Pharmazeutische Biologie und Phytochemie

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Bertold Krüger
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1 - SSA Pharmazeutische Biologie und Phytochemie Hydroxyzimtsäurederivate und Flavonoide in offizinellen Crataegus -Arten und einem kommerziellen Extrakt sowie Versuche zur stofflichen Zuordnung der Refraktärzeit-verlängernden Aktivität Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Ulrich Kuczkowiak aus Recklinghausen

2 Einleitung Seite Glossar VII 1 Zur Etymologie und Botanik des Weißdorns Crataegus monogyna Jacq.- Eingriffeliger Weißdorn Crataegus laevigata Poiret - Zweigriffeliger Weißdorn Crataegus nigra Waldst. et Kit.- Schwarzfrucht-Weißdorn Crataegus pentagyna Waldst. et Kit.- Fünfgriffeliger Weißdorn Crataegus azarolus L. - Welsche Mispel 7 2 Bekannte Inhaltsstoffe aus Crataegus-Arten Hydroxyzimtsäurederivate aus Crataegus-Arten Flavonoide aus Crataegus-Arten Weitere Pflanzeninhaltsstoffe aus Crataegus-Arten Triterpene, Amine und Purine Procyanidine 16 3 Gehaltsbestimmungen in den Arzneibüchern 16 4 Pharmakologische Prüfungen Aktuelle pharmakologische Arbeiten Testung antiarrhythmischer Eigenschaften Prüfung von Crataegw.s-Extrakten Prüfung von Crataegws-Inhaltsstoffen 23 5 Therapeutische Indikation des Weißdorns 24 6 Aktuelle klinische Studien und Anwendungsbeobachtungen von Crataegus -Extrakten 26 7 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 28 Ergebnisse 8 Isolierung und Strukturaufklärung von Hydroxyzimtsäurederivaten und ausgewählten Flavonoiden Voruntersuchungen Isolierung phenolischer Verbindungen aus dem Crataegws-Extrakt LI Isolierung von 2-0-Kaffeoyläpfelsäure aus Crataegus submollis 34

3 II 8.4 Strukturaufklärung der Monohydroxyzimtsäureester mit Chinasäure Strukturaufklärung von Dikaffeoylchinasäuren Strukturaufklärung von Hydroxyzimtsäureestern mit Aldonsäuren (-)-4-0-/ /-Kaffeoyl-L-threonsäure (-)-4-0-/ 7-p-Cufnaroyl-L-threonsäure (-)-2-0-/" 7-Kaffeoyl-L-threonsäure." NMR-Betrachtungen nach Synthese des y-l-threonolaktons Strukturaufklärung von (-)2-O-/ü7-Kaffeoyl-(+)-äpfelsäure aus Crataegus submollis Strukturaufklärung von Flavonoiden Isoorientin (Luteolin-6-C-glucopyranosid) Isovitexin (Apigenin-6-C-glucopyranosid) Vitexin-2"-0-a-L-rhamnosid Vitexin-4'"-Oacetyl-2"-0-a-L-rhamnosid (-)-Eriodictyol-7-0-ß-D-glucopyranosid Methoxykämpferol-3-O-ß-D-glucopyranosid und 8-Methoxykämpferol- 6"-0-malonyl-3-0-ß-D-glucopyranosid 78 9 Kernresonanzspektroskopische Untersuchungen an Hydroxyzimtsäuren mit Chinasäure Substituenteneffekte aufgrund einer Acylierung von Chinasäure Substituenteneffekte an Dikaffeoylchinasäuren Lösungsmitteleinflüsse in der Kernresonanzspektroskopie bei der Strukturbestimmung von Kaffeoylchinasäuren Lösungsmitteleinfluß am Beispiel der Chlorogensäure Einfluß von Hydroxylgruppen und Temperatur auf das Kopplungsmuster in DMSO-d 6 am Beispiel der Neochlorogensäure Quantifizierung der Hydroxyzimtsäurederivate und der Hauptflavonoide Zielsetzung und Methodenwahl Aufarbeitung Validierung Quantifizierung der Hydoxyzimtsäuren aus dem Crataegus-Extrakt LI132 und Weißdornblättern mit Blüten Verteilung im CrataegM.s-Extrakt Einfluß der Trocknungsmethode und des Erntezeitpunktes während der Blüte auf das Inhaltsstoffspektrum am Beispiel der Hydroxyzimt-säurederivate Verteilung in Weißdornblätter mit Blüten verschiedener Arten im Vergleich zum Crataegus-Extrakt Verteilung in Blüten und Blättern der verschiedenen Crataegus-Arten Quantifizierung ausgewählter Flavonoide aus dem Crataegus-Extrakt LI 132 und Weißdornblättern mit Blüten Verteilung im Crataegu.y-Extrakt 114

4 DI Verteilung in Weißdornblättern mit Blüten definierter Arten im Vergleich zum Extrakt Verteilung in den Blüten und Blättern der verschiedenen Crataegus-Arten Artzusammensetzung des Crataegw.s-Extraktes LI , Hydroxyzimtsäurederivate und Flavonoide in Weißdornfrüchten Fraktionierung des Crataegus-Extraktes LI 132 zur Prüfung auf Refraktärzeit-verlängernde Aktivität Vorarbeiten Fraktionierung polarer Verbindungen Fraktionierung an Sephadex LH Isolierung einer polymeren Kohlenhydrat-Fraktion A o Fraktionierung in Aminosäure"- und Kohlenhydrat"-Fraktion Isolierung einer Amin"-Fraktion Charakterisierung der polymeren Kohlenhydrat-Fraktion A o Kernresonanzspektroskopie Kapillarelektrophoretische Konfigurationsbestimmung der Zucker MALDI-TOF-MS Diskussion Quantifizierung der Aminosäuren aus dem Crataegus-Extrakt LI 132 und der Aminosäure"-Fraktion Pharmakologische Untersuchungen zur Bestimmung der Refraktärzeitverlängernden Aktivität Reproduzierbarkeit der Refraktärzeit-verlängernden Aktivität Polymere Kohlenhydratfraktion AQ Ionenaustauscher-Fraktionen: Aminosäure"- und Kohlenhydraf'-Fraktion Amin"-Fraktion Diskussion Abschließende Zusammenfassung 141 Experimenteller Teil 13 Crataegus-Extrakt LI 132 und Drogenmaterial Extrakt Drogenmaterial Geräte und Chemikalien Chemikalien und Lösungsmittel Laborgeräte Spektroskopische Charakterisierung Chromatographische Methoden Dünnschichtchromatographie 149

5 IV 15.2 Hydrostatische Säulechromatographie Chromatographie an Sephadex LH Isolierung phenolischer Verbindungen aus Crataegus-Extrakt und Fraktionierung zur Gewinnung der Fraktionen mit refraktärzeitverlängernder Aktivität Isolierung der 2-O-[E]-Kaffeoyläpfelsäure aus C. submollis Gewinnung der Aminosäure"-Fraktion Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPLC-System für das Screening phenolischer Verbindungen (HPLC 1) Quantifizierung der Hydroxyzimtsäurederivate (HPLC 2) Quantifizierung der Flavonoide (HPLC 3) Trennung Vitexin/Isovitexin (HPLC 4) Quantifizierung der Aminosäuren (HPLC 5) Präparative HPLC Mitteldruck-Flüssig-Chromatographie (MPLC) Gaschromatographische Verfahren Malonsäurenachweis nach Silylierung GC- Bestimmung der Zucker aus dem Hydrolysat der Fraktion A o Elektrophoretische Verfahren (CZE) Isolierung der Verbindungen Auswahl der Säure Optimierung der Ausschüttelung Ausschüttelung aus nicht-angesäuerter wäßriger Lösung Ausschüttelung aus TFA-saurer Lösung Ausschüttelung aus salzsaurer Lösung: Isolierung phenolischer Verbindungen aus dem Crataegw.s-Extrakt Aufarbeitung der Ethylacetatfraktion Isolierung der (-)-2-O-Kaffeoyl-D-äpfelsäure aus C. submollis Analytische Daten der isolierten Strukturen Hydroxyzimtsäurederivate Flavonoide Übersicht der Strukturen (optische Drehwerte; Rf R f -, R t -Werte; Auswaagen) Identifizierung der L-(+)-Threonsäure Hydrolysen der Threonsäurederivate Synthese des Y-(L)-Threonolaktons Hydrolyse der Flavonoide GC-Bestimmung der Malonsäure Hydrolyse Silylierung 166

6 23 CZE-Trennung von Aldose-Enantiomeren nach Derivatisierung mit S-(-)-l-PhenyIethylamin Quantifizierung der phenolischen Verbindungen : Aufarbeitung " Bestimmung der Kalibriergeraden Bestimmung der Korrekturfaktoren Prüfung auf ausreichende Extraktion Prüfung der Wiederfindung Fraktionierung des Crataegus -Extraktes für die Prüfung auf Refraktärzeitverlängernde Aktivität Fraktionierung des Extraktes an Sephadex LH Gewinnung der Refraktärzeit-verlängernden Fraktionen aus einer Extraktcharge der Jahre 1994 und Gewinnung der Fraktionen an Sephadex LH-20 zur weiteren Isolierung der Kohlenhydrat"-, Aminosäure"- und Amin"-Fraktion Fraktionierung zur Gewinnung der polymeren Kohlenhydratfraktion AQ Bestimmung des totalen Permeationsvolumens Elution löslicher Rückstände (Leerwert Sephadex ) Gewinnung der Aminosäure"- und Kohlenhydraf'-Fraktion Gewinnung der Amin"-Fraktion Charakterisierung der Fraktion AQ Elementaranalyse GC-Bestimmung der hydrolysierten Zucker Hydrolyse Derivatisierung des Hydrolysates Kalibrierung Dextrinnachweis in Glucosesirup nach DAß 10 (abgewandelt) Quantifizierung der Aminosäuren im Crataegw.s-Extrakt LI 132 und der Aminosäure"-Fraktion Retentionszeiten der Standardaminosäuren Bestimmung der Wiederfindung Aufarbeitung Bestimmung der Systempräzision Kalibrierung Aufarbeitung aus dem Extrakt Aufarbeitung aus der Aminosäure"-Fraktion Pharmakologiemodell des isoliert perfundierten Meerschweinchenherzens Präparation der Meerschweinchen Perfusionsapparatur Versuchsdurchführung Bestimmung der Refraktärzeit Semiquantitative Auswertung 180

7 VI Anhang 27 Tabellenanhang Literaturverzeichnis 187

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