicht Essen, Trinken, Rauchen.. Entsorgung von Gefahrenstoffen 9 Protokollführung (obligatorisch, Protokollheft A5) Das Versuchsprotokoll beginnt mit einer Aufgaben- oder Fragestellung, erwähnt die verwendeten Reagentien und Geräte, beschreibt die Durchführung eines Experiments und dokumentiert Beobachtungen, Fehler, Erklärungen sowie die Auswertung der Ergebnisse. Versuch, Datum (nicht Versuch 2 sondern Aminosäuretrennung mittels DC) Versuchsbedingungen (Reagenzien, Konzentration, Volumen,...) Ergebnisse (abgelesenen Werte, auch negative) Berechnung Endresultat: (Einheiten, signifikante Stellen) Interpretation (Diagnose positiv, Verdacht auf...) 10 5

6 FEHLER - Minimieren Die Ergebnisse aller Analysenverfahren sind nicht frei von Fehlern! grobe Fehler zufällige Fehler systematische Fehler Medizinische Chemie 11 Kenngrößen zufällige Fehler beinflussen die Reproduzierbarkeit der Experimente und Analysen Präzision = Reproduzierbarkeit systematische Fehler verursachen falsche Ergebnisse Richtigkeit = Abweichung des Mittelwertes von Mehrfachbestimmungen vom tatsächlichen Wert Präzision: gut schlecht gut Richtigkeit: gut gut schlecht Medizinische Chemie 12 6

7 Messgrößen Für Präzision (zufälligen Fehler): können mit der Gaußschen Verteilung beschreiben werden Standardabweichung, Variationskoeffizient Für Richtigkeit (systematischen Fehler): Abweichung des Mittelwerts vom wahren Wert Standardabweichung Medizinische Chemie 13 Meßgrößen für zufällige Fehler Mittelwert x = (x) n n = Anzahl der Einzelmessungen x = Einzelmessung Varianz (x-x) 2 s 2 = n-1 Standardabweichung (x-x) 2 s = n-1 Variationskoeffizient VK = s x

8 Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren. richtig positive richtig positive + falsch negative Spezifität bezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren. richtig negative richtig negative + falsch positive Screening (Suchtest) i. hohe Sensitivität ii. niedrige Spezifität Die "Sensitivität" (richtig positive Rate eines Tests) bezeichnet den Anteil der test-positiven Personen unter allen Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test die Kranken auch als krank zu identifizieren. Eine hohe Sensitivität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden soll. Die "Spezifität" (richtig-negative Rate eines Tests) beschreibt den Anteil der Test-negativen Personen unter allen Nicht-Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test Nicht-Erkrankte korrekt zu identifizieren. Eine hohe Spezifität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit großer Sicherheit bestätigt werden soll. Medizinische Chemie 15 Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren. richtig positive richtig positive + falsch negative Spezifität bezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren. richtig negative richtig negative + falsch positive Screening (Suchtest) i. hohe Sensitivität ii. niedrige Spezifität Medizinische Chemie 16 8

9 Verteilung der Messdaten Idealzustand Gesunde Kranke Konvention: Alle Daten die kleiner oder größer als der Mittelwert +/- 2 x Standardabweichung sind, werden ausgeschieden. Hohe Sensitivität aber geringe Spezifität Signalstärke > 95% der Daten Hohe Spezifität aber geringe Sensitivität Georg Weitzer,MUW 01/2017 Quellen: Qualitätskontrolle Qualitätsmanagement in medizinisch-analytischen Labors Extern: Versenden von gemessenen Proben Intern: mit Standards Medizinische Chemie 18 9

10 Bewertung von Messergebnissen bei Patienten Longitudinal Verlaufskontrolle über lange Zeit Transversal Vergleich mit Referenzbereich (Gesunde + andere Patienten Referenzbereich z.b. Mittelwert + 2 s Medizinische Chemie 19 SEMINAR 1: Wozu Experimente und Labordiagnostik? Voraussetzungen Allgemeines Verhalten im Labor Führung von Protokollen Fehlerquellen zufällige und systematische Fehler, Streuung Inhalt des ersten Praktikumstags 20 10

11 Für das Praktikum mitbringen: Arbeitsmantel Skriptum Rechner, Bleistift, Lineal... Protokollheft Anwesenheitsblatt 21 Trennmethoden Dünnschichtchromatographie Ionenaustauschchromatographie Reversed Phase Chromatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) Gaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) Affinitätschromatographie Elektrophorese 22 11

12 Allen Methoden ist gemeinsam, dass die Moleküle durch den unterschiedlich langen Aufenthalt in zwei nicht mischbaren Phasen getrennt werden. Phasen sind z.b. Lösungsmittel, Oberflächen, Antikörper, Georg Weitzer, MUW 01/2017 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.b. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). Verteilungskoeffizient c = [Br 2 ] Wasser [Br2 ] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/

13 Inhalt 1. DC von Aminosäuren 2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle) 3. Gelfiltration 4. Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen Trennung von Aminosäuren mittels der Dünnschichtchromatographie Stationäre Phase Cellulose auf Aluminiumträger, (mit Wasser gefülltes Gel) = hydrophil Mobile Phase Organisches Lösungsmittel = hydrophob 26 13

14 Auftragen der Proben Cellulose auf Alu-folie Glasröhrchen Standard, Referenzwert 27 Glastrog nach ca. 90 min Laufmittel= mobile Phase 28 14

15 Front Wanderstrecke der mobilen Phase Markieren der Front & Rf-Wert berechnen Wanderstrecke der Aminosäure Start Rf-Wert berechnen 29 Auswertung W(as) = Rf(as) W(m) Rf = Retentionsfaktor Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.b. gasförmig/flüssig oder flüssig/fest oder flüssig/flüssig). Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] mobile Phase [Aminosäure] stationäre Phase 30 15

16 2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle) 1. In eine Mikrotiterplatte werden in eine Spalte achtmal 125 µl Wasser pipettiert und µl gelbe Farbstofflösung zugesetzt. 3. Nach Pipettieren der Farbstofflösung wird durch mehrfaches Aufziehen mit der Pipette gemischt! 4. Die 1. Spalte dient als Leerwert (LW), in die nur destiliertes Wasser (200 µl) pipettiert wird. 5. Die Konzentration des Farbstoffs in diesen Mischungen wird durch Messung der Extinktion bei 415 nm mit einem Photometer bestimmt. 6. Berücksichtigen Sie bei Ihrer Auswertung den LW, indem sie den Mittelwert des LWs bilden und diesen von Ihren Messwerten abziehen! Aus den so erhaltenen 8 Werten/Spalte errechnen Sie nun jeweils den Mittelwert, die Standardabweichung und den Variationskoeffizienten. Das Resultat kann bei einem VK <10 % als zufriedenstellend angesehen werden und sollte idealerweise unter 5% liegen Gelfiltration Trennung nach Molekülgröße Gel als Molekularsieb kleine Moleküle können in Poren der Gelteilchen eindringen ( längerer Weg verzögerte Wanderung) große Moleküle Matrix: Dextrane, Polyacrylamid 32 16

17 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer equilibriert. 0.5 ml der Probe direkt auf die Glasfritte trockengelaufene Glasfritte auftragen. (Dextranblau und Methylrot) Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen. Austretender Elutionspuffer in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) sammeln. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit 1 Tropfen HCl ansäuern Gelfiltration Chemie erleben, Wawra et al

18 Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Dextranblau: Methylrot: großes Molekül, eluiert zuerst kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus 35 Ionenaustausch- bzw. Affinitätschromatographie 36 18

19 4. Elektrophorese Die Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld 37 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle 38 19

20 Welchen ph-wert muss die Pufferlösung haben, wenn die Proteine zur Anode wandern sollen? pi (Serumproteine) ~ 5 Anode = + Pol Kathode = - Pol Puffer soll ph > 5 sein, also in der Praxis bei 9 liegen isoelektr. Punkt 39 Elektrophorese -Durchführung Vorbereitung Pipettieren kleiner Volumina Proben auftragen 40 20

21 Nach der Elektrophorese Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Densitometrische Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials 41 Elektropherogramm Chemie erleben Wawra et al

22 Diagnostische Aussagemöglichkeiten 43 Wie Grundlagenforschung zu technologischen und oder medizinischen Anwendungen führen kann: Presentation title / topic OR Presenter's name Organisational unit 44 22

23 Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit der SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 45 Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit der SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Immunoblot: Nachweis eines bestimmten Proteins mittels Antikörpers 46 23

24 Isoelektrische Fokussierung Auftrennung über ph Gradienten 47 2D-Gelelektrophorese - Proteomanalyse 1. Isoelektrische Fokussierung 2. Dann SDS-PAGE 48 24

25 2D-Gelelektrophorese Proteomanalyse - Beispiele Maximal Punkte Quelle: Wikipedia 49 Diagnosemöglichkeit: Veränderte neue Kernproteine in Tumorproben identifziert mit 2D- Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (MALDI-TOF) Liver tumor Rat lung tissue Burkitts lymphoma Rat testis tissue Holzmann K et al. Eur J Biochem. 1997;244(2):

26 Presentation title / topic OR Presenter's name Organisational unit Praktikum: Gruppe 26 Do. 12:30 pünktlichst Gruppe 30 Do. 16:00 pünktlichst Presentation title / topic OR Presenter's name Organisational unit 52 26